CN116033921A - 用于生产蛋白质组合物的方法 - Google Patents

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CN116033921A CN202180057149.1A CN202180057149A CN116033921A CN 116033921 A CN116033921 A CN 116033921A CN 202180057149 A CN202180057149 A CN 202180057149A CN 116033921 A CN116033921 A CN 116033921A
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Abstract

本发明一般地涉及提供用于制备蛋白质组合物的手段和方法。本发明提供了一种方法，其包括以下步骤：(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中所述水解酶抑制剂被固定在固体载体上；(ii)回收包含所述蛋白质的组合物。另外，本发明涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其包括以下步骤：(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中所述水解酶抑制剂被固定在固体载体上；(ii)回收包含所述蛋白质的组合物，其中用于制备所述蛋白质制剂的所述方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到包含所述蛋白质的所述组合物。此外，本发明涉及通过本文所述的方法获得或能够获得的蛋白质组合物和/或涉及通过本文所述的方法获得或能够获得的蛋白质制剂。

Description

用于生产蛋白质组合物的方法
本发明一般地涉及提供用于制备蛋白质组合物的手段和方法。本发明提供了一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
此外，本发明涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中用于制备蛋白质制剂的方法进一步包括向包含蛋白质的组合物加入表面活性剂，优选脂肪酸酯。
此外，本发明涉及通过本文所述的方法获得或能够获得的蛋白质组合物和/或涉及通过本文所述的方法获得或能够获得的蛋白质制剂。
重组生物制药蛋白(例如单克隆抗体(mAb)、抗体片段(Fab)、复合物、抗体衍生蛋白和融合蛋白)通常在中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞系中以高表达率表达(Durocher(2009)Curr.Opin.Biotech.20:700-707)。在这些蛋白质的纯化期间，需要消除或至少充分减少宿主细胞蛋白质(HCP)的量，以保证患者对于药物的临床或市场应用的安全性(Vanderlaan(2018)Biotechnol Prog.34:828-837)。具有水解活性的HCP可导致表面活性剂降解(Labrenz(2014)J.Pharm.Sci.103:2268-2277)。酶源表面活性剂降解已经在生物制药行业中的多种生物制药制剂中被观察到，并且由于表面活性剂介导的防止蛋白质聚集的减少和/或由于积累的表面活性剂分解产物而可能导致可见颗粒形成(Labrenz(2014)J.Pharm.Sci.103:2268-2277；Cao(2015)J.Pharm.Sci.104:433–446；Larson(2020)J.Pharm.Sci.109:633-639；Graf(2020)Eur.J.Pharm.Biopharm.152:318-326)。颗粒和/或聚集体形成继而导致保质期限制。
最近的研究揭示了若干水解酶，其归因于生物制药制剂中增加的表面活性剂降解，包括脂蛋白脂肪酶(LPL)(Chiu(2017)Biotechnol.Bioeng.114:1006-1015)、溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)(Hall(2016)J.Pharm.Sci.105:1633-1642)和推定的磷脂酶B样2(PLBL2)(Dixit(2016)J.Pharm.Sci.105:1657-1666)。最值得注意的是，这些酶在下游处理过程中的持久性已被反复证明，突显了其难以去除和/或mAb关联性质(Valente(2014)Biotechnol.Bioeng.112:1232-1242；Levy(2014)Biotechnol.Bioeng.111:904-912；Tran(2016)J.Chromatogr.A 1438:31-38)。
人们对于单独的HCP(包括水解酶，诸如脂肪酶)的选择性去除知之甚少。据观察，大部分源自表面活性剂(如聚山梨醇酯20或80)的降解的含有脂肪酸的聚集体/可见颗粒在(长期)储存期间增加(Labrenz(2014)J.Pharm.Sci.103:2268-2277；Tomlinson(2015)Mol.Pharmaceutics 12:3805-3815)。这激发了用以消除引发聚山梨醇酯降解的污染物的策略的发展。基于稳定性研究以及脂肪酶活性测定，针对HCP去除对纯化期间的洗涤和/或孵育步骤的表现进行了评定，并且发现在含有聚山梨醇酯的蛋白质制剂的(长期)储存研究期间生成颗粒的剩余风险仍然存在。例如，WO2016/057739使用疏水相互作用介质来减少脂肪酶。然而，所述方法的缺点是疏水相互作用色谱法依赖于分子特性(疏水性)方面的差异。这种方法的适用性可能因蛋白质的性质而异。此外，取决于蛋白质的疏水性和所应用的缓冲条件，蛋白质可能与HIC树脂结合或导致产物的潜在产量损失。
因此，需要降低蛋白质组合物中的水解活性的手段和方法。
本发明潜在的技术问题是提供用于制备具有增加/较高的稳定性的蛋白质组合物和/或用于降低蛋白质组合物中的水解活性的手段和方法。通过提供权利要求中所表征并且如下文所提供的实施例来解决技术问题并且满足上述需求。
本发明涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
如所附实例中所示，令人惊奇并且出乎意料地发现，水解酶抑制剂可以被固定在固体载体上而不损失功能性(即固定的抑制剂保留与水解酶的结合)。由此可以可靠地从蛋白质组合物去除水解酶。
实例1表明固定的水解酶抑制剂奥利司他B保留与溶酶体脂肪酶A2(LPLA2)相互作用的能力。抗体溶液掺有重组LPLA2并且随后与固定在磁珠上的奥利司他B一起孵育。孵育后，对珠子进行LC-MS/MS分析，表明LPLA2对珠子具有高亲和力(图2B)。此外，结果表明，和与没有奥利司他B的对照珠子一起孵育的抗体溶液相比，与固定在珠子上的奥利司他B一起孵育的抗体溶液显示出水解活性方面的显著降低(图2A)。该结果进一步证实，在与固定的奥利司他B一起孵育后，则LPLA2从抗体溶液中去除。因此，在不必受科学理论束缚的情况下可以设想，奥利司他B尽管与珠子共价结合，但仍能够与LPLA2一起形成共价键。
实例2针对较高浓度的抗体溶液证实了这一结果(图3)。这表明对于组合物中宽范围的蛋白质浓度，可以实现水解酶的去除和水解活性的降低。
实例3表明对于抗体组合物(抗CD20/抗CD3双特异性抗体(glofitamab，也称为RG6026))的混合模式阴离子交换(MMAEX)负载溶液，确实存在残余水解酶活性。经证明，与起始蛋白质组合物相比，固定在固体载体上的奥利司他B能够降低回收的蛋白质组合物中的水解酶活性(图4)。与相应对照物(具有接头并且没有固定的奥利司他B的珠子/没有接头的珠子)相比水解酶活性也有所降低，证明水解酶抑制剂奥利司他B对水解酶活性降低具有特异性作用。此外，实例3表明，当经由两种不同的连接方法(即，利用胺与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯之间的反应的方法，或利用链霉亲和素与生物素的亲和力的方法)被固定时，奥利司他B保留其特异性结合水解酶的能力。因此，水解活性的降低可以独立于特定的固定方法和/或针对各种感兴趣的蛋白质而实现。
实例4进一步证实了在经曲妥珠单抗调整的蛋白A洗脱池中通过固定的奥利司他去除/降低残余水解酶活性(图5)。此外，实例4还表明水解酶抑制剂奥利司他A可用于从抗体溶液去除水解酶，即水解酶抑制剂本身可被固定在各种固体载体(分别为NHS活化琼脂糖珠和链霉亲和素琼脂糖珠)上并保留它们的结合活性，这继而可以有利地用于降低水解活性。
实例5用又另一种水解酶抑制剂(双烯醇酯)证实可以实现到固体载体的固定同时保留对水解酶的特异性结合活性(图6)。实例5进一步证实水解酶确实与抑制剂特异性结合而不与珠材料非特异性结合。
总之，本发明说明了在不同抑制剂被固定在不同固体载体上的情况下水解酶可以从若干不同的起始抗体组合物中去除。所述组合物还具有各种抗体浓度。总而言之，这证明了本发明可以在各种条件下有利地来实施。
已知水解酶会降解其相应的底物(例如脂肪酸酯/脂质，诸如如同蛋白质制剂(如药物组合物)中常规使用的表面活性剂)，从而由于表面活性剂介导的防止蛋白质聚集的减少和/或由于积累的表面活性剂分解产物而导致(可见)颗粒形成。因此，本文预期通过本发明降低水解活性导致蛋白质制剂的较少颗粒(形成)和/或改善的稳定性/溶解度。
一种已知的分子(所谓的奥利司他)能够抑制大多数与脂质水解相关的酶，并且因此抑制具有相似化学性质的表面活性剂(Jahn(2020),Pharm.Res.37:118)。该分子能够模仿脂肪酶的天然底物，并且因此能够经由在活性位点处形成共价酯键来捕捉脂肪酶(Fako(2014)ACS Catal.4:3444–3453)。然而，只是用奥利司他或其他抑制剂来补充蛋白质组合物是不可能的，因为大多数脂肪酶抑制剂是非极性化合物并且必须被加入有机溶剂中。特别是奥利司他是极不溶于水的。另外，这些化学物质在用药期间可能诱发患者的不良事件并可能影响药物质量。特别是奥利司他在被静脉内施加(例如与蛋白质组合物一起)时可能有毒性。此外，奥利司他与酶之间的酯键在蛋白质组合物的储存期间可能被水解(酸或碱催化)，从而重新释放活性酶。
在已加入水解酶抑制剂(例如奥利司他)的蛋白质组合物的储存期间(即其中抑制剂未被固定在固体载体上)，水解酶抑制剂(例如奥利司他)可能由于蛋白质组合物中蛋白质的高浓度而与蛋白质(例如抗体)的例如丝氨酸残基发生非特异性和共价反应。所述非特异性反应可能降低蛋白质(例如抗体)与靶标的结合亲和力(即降低的产品功效)和/或可能导致(增加的)蛋白质聚集(即降低的产品质量)。
相反，当蛋白质组合物仅与根据本发明的固定的水解酶抑制剂短时间接触时，所述非特异性反应不太可能发生。在固定的水解酶抑制剂在步骤(i)(“使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”)期间与蛋白质组合物中的感兴趣蛋白质发生反应的极少数情况下，感兴趣蛋白质也将被固定到固体载体并且不会存在于回收的蛋白质组合物中。因此，通过采用本文所述的本发明方法，可以避免或最小化在将水解酶抑制剂(例如奥利司他)加入到蛋白质组合物时出现的所提到的缺点(即存在具有与靶标的降低的结合亲和力(即降低的产品功效)的蛋白质(例如抗体)和/或(增加的)蛋白质(例如抗体)聚集(即降低的产品质量)。
作为本发明的进一步优点，可以在蛋白质制剂中不存在水解酶抑制剂本身和/或不需要去除此类水解酶抑制剂的情况下(即在抑制剂被加入到组合物中而不固定到固体载体的情况下)实现水解活性的降低。
水解酶抑制剂可以共价结合水解酶。其上固定有水解酶抑制剂的固体载体可以被若干次/重复用于实施本文所述的方法，特别是其步骤(i)。这例如在步骤(i)被重复实施的情况下可能是有用的，如下文进一步所述。因此，例如在达到针对水解酶的最大结合能力之前可以使起始组合物反复/随后经受相同的固体载体。然而，在优选的方面，材料(即其上固定有水解酶抑制剂的固体载体)供单次使用/利用。所述材料的单次使用/利用在作为例如经GMP(优质生产规范)认证和/或商业的纯化过程/平台的纯化过程/平台中可能是优选的。然而，对于基础研究和/或学术研究，设想所述材料可以被利用两次或更多次。如本文所用的对所述材料的两次或更多次使用意味着在相同水解酶抑制剂被固定在固体载体上的情况下步骤(i)(使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上)被执行两次或更多次。技术人员熟知在什么情况下可以对具有固定的水解酶抑制剂的固体载体利用两次或更多次，例如当在第一次利用后(即，使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上)水解酶抑制剂分子尚未与水解酶发生定量反应时，即当固体载体上仍存在能够在第二次或随后利用中与水解酶发生反应的水解酶抑制剂分子时。换句话讲，当在第一次利用(即，使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上)后并非所有水解酶抑制剂分子都已吸附(结合)水解酶时，材料(即具有固定的水解酶抑制剂的固体载体)可以被使用/利用两次或更多次。这意味着在第二次或随后利用中，水解酶也可以吸附到水解酶抑制剂。换句话讲，仍存在可以在第二次或后续利用中吸附水解酶分子的“游离的”(未结合的)水解酶抑制剂分子。
如上所述，通过疏水相互作用色谱法去除HCP可取决于蛋白质制剂中的蛋白质的性质。相反，水解酶抑制剂直接靶向存在的水解酶，并且因此通常保持不受蛋白质制剂中的蛋白质的影响。因此，本发明使用特定配体从蛋白质制剂/组合物去除特定杂质。
在下文中更详细地描述本发明。
特别地，本发明涉及以下项：
1.一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
2.根据项1所述的方法，其中所述方法是用于制备包含蛋白质的组合物。
3.根据项1或2所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述组合物与所述起始组合物相比具有降低的水解活性和/或与所述起始组合物相比具有减少的水解酶含量，例如，如通过脂肪酶活性测定(针对聚山梨醇酯(LEAP)测定的脂肪酶酶促测定)和/或脂肪酸质谱法(FAMS)测定所确定的。
4.根据项1至3中任一项所述的方法，其中所述方法是用于降低所述起始组合物中的所述水解活性和/或用于降低所述起始组合物中的所述水解酶含量。
5.根据项1至4中任一项所述的方法，其中所述起始组合物进一步包含水解酶和/或具有水解活性。
6.根据项1至5中任一项所述的方法，其中通过从所述起始组合物去除水解酶和/或通过降低所述起始组合物中的所述水解酶含量来制备所述蛋白质组合物。
7.根据项1至6中任一项所述的方法，其中所述步骤(i)进一步包括步骤(a)将所述水解酶吸附到所述水解酶抑制剂。
8.根据项1至7中任一项所述的方法，其中包含蛋白质的所述组合物为包含蛋白质的溶液。
9.根据项8所述的方法，其中所述溶液为水溶液。
10.根据项8或9所述的方法，其中所述溶液为经缓冲溶液。
11.根据项1至10中任一项所述的方法，其中所述水解酶为酯酶和/或酰胺酶。
12.根据项11所述的方法，其中所述酯酶为羧酸酯水解酶和/或硫酯酶。
13.根据项12所述的方法，其中所述羧酸酯水解酶为脂肪酶。
14.根据项1至12中任一项所述的方法，其中所述水解酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶、酸性神经酰胺酶、脂肪酸合成酶的C末端结构域、推定的磷脂酶b样2、溶酶体酸性脂肪酶和溶酶体磷脂酶。
15.根据项1至14中任一项所述的方法，其中固定的抑制剂选自由以下项组成的组：奥利司他或双烯醇酯。
16.根据项1至15中任一项所述的方法，其中所述固体载体选自由以下项组成的组：琼脂糖、聚苯乙烯和智能聚合物。
17.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由叠氮基基团与炔基基团的反应被固定在固体载体上。
18.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由链霉亲和素基团与生物素基团的结合被固定在固体载体上。
19.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由氨基基团与N-羟基琥珀酰亚胺基团的反应被固定在固体载体上。
20.根据项1至19中任一项所述的方法，其中所述抑制剂为能够通过使包含或包括式(1)、(2)、(3)或(4)，优选式(1)、(2)或(4)的化合物与叠氮化物反应而获得的基团
Figure BDA0004113420420000081
Figure BDA0004113420420000091
21.根据项1至20中任一项所述的方法，其中所述步骤按以下顺序实施：步骤(i)之后是步骤(ii)。
22.根据项1至21中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(i)之前和/或之后和/或在步骤(ii)之前和/或之后的蛋白质制备和/或纯化的步骤。
23.根据项1至22中任一项所述的方法，其中步骤(i)在亲和色谱法之后实施，优选地在蛋白A亲和色谱法之后实施。
24.根据项1至23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
25.根据项24所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
26.根据项24或25所述的方法，其中所述抗体为人源抗体或人源化抗体。
27.根据项1至26中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗HER2抗体、抗IL6抗体、抗IgE抗体、抗IL13抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-L1抗体、抗VEGF-A抗体、抗VEGF-A/ANG2抗体、抗CD79b抗体、抗ST2抗体、抗因子D抗体、抗因子IX抗体、抗因子X抗体、抗abeta抗体、抗tau抗体、抗CEA抗体、抗CEA/CD3抗体、抗CD20/CD3抗体、抗FcRH5/CD3抗体、抗Her2/CD3抗体、抗FGFR1/KLB抗体、FAP-4-1BBL融合蛋白、FAP-IL2v融合蛋白、奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法瑞昔单抗、泊洛妥珠单抗、更汀芦单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、格菲妥单抗、欣洛奇芙普(simlukafusp alfa)和RG7827。
28.一种用于制备蛋白质制剂的方法，所述方法包括根据项1至27中任一项所述的方法的步骤，其中用于制备所述蛋白质制剂的所述方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到所述组合物。
29.一种用于制备蛋白质制剂的方法，其中用于制备所述蛋白质制剂的所述方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到通过根据项1至27中任一项所述的方法被获得或能够被获得的所述组合物。
30.根据项28或29所述的方法，其中所述蛋白质制剂(基本上)不含可见和/或在显微镜下才可见的颗粒。
31.根据项28至30中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂在建议的储存条件下稳定至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月。
32.根据项28至30中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚氧乙烯失水山梨醇或异山梨醇脂肪酸单酯、二酯或三酯。
33.根据项28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚氧乙烯(20)失水山梨醇月桂酸酯。
34.根据项28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85或聚山梨醇酯120或它们的组合。
35.根据项28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
36.根据项28至31中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂为单或二酰基甘油、脂肪酸糖酯或α-生育酚聚乙二醇(PEG)琥珀酸酯。
37.根据项28至36中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯的降解在24个月内小于20％，优选地小于10％，并且更优选地小于5％。
38.根据项26至37中任一项所述的方法，其中所述抗体浓度为至少1mg/ml并且至多250mg/ml。
39.根据项28至38中任一项所述的方法，其进一步包括将缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂和/或载体加入到所述组合物。
40.根据项28至39中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂为药物组合物。
41.根据项1至40中任一项所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述组合物和/或所述蛋白质制剂基本上不含水解酶抑制剂。
42.一种蛋白质组合物，其通过根据项1至27中任一项所述的方法被获得或能够被获得。
43.一种蛋白质制剂，其通过根据项28至41中任一项所述的方法被获得或能够被获得。
44.根据项43所述的蛋白质制剂，其用作药物或用于医药中。
45.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于制备蛋白质组合物和/或蛋白质制剂的用途。
46.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或降低蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的水解活性的用途。
47.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或减少蛋白质组合物和/或蛋白质制剂中的杂质，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶(的含量)的用途。
48.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于抑制或减少蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的可见的和/或在显微镜下才可见的颗粒(的形成)和/或表面活性剂降解物的出现/存在的用途。
进一步，本发明涉及以下方面：
1.一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
2.根据项1所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述组合物与所述起始组合物相比具有降低的水解活性。
3.根据项1或2所述的方法，其中通过从所述起始组合物去除水解酶来制备所述蛋白质组合物。
4.根据项3所述的方法，其中所述水解酶为酯酶和/或酰胺酶，优选地其中所述酯酶为羧酸酯水解酶和/或硫酯酶。
5.根据项4所述的方法，其中所述酯酶为脂肪酶。
6.根据项3所述的方法，其中所述水解酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶、酸性神经酰胺酶、脂肪酸合成酶、推定的磷脂酶b样2、溶酶体酸性脂肪酶和溶酶体磷脂酶。
7.根据项1至6中任一项所述的方法，其中固定的抑制剂选自由以下项组成的组：奥利司他或双烯醇酯。
8.根据项1至7中任一项所述的方法，其中所述抑制剂能够通过使包含或包括式(1)、(2)、(3)或(4)，优选式(1)、(2)或(4)的化合物与叠氮化物反应而被获得：
Figure BDA0004113420420000121
Figure BDA0004113420420000131
9.根据项1至8中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(i)之前和/或之后的蛋白质制备和/或纯化的步骤。
10.根据项1至9中任一项所述的方法，其中步骤(i)在亲和色谱法之后实施，优选地在蛋白A亲和色谱法之后实施。
11.根据项1至10中任一项所述的方法，其中该多肽为抗体。
12.一种用于制备蛋白质制剂的方法，该方法包括根据项1至11中任一项所述的方法的步骤，其中用于制备该蛋白质制剂的该方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到该组合物。
13.根据项12所述的方法，其中所述蛋白质制剂(基本上)不含可见和/或在显微镜下才可见的颗粒。
14.根据项12或13所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚氧乙烯失水山梨醇或异山梨醇脂肪酸单酯、二酯或三酯。
15.从项1至11中任一项所述的方法获得或能够获得的上清液。
如上所述，本发明涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
如本文所用的术语“包含蛋白质的起始组合物”通常是指包含“感兴趣的蛋白质”的组合物。在本上下文中，术语“蛋白质”是指“感兴趣的蛋白质”。“感兴趣的蛋白质”通常是要从细胞培养物/培养细胞获得并且要从细胞培养物/培养细胞分离和/或纯化的蛋白质，例如，用于商业、药用、诊断和/或疗法目的和/或用于科学研究。术语“感兴趣的蛋白质”通常是指一种特定的感兴趣的蛋白质，例如与抗原A结合的特定抗体。然而，术语“感兴趣的蛋白质”也可指一种或多种不同的“感兴趣的蛋白质，例如指两种或更多种不同的感兴趣的蛋白质(例如，与抗原A结合的一种抗体和与抗原B结合的第二抗体)。此外，如下文进一步解释的，“起始组合物”除“感兴趣的蛋白质”之外还可包含一种或多种宿主细胞蛋白质(HCP。
术语“蛋白质”的含义在本领域中是众所周知的并且相应地用于本发明的上下文中。特别地，根据本发明所述，如本文所用的术语“蛋白质”是指包含给定长度的氨基酸链的蛋白质或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。通常，“蛋白质”具有至少20个连续氨基酸并且至多3500个连续氨基酸的长度。蛋白质可以为单体。术语“蛋白质”还包括形成多聚体(诸如二聚体、三聚体、四聚体等等)的蛋白质，其中此类多聚体可以为同源多聚体或异源多聚体。因此，如本文所用的术语“蛋白质”可以为由单体蛋白质组成的多聚体(多聚体蛋白质)。示例性蛋白质/感兴趣的蛋白质在本文下文进一步描述。
如本文所用的术语“包含蛋白质的起始组合物”(或同样地“包含蛋白质的初始组合物”)具体地意味着是指来自细胞培养物或培养细胞的提取物，所述细胞培养物或培养细胞产生蛋白质(感兴趣的蛋白质)或者所述细胞培养物或培养细胞用于产生蛋白质(感兴趣的蛋白质)。提取物可以是粗提取物或可以是纯化的提取物(纯化的提取物已经受一个或多个纯化步骤)。“包含蛋白质的起始组合物”可能因此已经受一个或多个常规纯化步骤，诸如离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法)、超滤/渗滤、病毒过滤、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法和疏水相互作用色谱法、混合模式色谱法/多模式色谱法(multimodal chromatography)(例如混合模式离子交换色谱法)以及它们的任何组合。
虽然本文中提供的方法实际上可用于任何“包含蛋白质的组合物”(甚至是不含任何杂质或仅含痕量的任何杂质的高度纯化的组合物)，但应理解，如本文所用的“包含蛋白质的起始组合物”通常包含来自用于产生所述蛋白质/感兴趣的蛋白质的细胞培养物/培养细胞的至少一种杂质，即来自从其获得/制备蛋白质/感兴趣的蛋白质的细胞培养物/培养细胞的至少一种杂质。杂质可以为一种或多种宿主细胞蛋白质，特别是具有水解活性的蛋白质(水解酶)。
例如，包含蛋白质的起始组合物可以通过在均质化溶液中均质化细胞(该细胞在细胞培养物中生长以产生所述感兴趣的蛋白质)来制备。当蛋白质在细胞培养期间被直接分泌时，包含蛋白质的起始组合物也可以为细胞培养物上清液。因此，包含蛋白质的起始组合物可以为收获的细胞培养液(HCCF)。HCCF是与细胞、细胞碎片和/或聚集体分开(通过过滤)的组合物，例如，HCCF是在调节和/或过滤后被获得的(例如通过过滤从细胞培养物制备的组合物或过滤细胞培养物上清液)。本文中的起始组合物优选为收获的细胞培养液(HCCF)。在过滤后成为HCCF的组合物可被称为收获前细胞培养液(PHCCF)。换句话讲，在调节和/或过滤之前的组合物(例如，从细胞培养物或细胞培养物上清液制备)被称为收获前细胞培养液(PHCCF)。
