JP2018516229A - 超精製DsbA及びDsbC、ならびにそれらの作製及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2015年3月6日出願の米国仮特許出願第62/129,701号の利益を主張するものであり、この開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:コンピュータ可読形式(CRF)の配列表(ファイル名:146392026040SeqList.txt、記録日:2016年3月4日、サイズ:9KB)。
「検出」という用語は、標的分子の質的測定及び量的測定の両方を含むために本明細書で最も広義に使用される。検出は、単に試料中の標的分子の存在を特定すること、ならびに標的分子が検出可能なレベルで試料中に存在するかを決定することを含む。
100×画分X/Y
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN−2によってそのプログラムのAとBとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性値%は、直前の段落に記載されるようにALIGN−2コンピュータプログラムを使用して得られる。
DsbA及びDsbCの超高純度調製物の生成方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、調製物は、約95.0%、約96.0%、約97.0%、約98.0%、約99.0%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%、約99.9%のうちのいずれかを超える純度のDsbAまたはDsbCを含む。いくつかの実施形態では、99%の純度のDsbAまたは99%の純度のDsbCである調製物は、調製物中の材料の1%未満がDsbAまたはDsbCの産生中に存在する細胞または細胞溶解物中に存在する物質(例えば、タンパク質、核酸、脂質等)であることを示す。DsbAまたはDsbCの99%の純度の調製物は、DsbAまたはDsbCの精製または製剤化に使用される緩衝液、塩、または他の賦形剤を含有し得る。
いくつかの態様では、本発明は、DsbAの超高純度調製物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、DsbAは、E.coli培養物等の細菌発酵培養物でDsbAを過剰発現することによって産生される。発酵後、細菌細胞が収集及び遠心分離される。結果として生じる細胞ペーストが溶解緩衝液(例えば、10mM MOPS(pH7.1))中に再懸濁され、溶解される(例えば、微小流動化剤を使用して)。いくつかの実施形態では、細胞溶解物がポリエチレンイミン(PEI)で条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、または約1.0%のうちのいずれかを超える最終濃度で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約15分間、約30分間、約45分間、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約8時間、約12時間、約16時間、約20時間、または約24時間のうちのいずれかを超える時間で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約0℃、約4℃、または約21℃のうちのいずれかを超える温度で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、周囲温度(約21℃)で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物が遠心分離されて、粒子状物質を除去する。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に濾過される。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に22μmのフィルターを介して濾過される。
いくつかの実施形態では、本発明は、DsbAの超高純度調製物を産生するための以下の例示的ではあるが非限定的な方法を提供する。DsbAは、E.coliで発現される。細胞ペーストが10mM MOPS(pH7.1)中に懸濁され(50g細胞ペースト/1L)、懸濁液が均質になるまで混合される。細胞溶解が、室内圧力(約7000psi)での3回通過の微小流動化剤110Fを使用して行われる。均等物が(10%PEIストック溶液を使用して)0.1%PEIになるように条件付けられ、周囲温度(約21℃)で30分間混合される。懸濁液が、「GSA」回転子を使用してSorval RC−5B+遠心分離機内で、8500rpmで30分間遠心分離される。遠心分離物が収集され、0.22umのDuraporeフィルターを介して濾過される。
細胞溶解物が結合及び溶出モードでQ−Sepharose(登録商標)FF(GE)に適用される。カラム高さは、約20〜30cmであり、流量は、150cm/時間であり、装填密度は、6mg/mL以下である。カラムは、25mM Tris、1M NaCl(pH9.2、86mS/cm、4カラム体積(CV))で事前平衡化される。カラムは、25mM Tris(pH9.1、0.3mS/cm、4CV)で平衡化される。DsbAを含む遠心分離物が水(1:1)で希釈され、その後、pHが1.5M Tris塩基(pH9.0、伝導度約1.0mS/cm、6mg/mL以下)で9.0に調整される。その後、カラムが6CVの平衡化緩衝液で洗浄される。DsbAが、塩濃度の段階勾配増加を使用してカラムから溶出される。緩衝液Bは、25mM Tris、250mM NaCl、pH9.2、26mS/cmである。DsbAは、まず4CVの15%緩衝液B、その後、4CVの20%緩衝液B、最後に溶出相の残りの25%緩衝液Bを適用することによってカラムから溶出される。これらのプールがSECによってアッセイされ、最大量のDsbAを含有する画分に基づいてプールされる。
その後、プールされたQSFF画分が結合及び溶出モードでPOROS HS 50カラムに適用される。QSFF画分が2.0M酢酸でpH5.0に調整される。カラム高さは、約20〜30cmであり、流量は、約150cm/時間であり、装填密度は、約6mg/mL以下である。POROS HS 50カラムは、12.5mM MES(pH5.5、0.4mS/cm、4CV)で最初に平衡化される。2M酢酸でpH5.0に調整され、その後、水(1:2)で希釈されたQSFFプール(pH5.0、0.4mS/cm)が、POROS HS 50カラムに装填される。その後、カラムが5CVの平衡化緩衝液で洗浄される。DsbAが塩勾配でカラムから溶出される。緩衝液Bは、12.5mM MES、250mM NaCl pH5.5、25mS/cmである。勾配は、15CVにわたる0〜60%Bである。1CVの画分がピーク収集される。画分がSDS−PAGEゲル及びSECによって分析され、純度に基づいてプールされる。POROSプールが、Sorval RC−3B 遠心分離機を用いて3000rpmで約30分間遠心分離される10kDのCentricon膜(Millipore)を使用して約3.0mg/mLに濃縮される。
いくつかの態様では、本発明は、DsbCの超高純度調製物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、DsbCは、E.coli培養物等の細菌発酵培養物でDsbCを過剰発現することによって産生される。発酵後、細菌細胞が収集及び遠心分離される。結果として生じる細胞ペーストが溶解緩衝液(例えば、10mM MOPS(pH7.1))中に再懸濁され、溶解される(例えば、微小流動化剤を使用して)。いくつかの実施形態では、細胞溶解物がポリエチレンイミン(PEI)で条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、または約1.0%のうちのいずれかを超える最終濃度で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約15分間、約30分間、約45分間、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約8時間、約12時間、約16時間、約20時間、または約24時間のうちのいずれかを超える時間で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約0℃、約4℃、または約21℃のうちのいずれかを超える温度で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、周囲温度(約21℃)で、PEIで条件付けられる。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物が遠心分離されて、粒子状物質を除去する。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に濾過される。いくつかの実施形態では、PEIで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に22μmのフィルターを介して濾過される。
いくつかの実施形態では、本発明は、DsbCの超高純度調製物を産生するための以下の例示的ではあるが非限定的な方法を提供する。DsbCは、E.coliで発現される。細胞ペーストが10mM MOPS(pH7.1)中に懸濁され(50g細胞ペースト/1L)、懸濁液が均質になるまで混合される。細胞溶解が、室内圧力(約7000psi)での3回通過の微小流動化剤110Fを使用して行われる。均等物が(10%PEIストック溶液を使用して)0.1%PEIになるように条件付けられ、周囲温度(約21℃)で30分間混合される。懸濁液が、「GSA」回転子を使用してSorval RC−5B+遠心分離機内で、8500rpmで30分間遠心分離される。遠心分離物が収集され、0.22umのDuraporeフィルターを介して濾過される。
浄化された遠心分離物(1.5M Tris塩基でpH8.0に条件付けられたもの)が、結合及び溶出モードでDEAE Sepharose(登録商標)Fast Flow(GE Healthcare)を含有するカラムに装填される。カラムは、以下の特性を有する。カラムは、直径28.4cm×2.6cm、体積151mL、タンパク質容量50mg/mL以下の樹脂であった。カラムは、3CVの250mM MOPS(pH7.1、伝導度6.2mS/cm)で事前平衡化され、10mM MOPS(pH7.1、伝導度0.3mS/cm)で平衡化される。装填の終わりに、カラムは、12CVの平衡化緩衝液で洗浄される。DsbCは、15CVの0〜60%緩衝液Bの勾配を使用して溶出される。溶出は、溶出緩衝液への15CVにわたる0〜60%緩衝液Bの線形勾配である。画分は、SDS−PAGEによって分析される。
その後、プールされたDEAE画分が結合及び溶出モードでPhenyl Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーに適用される。カラムは、以下の特性を有する。カラムは、直径20cm×2.6cm、体積106mL、タンパク質容量20mg/mL以下の樹脂であった。カラムは、0.6M硫酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH7.0で平衡化される。DsbCを含む条件付けられたDEAEプールは、Phenyl Sepharoseカラムに装填され、その後、1.2M硫酸ナトリウム(1:1)、1Mリン酸ナトリウム(1:20)で希釈され、装填前にpH7.0、約68mS/cmに調整される。その後、カラムは、7CVの0.6M硫酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)で洗浄され、次いで、7CVの0.6M硫酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)で洗浄される。DsbCは、精製水でカラムから溶出される。画分が収集され、カラム画分のSDS−PAGE分析によって分析される。
