KR20220005561A

KR20220005561A - 전구약물 조성물에서 약물 농도를 정량화하는 방법

Info

Publication number: KR20220005561A
Application number: KR1020217039733A
Authority: KR
Inventors: 킴 앨빙; 빙 왕
Original assignee: 젠자임 코포레이션
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2022-01-13
Also published as: WO2020227364A1; US11796546B2; JP2022531018A; MA55883A; US20200386768A1; SG11202111253WA; US20240168035A1; TW202108767A; CN113795590A; EP3966343A1

Abstract

전구약물 조성물에 존재하는 약물의 양을 정량화하는 방법이 제공된다.

Description

전구약물 조성물에서 약물 농도를 정량화하는 방법

관련 출원

본 출원은 2019년 5월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/844,579호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 전구약물 조성물에 존재하는 약물의 양을 정량화하는 방법에 관한 것이다.

지난 10년 동안 매년 평균적으로 17개의 새로운 펩티드가 소분자 승인율의 2배의 승인율(1상에서 마케팅까지)로 임상 시험에 진입했으며(Dharanipragada (2013) Future Medicinal Chemistry 5(7):831; Kaspar and Reichert (2013) Drug Discovery Today 18:807-817), 150개가 넘는 펩티드 약물 후보가 현재 개발 중이다(Lau and Dunn (2018) Bioorganic & Medicinal Chemistry 26:2700-2707).

그러나, 펩티드 약물의 개발은 특정 과제를 제시한다. 예를 들어, 펩티드 약물은 생체 내에서 단백질분해 절단을 거치며 빠르게 제거된다. 경구 전달은 부분적으로 생물학적 막의 낮은 투과성으로 인해 도전 과제로 남아 있다. 이러한 단점을 해결하려는 시도는 (예를 들어, 락탐화 및 클릭 고리화에 의한) 고리형 펩티드 형성, 탄화수소 스테이플링, 지질화, 및 폴리머 약물 접합체의 개발과 같은 입체형태적 제약을 모두 고려하여 이루어졌다.

펩티드 약물의 일례는, 글루카곤과 GLP1 수용체를 표적으로 하고 제2형 당뇨병 환자의 혈당 조절 및 체중 감소뿐만 아니라 건강한 지원자의 체중 감소를 촉진할 수 있는 이중 수용체 작용제인 SAR425899이다(Tillner et al. (2019) Diabetes Obes. Metab. 21:120, doi: 10.1111/dom.13494, Epub 2018 Sep 16). 그러나, 빠른 생체내 청소율로 인해, SAR425899의 1일 1회 용량이 필요하다.

히알루론산(HA)은 히알루로난이라고도 하며, β-1-3 및 β-1-4 글리코시드 결합에 의해 결합된 d-글루쿠론산과 N-아세틸-d-글루코사민의 반복 이당류 단위로 구성된 자연 발생적 비황산염 선형 다당류이다(Khunmanee et al. (2017) J. Tissue Engineering vol. 8 (doi: doi.org/10.1177/2041731417726464)). HA는 피부의 중요한 구조적 요소이며, 많은 세포 표면 수용체 상호작용에 참여한다. HA는 면역억제 및 항혈관신생 활성을 가지며, 뇌 조직, 유리 연골, 및 관절액에 존재한다. HA는 고형 부피의 1000배까지 많은 양의 수분을 흡수할 수 있는 생물학적 조직에서의 강한 친수성 특성 및 고분자량으로 인해 신체에서 중요한 구조적 및 기능적 역할을 나타낸다.

HA는 생체적합성 및 생분해성으로 인해 생의학 및 제약 용도에서 많은 용도가 확인되었다. 그러나, HA는 매우 가용성이며, 생체 내에서 급속한 분해 거동으로 매우 열악한 기계적 특성을 종종 나타낸다. 따라서, HA는 기계적 특성, 점도, 용해도, 분해, 및 생물학적 특성을 비롯한 특성을 개선하기 위해 화학적으로 변형되고/되거나 가교되었다. 조직 공학용 스캐폴드, 성대 확대술과 같은 연조직 수술, 약물 전달, siRNA의 세포내 전달, 상처 치유에서, 그리고 수술 절차의 장치로 HA 유도체가 생성되고 활용되었다.

가교된 히알루론산(xHA)은 수성 환경에서 수백만 달톤의 하이드로겔을 형성하며, 약물(예를 들어, 펩티드 약물)에 결합하여 생체 내에서 약물을 안정화시킬 수 있다. 그러나, 하이드로겔에 로딩된 약물의 양을 정량화 하는 것과 하이드로겔로부터의 약물의 방출 속도를 정량화하는 것은 모두 어렵다. 용액 중 펩티드의 기본적 정량화에 일반적으로 적용되는 간단한 UV 측정은 이러한 분석에서 약물 결합 하이드로겔 복합체가 완전히 용해되어야 하기 때문에 하이드로겔에 적용될 수 없다.

상승된 온도 또는 상승된 pH를 사용하여 링커의 가수분해 및 펩티드 약물의 방출을 촉진하기 위한 대안적 방법은 펩티드 약물의 부분적 분해를 초래하므로, 정량화하기 어려운 이종 혼합물을 생성한다. 따라서, 가교된 HA 하이드로겔에 대한 전구약물 조성물의 약물 로딩량을 정량화하기 위한 분석적 정량화 방법이 필요하다.

가교된 HA(xHA) 하이드로겔에 대한 약물 로딩량을 측정하는 분석 문제를 해결하기 위해, 예를 들어 xHA 하이드로겔의 펩티드 로딩량 측정을 가능하게 하여 이를 해결하기 위해, 중량/중량 백분율로 측정된 약물 로딩량(예를 들어, 생체고분자 펩티드 전구약물 로딩량)의 정확한 정량화를 가능하게 하는 새로운 방법을 발견하였다. 본원에 기재된 방법은 (예를 들어, 단백질분해, 가수분해 등에 의해) 더 작은 구성요소로 분해될 수 있는 모든 소분자(예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 등)에 적용될 수 있는 약물 로딩량 측정에 대해 매우 선택적이며, 전구약물, 예를 들어 생체고분자 함유 전구약물의 약물 로딩량 측정에 광범위하게 적용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 예를 들어 생체 내에서 약물의 용량 전달을 제어하는 데 유용하고, 제조 중에 전구약물 배치 사이에서 약물 로딩의 품질 제어를 하는 데 유용하다. 본원에 기재된 방법은 생체내 반감기가 증가된 약물, 예를 들어 펩티드 약물, 예를 들어 수 분에서 수일로 증가된 반감기를 갖는 펩티드 약물과 같은 약물의 생산을 가능하게 한다.

본원에 기재된 방법은 NMR 기반 방법과 같은, 당업계에 알려진 이전 방법에 비해 다양한 이점을 제공한다. 예를 들어, NMR 기반 방법은 본원에 기재된 방법보다 시간이 오래 걸리고 처리량이 낮다. NMR 기반 방법은 수 밀리그램의 물질이 필요하지만, 본원에 기재된 새로운 방법은 단지 수 나노그램의 물질만 필요하다. 또한, NMR 기반 방법의 동적 범위는 본원에 기재된 새로운 방법의 동적 범위보다 낮다. 또한, NMR 기반 방법은 본원에 기재된 새로운 방법보다 펩티드 오염에 의한 간섭에 더 민감하다.

이중 효소적 분해에 이은 분해 산물(들)의 정량화를 사용하여 하이드로겔에 대한 약물 로딩량(예를 들어, 펩티드 약물 로딩량)을 정확하게 정량화할 수 있다는 발견에 기초한 새로운 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법의 특정 구현예에서, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P)를 가교된 히알루론산을 분해하는 효소와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 단백질분해 효소를 적용하여 부착된 펩티드를 분해하고 단백질분해 분해 산물을 생성한다. 이어서, 펩티드를 나타내는 단백질분해 분해 산물을 정량화한다.

상기 방법의 특정 예시적인 구현예에서, 가교된 히알루론산 링커 펩티드 접합체(xHA-L-P)를 칭량하고 완충액에 하이드로겔로서 현탁한다. 하이드로겔은 효소에 의해 가용성 올리고머 히알루론산-링커-펩티드(oHA-L-P)로 분해된다. 생성된 oHA-L-P의 올리고머는 펩티드, 링커, 및 길이가 다른 올리고머 히알루론산으로 구성된 이종 혼합물로 존재한다. 이 올리고머 히알루론산 비균질성은 질량 분석 기반 정량화에는 바람직하지 않지만, 덜 특유한 UV 또는 형광 기반 분석에 적용될 수 있다. 따라서, 질량 분석 기반 기준 분석에 대해, 제2 효소적(예를 들어, 엔도단백질분해) 분해 단계를 도입하여 펩티드 약물을 분해하고 균질한 펩티드 분해 산물(예를 들어, 19개 아미노산의 C-말단 펩티드 분해 산물 DFIEWLKAGGPSSGAPPPS-NH2(도 3))을 생성한다. 이어서, 예를 들어 액체 크로마토그래피/고분해능 질량 분석(LC/MS)과 같은 분석을 사용하여 펩티드 산물을 검출하고 정량화할 수 있다.