可以使包含蛋白质的起始组合物在均质化所述细胞后(该细胞在细胞培养物中生长以产生感兴趣的蛋白质)直接与水解酶抑制剂接触。然而，本文中还设想使包含蛋白质的起始组合物在使所述包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触之前经受一个或多个纯化步骤。此类纯化步骤的非限制性实例在下文描述。
根据本发明所述，使“包含蛋白质的起始组合物”经受(进一步)纯化，包括使“包含蛋白质的起始组合物”与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上(该方法的步骤(i))。
在该步骤后，执行进一步的步骤(该方法的步骤(ii))，即“回收包含蛋白质的组合物”，即“包含蛋白质的组合物”被回收。更简单地讲，进一步的步骤为“回收蛋白质”。在本上下文中，术语“蛋白质”是指如上文所定义的“感兴趣的蛋白质”。换句话讲，包含在起始组合物中的感兴趣的蛋白质也是回收的组合物中的感兴趣的蛋白质或者是回收的感兴趣的蛋白质。我们在本文中也将该组合物称为“回收的组合物”并且将该蛋白质称为“回收的蛋白质”。
应当理解，使“包含蛋白质的起始组合物”与固定在固体载体上的水解酶抑制剂接触。换句话讲，术语“使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中所述水解酶抑制剂被固定在固体载体上”意味着“使起始组合物(所述组合物包含蛋白质)与水解酶抑制剂接触，其中所述水解酶抑制剂被固定在固体载体上”。
设想在接触步骤之前，即在该方法的步骤(i)之前，水解酶抑制剂可以被固定在固体载体上。换句话讲，水解酶抑制剂可以在其与包含蛋白质的起始组合物接触之前被固定在固体载体上(附着到固体载体)。应当理解，本文中水解酶抑制剂在接触步骤之前被固定在固体载体上。换句话讲，水解酶抑制剂在其与包含蛋白质的起始组合物接触之前被固定在固体载体上(附着到固体载体)。
因此，本发明在优选方面涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与被固定在固体载体上的水解酶抑制剂接触；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
换句话讲，本发明在优选方面涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂为被固定在固体载体上的水解酶抑制剂；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
应当理解，通过“使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触”，上述杂质(诸如一种或多种宿主细胞蛋白质，特别是具有水解活性的蛋白质(水解酶)，如果存在于起始组合物中)被去除或与“包含蛋白质的起始组合物”相比在“回收的组合物”中至少其含量减少。本文中优选的是，宿主细胞蛋白质，特别是具有水解活性的蛋白质(水解酶)，存在于起始组合物中。
如所提到的，术语“回收包含蛋白质的组合物”可以与“回收蛋白质”同义使用。因此，该方法旨在制备(或同样地获得)包含蛋白质的组合物。在本上下文中，“包含蛋白质的组合物”通常是根据该方法的步骤(ii)回收的组合物。
因此，本发明提供了一种用于制备或用于获得包含蛋白质的组合物的方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
因此，如果实施步骤(i)和(ii)(并且任选地重复步骤(i)和(ii)，如上文所解释的)，则通常制备或获得“包含蛋白质的组合物”。然而，方法还可包括在步骤(i)之前和/或在步骤(ii)之后和/或在步骤(i)和(ii)之间的附加步骤(诸如进一步的纯化步骤(例如常规纯化)，以便制备或获得“包含蛋白质的组合物”。当重复步骤(i)和(ii)时适用相同的解释和定义，如上文所解释的。
如本文上文还论述的，本发明方法的目的是去除或降低起始组合物中的水解活性(如果存在)和/或去除或减少杂质(如果存在)，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地起始组合物中的水解酶的含量。因此，在一个方面，“包含蛋白质的组合物”与起始组合物相比具有降低的水解活性和/或与起始组合物相比具有减少的杂质(如果存在)，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶的含量。当重复步骤(i)和(ii)时适用相同的解释和定义，如本文中所解释的。本文中优选的是，起始组合物中存在水解活性和/或起始组合物中存在杂质，特别是宿主细胞蛋白质，并且优选地起始组合物中存在水解酶。
因此，在一个方面，本发明提供了一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中包含该蛋白质的该组合物(回收的组合物)与该起始组合物相比具有降低的水解活性
和/或其中包含该蛋白质的该组合物(回收的组合物)与该起始组合物相比具有减少的杂质，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶的含量。
在本上下文中，应当理解，起始组合物具有水解活性和/或起始组合物具有/包含杂质，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶。换句话讲，如上文所定义的水解活性和/或杂质优选地存在于起始组合物中。起始组合物中如上所定义的水解活性和/或杂质的存在可以通过本领域中已知的和/或本文中公开和提供的测定来确定。用于测量、确定或定量水解活性的非限制性实例是：用于检测脂解活性的测定，或者换句话讲脂肪酶活性测定(例如，如Jahn等人所述)，本文中称为LEAP(针对聚山梨醇酯的脂肪酶酶促测定)测定(Jahn(2020)Pharm.Res.37:118)；和/或脂肪酸质谱法(FAMS)测定(Honemann(2019)J.Chromatogr.B 1116:1-8；Cheng(2019)J.Pharm.Sci.108:2880-2886)。此类测定也可用于确定水解活性的降低。
为了确定蛋白质的存在或量，本文中可以采用常规方法，诸如免疫凝集、免疫沉淀(例如免疫扩散、免疫电泳、免疫固定)、蛋白质印迹技术(例如(原位)免疫组织化学、(原位)免疫细胞化学、亲和色谱法、酶免疫测定)等。这些和其他合适的接触蛋白质的方法在本领域中是众所周知的，并且例如在Sambrook和Russell(2001.)Molecular cloning:alaboratory manual.第2卷,第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中也有描述。可以通过利用上述技术，特别是蛋白质印迹技术来执行定量。通常，技术人员知道用于蛋白质定量的方法。溶液中经纯化蛋白质的量可以通过物理方法(例如光度测定)来确定。定量混合物中的特定蛋白质的方法依赖于(例如抗体的)特异性结合。利用抗体特异性的特异性检测和定量方法包括例如免疫组织化学(原位)。蛋白质印迹结合了通过电泳进行的对蛋白质混合物的分离以及用抗体进行的特异性检测。电泳可以是多维(诸如2D)电泳。通常，多肽在2D电泳中沿一个维度根据它们的表观分子量以及沿另一个方向根据它们的等电点被分开。
如下文进一步解释的，用于确定给定组合物(例如起始组合物)具有水解活性和/或具有/包含如上文所定义的杂质的间接参数是可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的出现/存在(例如由于表面活性剂降解物的不溶性物质)和/或表面活性剂降解物本身的出现/存在。同样，可见和/或在显微镜下才可见的颗粒(例如由于表面活性剂降解物的不溶性物质)和/或表面活性剂降解物本身的出现/存在的减少是用于确定给定组合物(优选地包含蛋白质的组合物(回收的组合物))如本文所定义的与起始组合物相比具有降低的水解活性和/或具有减少的杂质含量的间接参数。
该确定(例如对可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的出现/存在(例如由于表面活性剂降解物的不溶性物质)和/或表面活性剂降解物本身的出现/存在的确定)可以涉及给定组合物(例如起始组合物和/或包含蛋白质的组合物(回收的组合物))的储存，例如在长期条件下储存，如下文进一步解释的。例如，如果给定组合物在开始时未显示出可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的出现/存在(例如由于表面活性剂降解物的不溶性物质)和/或表面活性剂降解物本身的出现/存在，但在储存后却显示出这种情况，则其表明给定组合物在开始时如上所定义的具有水解活性和/或具有/包含杂质。
这可用于将如本文所用的“起始组合物”中水解活性和/或杂质的存在确定为参考点，例如，如果该组合物未与抑制剂接触。通过将其和与抑制剂接触的“起始组合物”(即包含蛋白质的组合物(回收的组合物))进行比较，可以评定经接触的组合物(即包含蛋白质的组合物(回收的组合物))是否如本文所定义的与参考起始组合物相比(并且因此与“起始组合物”相比)具有降低的水解活性和/或具有减少的杂质含量。
术语“水解活性”的含义在本领域中是众所周知的，因此在本发明的上下文中使用并且在下文中进一步详细描述。
“水解酶抑制剂”在本文中以最广义使用并且可指抑制具有水解活性的另一分子的分子。本文下文提供了水解活性和水解酶的定义。本文下文还提供了水解酶的非限制性实例。水解酶抑制剂可以通过与酶结合来抑制酶。水解酶抑制剂可以与酶的活性位点结合。水解酶抑制剂可以与酶形成共价键。与对应的酶形成共价键并且在本发明的上下文中使用的水解酶抑制剂的非限制性实例是奥利司他和双烯醇酯。
下文涉及根据本发明所述所提供和要使用的“水解酶抑制剂”。术语“水解酶抑制剂”和“水解酶的抑制剂”在本文中可互换地使用。
术语“水解酶抑制剂”和“水解酶的抑制剂”在本发明的上下文中特别地意味着能够完全或部分地阻止或降低水解酶的生理活性的化合物。术语“拮抗剂”或“抑制剂”在本文中可互换地使用。本文中设想“水解酶抑制剂”为水解酶的选择性抑制剂。
因此，在本发明的上下文中，所述抑制剂可以阻止、降低、抑制或灭活水解酶的生理活性(例如在所述化合物/物质(即拮抗剂/抑制剂)与所述水解酶结合后)。如本文所用，术语“拮抗剂”还包括竞争性拮抗剂、(可逆)非竞争性拮抗剂或不可逆拮抗剂，尤其如Mutschler,"Arzneimittelwirkungen"(1986),Wissenschaftliche VerlagsgesellschaftmbH,Stuttgart,Germany中所描述的。这种抑制可以通过确定底物转换率(turnover)来测量。
总之，本文所述的水解酶拮抗剂/抑制剂将因此导致水解酶活性的减小或降低。
本文中设想并优选的是水解酶的拮抗剂靶向水解酶，特别是靶向水解酶的活性位点(例如催化三联体)。术语“靶向”在本上下文中是指与水解酶(并且此处特别是与水解酶的活性位点)的(特异性)结合和/或对水解酶活性的抑制，特别是对水解活性的抑制。
拮抗剂可以为小分子药物或(小)结合分子。
本文中要使用的抑制剂可以为小分子药物。术语“小分子药物”和“小分子化合物”在本文中可互换地使用。本文中要用作水解酶的抑制剂的小分子药物可指(有机)低分子量(<900道尔顿)化合物。小分子可有助于调节生物学过程并且通常具有大约10–9m的大小。本文中要使用的拮抗剂(如小分子(药物))可以例如通过筛选化合物库(例如Enamine、Chembridge或Prestwick化学库)来鉴定。
抑制剂优选地为水解酶的选择性抑制剂。
选择性表达了生物学事实，即在给定的化合物浓度处，酶(或蛋白质)受到不同程度的影响。在酶的情况下，选择性抑制可以被定义为在给定浓度处由化合物进行的优选抑制。或者换句话讲，当存在一定浓度时，一种酶(或蛋白质)被选择性地抑制超过另一种酶(或蛋白质)，这导致第一酶(或蛋白质)受到抑制，而第二酶(或蛋白质)不受影响或基本上不受影响。为了比较化合物对不同酶的影响，至关重要的是要采用类似的测定形式，诸如荧光能量转移(FRET)测定、Plus测定、组蛋白甲基转移酶(HMT)测定、热位移(thermoshift)测定、(报告蛋白/酶，诸如Cxcl1/CXCL8的)生物学读数、酶联免疫吸附测定(ELISA)或化学蛋白质组学。例如，可以采用可商购获得的测试试剂盒，如ELISA试剂盒。
本文中要使用的抑制剂优选地对水解酶具有选择性，即化合物选择性地抑制水解酶。换句话讲，水解酶抑制剂/拮抗剂优选地为选择性水解酶抑制剂/拮抗剂。
如本文所用的术语“选择性水解酶抑制剂”是指如本文所定义的抑制水解酶或显示对水解酶的拮抗作用而没有显示出对另一种蛋白质或酶(特别是另一种酶(即，特别是并非水解酶的另一种蛋白质或酶))的实质性抑制或拮抗作用的水解酶抑制剂(特别是小分子药物)。
因此，对水解酶具有选择性的水解酶抑制剂表现出相对于对另一种蛋白质或酶(即，特别是并非水解酶的另一种蛋白质或酶)的抑制或拮抗作用的大于约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍的水解酶选择性。对水解酶具有选择性的水解酶抑制剂可以表现出相对于包含蛋白质的组合物中的感兴趣的蛋白质的大于约10.000倍的水解酶选择性。
例如，泛水解酶抑制剂(即，广泛抑制基本上任何水解酶的化合物)(例如，奥利司他)可用于本发明的上下文中。泛水解酶抑制剂可以为如本文所定义的选择性水解酶抑制剂。例如，与其他蛋白质相比(即，特别是与非水解酶，特别是非脂肪酶相比)，奥利司他优先与水解酶(特别是脂肪酶)结合，但奥利司他可以与不同的脂肪酶反应/抑制不同的脂肪酶。
术语“选择性水解酶抑制剂”并不一定暗示抑制剂具有高度特异性，因为它可以与不同的水解酶(例如，不同的脂肪酶)反应/抑制不同的水解酶。高度特异性抑制剂只会与单一酶(单一水解酶)反应，同时区分所有其他蛋白质。本文中还设想使用(高度)特异性水解酶抑制剂(即，仅与单一酶(单一水解酶)反应/抑制单一酶同时区分所有其他蛋白质的抑制剂)。本文中设想如本文所定义的(高度)特异性水解酶抑制剂可以为如本文所定义的选择性水解酶抑制剂，反之亦然。
此外，水解酶抑制剂/拮抗剂优选地为有效的水解酶抑制剂/拮抗剂。
“针对水解酶的效力”也可以通过IC50值来确定或定义。例如，水解酶抑制剂的与水解酶相关的IC50值为低，优选地低于0.2μM，更优选地低于0.15μM、0.14μM、0.13μM、0.12μM或甚至更低。更优选地，IC50值低于0.1μM、0.095μM、0.090μM、0.085μM、0.080μM、0.075μM、0.070μM、0.065μM、0.060μM、0.055μM、0.050μM、0.045μM、0.040μM、0.035μM、0.030μM或甚至低于0.025μM，其中较低值优于较高值。甚至更优选地，IC50值低于0.024μM、0.023μM、0.022μM、0.021μM、0.020μM、0.019μM、0.018μM、0.017μM、0.016μM、0.015μM、0.014μM、0.013μM、0.012μM或0.011μM。IC50值可以甚至更低，例如，低于0.010μM、0.009μM、0.008μM、0.007μM、0.006μM或0.005μM。通常，本文中较低值优于较高值。
根据本发明所述的有效水解酶抑制剂可以在另选方案中或除与水解酶相关的IC50值之外由与另一种蛋白质或酶相关的IC50值来定义。
例如，有效水解酶抑制剂的与另一种蛋白质或酶相关的IC50值为高，优选地高于0.001μM、0.002μM、0.003μM、0.004μM、0.005μM、0.006μM、0.007μM、0.008μM、0.009μM或0.010μM。更优选地，IC50值高于0.011μM、0.012μM、0.013μM、0.014μM、0.015μM、0.016μM、0.017μM、0.018μM、0.019μM、0.020μM、0.021μM、0.022μM、0.023μM或0.024μM。甚至更优选地，IC50值高于0.025μM、0.030μM、0.035μM、0.040μM、0.045μM、0.050μM、0.055μM、0.060μM、0.065μM、0.070μM、0.075μM、0.080μM、0.085μM、0.090μM、0.095μM、0.1μM或甚至更高，其中较高值优于较低值。甚至更优选地，IC50值高于0.12μM、0.13μM、0.14μM、0.15μM、0.2μM或甚至更高。
本文中优选的是，优选地根据相同测定所确定的有效水解酶抑制剂对水解酶的IC50值相对于另一种蛋白质或酶对水解酶的IC50值的比率为约1:10或更低。1:10或更低的比率也指示抑制剂对水解酶的效力。更优选的是1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100或甚至更低的比率。
术语“水解酶”在本文中以最广义使用并且是指具有水解活性的分子/化合物。通常，“水解酶”因此是水解化学键的酶。例如，“水解酶”为羧酸衍生的酯裂解酶，其具有作为最终产物的衍生游离酸。另选地，水解酶为表现出水解酶活性(即，通过使用水分子来破坏共价键)的酶。“水解酶”的非限制性实例是脂肪酶、酯酶、硫酯酶、磷脂酶或神经酰胺酶。
如本文所用的“水解活性”如本领域中已知的并且是指水解化学键的能力。水解是指化学键的断裂，其中水分子充当亲核体。优选地，具有水解活性的分子/化合物为具有水解活性的蛋白质或多肽。因此，具有水解活性的蛋白质或多肽为具有水解活性的酶。因此，水解酶优选地为具有水解活性的酶。水解酶可以为酯酶或酰胺酶。
术语“酯酶”在本领域中是众所周知的并且在本发明的上下文中是指催化酯键的水解以形成酸和醇的酶。换句话讲，酯酶可以作用于酯键。酯酶是一类不同的酶，包括乙酰基酯酶、磷酸酶、核酸酶、硫酯酶和羧酸酯水解酶。优选地，本发明上下文中的水解酶为硫酯酶或羧酸酯水解酶。硫酯酶使用水分子将硫酯水解成硫醇和酸。羧酸酯水解酶使用水分子将羧酸酯水解成醇和羧酸盐。最优选地，水解酶/酯酶(诸如羧酸酯水解酶)为脂肪酶。脂肪酶催化脂肪酸酯类/脂类(包括甘油三酯类、脂肪类和油类)水解成脂肪酸类和醇头部基团。
术语“酰胺酶”在本领域中是众所周知的并且在本发明的上下文中是指催化酰胺键的水解的酶。换句话讲，酰胺酶可以作用于酰胺键。
优选地，根据本发明所述的水解酶为脂蛋白脂肪酶(登录号：G3H6V7)、棕榈酰基蛋白硫酯酶1(登录号：G3HN89)、酸性神经酰胺酶(登录号：G3GZB2)、脂肪酸合成酶的C末端结构域(登录号：G3GXD7)、推定的磷脂酶b样2(登录号：G3I6T1)、溶酶体酸性脂肪酶(登录号：G3HQY6)和/或溶酶体磷脂酶。更优选地，根据本发明所述的水解酶为脂蛋白脂肪酶、推定的磷脂酶b样2和/或溶酶体磷脂酶。这是由于它们备有证明文件的对表面活性剂(诸如聚山梨醇酯)的水解活性，该水解活性归因于组合物中(可见)颗粒的形成和/或组合物的降低的稳定性。最优选地，根据本发明所述的水解酶为溶酶体磷脂酶，特别是溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)(登录号：G3HKV9)。
这意味着从包含蛋白质的起始组合物被去除(或其含量在包含蛋白质的起始组合物中降低)的水解酶可以选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶、酸性神经酰胺酶、脂肪酸合成酶(特别是其C末端结构域)、推定的磷脂酶b样2、溶酶体酸性脂肪酶和溶酶体磷脂酶。因此，与水解酶抑制剂结合的水解酶可以选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶、酸性神经酰胺酶、脂肪酸合成酶、推定的磷脂酶b样2、溶酶体酸性脂肪酶和溶酶体磷脂酶。
术语“被固定在固体载体上”意味着水解酶抑制剂附着到固体载体(术语“固体载体”和“固相”在本文中可互换地使用)。换句话讲，水解酶抑制剂与固体载体结合。本文下文提供了固体载体的非限制性实例。水解酶抑制剂与固体载体之间的键可以为共价键和/或非共价键。优选地，该键为共价键。本文下文以及在所附实例中描述了水解酶抑制剂可以如何被固定在固体载体上的非限制性实例。
“回收包含蛋白质的组合物”意味着包含蛋白质的组合物在其与水解酶抑制剂接触后被收集。因此，“包含蛋白质的起始组合物”为在该组合物与水解酶抑制剂接触之前包含蛋白质的组合物。“包含蛋白质的组合物”为在该组合物(此处为“起始组合物”)与水解酶抑制剂接触后包含蛋白质的组合物(并且“包含蛋白质的组合物”则是回收的包含蛋白质的组合物)。
例如，步骤(i)和(ii)可以如下实施：
该方法可包括第一步(步骤(i))，该步骤包括：提供固体载体(或固相)，该载体包含被固定到其的水解酶抑制剂；以及使起始组合物与水解酶抑制剂(或与抑制剂被固定到的固体载体)接触。水解酶然后与水解酶抑制剂结合，而其余蛋白质(或至少其主要部分)(特别是感兴趣的蛋白质)不与抑制剂结合并且可以被收集(例如从流出物)(或结合至比水解酶低的程度)。
该方法可进一步包括：为了回收包含蛋白质的组合物((步骤(ii))，执行若干洗涤步骤，其中至少一个洗涤步骤使用能够将感兴趣的蛋白质(其可能已与抑制剂/载体结合)的至少部分与固体载体和/或抑制剂分离的洗涤缓冲液来执行，同时保留与固体载体和/或抑制剂结合的杂质(宿主细胞蛋白质，诸如水解酶)(的至少部分)。任选地，该方法可包括：在蛋白质可能已与抑制剂/载体结合的情况下使用能够将所述蛋白质(的至少部分)与固体载体和/或抑制剂分离的洗脱缓冲液来获得感兴趣的蛋白质，同时保留与固体载体和/或抑制剂结合的杂质(宿主细胞蛋白质，诸如水解酶)(的至少部分)。
如上所述，本文中设想的是，与包含蛋白质的起始组合物相比，包含蛋白质的组合物具有降低的水解活性。
因此，在一个方面，本发明涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中与起始组合物相比，包含蛋白质的组合物具有降低的水解活性。
因此，本发明在一个方面提供了一种用于制备或用于获得包含蛋白质的组合物的方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中与起始组合物相比，包含蛋白质的组合物具有降低的水解活性。
与包含蛋白质的起始组合物相比，包含蛋白质的组合物(回收的组合物)可以具有降低的水解活性，因为水解酶已从包含蛋白质的起始组合物被去除和/或在起始组合物中水解酶的含量已减少。
与包含蛋白质的起始组合物相比的水解活性降低当然暗示着起始组合物具有水解活性。类似地，与包含蛋白质的起始组合物相比的水解酶含量减少当然暗示着起始组合物包含水解酶。
因此，在如本文所述的方法中，包含蛋白质的起始组合物可以具有水解活性和/或包含一种或多种水解酶。
因此，本发明的方法可包括确定包含蛋白质的起始组合物的水解活性和/或确定包含蛋白质的组合物(回收的组合物)的水解活性的步骤。当两个步骤都被实施时(即，当包含蛋白质的起始组合物和包含蛋白质的组合物(回收的组合物)的水解活性都被确定时，可以容易地确定与起始组合物相比包含蛋白质的组合物(回收的组合物)是否具有降低的水解活性。
在一个方面，当(仅)确定包含蛋白质的起始组合物的水解活性的步骤被实施时并且当确定起始组合物不具有水解活性时，不实施权利要求的步骤(i)(和步骤(ii))。
在一个方面，当(仅)确定包含蛋白质的起始组合物的水解活性的步骤被实施时并且当确定起始组合物确实具有水解活性时，实施权利要求的步骤(i)(和步骤(ii))。
同样的解释经过必要的修正适用于包含蛋白质的起始组合物包含一种或多种水解酶的上述方面。
对水解酶存在的指示是蛋白质组合物/制剂中底物(例如，完整脂肪酸酯，例如，聚山梨醇酯)的(增加的)分解和/或游离脂肪酸含量的(同时)增加，特别是在与已被证实为不含水解酶的组合物/制剂相比的情况下。如果确定了这种分解，则首先指示需要执行该方法。然而，该方法通常可以用作针对难以去除的HCP的附加清除步骤。
技术人员熟知可以如何测量、确定或定量水解活性。
用于测量、确定或定量水解活性的非限制性实例是：用于检测脂解活性的测定，或者换句话讲脂肪酶活性测定(例如，如Jahn等人所述)，本文中也称为LEAP(针对聚山梨醇酯的脂肪酶酶促测定)测定(Jahn(2020)Pharm.Res.37:118)；和/或脂肪酸质谱法(FAMS)测定(Honemann(2019)J.Chromatogr.B 1116:1-8；Cheng(2019)J.Pharm.Sci.108:2880-2886)。针对允许测量、确定或定量水解活性的测定的非限制性实例是测量4-甲基伞形酮辛酸酯(4-MUCA)向4-甲基伞形酮(4-MU)的转化的脂肪酶活性测定(或者换句话讲用于检测脂解活性的测定)。可以如下文中所述执行使用4-MUCA作为底物的测定。
可以将要在其中确定水解活性的10μL包含蛋白质的组合物与80μL反应缓冲液(150mM Tris-HCl pH 8.0、0.25％(w/v)Triton X-100和0.125％(w/v)阿拉伯树胶)和10μL4-MUCA底物(1mM的DMSO溶液)混合。反应可以被设定在96孔半面积聚苯乙烯板(黑色带盖和透明平底，Corning Incorporated)中，并且可以通过将反应板例如在Infinite 200Pro板读数器(Tecan Life Sciences)中在37℃孵育两小时来每10分钟监测荧光信号的增加(在355nm处激发，在460nm处发射)以导出4-MU产生率。可以将包含蛋白质的组合物的4-MU产生率与包含蛋白质的起始组合物进行比较。
以下段落描述用于执行FAMS测定的示例性样品制备和分析过程。FAMS测定通过经由聚山梨醇酯20的水解定量游离脂肪酸的积累来测量脂肪酶活性。
所有样品(抗体溶液和缓冲液对照物)都可以被补充1％(w/v)超精制聚山梨醇酯20(Croda Health Care)和0.25M L-甲硫氨酸(Sigma Aldrich，货号M5308)的储备溶液以获得每个样品0.04％(w/v)超精制聚山梨醇酯20和0.01M L-甲硫氨酸的最终浓度。对于每个加标的(spiked)样品，可以将190μL的等分部分转移到可用于样品孵育的五个加盖的玻璃小瓶(称为t0、t1、t2、t3、t4)中。可以在分析之前将玻璃小瓶t0在其制备后立即在-70℃冷冻。可以将玻璃小瓶t1、t2、t3和t4在孵育箱中在25℃直立孵育并避光。对玻璃小瓶的孵育可以在接下来的5天至14天之间的时间段期间的某个时间被停止一次，随后可以在分析之前将玻璃小瓶在-70℃冷冻。
为进行分析，可以将经冷冻样品置于环境温度1小时。经稳定同位素标记的脂肪酸的储备溶液可以通过以下方式来制备：将50mg的相应脂肪酸—月桂酸2d23(Sigma Aldrich，目录号451401)和肉豆蔻酸13C14(Sigma Aldrich，目录号605689)溶解在50mL 80％丙酮/20％甲醇甲醇中以得到对于每种研究的脂肪酸具有1μg/mL的最终浓度的沉淀试剂。可以将50μL样品溶液加入到反应管中的200μL沉淀试剂，通过涡旋混合并保持处于室温1小时以使蛋白质沉淀。可以通过在20℃以15,000xg离心15分钟使沉淀物离心(spun down)。可以将100μL上清液转移到新的反应管中并与100μL流动相A(20mM乙酸铵)混合。在20℃以15,000×g离心15分钟后，可以将50μL至100μL溶液转移到LC-MS小瓶(300μl Fixed Insert Vial(透明，Screw Top)，Thermo Scientific，目录号03-FISV)中。
在配备有可控温自动取样器和柱温箱的ACQUITY UPLC H级系统(WatersCorporation，Milford，MA，US)上通过使用
Figure BDA0004113420420000281
C4 RP柱(
Figure BDA0004113420420000282
Figure BDA0004113420420000283
2x 50mm，5μm)(Phenomenex，目录号00B-4167-B0)可以实现对游离脂肪酸(FFA)的分离。流动相A可以为20mM乙酸铵(Sigma Aldrich，目录号73594)并且流动相B可以为100％甲醇(Merck，目录号1.06007.2500)，其可以通过应用以下梯度以0.4mL/分钟的流速运行4分钟：初始状态：70％流动相B，0.5分钟至3.4分钟：梯度可以从70％到85％流动相B线性变化；3.5分钟至4.0分钟：70％流动相B。自动取样器可以被保持在20℃并且柱温箱可以被保持在60℃。注射体积可以被设定为8μL。可以在负离子模式下在配备有外部前级泵的已连接的QDa Performance质谱仪(Waters)上执行检测。MS设定可以为如下：锥孔电压15V、源温度120℃、毛细管电压800V、探针温度600℃、质量范围50m/z至1000m/z以及采样频率2Hz。所有样品都可以重复进行三次分析。