その後、プールされたPhenyl Sepharose画分がSuperdex 75を使用してサイズ排除クロマトグラフィーに供される。このステップを使用して、任意の残留高分子量種及び低分子量種を除去し、DsbCを製剤化する。Superdex 75は、DsbC等のより小さいタンパク質(約24kDa)により適した分画範囲(5kDa〜70kDa)を有する。カラムは、Superdex 75であり、以下の特性を有する。カラムは、直径60cm×2.6cm、体積320mL、装填体積16mL以下であった。HICプール(画分7〜11)は、遠心分離フィルターを使用して16mL以下(SEC CVの5%以下)の体積に濃縮される。これらの装置は、20分間隔で臨床遠心分離機を使用して目標体積に到達するまで4000rpmで遠心分離される。Superdex 75サイズ排除カラムは、3CVのPBS(pH7.0±0.4)で平衡化される。Phenyl Sepharose画分は、カラムに装填され、PBS(pH7.0±0.4)で、1mL/分の流量で溶出される。
DsbA及びDsbCの調製物の純度の決定方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、調製物中のDsbAまたはDsbCの純度は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のDsbAまたはDsbCの純度は、高速液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー(HPLC SEC)によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のDsbAまたはDsbCの純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって決定される。いくつかの実施形態では、SDSPAGEゲル上のタンパク質は、蛍光タンパク質染色を使用して特定される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質染色は、Sypro(登録商標)Ruby染色である。いくつかの実施形態では、SDS−PAGE上のタンパク質は、Heukeshoven銀染色を使用して可視化される。他の実施形態では、DsbA分子またはDsbC分子の同一性は、N末端配列分析、ペプチド質量フィンガープリント法(PMF)、CHIP TOFによるインタクト/還元質量、及びウエスタンブロット分析を含むが、これらに限定されない特徴付けアッセイを使用して確認される。
本発明は、DsbA及びDsbCの超高純度調製物の生成方法を提供する。「Dsb」タンパク質という用語は、細菌ジスルフィドオキシドレダクターゼを指す。DsbAは、ペプチドが細胞のペリプラズム内に出現すると鎖内ジスルフィド結合を形成し、DsbCは、細胞のペリプラズムにおける酸化的タンパク質折り畳み中にジスルフィド結合イソメラーゼとしての機能を果たす。いくつかの実施形態では、DsbA及びDsbCは、細菌由来である。いくつかの実施形態では、DsbA及びDsbCポリペプチドは、E.coli DsbA及びDsbCポリペプチドである。他の実施形態では、DsbA及びDsbCポリペプチドは、Enterobacteria、Actinetobacter、Azoarcus、Salmonella、Buchnera、Xylella、Xanthmonas、Campylobacter、Shigella、Pseudomonas、Yersina、Erwinia、及びNeisseriaの任意の種由来である。いくつかの実施形態では、DsbAポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、DsbAポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約99%のうちのいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、DsbCポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、DsbCポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約99%のうちのいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
タンパク質折り畳み及び集合がDsbA及び/またはDsbCの過剰発現によって支援され得る細菌(例えば、E.coli)中で産生され得るポリペプチドの例としては、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Fc含有タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの例としては、哺乳類タンパク質、例えば、レニン等;ホルモン;成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ−1−抗トリプシン;インスリンA−鎖;インスリンB−鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子、例えば、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子;抗凝固因子、例えば、タンパク質C;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−PA);ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ;エンケファリナーゼ;RANTES(活性化時に調節され、正常T細胞が発現及び分泌している);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−アルファ);血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン;ミュラー管抑制物質;レラキシンA−鎖;レラキシンB−鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;酵素;微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ;DNase;IgE;細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA)、例えば、CTLA−4;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子の受容体;タンパク質AまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5、または−6(NT−3、NT−4、NT−5、またはNT−6)、または神経成長因子、例えば、NGF−b;血小板由来成長因子(PDGF);線維芽細胞成長因子、例えば、aFGF及びbFGF;表皮成長因子(EGF);形質転換成長因子(TGF)、例えば、TGF−アルファ及びTGF−ベータ、例えば、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、またはTGF−β5;インスリン様成長因子−I及び−II(IGF−I及びIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP);サイトカイン;CDタンパク質、例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、及びCD20;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;融合ポリペプチド、すなわち、2つ以上の異種ポリペプチドまたはその断片から成り、組換え核酸によってコードされるポリペプチド;Fc含有ポリペプチド、例えば、第2のポリペプチドに融合した免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質、またはその断片;免疫コンジュゲート;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M−CSF、GM−CSF、及びG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1〜IL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;分解促進因子;ウイルス抗原、例えば、AIDSエンベロープの一部等;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えば、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4、及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えば、CA125(卵巣癌抗原)、またはHER2、HER3、もしくはHER4受容体;イムノアドヘシン;ならびに上述のタンパク質のうちのいずれかの断片及び/または変異形、ならびにタンパク質、例えば、上述のタンパク質のうちのいずれか等に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注入によって動物において産生される。二機能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(式中、R及びR1が異なるアルキル基である)を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるポリペプチド、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られる。すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異形は除外され、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体またはポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られていた(例えば、Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)、及びBrennan et al.,Science 229:81(1985)を参照のこと)。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞から直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab’−SH断片は、E.coliから直接回収され、化学的にカップリングして、F(ab’)2断片を形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチに従って、F(ab’)2断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185、米国特許第5,571,894号、及び米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されるように、「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるタンパク質のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、タンパク質の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。タンパク質のアミノ酸配列変異形は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/またはそれへの挿入、及び/またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。
「ポリペプチド変異形」とは、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されるポリペプチド、例えば、活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異形としては、例えば、1つ以上のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のN末端またはC末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ポリペプチド変異形は、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%のうちのいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異形ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して1つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10個のうちのいずれか以下の保存的アミノ酸置換を有する。
表1.