일 양태에서, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 xHA-L-P 전구약물 제형의 샘플을 히알루로노글루코시다제, 예를 들어 히알루로니다제(HAase) 또는 히알루로네이트(HA) 리아제와 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계, oHA-L-P를 효소와 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계, 및 펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함한다.

특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 2개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 3개 아미노산 내지 약 75개 아미노산, 약 4개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 6개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 15개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 19개 아미노산의 길이이다. 특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 1개, 약 2개, 또는 약 3개 아미노산의 길이이다.

특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석(LC- HRMS), 자외선(UV) 흡광도 및 형광 검출 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다.

특정 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HAase 1, HAase 2, HAase 3, HAase 4, HAase 5, 및 HAase 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 HAase이다. 다른 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HAase 1 또는 HAase 2이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HAase 2이다. 특정 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HA 리아제 EC 4.2.2.1이다.

특정 예시적인 구현예에서, oHA-L-P는 엔도프로테이나제, 예를 들어 Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 또는 키모트립신과 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 엔도프로테이나제는 Asp-N이다.

특정 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 내부 표준물질의 사용을 추가로 포함한다. 특정 예시적인 구현예에서, 내부 표준물질은 하나 이상의 중동위원소를 포함한다.

특정 예시적인 구현예에서, 존재하는 약물의 양은 검량선을 사용하여 구해진다.

특정 예시적인 구현예에서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 히알루로노글루코시다제와 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI이다.

특정 예시적인 구현예에서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 제2 효소와 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI이다.

다른 양태에서, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 xHA-L-P 전구약물 제형의 샘플을 히알루로노글루코시다제와 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계, oHA-L-P를 엔도프로테이나제와 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계, 및 펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함한다.

특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 LC-MS, LC-MS-MS, LC-HRMS, UV 흡광도 및 형광 검출 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다.

특정 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HAase 1 또는 HAase 2이다. 특정 예시적인 구현예에서, 히알루로노글루코시다제는 HA 리아제 EC 4.2.2.1이다.

특정 예시적인 구현예에서, 엔도프로테이나제는 Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 예시적인 구현예에서, 엔도프로테이나제는 Asp-N이다.

특정 예시적인 구현예에서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 엔도프로테이나제와 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI이다.

다른 양태에서, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 xHA-L-P 전구약물을 히알루로니다제 2와 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계, oHA-L-P를 Asp-N과 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계, 및 펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함한다.

특정 예시적인 구현예에서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 히알루로니다제 2와 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI이다.

특정 예시적인 구현예에서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 Asp-N과 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI이다.

다른 양태에서, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 xHA-L-P 전구약물을 HA 리아제 EC 4.2.2.1과 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계, oHA-L-P를 Asp-N과 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계, 및 펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함한다.

특정 예시적인 구현예에서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 HA 리아제 EC 4.2.2.1과 접촉된다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높다. 특정 예시적인 구현예에서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI이다.

본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부 도면과 함께 아래의 예시적인 구현예의 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1은 생체 내에서 비활성 전구약물 형태로부터 활성 펩티드 약물(즉, 1일 1회 GLP-1/GCC 수용체 작용제, SAR425899)을 서서히 방출하는 고분자 담체 및 자가절단 링커를 도시한다.
도 2는 절단 가능한 링커를 통해 고분자량의 가교된 히알루론산 하이드로겔에 결합된 특정 예시적 구현예에 따른 주 1회 GLP-1/GCG 작용제(즉, SAR425899)의 복잡성 및 크기를 도시한다. D-세린은 SAR425899(HdSQGTFTSDLSKQK(γE-팔미테이트)ESKAAQDFIEWLKAGGPSSGAPPPS-NH2)의 2번 위치의 아미노산이다.
도 3은 정량화에 사용되는 C-말단 펩티드를 포함하여, 분해 산물을 생성하기 위한 엔도프로테이나제 Asp-N을 사용한 SAR425899의 분해를 개략적으로 나타낸다. D-세린은 SAR425899(HdSQGTFTSDLSKQK(γE-팔미테이트)ESKAAQDFIEWLKAGGPSSGAPPPS-NH2)의 2번 위치의 아미노산이다. 검량선은 단백질분해 분해 산물에 상응하는 합성 비표지 C-말단 펩티드를 사용하여 생성되며, 중동위원소 표지 C-말단 펩티드가 내부 표준물질로서 적용된다. 20 내지 40 μg의 펩티드를 37℃에서 밤새 100 mM 중탄산암모늄 중 1.20 내지 0.4 μg의 Asp-N(Sigma-Aldrich)(비율 1:100)을 사용하여, 또는 37℃에서 1시간 동안 1분의 사이클링 시간으로 대기압과 40 KPSI 사이에서 교대로 압력 바이오 사이클러를 사용하여 분해하였다.
도 4는 히알루로노글루코시다제(히알루로니다제(HAase))를 사용한 xHA-L-P의 분해에 이은 AspN을 사용한 분해, 및 후속 ??칭을 보여준다. 결합된 무손상 펩티드를 방출하기 위해 37℃에서 24시간 동안 가수분해를 수행하였다. LC/MS 분석 전에 내부 표준물질(IS)을 첨가하였다. AspN은 HA 분해 산물의 존재하에 완충액에서 SAR425899를 완전히 분해했다. C-말단 펩티드에 대한 방출된 무손상 펩티드의 비는 0.0006이었다.
도 5는 Asp-N을 사용한 SAR425899 전구약물의 분해가 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS)으로 검출 가능한 C-말단 펩티드 분해 산물을 생성함을 보여준다. SAR425899 전구약물은 xHA-링커-SAR425899이고, SAR425899는 HdSQGTFTSDLSKQK(E-palm)ESKAAQDFIEWLKAGGPSSGAPPPS-NH₂이다. Asp-N을 사용한 HA-링커-SAR425899 분해의 C-말단 펩티드 분해 산물은 LC/MC에 의해 검출될 수 있었고, 적당한 수율을 나타냈다.
도 6은 SAR425899 전구약물 절단의 정량화를 개략적으로 나타낸다. 표지된 펩티드 내부 표준물질(IS)은 ¹³C¹⁵N-Lys 표지된 C-말단 펩티드를 의미한다. 1 mg/mL의 HA-링커 펩티드 200 μL를 37℃에서 24시간 동안 100 mM 중탄산암모늄 중 100 U/mL의 히알루로네이트 리아제 EC 4.2.2.1(Sigma-Aldrich) 30 μL를 사용하여 분해하였다. 후속적으로 Asp-N 분해를 수행하였다.
도 7a 내지 도 7f는 HA 분해 산물이 주요 매트릭스 효과를 생성하지 않았음을 보여준다. 도 7a는 C-말단 Asp-N 분해 산물이 추가된, HAase 1을 사용하여 분해된 HA를 나타낸다. 도 7b는 C-말단 Asp-N 분해 산물이 추가된, HAase 2를 사용하여 분해된 HA를 나타낸다. 도 7c는 완충액에서 Asp-N을 사용하여 분해된 무손상 SAR425899를 보여주는 대조군이다. 도 7d는 무손상 SAR425899 펩티드가 추가된, HAase 1을 사용하여 분해된 HA를 나타낸다. 이후 Asp-N 분해를 수행하였다. 도 7e는 무손상 SAR425899 펩티드가 추가된, HAase 2를 사용하여 분해된 HA를 나타낸다. 이후 Asp-N 분해를 수행하였다. 도 7f는 완충액에서 Asp-N을 사용하여 분해된 무손상 SAR425899를 보여주는 대조군이다. C-말단 펩티드로 스파이킹된 2개의 HAase 분해물과 대조군에 대해, 그리고 SAR425899로 스파이킹된 2개의 HAase 분해물과 Asp-N을 사용하여 분해된 대조군에 대해 동일한 C-말단 펩티드 강도 수준이 관찰되었다.
도 8a 및 도 8b는 HAase 2가 HAase 1과 비교하여 개선된 후속 Asp-N 분해를 생성했음을 보여준다. 도 8a는 HAase 1을 사용하여 분해된 후 Asp-N을 사용하여 분해된 HA-링커-SAR425899를 나타낸다. 도 8b는 HAase 2를 사용하여 분해된 후 Asp-N을 사용하여 분해된 HA-링커-SAR425899를 나타낸다. C-말단 Asp-N 분해 산물은 956.99 m/z에서의 피크로 표시된다.
도 9a 및 도 9b는 분해 산물의 정량화를 나타낸다. 도 9a는 10 ng/mL에서 10 μg/mL까지 표준 C-말단 펩티드 곡선에 대해 허용 가능한 선형성이 관찰되었음을 보여준다. 도 9b는 다중 반응 모니터링(MRM) 방법에 적합한, Asp-N 분해에서 유래된 C-말단 펩티드의 매우 양호한 단편화를 나타낸다.
도 10은 HAase/Asp-N 분해 완전성의 평가를 개략적으로 나타낸다. 프로세스 수율을 나타내는 C-말단 펩티드가 검출된다. 후속 가수분해에 의한 펩티드 방출을 나타내는 무손상 펩티드가 검출된다. 단지 0.05%의 무손상 단백질이 검출되어 100%에 가까운 완전한 의도된 분해 과정을 나타냈다.
도 11a 및 도 11b는 매트릭스에서 HAase를 사용하여 분해된 가교된 히알루론산(xHA), 및 완충액에서 HAase를 사용하여 분해된 xHA를 나타낸다. 도 11a는 미처리 데이터를 나타낸다. 도 11b는 매트릭스 중의 곡선 및 완충액 중의 곡선을 그래프로 나타낸 것이다. 우수한 선형성이 관찰되었다. 곡선 기울기는 서로 3.1%의 편차가 있었다. 따라서, 매트릭스 효과는 미미했으며, 완충액 곡선을 정량 분석에 적용할 수 있었다.
도 12a 및 도 12b는 내부 표준물질 강도가 매트릭스 효과를 나타내지 않았음을 보여준다. 완충액 곡선과 매트릭스 곡선에서 일관된 결과를 얻었다.
도 13a 및 도 13b는 HA-링커 펩티드의 삼중 정량화를 나타낸다. 양호한 재현성이 관찰되었다(CV는 7.4%). 희석 배수를 적용한 경우, 총 펩티드 비율은 18%인 것으로 확인되었다.
도 14는 xHA-L-P의 3개 배치에 대한 펩티드(P) 로딩량을 나타낸다(P는 SAR425899임). 매트릭스 효과 없이 우수한 선형성이 관찰되었다. 전체 프로세스 반복에 대한 양호한 재현성이 관찰되었다. 이러한 결과는 직교 NMR에 의해 얻어진 결과와 일치하였다.
도 15는 효소적 분해 속도의 상당한 증가를 가져온, 적당한 가수분해 조건을 사용하여 얻은 결과를 나타낸다. 펩티드의 가수분해 방출에 대한 대조군으로서 의도된 링커-펩티드는 높은 수준의 합성 불순물을 나타냈다.