可以使用TargetLynx作为MassLynx软件4.1版(SCN781)(Waters Corporation，Milford，MA，US)的部分来执行数据评估。月桂酸和肉豆蔻酸的含量可以通过经由使用以下公式将脂肪酸的峰面积与相应的内部标记标准进行比较来确定：
Figure BDA0004113420420000291
其中ΣFFA的峰面积和Σ内标的峰面积分别是指单同位素峰和+1/+2或–1/–2处的同位素峰的总和。
为了确定脂肪酸释放率，可以将每个样品的游离脂肪酸浓度相对于孵育时间进行作图，并且可以从线性回归的斜率提取降解率。
与包含蛋白质的起始组合物相比，包含蛋白质的组合物的水解活性可以降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，例如从20％直至80％，优选地从50％直至80％。反之亦然，与包含蛋白质的起始组合物相比，包含蛋白质的组合物的水解活性可以降低至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％、至多95％或至多99％，优选地至多20％，更优选地至多50％，甚至更优选地至多80％。如果使组合物通过本文提供的方法经受一次或多次纯化(如下文进一步解释的)，那么如本文所定义的降低％优选地是将(初始、第一)起始组合物(即，尚未与如本文所述的水解酶抑制剂接触的起始组合物)称为参考点。
当然，还设想的是，包含蛋白质的组合物中的水解活性降低至低于所采用的测定的检测极限的水平(在后一种情况下，水解活性和/或水解酶被认为是“被去除”，或者更准确地说从本文中的起始组合物“被完全去除”)。
本发明还涉及一种用于制备或用于获得包含蛋白质的组合物的方法，其中包含蛋白质的组合物与起始组合物相比具有降低的水解活性，其中水解活性可以例如通过本文所述的测定中的一种测定来确定(例如，脂肪酶活性测定(例如，如Jahn等人所述)，本文称为LEAP(针对聚山梨醇酯的脂肪酶酶促测定)测定(Jahn(2020)Pharm.Res.37:118)；和/或脂肪酸质谱法(FAMS)测定)。
同样，与起始组合物相比，该组合物可包含含量降低的宿主细胞蛋白质(HCP)，诸如水解酶。例如，与起始组合物相比，HCP含量可以降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。例如，该组合物包含优选地小于100ppm、更优选地小于10ppm、更优选地小于1ppm、更优选地小于0.1ppm、最优选地小于0.01ppm的HCP。
应当理解，当包含蛋白质的起始组合物在所采用的用于测量或定量水解活性的测定中未表现出可检测的水解活性时，也可以采用本文所述的方法。不必受科学理论的束缚，设想的是包含蛋白质的组合物中低于所采用的测定的检测极限的水解活性也可能对包含蛋白质的组合物具有负面影响。所述负面影响可能仅在包含蛋白质的组合物的延期储存期间变得明显。所述负面影响可能是表面活性剂(例如，脂肪酸酯、酯或硫酯)的降解并且在本文中有更详细的描述。
本文中还设想的是，产生的/回收的包含蛋白质的组合物基本上没有水解活性。
因此，本发明涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中包含蛋白质的组合物基本上没有水解活性。
此外，本发明提供了一种用于制备或用于获得包含蛋白质的组合物的方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中包含蛋白质的组合物基本上没有水解活性。
如本文所用的“基本上没有水解活性”可以意味着包含蛋白质的组合物中的水解活性接近或低于用于测量或定量水解活性的测定的检测极限。如本文所用的“基本上没有水解活性”还可以意味着与包含蛋白质的起始组合物相比包含蛋白质的组合物的水解活性降低80％、90％、95％或99％。
如本文所用的“基本上没有水解活性”还可以意味着当包含蛋白质的组合物被储存时(例如，在4℃至8℃储存24个月，例如，储存至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月，并且优选地在如本文所述的标准长期条件下)，包含蛋白质的组合物中少于10％的酯(类)降解。组合物可包含从0.01％(w/v)到2％(w/v)的范围的如本文所述的蛋白质浓度、如本文所述的缓冲液体系、如本文所述的添加剂和如本文所述的表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。
可以通过经由结合ELSD/CAD检测的混合模式HPLC(Lippold(2017)J.Pharm.Biomed.Anal.132:24-34)或所谓的荧光胶束测定(FMA)(Lippold(2017)J.Pharm.Biomed.Anal.132:24-34)确定其余表面活性剂含量来监测降解。此外，FAMS测定可用于直接监测主要降解产物(例如，在PS20的情况下的月桂酸和肉豆蔻酸，在PS80的情况下的油酸)(Honemann(2019)J.Chromatogr.B1116:1-8；Cheng(2019)J.Pharm.Sci.108:2880-2886)。
对上述测定的使用和调整完全在相关技术人员的技能范围内。
应当理解，本文所述的方法可用于降低水解活性和/或用于降低包含蛋白质的起始组合物中的水解酶含量。
因此，本发明在一个方面还涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中该方法是用于降低起始组合物中的水解活性。
此外，本发明在一个方面提供了一种用于制备或用于获得包含蛋白质的组合物的方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含蛋白质的组合物
其中该方法是用于降低起始组合物中的水解活性。
上文已详细描述了可以如何降低水解活性和/或水解酶含量以及可以如何确定对应的降低。
因此，本发明在一个方面还提供了一种从蛋白质组合物去除水解酶和/或降低蛋白质组合物中的水解酶含量的方法。
通常，术语“蛋白质组合物”和“包含蛋白质的组合物”在本文中可互换地使用。
换句话讲，本发明在一个方面涉及一种方法，其中通过从包含蛋白质的起始组合物去除水解酶和/或通过降低起始组合物中的水解酶含量来制备包含蛋白质的组合物。因此，本发明在一个方面涉及一种方法，其中通过从包含蛋白质的起始组合物去除水解酶来制备包含蛋白质的组合物，该方法包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
因此，在如本文所述的方法中，包含蛋白质的起始组合物可包含一种或多种水解酶。
如本文所述的方法可进一步包括用于将水解酶吸附到水解酶抑制剂的步骤。因此，本发明在一个方面涉及一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物；
其中所述步骤(i)进一步包括步骤(a)将水解酶吸附到水解酶抑制剂。“吸附”在本文中以最广义使用并且意味着水解酶与水解酶抑制剂缔合。换句话讲，水解酶与水解酶抑制剂结合。水解酶和水解酶抑制剂可以经由非共价键或经由共价键缔合。非共价键的实例是氢桥、离子相互作用和疏水相互作用。优选地，水解酶和水解酶抑制剂经由共价键缔合。共价键可以为酯、硫酯或磷酸酯。
设想的是，奥利司他的β-内酯部分与水解酶的丝氨酸形成酯键。
进一步设想的是，包含蛋白质的组合物(回收的组合物)可以为包含蛋白质的溶液。此外，包含蛋白质的起始组合物可以为包含蛋白质的溶液。
所述包含蛋白质的溶液可以为水溶液。
所述包含蛋白质的溶液可以为经缓冲溶液。因此，包含蛋白质的所述水溶液也可以为经缓冲溶液。
哪些药剂可以用作用于缓冲溶液的缓冲液在本领域中是众所周知的。术语“缓冲液”在本文中如本领域中已知的那样使用并且是指稳定溶液的pH的药剂。缓冲液通常包含弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸。技术人员知道可以如何确定对于例如某种蛋白质而言的最佳pH以及可以使用哪种缓冲液来稳定所述最佳pH。可以用作缓冲液的药剂的非限制性实例是Tris、Hepes、Pipes、Mops、乙酸盐和磷酸盐。
如上所述，该方法可包括使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触。本文描述了水解酶抑制剂以及水解酶抑制剂的非限制性实例。此外，水解酶抑制剂可以选自由以下项组成的组：奥利司他或双烯醇酯、膦酸酯类，例如，a-氨基烷基磷酸酯或对硝基苯基膦酸酯(例如，4-硝基苯基十一-10-烯基膦酸甲酯)(Delorme(2014)Biochimie 107:124-134)
如上文已提到的，水解酶抑制剂可以被固定/附着到固体载体。术语“固体载体”和“固相”在本文中可互换地使用。
固体载体可以为树脂并且呈柱的形式，例如，可商购获得的树脂/柱。固相可以例如为树脂并且通常呈柱的形式，其本身是可商购获得的。在根据本发明所述的方法中使用柱是优选的，因为其能够易于放大。由于水解酶抑制剂与水解酶共价结合，因此这种柱可以用于一次性使用。因此，不需要再生柱。设想的是，这种包含被固定到固体载体的水解酶抑制剂的柱具有比例如用于在可比较的过程步骤中使用的疏水相互作用色谱法(HIC)的柱(HIC柱通常具有约20L的体积)更小的体积。包含被固定到固体载体的水解酶抑制剂的柱的体积可以介于约250ml至至多约5l之间，例如，可以介于约250ml至约5L之间、约250ml至约4L之间、约250ml至约3L之间、约250ml至约2L之间、约250ml至约1.5L之间、约250ml至约1L之间或者可以介于约500ml至约5L之间、约500ml至约4L之间、约500ml至约3L之间、约500ml至约2L之间、约500ml至约1.5L之间、约500ml至约1L之间，例如，可以为约500ml、约1L、约1.5L、约2L、约3L、约4L或约5L。优选地，包含被固定到固体载体的水解酶抑制剂的柱的体积介于约500ml至约1.5L之间，更优选地介于约500ml至约1L之间。最优选地，包含被固定到固体载体的水解酶抑制剂的柱的体积为约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1L、约1.1L、约1.2L、约1.3L、约1.4L或约1.5L。特别优选的是包含被固定到固体载体的水解酶抑制剂的柱的体积为约500ml或约1L。
然而，还可能的是固体载体呈珠的形式或呈膜的形式。
例如，如果固体载体呈包含所述抑制剂的珠的形式，则该方法可包括执行接触以及通过离心、倾析和溶解进行回收的步骤。也可能在回收步骤(其可包括洗涤步骤)期间使用磁珠和磁分离。本领域技术人员熟悉用于亲和纯化的不同过程并且可以容易地调整此类过程以用于根据本发明所述的方法中。
固体载体可以选自由以下项组成的组：琼脂糖、聚苯乙烯、无机金属和/或金属-杂原子颗粒(例如，Fe3O4、SiO2或FeS颗粒)、金颗粒、银颗粒和智能聚合物。还可能的是固体载体呈磁珠形式，并且在执行该方法时可以采用磁分离。技术人员熟悉在亲和纯化的上下文中通常使用的不同过程，并且可以容易地调整此类过程以用于根据本发明所述的方法中。
尽管技术人员熟知可以如何将水解酶抑制剂固定在固体载体上，但下文中提供了非限制性实例。通常，水解酶抑制剂可以经由官能团的连接和/或生物分子/配体结合被固定在固体载体上。
以下解释以及本文上文关于水解酶抑制剂的解释经过必要的修正也适用于用于制备被固定在固体载体上的水解酶抑制剂(例如，用于制备包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱))的方法。这种用于制备被固定在固体载体上的水解酶抑制剂(或用于制备包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱))的方法明确地被认为是本发明的方面。被固定在固体载体上的水解酶抑制剂和/或包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱)也是本发明的方面。反之亦然，本文关于包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱)的制备以及关于这种装置本身的解释和定义经过必要的修正也适用于被固定在固体载体上的水解酶抑制剂和/或用于制备其的方法。应当理解，当根据本发明水解酶抑制剂应被固定在固体载体上时，将使用如本文所解释的水解酶抑制剂的衍生物。
水解酶抑制剂可以经由叠氮基基团和炔基基团的反应被固定在固体载体上。所述反应可以为叠氮化物-炔烃Huisgen环加成反应。炔基基团可以附着到水解酶抑制剂，而叠氮基基团可以附着到固体载体。然而，还可能的是炔基基团可以附着到固体载体，而叠氮基基团可以附着到水解酶抑制剂。
因此，水解酶抑制剂可以被固定到经叠氮化物修饰的磁性颗粒(基于聚苯乙烯的叠氮化物珠；CLK-1036-1，Jena-Bioscience)。术语叠氮基基团和叠氮化物基团在本文中可互换地使用。
此外，水解酶抑制剂可以经由链霉亲和素基团与生物素基团的结合被固定在固体载体上。链霉亲和素基团可以附着到水解酶抑制剂，而生物素基团可以附着到固体载体。优选地，链霉亲和素基团可以附着到固体载体，而生物素基团附着到水解酶抑制剂。
此外，水解酶抑制剂可以经由氨基基团和N-羟基琥珀酰亚胺活化酯的反应被固定在固体载体上。氨基基团可以附着到水解酶抑制剂，而N-羟基琥珀酰亚胺活化酯附着到固体载体。然而，还可能的是氨基基团附着到固体载体而N-羟基琥珀酰亚胺活化酯附着到水解酶抑制剂。尽管对于技术人员而言是清楚的，但应注意水解酶抑制剂或固体载体可以经由接头与上述反应性基团分开。接头在本文下文进行描述。
尽管对于技术人员而言是清楚的，但应注意可以将如上所述用于将水解酶抑制剂固定在固体载体上的手段和方法进行组合。例如，设想的是，包含由接头分开的叠氮基基团和生物素基团的药剂首先经由点击化学与包含炔基基团的水解酶抑制剂偶联。随后，与所述药剂偶联的水解酶抑制剂被固定在包含链霉亲和素基团的固体载体上。技术人员熟知哪种接头可能是合适的。这种接头可以促进复合物形成和/或在水解酶抑制剂与固体载体之间建立确定的距离。接头原则上可以为适用于以所需距离共价连接固体载体上的水解酶抑制剂的任何化学键。技术人员可以根据关于键对预期用途的环境和条件的耐受性的需要来选择接头。例如，接头可包括PEG或生物聚合物(诸如DNA/LNA)、聚糖(例如，壳聚糖或衍生物)、马来酰亚胺烷烃接头、化学上可裂解接头(例如，肼/二硫化物接头)或酶促可裂解接头(例如，Val-Cit-PABC接头)。PEG接头可以为PEG3或PEG4。在优选的实施方案中，包含由PEG接头分开的叠氮基基团和生物素基团的药剂/接头为偶氮基生物素-PEG3-叠氮化物(Sigma-Aldrich；订单号：900891；CAS 1339202-33-3)，在本文中也称为偶氮基-生物素-叠氮化物，因为它以偶氮基-生物素-叠氮化物为名进行分销。在优选的实施方案中，与所述药剂偶联的水解酶抑制剂被固定在链霉亲和素Mag Sepharose珠(GE Healthcare；订单号：11791456)上。在另一个优选的实施方案中，包含由PEG接头分开的叠氮基基团和生物素基团的药剂为生物素-PEG4-叠氮化物(BroadPharm；目录号：BP-22119；CAS 1309649-57-7)。在优选的实施方案中，与所述药剂偶联的水解酶抑制剂被固定在链霉亲和素
Figure BDA0004113420420000362
High Performance珠(GE Healthcare；订单号：17511301)上。
此外，本文中设想的是，首先将包含由接头分开的叠氮基基团和氨基基团的药剂与包含NHS活化酯的固体载体偶联。随后，将包含炔基基团的水解酶抑制剂与被固定在固体载体上的所述药剂偶联。上文描述了对接头的描述。在优选的实施方案中，包含由接头分开的叠氮基基团和氨基基团的药剂为叠氮基-PEG4-胺(Broadpharm，BP-21615；CAS 951671-92-4)。在优选的实施方案中，与所述药剂偶联的水解酶抑制剂被固定在NHS活化的
Figure BDA0004113420420000363
4Fast Flow珠(GE Healthcare；订单号：17090601)上。
下文涉及可以根据本发明进行使用的抑制剂。
优选地，水解酶抑制剂(呈附着在固相上之前的形式)选自包含或包括(例如具有)选自以下项的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000361
其中在(HI-1)中
R1、R2和R3各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，任选地其中R1、R2或R3中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换，
其中在(HI-2)中
R11、R12和R13各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，任选地并且其中R11、R12和R13中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换。
如存在于固体载体上的水解酶抑制剂优选地选自包含或包括选自以下项的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000371
其中在(HIB-1)中
R1、R2和R3各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，其中R1、R2或R3中(优选地R2中)的一个末端–CH3基团被–CH2–*基团替换，其中–*表示水解酶抑制剂与固体载体连接的位置，
其中在(HIB-2)中
R11、R12和R13各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，并且其中R11、R12或R13中(优选地R11中)的至少一个末端–CH3基团被–CH2–*基团替换，其中–*表示水解酶抑制剂与固体载体连接的位置。
R1、R2和R11中的碳原子数可以独立地选自2至15，优选地3至14，更优选地4至12，甚至更优选地5至11。
R12和R13中的碳原子数可以独立地选自5至24，优选地8至18，更优选地10至16，甚至更优选地10至12。
R3中的碳原子数可以选自2至10，优选地2至8，更优选地3至6，甚至更优选地3至5。
R1和R2的烷基基团优选地为直链的。
R11、R12和R13的烷基基团优选地为直链的。
R3的烷基基团优选地为支链的。
优选地式(HIB-1)具有以下结构(HIB-1a)：
Figure BDA0004113420420000381
其中R1、R2和R3如上文所定义。
在上述(HI-1)和(HI-2)的实例中，(呈附着到固相之前的抑制剂的形式)以及在其任何更具体的实例中，除–C≡CH基团之外的官能团可包括诸如羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、其他炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)。应当理解，如存在于固体载体上的水解酶抑制剂将经由从官能团(其在水解酶抑制剂与固相结合之前存在于固体载体和水解酶抑制剂上)产生的接头基团(例如，在抑制剂(呈附着到固相之前的形式)具有炔基基团并通过与叠氮化物的反应(直接地或间接地)与固相结合的情况下经由1,2,3-三唑)与固体载体结合。
优选地，水解酶抑制剂(呈附着到固相之前的抑制剂的形式)含有炔基基团并且选自具有选自以下项的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000382
Figure BDA0004113420420000391
应当理解，本文提供的水解酶抑制剂通常涉及水解酶抑制剂本身，但是为了进行固定，水解酶抑制剂需要进行修饰/调整，例如因为抑制剂含有炔基基团。如此经修饰/经调整的水解酶抑制剂在本文中也称为“水解酶抑制剂的衍生物”。
经修饰/经调整的水解酶抑制剂(水解酶抑制剂衍生物)(呈附着到固相之前的抑制剂的形式)优选地为含有炔基基团的水解酶抑制剂并且选自具有选自以下项的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000392
其中在(HI-1)中
R1、R2和R3各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，其中R1、R2或R3中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换，
其中在(HI-2)中
R11、R12和R13各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，并且其中R11、R12和R13中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换。
这种经修饰/经调整的水解酶抑制剂(水解酶抑制剂衍生物)也在本文下文进行进一步解释和定义。
在以下Markush结构中提供了显示可以在本发明的上下文中使用的水解酶抑制剂。
Markush：奥利司他：
活性结构元素名称：(乙基氧杂环丁烷-2-酮)：
Figure BDA0004113420420000401
奥利司他为可商购获得的物质：
Figure BDA0004113420420000402
这在本文中也称为式(4)。
R1＝烷基-炔烃；R2＝烷基(奥利司他衍生物1；奥利司他A))：
Figure BDA0004113420420000403
R1＝烷基；R2＝烷基-炔烃(奥利司他衍生物2；奥利司他B))：
Figure BDA0004113420420000404
在优选的实施方案中，水解酶抑制剂为奥利司他。优选地，奥利司他经由叠氮基基团和炔基基团的反应被固定在固体载体上。应当理解，当奥利司他应被固定在固体载体上时，将使用奥利司他衍生物。优选地，奥利司他衍生物包含炔基基团。奥利司他还公开于Yang等人,(2010),J.Am.Chem.Soci 132,656-666中。优选地，包含炔基基团的奥利司他衍生物选自由以下项组成的组：式(1)，其在本文中命名为奥利司他A；和式(2)，其在本文中命名为奥利司他B。术语化合物(A)、式(1)、奥利司他A和奥利司他衍生物1在本文中可互换地使用。术语化合物(B)、式(2)、奥利司他B和奥利司他衍生物2在本文中可互换地使用。
Figure BDA0004113420420000411
在另一个优选的实施方案中，水解酶抑制剂为双烯醇酯。双烯醇酯是众所周知的，并且尤其在“Functionalized Bis-enol Acetates as Specific Molecular Probes forEsterases”(Richter(2013)ChemBioChem 18:2435-2438)中有描述。
该结构元素(双烯醇酯)源自具有以下结构的天然化合物
Figure BDA0004113420420000412
(参见https://roempp.thieme.de/lexicon/RD-03-00698或https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Caulerpenyne)。该化合物被称为Caulerpenyne，其CAS编号为70000-22-5，并且其PubChem CID为5311436。
以下涉及双烯醇酯。
Markush：双烯醇酯：
Figure BDA0004113420420000421
活性结构元素名称：(1,3)-丁-1,3-二烯-1,4-二基二脂肪酸
R1＝H或偶联基团[CH2-(CH2)n-炔烃或DiG/<Dig>/生物素-链霉亲和素、NHS、SH、LNA[n＝1-10]
R2＝-(CH2)x-CH3[x＝1-20]
R3＝-(CH2)y-CH3[y＝1-20]
优选地，双烯醇酯经由接头(诸如炔基基团)(例如，经由叠氮基基团和炔基基团的反应)被固定在固体载体上。应当理解，当双烯醇酯应被固定在固体载体上时，将使用双烯醇酯的衍生物。优选地，双烯醇酯衍生物包含炔基基团。优选地，包含炔基基团的双烯醇酯衍生物包含或包括式(3)
Figure BDA0004113420420000422
术语化合物(C)和式(3)在本文中可互换地使用。
如技术人员将理解的，诸如“被固定的抑制剂选自由奥利司他或双烯醇酯组成的组”的表述指示奥利司他或双烯醇酯经由合适的偶联基团与固体载体连接。例如，可以通过使含有炔基基团的经修饰的奥利司他或双烯醇酯与具有一个或多个叠氮基基团的固体载体反应来固定奥利司他或双烯醇酯。在这种情况下，应当理解，存在于固体载体上的奥利司他或双烯醇酯在其烷基基团中的一个烷基基团中具有修饰，通过该修饰奥利司他或双烯醇酯已连接到固体载体。例如，如果奥利司他的CH2-CH3基团已被修饰为–C≡CH基团以使得能够通过与固体载体的叠氮基基团的“点击”反应连接到固体载体，那么奥利司他的该部分也将被修饰为其中奥利司他连接到固体载体的形式(特别是代表-C≡CH基团的部分将成为通过-C≡CH基团与叠氮基基团的反应形成的三唑的部分)。
如上文已经提到的，本发明在一个方面进一步涉及一种用于制备或用于获得被固定在固体载体上的水解酶抑制剂和/或用于制备或用于获得包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱)的方法。因此，这种方法包括将水解酶抑制剂固定在固体载体上的步骤。本发明在一个方面还涉及一种被固定在固体载体上的水解酶抑制剂和/或一种包含被固定在固体载体上的水解酶抑制剂的装置(诸如柱)。所述被固定在固体载体上的水解酶抑制剂和/或所述装置可以通过该方法来制备或获得。此外，根据本发明可以使用通过本文公开的方法制备、获得或能够获得的被固定的抑制剂和/或通过本文公开的方法制备、获得或能够获得的被固定在固体载体上的水解酶抑制剂，例如在包括以下步骤的方法中
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物。
在优选的方面，抑制剂为能够通过使包含或包括式(1)、(2)、(3)或(4)，优选式(1)、(2)或(4)的化合物与叠氮化物反应而获得的基团。
换句话讲，本发明还涉及以下项1至42中所表达的方法和产物：
项1.一种用于将水解酶抑制剂固定在固体载体上的方法，其包括以下步骤：
提供固体载体，
提供水解酶抑制剂，
使所述固体载体与含有所述水解酶抑制剂的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂被固定在所述固体载体上。
项2.根据项1所述的方法，其中所述固体载体选自：聚(甲基)丙烯酸酯类，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；聚苯乙烯；聚环氧乙烷；纤维素和纤维素衍生物，例如，乙酸纤维素(CA)或再生纤维素；琼脂糖，包括交联的琼脂糖；聚砜(PSU)；聚醚砜(PES)；聚乙烯(PE)；聚丙烯(PP)；聚碳酸酯(PC)；聚丙烯腈(PAN)；聚酰胺(PA)；聚四氟乙烯(PTFE)；以及上述物质的共混物或共聚物，或与亲水性聚合物，优选地与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚环氧乙烷(PEO)的共混物或共聚物。
项3.根据项1或2所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项4.根据项3所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入能够与所述固体载体的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项5.根据项1至4中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项6.根据项5所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入能够与所述水解酶抑制剂的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项7.根据前述项中任一项所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
提供固体载体，
使所述固体载体与含有接头的溶液接触以形成载体-接头，
提供水解酶抑制剂，
使所述载体-接头与含有所述水解酶抑制剂的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂被固定在所述载体-接头上。