(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性:Asp、Glu
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。かかるエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は、c−metに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、c−metの2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬を、c−metを発現する細胞に限局させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体及び/または一アーム抗体及び/またはイムノアドヘシンの産生方法としてノブイントゥホール(Knobs into holes)を使用することは、当該技術分野で周知である。Genentechに譲渡された米国特許第5,731,168号(1998年3月24日付与)、Amgenに譲渡されたPCT公開第WO2009089004号(2009年7月16日公開)、及びNovo Nordisk A/Sに譲渡された米国特許公開第20090182127号(2009年7月16日公開)を参照されたい。Marvin and Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649−658及びKontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1−9も参照されたい。簡潔な考察が本明細書に提供されている。
表2.アミノ酸の特性
a水の分子量を差し引いたアミノ酸の分子量。Handbook of Chemistry and Physics,43rd ed.Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961からの値。
bA.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107−123,1972からの値。
cC.Chothia,J.Mol.Biol.105:1−14,1975からの値。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図6〜20に定義されている。
DsbA及びDsbCを使用した異種ポリペプチド(例えば、抗体)の組換え産生の場合、それをコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のために複製可能なベクターに挿入される。ポリペプチド(例えば、抗体)をコードするDNAは、従来の手技を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して)容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物起源のいずれかのものである。IgG、IgM、IgA、IgD、及び、IgE定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解される。
i.ベクター構築
本発明のポリペプチド(例えば、抗体)のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技法を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、かつ当該技術分野で既知である多くのベクターが本発明で使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて様々な成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手技:免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、DEAE等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばSephadex G−75を使用したゲル濾過が、好適な精製手技の例示である。
いくつかの態様では、本発明は、超高純度DsbA及び/またはDsbCを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、約95.0%、約96.0%、約97.0%、約98.0%、約99.0%、または約99.5%のうちのいずれかを超える単量体DsbAであるDsbAを含む。いくつかの実施形態では、95%の単量体DsbAを含む組成物は、調製物中の材料の5%未満が、DsbAの産生中に存在する細胞または細胞溶解物(例えば、タンパク質、核酸、脂質等)中に存在した他の物質である組成物である。いくつかの実施形態では、単量体DsbAポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、SEC−HPLC)によって測定される。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAを含む組成物は、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、または約0.1%のうちのいずれか未満の低分子量種(例えば、SECまたはSDS−PAGEによって測定される、単量体DsbA未満の分子量を有する種)を含む。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAを含む組成物は、約2%未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAを含む組成物は、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、または約0.1%のうちのいずれか未満の高分子量種(例えば、SECまたはSDS−PAGEによって測定される、単量体DsbAを超える分子量を有する種)を含む。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAを含む組成物は、約1%未満の高分子量種を含む。
ある特定の態様では、本発明は、DsbA及び/またはDsbCの存在について組換えポリペプチド試料を分析するための免疫アッセイで使用するための抗体(例えば、ポリクローナル抗体及び/またはモノクローナル抗体)を生成するために免疫原として使用するための超高純度DsbA及び超高純度DsbCを提供する。例えば、本抗体は、組換えポリペプチドがDsbA及び/またはDsbCを過剰発現する細菌細胞で産生された組換えポリペプチド試料中のDsbA及びまたはDsbCを検出及び/または定量するための免疫アッセイで使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、超高純度DsbAに特異的に結合するポリクローナル抗体及び/または超高純度DsbCに特異的に結合するポリクローナル抗体を提供する。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、DsbAまたはDsbCの異なるエピトープに特異的に結合し、それ故に、DsbAまたはDsbC断片、変異形、誤って折り畳まれたタンパク質等を検出するための有用性を提供する。免疫アッセイで測定される試料中のDsbAまたはDsbCのレベルの過剰定量をもたらし得る宿主細胞タンパク質不純物に対するウサギ抗体の生成を最小限に抑えるために、動物(例えば、ウサギ)が超高純度DsbAまたはDsbCで免疫化される。
いくつかの実施形態では、本発明は、DsbAの存在及び/または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のDsbAを検出することと、試料中で検出されたDsbAの量を超高純度DsbA参照標準の1つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、調製物は、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、または約0.01%のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度DsbA参照標準は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、または約0.01%のうちのいずれか未満の非DsbA化合物に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、DsbAは、E.coli DsbAである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞(例えば、E.coli宿主細胞)内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、DsbAを過剰発現する(例えば、DsbAを過剰発現したE.coli宿主細胞)。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、超高純度DsbAに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて、約50ng/mL、約25ng/mL、約15ng/mL、約10ng/mL、約5ng/mL、約2.5ng/mL、及び/または約1.5ng/mL未満、及び/またはそれらのうちのいずれかのDsbAを検出することができる。
本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチド及び/または本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチドを含む製剤は、製品に含まれ得る。いくつかの実施形態では、製品は、本明細書に記載の超高純度DsbA及び/またはDsbCポリペプチドを使用して生成された抗体を含む。製品は、ポリペプチド、抗体、ポリペプチド製剤、及び/または抗体製剤を収容する容器を含み得る。好ましくは、製品は、(a)本明細書に記載のポリペプチド、抗体、ポリペプチド製剤、及び/または抗体製剤を含む組成物を容器内に含む容器、ならびに(b)ポリペプチド及び/または抗体の使用に関する指示を有する添付文書を含む。
ジスルフィドオキシドレダクターゼ(DsbA)は、ジスルフィド結合を形成するためのチオール−ジスルフィド交換反応によってタンパク質中のシステインを酸化することができる強酸化剤である。これは、細菌におけるジスルフィド結合形成の一次触媒であり、タンパク質の正しいタンパク質折り畳みを促進する。同様に、ジスルフィドオキシドレダクターゼ(DsbC)は、細胞のペリプラズムにおける酸化的タンパク質−折り畳み中のジスルフィド結合イソメラーゼである。DsbA及びDsbCは、典型的には、E.coliで高レベルでは発現されないが、DsbA及び/またはDsbCを過剰発現するE.coliが抗体(例えば、多重特異性抗体)を含むヘテロ多量体真核生物タンパク質の適切な集合及び折り畳みを改善するために使用されている。
表3.ECPアッセイ検出
材料及び方法
抽出ステップ
DsbAをE.coliで発現させた(62A7 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3、lacIq、lacL8、ompTΔ(nmpc−fepE)ΔdegP ilvG修復型と名付けられたW3110誘導体)(Joly,JC and Swartz JR 1994,Biochem.33:4231−4236、Joly,JC and Swartz JR 1997,Biochem.36:10067−10072、米国特許第5,789,199号)。細胞ペーストを10mM MOPS(pH7.1)中に懸濁し(50g細胞ペースト/1L)、懸濁液が均質になるまで混合した。微小流動化剤110Fを7000psiで使用して細胞溶解を行った。均等物を(10%PEIストック溶液を使用して)0.1%PEIになるように条件付け、周囲温度(約21℃)で30分間混合した。懸濁液を、8500rpmで30分間遠心分離した遠心分離物を収集して、0.22umのDuraporeフィルターを介して濾過した。
全てのカラムクロマトグラフィーステップをGE製のAKTA Explorersで行った。DsbAを、均質化及び遠心分離を使用してE.coli細胞ペーストから抽出した。遠心分離物を、Q Sepharose(登録商標)FF(QSFF)カラムを使用して結合及び溶出モードで陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その後、QSFFプールを、Poros 50 HSカラムを使用して結合及び溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。詳細な実行条件を表4及び5に記載する。
モード:結合及び溶出、樹脂:Q−Sepharose(登録商標)FF(GE)、カラム高さ:20〜30cm、流量:150cm/時間、装填密度:6mg/mL以下)。
表4:QSFFプロセス
モード:結合及び溶出、樹脂:Poros 50 HS(Applied Biosystems)、カラム高さ:20〜30cm、流量:150cm/時間、装填密度:6mg/mL以下)。
表5:Poros 50 HSプロセス
プールを、3000rpmで約30分間遠心分離した10kDのCentricon膜(Millipore)を使用して約3.0mg/mLに濃縮した。
力価決定
