JP2023540734A - 夾雑リパーゼ活性を検出する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、発色団 ４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を４－ＭＵエステルの形で含む基質の加水分解を測定することにより、組換えタンパク質のサンプル中の夾雑リパーゼ活性を検出する方法であって、前記４－ＭＵエステルが、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ６～Ｃ１６） ４－ＭＵエステルである方法に関する。さらに、組換えタンパク質のサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットが提供される。

Description

本発明は、組換えタンパク質のサンプル中の夾雑リパーゼ活性を検出する方法に関する。より具体的には、前記方法は、少なくとも１つのサンプル（ＩＰＣサンプルなど）を、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ６～Ｃ１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む反応溶液と接触させる工程；並びに前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、夾雑リパーゼ活性を検出する工程を含む。さらに、ＩＰＣサンプルのような、組換えタンパク質を含むサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットであって、（ｉ）約４から約９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、及び（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ６からＣ１６）４－ＭＵエステルである）を含むキットが提供される。

治療薬としてのタンパク質は、ここ数十年で増々一般的になってきている。モノクローナル抗体のような、治療用タンパク質を含む製剤は、しばしば１００mg/mL以上の高タンパク質濃度を含有し、そしてしばしば界面活性剤の存在を必要とする。その生体適合性と低毒性のために、バイオ医薬品産業において最も広く使用されている界面活性剤は、ポリソルベート（ＰＳ）、例えばポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン モノラウラート、Ｔｗｅｅｎ２０（商標登録））又はポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン モノオレアート、Ｔｗｅｅｎ８０（商標登録））である。

ポリソルベートは、部分的に脂肪酸でエステル化された約２０個の重合したエチレンオキシド部分を伴う、ソルビトール及びその無水物の不均一な混合物である。しかし、ポリソルベートは分解されやすく、そのことが製品の品質に悪影響を及ぼす可能性がある。分解は、結果としてもたらされる製剤中の減少したポリソルベート濃度だけでなく、ポリソルベート分解物（脂肪酸及びポリオキシエチレン側鎖等）の不溶性物質由来の肉眼で見える粒子や肉眼では見えない（sub-visible）粒子の形成によっても、製品の品質に影響を及ぼす場合がある。ポリソルベートは、化学的又は酵素的に分解される可能性がある。化学的なポリソルベートの分解は主に酸化反応によって引き起こされ、これはとりわけアルデヒド、ケトン及び脂肪酸の生成をもたらす。酵素的なポリソルベートの分解は、ポリエトキシ化ソルビタンと脂肪酸とを結合しているエステル結合の加水分解によって特徴づけられる(Dwivedi et al., 2018, International Journal of Pharmaceutics 552:442-436)。ポリソルベートの酸化分解は長い間知られていたが、抗体製剤中のポリソルベートの酵素的加水分解は、最近になってようやく主要な分解経路の１つと考えられるようになった。近年、ポリソルベートの分解は、バイオ医薬品業界における主要な課題として浮上している。

最終的な医薬品（drug product）（ＤＰ）中に含有される、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のリパーゼ又は他の酵素の残存する加水分解活性は、ポリソルベートの分解をもたらしうることが報告されている。抗体製剤中のポリソルベートの分解におけるリパーゼの役割は、Ｃｈｉｕらによってさらに強調されており、この中では、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）ノックアウトＣＨＯ細胞から採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）が、ＰＳ２０及びＰＳ８０の分解を野生型と比較して減少させている(Chui et al., 2017, Biotechnol. Bioeng. 114, 1006-1015)。ポリソルベートの分解に対する、個々の精製工程及び条件の影響を測定するには数週間を要するため、治療用タンパク質の生産における、上流及び特に下流の生産プロセスに、必要な変更及び適応を行うことは困難である。

ポリソルベートの含有量及び分解は、様々な分析技術を用いて研究することができる。ポリソルベートの定量に最も一般的に使用される方法は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣなど）であり、これは、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）及び荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）とさらに組み合わせてよい。ポリソルベートの含有量の測定が可能な他の技術は、蛍光ミセルアッセイ（ＦＭＡ）又はソルビタン環のチオシアン酸コバルト若しくはチオシアン酸鉄（ＩＩＩ）との化学的錯体生成からなる。しかし、精製プロセスにおける変更が、ポリソルベート分解の原因となる加水分解活性を減少させるという点で成功したかどうかを決定するためには、関心対象のサンプルにポリソルベートをスパイクし、その分解を前記のように分析する必要がある。したがって、典型的には、ポリソルベートの分解は、ポリソルベート含有量の減少を経時的に監視することによって評価される。しかし、ポリソルベートの分解は遅いプロセスであり、数週間又は数カ月かかる場合がある。さらに、前記分析は、複雑であり且つ時間がかかる。

前記医薬品におけるポリソルベートの酵素的分解を最小にする精製条件を開発するために、様々なサンプルに容易に適合でき、且つ医薬品サンプルの原薬中のポリソルベートの分解の原因となる加水分解活性についての予測情報を提供する、高感度であり、高速で信頼性のある自動化されたハイスループットアッセイが必要とされている。そのようなアッセイは、標的タンパク質と共に共精製された、ポリソルベートの分解活性が最小化されるため、製品の品質が向上した原薬を製造するためのプロセス開発を導くツールとして有用である。

蛍光基質を用いたインビトロでのリパーゼの加水分解活性の検出は、当該技術分野で知られているが、これらの従来技術のアッセイは、組換えタンパク質調製物中の夾雑リパーゼ活性（前記組換えタンパク質（関心対象のタンパク質）と共に、真核細胞から共精製されただけのもの）を短時間で確実に検出するのに十分な感度がない。例えば、都築ら(Biosci. Biotechnol. Biochem, 2001, 65(9): 2078-2082)は、微生物由来のいくつかのリパーゼの活性を、蛍光基質を使用して高濃度で分析し、特定のリパーゼの疎水性の強い基質の加水分解を、ＤＭＳＯが増加させることを見出している。ＤＭＳＯは、ミセルを形成する界面活性剤ではない、基質を可溶化するために常用される有機溶媒である。Ｓｕｌｃｉｅｎｅら(Acta Paediatrica, supplement, 2018, 116:1049-1055)は、エポキシ化油を生産するための、酵母由来の固定化された脂肪分解酵素の使用を開示し、蛍光基質を用いる、これらの濃縮されたリパーゼ－ナノ粒子コンジュゲートのリパーゼ活性の検出を記載しているが、正確な条件は開示していない。同様に、Ｙｏｏら(Cell Chemical Biology, 2020, 27: 143-157)は、リパーゼ活性を検出するための蛍光基質アッセイを開示し、分析の前に、高濃度のリパーゼｒＰｆＭＡＧＬＬＰを可溶化するためにＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用しているが、反応溶液の一部としては使用していない。国際公開公報第２０１０／０２４９２４号は、蛍光基質を用いて大腸菌中で発現したリパーゼをスクリーニングするためのアッセイを開示しているが、ここでもまた、前記アッセイは、真核細胞から精製された組換えタンパク質サンプル中の夾雑リパーゼ活性を検出するためには使用されていない。これらの先行技術のアッセイのいずれもまだ、真核細胞において産生された組換えタンパク質サンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定していない。

Ｍｅｎｄｅｎら，２０１９(Journal of Enzyme Inhibition of Medicinal Chemistry, 34(1): 1474-1480)は、４－メチルウンベリフェリル ブチラート（４－ＭＵＢ）及びパルミタート（４－ＭＵＰ）を基質として用い、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａリパーゼ（ＣＲＬ）アイソフォームの規定された酵素抽出物のリパーゼ活性を検出して、阻害剤トロポロンの作用機序を検証する、リパーゼ活性アッセイを報告している。疎水性である脂肪酸尾部の、長さに伴う本質的な溶解性の低下、及び塩基性のpH範囲における前記基質の自己触媒作用を含む、前記アッセイに対する限界が報告されている。さらに、前記アッセイでは界面活性剤が使用されていない。より最近では、Ｊａｈｎら，２０２０(Pharm. Res. 37(118): 2-13)が、４－メチルウンベリフェリル オレアート（４－ＭｕＯ）を基質として用いる、採取した細胞培養液のサンプル中のポリソルベート分解を測定するのに使用するための、発色団ベースのリパーゼ活性アッセイを報告している。しかし、感度が中程度で、２４時間以上のインキュベーション時間が未だに必要である。

したがって、関連するサンプル中のリパーゼ活性を短時間で測定できる、高感度の改良された方法が未だに必要である。

本発明は、組換えタンパク質を含むサンプル中の（夾雑）リパーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程（前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む）；（ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；並びに（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵ（これは、４－ＭＵエステルの加水分解生成物である）の蛍光強度を検出することによって、（夾雑）リパーゼ活性を検出する工程を含み；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する方法に関する。前記方法は、インビトロでの方法を指すものと理解されるべきである。特定の実施態様では、反応混合物中の前記サンプル及び基質は、２分と５時間未満の間、及び２分と３時間未満、２分と２時間未満、又は２分と０．５時間未満の間のいずれかの時間、インキュベートされる。前記少なくとも１つのサンプルは、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）、工程内管理（in-process control）（ＩＰＣ）サンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルであってよい。リパーゼ活性を検出するための前記サンプル中の組換えタンパク質は、好ましくは、抗体、抗体断片、抗体由来分子又は融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）などの治療用タンパク質である。本発明によれば、リパーゼ活性を検出するための前記サンプル中の組換えタンパク質は、リパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を含まない。したがって、前記少なくとも１つのサンプル中で検出されるあらゆるリパーゼ活性は、夾雑リパーゼ活性であり、且つ／又は、真核細胞由来の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のような、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質に由来している。

好ましい実施態様では、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択され、より好ましくは、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。本発明の好ましい実施態様によれば、前記界面活性剤は、反応混合物中のその臨界ミセル濃度を超える、反応混合物中の最終濃度を有する。前記非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２など）又はサポニンであってよい。好ましくは、前記非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳである。ＣＨＡＰＳは、約８mMから約２０mM、好ましくは約８mMから約１５mM、より好ましくは約１０mMの、反応混合物中の最終濃度で提供されてよい。適切な緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む。好ましくは、前記緩衝液は、約５から約７．５のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液は、約５．５から約７．５のpHを有する。特定の実施態様では、前記緩衝液は、少なくとも約pH ５から少なくとも約pH ７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である。

任意選択的な非緩衝性塩は、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２であってよく、好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌである。非緩衝性塩は、約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMの濃度で反応混合物中に提供されてよい。反応混合物中の非緩衝性塩のイオン強度は、好ましくは約２００mM以下、より好ましくは約１７０mM以下、より好ましくは約１５０mM以下、例えば反応混合物中約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMである。あるいは、又はさらに、反応混合物中の緩衝液と非緩衝性塩の累積イオン強度は、約４５０、好ましくは約４００mM以下、より好ましくは約３５０mM以下であってよい。

別の態様では、本発明は、関心対象の組換えタンパク質を製造する方法であって、（ｉ）細胞培養において関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養する工程；（ｉｉ）前記組換えタンパク質を採取する工程；（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を精製する工程；及び（ｉｖ）任意選択的に、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程；及び（ｖ）工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）において、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程を含み、前記方法が、前記組換えタンパク質を含むサンプル中の（夾雑）リパーゼを検出する事をさらに含み、この工程が、（ａ）工程（ｖ）の、真核細胞中で産生された前記組換えタンパク質を含む前記少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程であって、前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む工程；（ｃ）前記サンプル及び基質を、反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、（夾雑）リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出する工程を含む、方法に関する。特定の実施態様では、前記方法は、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、前記サンプルが、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物である、工程（ｉｉ）；前記サンプルが、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである、工程（ｉｉｉ）；及び／又は前記サンプルが、原薬サンプル又は医薬品サンプルである、工程（ｉｖ）において得ることを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、工程（ｉｉｉ）において得る工程を含み、前記工程（ｉｉｉ）が、少なくとも１つのサンプルを、アフィニティークロマトグラフィーの前後、及び／又は酸処理の前後、酸処理に続く深層濾過の前後、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーの前後に得ることを含む。

別の態様では、本発明は、ＩＰＣサンプルなどの、組換えタンパク質を含むサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットであって、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６からＣ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩、及び／又は（ｖ）任意選択的に希釈用の水を含む、キットに関する。特定の実施態様では、前記緩衝液、前記界面活性剤及び前記任意選択的な非緩衝性塩は、アッセイ緩衝液として予め混合される。好ましくは、当該アッセイ緩衝液は、最終反応混合物に対して、少なくとも約３倍に濃縮、又は約３倍から約５倍に濃縮される。あるいは、前記アッセイ緩衝液は、乾燥混合物として提供される。そのような乾燥混合物は、水で再構成されて、最終反応混合物に対して少なくとも約３倍に濃縮又は５倍濃に濃縮された当該アッセイ緩衝液を提供するものであってよい。あるいは又はさらに、前記緩衝液、前記界面活性剤、前記基質及び任意選択的な非緩衝性塩は、あらかじめ混合され、マスター混合物としてサンプルに加えられ、前記マスター混合物は、反応混合物の約８０％（v/v）から約７０％（v/v）、好ましくは反応混合物の約７５％で提供される。

好ましい実施態様では、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及びメチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。前記キットは、基質を溶解するための有機溶媒、又は有機溶媒に溶解された基質、及び／又は９６のウェル又は９６の倍数のウェルを有する１つ以上のマイクロタイタープレートをさらに含んでもよい。前記非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２など）及びサポニンであってよい。好ましくは、前記非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳである。特定の実施態様では、前記緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ－プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む。好ましくは、前記緩衝液は、約５から約７．５のpHを有し、より好ましくは、前記緩衝液は、約５．５から約７．５のpHを有する。特定の実施態様では、前記緩衝液は、少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８までの緩衝範囲を有する多成分緩衝液である。前記任意選択的な非緩衝性塩は、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２であってよく、好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌである。