项8.根据项7所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项9.根据项7或8所述的方法，其中所述接头包含能够与所述固体载体的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项10.根据项7至9中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项11.根据项7至10中任一项所述的方法，其中所述接头进一步包含能够与所述水解酶抑制剂的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项12.根据前述项中任一项所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
提供固体载体，
提供水解酶抑制剂，
使所述水解酶抑制剂与接头接触以形成水解酶抑制剂-接头，
使所述固体载体与含有所述水解酶抑制剂-接头的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂-接头被固定在所述固体载体上。
项13.根据项12所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项14.根据项12或13所述的方法，其中该接头包含能够与该固体载体的该官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项15.根据项12至14中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
项16.根据项12至15中任一项所述的方法，其中该接头进一步包含能够与该水解酶抑制剂的该官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
项17.根据项1至16中任一项所述的方法，其中所述固体载体上的所述官能团包括氨基基团，优选伯氨基基团。
项18.根据项17所述的方法，其中所述固体载体上的所述氨基基团通过用反应性等离子体，优选地由包含氨的气体混合物生成的等离子体进行处理来被引入。
项19.根据项7至18中任一项所述的方法，其中所述接头为含有选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的至少两个官能团的化合物。
项20.根据项19所述的方法，其中所述接头进一步含有聚氧乙烯或聚氧丙烯部分，所述聚氧乙烯或聚氧丙烯部分优选地含有所述至少两个官能团结合到的3个至20个(更优选地3个至10个，甚至更优选地3个至5个)氧乙烯或氧丙烯单元。
项21.根据项7至20中任一项所述的方法，其中所述接头含有选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的至少两种不同官能团。
项22.根据项21所述的方法，其中所述接头每个分子含有：选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物、链霉亲和素和生物素的第一官能团；以及选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的与所述第一官能团不同的另外至少两个第二官能团，所述至少两个第二官能团优选为相同类型。
项23.根据项1至22中任一项所述的方法，其中所述固体载体为交联的琼脂糖，优选琼脂糖凝胶，更优选Mag-Sepharose-Streptavidin或Streptavidin
Figure BDA0004113420420000471
HighPerformance珠。
项24.根据项1至23中任一项所述的方法，其中所述固体载体含有包括链霉亲和素的官能团，并且所述接头含有包括生物素的官能团。
项25.根据项24所述的方法，其中所述接头另外含有叠氮基基团，并且所述水解酶抑制剂含有炔基基团。
项26.根据项1至25中任一项所述的方法，其中所述固体载体含有包括羧酸根的官能团，所述包括羧酸根的官能团任选地是NHS-活化的，并且所述接头含有包括胺基的官能团。
项27.根据项26所述的方法，其中该接头另外含有叠氮化物基团，并且该水解酶抑制剂含有炔基团。
项28.根据项1至27中任一项所述的方法，其中所述接头选自生物素-PEG3-叠氮化物(CAS 875770-34-6)、生物素-PEG4-叠氮化物(CAS1309649-57-7)、偶氮基-生物素-叠氮化物(CAS 1339202-33-3)和叠氮基-PEG4-胺(CAS 951671-92-4)。
项29.根据项1至28中任一项所述的方法，其中所述水解酶抑制剂含有炔基基团并且选自具有选自以下项的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000481
其中在(HI-1)中
R1、R2和R3各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，其中R1、R2或R3中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换，
其中在(HI-2)中
R11、R12和R13各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，并且其中R11、R12和R13中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换。
项30.根据项29所述的方法，其中R1、R2和R11中的碳原子数独立地选自2至15，优选地3至14，更优选地4至12，甚至更优选地5至11。
项31.根据项29或30所述的方法，其中R12和R13中的碳原子数独立地选自5至24，优选地8至18，更优选地10至16，甚至更优选地10至12。
项32.根据项29至31中任一项所述的方法，其中R3中的碳原子数选自2至10，优选地2至8，更优选地3至6，甚至更优选地3至5。
项33.根据项29至32中任一项所述的方法，其中R1和R2的所述烷基基团为直链的。
项34.根据项29至33中任一项所述的方法，其中R11、R12和R13的所述烷基基团为直链的。
项35.根据项29至34中任一项所述的方法，其中R3的所述烷基基团为支链的。
项36.根据项29至35中任一项所述的方法，其中式(HI-1)具有以下结构(HI-1a)：
Figure BDA0004113420420000491
其中R1、R2和R3如前述项中所定义。
项37.根据项1至36中任一项所述的方法，其中该水解酶抑制剂含有炔基团并且选自具有选自以下的结构的化合物：
Figure BDA0004113420420000492
项38.一种被固定在固体载体上的水解酶抑制剂，所述水解酶抑制剂通过根据项1至37中任一项所述的方法能够被获得。
项39.一种装置，其包括根据项38所述的被固定在固体载体上的所述水解酶抑制剂。
项40.根据项39所述的装置，其中所述装置为具有至少两个开口的管状装置。
项41.根据项39或40所述的装置，其中所述装置包括容器，所述容器优选地由金属、聚合物或玻璃制成，所述容器形成腔，在所述腔中容纳被固定在固体载体上的所述水解酶抑制剂。
项42.根据项39至41中任一项所述的装置，其中所述装置为柱，所述柱至少部分地填充有被固定在固体载体上的所述水解酶抑制剂。
优选的是，在包含蛋白质的组合物被回收之前，使包含蛋白质的起始组合物与被固定在固体载体上的水解酶抑制剂接触。换句话讲，在包含蛋白质的起始组合物与被固定在固体载体上的水解酶抑制剂接触之后回收包含蛋白质的组合物。因此，如本文所述的方法可以按以下顺序来实施：
步骤(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
之后是
步骤(ii)回收包含蛋白质的组合物。
本文所述方法的步骤(i)和(ii)通常将按该顺序执行，即，步骤(i)之后是步骤(ii)。虽然在步骤(i)与步骤(ii)之间可能存在进一步的步骤(诸如进一步的纯化步骤)，但本文中优选的是，步骤(i)之后直接进行步骤(ii)，即，在步骤(i)与步骤(ii)之间没有进一步的步骤。
此外，本文中设想和优选的是，步骤(i)和(ii)(优选地按(i)之后是(ii)的顺序)可以执行一次，使例如包含蛋白质的起始组合物(如粗提取物或已通过常规方法(诸如蛋白A亲和色谱法)纯化的提取物)经受该方法的步骤(i)，之后根据步骤(ii)回收包含蛋白质的组合物。换句话讲，本文中优选的是，在本文所述的方法中/在实施该方法时步骤(i)(仅)执行一次。如本文中提到和描述的，该方法可包括在步骤(i)之前和/或在步骤(i)和(ii)之间的附加纯化和/或制备步骤，例如，亲和色谱法、离子色谱法和/或混合模式色谱法。
然而，还设想的是，步骤(i)和(ii)(优选地按(i)之后是(ii)的顺序)可以被重复一次或多次，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。例如，可能期望在步骤(i)和(ii)已被第一次执行之后(进一步)降低回收的包含蛋白质的组合物中的水解活性，例如以达到水解活性的特定阈值和/或为了(进一步)去除或减少杂质(诸如宿主细胞蛋白质，特别是水解酶)。
在本上下文中，将使在该方法的步骤(ii)中回收的包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上。
例如，然后可以相应地如下实施该方法(优选地按(i)之后是(ii)之后是(iii)之后是(iv)的顺序(简称为顺序(i)至(iv)：
一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物；
(iii)使在(前一)步骤(ii)中回收的包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(iv)回收包含该蛋白质的组合物。
然后可以根据需要重复该操作，如上所述，例如如下：
一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物；
(iii)使在(前一)步骤(ii)中回收的包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(iv)回收包含该蛋白质的组合物；
(v)使在(前一)步骤(iv)中回收的包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(vi)回收包含该蛋白质的组合物；
等等。
为了进一步重复这些步骤，可以在该方法中附加地执行任何所需数量的以下步骤：
(vii)使在前一步骤中回收的包含蛋白质的组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(viii)回收包含该蛋白质的组合物；
等等。
尽管对于技术人员而言是清楚的，但应指出，本文所述的方法可以与(常规)蛋白质制备和/或纯化的手段和方法组合。
换句话讲，使包含蛋白质的起始组合物与被固定的水解酶抑制剂接触的步骤和回收蛋白质组合物的步骤可以与附加的(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤组合。因此，在优选的方面，该方法可以进一步包括在步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”之前的一个或多个(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤。
该方法可以进一步包括在步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”之后的一个或多个(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤。
该方法可以进一步包括在步骤(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上之前和之后的一个或多个(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤。
(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤的非限制性实例是离子交换色谱法(诸如阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX)，优选地阳离子交换色谱法(CEX))、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)和(超)过滤或它们的组合，诸如混合模式色谱法(例如，混合模式离子交换色谱法，优选地混合模式阴离子交换色谱法(MMAEX))。亲和色谱法优选地为蛋白A亲和色谱法。
这些术语和蛋白质制备和/或纯化步骤(包括亲和色谱法、离子交换色谱法(诸如阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX)和/或疏水相互作用色谱法(HIC)色谱法)的含义在本领域中是众所周知的。
混合模式色谱法的优点在于，溶质通过不止一种相互作用模式或机制与固定相相互作用，从而提高选择性和分离能力(Zhang和Liu(2016)J.Pharm.Biomed.Anal.128:73-88)。混合模式色谱法(或多模式色谱法)可以例如包括以下方法：
IEC/HIC
由于IEC和HIC条件最接近适用于保持生物活性的生理条件，因此它们的组合被广泛用于对生物制品的分离中。IEC/HIC MMC提高了分离能力和选择性，原因在于溶质通过静电和疏水相互作用两者与固定相相互作用。
IEC/RPLC
IEC/RP MMC结合了RPLC和IEC的优点。例如，当与单一的WAX或RPLC-相比时，WAX/RP提高了分离能力和调整分离选择性的自由度
HILIC/RPLC
Liu等人合成了HILIC/RP固定相，其可以通过调整流动相中的有机相来显示RPLC或HILIC保留(Liu和Pohl(2008)J.Chrom.A 1191:83–89)。
HILIC/IEC
Mant等人报告了与用于肽分离的RPLC相比，HELIC/CEX提供了独特的选择性、更强的分离能力和更广泛的应用。(Mant等人(1998)J.Chrom.A.816(1):79–88)
SEC/IEC
蛋白质SEC中的疏水相互作用在低离子强度下为相对弱，静电效应可能对保留有显著影响，并且这使我们可以使用SEC柱作为弱离子交换剂。
优选地，使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触是在使包含蛋白质的起始组合物(仅)经受蛋白A亲和色谱法以及任选地过滤之后实施的。如果实施过滤，那么优选地顺序为蛋白A亲和色谱法并且随后是过滤(即，蛋白A亲和色谱法之后是过滤)。“(仅)经受”意味着使起始组合物仅经受给定的(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤，诸如本上下文中的蛋白A亲和色谱法以及任选地过滤，即，该方法在步骤(i)之前不包括除给定方法之外的任何其他纯化方法。
本文中设想的是，使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触是在使包含蛋白质的起始组合物(仅)经受蛋白A亲和色谱法以及任选地过滤之后和/或在使包含蛋白质的起始组合物经受离子交换色谱法或混合模式离子交换色谱法(优选地阳离子交换色谱法或混合模式阴离子交换色谱法)之后实施的。
因此，在优选的方面，该方法可以在步骤(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上之前进一步包括亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)以及任选地过滤。
如本文所用的蛋白A亲和色谱法优选地包括降低组合物的pH值以及随后升高pH值(至初始pH值)。这用于灭活病毒(如果(潜在地)存在于组合物中)。经受了这种蛋白A亲和色谱法的组合物在本文中也称为“经调整蛋白A溶液池”、“经调整蛋白A洗脱池”、“经调整蛋白A洗脱液”、蛋白A洗脱池或蛋白A洗脱液。
此外，如本文所用的过滤可包括使用深度过滤器。因此，深度过滤在本文中是优选的。经受了这种蛋白A亲和色谱法之后进行过滤的组合物在本文中也称为“混合模式阴离子交换负载溶液”(其表明该溶液在实施步骤(i)之后经受混合模式离子交换色谱法，特别是混合模式阴离子交换色谱法。
如上所述，该方法可以进一步包括在步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”之后的一个或多个(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤。在优选的方面，该方法可以在步骤(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上之后(并且在回收组合物之前)进一步包括以下中的(至少)一个步骤：离子交换色谱法和/或混合模式色谱法(诸如混合模式离子交换色谱法)和/或疏水相互作用色谱法(HIC)，优选地阳离子交换色谱法和/或混合模式色谱法(诸如混合模式阴离子交换色谱法)和/或疏水相互作用色谱法(HIC)。
混合模式离子交换色谱法在本文中优选地为混合模式阴离子交换色谱法(MMAEX)。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于从培养细胞产生、纯化和/或分离感兴趣的蛋白质的步骤进一步包括选自由以下项组成的组的步骤中的至少一个步骤：收获澄清过程(或用于从细胞培养物去除完整细胞和细胞碎片的类似过程)、超滤(UF)过程(或用于浓缩产生的蛋白质的类似过程)、渗滤(DF)过程(或用于改变或稀释包含来自先前过程的产生的蛋白质的缓冲液的类似过程)、病毒灭活过程(或用于灭活或去除病毒颗粒的类似过程)、亲和捕获过程(或用于捕获产生的蛋白质并将其与缓冲液/溶液组分的其余部分分开的色谱法中的任一种色谱法)、配制过程和大块填充(bulk fill)过程。在一个方面，如本文所公开的用于从培养细胞产生、纯化和/或分离蛋白质的步骤包括至少收获澄清过程(或用于从细胞培养物去除完整细胞和细胞碎片的类似过程)、收获后超滤(UF)过程(或用于浓缩产生的蛋白质的类似过程)、收获后渗滤(DF)过程(或用于改变或稀释包含来自先前过程的产生的蛋白质的缓冲液的类似过程)、溶剂/清洁剂病毒灭活过程(或用于用化学方法灭活病毒颗粒的类似过程)、中间纯化过程(诸如疏水相互作用色谱法(HIC)或用于捕获产生的蛋白质并将其与缓冲液/溶液成分的其余部分分开的色谱法中的任一种色谱法)、HIC后UF/DF过程(或用于针对产生的蛋白质进行浓缩和/或缓冲交换的类似过程)、病毒减少过滤过程(或用于进一步去除任何病毒颗粒或者其他杂质或污染物的类似过程)；混合模式色谱法(诸如
Figure BDA0004113420420000552
Adhere琼脂糖色谱法，或者用于进一步纯化和/或浓缩产生的蛋白质的类似过程)、配制过程和大块填充过程。在一个方面，本文提供的方法的分离步骤进一步包括以下中的至少一者：收获物澄清、超滤、渗滤、病毒灭活、亲和捕获、HIC色谱法、混合模式色谱法以及它们的组合。
在一些方面，如本文所公开的用于从培养细胞纯化蛋白质的步骤包括色谱法过程。在一个实施方案中，色谱法过程为亲和捕获过程。色谱法过程可以涉及至少疏水相互作用色谱法(HIC)、蛋白A色谱法或
Figure BDA0004113420420000551
Adhere混合模式色谱法。
如上文在优选的方面所提到的，本文所述的方法可以在步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”之前和/或之后进一步包括一个或多个(常规)蛋白质制备和/或纯化步骤。因此，本文所述的方法可以为平台过程(即，用于纯化感兴趣的蛋白质(诸如抗体)的方法/过程)。
这种方法/过程可包括使用具有不同的纯化原理(即，不同的蛋白质制备和/或纯化步骤)的若干个柱。
本文所述的典型过程或方法(用于制备包含蛋白质的组合物)包括(常规)制备和/或纯化感兴趣的蛋白质的至少4个后续步骤，即，从细胞培养物制备蛋白质组合物，之后通常是(至少)3个(常规)色谱法步骤，任选地4个(常规)色谱法步骤。
因此：在已从细胞培养物或培养物上清液制备蛋白质组合物(步骤1)后，方法/过程通常涉及3个后续(常规)色谱法步骤(任选地4个后续步骤)，例如，通常使用3个柱(任选地4个柱)，每个柱采用不同的纯化原理(步骤2至4，或者在包括任选的步骤5(柱4)的情况下为步骤2至5)。
优选地，本文所述的方法/过程(用于制备包含蛋白质的组合物)除步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”之外，还包括使用具有三种(任选地4种)不同的纯化原理的(至少)三个柱(任选地4个柱)。
图7示出了用于制备感兴趣的蛋白质的组合物/纯化感兴趣的蛋白质的常规示意性方法/过程。图7还说明了其中步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”可用于本发明的方法中。
首先，制备来自细胞培养物(产生蛋白质/感兴趣的蛋白质的细胞)的组合物，例如，通过均质化细胞。该组合物也可以为细胞培养物上清液。优选地，上述组合物随后被纯化，例如，则该组合物为(如)与细胞、细胞碎片和/或聚集体分开(例如，通过过滤)的组合物。因此，(随后纯化的)组合物为(如)与细胞、细胞碎片和/或聚集体分开(通过过滤)的组合物，例如为收获细胞培养液(HCCF)。
第二，进一步纯化上述组合物，例如，通过蛋白质制备和/或纯化的进一步的步骤(步骤2)。蛋白质制备和/或纯化的进一步的步骤优选地为亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)。因此，亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)优选地为第一色谱法步骤。例如，使上述组合物(例如，收获细胞培养液(HCCF))经受蛋白A亲和色谱法。换句话讲，该过程包括使用亲和色谱柱(蛋白A亲和色谱柱)。
第三，然后使洗脱液经受第二柱(柱2)/步骤3)。
第四，然后使第二柱的洗脱液经受第三柱(柱3/步骤4)。第五，如果在第四步之后(即，在三个柱之后(优选地每个柱采用不同的纯化原理))未达到或要进一步提高质量(例如，感兴趣的蛋白质的纯度)，那么任选地可以使用第五步(例如，具有第四纯化原理的第四柱)(柱4/步骤5)。技术人员可以根据具体情况决定第五步是否是必要的和/或有益的，例如在平衡成本和/或增加的复杂性与提高的质量时。
因此，步骤 3 至 5可以为按任何顺序的离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC)。换句话将，柱2至4可以为按任何顺序的离子交换色谱柱(例如，阴离子交换色谱(AEX)柱或阳离子交换色谱(CEX)柱)、混合模式色谱柱和疏水相互作用色谱(HIC)柱，即，该过程包括按任何顺序使用上述柱中的任何柱。
在平台过程/纯化过程的开发期间，技术人员可以确定要使用的步骤/柱的顺序。
第六，在柱3或任选的柱4(步骤4以及任选地步骤5)之后，使洗脱液经受病毒过滤并且随后第七经受超滤/渗滤(UFDF)。在第七步(UFDF)之后，可以回收包含蛋白质的组合物。
在图7的方案中，使收获细胞培养液(HCCF)经受蛋白A亲和色谱法。然后使洗脱液经受第二柱(柱2)。然后使第二柱的洗脱液经受第三柱(柱3)。如果在第三步之后(即，在具有三种不同的纯化原理的三个柱之后)未达到质量(例如，感兴趣的蛋白质的纯度)，则(例如在有真正需要的情况下)可以使用第五步(例如，具有第四种纯化原理的第四柱)(图7中的柱4)。否则，通常不会使用第五步/第四列以避免成本、材料损耗和复杂性增加。技术人员可以根据具体情况决定第四步是否是必要的和/或有益的。
对于如图7所示的柱2、3和4，存在在开发期间定义的序列。所评估的纯化原理在本文中进行描述并且可以为离子交换色谱法(例如，阴离子-阳离子交换色谱法)、混合模式色谱法或疏水相互作用色谱法。换句话讲，在平台过程/纯化过程的开发期间，技术人员将确定所使用的柱的顺序。本文上文提供了不同的纯化原理(蛋白质制备和/或纯化步骤)相互之间的顺序的若干个非限制性实例。
在柱3或任选的柱4之后，使洗脱液经受病毒过滤并且随后经受超滤/渗滤(UFDF)。
此外，技术人员可以确定何时执行步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”(在图7中称为使组合物与水解酶抑制剂接触)。
本发明的方法/过程(用于制备包含蛋白质的组合物)包括步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂(诸如奥利司他)接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”(例如，该步骤为水解酶抑制剂色谱法(水解酶抑制剂色谱法步骤)。换句话讲，该方法/过程可包括使用水解酶抑制剂(例如奥利司他)柱。
优选地，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤在亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)步骤/步骤2之后。换句话讲，该过程可包括(直接)在蛋白A柱之后使用水解酶抑制剂(例如奥利司他)柱。因此，优选地，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”是在亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)之后执行的。这是为了确保以下纯化步骤确保从蛋白质组合物去除抑制剂(诸如奥利司他)。例如，由于基质的潜在渗出(即，从抑制剂被固定在其上的固体载体渗出)，在执行所述步骤(i)之后抑制剂可能存在于组合物中。
然而，如本文其他地方还论述的，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”可以在柱2或柱3之后执行(在第五步为适当的情况下)。
因此，另选地，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤可以在步骤3至5中的任一个步骤之后(步骤3至5可以为按任何顺序的离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC))。换句话讲，该过程包括直接在按任何顺序使用离子交换色谱柱(例如，阴离子交换色谱(AEX)柱或阳离子交换色谱(CEX)柱)、混合模式色谱柱和疏水相互作用色谱(HIC)柱之后使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
在一个方面，该方法/过程不包括混合模式色谱法。
水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤通常不(直接)在从细胞培养物制备蛋白质组合物的初始步骤之后(例如不在HCCF之后)。换句话讲，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤通常不在亲和色谱法(例如，蛋白A亲和色谱法)/步骤1之前执行。这是因为这种初始蛋白质组合物(例如，来自细胞培养物的蛋白质组合物/细胞培养物的上清液，优选地HCCF)通常仍包含高程度的杂质(例如细胞、细胞碎片和/或聚集体)。因此，该过程通常不包括(直接)在从细胞培养物制备蛋白质组合物的初始步骤之后使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱和/或通常不包括在使用亲和色谱柱(例如，蛋白A亲和色谱柱)之前使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
独立于要在本文所述的方法中使用的步骤的顺序，应清楚的是纯化的原料药(drug substance)(回收的包含蛋白质的组合物)不应含有抑制剂(例如，奥利司他)或者含有仅极少量(优选地不可检测的量)或不妨碍将组合物(或本文所述的蛋白质制剂，例如，包含组合物的制剂)施用给受试者/患者的量(例如，呈权威机构(诸如FDA或EMA)批准的制剂的形式)。换句话讲，该方法将以确保在回收的蛋白质组合物和/或本文所述的蛋白质制剂中不存在抑制剂(或仅如上所述的极少量)的方式来使用。
本文所述的方法(用于制备包含蛋白质的组合物)可包括按以下顺序的步骤
(1)从细胞培养物(产生蛋白质/感兴趣的蛋白质的细胞)制备组合物或从细胞培养物获得细胞培养物上清液，优选地之后是随后纯化制备的组合物或上清液(例如，从细胞、细胞碎片和/或聚集体分离/去除(例如，通过过滤))(优选地制备和/或纯化的组合物为收获细胞培养液(HCCF))；
(2)亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)(待应用于通过执行步骤(1)获得的(纯化的)组合物)，