DsbA遠心分離物の力価を、GE Healthcare製のSuperdex 200 10/300 SECカラム(ID番号0619081)を使用したHPLC(Agilent 1100)アッセイで定量化した。カラムを周囲温度にて0.5mL/分で運転した。カラムを、0.20Mリン酸カリウム、0.25M塩化カリウム(pH6.2±0.1)を用いて0.5mL/分で60分間平衡化した。吸光度を280nmで監視し、溶出ピーク面積を定量化した。吸光度を、1.15(mg/mL)−1*cm−1の減衰係数を使用して320nmのバックグラウンド吸光度を差し引いた280nmで測定した。
DsbA異質性、高分子量パーセント、単量体、及び断片を、GE Healthcare製のSuperdex 200 10/300 SECカラム(ID番号0619081)を使用して決定した。カラムを、0.20Mリン酸カリウム、0.25M塩化カリウム(pH6.2±0.1)中に、HPLC(Agilent 1100)で周囲温度にて0.5mL/分で60分間運転した。目標注入体積は50μgであり、吸光度を280nmで監視した。ピーク面積を、Agilent製のChemstationソフトウェアを使用して計算した。
SDS−PAGEを、4〜12%Bis−Trisプレキャストゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0322)を用いて行った。ゲルを、Heukeshoven銀染色方法を使用して染色した。
精製されたDsbAタンパク質を生成した。ウサギを免疫化し、最終採血をプールし、以下に記載されるように親和性精製した。
DsbAは、pH9.0の緩衝液を使用してカラムに結合し、装填することができた。QSFF溶出相は、3つの異なる溶出ピークを有した。溶出ピークにわたる選択されたQSFFプール画分を、Superdex 200 10/300 GL SECカラムを使用して分析した(図1)。低分子量不純物は、第1のピークで溶出する(画分3)。第2のピークは、高分子量種から主に成り(画分7)、第3のピークは、標的DsbAタンパク質を含有した(画分10及び11)。尾溶出ショルダーは、さらなる低分子量種及び微量のDsbAを含有した(画分15)。DsbAタンパク質を含有する画分をサイズ排除クロマトグラフィーデータに基づいてプールした。QSFFステップが高分子量及び低分子量種の部分的還元をもたらしたが、さらなる下流精製ステップを実施してDsbAの純度をさらに改善した。
DsbCを、二段階クロマトグラフィープロセスを使用して事前精製した(表6、プロセスA)。タンパク質は、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)開発の参照標準を生成するために、かつ分子プローブとして使用するための(ウサギにおける)DsbCに対する抗体を生成する免疫原として必要であった。
表6.DsbC精製プロセス
E.coli(62A7 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3、lacIq、lacL8、ompTΔ(nmpc−fepE)ΔdegP ilvG修復型と名付けられたW3110誘導体)(Joly,JC and Swartz JR 1994,Biochem.33:4231−4236、Joly,JC and Swartz JR 1997,Biochem.36:10067−10072、米国特許第5,789,199号)細胞ペースト(DsbCを含有するもの)を、溶解緩衝液(10mM MOPS、pH7.0、10mLの溶解緩衝液当たり1グラムの細胞ペースト)中に懸濁した。細胞溶解を、微小流動化剤(登録商標)(Microfluidics)を使用して行った(7〜8Kpsiで4回通過)。ポリエチレンイミン(PEI、綿状)を0.1%(m/v)の最終濃度になるまで溶解物に添加し、その後、室温で30分間混合した。PEI懸濁液を遠心分離し(10Krpm、45分間、18℃)、上清をクロマトグラフィー前に収集して、0.22μmのフィルターを介して濾過した。
合計1.8Lの浄化された遠心分離物(1.5M Tris塩基でpH8.0に条件付けられたもの)を、表7に記載されるように、結合及び溶出モードでDEAE Sepharose(登録商標)Fast Flow(GE Healthcare)を含有するカラムに装填した。このステップの最後に、DsbCを含有するタンパク質を694mg回収した。
表7.プロセスA DEAE Sepharose(登録商標)Fast Flowクロマトグラフィー
強陽イオン交換クロマトグラフィー培地、SP Sepharose(登録商標)Fast Flow(SP−FF、GE Healthcare)を、DEAE Sepharose(登録商標)Fast Flowクロマトグラフィープールからの宿主細胞タンパク質の除去について評価した。
表8.SP Sepharose Fast Flowクロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)をSP−FFプール中の残りの不純物の除去について評価した。プロセスCの開発時、5つの潜在的なHIC培地(Hi Propyl,Phenyl Sepharose(登録商標)6 Fast Flow(低置換)、Phenyl Sepharose(登録商標)6 Fast Flow(高置換)、Butyl Sepharose(登録商標)4 Fast Flow、及びOctyl Sepharose(登録商標)4 Fast Flow)を、SP−FFの初期評価について概説したもの(上述のプロセスB)と同じ1.0mLカラムプロセスを使用して評価した。クロマトグラフィー条件を表9に詳述する。
表9.プロセスC:DEAE−SPFF−HIC
精製:プロセスD
実験スキーム:位置2でのHIC、DEAEプール>HIC
位置3でのHIC、DEAEプール>SPFFプール>HIC
形式:重力(滴下方法)
HIC樹脂:Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(低置換)
装填密度:5mg/mL
緩衝液:
平衡化/洗浄1:0.6M硫酸ナトリウム+50mMリン酸塩(pH7)
洗浄2:0.1M硫酸ナトリウム+50mMリン酸塩(pH7)
溶出:PW(精製水)
平衡化(カラム):10カラム体積(CV)
装填:位置2でのHIC:5mgのDEAEプールを取り込み、それを希釈して、0.6M硫酸ナトリウム/50mMリン酸塩(pH7)の最終濃度を含有させた。最終pH7、約68mS/cmに調整した。
位置3でのHIC:5mgのSPFFプールを取り込み、それを希釈して、0.6M硫酸ナトリウム/50mMリン酸塩(pH7)の最終濃度を含有させた。最終pH7、約68mS/cmに調整した。
洗浄1:5CV
洗浄2:5CV
溶出:3CV
追加の3CV
塩基再生:0.1N NaOH(2CV)
DEAE−FFプールの精製を、Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow(低置換)を使用して拡大した。表10は、動作パラメータを列記する。主ピーク画分は、HICステップの7、8、9、10、及び11であった。
表10.Phenyl Sepharose Fast Flowクロマトグラフィー(低置換)
表11.Superdex 75サイズ排除クロマトグラフィー
製剤化バルクの安定性を、それを3回の凍結融解サイクルに−80℃以下の温度で供することによって評価した。凍結融解試料の分析を、SDS−PAGE及びHPLC−SECを使用して行った。
他の非DsbC不純物が最終製剤化バルク中に確実に存在しないようにするために、SDS−PAGEを行い、SyproRuby染色を使用して画像化した(Bio−Rad、図15)。
DsbC分子の同一性を、一組の特徴付けアッセイ(N末端配列分析、ペプチド質量フィンガープリント法(PMF)、CHIP TOFによるインタクト/還元質量)によって確認した。これらのアッセイにより、分子の正しい同一性が確認された。
超高純度DsbA及びDsbCに対して生成されたポリクローナル抗体を、治療用ポリペプチドの調製においてDsbA及びDsbCからの除去を測定するためのアッセイで使用するために生成した。以下の実施例は、ポリクローナルDsbA及びDsbC抗体を生成するために使用される精製方法を説明する。これらの重要な試薬は、DsbA及びDsbC免疫原とともに、特異的DsbA及びDsbC ELISAの開発に必要であった。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を使用してDsbA及びDsbC抗体の相対純度を決定し、タンパク質のモル質量を確認した。電気泳動をジスルフィド結合還元を用いて、また用いずに行い、抗体の共有結合凝集について評価した。
DsbA及びDsbC抗体の精製を、同じ抽出及びクロマトグラフィーステップを使用して並行して行った。このプロセスは、以下のものからなる。
ウサギ抗血清A、B、Cをプールした(体積=72mL(抗DsbA)、76mL(抗DsbC)。52mLの硫酸アンモニウム条件付け溶液(上記)を抗DsbA溶液に緩徐に添加し、55mLを添加中で緩徐に撹拌しながら抗DsbCに添加した。溶液を18℃の温度で45分間、13,000rpmで遠心分離した。硫酸アンモニウムペレット(DsbA及びDsbC抗体を含有するもの)を、親和性クロマトグラフィーの準備が整うまで−60℃以下で凍結させた。
抗DsbA及び抗DsbC 60%硫酸アンモニウムペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.2)中で再構成した後に、それらのそれぞれのDsbA−CPGまたはDsbC−CPG親和性カラムに装填した。
樹脂は、DsbA−CPGまたはDsbC−CPGであった。クロマトグラフィーは、結合及び溶出モードであった。床高さは、6.0cm(DsbA−CPG)または5.0cm(DsbC−CPG)であった。直径は、1.6cmであり、体積は、12.0mLまたは10.0mLであった。
表12.親和性クロマトグラフィー動作条件
より高いレベルの純度を得るために、Superdex 200カラム(GE Healthcare)を使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。抗DsbA親和性プールの量が限られているため、一定分量の抗DsbC親和性プールを最初に分画した。SECカラムの動作パラメータは、以下の通りであった。カラム体積は、1120mLであり、装填体積は、6mL以下(1CVの5%以下)であった。カラムを0.5mL/分の流量で3CVのPBS(pH7.2)で平衡化した。装填は、1サイクル当たり6.0mL以下であった。1サイクルを抗DsbAに実行し、2サイクルを抗DsbCに実行した。カラムを0.5mL/分で1CVのPBS(pH7.2)で展開した。各サイクルについて、ウサギ血清由来のpH調整親和性プールを、Amicon Ultra 10kDaフィルターを使用して6.0mLの最終体積に濃縮した。
表13.抗DsbC模擬プールのHPLC−SEC
抗DsbC親和性プール(非分画及び分画)を直接結合ELISA形式で評価して、より高い純度がより良好なアッセイ性能をもたらすのに必要であるかを判定した。2つのプール間で同等の用量応答曲線を達成し、高分子量種の除去が必要ではなかったことを示した(図16)。
SECステップを最終クロマトグラフィーステップとして最終精製プロセス(B)に追加して、低レベルの凝集体でのより高度の純度を確実にした。
試薬
コート抗体(ポリクローナル抗DsbAまたはポリクローナル抗DsbC)をPBSで約1.2mg/mLに希釈し、−60℃以下で保管した。融解後、コート抗体を、融解日から最大1週間、2〜8℃で保管した。標準材料(DsbAまたはDsbC)を100μg/mLに希釈し、−60℃以下で保管した。アッセイ対照源を標準曲線の低面積及び高面積内に入るようにアッセイ希釈剤で希釈し、−60℃以下で保管した。HRP−コンジュゲート(西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされるDsbAまたはDsbCに対する抗体)。融解後、HRP−コンジュゲート抗体を、融解日から最大1週間、2〜8℃で保管した。HRP−コンジュゲート抗DsbAストックIを、−10℃〜−30℃での保管のためにグリセロールでおよそ1:1に希釈した。HRP−コンジュゲート抗DsbCストックIを、−60℃での保管のためにアッセイ希釈剤でおよそ1:20に希釈した。
アッセイ希釈剤:0.15M塩化ナトリウム[NaCl]/0.1Mリン酸ナトリウム[NaPO4]/0.1%魚ゼラチン/0.05% Polysorbate 20/0.05% Proclin 300
洗浄緩衝液:PBS/0.05% Polysorbate 20
コーティング緩衝液:0.05M炭酸ナトリウム緩衝液
基質溶液:SureBlue Reserve(商標)TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard & Perry Labs[KPL]、カタログ番号53−00−00または等価物)
停止溶液:0.6N硫酸
標準、対照、及び試料調製
コート抗体ストックIをコーティング緩衝液で希釈して、標準曲線濃度及び所望の応答範囲を得た。100μLの希釈コート抗体ストックIをマイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで移し、2〜8℃で12〜72時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、プレート洗浄機を使用しておよそ400μLの洗浄緩衝液で3回吸引し、完全にブロットした。プレートを廃棄物リザーバー上で反転させても溶液がウェルから除去されなかった。およそ200μLのアッセイ希釈剤を各ウェルに添加し、撹拌しながら周囲温度で1〜2時間インキュベートした。洗浄ステップを繰り返した。