본 발명은 폴리머에 로딩된 약물의 양을 구하기 위한 새로운 정량화 방법의 개발을 기반으로 한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 가교된 히알루론산-링커-펩티드 약물(xHA-L-P)의 샘플에 존재하는 히알루론산(HA)을 절단하여 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)의 이종 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. oHA-L-P는 이후 단백질분해에 의해 분해되어, 예를 들어 액체 크로마토그래피, 질량 분석, UV 흡광도, 형광 기반 분석 등과 같은, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있는 균질한 펩티드 분해 산물을 생성할 수 있다. 특히 예시적인 구현예에서, xHA-L-P(예를 들어, SAR425899 전구약물)("P"는 펩티드 약물 SAR425899이고, "L"은 자가절단 가교제이고, "xHA"는 가교된 히알루론산임)를 포함하는 조성물이 제공된다(도 2).

본원에서 사용되는 용어 "전구약물"은 약리학적 효과를 나타내기 전에 생체변환을 겪는 화합물을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 전구약물은 모분자의 바람직하지 않은 특성을 변경하거나 제거하기 위해 일시적인 방식으로 사용되는 특수 무독성 보호기를 함유하는 생물학적 활성 모이어티로 간주될 수 있다. 일반적인 전구약물은, 물리화학적 또는 약동학적 특성을 개선하고 일반적으로 가수분해 절단에 의해 생체 내에서 쉽게 제거될 수 있는 일시적인 담체 그룹과 주어진 활성 물질의 일시적 결합을 포함하는 담체-결합 전구약물; 활성화 기의 차폐를 해제한 후에만 담체 그룹의 절단이 유효해지는 캐스케이드 전구약물일 수 있다.

SAR425899와 같은 약물의 생체내 물리화학적 또는 약동학적 특성을 향상시키기 위해, 이러한 약물은 담체(예를 들어, xHA)와 접합될 수 있다. 약물이 담체 및/또는 링커에 일시적으로 결합되는 경우, 이러한 시스템은 일반적으로 담체-결합 전구약물로 지정된다. IUPAC에서 제공하는 정의에 따르면, 담체-결합 전구약물은, 물리화학적 또는 약동학적 특성을 개선하고 일반적으로 가수분해 절단에 의해 생체 내에서 쉽게 제거될 수 있는 일시적인 담체 그룹과 주어진 활성 물질의 일시적 결합을 포함하는 전구약물이다.

본원에 기재된 담체-결합 전구약물에 사용되는 링커는 임의의 알려진 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커, 예를 들어 효소 분해성 링커(예: 산-절단성 링커, 환원성 링커(이황화 링커), β-글루쿠로나이드 링커 등), 광-절단성 링커, 티오에테르 링커, 말레이미도카프로일 링커, 펩티드 링커(예: 디펩티드 링커), 가교제 등일 수 있다. 적합한 링커는 예를 들어 Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, Creative Biolabs 등과 같은 다양한 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다.

특정 예시적인 구현예에서, 본원에 기재된 담체-결합 전구약물에 사용되는 링커는 일시적(예를 들어, 자가절단성)이며, 이는 예를 들어 1시간 내지 3개월 범위의 반감기를 가지고 생리학적 조건에서 비효소적으로 가수분해에 의해 분해(절단)될 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 "생리학적 조건"은 약물이 방출되도록 의도된 신체의 특정 환경에 대한 온도, pH 등을 의미한다. 예를 들어, 혈장 내 방출은 약 37℃(예를 들어, 약 36℃ 내지 약 38℃)의 온도 및 7.35 내지 7.45의 pH에서 발생하고, 리소좀 내 방출은 약 37℃의 온도 및 약 6.5 내지 약 4.5의 pH에서 발생할 것이다.

특정 예시적인 구현예에서, 약물(예를 들어, 펩티드 약물)은 자가절단 링커를 통해 하이드로겔 담체에 일시적으로 결합된다(예를 들어, xHA 하이드로겔 담체). 용어 "하이드로겔 전구약물"과 "하이드로겔-결합 전구약물"은 하이드로겔에 일시적으로 결합된 생물학적 활성 제제의 전구약물을 지칭하며, 서로 동의어로 사용된다.

용어 "약물", "펩티드 약물", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 모이어티", "생물학적 활성 제제", "활성제" 등은 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하는(이에 한정되지 않음) 생물학적 유기체의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 특히, 본원에서 사용되는 생물학적 활성 분자는, 인간 또는 다른 동물의 질병 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방을 위한 임의의 물질, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 행복을 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함한다. 특정 예시적인 구현예에서, 용어 "약물", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 모이어티", "생물학적 활성 제제", "활성제" 등은 예를 들어 SAR425899와 같은 펩티드 약물을 지칭한다.

"유리 형태"의 약물은 하이드로겔 접합체 전구약물(예를 들어, SAR425899 전구약물)에서 방출된 후와 같이 변형되지 않은 약리학적 활성 형태의 약물(예를 들어, SAR425899)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "항암 치료제" 또는 "항암제"는 신생물 또는 종양 또는 암 세포의 성장 및/또는 증식에 유해하고 악성종양을 감소시키거나, 억제하거나, 파괴하는 작용을 할 수 있는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "세포증식억제제"는 세포 성장 및 증식을 억제하는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "세포독성 뉴클레오시드"는 내인성 뉴클레오시드를 모방함으로써 세포독성 효과를 발휘하는 핵염기 또는 뉴클레오시드 유사체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "튜불린 결합제"는 튜불린 시스템과 직접 결합하는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "호르몬"은 다세포 유기체의 분비선에서 생성되고 다른 기관을 표적으로 하여 순환계에 의해 운반되어 생리 및/또는 거동을 조절하는 신호전달 분자 부류의 임의의 구성원을 지칭한다. "호르몬 길항제"는 호르몬 수용체에 작용하는 특정 유형의 수용체 길항제이다.

본원에서 사용되는 어구 "항혈관신생제"는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관을 형성하는 혈관신생의 생리학적 과정을 억제하는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "효소 억제제"는 특정 효소의 기능을 억제하는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "유전자 조절인자"는 유전자의 전사에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 어구 "세포독성 치료제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 용어 "세포독성제"는 화학요법제, 효소, 항생제, 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소와 같은 독소(이의 단편 및/또는 변이체를 포함함), 및 아래에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 탁소이드, 빈카스, DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 소형 약물, 렙토마이신 유도체, 아루리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 전구약물, 토포이소머라제 II 억제제, DNA 알킬화제, 항튜불린제, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다.