之后是“(i)使包含蛋白质的起始组合物(例如，此处为通过执行亲和色谱法获得的(纯化的)组合物)与水解酶抑制剂(诸如奥利司他)接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”(例如，该步骤为水解酶抑制剂色谱法(水解酶抑制剂色谱法步骤)；
(3)离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))(待应用于通过执行步骤(2)获得的(纯化的)组合物；
(4)混合模式色谱法(待应用于通过执行步骤(3)获得的(纯化的)组合物；
任选地(5)疏水相互作用色谱法(HIC)(待应用于通过执行步骤(4)获得的(纯化的)组合物；
(6)病毒过滤(待应用于通过执行步骤(4)(或(5)，如果适用)获得的(纯化的)组合物；
(7)过滤(例如，UFDF)(待应用于通过执行步骤(6)获得的(纯化的)组合物)；之后是(ii)回收包含蛋白质的组合物。
如所论述的，可以按任何顺序使用离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC)。
因此，另选地，上述方法可以例如包括按以下顺序的步骤：
(3)混合模式色谱法(待应用于通过执行步骤(2)获得的(纯化的)组合物；
(4)离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))(待应用于通过执行步骤(3)获得的(纯化的)组合物；
任选地(5)疏水相互作用色谱法(HIC)(待应用于通过执行步骤(4)获得的(纯化的)组合物。
在进一步的另选方案中，上述方法可以例如包括按以下顺序的步骤：
(3)疏水相互作用色谱法(HIC)(待应用于通过执行步骤(2)获得的(纯化的)组合物；
(4)离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))(待应用于通过执行步骤(3)获得的(纯化的)组合物；
任选地(5)混合模式色谱法(待应用于通过执行步骤(4)获得的(纯化的)组合物。
在进一步的另选方案中，上述方法可以例如包括按以下顺序的步骤：
(3)离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))(待应用于通过执行步骤(2)获得的(纯化的)组合物；
(4)疏水相互作用色谱法(HIC)(待应用于通过执行步骤(3)获得的(纯化的)组合物；
任选地(5)混合模式色谱法(待应用于通过执行步骤(4)获得的(纯化的)组合物。
如本文其他地方所论述的，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”优选地是在亲和色谱法(参见上文步骤(2))之后执行的。
如上文还论述的，在本文所述的方法中(例如，在上文步骤(3)、(4)和/或(5)中)，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”可以在针对随后的亲和色谱法(参见上文步骤(2))的另选方案中(或甚至除随后的亲和色谱法之外)在离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))后/之后被执行，或者在进一步的另选方案中在混合模式色谱法后/之后被执行，或者在进一步的另选方案中在疏水相互作用色谱法(HIC)后/之后被执行。
根据如本文所用和所定义的术语“起始组合物”，将与水解酶抑制剂接触的上述(纯化的)组合物中的任何组合物(其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上(步骤(i)))为或可以为“起始组合物”。例如，通过执行亲和色谱法)获得的(纯化的)组合物(参见上文步骤(2))为“包含蛋白质的起始组合物”。
相同的解释经过必要的修正通常适用于本文所述的要与水解酶抑制剂接触的(纯化的)组合物，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上(步骤(i))。例如，通过执行离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法(AEX)和/或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和/或疏水相互作用色谱法(HIC)获得的(纯化的)组合物为“包含蛋白质的起始组合物”。
通常，应当理解，术语“使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触”意味着“起始组合物包含蛋白质”并且该组合物将与水解酶抑制剂接触(其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上)。因此，起始组合物包含蛋白质而不包含水解酶抑制剂。
下文涉及可用于制备/生产感兴趣的蛋白质的培养细胞/细胞培养物。编码感兴趣的蛋白质的核酸可以作为外源基因被引入到这种宿主细胞中，其优选地具有调节元件、已经作为活性内源基因存在于宿主细胞中或变得活化为内源非活性基因。对应的培养细胞可以为宿主细胞或非人宿主(细胞)，其转化有或包含编码感兴趣的蛋白质的载体或核酸分子。应当理解，根据本发明所述，术语“转化有本发明的载体的宿主细胞或非人宿主”通常涉及包含编码蛋白质的载体或核酸分子的宿主细胞或非人宿主。用于表达多肽的宿主细胞在本领域中是众所周知的并且包括原核细胞以及真核细胞。因此，宿主可以选自由以下项组成的组：细菌、哺乳动物细胞、藻类细胞、纤毛虫、酵母和植物细胞。典型的细菌包括埃希氏杆菌属、棒杆菌属(谷氨酸棒杆菌(glutamicum))、假单胞菌属(荧光假单胞菌)、乳杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌(诸如巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌)或棒杆菌属(如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))。本文中最优选的细菌宿主为大肠杆菌(E.coli)。本文中要使用的示例性纤毛虫为四膜虫属，例如，嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)。
典型的哺乳动物细胞包括Hela、HEK293、HEK293T、H9、Per.C6和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3、NS0和C127细胞、COS 1、COS 7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞、小鼠肉瘤细胞、Bowes黑色素瘤细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。根据本发明所述的最优选的哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。此外，人胚肾(HEK)细胞是优选的。
其他合适的真核宿主细胞为例如酵母(诸如毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母)或鸡细胞(诸如，例如DT40细胞)。适用于表达的昆虫细胞为例如果蝇S2、果蝇Kc、灰翅夜蛾Sf9和Sf21或粉纹夜蛾Hi5细胞。优选的藻类细胞为莱茵衣藻或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)细胞等。示例性植物为小立碗藓属(Physcomitrella)，例如小立碗藓(Physcomitrella patens)。
也在本发明的范围内的是原代哺乳动物细胞或细胞系。原代细胞为直接从生物体获得的细胞。合适的原代细胞为例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠原代肝细胞、心肌细胞和神经元细胞以及小鼠肌肉干细胞(卫星细胞)、人皮肤和肺成纤维细胞、人上皮细胞(鼻、气管、肾、胎盘、肠道、支气管上皮细胞)、人分泌细胞(来自唾液腺、皮脂腺和汗腺)、人内分泌细胞(甲状腺细胞)、人脂肪细胞、人平滑肌细胞、人骨骼肌细胞、人白细胞(诸如B-细胞、T-细胞、NK-细胞或树突状细胞)以及它们的衍生的稳定永生化细胞系(例如，hTERT或致癌基因永生化细胞)。上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
宿主细胞可以例如用于产生大量感兴趣的蛋白质，诸如结合分子。
在本发明的上下文中有用的示例性结合蛋白/结合分子包括但不限于抗体、抗体片段(诸如Fab片段、Fab’片段、F(ab')2片段、单链可变片段(scFv))、(单一)结构域抗体(特别是源自骆驼科、美洲驼或鲨鱼的那些)、抗体的分离的可变区(VL区和/或VH区)(特别是来自人类或灵长类动物的那些)、CDR、免疫球蛋白结构域、CDR衍生的拟肽类、凝集素、纤连蛋白结构域、腱生蛋白结构域、蛋白A结构域、SH3结构域、锚定蛋白重复结构域和脂质运载蛋白或如所描述的各种类型的支架衍生结合蛋白。
下文涉及宿主细胞蛋白(HCP)，其可以存在于起始组合物中，并且如果存在则将被从包含感兴趣的蛋白质的组合物被去除(或在包含感兴趣的蛋白质的组合物中被减少含量)。
HCP是由在生产过程中所使用的细胞或生物体产生或编码并且与预期产物无关的蛋白质。有些是生长、存活和正常细胞处理所必需的，而另一些可能不是必需的。与预期产物一样，HCP也可以由宿主利用一定数量的翻译后修饰而被修饰。无论其是否有用或缺失，HCP在最终的原料药中通常是不需要的。虽然通常以少量存在(表达为每毫克预期蛋白质的纳克数的百万分率)，但业界花费了大量的精力和成本来去除它们。在批准用于疗法用途的生物制品之前，应对产品中的残留HCP的水平进行定量测量。因此，通常必须消除或减少HCP，并且必须证明消除或减少。目前用于测定重组生物制品中污染物HCP的存在的分析方法包括SDS-PAGE、免疫印迹技术和ELISA。有许多关于去除HCP污染以及例如使用例如疏水相互作用色谱法(Shukla等人,Biotechnol.Prog.2002,18,556-564)、蛋白A色谱法(Shukla等人,Biotechnol.Prog.2008,24,11151121)或耐盐阴离子交换配体(Riordan等人,Biotechnol.Prog.2009,第25卷,第6号)进行去除的出版物。
然而，如本文中所示，HCP含量无法通过常规纯化方法被充分去除。即使是少量残留量也会导致长期储存稳定性下降。设想的是，由于表面活性剂降解物的不溶性物质，组合物中HCP的存在会导致可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的出现。所述颗粒可能违反对于肠胃外制剂的要求(EP 2.9.19、EP 2.9.20、USP<787>、USP<788>和USP<789>)。此外，这些颗粒可包含不溶性蛋白质聚集体，其比可溶性蛋白质更具免疫原性。因此，本文提供的包含感兴趣的蛋白质的组合物/制剂为包含低含量HCP的组合物/制剂和/或优选地不表现出可见颗粒形成，特别是在例如在2℃至8℃储存至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月期间。
可见颗粒形成意味着本领域技术人员可以用裸眼观察到颗粒，任选地使用用于放大的装置，诸如放大镜。在监管领域中，可见微粒物质和不可见微粒物质之间是有区别的。可见微粒被宽泛地定义为可以用肉眼检测到的任何微粒。通常，可见物体被定义为0.05mm或更大的物体。如本发明中所用的术语“可见颗粒”意味着：为0.05mm或更大、优选地0.1mm或更大、更优选地0.2mm或更大、更优选地0.5mm或更大、最优选地1mm或更大的颗粒。还可能利用被设计为检测此类可见颗粒的装备来检测可见颗粒形成。与根据本发明所述的组合物(通过根据本发明所述的方法获得)一样，自动检查透明溶液中的微粒的最常见方法是搅动溶液并随时间对溶液成像。成像系统通常包括机器视觉相机、照明(在这种情况下为背景照明)和用于分析图像的视觉处理器。在已获取图像后，然后针对图像之间的差异按顺序对图像进行分析。差异可以被解释为在溶液内移动的物体，诸如气泡和微粒。在较大、较致密的微粒的情况下，检测是通过根据分析滤除气泡来实现的，因为气泡会在微粒下沉时上升。
如果目标是要找到直径小于约1mm的微粒，则必须使用更谨慎的搅动方法以从视野中去除气泡。这可以通过在谨慎关注加速率和减速率的情况下经由旋转搅动溶液来完成。然而，为了本发明的目的，检测方法对于定义“可见颗粒”并不重要，只要颗粒具有如上所定义的直径即可。
根据本发明所述的方法优选地得到包含相对于感兴趣的蛋白质含量的小于100ppm、更优选地小于10ppm、更优选地小于1ppm、更优选地小于0.1ppm、最优选地小于0.01ppm HCP的组合物/制剂。例如，组合物/制剂包含小于100ppm、更优选地小于50ppm、更优选地小于20ppm、更优选地小于10ppm、更优选地小于5ppm、更优选地小于2ppm、最优选地小于1ppm或更低的宿主细胞蛋白质。
本文所述的方法不限于特定的蛋白质/感兴趣的蛋白质。起始组合物中的蛋白质/感兴趣的蛋白质可以为源自任何来源的任何蛋白质。
具体而言，预期任何疗法、诊断和/或药用蛋白质/感兴趣的蛋白质以及科学研究中的任何感兴趣的蛋白质。以下是感兴趣的蛋白质的非限制性实例：
白细胞介素受体拮抗剂、白细胞介素-1受体拮抗剂(如EBI-005或阿那白滞素)、瘦素、乙酰胆碱酯酶、活化蛋白C(drotrecogin)、活化素受体IIB拮抗剂、腺苷脱氨酶、阿加糖酶(agalsidase)α、toll-样受体5的激动剂(如entolimod)、α-1抗胰蛋白酶、α-1蛋白酶抑制剂、α-半乳糖苷酶、α-人心房利钠肽、α-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶、阿替普酶、安地普酶、胰淀素、胰淀素类似物、ANF-ρ、血管紧张素(1-7)、血管紧张素II、血管紧张素转化酶2、抗上皮细胞粘附分子单链抗体片段、抗凝血酶α、抗凝血酶III、细胞凋亡诱导酶mi-APO、精氨酸脱亚胺酶、天冬酰胺酶(如calaspargase)、培门冬酶、crisantaspase、B结构域缺失因子VIII(如贝罗凝血素α或octofactor)、贝妥莫单抗(Lymphoscan)、胆汁盐刺激脂肪酶(如布塞酯酶α)、针对呼吸道合胞病毒的结合蛋白(如pavlizumab)、骨形态发生蛋白(如BMP-2(地波特明α)或BMP-6)、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)、牛碳氧血红蛋白、牛生长激素、C1-酯酶抑制剂、C3胞外酶蛋白、碳氧血红蛋白、CD19拮抗剂、CD20拮抗剂(如美罗华(rituxan))、CD3受体拮抗剂、CD40拮抗剂、CD40L拮抗剂(如达匹利珠单抗(dapirolizumab)或Antova)、脑苷脂硫酸酯酶、cethrin(如VGX-210)、软骨素裂解酶、凝血因子IX(如诺那凝血素(nonacog)γ、conacogβ、阿布诺凝血素(albutrepenonacog)α)、凝血因子VIIa(如依他凝血素(eptacog)α、marzeptacogα、伐曲凝血素(vatreptacog)α、奥凝血素(oreptacog)α)、凝血因子VIII(如舒索凝血素(susoctocog)α、damoctocogα、妥罗凝血素α、rurioctocogα、艾莫凝血素(efmoroctocog)α、efraloctocogα、塞莫凝血素α)、凝血因子X、凝血因子XIII(如卡德凝血素)、溶组织棱状芽胞杆菌的胶原酶、补体因子C3抑制剂、补体受体5a拮抗剂、促肾上腺皮质素释放因子、CSF1受体拮抗剂(如FPA008)、CSF1R拮抗剂、CTLA-4拮抗剂(如伊匹单抗)、蓝藻抗病毒蛋白-N、脱氧核糖核酸酶I(如链道酶(dornase)α)、EGFR受体拮抗剂、弹性蛋白酶(如人I型胰弹性蛋白酶，如vonapanitase)、内皮抑制素、enkastim、表皮生长因子、促红细胞生成素α、促红细胞生成素ζ、FcγIIB受体拮抗剂、纤维蛋白原酶、纤维蛋白溶酶(如纤维蛋白酶)、成纤维细胞生长因子1(人酸性成纤维细胞生长因子)、成纤维细胞生长因子18、成纤维细胞生长因子2(人碱性成纤维细胞生长因子)、成纤维细胞生长因子21、成纤维细胞生长因子受体2拮抗剂(如FPA144)、Fms-样酪氨酸激酶3配体、促卵泡激素(如促卵泡素α或促卵泡素β)、人杀菌/通透性增加蛋白21的片段(奥培巴康/rBPI 21)、白树毒素、胰高血糖素受体激动剂、糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂(如阿昔单抗)、糖胺聚糖降解酶(如坎多立酶(condoliase))、gp120/gp160、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、来自与转录因子E7融合的分枝杆菌BCG的热休克蛋白hsp 65(卡维帕塞(verpasep caltespen))、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体(HGFR)拮抗剂、肝杀菌肽拮抗剂、Her2/neu受体拮抗剂(如赫塞汀)、异二聚体15:IL-15Ra(hetIL-15)、水蛭素、hsp70拮抗剂、人酸性鞘磷脂酶、人绒毛膜促性腺激素(如绒促性素(choriogonadotropin)α)、人酶酸性α-葡萄糖苷酶(如reveglucosidaseα或阿糖苷酶(alglucosidase)α)、人生长激素、人角质细胞生长因子(KGF)、人基质金属蛋白酶、人髓磷脂碱性蛋白片段、人成骨蛋白1、人成骨蛋白-1、人甲状旁腺激素、人血栓调节蛋白α、透明质酸酶(如rHuPH20)、透明质酸酶(如人透明质酸酶PH-20(福玻璃酸酶(vorhyaluronidase)α)、透明糖酶或bovhyaluronidase)、水解溶酶体葡萄糖脑苷脂特异性酶(如葡萄糖脑苷脂酶、维拉西梅α或他利西酶α)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、IgE拮抗剂(如奥马珠单抗)、iIroquois同源框蛋白2(IRX-2)、胰岛素、胰岛素类似物、整合素α4β1拮抗剂、干扰素τ、干扰素-α、干扰素-α拮抗剂、干扰素-α超级激动剂、干扰素-α-n3(Alferon N Injection)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、白细胞介素2融合蛋白(如DAB(389)IL-2)、白细胞介素-11(如oprelevkin)、白细胞介素-12、白细胞介素-17受体拮抗剂、白细胞介素-18结合蛋白、白细胞介素-2、白细胞介素-22、白细胞介素-4(如匹曲白滞素)、白细胞介素-4突变蛋白、白细胞介素-6受体拮抗剂、白细胞介素-7、白细胞介素-22受体亚基α(IL-22ra)拮抗剂、鸢尾素、胰岛新生相关蛋白、血管舒缓素、乳铁蛋白、乳铁蛋白片段、拉诺替普酶、脂肪酶(如burlulipase、根霉脂肪酶、依帕非酶或sebelipaseα)、黄体化激素、促黄体素α、淋巴细胞扩增分子、溶葡萄球菌素、哺乳动物胃脂肪酶(merispace)、甘露糖苷酶(如维马酶α)、黑皮质素-4受体激动剂、MEPE-衍生的23-氨基酸肽、甲硫氨酰基人干细胞因子(安塞司亭)、微纤溶酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶(如elosulfaseα)、N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶、那沙普酶β、神经生长因子、神经调节蛋白-1、神经毒素(例如，梭菌神经毒素，如肉毒杆菌神经毒素(诸如肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F或G，特别是肉毒杆菌神经毒素血清型A)、中性粒细胞白明胶酶相关脂质运载蛋白、奥克纤溶酶、Omithodoros moubata补体抑制剂(OmCI/Coversin)、骨保护素、P128(StaphTAME)、帕米普酶、甲状旁腺素(PTH)、PD-1拮抗剂、PDGF拮抗剂、正五聚蛋白-2蛋白、噬菌体细胞溶素(如HY133)、苯丙氨酸解氨酶(如valiase)、磷酸酶(如组织非特异性碱性磷酸酶或阿司福酶α)、血纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白溶酶原变体(如V10153)、血小板源性生长因子-BB、猪生长激素、抑制素靶向肽1、胰岛素原、蛋白A、蛋白C(如drotrecognin)、蛋白结合成纤维细胞生长因子受体配体(如FP-1039)、重组组织因子途径抑制剂(替法可近)、松弛素、松弛素类似物(如塞松弛素)、瑞替普酶、rhPDGF-BB、核糖核酸酶(如豹蛙酶(onconase)或amphinase)、senrebotase、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如考奈司他α)、司非立酶、唾液酸酶、可溶性补体受体1型、可溶性DCC(在结肠直肠癌中缺失)受体、可溶性TACI受体(阿塞西普)、可溶性肿瘤坏死因子I受体(sTNF-RI)、可溶性肿瘤坏死因子II受体(sTNF-RII)、可溶性VEGF受体Flt-1、可溶性人FcγIIB受体、葡萄球菌激酶、链球菌激酶、硫酸胺酶(sulfamidase)、T-细胞受体配体、替奈普酶、血小板生成刺激蛋白(AMG-531)、促血小板生成素、血小板反应蛋白-1、甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素(TRH)类似物(如他替瑞林)、组织纤溶酶原激活剂、组织型纤溶酶原激活剂(如帕米普酶)、三肽氨基肽酶I、肿瘤坏死因子(TNFα)、肿瘤坏死因子α拮抗剂、尿酸酶(如拉布立酶或pegadricase)、尿扩张素、尿促卵泡素、尿激酶、子宫珠蛋白、VEGF拮抗剂(如ranbizumab或贝伐珠单抗)、VEGF/PDGF拮抗剂、VEGF/PDGF拮抗剂(如多-VEGF/PDGF DARPin或融合蛋白)、槲寄生凝集素、血管性血友病因子(如vonicogα)。白细胞介素受体拮抗剂(尤其是白细胞介素-1受体拮抗剂，如EBI-005或阿那白滞素)以及瘦素(尤其是人瘦素，或突变体人瘦素(huLeptin(W100Q)，一种在成熟多肽链中的第100位处具有色氨酸至谷氨酰胺的取代的人瘦素突变体))，
优选地，蛋白质/感兴趣的蛋白质为抗体。因此，本发明在一个方面涉及一种方法，其包括以下步骤：
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
其中蛋白质为抗体。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，包括各种抗体结构并且可以为可以与靶蛋白特异性或选择性结合的任何分子。抗体可以包括或者是抗体或其结构域/片段，其中结构域/片段显示与全长抗体基本相同的结合活性。非限制性实例是单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如，优选双特异性抗体)。优选地，抗体为单克隆抗体或双特异性抗体。本发明中的抗体还可以为嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体或(完全)人源抗体。优选地，抗体为人源化或人源抗体。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2。
抗体还可包括多价分子、多特异性分子(例如，双抗体)、融合分子、适配体(aptimers)、avimers或者其他天然存在的或重组形成的分子。在本发明中有用的例示性抗体包括抗体样分子。抗体样分子为可以通过与靶分子结合而表现出功能的分子(参见例如Gill(2006)Curr Opin Biotechnol 17:653-658；Nygren(1997)Curr Opin Struct Biol7:463-469；Hosse(2006)Protein Sci 15:14-27)并且包括例如DARPins(WO 2002/020565)、Affibodies(WO 1995/001937)、Avimers(WO 2004/044011；WO 2005/040229)、Adnectins(WO 2002/032925)和fynomers(WO 2013/135588)。
本发明中的抗体的非限制性实例为抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗HER2抗体、抗IL6抗体、抗IgE抗体、抗IL13抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-L1抗体、抗VEGF-A抗体、抗VEGF-A/ANG2抗体、抗CD79b抗体、抗ST2抗体、抗因子D抗体、抗因子IX抗体、抗因子X抗体、抗abeta抗体、抗tau抗体、抗CEA抗体、抗CEA/CD3抗体、抗CD20/CD3抗体、抗FcRH5/CD3抗体、抗Her2/CD3抗体、抗FGFR1/KLB抗体、FAP-4-1BBL融合蛋白、FAP-IL2v融合蛋白、奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法瑞昔单抗、泊洛妥珠单抗、更汀芦单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、格菲妥单抗、欣洛奇芙普和RG7827。
本文中优选的是抗CD20/抗CD3抗体(特别是抗CD20/抗CD3双特异性抗体，尤其是glofitamab)、抗Her2抗体(特别是曲妥珠单抗)和/或抗IL6受体抗体(特别是托珠单抗)。
当本文所述的本发明的方法用于纯化曲妥珠单抗时，设想的是，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”是在使曲妥珠单抗溶液经受蛋白A色谱法之后被执行的。
Glofitamab是一种抗CD20/抗CD3双特异性抗体并且也称为RG6026。Glofitamab的氨基酸序列公开于PCT/EP2015/067776(WO/2016/020309)中。当本文所述的本发明的方法用于纯化Glofitamab时，设想的是，步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”是在使Glofitamab溶液经受混合模式阴离子交换色谱法(MMAEX)(即，经调整蛋白A洗脱液)之前被执行的。在Glofitamab纯化的上下文中，术语MMAEX负载溶液是指在其经受MMAEX色谱法之前的抗体溶液
在一个优选的方面，感兴趣的蛋白质为托珠单抗，抑制剂为奥利司他B，包含由用于与固体载体偶联的接头分开的叠氮基基团和生物素基团的药剂(接头)为偶氮基生物素-叠氮化物，并且固体载体为链霉亲和素Mag Sepharose(珠)(参见实例1和2)。
在一个优选的方面，感兴趣的蛋白质为Glofitimab，抑制剂为奥利司他B，包含用于与固体载体偶联的叠氮基基团和生物素基团的药剂(接头)为生物素-PEG4-叠氮化物，并且固体载体为Streptavidin
Figure BDA0004113420420000701
High Performance珠(参见实例3)。
在一个优选的方面，感兴趣的蛋白质为Glofitimab，抑制剂为奥利司他B，包含用于与固体载体偶联的叠氮基基团和氨基基团的药剂(接头)为叠氮基-PEG4-胺，并且固体载体为NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000702
4Fast Flow珠(参见实例3)。
在一个优选的方面，感兴趣的蛋白质为曲妥珠单抗，抑制剂为奥利司他A或奥利司他B，包含用于与固体载体偶联的叠氮基基团和生物素基团的药剂(接头)为生物素-PEG4-叠氮化物，并且固体载体为Streptavidin
Figure BDA0004113420420000703
High Performance珠(参见实例4)。
在一个优选的方面，感兴趣的蛋白质为曲妥珠单抗，抑制剂为奥利司他A或奥利司他B，包含用于与固体载体偶联的叠氮基基团和氨基基团的药剂(接头)为叠氮基-PEG4-胺，并且固体载体为NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000704
4Fast Flow珠(参见实例4)。
上述药剂/接头被称为生物素-PEG4-叠氮化物(CAS 1309649-57-7)、偶氮基-生物素-叠氮化物(CAS 1339202-33-3)(也被称为偶氮基-生物素-PEG3-叠氮化物)和叠氮基-PEG4-胺(CAS 951671-92-4)。