試料濃度を、最低5パラメータのロジスティック曲線当てはめプログラムを有するデータ処理ソフトウェアを使用して決定した。
MAb1を、適切な折り畳み及びジスルフィド結合の生成を支援するDsbA及びDsbCを過剰発現したE.coli細胞で産生した。簡潔には、MAb1、DsbA、及びDsbCを発現するE.coli細胞を溶解して遠心分離し、溶解物を浄化した。その後、遠心分離物をMabSelect Sureタンパク質Aカラム(MSS)に適用した。その後、MAb1を含有する溶出したMSS画分をCaptoAdhere(Capto)混合モードクロマトグラフィー、Poros 50 HS陽イオン交換クロマトグラフィー、及びQSFF陰イオン交換クロマトグラフィーに全て結合及び溶出モードで適用した。その後、MAb1を含有するプールされたQSFF画分を、限外濾過及び透析濾過を使用して濃縮して製剤化した。
抗体の精製に使用した回収プロセスを、宿主細胞タンパク質(E.coliタンパク質またはECP)のレベルを低減するその能力について評価した。ECPの定量を、以下に記載のELISAアッセイを使用してインプロセス試料及び濾過されたバルク試料で行った。これらのデータは、臨床抗体材料中のECPが回収プロセスによって50ng/mg未満の抗体レベルまで著しく低減されたことを実証する。
表17.精製画分の総相対DsbA含有量(ngのDsbA/mgの総タンパク質)
表19.精製画分の総相対DsbC含有量(ngのDsbC/mgの総タンパク質)
Claims (255)
- DsbAポリペプチドを含む細胞溶解物からの前記DsbAポリペプチドの精製方法であって、
a)ポリエチレンイミン(PEI)を、約0.01%〜約1.0%の最終濃度になるまで、前記DsbAポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、
b)遠心分離により前記細胞溶解物を浄化することと、
c)前記DsbAポリペプチドを含む前記浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
d)前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記DsbAポリペプチドを溶出させて、前記DsbAポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、
e)前記DsbAポリペプチドを含む前記陰イオン交換溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
f)前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料から前記DsbAポリペプチドを溶出させて、前記精製されたDsbAポリペプチドを含む陽イオン交換溶出物を生成することと、を含む、前記方法。 - 前記DsbAポリペプチドを含む前記細胞溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に前記PEI中に少なくとも約16時間保持される、請求項1に記載の方法。
- 前記溶解物中のPEIの前記最終濃度が約0.1%である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記DsbAポリペプチド及び前記PEIを含む前記溶解物がpH約7.0である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料が強陰イオン交換体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記強陰イオン交換体が第四級アミンを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第四級アミンが架橋アガロースに結合している、請求項5または6に記載の方法。
- 前記DsbAが、塩勾配を使用して前記陰イオンクロマトグラフィー材料から溶出される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩勾配が段階勾配である、請求項8に記載の方法。
- 前記浄化された溶解物がpH7.1の10mM MOPSを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbAが、以下のステップ:
約4カラム体積の約15%の約25mM Tris及び約250mM NaCl(約pH9.2)、
約4カラム体積の約20%の約25mM Tris及び約250mM NaCl(約pH9.2)、
DsbAが前記カラムから溶出するまで約25%の約25mM Tris及び約250mM NaCl(約pH9.2)で前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出される、請求項10に記載の方法。 - ステップb)の前記DsbAポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に0.22μmのフィルターに通される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)の前記DsbAポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前にpH約9.0に調整される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換溶出物が画分で収集される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、陽イオン交換クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも約55%のDsbAを含む画分がさらなる精製のために選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記陽イオン交換材料がスルホプロピル部分を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スルホプロピル部分が、架橋ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)マトリックスまたはその等価物に結合している、請求項17に記載の方法。
- ステップd)の前記陰イオン交換溶出物が、陽イオン交換クロマトグラフィー前にpH約5.0に調整される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbAが、塩勾配を使用して前記陽イオンクロマトグラフィー材料から溶出される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオンクロマトグラフィー材料が、5カラム体積の12.5mM MESで洗浄される、請求項20に記載の方法。
- 前記塩勾配が、15カラム体積にわたる約0%〜約60%の12.5mM MES及び1M NaCl勾配である、請求項20または21に記載の方法。
- 前記陽イオン交換溶出物が画分で収集される、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分がサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される、請求項23に記載の方法。
- 少なくとも約95%のDsbAを含む画分がプールされる、請求項24に記載の方法。
- 前記DsbAポリペプチドがEscherichia coli DsbAポリペプチドである、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbAポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記DsbAポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも約80%同一である、請求項27に記載の方法。
- 前記DsbAが細胞で発現される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が原核生物細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞がE.coli細胞である、請求項29または30に記載の方法。
- 前記細胞が、DsbAの内因性発現を超えるレベルでDsbAを発現するように操作される、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が微小流動化剤を使用して溶解される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって精製されたDsbAポリペプチドを含む組成物。
- 精製されたDsbAポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約95%の単量体DsbAポリペプチドを含む、前記組成物。
- 約2%未満の低分子量種を含む、請求項35に記載の組成物。
- 前記組成物が約1%未満の高分子量種を含む、請求項35または36に記載の組成物。
- 単量体DsbAポリペプチドの割合がサイズ排除クロマトグラフィーによって検出される、請求項35〜37のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が約5%未満の不純物を含む、請求項35に記載の組成物。
- 前記不純物が、天然DsbAに対して高分子量及び/または低分子量のポリペプチド種である、請求項39に記載の組成物。
- 前記不純物が、E.coliタンパク質(ECP)、DsbA凝集体、DsbA断片、核酸、または細胞培養培地成分のうちの1つ以上である、請求項39または40に記載の組成物。
- 前記DsbAが1回以上の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項34〜41のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記DsbAが3回の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項42に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの純度が、クロマトグラフィー、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウエスタンブロット分析のうちの1つ以上によって測定される、請求項34〜37または39〜43のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの純度が、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定される、請求項34〜44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの純度が、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される、請求項34〜45のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの純度が、蛍光タンパク質染色または銀染色を使用してSDSゲル電気泳動によって測定される、請求項34〜37または39〜44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の非DsbAポリペプチドの存在が、ウエスタンブロット分析により示される抗DsbA抗体と免疫反応しないゲル電気泳動によって特定される種の存在によって特定される、請求項47に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの凝集体の存在が、ウエスタンブロット分析による前記天然DsbAを超える分子量を有する種の存在によって特定される、請求項48に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbAポリペプチドの断片の存在が、ウエスタンブロット分析による前記天然DsbA未満の分子量を有する種の存在によって特定される、請求項48に記載の組成物。
- DsbAに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を請求項34〜50のいずれか一項に記載の組成物に曝露することを含む、前記方法。
- 前記動物から血清を収集することをさらに含み、前記血清がDsbAに特異的に結合する抗体を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記血清がDsbAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項52に記載の方法。
- 1つ以上のモノクローナル抗体が前記血清から単離される、請求項52または53に記載の方法。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項51〜54のいずれか一項に記載の方法。