基質４－ＭＵＤの加水分解反応を示す。 可変pHでの様々なバルク原薬（ＢＤＳ）中のリパーゼ活性の検出である。バルク原薬Ａ～Ｂ及びＤ～Ｅ（モノクローナル抗体及び抗体様フォーマット（formats））サンプルの加水分解活性は、示されているようにpH４とpH８の間の種々のpHで測定された。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５m M酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施された。 アッセイ緩衝液中の４－ＭＵＤの溶解度である。０から６０μMの４－ＭＵＤの溶解度を、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ４～８）中で、光散乱実験を用いて試験した。 バルク原薬（ＢＤＳＤ）における加水分解活性のミカエリス・メンテン反応速度である。アッセイは、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中で、４－ＭＵＤの濃度を変えて（１．５６２５μM～１５０μM）実施された。 ４－ＭＵＤの溶解度を、１cmマクロキュベットにおいて、蛍光分光計（λ_ｅｍ＝４００nm、λ_ｅｘ＝４００nm）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、２０mM ＣＨＡＰＳ、pH ７）中で、光散乱実験を用いて試験した。 ４－ＭＵＢ及び４－ＭＵＤの自己加水分解である。蛍光を、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、各々３０μM ４－ＭＵＢ又は４－ＭＵＤで、１８００秒間監視した。 バルク原薬（ＢＤＳ）中のリパーゼ活性に対するＣＨＡＰＳの影響である。（Ａ）ＢＤＳ Ｇのサンプル及び緩衝液対照の加水分解活性が、ＣＨＡＰＳを加えて、又は加えずに測定され、経時的に放出された４－ＭＵ（μM）が提供される。（Ｂ）ＢＤＳ Ｂ，ＢＤＳ Ｇ及びＢＤＳ Ｆ（モノクローナル抗体及び抗体様フォーマット）サンプルの加水分解活性を、ＣＨＡＰＳを加えて、又は加えずに測定した。各製品についての、ブランクを差し引いたデータの、ＣＨＡＰＳありでの加水分解活性に対して正規化された活性が提供される。さらに、限外濾過／透析濾過後の代表的なＩＰＣサンプル（UFDF Product D）が示される。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、ボトムリードモード）を使用して、１０mM ＣＨＡＰＳを含むか又は含まないＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施された。 イオン強度に対する加水分解活性の依存性である。例示的な医薬品（製品Ｅ）サンプルの加水分解活性が、様々な濃度のＮａＣｌ（７．８１２５mM～１０００mM）の存在下で測定された。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで行われた。 ＰＳ２０による加水分解活性の競合的阻害である。医薬品サンプルの加水分解活性が、様々な濃度のＰＳ２０（０．０１２５mg/mL～３．２mg/mL）の存在下で測定された。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（５０mM 酢酸、５０mM ＭＥＳ、１００mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施された。 アッセイ緩衝液中での、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００又はＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びアラビアゴムを使用した加水分解活性の比較である。ＰＰＬ（Ａ）、バルク原薬（ＢＤＳ）Ｂ（Ｂ）、及びＢＤＳ Ｅ（Ｃ）の、反応混合物中ＰＰＬ ０．０２４mg/mL又はＢＤＳ ２．４mg/mLでの加水分解活性が、１０mM ＣＨＡＰＳ（上の黒い線）、０．２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（中の明るい灰色の線）、又は０．２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び０．１２５％ アラビアゴム（下の濃い灰色の線）のいずれかで、標準的な条件（ＡＭＴ緩衝液、５．５）で測定された。 蛍光分光計（Ａ）及びマイクロプレートリーダー（Ｂ）を用いて測定された、ある製品（モノクローナル抗体）の様々なＩＰＣサンプル中のリパーゼ活性の比較である。すべての測定は、３μM ４－ＭＵＤを含むリン酸アッセイ緩衝液（８１mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１９mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ７．４）を用いて実施された。蛍光分光計では、１cmのマクロキュベットを使用し、マイクロプレートリーダーではブラック９６ウェルプレート（トップリードモード）を使用し、いずれもλ_ｅｍ＝４５０nm及びλ_ｅｘ＝３４０nmとした。様々なＩＰＣサンプルは、以下に示す通りである：プロテインＡ溶出緩衝液（ＰｒｏｔＡ緩衝液）と製品プール（Ｐｒｏｔ Ａ Ｐｒｏｄ Ｐ）、中和酸処理製品プール（Ｎｅｕｔｒａｌ．ＡＴ Ｐｒｏｄ Ｐｏｏｌ)、深層濾過製品プール（Ｄｅｐｔｈ．ｆｉｌｔｒ．Ｐｒｏｄ Ｐ）、陽イオン交換クロマトグラフィー緩衝液（ＣＩＥＸ緩衝液）及び製品プール（ＣＩＥＸ Ｐｒｏｄ Ｐ）、ウイルス濾過製品プール（Ｖｉｒｕｓ ｆｉｌｔｒ．Ｐｒｏｄ Ｐ）、３０kD 限外濾過／透析濾過緩衝液（ＵＦ／ＤＦ緩衝液）及び製品プール（ＵＦ／ＤＦ Ｐｒｏｄ Ｐ）、製剤緩衝液、原薬（ＤＳ）。 オルリスタットによるポリソルベートの分解の阻害である。０．２mg/mL ＰＳ２０を含む医薬品サンプル（製品Ｄ）を、いくつかの採取点（pull point）を設けて最大５６日間、室温でインキュベートした。残存するＰＳ２０の含有量を、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を用いて測定した。１μM オルリスタットは、対照の反応（ＤＭＳＯのみ）と比較して減少したＰＳ２０の分解をもたらした。 オルリスタットによる加水分解活性の阻害である。医薬品サンプル（製品Ｄ）の加水分解活性が、様々な濃度のオルリスタット（７．３nM～２０μM）の存在下で測定された。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイバッファー（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施された。結果は、４－ＭＵＤアッセイを使用して監視された加水分解活性と同様に、オルリスタットが、ポリソルベートの分解の原因となる加水分解活性を阻害していることを示唆している。 ＰＳでスパイクされたＩＰＣサンプル（製品Ｂ）におけるＰＳ分解と、４－ＭＵＤアッセイで測定された加水分解活性の比較である。ＰＳ分解はＦＭＡアッセイを用いて測定され；加水分解活性（４－ＭＵＤアッセイ）は、１cmマクロキュベットにおいて、蛍光分光計（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３４０nm）を使用して、３μM ４－ＭＵＤを含有するリン酸アッセイ緩衝液（１００mM ＮａＨＰＯ_４、１４０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ７．４）を用いて実施された。様々なＩＰＣサンプルは、以下に示す通りである：プロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）、深層濾過製品（Ｃｕｎｏ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ）、バルク原薬（ＢＤＳ）。

詳細な説明
一般的な実施態様の「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様の「からなる」を包含する。さらに、単数形と複数形は、限定的に使用されない。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数形のみを指定すると明示されていない限り、単数形と複数形の両方を指定する。

本明細書で使用される用語「サンプル」は、組換えタンパク質を含むいずれかのサンプルを指し、前記組換えタンパク質は、細胞培養において真核細胞で産生される。前記少なくとも１つのサンプルは、例えば、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬（本明細書ではバルク原薬とも呼ばれる）サンプル、又は組換えタンパク質（抗体、抗体断片、抗体由来分子又は融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）など）を含む医薬品サンプルであってよい。本明細書で使用されるとき、前記サンプルに含まれる組換えタンパク質は、リパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を含まない。したがって、サンプル中に検出されるあらゆるリパーゼ活性は、夾雑リパーゼ活性であり、且つ／又は、真核細胞に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの、リパーゼ活性を有する夾雑タンパク質に由来し、少なくとも１つのその夾雑タンパク質である。

本明細書で使用される用語「夾雑」又は「混入」は、望ましくない、及び／又は意図しない物質であって、非脂肪分解活性を有する他の圧倒的に多く産生された物質（関心対象のタンパク質のような）と比較しての、又は医療処置用タンパク質（例えば、抗体又は抗体様化合物）の微量成分に過ぎないと見なしうる物質（例えば、宿主細胞タンパク質が伴う脂肪分解活性、及び／又は加水分解活性（例えばリパーゼ活性）を有する少なくとも１つのタンパク質又は物質）の存在を指す。本発明の文脈では、加水分解活性、特にリパーゼ活性は、組換えタンパク質と共精製され得るそのポリソルベート分解能のために望ましくない。これは特に、最終的に製剤化されたタンパク質調製物に適用され、これは好ましくは、そのような望ましくない因子を、総タンパク質含有量と比較して１％未満（w/w）、好ましくは０．１％未満（w/w）、より好ましくは０．０１％未満（w/w）しか含まない。

本明細書で使用されるとき、用語「リパーゼ活性」は、脂質（脂肪酸エステル等）中のエステル結合の加水分解を触媒する物質、典型的にはタンパク質（酵素）の活性を指す。リパーゼは、加水分解とも呼ばれる水との化学反応で、エステルを酸とアルコールに分解する加水分解酵素である。リパーゼは、例えば、カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）、（ＥＣ３．１．１．２３）、ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）、リポタンパク質リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３４）又はホルモン感受性リパーゼ（ＥＣ３．１．１．７９）などのカルボン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．１）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）、ホスホイノシチド ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．１１）、グリコシルホスファチジルイノシトール ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．５０）又はＮ－アセチルホスファチジルエタノールアミン－加水分解性ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．５４）などのリン酸ジエステル ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．４）；又はスフィンゴ糖脂質デアシラーゼ（ＥＣ３．１．１．６９）であってよい。

用語「タンパク質」は、「アミノ酸配列」又は「ポリペプチド」と互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、反応（グリコシル化、アセチル化、リン酸化、糖化又はタンパク質プロセッシングを含むが、これらに限定されない）を通じて翻訳後修飾されているタンパク質を含む。ポリペプチドの構造中での修飾及び変更（例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入）を、分子がその生物学的機能活性を維持している一方で、行うことができる。例えば、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列中で、特定のアミノ酸配列の置換を行うことができ、同じ性質を有するタンパク質を得ることができる。

本明細書で使用される用語「組換えタンパク質」は、分子クローニングなどの組換え技術によって生成されたタンパク質に関するものであり、関心対象の組換えタンパク質と呼ばれる場合がある。本明細書で使用されるとき、前記組換えタンパク質は、例えば精製されるサンプル中の、関心対象のタンパク質である。そのような方法は、多数のソースから遺伝物質を寄せ集めるか、又は自然には存在しない配列を作成する。組換えタンパク質は、典型的には、細胞培養におけるタンパク質の産生に使用されるレシピエントの宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞）とは異なる細胞又は生物、あるいは異なる種由来の配列に基づくか、又は、融合タンパク質などの人工的な配列に基づく。本発明の文脈において、前記組換えタンパク質は、関心対象のタンパク質であり、好ましくは、抗体、抗体断片、抗体由来分子（例えば、ｓｃＦｖ、二重若しくは多重特異性抗体）又は融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）などの治療用タンパク質である。したがって、一実施態様では、前記組換えタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体由来分子及び融合タンパク質からなる群より選択される。

本明細書で使用される用語「真核細胞」は、核膜内（nuclear envelop）の核を有する細胞を指し、動物細胞、ヒト細胞、植物細胞及び酵母細胞を含む。本発明において、「真核細胞」は特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＨＥＫ２９３細胞由来の細胞などの哺乳類細胞、及び酵母細胞を包含する。

用語「原薬（ＤＳ）」又は「バルク原薬（ＢＤＳ）」は、本明細書で同義的に使用され、賦形剤と共に製剤化された医薬品有効成分（ＡＰＩ）を指す。前記ＡＰＩは、ＡＰＩの送達を補助する賦形剤とは対照的に、体内で治療効果を有する。生物学的治療薬の場合、賦形剤と共に製剤化されたＡＰＩは、典型的には、少なくとも、最終的な剤形において使用される最高の濃度の、最終配合の緩衝液中のＡＰＩを意味し、医薬品とも呼ばれる。

本明細書で使用されるとき、ＤＰと略される用語「医薬品」は、原薬の最終的な市販される剤形、例えば錠剤又はカプセル、或いは、生物学的製剤の剤形の場合、典型的には、適切な容器（バイアル又は注射器等）に入った注射液を指す。前記医薬品はまた、凍結乾燥された形態であってよい。

本明細書で使用される用語「ポリソルベート２０」は、ポリエトキシル化ソルビタン及びラウリン酸に由来する、非イオン性のポリソルベート型界面活性剤を指す（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン モノラウラート）。それは、Ｔｗｅｅｎ２０としても知られる。その安定性と相対的に非毒性であることにより、多くの国内の（domestic）科学的分析において、界面活性剤及び乳化剤として使用することが可能になる。ポリソルベート２０は、イムノアッセイ、ウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡにおいて洗浄剤として使用することができる。さらに、医薬製剤などの薬理学的用途、特に、抗体及びＦｃ融合タンパク質などの生物学的製剤に使用することができる。それは特に、非特異性抗体の結合を防ぐのに役立つ。

本明細書で使用される用語「ポリソルベート８０」は、ポリエトキシル化ソルビタン及びオレイン酸に由来する、非イオン性のポリソルベート型界面活性剤を指す（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン モノオレアート）。それは、Ｔｗｅｅｎ８０としても知られ、ポリソルベート２０と同様の用途を有する。

本明細書で使用される用語「治療用タンパク質」は、ヒト及び／又は動物の医学的処置に使用することができるタンパク質を指す。これらは、抗体、成長因子、血液凝固因子、ワクチン、インターフェロン、ホルモン及び融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「産生される」は、細胞培養における、組換えタンパク質、好ましくは治療用タンパク質の、真核細胞、好ましくは酵母細胞又は哺乳類細胞内での産生に関する。当業者は、発酵を用いて細胞内で組換えタンパク質を産生する方法を知っている。組換えタンパク質の産生は、細胞培養において、関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養することを含む。細胞培養において組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養することは、真核細胞を、適切な培地中で、増殖及び／又はタンパク質の生産／発現を可能にする条件下に維持することを含む。前記組換えタンパク質は、流加培養又は連続細胞培養によって産生されてよい。したがって、真核細胞は、流加培養又は連続細胞培養、あるいはそれらの組み合わせ、好ましくは流加細胞培養において培養されてよい。

本明細書で使用される用語「組換えタンパク質を発現する」は、翻訳後修飾を含むタンパク質配列に転写及び翻訳される、すなわち、細胞培養における組換えタンパク質の産生をもたらす、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む細胞を指す。

本明細書で使用される用語「約」は、特定された値の１０％の変動を指し、例えば約５０％は、４５から５５％の変動を有する。

リパーゼ活性を検出する方法
本発明は、組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する（インビトロの）方法であって、（ａ）真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程（前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む）；（ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）４－ＭＵエステル（前記基質）の加水分解を測定すると共に、放出された前記発色団４－ＭＵ（これは、４－ＭＵエステルの加水分解生成物である）の蛍光強度を検出することによって、リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程を含む、方法に関する。前記方法はさらに、前記少なくとも１つのサンプルに関する加水分解を測定して得られたデータを分析する工程をさらに含んでもよい。本発明の方法で使用される反応溶液は、水性反応溶液である。当業者はまた、前記少なくとも１つのサンプルが、細胞培養において真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含むことを理解するであろう。さらに、本発明による方法は、夾雑リパーゼ活性を検出するためのものであり、工程（ｄ）で検出されたリパーゼ活性は、前記組換えタンパク質、より具体的には関心対象の組換えタンパク質を含む、前記少なくとも１つのサンプル中の夾雑リパーゼ活性である。

アッセイの読み出しは、２０分程度か、又はさらに早くてもよい。したがって、特定の実施態様では、前記サンプル及び基質は、反応混合物中で、５時間未満、３時間未満、２時間未満、又は０．５時間未満インキュベートされる。十分なデータポイントを得るためには、前記サンプル及び基質は、反応混合物中で、少なくとも１分間、少なくとも２分間、又は少なくとも５分間インキュベートすることが望ましい。したがって、反応混合物中の前記サンプル及び基質は、２分から５時間未満、２分から３時間未満、２分から２時間未満、又は２分から０．５時間未満のいずれかの時間インキュベートされてよい。前記少なくとも１つのサンプルは、ＨＣＣＦ、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬又は医薬品であってよい。本発明によれば、前記サンプル中の組換えタンパク質は、リパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を含まない。さらに、本発明の方法によるサンプル中の組換えタンパク質は、エステラーゼ又はヒドロラーゼではなく、且つ／又はエステラーゼ活性又はヒドロラーゼ活性を含まない。したがって、前記少なくとも１つのサンプルに検出されるあらゆるリパーゼ活性は、夾雑リパーゼ活性であり、且つ／又は、真核細胞由来の１つ以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質に由来する。したがって、真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む前記少なくとも１つのサンプルは、潜在的に、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質をさらに含んでよい。１つの実施態様では、前記方法は、工程（ａ）において、真核生物、好ましくは哺乳類細胞中、細胞培養中で産生された組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；及び工程（ｄ）において、４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、当該ＨＣＰのリパーゼ活性を検出する工程を含む。

前記基質は、発色団４－ＭＵを飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６からＣ_１６）４－ＭＵエステルの形で含む（前記飽和非分岐鎖脂肪酸のアシル鎖は、Ｃ_６からＣ_１６の炭素原子を有する）。この基質は、ポリソルベートの非常に重要なエステル結合、すなわち脂肪酸エステル結合を模倣する。

加水分解は、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度の検出の前に、特定の時点で停止されてよい。あるいは、そして好ましくは、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度は、前記４－ＭＵエステルの加水分解を停止することなくリアルタイムで検出されてよい。特定の実施態様では、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度は、４－ＭＵエステルの加水分解を停止することなく検出される。特定の実施態様では、加水分解は、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び基質を反応混合物中でインキュベートしながら、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって測定される。

リアルタイム検出は、加水分解を経時的に測定することを可能にし、それゆえに比反応速度が測定されうる。本発明による方法では、反応混合物中の４－ＭＵエステルの加水分解は、典型的には擬ゼロ次反応速度に従う。したがって、リアルタイムで蛍光を検出することにより、擬ゼロ次反応速度の時間枠での測定が可能になる。したがって、特定の実施態様では、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度は経時的に検出され、擬ゼロ次反応速度に従う。任意選択的に、擬ゼロ次反応速度の要件を満たさない反応混合物は、分析から除外される。擬ゼロ次反応速度は、線形回帰分析によって評価できる。好ましくは、サンプルは、少なくとも３回実験され、個々の反応混合物は、例えばウェルの気泡などによって、擬ゼロ次反応速度を満たさない場合には、外れ値を排除するために分析から除外される。記載されているように外れ値を排除することは、分析の感度を強く高める。規定された濃度の４－ＭＵを使用した検量線を使用して、加水分解の速度（例えば、nmol／秒）を計算することができる。既知４－ＭＵ濃度での検量線はさらに、異なるpH値での反応速度の決定及び比較を可能にする。