托珠单抗是一种抗IL6受体抗体。托珠单抗的CAS登记号为375823-41-9。INN托珠单抗公开于WHO Drug Information,第18卷,第3号,2004中。
如本文所用的术语“蛋白质”(感兴趣的蛋白质)以及特别是“抗体”包括和/或涉及其生物仿制药(biosimilar)。因此，如本文所用的术语“蛋白质”(感兴趣的蛋白质)以及特别是“抗体”可以理解为相应地是指“蛋白质和/或其生物仿制药”(或同样地“感兴趣的蛋白质和/或其生物仿制药”)、“抗体和/或其生物仿制药”，等等。
生物仿制药是一种生物医药产品(也称为生物制品)，其与另一种已获批准的生物医药(“参考医药”)高度相似。如本文所用的“参考医药”还指如本文所定义的“参考蛋白质/参考感兴趣的蛋白质”，特别是在该“参考蛋白质/参考感兴趣的蛋白质”获得(权威机构(诸如EMA、FDA等))批准的情况下。
生物仿制药根据适用于所有生物医药的相同药物质量、安全性和有效性标准获得批准。如本文所用的术语“生物仿制药”一般是指与如本文所定义的参考蛋白质/感兴趣的蛋白质具有相同(即，等同)(或基本相同)的氨基酸序列的蛋白质/感兴趣的蛋白质。应当理解，“生物仿制药”可以具有与参考蛋白质/感兴趣的蛋白质不同的糖基化或其他特性。
本文描述了示例性参考蛋白质/感兴趣的蛋白质，例如，奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法瑞昔单抗、泊洛妥珠单抗、更汀芦单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、格菲妥单抗、欣洛奇芙普和RG7827。本文中优选的是曲妥珠单抗、托珠单抗和glofitamab。
参考蛋白质/感兴趣的蛋白质的氨基酸序列可以经由INN和相关出版物来轻松鉴定。
根据上文，如果本文中提到特定参考蛋白质(参考感兴趣的蛋白质)，则特定参考蛋白质(参考感兴趣的蛋白质)包括并涉及其生物仿制药(优选地，其中生物仿制药为具有与参考感兴趣的蛋白质相同的氨基酸序列的蛋白质)。
例如，术语“抗CD20/抗CD3抗体”可以指“抗CD20/抗CD3抗体和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗CD20/抗CD3抗体相同的氨基酸序列的抗CD20/抗CD3抗体)。
例如，术语“抗CD20/抗CD3双特异性抗体”可以指“抗CD20/抗CD3双特异性抗体和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗CD20/抗CD3双特异性抗体相同的氨基酸序列的抗CD20/抗CD3双特异性抗体)。
例如，术语“glofitamab”可以指“glofitamab和/或其生物仿制药”，(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗体glofitamab相同的氨基酸序列的抗体)。
例如，术语“抗Her2抗体”可以指“抗Her2抗体和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗Her2抗体相同的氨基酸序列的抗Her2抗体)。
例如，术语“曲妥珠单抗”可以指“曲妥珠单抗和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗体曲妥珠单抗相同的氨基酸序列的抗体)。
例如，术语“抗IL6受体抗体”可以指“抗IL6受体抗体和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗IL6受体抗体相同的氨基酸序列的抗IL6受体抗体)。
例如，术语“托珠单抗”可以指“托珠单抗和/或其生物仿制药”(优选地，其中生物仿制药为具有与参考抗体托珠单抗相同的氨基酸序列的抗体)。
上文解释经过必要的修正适用于本文中公开的所有蛋白质/感兴趣的蛋白质，尤其是抗体。
本发明进一步涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法。所述用于制备蛋白质制剂的方法可包括如本文上文所述的方法，并且进一步包括向包含蛋白质的组合物添加表面活性剂，优选脂肪酸酯。换句话讲，用于制备蛋白质制剂的方法可包括为如通过本文上文所述的方法制备的包含蛋白质的组合物补充表面活性剂，优选脂肪酸酯。
如本文上文所示，所提供的方法可用于制备具有含量减少的杂质(诸如宿主细胞蛋白质，特别是水解酶)和/或具有降低的水解活性的蛋白质组合物。因此，根据本发明制备的蛋白质组合物可以有利地用于制备蛋白质制剂，后者显示出改善的(物理)稳定性，即使例如此类宿主细胞蛋白质的底物(如表面活性剂)存在于蛋白质制剂中。因此在长期储存期间出现优选地减少的颗粒形成，优选地无可见颗粒形成
因此，本发明在一个方面涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其包括如本文上文所述的方法的步骤，其中用于制备蛋白质制剂的方法进一步包括向包含蛋白质的组合物加入表面活性剂，优选脂肪酸酯。
在一个实施方案中，用于制备蛋白质制剂的方法可包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中该水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含该蛋白质的组合物，
以及进一步向包含蛋白质的组合物加入表面活性剂，优选脂肪酸酯。
本发明在一个方面进一步涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其中用于制备蛋白质制剂的方法进一步包括向通过如本文上文所述的方法获得或能够获得的包含蛋白质的组合物加入表面活性剂，优选脂肪酸酯。
表面活性剂可用作共溶剂和稳定剂。它们通过与亲水表面和亲脂表面缔合以保持成分(如蛋白质)的分散性和结构稳定性来发挥作用。将表面活性剂加入到蛋白质制剂中主要是为了增强蛋白质相对于机械应力(诸如气/液界面和固/液界面剪切力)的稳定性。如本文所用的术语“表面活性剂”特别是指如本文中所解释和所定义的“脂肪酸酯”。
当表面活性剂降解时，表面活性剂分解产物可能形成可见或在显微镜下才可见的颗粒。还设想的是，随着蛋白质制剂中表面活性剂浓度降低，蛋白质在某些情况下可能在溶液中变得结构不稳定，并且形成最终变成可见或在显微镜下才可见的颗粒的多聚体聚集体。
术语“脂肪酸酯”在本文中以最广义使用并且是指含有经由酯键与头部基团连接的脂肪酸链的任何有机化合物。当羟基基团(例如，醇或甲酸)被烷氧基基团替换时形成酯键。通常，酯衍生自甲酸和醇。醇基团一般被称为头部基团。醇可以为甘油、山梨糖醇、失水山梨醇、异山梨醇等。在聚山梨醇酯的情况下，酯化发生在甲酸与附着到例如山梨糖醇的聚氧乙烯重复单元的末端羟基基团之间。
术语“脂肪酸”或“脂肪酸链”意味着具有脂肪族尾部的甲酸。脂肪族尾部只是包含碳和氢并且在某些情况下包含氧、硫、氮和/或氯取代物的烃链。
脂肪族尾部可以是饱和的(如在饱和脂肪酸中)，这意味着所有碳-碳键都是单键(即，烷类)。脂肪族尾部可以是不饱和的(如在不饱和脂肪酸中)，其中一个或多个碳-碳键为双键(烯类)或三键(炔类)。
脂肪酸通常被命名为：短链脂肪酸，其在其脂肪族尾部中具有少于六个碳；具有六个至十二个碳的中链脂肪酸；具有十三个至二十一个碳的长链脂肪酸；以及具有二十二个碳或更长的脂肪族尾部的超长链脂肪酸。如上所述，脂肪酸也根据其饱和度进行分类，饱和度与刚度和熔点相关。常见的脂肪酸包括辛酸(8个碳原子:0个双键；8:0)、癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、肉豆蔻脑酸(14:1)、棕榈酸(16:0)、棕榈烯酸(16:1)、sapienic acid(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、反油酸(18:1)、异油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、反亚油酸(linelaedic acid)(18:2)、α-亚麻酸(18:3)、花生酸(20:0)、花生四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)、山萮酸(22:0)、芥酸(22:1)、二十二碳六烯酸(22:6)、木蜡酸(24:0)和蜡酸(26:0)。
优选地，脂肪酸酯为聚氧乙烯失水山梨醇或异山梨醇脂肪酸单酯、二酯或三酯。在优选的实施方案中，本发明中的脂肪酸酯为聚氧乙烯(4)失水山梨醇单酯、聚氧乙烯(5)失水山梨醇单酯或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯。
聚氧乙烯(4)失水山梨醇单酯、聚氧乙烯(5)失水山梨醇单酯或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯优选地选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯120以及它们的组合。聚山梨醇酯20主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯。聚山梨醇酯40主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯。聚山梨醇酯60主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯。聚山梨醇酯61主要包括聚氧乙烯(4)失水山梨醇单硬脂酸酯。聚山梨醇酯80主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯。聚山梨醇酯81主要包括聚氧乙烯(5)失水山梨醇单油酸酯。聚山梨醇酯120主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单异硬脂酸酯。
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸酯为聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯。优选地，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯120以及它们的组合。更优选地，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80以及它们的组合。最优选地，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80以及它们的组合。
在另一个优选的实施方案中，本发明中的脂肪酸酯为聚氧乙烯(20)失水山梨醇三酯。优选地，聚氧乙烯(20)失水山梨醇三酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯85以及它们的组合。聚山梨醇酯65主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇三硬脂酸酯。聚山梨醇酯85主要包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇三油酸酯。
在另一个优选的实施方案中，本发明中的脂肪酸酯为单酰基甘油或二酰基甘油、saccaride-脂肪酸酯或α-生育酚PEG琥珀酸酯(TPGS)。应清楚的是，本文中所提到的所有表面活性剂都可以进行组合。
如上所述，表面活性剂的降解可以为脂肪酸酯的水解。表面活性剂通过水解的损耗可能导致蛋白质聚集，这可能导致可见和/或在显微镜下才可见的颗粒形成的形成。表面活性剂本身的降解产物也可能导致可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的形成。如本文中所设想和上文所述，本发明的方法可以降低包含蛋白质的组合物中的水解活性。因此，还设想的是，从所述包含蛋白质的组合物制备的制剂可以具有降低的水解活性或基本上不含水解活性。技术人员将认识到，制备的制剂中降低的水解活性或没有水解活性将导致制备的制剂中可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的减少的量。也可能的是，制备的制剂将不含或基本上不含可见和/或在显微镜下才可见的颗粒。尤其重要的是，制备的制剂在储存时将不含或基本上不含可见和/或在显微镜下才可见的颗粒。上文已经提供了对应的定义。这些定义和解释经过必要的修正适用于此。
因此，本发明在一个方面涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其中蛋白质制剂(特别是在储存时)(基本上)不含可见和/或在显微镜下才可见的颗粒。
可见和在显微镜下才可见的颗粒通过分析方法来表征(参见方法列表的表A)，并且根据对应的法规(EP 2.9.19、EP 2.9.20、USP<787>、USP<788>和USP<789>)中的要求进行分类。对颗粒的定量和化学鉴定用于为颗粒风险评定提供信息。通过目测检查进行可见颗粒检测是概率性的并且取决于颗粒大小、形态、颜色、密度、反射率、周围制剂的性质、测量条件和人为表现。已发表的研究表明，150μm是球形聚苯乙烯颗粒标准(用于校准方法)的大小，其被人类检查者检测到的概率为>70％，如USP<1790>(Melchore(2011)AAPSPharmSciTech.12:215-221)中所论述的。
还根据针对≥10μm和≥25μm(以及对于眼用溶液≥50μm)的颗粒的药典和产品规范极限对在显微镜下才可见的颗粒进行评估。≥2μm和≥5μm的颗粒群通常也受到监测，尤其是在产品开发期间。基于当前可用的技术(例如，HIAC)检测在显微镜下才可见的颗粒的上限为100μm。
与美国药典(USP)(USP<788>)一致，“可见灰色区”是指目力检查下限处的尺寸范围，其中通过目力检查检测到颗粒的概率从150μm处的<70％下降至50μm附近的零，这是在显微镜下才可见的颗粒检测能力的上限。
颗粒的允许量可以为每10个容器少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个或少于1个颗粒。
技术人员熟知如何接收关于颗粒的附加信息(例如，欧洲药典(EP)2.9.19、EP2.9.20、USP<787>、USP<788>、USP<789>、Mathonet(2016)PDA J Pharm Sci Technol.70:392-408,Rech(2020)J.Pharm.Sci.109:1725-1735)
Figure BDA0004113420420000771
表A：用于对颗粒的检测/表征的方法
如上文已提到的，权威机构对药物制剂的可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的数量进行了限制。因此，由于可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的形成，药物制剂在一定的时间量后不能再使用。
本文中设想的是，具有可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的减少的形成的蛋白质制剂具有增加的稳定性或在更长的时间是稳定的。换句话将，具有可见和/或在显微镜下才可见的颗粒的减少的形成的蛋白质制剂具有增加的保质期。
因此，具有降低的水解活性的蛋白质制剂可以具有增加的稳定性、增加的保质期或者在更长的时间是稳定的。
因此，本发明在一个方面涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其包括如本文所述的方法的步骤，其中用于制备蛋白质制剂的方法进一步包括向包含蛋白质的组合物加入表面活性剂，优选脂肪酸酯，其中蛋白质制剂具有增加的稳定性、增加的保质期和/或(在更长的时间)是稳定，特别是储存稳定的。
必须生成药物产品(例如，如本文中所定义的蛋白质制剂)的长期稳定性数据以确认在整个保质期内具有足够的稳定性。对于生物技术药物产品通常考虑三个标准长期条件。长期条件也被称为建议的储存条件。其表示提议的标签储存条件。
标准长期条件可包括
i)在冷冻箱(-20℃)中储存(根据ICH Q1A)至少6个月的时间段(根据ICH Q5C)，
ii)在冷冻箱(5℃(根据ICH Q1A)，即，针对药物产品的建议的储存条件)中储存至少6个月的时间段(根据ICH Q5C)，
iii)在室温(25℃)储存(根据ICH Q1A)至少6个月的时间段(根据ICH Q5C)。
标准长期条件(也被称为“标准长期储存条件”或“建议的储存条件”)可包括储存至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月。
因此，可以在此类“标准长期条件”下测试和/或确认药物产品(例如，如本文中所定义的蛋白质制剂)的稳定性。
应当理解，在实践中，对于商业产品的批准需要至少18个月的保质期(即，稳定性)。因此，本文中要使用的标准长期条件(也被称为“标准长期储存条件”或“建议的储存条件”)优选地包括储存至少18个月。然而，出于实际目的，持续至少6个月的长期稳定性研究可能是足够的，因为可以将数据外推至更长的储存时间。
应当理解，术语“至少X个月”可以指特定的时间段，即“X个月”。例如，术语“(储存)至少6个月”可以指“(储存)6个月”，等等。
应当应用适当的分析方法来定期评估关键质量属性。
如本文上文所述，设想的是，本发明方法的步骤(i)降低包含蛋白质的组合物中的水解活性。
因此，本发明在一个方面涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其中该蛋白质制剂与未经受该方法的步骤(i)的蛋白质制剂相比具有增加的稳定性、增加的保质期或者在更长的时间是稳定的。
本发明进一步涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其中该蛋白质制剂可以在4℃储存至多18个月、至多24个月、至多36个月或至多60个月，特别地其中该制剂是(更加)稳定的，特别是(更加)储存稳定的。
例如，在稳定性测试期间，优选地在如本文所述的标准长期条件下，例如在2℃至8℃，优选地在约5℃历经至少2个月，更优选地历经至少3个月、历经至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月，该制剂未表现出显著的可见颗粒形成。
无显著的可见颗粒形成意味着在1mL的制剂中形成<20个可见颗粒。优选地，在针对制剂储存所指定的条件下进行稳定性测试期间，每1mL制剂形成15个或更少的颗粒、更优选地10个或更少、更优选地5个或更少、最优选地少于1个颗粒。
如上所述，如本文所用的术语“可见颗粒”表示直径为50μm或更大、优选地100μm或更大、更优选地500μm或更大、最优选地1mm或更大的颗粒。颗粒既可以通过裸眼观察(任选地使用放大装置)也可以通过自动化过程观察(诸如，例如胶片相机和用于分析胶片材料的合适装置)，如前文所述。
如上所述，设想的是，制备的蛋白质制剂中的水解活性降低。因此，在制备的蛋白质制剂中也可以减少脂肪酸酯的降解。
因此，本发明涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其中与初始制剂(在储存开始之前的制剂)相比，例如在优选地24个月内脂肪酸酯的降解小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。这可以在稳定性测试期间来确定(优选地在如本文所述的标准长期条件下)。
优选地，与初始制剂(在储存开始之前的制剂)相比，例如在24个月内脂肪酸酯的降解小于10％。这可以在稳定性测试期间来确定(优选地在如本文所述的标准长期条件下)。
如上所述，包含蛋白质的组合物中的蛋白质优选地为抗体。因此，本文中还设想的是，本发明中的蛋白质制剂中的蛋白质为抗体。制剂中的抗体的浓度可以低于1mg/ml或高于250mg/ml。通常抗体的浓度将介于1mg/ml至250mg/ml之间。
因此，本发明涉及一种用于制备蛋白质制剂的方法，其中蛋白质为抗体并且其中抗体浓度为至少1mg/ml并且至多250mg/ml，优选地至少5mg/ml并且至多200mg/ml。
例如，抗体浓度可以为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml。
尽管对于技术人员而言是清楚的，但应注意，除表面活性剂之外，还可以向包含蛋白质的组合物加入附加的物质。此类物质可以为缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂、载体以及它们的组合。
因此，本发明涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其进一步包括向包含蛋白质的组合物加入缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂和/或载体。
合适的缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂和载体的实例在本领域中是众所周知的。合适的缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂和载体可包括任何材料，只要蛋白质制剂中的蛋白质在与所述缓冲液、赋形剂、稀释剂、稳定剂和载体接触后保持其生物活性即可。
本文上文提供了缓冲液的非限制性实例。其他物质的非限制性实例为海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、氯化钠、氯化钾和氯化钙、对羟基苯甲酸甲酯、对-羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚、人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇、N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、生育酚、乙酸生育酚酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯(triamyl gallate)和没食子酸丙酯、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠和偏磷酸钠。
清楚的是，制备的蛋白质制剂可以为药物组合物(或者换句话讲药物制剂)。
因此，本发明涉及一种用于制备如本文所述的蛋白质制剂的方法，其中蛋白质制剂为药物组合物。
如本文所述的药物组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如，通过肠胃外、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、局部、支气管内、肺内和鼻内施用，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。如本文所述的药物组合物也可以被直接施用至目标部位，例如，通过基因枪递送至外部或内部目标部位，如特定受影响的器官。
本文中还设想的是，蛋白质制剂可以为诊断组合物，例如用于体内或体外/离体诊断方法。
本发明的优点在于，水解酶抑制剂被固定在固体载体上并且不会污染包含蛋白质的组合物和由其衍生的蛋白质制剂。
因此，本发明涉及一种包含蛋白质的组合物和/或涉及一种蛋白质制剂，其中包含蛋白质的组合物和/或蛋白质制剂基本上不含水解酶抑制剂(例如，包含蛋白质的组合物和/或蛋白质制剂中不存在水解酶抑制剂(或它们的存在是不可检测到的)或者水解酶抑制剂仅以微量存在)。
本发明进一步涉及一种通过本文所述的方法被获得或能够被获得的包含蛋白质的组合物。
因此，本发明还涉及一种通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂。
本文中还设想的是，本发明的蛋白质制剂被用作药物。换句话讲，设想的是，本发明的蛋白质制剂被用作药物或用于医药中。
因此，本发明进一步涉及一种通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂用作药物。因此，本发明进一步涉及一种通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂用于医药中。此外，本发明进一步涉及一种通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂用于疾病的治疗中。本发明还涉及一种通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂用于制备用于治疗疾病的药物或用于制备诊断组合物。
此外，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用通过如本文所述的用于制备蛋白质制剂的方法被获得或能够被获得的蛋白质制剂。
清楚的是，被固定在固体载体上的水解酶抑制剂可用于制备包含蛋白质的组合物和/或蛋白质制剂。
因此，在一个方面，本发明涉及一种被固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于制备包含蛋白质的组合物的用途。因此，在一个方面，本发明还涉及一种被固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于制备蛋白质制剂的用途。在一个方面，本发明还涉及固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于制备蛋白质组合物和/或蛋白质制剂的用途。在一个方面，本发明还涉及固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或降低蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的水解活性的用途。在一个方面，本发明还涉及固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或减少蛋白质组合物和/或蛋白质制剂中的杂质，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶(的含量)的用途。在一个方面，本发明还涉及固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于抑制或减少蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的可见的和/或在显微镜下才可见的颗粒(的形成)和/或表面活性剂降解物的出现/存在的用途。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或它们的语法变体应被视为指定所陈述的特征、整体、步骤或部件，但不排除添加一个或多个附加特征、整体、步骤、部件或它们的组。术语“包含”/“包括”/“具有”包括术语“由......组成”和“基本上由......组成”。因此，每当术语“包含”/“包括”/“具有”在本文中使用时，它们可以被“基本上由......组成”或优选地由“由......组成”替换。
术语“包含”/“包括”/“具有”意味着可以存在任何进一步的部件(或同样地特征、整体、步骤等)。
术语“由......组成”意味着不能存在进一步的部件(或同样地特征、整体、步骤等)。
术语“基本上由......组成”或其语法变体在本文中使用时应被视为指定所陈述的特征、整体、步骤或部件，但不排除添加一个或多个附加特征、整体、步骤、部件或它们的组，但前提条件是附加特征、整体、步骤、部件或它们的组不会实质地改变要求保护的产品、组合物、装置或方法等的基本和新颖的特性。
因此，术语“基本上由......组成”意味着可以存在特定的进一步的部件(或同样地特征、整体、步骤等)，即，那些部件不会实质地影响产品、组合物、装置或方法的基本特性。换句话讲，术语“基本上由......组成”(其在本文中可以与术语“基本上包含”可互换地使用)允许除强制性部件(或同样地特征、整体、步骤等)之外在产品、组合物、装置或方法中存在其他部件，前提是产品、组合物、装置或方法的基本特性不实质地受其他部件的存在的影响。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
如本文所用，“一个(a)”或“一个(an)”可以意味着一个或多个。
本发明通过所附非限制性附图和实例进行说明。
附图说明
图1：用于固定的水解酶抑制剂的化学结构
A)如实例4中所用的炔烃取代的奥利司他变体1“奥利司他A”(式(1)或同样地化合物A)B)如实例1至4中所用的炔烃取代的奥利司他变体2“奥利司他B”。(式(2)或同样地化合物B)C)如实例5中所用的“双烯醇酯”试剂(式(3)或同样地化合物C)。