본원에서 사용되는 어구 "제약상 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 및 항진균제 등을 지칭한다. 적합한 담체, 희석제, 및/또는 부형제의 예는 물, 아미노산, 식염수, 인산염 완충 식염수, 완충 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 숙신산염; 히스티딘, 아르기닌, 글리신, 프롤린, 글리실글리신과 같은 아미노산 및 유도체; 무기염 NaCl, 염화칼슘; 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 수크로스, 트레할로스, 만니톨과 같은 당 또는 다가알코올; 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188과 같은 계면활성제 등 중 하나 이상, 및 이들의 조합을 포함한다. 많은 경우에, 조성물에 당, 다가알코올, 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 적합할 것이며, 제형은 또한 트립타민과 같은 항산화제 및 Tween 20과 같은 안정화제를 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "히알루론산", "HA", 및 "히알루로난"은 상호교환적으로 사용되며, β-1-3 및 β-1-4 글리코시드 결합에 의해 결합된 d-글루쿠론산과 N-아세틸-d-글루코사민의 반복 이당류 단위(예: →4)-β-d-GlcpA-(1→3)-β-d-GlcpNAc-(1→)로 구성된 비황산염 선형 다당류를 지칭한다. HA는 다양한 분자량으로 나타난다. 고분자량 HA(HMWHA)는 약 1×10⁶ Da보다 크고, 저분자량 HA(LMWHA)는 약 0.8 내지 약 8×10⁵ Da이다. 올리고머 HA는 일반적으로 약 6×10³ Da 미만이다.

HA는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO), Novozymes(Blair, NE), 및 Stanford Chemicals(Lake Forest, CA)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. FDA 승인 HA는 Hyalovet(Boehringer Ingelheim Vetmedica, 동물용으로 승인), Hylira(Hawthorn), Hylase(ECR), Hylartin V(Zoetis, 동물용으로 승인), Hyvisc(Anika Therapeutics, 동물용으로 승인), Legend(Bayer Animal Health, 동물용으로 승인), NexHA(Vetoquinol, 동물용으로 승인), Orthovisc(DePuy Mitek), ProVisc(Alcon), Shellgell(Cytosol Opthalmics), Solesta(Salix), Supartz(Bioventus), Synacid(Intervet, 동물용으로 승인), Healon5(Abbott Medical Optics), Healon GV(Abbott), Healon Endocoat(Abbott Medical Optics), Healon(Abbott), Euflexxa(Ferring Pharmaceuticals), Equron(Zoetis, 동물용으로 승인), Coease(Abbott Medical Optics), Bionect(Cipher), Amvisc(Chiron), Synvisc(Genzyme), Gel-One(Zimmer Biomet), 및 Hyaglan(Fidia Pharma)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

기계적 특성을 개선하고 생체 내 HA의 지속 시간을 연장하기 위해, HA 폴리머 사슬을 3차원 네트워크로 공유 가교결합하여 하이드로겔을 형성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ågerup, Berg, & Åkermark (2005) BioDrugs 19:23; Edsman et al. (2011) Cartilage 2:384] 참조). 가교된 HA(xHA) 하이드로겔의 기계적 및 물리적 특성은 변형 및 가교의 정도에 따라 다르다(La Gatta, Schiraldi, Papa, & De Rosa (2011) Polymer Degradation and Stability 96:603).

본원에서 사용되는 용어 "가교결합제" 및 "가교제"는 공유 결합 및/또는 비공유 결합 중 적어도 하나를 통해 히알루론산과 반응할 수 있는 화학 제제를 포괄하는 것으로 의도된다. 비공유 결합의 비제한적인 예는 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 및 반데르발스 힘(분산 인력, 쌍극자-쌍극자 및 쌍극자 유도 상호작용)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "가교"는 가교결합제를 통해 공유 및/또는 비공유 결합된 2개 이상의 히알루론산 폴리머 사슬을 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 가교는 하나의 폴리머 사슬 내에서 또는 2개 이상의 사슬 사이에서 락톤, 무수물, 또는 에스테르 형성을 초래하는 분자간 또는 분자내 탈수와 구별된다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에서 분자내 가교도 일어날 수 있는 것으로 여겨진다. 가교결합제는 2개 이상의 분자(즉, 히알루론산 사슬) 사이에 공유 및/또는 비공유 결합을 생성하는 2개 이상의 작용기를 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, 가교결합제는 가교가 진행될 수 있도록 히알루론산의 작용기에 상보적인 작용기를 포함한다.

HA의 물리적 가교는 다양한 pH, 온도, 이온 강도 조건, 및 물리화학적 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용, 수소 결합, 전하 상호작용, 또는 입체복합화를 이용해 달성될 수 있다. 특히, 온도 반응성 하이드로겔은 다양한 용도에 대해 광범위하게 조사된 바 있다. 열감응성 HA 하이드로겔을 제조하기 위해 HA를 변형하는 데 자주 사용되는 일반적인 열겔화 폴리머는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 플루론산, 메틸셀루로스, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

HA를 가교하여 하이드로겔을 형성하는 방법은 -COOH 기를 변형하는 방법, -OH 기를 변형하는 방법, -NHCOCH₃ 기를 변형하는 방법, 및 Schiff-염기 가교, 디알데히드 히알루론산(CHO-HA), 티올 변형, Diels-Alder 반응, 및 효소 매개 결합을 이용한 화학적 가교 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

HA 하이드로겔의 가교 방법은 문헌[Kenne et al. (2013) Carb. Polymers 91:410]; 상기 Khunmanee의 문헌; 문헌[Hoare TR, Kohane DS. Hydrogels in drug delivery: progress and challenges. Polymer 2008; 49(8): 1993-2007]; 문헌[Gupta D, Tator CH, Shoichet MS. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials 2006; 27(11): 2370-2379]; 문헌[Fang, J-Y, Chen, J-P, Leu, Y-L. Temperature-sensitive hydrogels composed of chitosan and hyaluronic acid as injectable carriers for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm 2008; 68(3): 626-636]; 및 문헌[Ha DI, Lee SB, Chong MS, et al. Preparation of thermo-responsive and injectable hydrogels based on hyaluronic acid and poly(N-isopropylacrylamide) and their drug release behaviors. Macromol. Res. 2006; 14(1): 87-93]에 기재되어 있으며, 각 문헌은 모든 목적을 위해 전체가 본원에 참조로 포함된다.

가교된 HA는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 및 Stanford Chemicals(Lake Forest, CA)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다.

본원에서 사용되는 용어 "하이드로겔"은 많은 양의 수분을 흡수할 수 있는 3차원, 친수성 또는 양친매성 고분자 네트워크를 의미하는 것으로 의도된다. 네트워크는 동종중합체 또는 공중합체로 구성되며, 공유 화학적 또는 물리적(이온, 소수성 상호작용, 얽힘) 가교의 존재로 인해 불용성이다. 가교는 네트워크 구조 및 물리적 무결성을 제공한다. 하이드로겔은 물과의 열역학적 융화성을 나타내어 수성 매질에서 팽창할 수 있다. 네트워크의 사슬은 기공이 존재하고 이러한 기공의 상당 부분이 1 nm 내지 1000 nm의 치수가 되도록 연결된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 xHA를 절단하기 위해, 예를 들어 xHA-L-P에 존재하는 xHA를 절단하여 oHA-L-P를 형성하기 위해 하나 이상의 효소 및/또는 화합물을 사용한다.

xHA를 절단하는 데 적합한 효소는 박테리아 β-엔도글리코시다제, 박테리아 β-엑소글리코시다제(예를 들어, β-글루쿠로니다제, β-N-아세틸-헥소사미니다제 등), 진핵생물 β-엔도글리코시다제(예를 들어, 엔도-β-n-아세틸헥소사미니다제, β-엔도글루쿠로니다제 등), 진핵생물 β-엑소글리코시다제(예를 들어, β-엑소글루쿠로니다제, 엑소-β-N-아세틸글루코사미니다제 등), 히알루로니다제, 히알루로노글루코시다제 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

xHA를 절단하는 비효소적 방법은 산성 가수분해, 알칼리성 가수분해, 초음파 분해, 열적 분해, 산화제(예: 수퍼옥사이드 음이온 라디칼, 과산화수소, 일중항 산소, 하이드록실 라디칼, 일산화질소, 과산화아질산염 음이온, 차아염소산 음이온, 탄산염 라디칼 음이온, 이염화물 라디칼 음이온 등)에 의한 분해, 마이크로파 조사, UV 조사, γ-조사, Hg 램프 조사 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다(모든 목적을 위해 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Stern et al. (2007) Biotechnol. Adv. 25:537] 참조).

다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 xHA를 절단하기 위해, 예를 들어 xHA-L-P에 존재하는 xHA를 절단하여 oHA-L-P를 형성하기 위해 하나 이상의 히알루로노글루코시다제, 예를 들어 히알루로니다제(HAase)를 사용한다. 특정 예시적인 구현예에서, xHA를 절단하기 위해 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 HAase의 조합이 사용된다. 다른 구현예에서, xHA를 절단하기 위해 단일 HAase가 사용된다.

본원에서 사용되는 "히알루로니다제"는 HA의 분해를 촉매하기 위해 N-아세틸글루코사민과 글루쿠로네이트 사이의 (1->4)-결합(EC 3.2.1.35) 또는 (1->3)-결합(EC 3.2.1.36)을 절단하는 히알루로노글루코시다제를 지칭한다.