本明細書で使用される用語「反応速度」は、特定の時間内に基質を少なくとも１つの生成物に変換する酵素の速度を指す。いくつかの反応では、前記速度は見かけ上、反応物の濃度に依存しない。これは、式の速度が反応の速度定数ｋに等しいことを意味し、ゼロ次反応と呼ばれる。ゼロ次反応速度論は常に、反応が行われる条件の所産（artefact）である。このため、ゼロ次反応速度論に従う反応は、しばしば疑ゼロ次反応と呼ばれる。

本発明による方法は、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を相対蛍光単位（ＲＦＵ）として検出することによって、加水分解の速度を決定する工程、及びそれを規定された４－ＭＵの濃度を使用することによって作成された検量線と比較することによって、放出された発色団４－ＭＵの量（mol／秒）を決定する工程をさらに含んでもよい。典型的には、活性は、４－ＭＵの放出（nmol／分）によって決定される。あるいは、又はさらに、相対値は、別のサンプル、又は好ましくは、陽性対照として役立つ市販のリパーゼ（ブタ膵リパーゼ（ＰＰＬ）など）のような、内部標準と比較して計算されてよい。

前記サンプル及び前記基質の前記反応混合物中でのインキュベーションは、潜在的に存在する、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質が、４－ＭＵエステルを加水分解することを可能にする。典型的には、インキュベーションは数分から数時間である。１つの実施態様では、加水分解は、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、すなわち、インキュベーションの間にリアルタイムで、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって測定される。アッセイの感度のため、典型的には、検出はステップ（ｂ）の直後に開始される。インキュベーションの時間及びそれゆえの検出時間は、前記サンプル中に存在するリパーゼ活性に依存する場合があり、典型的には、５時間を超えず、好ましくは３時間を超えない。特定の実施態様では、前記反応混合物中のサンプル及び基質は、５時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、又は０．５時間未満インキュベートされる。十分なデータポイントを得るために、前記サンプル及び基質は、反応混合物中で少なくとも約１分間、少なくとも約２分間又は少なくとも約５分間インキュベートすることが望ましい。したがって、反応混合物中の前記サンプル及び基質は、約２分から５時間未満、約２分から３時間未満、約２分から２時間未満、又は約２分から０．５時間未満の間のいずれかの時間インキュベートされてよい。好ましくは、前記反応混合物中のサンプル及び基質は、約２５℃の温度で、２０分と２時間の間でインキュベートされる。反応温度は反応時間に影響を与えるため、前記反応温度は、測定中一定に、例えば、２０～３７℃の間、好ましくは２２～２８℃の間、より好ましくは２４～２６℃の間で、一定に保つべきである。１つの実施態様では、前記反応混合物中のサンプル及び基質は、２０～３７℃の間、好ましくは２２～２８℃の間、より好ましくは２４～２６℃の間の一定温度で、５時間未満、３時間未満、２時間未満又は１時間未満インキュベートされるか、又は、２０～３７℃、好ましくは２２～２８℃、より好ましくは２４～２６℃の間の一定温度で、約２分と５時間未満、約２分と３時間未満、約２分と２時間未満又は約２分と１時間未満の間のいずれかの時間インキュベートされる。

発色団４－ＭＵを含む基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルの形で存在し、前記飽和非分岐鎖脂肪酸のアシル鎖は、Ｃ_６～Ｃ_１６の炭素原子を有する。この基質は、ポリソルベートの重要な特徴、すなわち脂肪酸エステル結合及び長いアシル鎖を模倣する。ポリソルベート２０は、飽和非分岐鎖脂肪酸である脂肪酸、ラウリン酸のエステルである。これに対して、ポリソルベート８０は、不飽和脂肪酸である脂肪酸、オレイン酸のエステルである。

不飽和脂肪酸は、その二重結合のために飽和脂肪酸よりも嵩高く、さらに分岐鎖脂肪酸は、非分岐鎖脂肪酸よりも嵩高い。組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性は、１つ以上のリパーゼ又は他の加水分解酵素によって媒介され、個々の抗体のように、様々な生成物によって異なる場合がある（図２参照）。したがって、ほとんどの場合、リパーゼ活性を有する夾雑タンパク質（複数可）は未知であり、１つ以上のタンパク質の混合物でありうる。トリアシルグリセロールリパーゼなどの多くのリパーゼは、その活性部位が、ポリペプチド鎖の一部であるフラップ又は蓋によって溶媒から遮蔽されているのに対して、開放状態又は閉鎖状態であることができる。したがって、多くのリパーゼの活性部位は、空洞又は樽の内部に似ており、これが基質の特異性を決定する可能性が高い。したがって、中程度の長さである飽和非分岐鎖脂肪酸（嵩高くない脂肪酸）のエステルは、例えば、本発明の方法で使用されるような、より長く不飽和のアシル鎖を有するオレイン酸と比較して、より広い酵素スペクトルを獲得する可能性が高い。好ましくは、基質は、ＰＳ２０又はＰＳ８０と比較して同等又はより広い酵素スペクトルを獲得する。

さらに、より短いアシル鎖を有する脂肪酸エステルは、より長い鎖長の脂肪酸エステルと比較して、水性反応混合物へのより良い溶解性を提供する。その結果、更なる基質をアッセイ混合物に使用することができる。より具体的には、Ｃ_１６以上の鎖長で、溶解性は強く制限されることが見出された。

さらに、デカン酸エステル（４－ＭＵＤ）は、例えば酪酸エステル（４－ＭＵＢ）と比較して、自己加水分解に対するより良い耐性を提供することが見出された。Ｃ_５までの鎖長は、自己加水分解を強く増加させることが見出された。４－ＭＵＤにおけるＣ_１０脂肪酸は、実施例での使用に最適であることが見出されたが、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステル、若しくはより好ましくは飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_８～Ｃ_１２）４－ＭＵエステルのような、わずかに長い若しくは短い飽和非分岐脂肪酸エステルも、本発明による方法で同様に使用されうる。したがって、本発明による方法で使用される４－ＭＵエステルは、Ｃ_６～Ｃ_１６の炭素原子の飽和非分岐鎖脂肪酸のアシル鎖を有する。より好ましくは、前記脂肪酸は、中鎖の脂肪酸であり、前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_８～Ｃ_１２）４－ＭＵエステルである。特定の実施態様では、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。特定の好ましい実施態様では、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。より好ましい実施態様では、前記基質は、４－ＭＵＤである。前記基質は、典型的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、好ましくはＤＭＳＯのような有機溶媒に、原液（反応混合物中の濃度に対して１００倍の原液など）として溶解される。特定の実施態様では、前記基質は、ＤＭＳＯ又はＤＭＦから選択される有機溶媒、好ましくはＤＭＦに溶解された原液として提供される。

本発明における適切な基質の濃度は、約１μMから約１mMでありうる。したがって、特定の実施態様では、前記基質は、約１μMから約１mM、好ましくは約１μMから３００μM、好ましくは１μMから３０μM、より好ましくは約３μMから３０μMの、反応混合物中の最終濃度で提供される。特定の実施態様では、前記基質は、有機溶媒中の原液として提供され、前記原液は、反応混合物の約１％から約５％（v/v）で加えられる。

本発明による方法は、少なくとも１つのサンプルを、エステル結合を有しない非変性性界面活性剤を含む反応溶液と接触させる工程を含み、前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤（本明細書では、「エステル結合を有しない非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤」ともいう）である。本明細書で使用される用語「界面活性剤」は、ミセルを形成することができ、２つの液体間、気体と液体間及び液体と固体間の表面張力を低下させる界面活性化合物を指す。界面活性剤は、本明細書では洗剤と呼ばれることもある。界面活性剤は、両親媒性、すなわち疎水性基（尾部）及び親水性基（頭部）の両方を含む。界面活性剤は、典型的には有機化合物である。水相では、界面活性剤はミセル等の凝集体を形成し、そこでは、疎水性の尾部が凝集体のコアを形成し、親水性の頭部が周囲の水性液体と接触する。したがって、疎水性の尾部（疎水性炭化水素部分とも呼ばれる）は、ミセルを形成するための一定の長さを有する。したがって、本明細書で使用される界面活性剤は、エタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような有機溶媒を包含しない。ほとんどの界面活性剤の尾部は、典型的には、分岐鎖、直鎖又は芳香族であることができる、１つ以上の炭化水素鎖からなる。前記界面活性剤は、１つ以上の疎水性の尾部を含んでよく、好ましくは、前記界面活性剤は、１つの疎水性鎖を含む（単一尾部の界面活性剤）。界面活性剤は、一般的に親水性の頭部基にしたがって分類される。非イオン性界面活性剤は、その頭部に荷電基を有さず、１つのイオン性界面活性剤は、正味１つの正（陽イオン）又は負（陰イオン）の電荷を有し、１つの双性イオン性界面活性剤は、反対に荷電した２つの基を含有する。したがって、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、親水性頭部基に正味の電荷を有さず、性質はより穏やかである。さらに、多くの界面活性剤では、疎水性尾部は、ＰＳ２０又はＰＳ８０のように、エステル結合を介して親水性頭部に結合している。さらに、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、非変性性界面活性剤である。本明細書で使用される用語「非変性性界面活性剤」は、タンパク質構造に対する界面活性剤の効果を指す。非変性性界面活性剤は、特に水溶性タンパク質の、タンパク質間相互作用を乱さない。

エステル結合を含む界面活性剤は、リパーゼに対する潜在的な基質であるため、アッセイに干渉する場合がある。さらに、リパーゼ活性によるタンパク質の変性及びそれゆえのサンプルにおけるリパーゼ活性との干渉は避けるべきである。したがって、本発明による方法で使用される界面活性剤は、エステル結合を有しない非変性性界面活性剤であり、前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である。適切な非変性性双性イオン性界面活性剤の例は、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３－（［３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナート）（ＣＨＡＰＳＯ）、ＣＨＡＰＳ類似体（ＢＩＧ－ＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド）など）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（様々な長さ、例えば、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２））及び３－[Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナート又は他のアミドスルホベタイン洗剤であるが、これらに限定されない。適切な非変性性非イオン性界面活性剤の例は、ピラノシド系界面活性剤（オクチル β－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ）、ノニル β－Ｄ－グルコピラノシド、ドデシル β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）若しくはオクチル β－Ｄ－チオグルコピラノシドなど）、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）又は他のポリオキシエチレンエーテル；サポニン（例えば、ジギトニン）、オクチルフェノキシ ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）、ポロキサマー １８８，３３８，４０７あるいはテルジトールであるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（非イオン性又は双性イオン性界面活性剤）は、エトキシラートでなく、及び／又はポリエチレングリコール基を含まず、及び／又は芳香環を含まない。特定の実施態様では、前記エステル結合を有しない非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤は、オクトキシノール－９（octoxinol-9）ではなく、具体的には、ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；ＣＡＳ番号９００２－９３－１）及び／又はポリエチレングリコール ノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０、ＣＡＳ番号９０１６－４５－９）ではない。好ましい実施態様では、前記界面活性剤は、エステル結合を有しない非変性性界面活性剤であり、前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤であり、より好ましくは、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（ＣＡＳ番号７５６２１－０３－３又はその水和物ＣＡＳ番号３３１７１７－４５－４）、ＣＨＡＰＳＯ（ＣＡＳ番号８２４７３－２４－３）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２；ＣＡＳ番号１４９３３－０８－５）及びサポニン（ＣＡＳ番号８０４７－１５－２）からなる群より選択され、好ましくはＣＨＡＰＳである、非変性性界面活性剤（非イオン性又は双性イオン性界面活性剤）である。これらの例示的で適切な界面活性剤は、いずれもエステル結合又はアシル鎖を示さないため、リパーゼの基質ではない。これらの界面活性剤は前記基質と競合せず、それゆえアッセイの感度に影響を与えない。さらに、界面活性剤の存在は、使用される水中濃度での基質の溶解性を仲介する。当業者は、例えば、実施例７でＰＳ２０について示されているように、アッセイ条件下で４－ＭＵエステル加水分解に対する効果を測定することにより、さらなる適切なエステル結合を有しない非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤を同定する方法を知っているであろう。

界面活性剤（ＣＨＡＰＳ １０mMなど）の存在は、リパーゼ活性を増加させ、それゆえアッセイの感度を改善することが示されている。理論に縛られるものではないが、界面活性剤は、活性部位を覆うと記載されている蓋又はフラップの再配置及び開口を可能にすることによって、リパーゼ活性を促進する環境を作り出すと仮定されている(Grochulski P, Li Y, Schrag JD, et al. Protein Sci 1994; 3:82-91 and Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, et al. Biochemistry 1994; 33:3494-500)。この効果を達成するためには、前記界面活性剤は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超えているべきである。

したがって、本発明によれば、前記非変性性界面活性剤（非イオン性又は双性イオン性）は、反応混合物中で、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える最終濃度を有する。ＣＭＣは、水溶液中における所与の界面活性剤の重要な物理化学的特性を表す。ミセルは、その炭化水素基がほとんど水と接触していない球状の凝集体である。本明細書で使用される用語「臨界ミセル濃度」又は「ＣＭＣ」は、それを超えるとミセルが形成される界面活性剤の濃度（すなわち、最大モノマー濃度）を指し、当該技術分野で知られている方法にしたがって測定されうる。例えば、ＣＭＣを測定するのに適した方法は、蛍光疎水性染料Ｎ－フェニル－１－ナフチルアミン（ＮＰＮ）の界面活性剤ミセルへの分配を用いる、蛍光ミセルアッセイ（ＦＭＡ）である。ＮＰＮは、水性環境では低い蛍光量子収率を示し、ミセルのコアのようなより疎水性の環境ではそれが増加する。このアッセイは、元々ＣＭＣの測定のために開発されたものであり、実施例中にあるように、バイオ医薬品におけるポリソルベートの含有量を測定するためにも使用されてきた。ミセル化時における１，６－ジフェニル－ｌ，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）の蛍光の増強を利用する別の方法が、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ及びＨａｒｉｋｕｍａｒによって報告されている(FEBS Letters 391 (1996) 199-202)。

界面活性剤に関するＣＭＣは文献から導き出すことが可能であり、例えば、ＣＨＡＰＳでは約６mM、ＣＨＡＰＳＯでは約８mM、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２では約２～４mMである。特定の実施態様では、非変性性双性イオン界面活性剤は、ＣＨＡＰＳであり、約８mMから約２０mM、好ましくは約８mMから約１５mM、より好ましくは約１０mMの、反応混合物中の最終濃度で提供される。他の実施態様では、前記非変性性双性イオン界面活性剤は、ＣＨＡＰＳＯであり、約１０mMから約２０mM、好ましくは約１０mMから約１５mMの、反応混合物中の最終濃度で提供される。さらに別の実施態様では、前記非変性性双性イオン界面活性剤は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２であり、約４mMから約１０mM、好ましくは約６mMから約８mMの、反応混合物中の最終濃度で提供される。さらに別の実施態様では、前記非変性性非イオン界面活性剤はサポニンであり、約０．００１％から０．０１％（w/v）の、反応混合物中の最終濃度で提供される。

本発明による方法で使用される反応溶液は、約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液をさらに含む。好ましくは、前記方法は、約pH４から約pH８、好ましくは約pH５から約pH７．５、より好ましくは約pH５．５から約pH７．５のpHを有する緩衝液を用いて行われる。当業者は、前記緩衝液のpHは、本発明の方法で使用されたとき、その緩衝範囲内であることを理解するであろう。原理的には、pHが約pH４から約pH９までの緩衝範囲を有するならば、当該技術分野で知られているいずれの緩衝液をも使用することができる。前記緩衝液は、単一の緩衝性物質を含んでもよく、又は多成分緩衝液であってもよい。多成分緩衝液は、典型的には、より広い緩衝範囲を有する。例えば、前記緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含んでもよい。好ましくは、前記緩衝液は、リン酸緩衝液（Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４）、トリス緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、前記緩衝液は、約５０から４００mM、好ましくは約５０から３００mM、より好ましくは約５０から２００mMの濃度を有する。