- DsbAに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗DsbA抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度DsbAを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、前記クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、前記抗DsbA抗体を溶出させることと、を含む、前記方法。
- 超高純度DsbAを含む前記組成物が少なくとも約95%の単量体DsbAポリペプチドを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記超高純度DsbAが請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項56または57に記載の方法。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項56〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項56〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体の約1%未満が非DsbA化合物に特異的に結合する、請求項60に記載の方法。
- DsbAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、前記ポリクローナル抗体が動物を請求項34〜50のいずれか一項に記載の組成物に曝露することによって生成される、前記組成物。
- 前記ポリクローナル抗体が前記動物の前記血清から収集される、請求項62に記載の組成物。
- DsbAに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が動物を請求項34〜50のいずれか一項に記載の組成物に曝露することによって生成される、前記組成物。
- 前記抗体が請求項56〜61のいずれか一項に記載の方法によって精製される、請求項62〜64のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項62〜65のいずれか一項に記載の組成物。
- 試料中のDsbAの定量化方法であって、検出システムを使用して前記試料中のDsbAを検出することと、前記試料中で検出されたDsbAの量を超高純度DsbA参照標準の1つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度DsbA参照標準が少なくとも約95%の単量体DsbAポリペプチドを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記超高純度DsbA参照標準が請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項67または68に記載の方法。
- 前記検出システムが免疫アッセイである、請求項67〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが超高純度DsbAに特異的に結合する抗体を含む、請求項70に記載の方法。
- DsbAの存在及び/または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して前記試料中のDsbAを検出することと、前記試料中で検出されたDsbAの量を超高純度DsbA参照標準の1つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度DsbA参照標準が少なくとも約95%の単量体DsbAポリペプチドを含む、請求項72に記載の方法。
- 前記超高純度DsbA参照標準が請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項72または73に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが超高純度DsbAに特異的に結合する抗体を含む、請求項72〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 超高純度DsbAに特異的に結合する前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項75に記載の方法。
- 超高純度DsbAに特異的に結合する前記抗体が前記免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される、請求項75または76に記載の方法。
- 超高純度DsbAに特異的に結合する前記抗体が検出抗体として使用される、請求項75〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が検出剤にコンジュゲートされる、請求項78に記載の方法。
- 検出剤が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項75〜79のいずれか一項に記載の方法。
- DsbAに特異的に結合する前記抗体が請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項75〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbAがE.coli DsbAである、請求項72〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが宿主細胞内で調製される、請求項72〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞がE.coli細胞である、請求項83に記載の方法。
- 前記宿主細胞がDsbAを過剰発現する、請求項83または84に記載の方法。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項72〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項72〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項87に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド試料中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項72〜88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項89に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項89または90に記載の方法。
- 試料中のDsbAの検出のための免疫アッセイ方法であって、前記試料が組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株から得られ、前記方法が、
(a)DsbAに結合する捕捉抗体を前記試料と接触させて、それにより試料−捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、
(b)DsbAに結合する検出抗体を前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、
(c)前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料に結合している前記検出抗体を検出することと、を含む、前記方法。 - 標準滴定曲線を使用して結合している前記検出抗体のレベルを定量化することをさらに含む、請求項92に記載の方法。
- 結合している前記検出抗体のレベルに基づいて前記試料中に存在するDsbAの量を計算することをさらに含む、請求項93に記載の方法。
- 前記試料中に存在するDsbAの前記量が、前記標準滴定曲線を超高純度DsbA組成物で生成された標準滴定曲線と比較することによって決定される、請求項94に記載の方法。
- 前記超高純度DsbA組成物が少なくとも約95%の単量体DsbAポリペプチドを含む、請求項95に記載の方法。
- 前記組成物中の前記超高純度DsbAが請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項95または96に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が超高純度DsbAに特異的に結合する、請求項92〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が超高純度DsbAに特異的に結合する、請求項92〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 超高純度DsbAに特異的に結合する前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項98または99に記載の方法。
- DsbAに結合する前記検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされる、請求項92〜100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリクローナル抗体が請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、請求項92〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイがサンドイッチアッセイである、請求項92〜102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンドイッチアッセイが酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である、請求項103に記載の方法。
- 前記DsbAがE.coli DsbAである、請求項92〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物または前記宿主細胞株がE.coliから得られる、請求項92〜105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞株がDsbAを過剰発現する、請求項106に記載の方法。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項92〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項92〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項109に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項92〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項111に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項111または112に記載の方法。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、放出アッセイが、前記薬学的組成物の試料を請求項92〜113のいずれか一項に記載の免疫アッセイ方法に供することを含み、前記組成物中で検出されたDsbAの量が、前記薬学的組成物が動物への投与に好適であるかを決定する、前記品質アッセイ。
- 約1ppm未満の前記薬学的組成物中のDsbAの量が、前記薬学的組成物が前記動物への投与に好適であることを示す、請求項114に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞がE.coli細胞である、請求項114または115のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞がDsbAを過剰発現する、請求項114〜116のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項114〜117のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項114〜118のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項119に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項114〜120のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項121に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項122に記載の品質アッセイ。
- DsbCポリペプチドを含む細胞溶解物からの前記DsbCポリペプチドの精製方法であって、
a)ポリエチレンイミン(PEI)を、約0.01%〜約1.0%の最終濃度になるまで、前記DsbCポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、
b)遠心分離により前記細胞溶解物を浄化することと、
c)前記DsbCポリペプチドを含む前記浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
d)前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記DsbCポリペプチドを溶出させて、前記DsbCポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、