图2：使用被固定在Streptavidin Mag Sepharose珠上的奥利司他B从托珠单抗溶液去除重组LPLA2。
奥利司他B：Mag-Sepharose-Streptavidin+偶氮基-生物素-叠氮化物(偶氮基-生物素-PEG3-叠氮化物)+炔基-奥利司他B；
珠对照物：Mag-Sepharose-Streptavidin+偶氮基-生物素-叠氮化物；
在5mg/mL托珠单抗+50ppm rec.LPLA2(＝250ng/mL LPLA2)中捕捞(fishing)。
A)LPLA2加标的托珠单抗上清液与缀合珠一起孵育后的脂肪酶活性测定。给出了等同于5ng/mL LPLA2的活性。
B)来自珠上消化样品的LPLA2 LC MS/MS分析的谱图计数。
图3：在100mg/mL托珠单抗+50ppm rec.LPLA2(＝5μg/mL LPLA2)中用缀合珠捕捞后托珠单抗溶液的脂肪酶活性测定。
给出了等同于5ng/mL LPLA2的活性。
奥利司他B：Mag-Sepharose-Streptavidin+偶氮基-生物素-叠氮化物+炔基-奥利司他B；接头对照物：Mag-Sepharose-Streptavidin+偶氮基-生物素-叠氮化物；
mAb+LPLA2：100g/l托珠单抗+50ppm rec.LPLA2(＝5μg/mL LPLA2)；
mAb：100g/L托珠单抗。
图4：针对glofitamab MMAEX负载溶液的脂肪酶活性测定
给出的活性被归一化至100μg蛋白质。每个条代表一次技术性捕捞重复。用于glofitamab MMAEX负载溶液中的捕捞实验的珠组合物如下：
NHS-活化的琼脂糖
“含有奥利司他B的NHS”：NHS-活化的琼脂糖珠+叠氮基-PEG4-胺+炔基-奥利司他B；
“不含奥利司他B的NHS”：NHS-活化的琼脂糖珠+叠氮基-PEG4-胺+生物素-PEG4-炔烃；
“NHS”：NHS活化的琼脂糖珠
链霉亲和素琼脂糖珠
“含有奥利司他B的Seph-SA”：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000843
High Performance珠+生物素-PEG4-叠氮化物+炔基-奥利司他B；
“不含奥利司他B的Seph-SA”：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000842
High Performance珠+生物素-PEG4-叠氮化物+生物素-PEG4-炔烃；
“Seph-SA”：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000841
High Performance珠
“Glofitamab对照物”是指起始蛋白质组合物的活性
可用的珠材料刚好足以针对“NHS”、“含有奥利司他B的SA”和“SA”重复执行两次捕捞实验，因此缺少重复进行三次的测量。
图5：针对曲妥珠单抗的经调整蛋白A洗脱池样品的脂肪酶活性测定。仅加载，而没有任何珠。给出的活性被归一化至100μg蛋白质。用于曲妥珠单抗的经调整蛋白A洗脱池中的实验的珠组合物如下：
含有奥利司他A的Seph-NHS：NHS-活化的琼脂糖珠+叠氮基-PEG4-胺+炔基-奥利司他A；
含有奥利司他B的Seph-NHS：NHS-活化的琼脂糖珠+叠氮基-PEG4-胺+炔基-奥利司他B；
不含奥利司他的Seph-NHS：NHS-活化的琼脂糖珠+叠氮基-PEG4-胺+生物素-PEG4-炔烃；
含有奥利司他A的Seph-SA：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000851
High Performance珠+生物素-PEG4-叠氮化物+炔基-奥利司他A；
含有奥利司他B的Seph-SA：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000853
High Performance珠+生物素-PEG4-叠氮化物+炔基-奥利司他B；
不含奥利司他的Seph-SA：Streptavidin
Figure BDA0004113420420000852
High Performance珠+生物素-PEG4-叠氮化物+生物素-PEG4-炔烃；
曲妥珠单抗对照物是指起始蛋白质组合物的活性。
图6：结合在双烯醇酯官能化珠上的脂肪酶CalB2的肽峰强度。
给出了共价结合脂肪酶CalB2的峰强度(右)归一化水平中的基于LC-MS的读数(基于洗涤步骤后由与珠表面暴露的炔基基团进行点击反应后的双烯醇酯部分(化合物C(或同样地式(3))支撑的官能化珠上的两种肽(肽CalB2脂肪酶1：LMAFAPDYK和CalB2脂肪酶2：PFAVGK)))。非共价吸附的mAb(肽Mab：FNWYVDGVEVHNAK)作为针对mAb吸附、消化和LC-MS实验的对照肽(右和左)。
图6左侧示出了非官能化珠，其使用与针对图6右侧所示的官能化珠相同的样品处理步骤。非官能化珠缺少双烯醇酯部分并且因此在其表面上仅具有残余炔烃部分。非共价吸附的mAb肽为整个工作流程提供置信度。缺失的脂肪酶肽表明洗涤方案能够去除非共价结合的脂肪酶。
图7：用于制备包含蛋白质的组合物的示意性过程。
图7示出了根据本发明所述的用于制备包含蛋白质(感兴趣的蛋白质)的组合物的示例性过程或方法。
典型的过程或方法包括至少4个后续步骤：(常规)制备和/或纯化感兴趣的蛋白质，即，从细胞培养物制备蛋白质组合物，之后通常是(至少)3个((常规)色谱法步骤，任选地4个(常规)色谱法步骤。
因此：在已从细胞培养物或培养物上清液制备蛋白质组合物(步骤1)后，过程通常涉及3个后续(常规)色谱法步骤，例如，通常使用3个柱(任选地4个柱)，每个柱采用不同的纯化原理(步骤2至4，或者在包括任选的步骤5(柱4)的情况下为步骤2至5)。
首先，制备来自细胞培养物(产生蛋白质/感兴趣的蛋白质的细胞)的组合物，例如，通过均质化细胞。该组合物也可以为细胞培养物上清液。优选地，上述组合物随后被纯化，例如，则该组合物为(如)与细胞、细胞碎片和/或聚集体分开(例如，通过过滤)的组合物。因此，(随后纯化的)组合物为(如)与细胞、细胞碎片和/或聚集体分开(通过过滤)的组合物，例如为收获细胞培养液(HCCF)。
第二，进一步纯化上述组合物，例如，通过蛋白质制备和/或纯化的进一步的步骤(步骤2)。蛋白质制备和/或纯化的进一步的步骤优选地为亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)。因此，亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)优选地为第一色谱法步骤。例如，使上述组合物(例如，收获细胞培养液(HCCF))经受蛋白A亲和色谱法。换句话讲，该过程包括使用亲和色谱柱(蛋白A亲和色谱柱)。
第三，然后使洗脱液经受第二柱(柱2)/步骤3)。
第四，然后使第二柱的洗脱液经受第三柱(柱3/步骤4)。第五，如果在第四步之后(即，在三个柱之后(优选地每个柱采用不同的纯化原理)未达到或要进一步提高质量(例如，感兴趣的蛋白质的纯度)，那么任选地可以使用第五步(例如，具有第四纯化原理的第四柱)(柱4/步骤5)。技术人员可以根据具体情况决定第五步是否是必要的和/或有益的，例如在平衡成本和/或增加的复杂性与提高的质量时。
因此，步骤3至5可以为按任何顺序的离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC)。换句话将，柱2至4可以为按任何顺序的离子交换色谱柱(例如，阴离子交换色谱(AEX)柱或阳离子交换色谱(CEX)柱)、混合模式色谱柱和疏水相互作用色谱(HIC)柱，即，该过程包括按任何顺序使用上述柱中的任何柱。
在纯化过程的开发期间，技术人员可以确定要使用的步骤/柱的顺序。
第六，在柱3或任选的柱4(步骤4以及任选地步骤5)之后，使洗脱液经受病毒过滤并且随后第七经受超滤/渗滤(UFDF)。
该过程包括步骤“(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂(诸如奥利司他)接触，其中水解酶抑制剂被固定在固体载体上”(例如，该步骤为水解酶抑制剂色谱法(水解酶抑制剂色谱法步骤)。换句话讲，该过程包括使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
优选地，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤在亲和色谱法(优选地蛋白A亲和色谱法)步骤/步骤2之后。换句话讲，该过程包括(直接)在蛋白A柱之后使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
另选地，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤在步骤3至5中的任一个步骤之后(步骤3至5可以为按任何顺序的离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法(AEX)或阳离子交换色谱法(CEX))、混合模式色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC))。换句话讲，该过程包括(直接)在使用按任何顺序的离子交换色谱柱(例如，阴离子交换色谱(AEX)柱或阳离子交换色谱(CEX)柱)、混合模式色谱柱和疏水相互作用色谱(HIC)柱之后使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤通常不(直接)在从细胞培养物制备蛋白质组合物的初始步骤之后(例如不在HCCF之后)。换句话讲，水解酶抑制剂色谱法/色谱法步骤通常不在亲和色谱法(例如，蛋白A亲和色谱法)/步骤2之前执行。这是因为这种初始蛋白质组合物(例如，来自细胞培养物的蛋白质组合物/细胞培养物的上清液，优选地HCCF)通常仍包含高程度的杂质(例如细胞、细胞碎片和/或聚集体)。因此，该过程通常不包括(直接)在从细胞培养物制备蛋白质组合物的初始步骤之后使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱和/或通常不包括在使用亲和色谱柱(例如，蛋白A亲和色谱柱)之前使用水解酶抑制剂(例如，奥利司他)柱。
实例对本发明进行说明。
实例1：使用被固定在Streptavidin Mag Sepharose珠上的奥利司他B从rec.LPLA2加标的托珠单抗溶液(5mg/mL)降低水解活性并去除LPLA2
以下实验展示了使用被固定在Streptavidin Magnetic Sepharose珠上的奥利司他B(式(2)或化合物(B))(参见图1B)从托珠单抗溶液去除重组溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)。
通过两步过程制备了官能化珠，该过程包括：奥利司他B(ASM ResearchChemicals GmbH)与偶氮基生物素-叠氮化物(偶氮基生物素-PEG3-叠氮化物)(Sigma-Aldrich；订单号：900891；CAS 1339202-33-3)每次点击化学的缀合；以及利用附着的生物素基团对链霉亲和素的高亲和力使用Streptavidin Mag Sepharose珠(GE Healthcare)的后续偶联步骤。
根据表1中指示的顺序通过在反应管中混合试剂执行了点击反应(样品/对照物)
Figure BDA0004113420420000881
表1：用于实例1的铜催化的点击反应组合物。
将两种反应混合物(包括奥利司他或用于对照珠的仅DMSO)在滚筒混合器上在室温孵育2小时，并使用真空离心机蒸发溶剂(45℃，2小时)。将沉淀物溶解在200μL DMSO中并在进一步使用之前在4℃储存。
对于Streptavidin Mag Sepharose珠上的缀合，将1mL的10％培养基浆液用1mL1x PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)洗涤三次。洗涤后，将1mL的10％培养基浆液与100μL的点击反应产物如上所述进行混合(样品/对照物，各重复进行两次)，并在滚筒混合器上孵育1小时。将缀合珠用1mL lx PBS洗涤五次并在进一步使用之前在4℃储存。
托珠单抗掺有rec.LPLA2以获得5mg/mL的最终抗体浓度和50ppm(250ng/mL)的LPLA2浓度(表2)：
Figure BDA0004113420420000891
表2：在5mg/ml托珠单抗溶液中加标50ppm LPLA2。
每次捕捞反应，将500μL的LPLA2加标的托珠单抗与200μL的缀合珠(样品/对照物)一起在Eppendorf
Figure BDA0004113420420000892
中以900rpm在37℃孵育4小时。孵育后，通过脂肪酶活性测定(参见下文“脂肪酶活性测定”部分)对上清液(样品/对照物)进行了评定，并针对珠上消化和LC-MS/MS分析(参见下文“珠上消化和LC-MS/MS”部分)对缀合珠(样品/对照物)进行了处理。
脂肪酶活性测定
本段描述了在实例1、2、3和4中执行的脂肪酶活性测定。脂肪酶活性测定通过监测非荧光底物(4-MUCA，Chem Impex Int’l Inc)通过底物酯键的裂解向荧光产物(4-MU，Sigma-Aldrich)的转化来测量脂肪酶活性。测定反应混合物含有80μL反应缓冲液(150mMTris-HCl pH 8.0、0.25％(w/v)Triton X-100和0.125％(w/v)阿拉伯树胶)、10μL 4-MUCA底物(1mM的DMSO溶液)和10μL蛋白质样品。表3中列出了对应的实例中使用的样品浓度和对应的缓冲液。
Figure BDA0004113420420000901
表3：如脂肪酶活性测定中使用的样品浓度和对应的抗体溶液缓冲液的汇总。
*通过使用Amicon Ultra-0.5ml离心过滤装置(10,000Da截留值，MerckMillipore)将经曲妥珠单抗调整的蛋白A洗脱池重新缓冲至150mM Tris-HCl pH 8.0。
**在将蛋白质溶液与珠一起孵育后，再次测量每个样品的样品浓度。这是使用Thermo ScientificTMNanoDropTMOne Microvolume UV-Vis分光光度计重复进行两次来执行的。
每个反应被设定为在96孔半面积聚苯乙烯板(黑色带盖和透明平底，CorningIncorporated)中进行三次技术重复，并通过在Infinite 200Pro板读数器(Tecan LifeSciences)中在37℃将反应板孵育两小时来每10分钟监测荧光信号的增加(在355nm处激发，在460nm处发射)。MU产生率由荧光时间进程的斜率(0.5小时至2小时)导出，并表示反应的原始速率(k原始[RFU/h])。
另外建立酶空白反应以测量由缓冲液基质引起的底物的任何非酶促裂解。将反应混合物中的10μL蛋白质样品替换为10μL样品缓冲液(表3)。自裂解速率(k自裂解[RFU/h])由荧光时间进程的斜率(0.5小时至2小时)导出。为了将荧光信号(RFU)转换为MU的μM，每个板重复添加标准MU三次。为10μL MU(100μM的DMSO溶液)补充10μL样品缓冲液(表3)和80μL反应缓冲液。通过对荧光信号(0.5小时至2小时)求平均值并将其除以孔中存在的MU的最终浓度来计算转化因子a[RFU/μM]。
以[μM MU/h]给出的样品的脂肪酶活性通过从样品的反应速率(k原始[RFU/h])中减去酶空白的反应速率(k自裂解[RFU/h])，并通过将该项除以转化因子a[RFU/μM]将荧光信号转化为μM MU/h来确定。活性针对每孔应用的脂肪酶浓度(表3的第1行和第2行)进行报告或归一化为100μg抗体(表3的第3行和第4行)(还请参见对图2A的描述)。
珠上消化和LC-MS/MS
对于珠上消化，将缀合珠(样品、对照物)用1mL的1x PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4)连续洗涤三次，用1mL的1％(w/v)SDS连续洗涤三次，用1mL变性缓冲液(400mM Tris/HCl，8M GdmCl，pH 8.5)连续洗涤三次并用1mL的lx PBS(137mMNaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4)连续洗涤五次。弃去上清液，并将珠在Eppendorf
Figure BDA0004113420420000912
中在300μL变性缓冲液(400mM Tris/HCl，8M GdmCl，pH 8.5)和10μL DTT溶液(0.1g DTT/mL的PWA溶液)中在50℃以900rpm孵育60分钟。孵育后，加入10μL碘乙酸溶液(0.33g/mL的PWA溶液)，并在室温避光孵育30分钟。将珠用1mL消化缓冲液(0.1MTris/HCl，pH 7.0)洗涤并去除上清液。在加入250μL消化缓冲液(0.1M Tris/HCl，pH 7.0)和5μL的0.25mg/mL胰蛋白酶溶液(25μg冻干胰蛋白酶在100μl 10mM HCl中的溶液)后，在Eppendorf
Figure BDA0004113420420000911
中在50℃以900rpm执行珠上消化18小时。将上清液转移到新的反应管中，并通过加入25μL甲酸溶液(10％的PWA溶液)灭活胰蛋白酶，并将样品在进行分析之前在4℃储存。
使用Thermo Fisher Scientific Vanquish-H UHPLC系统在CSH130 C18(1.7μm，2.1mm x 150mm)柱(Waters)上在60℃分离肽。以300μL/分钟的流速注入100μL样品。流动相A包括0.1％甲酸水溶液，并且流动相B包括0.1％甲酸乙腈溶液。65分钟梯度从历经45分钟的0％至40％ B的线性增加开始，之后在95％ B处进行5分钟柱洗涤，并在1％ B处进行柱再平衡(re-equilibration)10分钟。此外，在每个样品实施之前进行洗脱液A运行(65分钟梯度)并在每个样品实施之后用10％甲醇进行30分钟洗涤梯度，以防止遗留(carry over)和结果失真。将UHPLC系统与具有DuoSpray Ion Source的TripleTOF 6600质谱仪(Sciex)耦接。使用具有以下设定的数据相关采集(DDA)来执行串联质谱分析：在200m/z至2000m/z的质量范围内从每一次MS全谱扫描(250ms)中选择前20个最丰富的离子。MS/MS扫描(69ms)在包括+2至+5的电荷状态的100m/z至1600m/z(高灵敏度模式)的质量范围内获取。对于MS/MS选择，将动态排除设定为持续6秒的时间，并将先驱离子阈值设定为每秒150个计数。
使用ProteinPilot软件(Sciex，5.0版)针对定制的CHO数据库搜索MS/MS数据，该数据库具有35,862个蛋白质序列，其中含有来自Uniprot.org的所有CHO蛋白质(包括Swiss-Prot和TrEMBL注释)、药物产品序列和人角蛋白杂质。将针对阳性蛋白质鉴定的验收标准设定为<1％的错误发现率，其中至少有两个独特的肽的置信度为95％。
结论
与不含奥利司他B的相应对照物(与Streptavidin Mag Sepharose珠偶联的偶氮基-生物素-叠氮化物)相比，用被固定的奥利司他B孵育掺有50ppm rec.LPLA2的5g/l托珠单抗溶液显著降低了上清液中的水解活性，如脂肪酶活性测定所示(图2A)。与这些结果一致，rec.LPLA2可以通过仅在奥利司他B官能化珠上(但不能用于对照珠)的珠上消化和LC-MS/MS分析进行鉴定，表明奥利司他B在LPLA2上的共价结合以及因此将其从抗体溶液中去除(图2B)。
实例2：使用被固定在Streptavidin Mag Sepharose珠上的奥利司他B(式(2)或化合物B))来降低rec.LPLA2加标的托珠单抗溶液(100mg/mL)中的水解活性
该实验表明，实例1中所述的方法也适用于含有相同比率的加标rec.LPLA2(即，50ppm，5μg/mL)处的高蛋白质浓度的抗体溶液(即，100mg/mL托珠单抗)。
为此，如实例1中所述制备了官能化珠。
托珠单抗掺有rec.LPLA2以获得100mg/mL的最终抗体浓度和50ppm(5μg/mL)的LPLA2浓度(表4)。
Figure BDA0004113420420000931
表4：在100mg/ml托珠单抗溶液中加标50ppm LPLA2。
将250μL LPLA2加标的托珠单抗与100μL缀合珠(样品/对照物)在Eppendorf
Figure BDA0004113420420000937
中在37℃以900rpm一起孵育4小时。孵育后，通过脂肪酶活性测定对上清液(样品/对照物)进行了评定(参见实例1)。
结论：
与来自实验1的结果一致，与不含奥利司他B的相应对照物(偶联至StreptavidinMag Sepharose珠的偶氮基-生物素-叠氮化物)相比，用被固定的奥利司他B孵育掺有50ppmrec.LPLA2的100g/l托珠单抗溶液显著降低了上清液中的水解活性，如脂肪酶活性测定所示(图3A)。这种作用可归因于奥利司他B的固定，因为对照样品(与Streptavidin MagSepharose珠偶联的偶氮基-生物素-叠氮化物)显示出与掺有rec.LPLA2的抗体溶液(不包括用Streptavidin Mag Sepharose珠进行的孵育步骤)相当的水解活性。
实例3：使用被固定在Streptavidin
Figure BDA0004113420420000932
High Performance珠或NHS-活化的Sepharose珠上的奥利司他B来降低glofitamab的过程中池的水解活性
该实验表明，当与被固定在NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000933
4Fast Flow珠(GEHealthcare)或Streptavidin
Figure BDA0004113420420000934
High Performance珠(GE Healthcare)上的奥利司他B(式(2)或化合物B))一起孵育时，glofitamab过程中池(即，MMAEX负载溶液)中的水解活性降低。
制备被固定在NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000935
4Fast Flow珠上的奥利司他B)
通过两步过程制备了官能化的
Figure BDA0004113420420000936
4Fast Flow珠，该过程包括：将接头叠氮基-PEG4-胺(BroadPharm，BP-21615；CAS 951671-92-4)偶联在胺反应性NHS-活化珠上；以及随后通过每次点击化学将其炔基基团与偶联珠的接头的叠氮基基团缀合来固定奥利司他B。
为了将接头叠氮基-PEG4-胺偶联到NHS-活化的珠上，执行了以下步骤：将100μL叠氮基-PEG4-胺在1900μL偶联缓冲液(0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)中稀释以获得2000μL的总体积。将600μL NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000941
4Fast Flow珠填充到Poly-PrepChromatography Column(BioRad)中，并紧接在使用之前用10CV冰冷的1mM HCl(在PWA中)溶液洗涤。将300μL制备的叠氮基-PEG4-胺溶液加入到经洗涤的珠中，并在滚筒混合器上在室温孵育4小时。对于未反应的NHS酯的封闭(blocking)以及洗涤，以指示的顺序和体积加入偶联缓冲液(0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)、洗涤缓冲液A(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH 4.0)、洗涤缓冲液B(0.1M Tris-Cl，pH 8.0)和1x PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)：
a)3x2CV封闭缓冲液
b)3x2CV洗涤缓冲液A
c)3x2CV封闭缓冲液
d)在封闭缓冲液中静置30分钟
e)3x2CV洗涤缓冲液A
f)3x2CV洗涤缓冲液B
g)3x2CV洗涤缓冲液A
h)3x2CV洗涤缓冲液B
i)3x2CV洗涤缓冲液A
j)3x2CV洗涤缓冲液B
k)5x2CV 1xPBS
为了每次点击化学将奥利司他B缀合到接头的偶联珠的叠氮基基团上，执行了以下步骤：
将如上所述获得的500μL沥干的叠氮基官能化珠与500μL lx PBS((137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)混合并均质化。将400μL所得珠浆液填充到新的Poly-Prep Chromatography Column(BioRad)中。在珠床沉降后，弃去上清液。为了缀合奥利司他B(称为含有奥利司他B的NHS Sepharose)或生物素-PEG4-炔烃(称为不含奥利司他B的NHS Sepharose)(Sigma-Aldrich)，以指示的顺序和体积将以下试剂加入到了经填充的Poly-Prep Chromatography Column中(表5)：
Figure BDA0004113420420000951
表5：实例3中用于叠氮基官能化的珠的官能化的铜催化的点击反应组合物
将两种反应混合物(样品/对照物)在滚筒混合器上在室温孵育2小时，并用10CV的1xPBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)洗涤。将含有制备的树脂的柱在进一步使用之前在4℃储存。
被固定在Streptavidin
Figure BDA0004113420420000952
High Performance珠上的奥利司他B
为了制备用奥利司他B官能化的Streptavidin
Figure BDA0004113420420000953
High Performance珠，通过根据指示的顺序和体积在反应管中混合以下试剂执行了奥利司他B与生物素-PEG4-叠氮化物(BroadPharm；CAS 1309649-57-7)之间的点击反应(表6)：
Figure BDA0004113420420000954
Figure BDA0004113420420000961
表6实例3中用于Streptavidin
Figure BDA0004113420420000962
High Performance珠的官能化的铜催化的点击反应组合物。
将两种反应混合物在滚筒混合器上在室温孵育2小时，并使用真空离心机蒸发挥发性溶剂(45℃，2小时)，并在进一步使用之前在4℃储存。
为了实现Streptavidin
Figure BDA0004113420420000963
High Performance珠上的缀合，将1mL介质浆液用结合缓冲液(20mM NaPO4，0.15M NaCl，pH 7.5)洗涤十次，填充到Poly-PrepChromatography Column(BioRad)中，并用5CV结合缓冲液(20mM NaPO4，0.15M NaCl，pH7.5)平衡。将500μL结合缓冲液(20mM NaPO4，0.15M NaCl，pH 7.5)与200μL缀合的生物素-奥利司他(称为含有奥利司他B的Seph-SA)/生物素-生物素(称为不含奥利司他B的Seph-SA)混合，并将总混合物加入到经平衡的珠中。在滚动混合器上在室温孵育30分钟后，依次用10CV结合缓冲液(20mM NaPO4，0.15M NaCl，pH 7.5)和10CV的1x PBS(137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)洗涤珠。将缀合珠(含有奥利司他B的Seph-SA和不含奥利司他B的Seph-SA)在进一步使用之前在4℃储存。
将缀合珠与抗体Glofitamab的MMAEX负载溶液一起孵育
将100μL官能化珠浆液(含有奥利司他B的NHS Sepharose、不含奥利司他B的NHSSepharose、含有奥利司他B的Seph-SA和不含奥利司他B的Seph-SA)以及普通珠浆液(NHS-活化的Sepharose珠和Streptavidin
Figure BDA0004113420420000964
High Performance)转移到了反应管中，并弃去了50μL上清液。加入了450μL Glofitamab的MMAEX负载溶液(c＝7.3mg/ml)，并将混合物在Eppendorf Thermomixer中以850rpm在25℃孵育。将样品以1000rpm离心30秒，并针对脂肪酶活性对上清液进行了评定，如实例1中所述。
结论：