前記緩衝液はさらに、より広い緩衝範囲を有するために、重複する緩衝範囲を有する複数の緩衝性物質を含む多成分緩衝液であってよい。前記緩衝液は、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の緩衝性物質、好ましくは２つ以上の緩衝性物質、より好ましくは３つ以上の緩衝性物質を含んでよい。例えば、前記多成分緩衝液は、２つから４つの緩衝性物質、３つから４つの緩衝性物質、より好ましくは３つの緩衝性物質を含んでよい。特定の実施態様では、前記多成分緩衝液は、重複する緩衝範囲を有する少なくとも３つの緩衝性物質を含み、好ましくは、トリス、ＭＥＳ及び／又は酢酸の少なくとも１つを、好ましくは酢酸、ＭＥＳ及びトリスを１：１：２の比率で含む。

アッセイは、イオン強度に敏感であることが判明したので、適切な多成分緩衝液の設計のためには、それが重複した緩衝範囲を有する緩衝性物質を含むだけでなく、前記緩衝液が、異なるpH（pH範囲 ４～８）で、イオン強度を中程度にしか変化させない（１５％未満、さらに好ましくは１０％未満）ことが重要である(Ellis KJ, Morrisson JF, 1982. Methods in Enzymology, 87: 405-426)。例えば、酢酸、ＭＥＳ及びトリスを含むＡＭＴ緩衝液は、イオン強度に中程度にしか影響せずに、異なるpHで緩衝液を使用して、例えば、pH条件を含む、加水分解活性を低下させる条件を特定することを可能にする。この緩衝液はさらに、前記サンプルのpHで測定を行い、サンプル中に存在する特定の条件でのリパーゼ活性を測定し、加えて精製中の様々な状態でのリパーゼ活性を比較することを可能にする。このアッセイは、最適pHでサンプルを測定することによって、感度をさらに高めることを可能にする。

したがって、本明細書得に開示される多成分緩衝液は、少なくとも約pH４から少なくとも約pH８まで、又は少なくとも約pH４から少なくとも約pH９までの、可変のpHを有する緩衝液の使用を可能にする。あるいは、又はさらに、約pH４と約pH９の間の様々なpH値を有する緩衝液の使用は、緩衝液のイオン強度に、１５％未満、好ましく１０％未満、又はさらに７．５％未満若しくは５％未満、例えば０％から１５％未満、０％から１０％未満、０％から７．５％未満、若しくは５％未満、又は、例えば２％から１５％未満、２％から１０％未満、２％から７．５％未満若しくは２％から５％未満の影響を与える。一実施態様では、約pH４と約pH８の間の様々なpH値を有する緩衝液の使用は、緩衝液のイオン強度に、１５％未満、好ましくは１０％未満、又はさらに７．５％未満若しくは５％未満、例えば０％から１５％未満、０％から１０％未満、０％から７．５％未満若しくは０％から５％未満、又は、例えば２％から１５％未満、２％から１０％未満２％から７．５％未満若しくは２％から５％未満の影響を与える。本明細書に開示される多成分緩衝液の使用はさらに、緩衝液のpHを、サンプルのpHに調整する（緩衝液の緩衝液組成を変更することなく）ことを可能にする。本明細書に開示される多成分緩衝液の使用はさらに、緩衝液のpHを、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質の至適のもの付近に調整すること（これにより、前記方法の感度を高める）、及び／又は加水分解活性を低下させる条件を比較し、特定することを可能にする。

前記反応溶液は、非緩衝性塩をさらに含んでよい。本発明では、水中で解離し、緩衝効果を有しない塩はいずれも、反応溶液のイオン強度を調整するのに適したものでありうる。適切な塩の例は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、又はＣａＣｌ_２である。本発明のある例では、非緩衝性塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群より選択され、好ましくは、非緩衝性塩は、ＮａＣｌ又はＫＣｌである。

任意選択的な非緩衝性塩の濃度は、約１００mMから約２００mMの範囲であってよい。本発明のある実施態様では、前記非緩衝性塩は、反応混合物中で、約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMの濃度を有する。しかし、反応混合物中のイオン強度は、リパーゼ活性に悪影響を及ぼすため、特定の値を超えるべきではない。例えば、任意選択的な非緩衝性塩のイオン強度は、好ましくは、反応混合物中で、約２００mM以下、約１９０mM以下、約１８０mM以下、約１７０mM以下、約１６０mM以下、約１５０mM以下であり、例えば、反応混合物中で、約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMである。特定の実施態様では、反応混合物中の緩衝液及び非緩衝性塩のイオン強度の累積イオン強度は、約４５０mMを超えない。したがって、反応混合物中の緩衝液及び非緩衝性塩の累積イオン強度は、約４５０mM以下、約４００mM以下、約３８０mM以下、約３６０mM以下又は約３５０mM以下であってよい。例えば、反応混合物中の緩衝液及び非緩衝性塩の累積イオン強度は、約１５０mMから約４５０mM以下、約１５０mMから約４００mM以下、約１５０mMから約３８０mM以下、約１５０mMから約３６０mM以下又は約１５０mMから約３５０mM以下であってよい。

本発明による方法は、蛍光分光計又はマイクロプレート分光光度計（好ましくはλ_ｅｘ ３３０～３４０nm、λ_ｅｍ ４５０nmで）における蛍光の検出に適している。したがって、反応混合物は、測定のためにキュベット又はマイクロタイタープレート、好ましくは、少なくとも９６ウェルのマイクロタイタープレートに含有される（そして、好ましくはその中に混合される）。したがって、本発明による方法は、サンプルのハイスループット分析及び／又は自動分析に特に適している。特定の実施態様では、本発明による方法において、少なくとも２、３、４、５、１０又はそれ以上のサンプルが同時に分析される。さらに、それぞれのサンプルは、好ましくは、少なくとも３回測定される。したがって、本発明による方法は、好ましくは、９６のウェル、又は９６の倍数のウェルを有するマイクロタイタープレートを使用して行われる。マイクロタイタープレートは、工程（ｄ）における加水分解の測定のためだけでなく、工程（ｄ）において少なくとも１つのサンプルを反応溶液に接触させ、そして工程（ｃ）において反応混合物中でサンプルと基質をインキュベートするためにも使用される。したがって、特定の実施態様では、前記サンプルは、９６のウェル、又は９６の倍数のウェルを有するマイクロタイタープレートのフォーマットで接触され、インキュベートされ、測定される。

特定の実施態様では、前記サンプルは、反応混合物の約３０％（v/v）以下、好ましくは約２５％（v/v）以下で提供される。したがって、前記サンプルは、反応混合物の約２０％（v/v）から約３０％（v/v）、好ましくは反応混合物の約２０％（v/v）から約２５％（v/v）で提供される。任意選択的に、前記サンプルは、あらかじめ希釈されてよい。組換えタンパク質を含む少なくとも１つの前記サンプルは、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルであってよく、好ましくは、ＩＰＣサンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルであってよい。好ましくは、少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成することは、少なくとも１つのサンプルを反応溶液と混合して、均一な反応混合物を得ることを含む。好ましくは、これは、最初により小さい体積のもの（典型的には前記サンプル）を加え、次により大きい体積のもの（典型的には前記反応溶液）を加えることによって行われる。好ましくは、前記反応溶液の成分を、マスター混合物として加え、前記マスター混合物は、濃縮物として調製され、前記サンプルに加える前に作業濃度に希釈されるものとしてよい。

さらに、前記緩衝液、非変性性界面活性剤（非イオン性又は双性イオン性）、及び任意選択的な非緩衝性塩は、好ましくは、反応混合物に対して少なくとも約３倍、又は約３倍から約５倍の濃度のアッセイ緩衝液として予め混合される。アッセイ緩衝液は、使用する前に保存されてよい。又は、前記アッセイ緩衝液は、乾燥混合物として提供される。そのような乾燥混合物は、水で再構成されて、最終反応混合物に対して当該少なくとも約３倍に濃縮、又は約３倍から約５倍に濃縮されたアッセイ緩衝液を提供するものであってよい。前記基質は、使用前にアッセイ緩衝液に加えられて、反応溶液を提供し；好ましくは、前記基質は使用直前にアッセイ緩衝液に加えられる。したがって、前記緩衝液、界面活性剤、基質及び任意選択的な非緩衝性塩は、好ましくは、マスター混合物として予め混合される。前記マスター混合物の成分は、反応溶液中の成分と同一である。前記マスター混合物は、サンプルに添加する前に作業濃度まで希釈される、濃縮物として調製されてよい。

特定の実施態様では、前記緩衝液、非変性性界面活性剤（非イオン性又は双性イオン性）、基質及び任意選択的な非緩衝性塩は、マスター混合物として加えられ、前記マスター混合物は、約７０％（v/v）以上、約７５％（v/v）以上で提供される。したがって、前記マスター混合物は、約７０％（v/v）から約８０％（v/v）、好ましくは約７５％（v/v）から約８０％（v/v）で提供されうる。

前記少なくとも１つのサンプルは、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルであってよい。リパーゼ活性を検出するためのサンプル中の組換えタンパク質は、好ましくは、抗体、抗体断片、抗体由来分子、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）、成長因子、サイトカイン又はホルモンなどの治療用タンパク質、好ましくは、抗体、抗体断片、抗体由来分子又はＦｃ融合タンパク質である。したがって、前記組換えタンパク質は、好ましくは、分泌タンパク質である。本明細書で使用される用語「採取した細胞培養液」又は「ＨＣＣＦ」は採取後の、すなわち細胞から分離された後の細胞培養上清を指す。本発明によれば、リパーゼ活性を検出するためのサンプル中の組換えタンパク質はリパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を含まない。したがって、少なくとも１つのサンプル中に検出されたリパーゼ活性はいずれも、夾雑リパーゼ活性であり、及び／又は、真核細胞由来の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のような、リパーゼ活性を有する少なくとも１つの夾雑タンパク質に由来している。さらに、本発明の方法によるサンプル中の組換えタンパク質は、エステラーゼ又はヒドロラーゼではなく、且つ／又はエステラーゼ又はヒドロラーゼ活性を含まない。

したがって、有利には、本発明の方法は、抗体、抗体断片、抗体由来分子又は融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を含むサンプル中の加水分解を測定することによって、リパーゼ活性を検出するために使用することができる。典型的には、抗体は単一特異性であるが、抗体は多重特異性である場合もある。したがって、本発明による方法は、単一特異性抗体、多重特異性抗体、又はそれらの断片、好ましくは、抗体（単一特異性）、二重特異性抗体、三重特異性抗体又はそれらの断片、好ましくは、その抗原結合性断片を含むサンプルに使用されてよい。特に言及しない限り、前記用語「抗体」は、単一特異性抗体を指す。本発明の範囲内の例示的抗体は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１）抗体、抗ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＩＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ－５Ｒ抗体、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体又は抗ＩｇＥ抗体を含むが、これらに限定されず、そして好ましくは、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－２抗体、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体及び抗ＩｇＥ抗体からなる群より選択される。一実施態様では、前記抗体は、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体、具体的にはスペソリマブである。別の実施態様では、前記抗体は、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体ではなく、特にスペソリマブではない。

本明細書で使用される用語「抗体」、「抗体」又は「免疫グロブリン」は、分化したＢ－リンパ球（形質細胞）から異物（＝抗原）に対する宿主生物の反応として自然に形成されるグロブリンの中から選択されるタンパク質に関する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷと、さまざまな種類の免疫グロブリンがある。好ましくは、前記抗体は、ＩｇＧ抗体であり、より好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である。本明細書において、前記用語免疫グロブリン及び抗体は、互換的に使用される。抗体は、モノクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（二重特異性抗体又は三重特異性抗体など）、単鎖抗体、抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）、ジスルフィド結合性Ｆｖ等を含む。抗体は任意の種のものであってよく、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。「キメラ」抗体は、抗体ドメイン又は抗体領域が異なる種に由来する分子である。例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域はラット又はマウスの抗体に由来し、定常領域はヒト抗体に由来するものでありうる。「ヒト化」抗体では、最小限の配列のみが非ヒト種に由来する。多くの場合、ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸残基のみが、マウス、ラット、ウサギ又はラマなどの非ヒト種のＣＤＲアミノ酸残基に置換されている。時には、抗原結合特異性及び親和性に影響を与える重要な数フレームワークアミノ酸残基も、非ヒトアミノ酸残基に置換される。抗体は、化学合成を通じて、組換え又はトランスジェニック手段を介して、細胞（例えば、ハイブリドーマ）培養を介して、又はその他の手段によって、生産されてよい。

典型的には、抗体は、それぞれ重鎖及び軽鎖によって形成される２対のヘテロ二量体から構成される、四量体ポリペプチドである。ヘテロ二量体並びに四量体ポリペプチド構造の両方の安定化は、鎖間ジスルフィド架橋を介して生じる。それぞれの鎖は、「免疫グロブリンドメイン」又は「免疫グロブリン領域」と呼ばれる構造ドメインで構成されており、ここでの用語「ドメイン」又は「領域」は、互換的に使用される。それぞれのドメインは、約７０～１１０個のアミノ酸を含有し、コンパクトな三次元構造を形成する。重鎖及び軽鎖の両方とも、Ｎ末端に、抗原の認識及び結合を担う、配列があまり保存されていない「可変ドメイン」又は「可変領域」を含有する。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」とも呼ばれ、重鎖の可変領域は、「ＶＨ」とも呼ばれる。

抗原結合性断片は、例えば「Ｆａｂ断片」（Fragment antigen-binding＝Ｆａｂ）を含むが、それに限定されない。Ｆａｂ断片は、隣接する定常領域によって一緒に保持されている、両方の鎖の可変領域からなる。これらは、従来の抗体から、プロテアーゼ消化（例えばパパインによる）によって形成されてもよいが、Ｆａｂ断片もまた同様に、遺伝子工学によって産生されてもよい。さらなる抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片を含み、これはペプシンによるタンパク質分解開裂によって調製される。

遺伝子工学的方法を用いると、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみからなる短かくした抗体断片を作製することが可能である。これらは、Ｆｖ断片（Fragment variable＝可変部の断片）と呼ばれる。これらのＦｖ断片は、定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠いているため、Ｆｖ断片は、しばしば安定化される。重鎖及び軽鎖の可変領域を短いペプチド断片、例えば１０個から３０個のアミノ酸、好ましくは１５個のアミノ酸により結合させると有利である。この方法で、ペプチドリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬからなる、単一のペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。ｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、当業者に知られている。したがって、抗体断片及び抗原結合性断片は、Ｆｖ断片及び特にｓｃＦｖをさらに含む。

近年、ｓｃＦｖを多量体誘導体として調製するための様々な戦略が開発されている。これは特に、薬物動態学的特性及び生体内分布特性が改善され、結合親和性が増加した組換え抗体につながることを意図している。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖが多量体化ドメインを有する融合タンパク質として調製された。前記多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域、又はロイシンジッパードメインのようなコイルドコイル構造（らせん構造）であってよい。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用を、多量体化（例えば、ダイアボディ、トリボディ、ペンタボディ）のために使用する戦略もある。当業者にとって、ダイアボディは、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ分子内のリンカーを５～１０アミノ酸に短くすることは、鎖間ＶＨ／ＶＬ重ね合わせが起こるホモ二量体の形成をもたらす。ダイアボディはさらに、ジスルフィド架橋の組み込みにより安定化されてよい。ダイアボディの抗体タンパク質の例は、先行技術から知られている。

当業者にとって、ミニボディは、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ミニボディは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、ｓｃＦｖにヒンジ領域（例えばＩｇＧ１からも）及びリンカー領域を介して接続される二量化領域として含有する、融合タンパク質からなる。ミニボディ抗体タンパク質の例は、先行技術から知られている。

当業者にとって、トリボディは、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ＶＨ－ＶＬがリンカー配列なしで直接融合したｓｃＦｖ誘導体は、三量体の形成をもたらす。

当業者は、二価、三価又は四価の構造を有し、ｓｃＦｖに由来する、いわゆるミニ抗体にも精通している。多量体化は、二価、三価又は四価のコイルドコイル構造によって行われる。本発明の好ましい実施態様では、関心対象の遺伝子は、上記の所望のポリペプチドのいずれか、好ましくは、モノクローナル抗体、その誘導体又は断片のいずれかをコードする。

抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される免疫グロブリン断片は、その結晶化傾向ゆえに、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃ」と呼ばれる（Ｆｃ＝fragment crystallizable）。これらは、例えば、従来の抗体から、パパイン又はペプシンを用いたプロテアーゼ消化によって形成されうるが、遺伝子工学によっても生成されうる。Ｆｃ断片のＮ末端部分は、まだ存在しているヒンジ領域のアミノ酸がいくつかによって異なりうる。

抗原結合性断片及びＦｃ領域を含む抗体は、完全長抗体とも呼ばれる場合がある。完全長抗体は、単一特異性、及び二重特異性抗体又は三重特異性抗体のような多重特異性抗体であってよい。

本発明による好ましい治療用抗体は、多重特異性抗体、具体的には、二重特異性又は三重特異性抗体である。二重特異性抗体は、典型的には、１つの分子内で、標的細胞（例えば悪性Ｂ細胞）及びエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージ）に対する抗原結合特異性を組み合わせている。例示的な二重特異性抗体は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ（Bi-specific T-cell Engager）フォーマット及びＤＡＲＴ（Dual-Affinity Re-Targeting）フォーマットであるが、それらに限定されない。前記ダイアボディフォーマットは、２つの別々のポリペプチド鎖上の、２つの抗原結合特異性の重鎖及び軽鎖の同族可変ドメインを分離しているが、前記２つのポリペプチド鎖は、非共有結合している。ＤＡＲＴフォーマットは、ダイアボディフォーマットに基づいているが、Ｃ末端ジスルフィド架橋を通してさらなる安定化を提供する。三重特異性抗体は、３つの抗原結合特異性を組み合わせたモノクローナル抗体である。三重特異性抗体は、２つの異なる抗体の抗原認識ドメインを１つの二重特異性分子に再構成する二重特異性抗体技術に基づいて構築されてよい。例えば、がん細胞上のＣＤ３８並びにＴ細胞上のＣＤ３及びＣＤ２８を標的とする三重特異性抗体が作成されている。多重特異性抗体は、高い製品品質で製造することが特に困難である。

別の好ましい治療用タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質のような融合タンパク質である。したがって、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質のような融合タンパク質の生産に有利に使用することができる。さらに、本発明によるタンパク質の生産量を増加させる方法は、Ｆｃ融合タンパク質のような融合タンパク質の生産に有利に使用することができる。

前記融合タンパク質のエフェクター部分は、天然又は修飾された異種タンパク質の完全配列、又は配列の任意の部分でありうる。免疫グロブリン定常ドメインの配列は、免疫グロブリンの、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２サブタイプなどの任意のサブタイプ、又はＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ若しくはＩｇＭなどのクラスから得られてよい。好ましくは、それらは、ヒト免疫グロブリンに由来し、より好ましくはヒトＩｇＧに由来し、そしてさらにより好ましくはヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に由来する。Ｆｃ融合タンパク質の非限定的な例は、Ｎ－結合性グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインに結合した、ＭＣＰ１－Ｆｃ、ＩＣＡＭ－Ｆｃ、ＥＰＯ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ断片などである。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ－結合性グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインを、例えば他の免疫グロブリンドメイン、酵素活性タンパク質部分、又はエフェクタードメインを含む、別の発現構築物に導入することによる、遺伝子工学的アプローチによって構築することができる。したがって、本発明によるＦｃ融合タンパク質は、重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメイン（例えば、Ｎ－結合性グリコシル化部位を含むもの）に結合した単鎖Ｆｖ断片も含む。

本発明の組換えタンパク質は、真核細胞中で産生される。好ましくは、前記組換えタンパク質を産生するために使用される真核細胞は、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又は哺乳類細胞（例えば、ハムスター又はヒトの細胞）である。前記哺乳類細胞は、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はそれらの誘導体が含むが、これらに限定されない。大規模な工業生産のために一般的に使用されるＣＨＯ細胞は、生産プロセスにおける特性を改善するため、又は組換え細胞の選択を容易にするために、しばしば操作される。そのような操作は、アポトーシス抵抗性を増加させること、オートファジーを減少させること、細胞増殖を増加させること、細胞周期調節タンパク質の改変された発現、シャペロン操作、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（ＵＰＲ）の操作、分泌経路の操作及び代謝の操作を含むが、これらに限定されない。

好ましくは、効率的な細胞株発生プロセスを可能にするＣＨＯ細胞は、例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）ノックアウト及び／又はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ノックアウト（それぞれ、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）又はメトトレキサートによる選択を容易にする）によって、代謝的に改変されている。

好ましくは、前記組換えタンパク質を産生するために使用されるＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯグルタミン合成酵素（ＧＳ）欠損細胞又はこれらの細胞のいずれかの誘導体である。

細胞は、血清を含まない条件下で（且つ任意選択的に、動物由来のタンパク質／ペプチドを何ら含まない培地中で）確立され、適応され、且つ完全に培養されると、最も好ましい。Ｈａｍ’ｓＦ１２（Sigma, Deisenhofen, Germany）、ＲＰＭＩ－１６４０(Sigma)、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ）；Sigma）、ＣＤ－ＣＨＯ（(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Carlsbad, CA)、血清フリーＣＨＯ培地（Sigma）、及びタンパク質フリーＣＨＯ培地（Sigma）などの市販の培地は、代表的な適切な栄養溶液である。前記いずれの培地も、必要に応じて、様々な化合物（その非限定的な例は、組換えホルモン及び／又は他の組換え成長因子（インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インスリン様成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース若しくは他の同等のエネルギー源、抗生物質及び微量元素である）を補足されてよい。その他の必要ないずれのサプリメントもまた、当業者には知られている適切な濃度で含まれてよい。選択可能な遺伝子を発現する遺伝子組換え細胞の増殖及び選択のために、適切な選択剤が培養液に加えられる。

本発明の方法の組換えタンパク質は、真核細胞中、細胞培養で産生される。発現後、前記組換えタンパク質は採取され、さらに精製される。前記組換えタンパク質は、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）中の分泌タンパク質として培養液から、又は細胞溶解物（すなわち、任意の手段（細胞膜、及び任意選択的に細胞壁の酵素的、化学的、浸透圧的、機械的及び／又は物理的破壊を含むが、これらに限定されない）によって溶解された細胞の内容物を含有する液体）から回収され、当該技術分野でよく知られた技術を用いて精製されてよい。精製の様々な工程で得られ、及び／又は分析されたサンプルは、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル又はプロセス中間体とも呼ばれる。前記採取は、典型的には、例えば採取した細胞培養液又は細胞溶解物、好ましくは採取した細胞培養液を作成するための、遠心分離及び／又は濾過を含む。したがって、前記採取した細胞培養液又は細胞溶解物は、清澄化された採取した細胞培養液又は清澄化された細胞溶解物と呼ばれる場合もある。ほとんどの細胞成分が除去されているだけでなく、生きた細胞や細胞の残骸を含有しない。清澄化は、典型的には、遠心分離又は濾過、好ましくは濾過を意味する。さらなる工程段階（process steps）は、製品を夾雑物質から分離するための、アフィニティークロマトグラフィー、具体的には、抗体又はＦｃ含有タンパク質のためのプロテインＡカラムクロマトグラフィーを含んでよい。さらなる工程段階は、ウイルスを不活化するための酸処理、深層濾過（好ましくは、酸処理に続いて）によって製品プールを清澄化すること、ＨＣＰ及びＤＮＡなどの細胞夾雑物質を除去することを含んでよい。さらなる工程段階は、イオン交換クロマトグラフィー、特に、夾雑細胞成分をさらに除去するための陰イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は凝集体などの製品関連夾雑物質を除去するための陽イオン交換クロマトグラフィーを、この順序で、又は個々の場合に適切であり得る他のいずれかの順序で含んでよい。さらに、好ましくは、次の工程段階は、ウイルスをさらに除去するためのナノ濾過、並びにそれぞれ組換えタンパク質を濃縮し、緩衝液を交換するための、限外濾過及び透析濾過を含んでよい。

リパーゼ活性は、宿主細胞のタンパク質夾雑物質と関連する場合があるため、本発明による方法は、アフィニティークロマトグラフィーの前後、酸処理と組み合わせた深層濾過の前後及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィーの前後など、ＨＣＰを除去する精製工程の後（好ましくは前後）のプロセス中間体の分析（関連する工程を、プロセス中間体中のリパーゼ活性のより効率的な除去に適応させるためのもの）に、特に有用であり得る。いくつかの実施態様では、前記方法は、アフィニティークロマトグラフィーの後、及び／又は酸処理と組み合わせた深層濾過の後（又は酸処理の後、及び／又は深層濾過の後）、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー）の後に、少なくとも１つのサンプルを得ることを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、アフィニティークロマトグラフィーの前後、及び／又は酸処理と組み合わせた深層濾過の前後（又は酸処理の前後及び／又は深層濾過の前後）、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー）の前後に、少なくとも１つのサンプルを得ることを含む。当業者は、ある特定の方法の工程の後に得られたサンプルが、その次の方法の工程の前に得られたサンプルと同じであり得ること、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡクロマトグラフィー）の後に得られたサンプルが、酸処理の前の（又は、酸処理と組み合わせた（すなわち酸処理に続く）深層濾過の前の）サンプルと同じであり得ることを知るであろう。上記で説明したように、緩衝液の広い緩衝範囲により、異なるpH値を有するサンプルにおけるリパーゼ活性でさえ、本発明による方法を用いて比較することができる。本発明による方法を用いて分析され得るその他のサンプルは、原薬又は医薬品のサンプルである。原薬又は医薬品のサンプルは、製剤の緩衝液を含み、したがってしばしばポリソルベートを含む。非常に高い濃度では、ポリソルベートは、基質との競合により反応を阻害する可能性がある。しかし、アッセイの感度により、典型的な濃度である０．４から０．８mg/mLのポリソルベートでは、原薬又は医薬品のサンプル中でもリパーゼ活性を測定することができる。

１つの態様では、関心対象の組換えタンパク質を製造する方法であって、組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する工程を含み、この工程が、（ａ）真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程（前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む）；（ｃ）前記サンプル及び基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程を含む、方法が提供される。当業者は、前記方法が、夾雑リパーゼ活性を検出するための方法であり、工程（ｄ）で検出されるリパーゼ活性が、組換えタンパク質、より具体的には前記関心対象の組換えタンパク質を含む、少なくとも１つのサンプル中の夾雑リパーゼ活性であることを理解するであろう。当業者は、前記方法が、（ｉ）細胞培養において関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養する工程；（ｉｉ）前記組換えタンパク質を採取する工程；（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を精製する工程；及び（ｉｖ）任意選択的に、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程をさらに含むことを理解するであろう。したがって、関心対象の組換えタンパク質を製造する方法であって、（ｉ）関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養する工程；（ｉｉ）前記組換えタンパク質を採取する工程；（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を精製する工程；及び（ｉｖ）任意選択的に、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程；及び（ｖ）工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）において、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程を含み、前記方法が、前記組換えタンパク質を含むサンプル中の（夾雑）リパーゼ活性を検出することをさらに含み、この工程が、（ａ）工程（ｖ）の、真核細胞中で産生された前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程であって、前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む工程；（ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、（夾雑）リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に測定する工程を含む、方法が提供される。本発明の方法で使用される前記反応溶液は、水性反応溶液である。さらに、工程（ｄ）で検出されるリパーゼ活性は、前記組換えタンパク質、より具体的には関心対象の組換えタンパク質を含む、少なくとも１つのサンプル中の夾雑リパーゼ活性である。特定の実施態様では、前記関心対象の組換えタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体由来分子（例えば、ｓｃＦｖ、二重又は多重特異性抗体）又は融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）などの治療用タンパク質である。１つの実施態様では、前記抗体は、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体、特にスペソリマブである。別の実施態様では、前記抗体は、抗ＩＬ－３６Ｒ抗体ではなく、特にスペソリマブではない。

特定の実施態様では、本発明による関心対象の組換えタンパク質を製造する方法は、前記組換えタンパク質を採取する工程内（工程（ｉｉ）内）（前記サンプルは、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物である）；前記組換えタンパク質を精製する工程内（工程（ｉｉｉ）内）（前記サンプルは、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである）；及び／又は、任意選択的な、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程内（工程（ｉｖ）内）（前記サンプルは、原薬サンプル又は医薬品サンプルである）に、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程を含む。好ましくは、本発明による関心対象の組換えタンパク質を製造する方法は、工程（ｉｉｉ）内に、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程を含み（前記サンプルは、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである）、例えば、アフィニティークロマトグラフィー後に、酸処理に続く深層濾過後（又は、酸処理後及び／又は酸処理後）に、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー）後に、少なくとも１つのサンプルを得る工程を含む。より好ましくは、前記方法は、アフィニティークロマトグラフィーの前後に、酸処理後の深層濾過の前後（又は、酸処理の前後及び／又は酸処理の前後）に、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー）の前後に、少なくとも１つのサンプルを得る工程を含む。前記組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する工程は、本明細書に記載されているリパーゼ活性を検出する方法にしたがって、且つそれに特定されているとおりに実行される。

サンプル中の加水分解を測定することによって夾雑リパーゼ活性を測定するためのキット
また、組換えタンパク質を含むサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットであって、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩、及び／又は（ｖ）任意選択的に、希釈用の水を含む、キットが提供される。１つの実施態様では、前記キットは、市販のリパーゼ、例えばブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）のような内部標準をさらに含み、前記内部標準は、陽性対照として機能し、及び／又は、前記内部標準と比較した相対値を計算することを可能にする。前記キットは、９６のウェル、又は９６の倍数のウェルを有する、１つ以上のマイクロタイタープレートも含んでよい。前記キットの構成成分は、溶液及び／又は乾燥成分として、別々に、又はあらかじめ混合された形で提供されてよい。緩衝液の場合は、希釈又は再構成時に約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液を提供する乾燥化合物として提供されてよい。

特定の実施態様では、前記緩衝液、界面活性剤及び任意選択的な非緩衝性塩が、アッセイ緩衝液として予め混合される。好ましくは、当該アッセイ緩衝液は、最終反応混合物に対して、少なくとも約３倍に濃縮、又は約３倍から約５倍に濃縮される。あるいは、前記アッセイ緩衝液は、乾燥混合物として提供される。そのような乾燥混合物は、水で再構成されて、当該最終反応混合物に対して少なくとも約３倍に濃縮、又は５倍に濃縮されたアッセイ緩衝液を提供するものであってよい。１つの実施態様では、前記アッセイ緩衝液の乾燥混合物は、凍結乾燥したアッセイ緩衝液である。前記基質は、反応溶液を提供するための使用前にアッセイ緩衝液に加えられるように、別個に提供される。あるいは、前記キットは、マスター混合物として予め混合された前記緩衝液、界面活性剤、基質及び任意選択的な非緩衝性塩を含んでよい。前記マスター混合物は、反応混合物の約８０％（v/v）から約７０％（v/v）で、好ましくは反応混合物の約８０％から約７５％で提供されることに適応させたものであってよい。前記アッセイ緩衝液及び反応溶液は水溶液である。

前記反応溶液の成分には、本発明の方法について上記に特定したものと同じものが当てはまる。前記発色団４－ＭＵを含む基質は、飽和非分枝鎖脂肪酸（Ｃ_６からＣ_１６）４－ＭＵエステルの形であり、飽和非分枝鎖脂肪酸の脂肪族鎖は、Ｃ_６からＣ_１６の炭素原子、又は好ましくはＣ_８からＣ_１２の炭素原子を有する。したがって、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、メチルウンベリフェリル ウンデカノアート又はメチルウンベリフェリル ドデカノアートであってよい。特定の実施態様では、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択され、好ましい実施態様では、前記基質は、４－ＭＵＤである。

前記キットは、前記基質を溶解するための有機溶媒をさらに含んでいてよく、又は前記基質は、有機溶媒に溶解されている。前記基質は、乾燥物質及び任意選択的な追加の有機溶媒として提供されてもよく、又は、原液（例えば、反応混合物中の濃度に対して１００倍の原液）として、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）若しくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、好ましくはＤＭＳＯ）に溶解されていてもよい。したがって、特定の実施態様では、前記基質は、約１００μMから約１００mM、好ましくは約１００μMから３０mM、好ましくは１００μMから３mM、より好ましくは約３００μMから３μMの原液として提供される。特定の実施態様では、前記基質は、有機溶媒中の原液として提供され、前記原液は、反応混合物の約１％から約５％（v/v）で加えられる。