e)前記DsbCポリペプチドを含む前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)材料に適用することと、
f)前記HIC材料から前記DsbCポリペプチドを溶出させて、HIC溶出物を生成することと、
g)前記DsbCポリペプチドを含む前記HIC溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに適用することと、
h)前記サイズ排除クロマトグラフィーから前記精製されたDsbCポリペプチドを含む画分を収集することと、を含む、前記方法。 - 前記DsbCポリペプチドを含む前記細胞溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に前記PEI中に少なくとも約16時間保持される、請求項124に記載の方法。
- 前記溶解物中のPEIの前記最終濃度が約0.1%である、請求項124または125に記載の方法。
- 前記DsbCポリペプチド及び前記PEIを含む前記溶解物がpH約7.0である、請求項124〜126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料が弱陰イオン交換体である、請求項124〜127のいずれか一項に記載の方法。
- 前記弱陰イオン交換体が第四級アミンを含む、請求項128に記載の方法。
- 前記第四級アミンが架橋アガロースに結合している、請求項128または129に記載の方法。
- 前記DsbCが、塩勾配を使用して前記陽イオンクロマトグラフィー材料から溶出される、請求項124〜130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩勾配が線形勾配である、請求項131に記載の方法。
- 前記陰イオン交換材料が10mM MOPS中で洗浄される、請求項132に記載の方法。
- 前記塩勾配が、15カラム体積にわたる約0%〜約60%の10mM MOPS及び250mM NaCl勾配である、請求項133に記載の方法。
- ステップb)の前記DsbCポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に0.22μmのフィルターに通される、請求項124〜134のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)の前記DsbCポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前にpH約8.0に調整される、請求項124〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換溶出物が画分で収集される、請求項124〜136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、疎水性相互作用クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される、請求項137に記載の方法。
- 少なくとも約25%のDsbCを含む画分がさらなる精製のために選択される、請求項138に記載の方法。
- 前記HIC材料がフェニル部分を含む、請求項124〜139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フェニル部分が架橋アガロースに結合している、請求項140に記載の方法。
- 前記陰イオン交換溶出物が、HICクロマトグラフィー前に約0.54M硫酸ナトリウム及び約50mM PO4(約pH7)を含有するように条件付けられる、請求項124〜141のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbCが、水を使用して前記HIC材料から溶出される、請求項124〜142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC溶出物が画分で収集される、請求項140〜143のいずれか一項に記載の方法。
- DsbCを含む画分がプールされる、請求項144に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー材料が、架橋アガロースとデキストランとの球状複合体を含む、請求項124〜145のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイズ排除貫流物が画分で収集される、請求項146のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー前に限外濾過される、請求項146または147に記載の方法。
- DsbCを含む画分がプールされる、請求項146〜148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbCポリペプチドがEscherichia coli DsbCポリペプチドである、請求項124〜149のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbCポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項150に記載の方法。
- 前記DsbCポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約80%同一である、請求項151に記載の方法。
- 前記DsbCが細胞で発現される、請求項124〜152のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が原核生物細胞である、請求項153に記載の方法。
- 前記細胞がE.coli細胞である、請求項153または154に記載の方法。
- 前記細胞が、DsbCの内因性発現を超えるレベルでDsbCを発現するように操作される、請求項153〜155のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が微小流動化剤を使用して溶解される、請求項124〜156のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項124〜157のいずれか一項に記載の方法によって精製されたDsbCポリペプチドを含む組成物。
- 精製されたDsbCポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約95%の単量体DsbCポリペプチドを含む、前記組成物。
- 前記組成物が約2%未満の低分子量種を含む、請求項159に記載の組成物。
- 前記組成物が約1%未満の高分子量種を含む、請求項159または160に記載の組成物。
- 単量体DsbCポリペプチドの割合がサイズ排除クロマトグラフィーによって検出される、請求項159〜161のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が約5%未満の不純物を含む、請求項159に記載の組成物。
- 前記不純物が、天然DsbCに対して高分子量及び/または低分子量のポリペプチド種である、請求項163に記載の組成物。
- 前記不純物が、E.coliタンパク質(ECP)、DsbA凝集体、DsbC断片、核酸、または細胞培養培地成分のうちの1つ以上である、請求項163または164に記載の組成物。
- 前記DsbAが1回以上の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項162〜165のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記DsbCが3回の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項166に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbCポリペプチドの純度が、クロマトグラフィー、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウエスタンブロット分析のうちの1つ以上によって測定される、請求項158〜161または163〜167のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbCポリペプチドの純度が、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定される、請求項158〜168のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbCポリペプチドの純度が、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される、請求項158〜169のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbCポリペプチドの純度が、蛍光タンパク質染色または銀染色を使用してSDSゲル電気泳動によって測定される、請求項158〜161または163〜168のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の非DsbCポリペプチドの存在が、ウエスタンブロット分析により示される抗DsbC抗体と免疫反応しないゲル電気泳動によって特定される種の存在によって特定される、請求項171に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記DsbCポリペプチドの凝集体の存在が、ウエスタンブロット分析による前記天然DsbCを超える分子量を有する種の存在によって特定される、請求項172に記載の組成物。
- DsbCに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を請求項158〜173のいずれか一項に記載の組成物に曝露することを含む、前記方法。
- 前記動物から血清を収集することをさらに含み、前記血清がDsbCに特異的に結合する抗体を含む、請求項174に記載の方法。
- 前記血清がDsbCに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項175に記載の方法。
- 1つ以上のモノクローナル抗体が前記血清から単離される、請求項175または176に記載の方法。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項174〜177のいずれか一項に記載の方法。
- DsbCに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗DsbC抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度DsbCを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、前記クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、前記抗DsbC抗体を溶出させることと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度DsbCが少なくとも約95%の単量体DsbCポリペプチドを含む、請求項179に記載の方法。
- 前記超高純度DsbCが請求項66〜99のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項179または180に記載の方法。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項179〜181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が請求項174〜176のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項179〜182のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体の約1%未満が非DsbC化合物に特異的に結合する、請求項183に記載の方法。
- DsbCに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、前記ポリクローナル抗体が動物を請求項158〜173のいずれか一項に記載の組成物に曝露することによって生成される、前記組成物。
- 前記ポリクローナル抗体が前記動物の前記血清から収集される、請求項185に記載の組成物。
- DsbCに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が動物を請求項158〜173のいずれか一項に記載の組成物に曝露することによって生成される、前記組成物。
- 前記抗体が請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法によって精製される、請求項185〜187のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項185〜187のいずれか一項に記載の組成物。
- 試料中のDsbAの定量化方法であって、検出システムを使用して前記試料中のDsbCを検出することと、前記試料中で検出されたDsbCの量を超高純度DsbC参照標準の1つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度DsbC参照標準が少なくとも約95%の単量体DsbCポリペプチドを含む、請求項190に記載の方法。