히알루로니다제에는 다음의 3가지 일반적인 부류가 있다. 1. 주요 최종 생성물로서 4당류 및 6당류를 갖는 엔도-베타-N-아세틸헥소사미니다제인 포유류형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35). 이들은 가수분해 활성 및 트랜스 글리코시다제 활성을 둘 다 가지고 있으며, 히알루로난 및 콘드로이틴 설페이트(CS), 특히 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있음; 2. 히알루로난을 분해하고 다양한 정도로 CS 및 DS를 분해하는 박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.99.1). 이들은 주로 이당류 최종 생성물을 생성하는 베타 제거 반응에 의해 작동하는 엔도-베타-N-아세틸헥소사미니다제임; 및 3. 거머리, 기타 기생충, 및 갑각류의 히알루로니다제(EC 3.2.1.36)는 베타 1-3 결합의 가수분해를 통해 4당류 및 6당류 최종 생성물을 생성하는 엔도-베타-글루쿠로니다제임.

포유류 히알루로니다제는 중성 활성 효소 및 산 활성 효소의 두 그룹으로 더 나눌 수 있다. 인간 게놈에는 6개의 히알루로니다제 유사 유전자 HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1, 및 PH20/SPAM1이 있다. HYALP1은 유사유전자이고, HYAL3은 어떠한 알려진 기질에 대해서도 효소 활성을 갖지 않는 것으로 나타났다. HYAL4는 콘드로이티나제이며 히알루로난에 대한 활성이 없다. HYAL1(LUCA1, MPS9, 및 NAT6로도 알려짐)은 원형적 산 활성 효소이고 PH20은 원형적 중성 활성 효소이다. HYAL1 및 HYAL2와 같은 산 활성 히알루로니다제는 중성 pH에서 촉매 활성이 없다. 예를 들어, HYAL1은 pH 4.5 초과에서 시험관내 촉매 활성이 없다(Frost et al. (1997) Anal. Biochemistry). HYAL2는 시험관내 비활성(specific activity)이 매우 낮은 산 활성 효소이다.

HYAL5는 첨체 반응 중에 방출되는 첨체-무손상 정자의 원형질 및 첨체 막에 위치하는, 마우스에서 원래 발견되는 HAase이다. HYAL6은 마우스에서 또한 발견된 HAase이다.

화학 등급 HAase는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO), Millipore Sigma(Burlington, MA), 및 Calzyme Laboratories(San Luis Obispo, CA)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. FDA 승인 HAase는 Amphadase(소 히알루로니다제; 신약 신청(NDA) No. 021665; Amphastar Pharmaceuticals), Hydase(소 히알루로니다제; NDA No. 021716; Akorn Inc.), Hylenex(재조합 인간 히알루로니다제; NDA No. 021859; Halozyme); Vitrase(양 히알루로니다제; NDA No. 021640; Bausch and Lomb), 및 Wydase(소 히알루로니다제; NDA No. 006343; Baxter Healthcare)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용하기에 적합한 추가적인 HAase는 월드와이드 웹 사이트: brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.2.1.35; 문헌[Karl Meyer and Maurice M. Rapport's chapter on "Hyaluronidases" Advances in Enzymology - and Related Areas of Molecular Biology pp 199-236 vol. 13 (doi.org/10.1002/9780470122587.ch6)]; 문헌[Stern and Jedrzejas Chem. Rev. 2006, 106, 818-839 Hyaluronidases: Their Genomics, Structures, and Mechanisms of Action]; 문헌[Stern and Jedrzejas, Chem. Rev. 2008, 108, 5061-5085]; 문헌[Yoshida et al (2013) KIAA1199, A deafness gene of unknown function, is a new hyaluronan binding protein involved in hyaluronan depolymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 5612-5617]; 문헌[Nagaoka et al. 2015 Regulation of Hyaluronan (HA) Metabolism Mediated by HYBID, doi: 10.1074/jbc.M115.673566 originally published online October 30, 2015]; 문헌[Yoshino et al. 2018 Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 505, Issue 1, 20 October 2018]; 문헌[Yamaguchi et al 2019 (Matrix Biol. (2019) 78-79, 139-146 TMEM2: A missing link in hyaluronan catabolism identified?)]에 기재되어 있으며, 각 문헌은 모든 목적을 위해 전체가 본원에 참조로 포함된다.

"히알루로니다제 리아제", "히알루로네이트 리아제", "HA 리아제", "EC 4.2.2.1", 또는 "HA 리아제 4.2.2.1"은 베타-D-GalNAc-(1->4)-베타-D-GlcA 결합에서 히알루로난 사슬을 절단하여 궁극적으로 다당류를 3-(4-데옥시-베타-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민으로 분해하는 히알루로노글루코시다제(즉, 박테리아 탄소-산소 리아제)를 지칭한다. 히알루로네이트 리아제는 박테리아 및 스트렙토마이세스로부터 단리될 수 있으며, N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기 사이의 베타 1,4-글리코시드 결합의 가수분해보다는 제거 반응을 촉매하므로 작용 방식이 다른 기원의 히알루로니다제와 다르다.

다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 펩티드를 절단하기 위해, 예를 들어 xHA-L-P에 존재하는 P를 절단하여 oHA-L-P를 형성하기 위해 하나 이상의 단백질분해 효소, 예를 들어 가수분해를 통해 펩티드 결합을 절단함으로써 단백질분해를 촉매하는 효소를 사용한다. 적합한 프로테아제는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파라긴 펩티드 리아제 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 활성 상태인 최적 pH에 의해 분류되는 적합한 프로테아제는 산 프로테아제, 중성 프로테아제, 및 염기성 프로테아제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 예시적인 구현예에서, 펩티드를 절단하기 위해 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 단백질분해 효소의 조합이 사용된다. 다른 구현예에서, 펩티드를 절단하기 위해 단일 단백질분해 효소가 사용된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 약물 또는 전구약물의 펩티드 분해 산물을 생성하기 위해, 유리 약물 또는 전구약물로 존재하는, 예를 들어 유리 SAR425899로 또는 SAR425899 전구약물로 존재하는 펩티드 약물을 절단하는 하나 이상의 효소 및/또는 화합물을 사용한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 약물 또는 전구약물의 펩티드 분해 산물을 생성하기 위해, 유리 약물 또는 전구약물로 존재하는, 예를 들어 유리 SAR425899로 또는 SAR425899 전구약물로 존재하는 펩티드 약물을 절단하는 하나 이상의 엔도프로테이나제를 사용한다. 적절한 엔도프로테이나제를 선택하는 데 사용된 기준은 다음과 같다: 1) 고도로 특이적인 단편을 가능한 한 적게 생성할 것; 2) 라이신에 결합된 글루타메이트-팔미테이트를 함유하지 않는 C-말단 단편을 생성할 것; 및 3) 상업적으로 이용 가능한 일반적인 효소를 사용할 것.

적합한 엔도프로테이나제는 Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 및 키모트립신을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 예시적인 구현예에서, 엔도프로테이나제 Asp-N이 본원에 기재된 방법에 사용된다. Sigma-Aldrich(St. Louis, MO), New England Biolabs(Ipswich, MA), Thermo Scientific(Lenexa, KS), 및 Promega(Fitchburg, WI)와 같은 회사에서 다양한 적합한 엔도프로테이나제를 상업적으로 입수할 수 있다.

특정 구현예에서, xHA 및/또는 oHA 분해 시간을 개선하기 위해(예를 들어, 감소시키기 위해) 압력 사이클러가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, xHA 및/또는 oHA 분해는 약 5 KPSI 내지 약 80 KPSI의 범위, 예를 들어 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 약 15 KPSI, 약 20 KPSI, 약 25 KPSI, 약 30 KPSI, 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 약 45 KPSI, 약 50 KPSI, 약 55 KPSI, 약 60 KPSI, 약 65 KPSI, 약 70 KPSI, 약 75 KPSI, 또는 약 80 KPSI의 사이클링 압력 하에 압력 사이클러에서 수행될 수 있다.

특정 구현예에서, 약 50 KPSI 미만, 약 40 KPSI 미만, 약 30 KPSI 미만, 또는 약 20 KPSI 미만의 압력에서 xHA를 분해하기 위해 하나 이상의 히알루로노글루코시다제(예를 들어, HAase)와 함께 압력 사이클러가 사용된다. 특정 구현예에서, 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI의 압력에서 xHA를 분해하기 위해 하나 이상의 히알루로노글루코시다제(예를 들어, HAase)와 함께 압력 사이클러가 사용된다. 특정 구현예에서, 약 10 KPSI의 압력에서 xHA를 분해하기 위해 하나 이상의 히알루로노글루코시다제(예를 들어, HAase)와 함께 압력 사이클러가 사용된다.