エステル結合を有しない適切な非変性性双性イオン界面活性剤の例は、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３－（［３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、ＣＨＡＰＳ類似体（Ｂｉｇ ＣＨＡＰ （Ｎ，Ｎ－ビス－（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド）など）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（様々な長さ、例えばｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２））及び３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホナート又は他のアミドスルホベタイン洗剤であるが、これらに限定されない。適切な非変性性非イオン性界面活性剤の例は、ピラノシド界面活性剤（例えば、オクチル β－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ）、ノニル β－Ｄ－グルコピラノシド、ドデシル β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）又はオクチル β－Ｄ－チオグルコピラノシド）、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）若しくは他のポリオキシエチレンエーテル；サポニン（例えば、ジギトニン）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）、ポロキサマー１８８、３３８、４０７又はタージトールであるが、それらに限定されない。特定の実施形態では、前記界面活性剤は、エステル結合を有しない、非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤は、ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、そしてポリエチレングリコール ノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではない。好ましい実施形態では、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２など）及びサポニンからなる群より選択される非変性性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤であり、好ましくはＣＨＡＰＳである。

特定の実施態様では、前記緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される一つ以上の緩衝性物質を含む。特定の実施態様では、前記緩衝液は、約pH４から約pH８のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液は、約pH５から約pH７．５のpHを有し、より好ましくは、前記緩衝液は、約pH５．５から約pH７．５のpHを有する。

前記緩衝液は、単一の緩衝性物質を含んでもよく、又は本発明による方法のための上記で特定したような複数成分の緩衝液であってもよい。前記多成分緩衝液は、より広い緩衝範囲を有するように、重複する緩衝範囲を有する１つ以上の緩衝性物質を含んでよい。前記緩衝液は、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の緩衝性物質、好ましくは２つ以上の緩衝性物質、より好ましくは３つ以上の緩衝性物質を含んでよい。例えば、前記多成分緩衝液は、２つから４つの緩衝性物質、３つから４つの緩衝性物質、より好ましくは３つの緩衝性物質を含んでよい。特定の実施態様では、前記多成分緩衝液は、重複する緩衝範囲を有する少なくとも３つの緩衝性物質を含み、好ましくはトリス、ＭＥＳ及び／又は酢酸の少なくとも１つを含み、より好ましくは、酢酸、ＭＥＳ及びトリスを１：１：２の比率で含む。特定の実施態様では、前記緩衝液は、少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である。１つの実施態様では、約pH４と約pH９の間の異なるpH値の多成分緩衝液の使用は、緩衝液のイオン強度に、１５％未満、好ましくは１０％未満、又はさらに７．５％未満若しくは５％未満、例えば、０％から１５％未満、０％から１０％未満、０％から７．５％未満又は０％から５％未満、又は、例えば２％から１５％未満、２％から１０％未満、２％から７．５％未満又は２％から５％未満の影響を与える。任意選択的な非緩衝性塩は、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２であってよく、好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌである。

上記に鑑みて、本発明は以下の項目も包含することが理解される：
項目１は、組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程（前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む）、（ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程を含む方法を提供する。

項目２は、項目１又は項目２の方法を特定し、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度は、前記４－ＭＵエステルの加水分解を停止することなく検出され、及び／又は、前記反応混合物中の前記サンプル及び前記基質は、２分と５時間未満、２分と３時間未満、２分と２時間未満又は２分と０．５時間未満の間のいずれかの時間、インキュベートされる。

項目３は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記放出された発色団 ４－ＭＵの蛍光強度は、経時的に検出され、且つ擬ゼロ次反応速度に従い、（任意選択的に、擬ゼロ次反応速度の要件を満たさない反応混合物は、分析から除外される）。

項目４は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、（ａ）前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として検出することによって加水分解速度を決定し、それを、規定された４－ＭＵの濃度を使用することによって作成された検量線と比較することによって、放出された発色団４－ＭＵの量（mol／秒）を決定する工程、及び／又は（ｂ）内部標準と比較した相対値を計算する工程をさらに含む。

項目５は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、少なくとも１つのサンプルで検出されたリパーゼ活性は、夾雑リパーゼ活性である。

項目６は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。

項目７は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記基質は、反応混合物中約１μMから約１mMの最終濃度で提供される。

項目８は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記基質は、有機溶媒中の原液として提供され、前記原液は、反応混合物の約１％から約５％（v/v）の濃度で添加され、及び／又は、前記有機溶媒はＤＭＳＯ又はＤＭＦである。

項目９は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記界面活性剤は、その反応混合物中での臨界ミセル濃度を超える、反応混合物中の最終濃度を有する。

項目１０は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、からなる群より選択され、好ましくはＣＨＡＰＳであり、及び／又は、且つポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではない。

項目１１は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳであり、且つ約８mMから約２０mM、好ましくは約８mMから約１５mM、より好ましくは約１０mMの、反応混合物中の最終濃度で提供される。

項目１２は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む。

項目１３は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記緩衝液は、約５から約７．５のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液は、約５．５から約７．５のpHを有する。

項目１４は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記緩衝液は、少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である。

項目１５は、項目１４の方法を特定し、前記多成分緩衝液は、重複する緩衝範囲を有する少なくとも３つの緩衝性物質を含み、好ましくは、トリス、ＭＥＳ及び／又は酢酸の少なくとも１つを含む。

項目１６は、項目１４又は項目１５の方法を特定し、前記方法は、（ａ）少なくとも約pH４から少なくとも約pH８までの可変のpHを有する緩衝液の使用；（ｂ）約pH４から約pH８の間の種々のpH値を有する緩衝液の使用であって、それにより、イオン強度に１５％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは０％から１５％未満、０％から１０％未満、０％から７．５％未満、又は０％から５％未満の影響を与える使用；（ｃ）前記緩衝液のpHを、前記サンプルのpHに調整する工程；（ｄ）前記緩衝液のpHを、リパーゼ活性を有する前記少なくとも１つの（夾雑）タンパク質の最適のもの付近に調整する工程；又は（ｅ）加水分解活性を低下させる条件を比較及び特定する工程を含む。

項目１７は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、少なくとも２、３、４、５、１０又はそれ以上のサンプルが、同時に分析される。

項目１８は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記サンプルは、９６のウェル又は９６の倍数のウェルを有するプレートのフォーマットで接触され、インキュベートされ、測定される。

項目１９は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記サンプルは、前記反応混合物の約２０％から約３０％（v/v）、好ましくは、前記反応混合物の約２５％で提供され、任意選択的に、前記サンプルは、あらかじめ希釈されうる。

項目２０は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記緩衝液、界面活性剤及び任意選択的な非緩衝性塩は、前記反応混合物に対して約３倍から約５倍に濃縮されているアッセイ緩衝液としてあらかじめ混合される。

項目２１は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記緩衝液、界面活性剤、基質及び任意選択的な非緩衝性塩は、マスター混合物としてサンプルに加えられ、前記マスター混合物は、前記反応混合物の約８０％（v/v）から約７０％（v/v）、好ましくは前記反応混合物の約７５％で提供される。

項目２２は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記非緩衝性塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群より選択され、好ましくは、前記非緩衝性塩は、ＮａＣｌ又はＫＣｌである。

項目２３は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記非緩衝性塩は、前記反応混合物中で、約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMの濃度を有する。

項目２４は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記非前記緩衝性塩のイオン強度は、前記反応混合物中で約２００mM以下、好ましくは前記反応混合物中で約１５０mM以下、好ましくは前記反応混合物中で、約１００mMから約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMである。

項目２５は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記反応混合物中の緩衝塩と非緩衝性塩の累積イオン強度は、前記反応混合物中で約４５０mM以下、好ましくは約４００mM、より好ましくは３５０mM以下である。

項目２６は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記蛍光は、蛍光分光計又はマイクロプレート分光光度計を用いて検出される。

項目２７は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記少なくとも１つのサンプルは、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルである。

項目２８は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、（ａ）前記組換えタンパク質は、リパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を有する酵素ではなく、及び／又は（ｂ）前記組換えタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体由来分子及び融合タンパク質からなる群より選択される。

項目２９は、先行するいずれか１つの項目の方法を特定し、前記組換えタンパク質を産生するために用いられる真核細胞は、酵母細胞又は哺乳類細胞であり、前記哺乳類細胞は、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はそれらの誘導体である。

項目３０は、組換えタンパク質を含むサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットであって、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液；（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）；及び（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６からＣ_１６）４－ＭＵエステルである）；及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩；及び／又は（ｖ）任意選択的に、希釈のための水を含む、キットを提供する。

項目３１は、項目３０のキットを特定し、前記基質は、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される。

項目３２は、項目３０又は項目３１のキットを特定し、前記キットは、前記基質を溶解するための有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯ又はＤＭＦをさらに含む。

項目３３は、項目３０から項目３２のいずれか１つのキットを特定し、前記界面活性剤は、ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではなく、又は、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔからなる群より選択される非変性性双性イオン性界面活性剤であり、好ましくはＣＨＡＰＳである。

項目３４は、項目３０から項目３３のいずれか１つのキットを特定し、前記緩衝液は、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む。

項目３５は、項目３０から項目３４のいずれか１つのキットを特定し、前記緩衝液は、約５から約７．５のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液は、約５．５から約７．５のpHを有する。

項目３６は、項目３０から項目３５のいずれか１つのキットを特定し、前記緩衝液は、少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である。

項目３７は、項目３６のキットを特定し、前記多成分緩衝液は、重複する緩衝範囲を有する少なくとも３つの緩衝性物質を含み、好ましくは、トリス、ＭＥＳ及び／又は酢酸の少なくとも１つを含む。

項目３８は、項目３０から項目３７のいずれか１つのキットを特定し、前記キットは、９６のウェル又は９６の倍数のウェルを有する１つ以上のマイクロタイタープレートをさらに含む。

項目３９は、項目３０から項目３８のいずれか１つのキットを特定し、前記緩衝液、界面活性剤及び任意選択的な非緩衝性塩は、最終反応混合物に対して少なくとも約３倍、又は約３倍から約５倍に濃縮されたアッセイ緩衝液として予め混合され、且つ／又は乾燥混合物として提供される。

項目４０は、項目３０から項目３９のいずれか１つのキットを特定し、前記非緩衝性塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群より選択され、好ましくは、前記非緩衝性塩は、ＮａＣｌ又はＫＣｌである。

項目４１は、関心対象の組換えタンパク質を製造する方法であって、（ｉ）細胞培養において関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養する工程；（ｉｉ）前記組換えタンパク質を採取する工程；（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を精製する工程；及び（ｉｖ）任意選択的に、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程；及び（ｖ）工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）において、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程を含み、前記方法が、前記組換えタンパク質を含むサンプル中の（夾雑）リパーゼ活性を検出する工程をさらに含み、この工程が、（ａ）工程（ｖ）の、真核細胞中で産生された前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；（ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程であって、前記反応溶液は、（ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、（ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、（ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び（ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩を含む工程；（ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；（ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、（夾雑）リパーゼ活性を検出する工程；任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程を含む、方法を提供する。好ましい実施態様では、工程（ｂ）（ｉｉ）における界面活性剤は、ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではない。好ましくは、前記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔからなる群より選択されるもののような、非変性双性イオン性界面活性剤であり、好ましくはＣＨＡＰＳである。

項目４２は、項目４１に記載の関心対象の組換えタンパク質の製造方法を特定し、前記方法は、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、前記サンプルが、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物である、工程（ｉｉ）；前記サンプルが、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである、工程（ｉｉｉ）；及び／又は前記サンプルが、原薬又は医薬品サンプルである、工程（ｉｖ）において得る工程を含む。

項目４３は、項目４１又は項目４２に記載の関心対象の組換えタンパク質を製造する方法を特定し、前記方法は、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、前記サンプルは、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである、工程（ｉｉｉ）において得る工程を含む。

項目４４は、項目４３に記載の関心対象の組換えタンパク質を製造する方法を特定し、前記方法は、少なくとも１つのサンプルを、アフィニティークロマトグラフィーの後、酸処理に続く深層濾過の後（又は、酸処理の後及び／又は深層濾過の後）、及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィーの後に得る工程、好ましくは、少なくとも１つのサンプルを、アフィニティークロマトグラフィーの前後、酸処理に続く深層濾過の前後（又は、酸処理の前後及び／又は深層濾過の前後）、及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィーの前後に得る工程を含む。

項目４５は、項目４１から項目４４のいずれか１つに記載の関心対象の組換えタンパク質を製造する方法を特定し、前記方法は、項目１から項目２９のいずれか１つの方法にしたがって、前記組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する工程を含む。

発色団としての４－ＭＵの選択
多くのリパーゼは、４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）の脂肪酸エステルを加水分解することができる。加水分解すると脂肪酸だけでなく、高い蛍光性の４－ＭＵも放出される（図１）。蛍光の増加は、加水分解の速度に正比例し、したがって、所与のサンプルにおける加水分解活性又はリパーゼ活性を測定するために使用することができる。

検出剤として４－メチルウンベリフェリルが選択されたのは、そのスペクトル特性が、高い量子収率と、変化するイオン強度及びpHに対する十分な非感受性とを兼ね備えているからである（データは示されていない）。これらの特性が、強固なアッセイ性能を支援する。これはさらに、例えば光散乱によって引き起こされる妨害に対して十分に非感受性である（データは示されていない）、蛍光に基づく高感度の検出原理の鍵を開ける。

リパーゼアッセイ
リパーゼアッセイには、２つの異なる緩衝液が使用されている。リン酸アッセイ緩衝液、又は多成分緩衝液であるＡＭＴ緩衝液である。リン酸緩衝液は、pH７．４で、１０８mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、１８６．２mM ＮａＣｌ、１３．３mM ＣＨＡＰＳを含み、pH ７．４の反応混合物中の最終濃度は、８１mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１９mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳとなる。pH４～８の広い緩衝範囲を有するＡＭＴアッセイ緩衝液は、４倍濃度の原液として提供され、０．３Ｍ 酢酸、０．３Ｍ ＭＥＳ、０．６Ｍ トリス、０．６Ｍ ＮａＣｌ、４０mM ＣＨＡＰＳを含み、ＨＣｌ又はＮａＯＨを使用して、述べたようにpHが調整され（推奨されるpH範囲：４～８）、反応混合物中の最終濃度は、７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、及び１０mM ＣＨＡＰＳのとなる。

前記基質は、ＤＭＳＯ中に４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ；ＦＭ２５９７３、Carbosynth） ３mMを含む濃縮原液で保存され、使用前にＤＭＳＯで１：１０に希釈されて、ＤＭＳＯ中に０．３mMを含む、使用のための１００倍原液が得られた。

測定値の比較可能性を確保するために、前記アッセイ緩衝液及び基質は、使用前に混合される。前記マスター混合物は、使用直前に調製され、所与のサンプル（例えば、原薬）を、前記基質及びアッセイ緩衝液、並びに任意選択的に追加の水を含む前記マスター混合物と混合することによって、反応が開始された。反応容器内での混合は、サンプルとマスター混合物の２つの成分のうち多量の方を加える前に、少量の方を反応容器に提供することによって行われた。したがって典型的には、前記サンプルが最初に追加された。

前記反応混合物は以下のように調製された。前記リン酸緩衝液（一定のpH ７．４）に基づくアッセイでは、Ａ）キュベット：反応容器中で、サンプル ７２０μLに、マスター混合物（リン酸アッセイ緩衝液 ２２５０μL、ＤＭＳＯ中０．３mM ４－ＭＵＤ ３０μL）を添加した、Ｂ）９６ウェルプレートのウェルあたり：反応容器中で、サンプル ７２μLに、マスター混合物（リン酸アッセイ緩衝液 ２２５μL、ＤＭＳＯ中０．３mM ４－ＭＵＤ ３μL）を添加した。ＡＭＴ緩衝液（３成分緩衝液とも呼ばれる）（可変pH）に基づくアッセイでは、Ｃ）キュベット：反応容器中で、サンプル ７２０μLに、マスター混合物（４倍ＡＭＴアッセイ緩衝液 ７５０μL、Ｈ_２Ｏ １５００μL、ＤＭＳＯ中０．３mM ４－ＭＵＤ ３０μL）を添加した、Ｄ）９６ウェルプレートのウェルあたり：反応容器中で、サンプル ７２μLに、マスター混合物（４倍ＡＭＴアッセイ緩衝液 ７５μL、Ｈ_２Ｏ １５０μL、ＤＭＳＯ中０．３mM ４－ＭＵＤ ３μL）を添加した。