- 前記超高純度DsbC参照標準が請求項124〜157のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項190または191に記載の方法。
- 前記検出システムが免疫アッセイである、請求項190〜192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが超高純度DsbCに特異的に結合する抗体を含む、請求項193に記載の方法。
- DsbCの存在及び/または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して前記試料中のDsbCを検出することと、前記試料中で検出されたDsbCの量を超高純度DsbC参照標準の1つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度DsbC参照標準が少なくとも約95%の単量体DsbCポリペプチドを含む、請求項195に記載の方法。
- 前記超高純度DsbC参照標準が請求項124〜157のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項195または196に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが超高純度DsbCに特異的に結合する抗体を含む、請求項195〜197のいずれか一項に記載の方法。
- 超高純度DsbCに特異的に結合する前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項198に記載の方法。
- 超高純度DsbCに特異的に結合する前記抗体が前記免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される、請求項198または199に記載の方法。
- 超高純度DsbCに特異的に結合する前記抗体が検出抗体として使用される、請求項198〜200のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が検出剤にコンジュゲートされる、請求項201に記載の方法。
- 検出剤が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項198〜202のいずれか一項に記載の方法。
- DsbCに特異的に結合する前記抗体が請求項106〜108のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項198〜203のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DsbCがE.coli DsbCである、請求項195〜204のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが宿主細胞内で調製される、請求項195〜205のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞がE.coli細胞である、請求項206に記載の方法。
- 前記宿主細胞がDsbCを過剰発現する、請求項206または207に記載の方法。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項195〜208のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項195〜209のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項210に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド試料中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項195〜211のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項212に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項212または213に記載の方法。
- 試料中のDsbCの検出のための免疫アッセイ方法であって、前記試料が組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株から得られ、前記方法が、
(a)DsbCに結合する捕捉抗体を前記試料と接触させて、それにより試料−捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、
(b)DsbCに結合する検出抗体を前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、
(c)前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料に結合している前記抗体を検出することと、を含む、前記方法。 - 標準滴定曲線を使用して結合している前記検出抗体のレベルを定量化することをさらに含む、請求項215に記載の方法。
- 結合している前記検出抗体のレベルに基づいて前記試料中に存在するDsbCの量を計算することをさらに含む、請求項216に記載の方法。
- 前記試料中に存在するDsbCの前記量が、前記標準滴定曲線を超高純度DsbC組成物で生成された標準滴定曲線と比較することによって決定される、請求項217に記載の方法。
- 前記超高純度DsbC組成物が少なくとも約95%の単量体DsbCポリペプチドを含む、請求項218に記載の方法。
- 前記組成物中の前記超高純度DsbCが請求項66〜99のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項218または219に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が超高純度DsbCに特異的に結合する、請求項215〜220のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が超高純度DsbCに特異的に結合する、請求項215〜221のいずれか一項に記載の方法。
- 超高純度DsbCに特異的に結合する前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項221または222に記載の方法。
- DsbCに結合する第2の検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされる、請求項215〜217のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリクローナル抗体が請求項174〜176のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、請求項215〜224のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイがサンドイッチアッセイである、請求項215〜225のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンドイッチアッセイが酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である、請求項226に記載の方法。
- 前記DsbCがE.coli DsbCである、請求項215〜227のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物または前記宿主細胞株がE.coliから得られる、請求項215〜228のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞株がDsbAを過剰発現する、請求項219に記載の方法。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項215〜230のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項215〜231のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項232に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項215〜233のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項234に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項234または235に記載の方法。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、前記品質アッセイが、前記薬学的組成物の試料を請求項49〜56のいずれか一項に記載の免疫アッセイ方法に供することを含み、前記免疫アッセイにおけるDsbCの検出が、前記薬学的組成物が動物への治療的投与に好適ではないことを示す、前記品質アッセイ。
- 約1ppm未満の前記薬学的組成物中のDsbCの量が、前記薬学的組成物が前記動物への投与に好適であることを示す、請求項237に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞がE.coli細胞である、請求項237または238のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞がDsbCを過剰発現する、請求項237〜239のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が細胞溶解物である、請求項237〜240のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項237〜241のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項242に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンである、請求項237〜243のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項244に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項245に記載の品質アッセイ。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のDsbAの検出のためのキットであって、請求項51〜55のいずれか一項に記載の方法によって調製された抗DsbA抗体、または請求項56〜61のいずれか一項に記載の抗DsbA抗体の組成物を含む、前記キット。
- 前記キットが、試料中のDsbAを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための、かつ/または陽性対照として使用するための超高純度DsbAをさらに含む、請求項247に記載のキット。
- 前記超高純度DsbAが請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項248に記載のキット。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のDsbCの検出のためのキットであって、請求項174〜178のいずれか一項に記載の方法によって調製された抗DsbC抗体、または請求項185〜189のいずれか一項に記載の抗DsbC抗体の組成物を含む、前記キット。
- 前記キットが、試料中のDsbCを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための、かつ/または陽性対照として使用するための超高純度DsbCをさらに含む、請求項250に記載のキット。
- 前記超高純度DsbCが請求項124〜157のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項251に記載のキット。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のDsbA及びDsbCの検出のためのキットであって、a)請求項51〜55のいずれか一項に記載の方法によって調製された抗DsbA抗体、または請求項56〜61のいずれか一項に記載の抗DsbA抗体の組成物と、b)請求項174〜178のいずれか一項に記載の方法によって調製された抗DsbC抗体、または請求項185〜189のいずれか一項に記載の抗DsbC抗体の組成物と、を含む、前記キット。
- 前記キットが、試料中のDsbA及び/もしくはDsbCを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための、かつ/または陽性対照として使用するための超高純度DsbA及び超高純度DsbCをさらに含む、請求項253に記載のキット。
- 前記超高純度DsbAが請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法に従って調製され、かつ/または前記超高純度DsbCが請求項124〜157のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項254に記載のキット。
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