특정 구현예에서, 약 80 KPSI 미만, 약 70 KPSI 미만, 약 60 KPSI 미만, 또는 약 500 KPSI 미만의 압력에서 펩티드를 분해하기 위해 하나 이상의 효소(예를 들어, 엔도프로테이나제, 단백질분해 효소, Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 키모트립신 등)와 함께 압력 사이클러가 사용된다. 특정 구현예에서, 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI의 압력에서 펩티드를 분해하기 위해 하나 이상의 효소(예를 들어, 엔도프로테이나제, 단백질분해 효소, Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 키모트립신 등)와 함께 압력 사이클러가 사용된다. 특정 구현예에서, 약 40 KPSI의 압력에서 펩티드를 분해하기 위해 하나 이상의 효소(예를 들어, 엔도프로테이나제, 단백질분해 효소, Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 키모트립신 등)와 함께 압력 사이클러가 사용된다.

특정 구현예에서, 압력 사이클러는 비가압 조건에서의 분해에 비해 적어도 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간 이상만큼 펩티드, xHA, 및/또는 oHA 분해 시간을 단축한다.

본원에서 사용되는 "펩티드 분해 산물"은 효소에 의해 생성되고 무손상 펩티드 약물보다 작은, 펩티드 약물(예를 들어, 유리 약물 또는 전구약물)의 임의의 일부 또는 부분을 의미한다. 특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 50개 미만의 아미노산 길이, 예를 들어 약 2개 내지 약 100개 아미노산, 약 3개 내지 약 75개 아미노산, 약 2개 내지 약 50개 아미노산, 약 4개 내지 약 50개 아미노산, 약 5개 내지 약 40개 아미노산, 약 6개 내지 약 30개 아미노산, 또는 약 15개 내지 약 20개 아미노산의 길이, 또는 이들 범위 내 임의의 값 또는 하위 범위의 길이이다. 특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 31개, 약 32개, 약 33개, 약 34개, 약 35개, 약 36개, 약 37개, 약 38개, 약 39개, 약 40개, 약 41개, 약 42개, 약 43개, 약 44개, 약 45개, 약 46개, 약 47개, 약 48개, 약 49개, 약 50개, 약 51개, 약 52개, 약 53개, 약 54개, 약 55개, 약 56개, 약 57개, 약 58개, 약 59개, 약 60개, 약 61개, 약 61개, 약 63개, 약 64개, 약 65개, 약 66개, 약 67개, 약 68개, 약 69개, 약 70개, 약 71개, 약 72개, 약 73개, 약 74개, 약 75개, 약 76개, 약 77개, 약 78개, 약 79개, 약 80개, 약 81개, 약 82개, 약 83개, 약 84개, 약 85개, 약 86개, 약 87개, 약 88개, 약 89개, 약 90개, 약 91개, 약 92개, 약 93개, 약 94개, 약 95개, 약 96개, 약 97개, 약 98개, 약 99개, 또는 약 100개 아미노산의 길이이다.

특정 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 19개 아미노산의 길이이다. 다른 특정 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 1개, 약 2개, 또는 약 3개 아미노산의 길이이다. 또 다른 특정 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 4개 내지 약 50개 아미노산의 길이이다. 또 다른 특정 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 약 15개 내지 약 20개 아미노산의 길이이다.

특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 분해 산물은 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석(LC-HRMS), 나노-LC-MS-MS, 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 MS(HPLC-MS-MS), 나노 HPLC-MS-MS, 초고성능 탠덤 MS(UPLC-MS-MS), 나노 UPLC-MS-MS, 초고성능 탠덤 MS(UHPLC-MS-MS), 나노 UHPLC-MS-MS, 자외선(UV) 분광법, 형광 분광법 등과 같은 펩티드 식별 방법을 사용하여 검출된다.

특정 예시적인 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 크로마토그래피 방법, 예를 들어 액체 크로마토그래피와 같은 분리 공정을 이용한다. 일 구현예에 따르면, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 (i) 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), (ii) 음이온 교환, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피; (iv) 양이온 교환; (v) 양이온 교환 크로마토그래피; (vi) 이온쌍 역상 크로마토그래피; (vii) 크로마토그래피; (viii) 1차원 전기영동; (ix) 다차원 전기영동; (x) 크기 배제; (xi) 친화성; (xii) 역상 크로마토그래피; (xiii) 모세관 전기영동 크로마토그래피("CEC"); (xiv) 전기영동; (xv) 이온 이동도 분리; (xvi) 필드 비대칭 이온 이동도 분리 또는 분광법("FAIMS"); (xvii) 모세관 전기영동; 및 (xviii) 초임계 유체 크로마토그래피에 의해 수행된다.

펩티드 분해 산물의 양은 펩티드 전구체 이온, 하나 이상의 단편 이온, 및 체류 시간으로 구성된 다중 반응 모니터링(MRM) 전이의 측정에 의해 구해질 수 있다. 이 측정은 예를 들어 삼중 사중극자 기기에서 수행된다. 신호는 무손상 펩티드의 정확한 고분해능 질량 분광 분석과 체류 시간의 조합에 의해 얻을 수도 있다. 일반적으로 이러한 정량화 방법은 표지된 내부 표준물질 및 외부 합성 펩티드 검량선을 필요로 한다.

특정 예시적인 구현예에서, 펩티드 약물에 상응하는 표지된 펩티드, 예를 들어 SAR425899의 C-말단 Asp-N 분해 산물에 상응하는 표지된 C-말단 펩티드를 포함하는 내부 표준물질이 사용된다. 일반적으로 내부 표준물질은 알려진 펩티드 서열을 가지며 알려진 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, 표준물질은 하나 이상의 중동위원소, 예를 들어 ¹³C 또는 ¹⁵N으로 표지된다.

본원에 기재된 펩티드 분해 산물 프로파일링 방법은 하이드로겔 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 측정하는 데 유용하다. 본원에 기재된 방법은 또한 배치(batch) 간 재현성 평가를 수행하는 데 유용하다.

본원에 사용되는 "샘플"은 펩티드 약물을 (예를 들어, 전구약물 형태로) 함유하는 임의의 조성물을 지칭한다. 예시적인 샘플은 제약 조성물, 용해 매질 또는 방출 매질 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 샘플은 하이드로겔이다. 다른 구현예에서, 샘플은 수성이다.

본원에 기재된 정량화 방법에 사용하기 위한 샘플은 경구, 설하, 점막내, 피내, 피하, 정맥내, 근육내, 비경구, 또는 흡입 투여용 액체 제제와 같은 치료용 조성물일 수 있다.

다른 구현예에서, 샘플은 기질, 예컨대 나노입자, 캡슐, 필름 또는 정제, 또는 하이드로겔(예: xHA 하이드로겔)과 같은 겔을 포함할 것이다. 본원에 기재된 정량화 방법은 기질, 예컨대 나노입자 또는 캡슐, 또는 필름 또는 하이드로겔(예: xHA 하이드로겔) 내 펩티드 약물의 양을 정량화하는 데 유용하다. 방출은 기질(예를 들어, xHA 하이드로겔)의 내부, 또는 기질의 외부(예를 들어, 표면)로부터 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 방출 프로파일은 펩티드 약물의 완전한 방출의 수행 후, 일정 기간에 걸쳐 또는 다양한 배양 또는 용액 조건(예를 들어, 다양한 온도, pH 등)에서와 같은 제어 방출에 대해 분석함으로써 분석된다. 제어 방출 분석에서 방출된 펩티드 약물의 양은 일반적으로, 완전한 방출 조건에서 방출된 펩티드 약물의 양과 비교하여 분획 또는 백분율로 보고된다.

본원에서 사용되는 "용해 매질" 및 "방출 매질"은 시험관내 약물 방출 정보를 제공하는 데 사용되는 조성물을 지칭한다. 용해 매질 또는 방출 매질은 예를 들어 샘플에서 펩티드 약물의 방출 및/또는 안정성을 측정하기 위한 샘플의 품질 관리 테스트에 유용하다. 적합한 용해 매질 또는 방출 매질을 선택함에 있어, 펩티드 약물의 분석 목표 프로파일(예를 들어, 지연 방출, 일정 방출, 연장 방출 등) 및/또는 펩티드 약물 용해도 프로파일을 결정하는 것이 유용하다. 용해 매질 선택에 대한 검토는 문헌[Martin and Gray (Summer 2011) Journal of Validation Technology] 참조.

본원에서 사용되는 "방출 속도"는 시험관내 방출 테스트에서 펩티드 약물이 하이드로겔 전구약물 제형으로부터 주변 매질로 흐르는 속도를 의미한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 조성물을 적절한 시험관내 방출 매질에 현탁시켜 방출 테스트를 위한 조성물을 먼저 제조한다. 이는 일반적으로 원심분리에 의해 기질(예: 하이드로겔)을 펠릿화한 후 완충액을 교환하고 적당한 조건을 사용하여 기질을 재구성함으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 분석은 적절한 온도 제어된 장치에서 샘플을 37℃로 현탁함으로써 시작된다. 샘플은 일반적으로 다양한 시점에 제거된다.

본원에 개시된 구현예의 범위를 벗어남 없이 본원에 기재된 방법의 다른 적절한 변형 및 수정이 적절한 균등물을 사용하여 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예를 상세히 설명하였지만, 이는 예시의 목적으로만 포함되고 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이다.