基質４－ＭＵＤの加水分解を、放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、混合直後から、蛍光強度に応じて数分間から５時間まで、リアルタイムで測定した。４－ＭＵの放出を示す蛍光（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０又は３４０nm）を、２５℃で、キュベット中、蛍光分光計を用いて、又は９６ウェルプレート中、適切なマイクロプレートリーダーを用いてのいずれかで監視した。蛍光分光計(Fluoromax 4, Horiba Jobin Yvon)の使用とプレートリーダーSpectraMax M3 (Molecular Devices)の間に、高い相関が認められた（図９を参照のこと）。潜在的な自己加水分解を除外するために、サンプルを含まない陰性対照を含めた。直線当てはめを用いて勾配（例：ＲＦＵ／ｓ）を計算した。蛍光をリアルタイムで検出することにより、擬似ゼロ次反応速度で時間枠内に測定することが可能になる。サンプルは少なくとも３回試験し（run）、例えばウェル内の気泡などにより、擬似ゼロ次反応速度を満たさない場合、個々の反応混合物を分析から除外した。この外れ値を除去する方法は、アッセイの感度を強く高めることが見出された。規定された濃度の４－ＭＵを用いた検量線を使用して、加水分解の速度（例えばnmol／秒）を計算することができる。既知の４－ＭＵ濃度を使用した検量線はさらに、様々なpH値での反応速度の決定と比較を可能にした。

ＡＭＴ緩衝液の開発
前記リパーゼアッセイは、最初はリン酸アッセイ緩衝液を使用して設定された。変動するpHでの様々な医薬品サンプル中の加水分解活性の速度論的測定のために、３成分のＡＭＴ緩衝液が開発された。緩衝性物質として酢酸、ＭＥＳ及びトリスを含む前記ＡＭＴ緩衝液は、より広いpH緩衝範囲、及びそれゆえのより広いpH範囲、又は異なるpHでさえも、測定を可能にする。使用される緩衝性物質は、非蛍光性で、不十分な金属キレート剤であることが知られており、酵素活性への干渉の可能性は少ない。前記リン酸アッセイ緩衝液に匹敵するものとして、ＣＭＣ超のＣＨＡＰＳを加え、イオン強度を、ＮａＣｌを用いて調整した。前記アッセイは、イオン強度に敏感であることが判明したため、緩衝範囲が重複する緩衝性物質を含む緩衝液というだけでなく、種々のpH（pH４～８の範囲）で、イオン強度を中程度にしか変化させない（１５％未満、好ましくはさらに１０％未満）緩衝液を作成することが重要であった(Ellis KJ, Morrisson JF, 1982. Methods in Enzymology, 87: 405-426)。前記ＡＭＴ緩衝液は、例えば、加水分解活性を低下させる条件（pH条件を含む）を特定することを可能にする。この緩衝液はさらに、サンプルのpHで測定を行って、サンプルに存在するリパーゼ活性を特定の条件で測定することに加えて、精製中の様々な状態のリパーゼ活性を比較することを可能にする。前記アッセイは、至適pHでサンプルを測定することにより、感度をさらに高めることを可能にする。

ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法
ＨＰＬＣ－ＣＡＤを用いて、水溶液中のポリソルベートの含有量を定量した。イソプロパノール又はその等価物を含有する水性移動相を用いて、元の状態の（intact）ポリソルベートを、逆相とイオン交換ポリマーの混合物に基づく混合モードのカラムに結合させた。次に、アセトニトリル又はその等価物を有する移動相を用いてポリソルベートを溶出させた。より具体的には、１０mM ギ酸アンモニウム、pH ４．５、２－プロパノール ２０％（v/v）の移動相Ａ（ＭＰＡ）と、アセトニトリル ５０％（v/v）及び２－プロパノール ５０％（v/v）を含む移動相Ｂ（ＭＰＢ）を用いて、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行った。タンパク質及びマトリックス成分、並びにポリソルベート分解物の分離は、１．０mL／分のＭＰＡの流れを用いて、混合モードカラム(Ｏａｓｉｓ（商標登録）Ｍａｘ Ｏｎｌｉｎｅ ｃｏｌｕｍｎ、２．１mm×２０mm、３０μm、８０Å）上で達成され、ＭＰＢを用いた段階的なグラディエントによって、元の状態のポリソルベート種を溶出させた。前記分析物は、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を用いて検出された。ＣＡＤ検出は、分析物を噴霧し、移動相を除去し、荷電粒子の形成を誘導する不活性ガス流システムを採用している。測定された誘導電流は、サンプル中に含まれるポリソルベートの量に比例する。ポリソルベートは、外部較正標準系列を用いて定量した。

蛍光ミセルアッセイ
Ｎ－フェニル－１－ナフチルアミン（ＮＰＮ）のような蛍光分子は、界面活性剤の存在下で水溶液に可溶化することができる。界面活性剤がその臨界ミセル濃度を超えると、蛍光剤が疎水性であるミセルの内部に入り込むので、蛍光量子収率の大きな増加が観察される。可溶化された蛍光剤の量は、溶液中のミセルの濃度に正比例する。より詳細には、サンプルは、ＮＰＮ ５×１０^－６Ｍでスパイクされ、蛍光は、蛍光検出器（λ_ｅｍ＝４２０nm、λ_ｅｘ＝３５０nm）を用いて検出された。ポリソルベートは、外部較正標準系列を用いて定量した。

実施例１：リパーゼアッセイは、様々な原薬中の活性を測定することを可能にする
前記リパーゼアッセイは、最終的な医薬品におけるポリソルベート分解の原因となる最終原薬中のリパーゼ活性を除去するために、精製後の様々な原薬中のリパーゼ活性を測定し、また下流の処理の間の精製工程を適合させ、改善する助けとなるように開発された。いくつかの原薬中に存在する宿主細胞タンパク質として共精製される夾雑リパーゼ活性は、精製工程のみならず、タンパク質によっても異なる場合がある。様々なリパーゼは、特定の至適pHを示すが、これは通常、それらの細胞局在に関連しており、例えば、リソソームリパーゼは、典型的には酸性の至適pHを有する。

したがって、前記リパーゼアッセイは、変動するpHでの種々のバルク原薬（ＢＤＳ）中の、加水分解活性の速度論的測定のために使用された。このため、pH４～８の範囲内でpH依存性を測定するために、前記ＡＭＴ緩衝液が確立された。前記ＢＤＳを、各サンプルにつき１ウェルあたり７２μLで、希釈されない形で使用した。既知の４－ＭＵ濃度の検量線により、各pHでの反応速度をnmol/分/mLで測定することができた。陰性対照として、非酵素的加水分解を監視するためにのみ、製剤緩衝液を用いて空試験を実施した。任意選択的に、０．２４mg/mL以下でブタ膵リパーゼ（ＰＰＬ）などの市販のリパーゼを使用する陽性対照が含まれた。医薬品（ＢＤＳの製品Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥ（ＢＤＳ Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥ）と呼ばれる）は、検出された加水分解活性の量（図２を参照のこと）、並びに加水分解活性のpHプロファイルが異なっていた。例えば、ＢＤＳ ＡがアルカリpHで明確な至適pHを示す一方、ＢＤＳ Ｄ及びＢＤＳ Ｅは、むしろ酸性pHで至適pHを示した（図２）。pH７．５以上では、自己加水分解が、残存する加水分解活性の原因となる場合がある（ＢＤＳ Ｂ及びＢＤＳ Ｅを参照のこと）。これは、残存する加水分解活性を、オルリスタットのようなリパーゼ阻害剤の存在下（３．３μM）で検出するか、又は、リパーゼ活性を含まないブランクサンプル（サンプル緩衝液又は培地）を並行して試験することによって検証できる（データは示されていない）。この実験では、ＢＤＳ Ｂのもののような極端に低いリパーゼ活性でも、至適pH（pH６）で検出可能であることも実証された。

全体として、試験された様々な原薬サンプルの間でpH依存性が異なることが見出されており、これは、種々の原薬が、リパーゼ活性を有する種々の夾雑タンパク質を含み、それらが時に、特有の至適pHを伴うことを示している。これは、前記アッセイが、試験されたサンプル中の、リパーゼ活性を有するそのような異なる酵素を検出するのに有用であることを実証している。

さらに、種々の製剤緩衝液を種々のpHで試験して、種々の製剤緩衝液が、医薬品中のリパーゼ活性を支援し、又は抑制しうることを実証した（データは示されていない）。

実施例２：基質濃度の影響
観察される反応の十分に高い感度を達成するためには、溶液中に十分な基質を有することが重要である。この必要性は、水ベースのマスター混合物及び反応混合物における４－ＭＵＤ及びその誘導体の限られた溶解度と競合する。高濃度で４－ＭＵＤを水に加えると、瞬時に目に見える粒子が形成された。ＣＨＡＰＳのような界面活性剤のアッセイ混合物への添加は、４－ＭＵＤの溶解度を大幅に増加し、それゆえ、沈殿を防いだ。

そこで、１組の光散乱及び活性実験を実施することによって、意図される使用のための理想的な基質濃度が決定された。１cmマクロキュベットにて、蛍光分光計（λ_ｅｍ＝４００nm、λ_ｅｘ＝４００nm）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ７）中で、直角光散乱（ＲＡＬＳ）実験を用いて４－ＭＵＤの溶解度を試験した。１０mM ＣＨＡＰＳを含むＡＴＭ緩衝液中の最大溶解度は、４－ＭＵＤの約４０μMであることが見出された（図３）。

バルク原薬（ＢＤＳ Ｄ）における加水分解活性のミカエリス・メンテン反応速度論を分析した（１ウェルあたり７２μL、希釈されていないＢＤＳ Ｄ）。アッセイは、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中で、４－ＭＵＤの濃度を変えて（１．５６２５μM～１５０μM）実施した。pHはバルク原薬のpHに調整した。図４に示すように、反応の速度は、３μM又はそれ未満の４－ＭＵＤでも、高速読み取りを支援するのに十分であることが見出された。典型的には、４－ＭＵの放出は、混合直後に測定され、数分から数時間、典型的には約２０分から約２時間検出される。

その結果、１μMから１０００μMの濃度でも使用できるが、３μMから３０μMの間の４－ＭＵＤの濃度が、標準濃度として使用するための合理的な妥協点であることが証明された（図４）。

特殊な単位操作及び／又はトラブルシューティング活動の場合は、例えばミカエリス・メンテン反応速度論を測定するために、より高い濃度が好ましい場合がある（図４）。そのため、図５に示すようにＣＨＡＰＳ濃度を上げてもよく、他の適切な界面活性剤（例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）を使用することもできる。

実施例３：脂肪酸鎖長の影響
アシルエステル誘導体の４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）を選択したのは、デカン酸のアシルエステルが、例えば、より長い不飽和のアシル鎖を含む、オレイン酸エステルを用いたものと比較して、より広い酵素スペクトルを獲得するためである。さらに、デカン酸エステルのより短い鎖長は、例えばオレイン酸エステルと比較して、水性反応混合物におけるより良好な溶解性を提供した。その結果、より多くの基質をアッセイ混合物に使用することができる。より具体的には、Ｃ_１６又はより長い鎖長で、溶解度が強く制限されるようになることが見出された（データは示されていない）。さらに、デカン酸エステルは、例えば酪酸エステルと比較して、自己加水分解に対するより良好な耐性を提供することが見出された（図６）。４－メチルベリフェリル ブチラート（４－ＭＵＢ）及び４－ＭＵＤの自己加水分解を分析した。ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を用いて、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中で、３０μM ４－ＭＵＢと３０μM ４－ＭＵＤを用いて、蛍光を１８００秒間監視し、比較した。さらに、本発明者らは、Ｃ_５までの鎖長が自己加水分解を強く増加させることを測定した（データは示されていない）。Ｃ_８鎖を有するが、異なる発色団を有する基質を使用すると、より多いが、それでも許容可能な自己加水分解が示された（データは示されていない）。まとめると、使用される特定の基質が重要であり、アッセイの感度を強く改善し、向上させることが実証された。アッセイに使用される４－ＭＵＤにおけるＣ_１０脂肪酸が、最適な選択であることが見出された。

実施例４：反応混合物中の界面活性剤の影響
反応条件は、リパーゼの加水分解活性のような、関連する酵素の活性を維持し、支援するように設計されるべきである。とりわけ、アッセイの反応混合物を修正することによって、この要件が達成された。

始めに、界面活性剤を、そのＣＭＣ（臨界ミセル濃度）超で試験した。したがって、１０mM ＣＨＡＰＳをアッセイに加えた。具体的には、前記アッセイは、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、ボトムリードモード）を使用して、１０mM ＣＨＡＰＳを含むか又は含まないＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施した。試験したサンプルは、製品Ｇ、製品Ｂ、製品Ｆ及び製品Ｄを限外濾過／透析濾過した後のサンプルを含む原薬サンプルであり、１ウェルあたり７２μLをそれぞれ加えた。結果は、図７Ａ及びＢに示されており、ＣＭＣ超のＣＨＡＰＳなどの界面活性剤の存在が、アッセイの感度を向上させたことを実証している。理論に縛られるものではないが、界面活性剤は、活性部位を覆うと記述されている蓋又はフラップの再配列と開口を可能にすることによって、リパーゼ活性を促進する環境を作り出すという仮説が立てられている(Grochulski P, Li Y, Schrag JD, et al. Protein Sci 1994; 3:82-91 and Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, et al. Biochemistry 1994; 33:3494-500)。したがって、最終的な反応混合物中、１０mM ＣＨＡＰＳの濃度が選択された。その結果、リパーゼ加水分解が増加し、加えてアッセイの感度が向上した（図７）。

前記界面活性剤は、別の界面活性剤でありうるが、リパーゼ活性を有するタンパク質の本来の構造及び活性を維持するためには、穏やかな、具体的には非変性の界面活性剤であることが必要である。さらに、前記界面活性剤は、リパーゼ／加水分解と競合しない、又は阻害しないことが重要である。ＣＨＡＰＳは、エステル結合又はアシル鎖を有さず、したがってリパーゼの基質ではない。したがって、前記基質と競合せず、それゆえアッセイの感度に影響を与えない。さらに、ＣＨＡＰＳは、使用した濃度での水中の４－ＭＵＤの溶解度を仲介する（図３）。

実施例５：様々なpH値を有するサンプルの測定
酵素の活性は、しばしばpHの影響を受ける。工程内管理（ＩＰＣ）サンプルの予想されるpHの範囲は３．５から７．５に達するので（表１）、夾雑リパーゼの観測される活性への影響が予想された。様々なpH値のサンプル間の比較可能性を最大にするため、反応混合物においてpHを一定の７．４に維持するように、第一の緩衝成分が特定された。表１は、様々な精製工程に由来するサンプルのpHを実証するために、１つの下流処理からの様々なＩＰＣサンプルを要約している。各サンプルのpHと、対応する反応混合物のpHを示す。同様のpH変動が、下流処理の間に、様々な抗体又はＦｃ融合タンパク質で見出された。実験はいくつかの製品で行われ、同様の結果をもたらした。

同じpHでＩＰＣサンプルを分析することは、一定の反応条件を維持し、それゆえ、得られるデータの比較可能性を高める。しかし、場合によっては、例えば加水分解活性を低下させる条件を見出し（例えば、図２を参照）、製剤の開発を支援するために、pHを変更することが有益である。したがって、３成分ＡＭＴ緩衝系が開発された。

実施例６：イオン強度の影響
サンプル中のタンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質の本来の構造を維持するためには、イオンを提供することが有益である。しかし、イオン強度はまた、酵素活性に影響を与える場合がある。そこで、測定される加水分解活性に及ぼすイオン強度の影響を試験した。例示的な医薬品サンプルの加水分解活性を、様々な濃度のＮａＣｌ（１０００mM～７．８１２５mM）の存在下で測定した。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３４０nm、２５℃、トップリードモード）を使用して、ＮａＣｌを含まないＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中で、３０μM ４－ＭＵＤと、サンプル ７２μLを用いて実施した。加水分解活性のイオン強度への依存性が、いくつかのｍＡｂを用いて検討されており、図８で例示的に製品Ｆについて示されている。

図８からわかるように、リパーゼ活性は、２５０mM以上のＮａＣｌ濃度で減少した。したがって、ＡＭＴ緩衝液では、１５０mMのＮａＣｌ濃度が最適であることが見出された。