与图4中的相应对照珠(即，不含奥利司他B的缀合珠以及未缀合珠)和起始蛋白质组合物相比，将Glofitamab(MMAEX负载溶液)与经奥利司他B官能化的珠一起孵育导致水解活性的显著降低，如通过这些珠的降低的平均转化速率可以看出的。这些数据表明被固定的奥利司他B能够从具有相当高水平的水解活性特征的抗体溶液的过程中池中去除水解活性酶。此外，对于NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000971
4Fast Flow珠(如上所述经由NHS和点击化学偶联)和Streptavidin
Figure BDA0004113420420000972
High Performance珠(GE Healthcare)(如上所述经由点击化学并利用生物素与链霉亲和素之间的高亲和力偶联)两者都可以证明被固定的奥利司他B的有益效果，因为与相应的对照物(即，不含奥利司他B的缀合珠、未缀合珠和起始蛋白质组合物)相比，这两种方法都导致水解活性的显著降低，如图4中的平均转化速率所示。
实例4：使用被固定在Streptavidin
Figure BDA0004113420420000978
High Performance珠或NHS-活化的Sepharose珠上的奥利司他A或奥利司他B来降低曲妥珠单抗的过程中池的水解活性
该实验表明，通过使用被固定在NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000979
4Fast Flow珠或Streptavidin
Figure BDA0004113420420000977
High Performance珠(GE Healthcare)珠上的奥利司他A(式(1)或化合物A))或奥利司他B(式(2)或化合物B)降低了
Figure BDA00041134204200009710
(曲妥珠单抗)过程中池(即，蛋白A洗脱池)中的水解活性。
针对奥利司他B和奥利司他A两者(通过用奥利司他A取代奥利司他B)制备了官能化珠(NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000973
4Fast Flow和Streptavidin
Figure BDA0004113420420000974
HighPerformance珠(GE Healthcare))，如实例3中所述。
将100μL经奥利司他A/B官能化的珠/对应对照珠(对于NHS-活化的
Figure BDA0004113420420000975
4Fast Flow珠以及Streptavidin
Figure BDA0004113420420000976
High Performance珠两者，如上所述对它们进行了处理)转移到反应管中并弃去50μL上清液。加入了450μL赫赛汀的蛋白A洗脱池(7g/l)，并将混合物在Thermomixer中以850rpm在25℃孵育。将样品以1000rpm离心30秒，并通过脂肪酶活性测定对上清液以及起始蛋白质组合物进行了评定，如实例1中所述。
结论：
与相应的对照物和起始蛋白质组合物(不包括用官能化珠进行的孵育步骤)相比，对于赫塞汀的蛋白A洗脱池而言，在与被固定在NHS-活化的Sepharose4Fast Flow珠或Streptavidin
Figure BDA0004113420420000981
High Performance珠上的奥利司他A和奥利司他B两者一起孵育后，可以实现水解活性的显著降低，如图5中的平均转化速率所示，表明被固定的水解酶抑制剂(即，奥利司他A和B)能够从已被纯化的抗体溶液(即，曲妥珠单抗的过程中池)中去除水解活性酶。
实例5：对与固体支撑物结合的脂肪酶双烯醇酯构造体的蛋白质组学评定
该实验证明了共价偶联在经叠氮化物修饰的磁性颗粒上(经由点击反应化学)的双烯醇酯(式(3)或化合物C)能够与脂肪酶(模型脂肪酶：CalB2)共价地和选择性地结合并从抗体溶液中去除相应的脂肪酶。将官能化珠结合脂肪酶的能力与作为对照物的非官能化珠进行了比较。
测试样品：将作为用于基于LC-MS的蛋白质组学工作流程的对照蛋白质的赫赛汀(mAb；0.2μg/μl的磷酸钠缓冲液溶液)与作为目标的脂肪酶CalB2(CalB2；0.2μg/μl的ca.1:1(mol/mol)比例的磷酸钠缓冲液溶液)混合。将上述样品用与60μg经叠氮化物修饰的磁性颗粒(制备了60μl的1μg/μl水溶液)(基于聚苯乙烯的叠氮化物珠；CLK-1036-1，Jena-Bioscience)共价偶联的化合物C(双烯醇酯)进行了处理，该磁性颗粒通过点击反应和纯化制备而成(参见方案实验实例1和针对Jena-Bioscience点击方案所述的一般过程)。作为对照，非官能化叠氮化物修饰珠(基于聚苯乙烯的叠氮化物珠；CLK-1036-1，Jena-Bioscience)已经以与化合物C偶联珠相同的方式进行了处理，不同之处在于偶联步骤仅使用化合物C的溶剂来执行。
CalB2和mAb混合物的孵育是通过将60μg(60μl的1μg/μl溶液)相应官能化或非官能化珠与50μl CalB2(0.2μg/μl)和50μl mAb(0.2μg/μl)混合来完成的。将样品在40℃以1000rpm涡旋过夜。孵化后，根据以下方案使用磁分离和低结合一次性用品来洗涤官能化珠以及非官能化珠：
第1次洗涤：将60μg珠用200μl PBS缓冲液洗涤两次，之后进行干燥步骤
第2次洗涤：用含有Triton-X100的PBS缓冲液(用9990μl PBS稀释的10μl Triton-X100)将来自第1步的经干燥珠洗涤三次，之后在室温进行风干
第3次洗涤：将来自第二步的珠用200μl水洗涤两次，之后进行在室温风干的步骤
第4次洗涤：用200μl(70％乙腈/30％水和0.1％甲酸(v/v/v))洗涤来自第3步的珠
第5次洗涤：最后用200μl水洗涤来自第4步的珠
对于靶向LC-MS分析，将经洗涤的珠用5μl IAM溶液(55mM：1mg/ml的98.3μlMilliQ-Water溶液)脲甲基化(Carbamidomethylated)，并用5μl DTT(10mM的水溶液)溶液还原30分钟。
在上述步骤之后，通过加入50μl变性缓冲液/消化缓冲液(胰蛋白酶稀释液(50mMAcOH)，10μl AcOH，冰的用3470μL MilliQ-Water稀释，4℃，之后将20μg胰蛋白酶在原管(original tube)中溶解在40μl胰蛋白酶稀释溶液(50mM AcOH)中)来实现相应珠上的蛋白质的变性。将5μl胰蛋白酶溶液、1μl Rapid PNGase F和1μl(N/O-)去糖基化MIX II加入到样品混合物中，之后进行混合和孵育：(在thermoshaker中在37℃以1000rpm进行16至20小时，37℃)。珠上清液分离是通过短暂离心之后进行磁分离来完成的。
通过向样品消化物加入2μl FA溶液，之后进行孵育步骤(在热振动器中在37℃以800rpm进行1.5至2小时(对于PPS的水解))来使消化物停止。将消化物样品至分析之前在-80℃(原始样品处)储存
以TFA(0.05％v(v)作为缓冲液使用水/乙腈梯度执行了靶向LC-MS分析。分离柱为PepSwift Monolithic Capillary Column，200μm x 5cm，P/N：161409.作为质谱仪，使用了Thermo LTQ FT系统。针对定量分析的进一步实验设计遵循一般实验靶向LC-MS过程。通过在分析柱上注入1μl经消化样品将与珠结合的蛋白质应用于LC-MS系统。
以下肽和各自的质量已用于评估从靶向质谱读数得出的绝对峰强度(峰强度作为归一化水平((NL))：
肽CalB2脂肪酶1：LMAFAPDYK，电荷z＝2；质量/电荷：528.27Da
肽CalB2脂肪酶2：PFAVGK，电荷z＝2；质量/电荷：309.68Da
肽mAb：FNWYVDGVEVHNAK，电荷z＝3；质量/电荷：559.94Da
针对mAb肽和脂肪酶肽的相应靶向LC-MS信号已与它们的相应信号强度一起使用以生成图6。
质谱分析结果表明，在具有强信号计数的消化后可发现脂肪酶CalB2的两种选择性肽。
因此，该实验清楚地表明，模型脂肪酶CalB2与用双烯醇酯官能化的珠结合，即使在经受大量洗涤步骤时也是如此(图6)。这种相互作用显然是特异性的，因为在非官能化的对照珠上未检测到脂肪酶。
mAb极易沉淀并以非共价方式吸附到珠。在官能化珠和对照珠上检测到了mAb肽，验证了针对官能化珠和对照珠的功能性基于LC-MS的蛋白质组学工作流程。
本文引用的所有参考文献均通过引用完全并入。现在已经完整地描述了本发明，本领域技术人员将理解，本发明可以在广泛和等效的条件、参数等范围内实施，而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。

Claims (90)

1.一种方法，其包括以下步骤
(i)使包含蛋白质的起始组合物与水解酶抑制剂接触，其中所述水解酶抑制剂被固定在固体载体上；
(ii)回收包含所述蛋白质的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于制备包含蛋白质的组合物的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述组合物与所述起始组合物相比具有降低的水解活性及/或与所述起始组合物相比具有降低的水解酶含量，例如如通过脂肪酶活性测定(针对聚山梨醇酯(LEAP)测定的脂肪酶酶促测定)和/或脂肪酸质谱(FAMS)测定所确定的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法是用于降低所述起始组合物中的所述水解活性和/或用于降低所述起始组合物中的所述水解酶含量的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述起始组合物进一步包含水解酶和/或具有水解活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过从所述起始组合物去除水解酶和/或通过降低所述起始组合物中的所述水解酶含量来制备蛋白质组合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述步骤(i)进一步包括步骤(a)将所述水解酶吸附到所述水解酶抑制剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中包含蛋白质的所述组合物为包含蛋白质的溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液为水溶液。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述溶液为经缓冲的溶液。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述水解酶为酯酶和/或酰胺酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酯酶为羧酸酯水解酶和/或硫酯酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述羧酸酯水解酶为脂肪酶。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述水解酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、酸性神经酰胺酶、脂肪酸合成酶的C末端结构域、推定的磷脂酶b样2、溶酶体酸性脂肪酶和溶酶体磷脂酶。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中固定的抑制剂选自由以下项组成的组：奥利司他或双烯醇酯。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述固体载体选自由以下项组成的组：琼脂糖凝胶、聚苯乙烯和智能聚合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由叠氮基基团与炔基团的反应被固定在固体载体上。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由链霉亲和素基团与生物素基团的结合被固定在固体载体上。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抑制剂经由氨基基团与N-羟基琥珀酰亚胺基团的反应被固定在固体载体上。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抑制剂为能够通过使包含式(1)、(2)、(3)或(4)，优选式(1)、(2)或(4)，或由式(1)、(2)、(3)或(4)，优选式(1)、(2)或(4)构成的化合物与叠氮化物反应而获得的基团
Figure FDA0004113420380000021
Figure FDA0004113420380000031
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述步骤按以下顺序实施：步骤(i)之后是步骤(ii)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(i)之前和/或之后及/或在步骤(ii)之前和/或之后的蛋白质制备和/或纯化的步骤。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中步骤(i)在亲和色谱法之后，优选地在蛋白A亲和色谱法之后实施。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述抗体为人抗体或人源化抗体。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗HER2抗体、抗IL6抗体、抗IgE抗体、抗IL13抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-L1抗体、抗VEGF-A抗体、抗VEGF-A/ANG2抗体、抗CD79b抗体、抗ST2抗体、抗因子D抗体、抗因子IX抗体、抗因子X抗体、抗abeta抗体、抗tau抗体、抗CEA抗体、抗CEA/CD3抗体、抗CD20/CD3抗体、抗FcRH5/CD3抗体、抗Her2/CD3抗体、抗FGFR1/KLB抗体、FAP-4-1BBL融合蛋白、FAP-IL2v融合蛋白、奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法瑞昔单抗、泊洛妥珠单抗、更汀芦单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、格菲妥单抗、欣洛奇芙普和RG7827。
28.一种用于制备蛋白质制剂的方法，所述方法包括根据权利要求1至27中任一项所述的方法的步骤，其中用于制备所述蛋白质制剂的所述方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到所述组合物。
29.一种用于制备蛋白质制剂的方法，其中用于制备所述蛋白质制剂的所述方法进一步包括将表面活性剂，优选地脂肪酸酯加入到通过根据权利要求1至27中任一项所述的方法获得或能够获得的所述组合物。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述蛋白质制剂(基本上)不含可见的和/或在显微镜下才可见的颗粒。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂在建议的储存条件下稳定至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚氧乙烯失水山梨醇或异山梨醇脂肪酸单酯、二酯或三酯。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚氧乙烯(20)失水山梨醇月桂酸酯。
34.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯选自由以下项组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85或聚山梨醇酯120或它们的组合。
35.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
36.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂为单或二酰基甘油、脂肪酸糖酯或α-生育酚聚乙二醇(PEG)琥珀酸酯。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸酯的降解在24个月内小于20％，优选地小于10％，并且更优选地小于5％。
38.根据权利要求26至37中任一项所述的方法，其中抗体浓度为至少1mg/ml并且至多250mg/ml。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其进一步包括将缓冲剂、赋形剂、稀释剂、稳定剂和/或载体加入到所述组合物。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂为药物组合物。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述组合物和/或所述蛋白质制剂基本上不含水解酶抑制剂。
42.一种蛋白质组合物，其是通过根据权利要求1至27中任一项所述的方法获得或能够获得的。
43.一种蛋白质制剂，其是通过根据权利要求28至41中任一项所述的方法获得或能够获得的。
44.根据权利要求43所述的蛋白质制剂，其用作药物或用于医药中。
45.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于制备蛋白质组合物和/或蛋白质制剂的用途。
46.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或降低蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的水解活性的用途。
47.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于去除或减少蛋白质组合物和/或蛋白质制剂中的杂质，特别是宿主细胞蛋白质，以及优选地水解酶(的含量)的用途。
48.固定在固体载体上的水解酶抑制剂用于抑制或减少蛋白质组合物中和/或蛋白质制剂中的可见的和/或在显微镜下才可见的颗粒(的形成)和/或表面活性剂降解物的出现/存在的用途。
49.一种用于将水解酶抑制剂固定在固体载体上的方法，其包括以下步骤：
提供固体载体，
提供水解酶抑制剂，
使所述固体载体与含有所述水解酶抑制剂的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂被固定在所述固体载体上。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述固体载体选自：聚(甲基)丙烯酸酯类，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；聚苯乙烯；聚环氧乙烷；纤维素和纤维素衍生物，例如，乙酸纤维素(CA)或再生纤维素；琼脂糖，包括交联的琼脂糖；聚砜(PSU)；聚醚砜(PES)；聚乙烯(PE)；聚丙烯(PP)；聚碳酸酯(PC)；聚丙烯腈(PAN)；聚酰胺(PA)；聚四氟乙烯(PTFE)；以及前述者的共混物或共聚物，或者与亲水性聚合物，优选地与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚环氧乙烷(PEO)的共混物或共聚物。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
52.根据权利要求51所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入能够与所述固体载体的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
54.根据权利要求53所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入能够与所述水解酶抑制剂的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
55.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
提供固体载体，
使所述固体载体与含有接头的溶液接触以形成载体-接头，
提供水解酶抑制剂，
使所述载体-接头与含有所述水解酶抑制剂的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂被固定在所述载体-接头上。
56.根据权利要求55所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述接头包含能够与所述固体载体的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述接头进一步包含能够与所述水解酶抑制剂的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
60.根据权利要求49至59中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
提供固体载体，
提供水解酶抑制剂，
使所述水解酶抑制剂与接头接触以形成水解酶抑制剂-接头，
使所述固体载体与含有所述水解酶抑制剂-接头的溶液接触，以及
允许所述水解酶抑制剂-接头被固定在所述固体载体上。
61.根据权利要求60所述的方法，其中提供所述固体载体的步骤包括以下步骤：处理所述固体载体以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述接头包含能够与所述固体载体的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中提供所述水解酶抑制剂的步骤包括以下步骤：处理所述水解酶抑制剂以引入优选地选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的官能团。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述接头进一步包含能够与所述水解酶抑制剂的所述官能团反应，以优选地形成链霉亲和素-生物素相互作用或以形成选自酯类、酰胺类、亚胺类、尿烷类、脲类、β-氨基醇类和1,2,3-三唑类的一个或多个基团的官能团。
65.根据权利要求49至64中任一项所述的方法，其中所述固体载体上的所述官能团包括氨基基团，优选伯氨基基团。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述固体载体上的所述氨基基团通过用反应性等离子体，优选地由包含氨的气体混合物生成的等离子体进行处理而被引入。
67.根据权利要求55至66中任一项所述的方法，其中所述接头为含有选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的至少两个官能团的化合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述接头另外含有聚氧乙烯或聚氧丙烯部分，所述聚氧乙烯或聚氧丙烯部分优选地含有所述至少两个官能团所结合到的3个至20个(更优选地3个至10个，甚至更优选地3个至5个)氧乙烯或氧丙烯单元。
69.根据权利要求55至68中任一项所述的方法，其中所述接头含有选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的至少两种不同官能团。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述接头每个分子含有：选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物、链霉亲和素和生物素的第一官能团；以及另外的选自羟基基团、羧酸根基团、酮类、醛类、异氰酸酯类、环氧化物、羟基基团、羧酸根基团、胺类、炔类、叠氮化物和生物聚合物(例如链霉亲和素和/或生物素)的与所述第一官能团不同的至少两个第二官能团，所述至少两个第二官能团优选为相同类型。
71.根据权利要求49至70中任一项所述的方法，其中所述固体载体为交联的琼脂糖，优选为琼脂糖凝胶，更优选为Mag-Sepharose-Streptavidin(珠)或Streptavidin
Figure FDA0004113420380000091
High Performance(珠)。
72.根据权利要求49至71中任一项所述的方法，其中所述固体载体含有包括链霉亲和素的官能团，并且所述接头含有包括生物素的官能团。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述接头另外含有叠氮化物基团，并且所述水解酶抑制剂含有炔基团。
74.根据权利要求49至73中任一项所述的方法，其中所述固体载体含有包括羧酸根的官能团，所述包括羧酸根的官能团任选地是NHS-活化的，并且所述接头含有包括胺的官能团。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述接头另外含有叠氮化物基团，并且所述水解酶抑制剂含有炔基团。
76.根据权利要求49至75中任一项所述的方法，其中所述接头选自生物素-PEG3-叠氮化物(CAS 875770-34-6)、生物素-PEG4-叠氮化物(CAS1309649-57-7)、偶氮基-生物素-叠氮化物(CAS 1339202-33-3)和叠氮基-PEG4-胺(CAS 951671-92-4)。
77.根据权利要求49至76中任一项所述的方法，其中所述水解酶抑制剂含有炔基团并且选自具有选自以下的结构的化合物：
Figure FDA0004113420380000101
其中在(HI-1)中
R1、R2和R3各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，其中R1、R2或R3中的至少一个末端-CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换，
其中在(HI-2)中
R11、R12和R13各自独立地选自可为直链或支链的C2-24-烷基，并且其中R11、R12和R13中的至少一个末端–CH2-CH3基团被–C≡CH基团替换。
78.根据权利要求77所述的方法，其中R1、R2和R11中的碳原子数独立地选自2至15，优选地3至14，更优选地4至12，甚至更优选地5至11。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中R12和R13中的碳原子数独立地选自5至24，优选地8至18，更优选地10至16，甚至更优选地10至12。
80.根据权利要求77至79中任一项所述的方法，其中R3中的碳原子数选自2至10，优选地2至8，更优选地3至6，甚至更优选地3至5。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，其中R1和R2的烷基基团为直链的。
82.根据权利要求77至81中任一项所述的方法，其中R11、R12和R13的烷基基团为直链的。
83.根据权利要求77至82中任一项所述的方法，其中R3的烷基基团为支链的。
84.根据权利要求77至83中任一项所述的方法，其中式(HI-1)具有以下结构(HI-1a)：
Figure FDA0004113420380000111
其中R1、R2和R3如权利要求77、78、80、81和83中任一项中所定义。
85.根据权利要求49至84中任一项所述的方法，其中所述水解酶抑制剂含有炔基团并且选自具有选自以下的结构的化合物：
Figure FDA0004113420380000112
Figure FDA0004113420380000121
86.一种固定在固体载体上的水解酶抑制剂，所述水解酶抑制剂是通过根据权利要求49至85中任一项所述的方法能够获得的。
87.一种装置，其包括根据权利要求86所述的固定在固体载体上的水解酶抑制剂。
88.根据权利要求87所述的装置，其中所述装置为具有至少两个开口的管状装置。
89.根据权利要求87或88所述的装置，其中所述装置包括容器，所述容器优选地由金属、聚合物或玻璃制成，所述容器形成腔，在所述腔中容纳所述固定在固体载体上的水解酶抑制剂。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的装置，其中所述装置为柱，所述柱至少部分地填充有所述固定在固体载体上的水解酶抑制剂。
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