실시예 I

전구약물 제형에 존재하는 펩티드 약물의 정량화

SAR425899는 글루카곤 및 GLP1 수용체를 표적으로 하는 이중 수용체 작용제이다. 빠른 청소율로 인해, 1일 1회 용량이 필요하다. 투약 빈도를 줄이기 위해, 1일 1회 SAR425899 펩티드 약물 후보(도 1)를 자가절단 링커를 통해 고분자 담체(가교된 히알루론산(xHA))에 결합시켜, 비활성 전구약물로부터의 활성 펩티드 약물의 느린 방출을 제공하였다(도 2). SAR425899 전구약물은 자가절단 가능한 링커(L)를 통해 SAR425899 리포펩티드(P)에 결합된 가교된 히알루론산(xHA)을 포함한다.

투약 및 품질 제어를 위해 하이드로겔의 펩티드 로딩량 측정이 필요하다. 가교된 히알루론산은 수성 환경에서 수백만 달톤의 하이드로겔을 형성한다. 용액 중 펩티드의 기본적 정량화에 일반적으로 적용되는 간단한 UV 측정은 이 분석에서 하이드로겔-링커-펩티드가 완전히 용해되어야 하기 때문에 하이드로겔에 적용될 수 없다. 링커가 자가절단되지만, 생리학적 조건에서의 완전한 절단은 설계상 매우 느리므로, 완전한 방출이 달성되었다는 확실성을 요구하는 분석적 정량화 방법에는 적합하지 않다.

이 분석 과제를 해결하고 펩티드 로딩량 측정을 가능하게 하기 위해, 중량/중량 백분율로 측정된 생체고분자 전구약물 중 펩티드 약물 로딩량의 정확한 정량화를 가능하게 하는 새로운 방법이 개발되었다. 원칙적으로 생체고분자-링커-펩티드 약물은 절단되거나 가수분해될 수 있는 모든 소분자(예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 약물에 적용될 수 있으며, 상기 방법은 생체고분자 함유 전구약물의 약물 로딩량 측정에 광범위하게 적용될 수 있다.

상기 방법은 이중 효소적 분해에 이은, 펩티드를 나타내는 분해 산물의 정량화를 기반으로 한다. 처음에, 가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P)를 가교된 히알루론산을 분해하는 효소를 사용하여 분해된다. 이어서, 단백질분해 효소를 적용하여 부착된 펩티드를 분해하고 단백질분해 분해 산물을 생성한다. 이어서, 펩티드를 나타내는 이러한 단백질분해 분해 산물을 정량화한다.

xHA-L-P를 칭량하고 완충액에 하이드로겔로서 부분적으로 용해시킨다. 하이드로겔은 효소에 의해 복수의 가용성 올리고머 히알루론산-링커-펩티드(oHA-L-P)로 분해된다. 생성된 oHA-L-P의 히알루론산 올리고머는 펩티드, 링커, 및 길이가 다른 히알루론산 올리고머로 구성된 이종 혼합물이다. 올리고머 히알루론산 불균질성은 정량화에 바람직하지 않으며, 이러한 이유로, 펩티드 약물 모이어티가 분해되어 균질한 19개 아미노산의 C-말단 펩티드 분해 산물 DFIE.....PPPS-NH₂(도 3)를 생성하는 제2 효소적(예를 들어, 단백질분해) 분해 단계가 도입된다. 이러한 C-말단 펩티드는 LC/HRMS를 사용하여 검출되고 정량화된다.

사전 히알루로노글루코시다제 처리 없이 Asp-N을 사용한 전구약물의 분해는, 추측하건대 가교된 히알루론산에 의한 Asp-N 활성의 입체 장애로 인해 낮은 수율의 C-말단 펩티드를 생성했다(도 5). 링커의 가수분해는 정량화를 위한 펩티드 방출 방법으로서 비실용적인 것으로 확인되었다.

HA 분해 방법이 개발되었다(도 6). 후속 엔도프로테이나제(예를 들어, Asp-N) 분해에 적합한 분해 조건을 사용하였다. HA를 분해할 수 있는 여러 효소(예를 들어, HAase)를 테스트하였다.

가교된 히알루론산의 분해는 유리 SAR425899의 Asp-N 분해를 방해하지 않았으며(도 7a 내지 도 7f), Asp-N 분해 C-말단 펩티드 분해 산물의 후속 수율을 상당히 증가시키는 것으로 입증되었다(도 8a 및 도 8b). 실제로, Asp-N 단백질분해 효소는 SAR425899 펩티드에 대해 거의 100% 분해 효율을 제공하는 것으로 확인되었다.

Asp-N은 완충액에서 HA 분해 산물의 존재하에 SAR425899를 완전히 분해하는 것으로 입증되었다(도 4). HA-링커-펩티드에 대해 삼중으로 HAase에 의한 분해를 수행하였고, 이어 Asp-N을 사용한 분해, 및 ??칭이 뒤따랐다. 37℃에서 24시간 동안 후속 가수분해를 수행하여 모든 결합된 무손상 펩티드를 방출하고, LC/MS 분석 전에 내부 표준물질(IS)을 첨가하였다. C-말단 펩티드에 대한 방출된 무손상 펩티드의 비는 0.0006이었다.

HAase를 사용하여 2 x 24 시간 동안 HA-링커-펩티드에 대해 삼중으로 이중 분해를 수행하였고, 이어 Asp-N을 사용한 분해, 및 ??칭이 뒤따랐다. 37℃에서 24시간 동안 후속 가수분해를 수행하여 모든 결합된 무손상 펩티드를 방출하고, LC/MS 분석 전에 IS를 첨가하였다. 무손상 펩티드는 관찰되지 않았다.

HAase를 사용하여 14일 동안 HA-링커-펩티드에 대해 삼중으로 분해를 수행하였고, 이어서 Asp-N을 사용한 분해가 뒤따랐다. 1일 동안의 분해와 비교하여 C-말단 펩티드의 증가가 관찰되지 않았지만, C-말단 펩티드 이성체가 일반 C-말단 펩티드보다 약간 일찍 용출되는 것으로 관찰되었다.

반응 산물의 LC/MS는 다음과 같이 수행하였다. 관찰된 흡착 문제를 방지하기 위해 25% 아세토니트릴(ACN), 0.1% 포름산(FA)에서 샘플 및 표준물질을 준비하였다. 50℃에서 작동되는 Luna Omega C18 컬럼 100 x 2.1 mm, 100 A(부품 번호 OOD-4742-AN)(S/N H16-168886)가 장착된 Accela 1250 LC 시스템에서 분리를 수행하였다.

이동상 A: 0.1% 포름산 수성 Mo; 이동상 B: ACN 0.1% 포름산; 유량은 400 μL/분이었다. 7분 내에 5%에서 50% B로 구배. 99% B 30초 동안 유지. 2.5분 동안 5% B에서 평형화. 20% B에서 시작하는 구배도 적용되었고 실행 가능했다.

양이온 모드에서 작동되는 표준 HESI ESI 소스를 사용하여 Orbitrap ELITE에 용출액을 도입하였다. m/z 400에서 60000의 Orbitrap 분해능이 적용되었고, m/z 범위는 350~1500이다.

남아 있는 무손상 펩티드 없이 모든 펩티드가 분해 산물로 변환된 것으로 확인되었다.

표 1. HAase-1을 사용하여 분해된 xHA, C-말단 펩티드(Asp-N 분해 산물에 상응) 추가, LC/MS에 의한 분석(exp #1); HAase-1을 사용하여 분해된 xHA, 전장 펩티드 추가, Asp-N을 사용한 분해, LC/MS에 의한 분석(exp #2); HAase-2를 사용하여 분해된 xHA, Asp-N 분해물에 상응하는 C-말단 펩티드 추가, LC/MS에 의한 분석(exp #3); xHA digested with HAase-2를 사용하여 분해된 xHA, 전장 펩티드 추가, Asp-N을 사용한 분해, LC/MS에 의한 분석(exp #4); 대조군 - 전장 펩티드 추가, Asp-N을 사용한 분해, LC/MS에 의한 분석(exp #5); HAase-1을 사용하여 분해된 xHA-링커-펩티드, 이어서 Asp-N을 사용하여 분해, LC/MS에 의한 분석(exp #6); HAase-2를 사용하여 분해된 xHA-링커-펩티드, 이어서 Asp-N을 사용하여 분해, LC/MS에 의한 분석(exp #7).