実施例７：ポリソルベートによるリパーゼアッセイの阻害
最終的な医薬品中のポリソルベートは、追跡可能な蛍光基質（４－ＭＵＤ）に対する競合基質として機能する可能性が高い。医薬品中のポリソルベート２０（ＰＳ２０）又はポリソルベート８０の濃度は、約０．２g/Lから１．０g/Lの間の範囲であってよく、典型的には０．２g/Lから０．４g/LのＰＳ２０又はＰＳ８０、又はそれらの混合物である。そこで、抗体の限外濾過－透析濾過材料を薬学的有効成分（水中のＡＰＩ、ＰＳ２０なし）として使用し、反応混合物に様々な濃度のＰＳ２０（０．０１２５～３．２mg/mL）を加える実験を設定した。

サンプル中の４－ＭＵＤの加水分解活性を、ＰＳ２０ ０．０１２５～３．２mg/mL（最終反応混合物濃度）の存在下で測定した。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（５０mM 酢酸、５０mM ＭＥＳ、１００mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中、３０μM ４－ＭＵＤで実施した。この最初の実験では、ＡＭＴ緩衝液をより低い濃度で使用したが、その後これはpH４及びpH８での緩衝には低すぎることがわかった。そこで、上記の濃度まで濃度を上げた。

結果は、ＰＳ２０が、高濃度では４－ＭＵＤ加水分解に対する競合阻害剤であることを示す。反応混合物中、ＰＳ２０ ０．２g/Lまで（ＤＰ中０．８g/L以上）は阻害は観察されなかったが、アッセイサンプル中０．４g/L以上の濃度で濃度依存的な阻害が観察され、４－ＭＵＤ加水分解は、ＰＳ２０ ０．４g/Lの濃度でも明らかに検出可能であった（図９）。対照的に、Ｊａｈｎら(Pharm. Res., 2020, 37:118, pages 1-13)は、サンプル中ＰＳ２０ ０．０２％（w/v）（０．２g/L）で、ほぼ完全な阻害を既に観察しており、本発明によるリパーゼアッセイのより高い感度を示している。

リパーゼアッセイの阻害が予想されたのは、アッセイで検出された４－ＭＵＤの加水分解活性と、ポリソルベートの分解の間の相関を、それが示すことによる。しかし、医薬品中でもリパーゼ活性の測定が可能であるためには、抗体製剤に典型的に適用される濃度、例えば０．１g/Lから０．４g/Lが、アッセイに干渉しないか、又はわずかしか干渉しないと有利である。

全体として、データは、製剤化された原薬に一般的に使用されるポリソルベート濃度を含むサンプルを分析する４－ＭＵＤ実験では、活性に有為な影響はないと予想されることを示している。

実施例８：リパーゼ活性に対する他の洗剤の影響
Ｊａｈｎら(Pharm. Res., 2020, 37:118, pages 1-13)は、界面活性剤、中でもＴｒｉｔｏｎＸ－１００の存在によって引き起こされる、ＰＰＬ活性に対する不活性化効果を報告した。そこで、ＰＰＬ（反応混合物中０．０２４mg/mL）、並びにＢＤＳ Ｂ及びＢＤＳ Ｅ（反応混合物中２．４mg/mL）の加水分解活性を、１０mM ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ０．２５％、又はＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ０．２５％及びアラビアゴム ０．１２５％のいずれかを含む、pH５．５のＡＴＭ緩衝液中で測定した。図１０Ａ－Ｃに示す結果は、ＣＨＡＰＳがＴｒｉｔｏｎＸ－１００並びにＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びアラビアゴムよりも性能が優れていることを実証している。アラビアゴムは乳化剤であり、どの実験においても、活性に対するアラビアゴムの影響は観察されていない。

実施例９：４－ＭＵＤアッセイのＩＰＣサンプル分析に対する適合性
ＩＰＣサンプル分析に対する前記４－ＭＵＤアッセイの適合性を、いくつかの例示的な処理について試験した。そこで、様々な下流の処理段階からの工程内管理サンプルについて、溶解度が十分であるか、pHが予想された範囲内であるか、速度論測定値が要件（擬ゼロ次反応速度）を満たしているかを分析した。

表２は、粒子、イオン強度、pH及び他のいくつかの影響因子の可能性のある影響に関する、処理サンプルの適用可能性を示している。サンプルは３回分析し、擬ゼロ次反応速度の要件を満たさない反応混合物は分析から除外した。

アッセイの適合性を示すことができ、その結果、アッセイは、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に続く工程を含む、試験された全ての工程段階、及び最終的な製剤化されたバルク原薬（ＢＤＳ）に適用することができた。

分光計（図１１Ａ）及びプレートリーダー（図１１Ｂ）において、リパーゼアッセイを使用して、特定の抗体についてこれをさらに測定した。

４－ＭＵＤ プレートリーダーアッセイの結果は、概して、分光計の結果とよく相関した。どちらの読み出しも、製品含有サンプルにおけるリパーゼ活性が、溶出緩衝液単独と比較して低く、また原薬におけるリパーゼ活性が、製剤緩衝液単独と比較して低いことを実証しうるものであった。４－ＭＵＤアッセイは、高スループット目的のマイクロタイタープレートフォーマットで実施することができ、したがって自動化することができる。

実施例１０：リパーゼ阻害剤の効果
エステル結合の酵素的加水分解を阻害することが可能ないくつかの物質が存在する。したがって、医薬品、原薬及びバイオ医薬品開発の他の処理段階におけるポリソルベートの分解を減少させることが可能な阻害剤は、４－ＭＵＤアッセイにより監視される加水分解活性も阻害するはずである。

そこで、サンプルを、不可逆的リパーゼ阻害剤であるオルリスタット(Borgstrom 1988) １μMと共に、又はなしでインキュベートし、室温（約２２℃）で２ヶ月間、pH５．５で安定性を試験した。ＰＳ２０ ０．２mg/mLを含む医薬品サンプル（製品Ｄ）を、いくつかの採取点（pull point）を設けて、室温で最大５６日間インキュベートした。ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を用いて、示された時点で、ＰＳ２０の含有量を測定した。図１２に示すように、１μM オルリスタットは、対照の反応物（ＤＭＳＯのみ）と比較して減少した、ＰＳ２０の分解をもたらした。

同じ医薬品サンプル（製品Ｄ）の加水分解活性を、リパーゼアッセイを用いて、様々な濃度のオルリスタット（７．３nM～２０μM）の存在下で測定した。すべての測定は、ブラック９６ウェルプレートにおいて、マイクロプレートリーダー（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３３０nm、トップリードモード）を使用して、ＡＭＴアッセイ緩衝液（７５mM 酢酸塩、７５mM ＭＥＳ、１５０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ５．５）中で、３０μM ４－ＭＵＤを用いて実施した。図１３に示すように、オルリスタットは、４－ＭＵＤアッセイによって測定されるように、濃度依存的にリパーゼ活性を阻害した。結果は、オルリスタットが、ポリソルベートの分解の原因となる加水分解活性（図１２）に加えて、４－ＭＵＤアッセイを使用して監視される加水分解活性（図１３）をも阻害していることを示唆している。さらに、阻害は、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して、数日というよりも数分以内に、はるかに低い阻害剤濃度で検出可能であった。

実施例１１：４－ＭＵＤ活性と比較した、スパイク実験におけるポリソルベートの分解
４－ＭＵＤアッセイによって測定された加水分解活性と、ポリソルベートの分解の間の相関を試験するために、ポリソルベートのスパイク実験を行った。ポリソルベートの分解速度を評価するために、関連する処理工程内（ＩＰＣ）サンプルを、ポリソルベートでスパイクし、その結果として、蛍光ミセルアッセイ（ＦＭＡ）によってポリソルベート含有量を経時的に監視した。試験されたＩＰＣサンプルは、プロテインＡ精製（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）後、深層濾過（Ｃｕｎｏ）後、イオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ）後のサンプル及び原薬（ＢＤＳ）を含む。

ポリソルベートの分解を、ＦＭＡアッセイを用いて測定し、リパーゼアッセイ（１cmマクロキュベット中、蛍光分光計（λ_ｅｍ＝４５０nm、λ_ｅｘ＝３４０nm）を使用して、３μM ４－ＭＵＤを含むリン酸アッセイ緩衝液（８１mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１９mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣＨＡＰＳ、pH ７．４）を使用）によって測定した加水分解活性と比較した。結果（図１４）は、リパーゼアッセイによって測定された加水分解活性の、製品Ｂの関連するＩＰＣ工程におけるポリソルベートの分解との相関関係を示唆している。

Claims (16)

1. 組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する方法であって、下記（ａ）～（ｄ）：
   （ａ）真核細胞中で産生された組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；
   （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程であって、前記反応溶液は、下記（ｉ）～（ｉｖ）：
   （ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、
   （ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）、
   （ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び
   （ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩
   を含む工程；
   （ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；
   （ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、リパーゼ活性を検出する工程；
   任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程
   を含む方法。
2. 前記混合物中の前記サンプル及び前記基質が、２分と５時間未満の間、２分と３時間未満の間、２分と２時間未満の間、又は２分と０．５時間未満の間のいずれかの時間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
3. 前記基質が、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、
   （ａ）前記界面活性剤が、その前記反応混合物中の臨界ミセル濃度よりも高い、前記反応混合物中の最終濃度を有する；及び／又は
   （ｂ）前記界面活性剤が、
   （ｉ）ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔからなる群より選択され、好ましくはＣＨＡＰＳである；又は
   （ｉｉ）ＣＨＡＰＳであり、且つ約８mMから約２０mM、好ましくは約８mMから約１５mM、より好ましくは約１０mMの、前記反応混合物中の最終濃度で提供される；又は
   （ｉｉｉ）ポリエチレングリコールtert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではない、方法。
5. 前記緩衝液が、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記緩衝液が、
   （ａ）約５から約７．５のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液は、約５．５から約７．５のｐHを有する；及び／又は
   （ｂ）少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である、
   先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
7. 先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、
   （ａ）前記非緩衝性塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群より選択され、好ましくは、前記非緩衝性塩が、ＮａＣｌ又はＫＣｌである；及び／又は
   （ｂ）前記非緩衝性塩が、前記反応混合物中で約１００mM～約２００mM、好ましくは約１３０mMから約１７０mM、より好ましくは約１４０mMから約１５０mMの濃度を有する；及び／又は
   （ｃ）前記非緩衝性塩のイオン強度が、前記反応混合物中で約２００mM以下、好ましくは反応混合物中で約１５０mM以下である；及び／又は
   （ｄ）前記反応混合物中の前記緩衝液及び前記非緩衝性塩の累積イオン強度が約４５０mM以下、好ましくは前記反応混合物中で約４００mM以下、より好ましくは約３５０mM以下である、方法。
8. 先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、
   （ａ）前記少なくとも１つのサンプルが、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）、工程内管理（ＩＰＣ）サンプル、原薬サンプル又は医薬品サンプルである；及び／又は
   （ｂ）前記組換えタンパク質が、リパーゼではなく、且つ／又はリパーゼ活性を有する酵素ではない；及び／又は
   （ｃ）前記組換えタンパク質が、抗体、抗体断片、抗体由来分子及び融合タンパク質からなる群より選択される、方法
9. 関心対象の組換えタンパク質を製造する方法であって、下記工程（ｉ）～（ｖ）：
   （ｉ）細胞培養において関心対象の組換えタンパク質を発現する真核細胞を培養する工程；
   （ｉｉ）前記組換えタンパク質を採取する工程；
   （ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を精製する工程；及び
   （ｉｖ）任意選択的に、前記組換えタンパク質を、投与に適した薬学的に許容され得る製剤に製剤化する工程；及び
   （ｖ）工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）において、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを得る工程
   を含み、
   前記方法が、前記組換えタンパク質を含むサンプル中のリパーゼ活性を検出する工程をさらに含み、この工程が、下記工程（ａ）～（ｄ）：
   （ａ）工程（ｖ）の、真核細胞中で産生された前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを提供する工程；
   （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルを反応溶液と接触させて、反応混合物を形成する工程であって、前記反応溶液は、下記（ｉ）～（ｉｖ）：
   （ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液、
   （ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤は、ポリエチレングリコールtert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではない））、
   （ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記４－ＭＵエステルは、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６～Ｃ_１６）４－ＭＵエステルである）、及び
   （ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩
   を含む工程；
   （ｃ）前記サンプル及び前記基質を、前記反応混合物中でインキュベートする工程；及び
   （ｄ）前記４－ＭＵエステルの加水分解を測定すると共に、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を検出することによって、リパーゼ活性を検出する工程；
   任意選択的に、工程（ｃ）にしたがって前記サンプル及び前記基質を前記反応混合物中でインキュベートしながら、前記放出された発色団４－ＭＵの蛍光強度を経時的に検出することによって、加水分解を測定する工程
   を含む、方法。
10. 前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、
    前記サンプルが、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）又は細胞溶解物である、工程（ｉｉ）；
    前記サンプルが、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルである、工程（ｉｉｉ）；及び／又は
    前記サンプルが、原薬サンプル又は医薬品サンプルである、工程（ｉｖ）
    において得る工程を含み、
    好ましくは、前記組換えタンパク質を含む少なくとも１つのサンプルを、工程（ｉｉｉ）において得る工程を含み、前記工程（ｉｉｉ）が、少なくとも１つのサンプルを、アフィニティークロマトグラフィーの前後、酸処理の前後、深層濾過の前後、及び／又はイオン交換クロマトグラフィーの前後に、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーの前後に得る工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つのサンプル中で検出されるリパーゼ活性が、夾雑リパーゼ活性である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 組換えタンパク質を含むサンプル中の夾雑リパーゼ活性を測定するためのキットであって、下記（ｉ）～（ｖ）：
    （ｉ）約pH４から約pH９のpHを有する緩衝液；
    （ｉｉ）エステル結合を有しない非変性性界面活性剤（前記界面活性剤は、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤である）；
    （ｉｉｉ）発色団４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）を、４－ＭＵエステルの形で含む基質（前記基質は、飽和非分岐鎖脂肪酸（Ｃ_６からＣ_１６）４－ＭＵエステルである）；及び
    （ｉｖ）任意選択的に、非緩衝性塩；及び／又は
    （ｖ）任意選択的に、希釈用の水
    を含む、キット。
13. 請求項１２に記載のキットであって、
    （ａ）前記基質が、４－メチルウンベリフェリル オクタノアート、４－メチルウンベリフェリル ノナノアート、４－メチルウンベリフェリル デカノアート（４－ＭＵＤ）、４－メチルウンベリフェリル ウンデカンノアート及び４－メチルウンベリフェリル ドデカノアートからなる群より選択され；及び／又は
    （ｂ）前記キットが、前記基質を溶解するための有機溶媒をさらに含む、キット。
14. 請求項１２又は１３のいずれか１項に記載のキットであって、
    （ａ）前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ及びサポニンからなる群より選択され、好ましくはＣＨＡＰＳであり；及び／又は
    （ｂ）前記界面活性剤が、ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）ではなく、且つポリエチレングリコール ノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）ではなく；
    （ｃ）前記緩衝液が、ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、コハク酸、ＴＥＳ（２－｛[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリス塩基、トリス、ビス－トリス、ビス－トリス－プロパン、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３－（[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、トリシン（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＨ_２ＰＯ_４からなる群より選択される１つ以上の緩衝性物質を含む、キット。
15. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載のキットであって、
    （ａ）前記緩衝液がpH約５から約７．５のpHを有し、好ましくは、前記緩衝液が約５．５から約７．５のpHを有する；
    （ｂ）前記緩衝液が、少なくとも約pH５から少なくとも約pH７．５、好ましくは少なくとも約pH４から少なくとも約pH８の緩衝範囲を有する多成分緩衝液である；及び／又は
    （ｃ）前記非緩衝性塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群から選択され、好ましくは、前記非緩衝性塩が、ＮａＣｌ又はＫＣｌである、キット。
16. 請求項１２～１５のいずれか１項に記載のキットであって、
    （ａ）前記キットが、９６ウェル又は９６の倍数のウェルを有する１つ以上のマイクロタイタープレートをさらに含み；及び／又は（ｂ）前記緩衝液、界面活性剤及び任意選択的な非緩衝性塩が、最終反応混合物に対して約３倍から約５倍の濃度であるアッセイ緩衝液として予め混合され、且つ／又は乾燥混合物として提供される、キット。