순차적 이중 분해 후 높은 C-말단 펩티드 수율이 여러 방법으로 입증되었다(도 10). 이중 분해가 진행되도록 한 다음, 비등으로 모든 효소 활성을 ??칭하였다. 이어서, 37℃에서 가수분해가 진행되도록 함으로써, 링커를 통해 히알루론산에 부착된 채로 남아 있을 수 있는 모든 무손상 펩티드를 방출하였다. 무손상 펩티드는 관찰되지 않거나 매우 소량으로 관찰되었으며, 이는 이중 분해가 모든 펩티드 약물 분자를 거의 완전히 분해했음을 나타낸다. 별도의 실험에서, 2주에 걸친 가수분해에 의한 방출 후 Asp-N 분해는 이중 분해 절차보다 많은 양의 C-말단 펩티드를 생성하지 않았다. 방법 검증의 일환으로, 18%의 펩티드 로딩량을 갖는 xHA-L-P 배치를 얻은 것으로 분석에 의해 나타났으며, 이는 약 20%의 로딩량을 나타내는 여러 로트에 대해 얻은 결과와 일치하였다(과학적 이론에 구애됨 없이, 20%보다 적은 양은 동결건조된 물질의 수분 흡수에 기인함). 동결건조된 하이드로겔이 수분을 흡수하면, 결과적으로 가중된 양은 수분 첨가로 인해 더 낮은 비율의 펩티드를 함유한다. 이로 인해 펩티드 비율은 20%에서 18%로 될 수 있다. 해결책은 가중된 물질이 습한 공기 조건에 노출되지 않도록 주의하는 것이다.

펩티드를 함유하지 않은 가교된 HA를 분해하고 매트릭스로서 사용하였다. 분해 산물(매트릭스)에 SAR 425899의 C-말단 Asp-N 펩티드 분해 산물에 상응하는 합성 비표지 C-말단 펩티드를 스파이킹하여 희석 시리즈를 생성하였다. 중동위원소 표지 C-말단 펩티드를 내부 표준물질로서 적용하였다. 해당 곡선을 25% ACN 및 0.1% 포름산 완충액에서 작성된 등가 곡선과 비교하였다.

기울기가 서로 15%(완충액 검량선을 수용하기 위한 최소 기준) 이내인지 확인하기 위해 곡선을 LC/MS 분석으로 분석하였다.

본원에 기재된 방법을 사용한 펩티드 정량화는 재현성이 있었다. HA-링커 펩티드의 3개 분취량을 칭량하고 HAase 및 Asp-N을 사용하여 분해하였다. 분해 산물을 25% ACN으로 조정한 후, 추가로 100배 희석한 다음, 중질 내부 표준물질(H-IS)을 첨가하여 2배 더 희석하였다. 2배 희석 단계를 사용하여 10 μg/mL에서 20 ng/mL까지 10-포인트 표준 곡선을 작성하였다. H-IS를 1:1 부피비로 첨가하여 곡선을 2배 더 희석하였다.

상기 방법은 매트릭스에 크게 영향을 받지 않았다(도 7a 내지 도 7f). 완충액에서의 C-말단 펩티드 검량선은 가교된 히알루론산(xHA)의 분해에 의해 생성된 추출된 매트릭스에서의 검량선과 동일한 기울기를 나타냈다(도 9a, 도 9b, 도 11a, 도 11b, 도 12a, 도 12b, 도 13a, 및 도 13b). 또한, xHA의 분해에 의해 생성된 매트릭스는 Asp-N 분해 효율을 방해하지 않는 것으로 확인되었다.

여러 상용 히알루로니다제를 테스트하였고, HAase 2가 더 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 기상 충돌 유도 단편화(CID) 처리를 받은 경우 C-말단 펩티드는 거의 완전한 단편 시리즈를 생성했고, 이러한 단편은 초기 작업에 적용된 고분해능 질량 분석 기반 방법(LC/HRMS에 의한 정량화)의 대안으로서 다중 반응 모니터링 정량화 방법 MRM(LC/MS MRM)을 개발하는 데 적합한 강도를 나타낸 것으로 입증되었다.

UV 또는 형광 검출의 전제 조건은 피분석물이 가용성이어야 한다는 것이다. xHA-L-P는 가용성이 아니다. 반면, oHA-L-P는 수용성이므로 UV 또는 형광 분석을 이용할 수 있다. 그러나, xHA-L-P로부터 oHA-L-P를 생성하는 데 필요한 분해는 혼합물에 히알루로노글루코시다제, 예를 들어 히알루로니다제 또는 HA 리아제를 도입한다. 히알루로노글루코시다제, 예를 들어 히알루로니다제 또는 HA 리아제는 자체적으로 UV를 흡수하는 단백질이다. 따라서, 히알루로노글루코시다제는 직접적인 UV 검출이 뒤따르는 첫 번째 분해 단계 후에 제거될 것이다. 이 방법은 규제된 분석 개발/제조 환경에 훨씬 더 적합하다.

xHA-L-P(P는 SAR425899임)의 3가지 개별 배치의 펩티드 로딩량을 측정하였다(도 14). 매트릭스 효과 없이 우수한 선형성을 얻었다. 전체 프로세스 반복에 대한 양호한 재현성이 달성되었고, 결과는 직교 NMR을 사용하여 얻은 결과와 일치하였다. 본원에 기재된 방법은 폭넓게 적용될 수 있으며, 제형 최적화를 보조하기 위해 적용되고 있다. 본원에 기재된 방법은 광범위한 폴리머 및 펩티드 약물을 사용하여 절단 가능한 링커 시나리오와 절단 불가능한 링커 시나리오 둘 다에 적용할 수 있다.

요약

HA-링커-SAR425899, SAR425899, 및 단편/분해 산물의 분석을 위한 LC/MS 방법을 개발하였다. 정량화를 위해 C-말단 펩티드 단편을 방출하기 위한 Asp-N을 사용한 SAR425899의 완전한 절단을 입증하였다. Asp-N에 의한 HA-링커-SAR425899의 초기 절단이 입증되었지만, 분해는 적당한 LC/MS 반응을 기반으로 불완전할 가능성이 높았다.

여러 HAase를 테스트하였고, HA 리아제(Sigma-Aldrich) EC 4.2.2.1은 Asp-N 분해 산물의 상당히 증가된 수율을 나타냈다. 동위원소 표지 C-말단 펩티드를 도입하였고, 접착 문제 해결 후 선형성 범위를 나타냈다. 분해 효율을 평가하는 실험을 수행하였다. 매트릭스 곡선 조사에서 매트릭스 효과는 나타나지 않았으며, 기울기 차이는 단지 3%로 양호한 매트릭스 곡선 대 완충액 곡선 정렬을 나타냈다. 삼중 칭량, 처리, 및 분석은 7.5% CV의 양호한 재현성을 보여주었다.

샘플 로트의 총 펩티드 비율은 18%인 것으로 확인되었다(샘플의 수분 함량은 특히 여러 번의 동결-해동(실온) 사이클 후에 알려지지 않음).

실시예 II

전구약물 제형에 존재하는 펩티드 약물의 정량화를 위한 압력 사이클러

전구약물의 수화 및 변성을 통해 신규 압력 사이클러 프로세스를 사용하여 SAR425899 전구약물에 로딩된 약물의 양을 측정하였다. 분해 반응은 AspN을 사용한 SAR425899 분해를 테스트하였다(1시간 내에 100% 반응이 달성됨). 압력 사이클러를 사용하여 xHA 분해 시간을 24시간에서 2시간으로 줄일 수 있는 조건을 확인하였다.

HAase는 매우 높은 압력에 민감한 것으로 나타났다. 따라서, 10 KPSI의 최대 압력을 적용하였고, 더 높은 효소 농도를 사용하였다. 최적화된 조건에서, 2시간 압력 사이클러-보조 분해에 대해 더 높은 oHA-L-P 산물 농도가 관찰되었다.

16개 샘플을 동시에 분석하였다(50~150 μL/샘플). 압력 증가/감소의 속도를 제어하였다. 압력 프로파일의 형태(사인파/방형파 등)를 관찰하였다. 샘플 온도는 내장된 전기 히터를 사용하여 제어하였다. 사용된 최대 압력은 40 KPSI였다. 일반적인 분석은 대기압부터 1시간의 지속 시간 동안 1 Hz 주기로 적용된 10~40 KPSI까지 진행되었다.

37℃ 분당 1회의 40 kPSI 압력 사이클에서의 oHA-L-P의 AspN 분해는 37℃ 대기압에서의 oHA-L-P의 12시간 AspN 분해만큼 효과적인 것으로 확인되었다. 모든 실험은 Pressure Biosciences Barocycler(Model 2320EXT, South Easton, MA)를 사용하여 수행하였다.

37℃에서 1시간 동안 1분 간격으로 40 KPSI 압력과 대기압 사이를 사이클링하는 AspN 분해는 37℃ 대기압에서의 12시간과 동일한 분해 효율을 제공하는 것으로 확인되었다. 유사하게, 2시간 동안 1분의 사이클 시간으로 10 KPSI 압력 사이의 사이클링을 사용하여 분해된 HAase(E.C. 4.2.2.1)는 관찰된 올리고머를 기반으로, 37℃ 대기압에서의 24시간 분해와 같은 결과를 야기했다.

일반적으로, 각각의 새로운 효소는 온도와 압력, 압력 프로파일, 가해지는 압력의 빈도 및 지속시간 측면에서 최적화된다.

샘플 순도 및 주요 불순물 측정을 분석하였다(도 15). 적절한 가수분해 조건에서 무손상 펩티드의 방출이 확인되었다(4℃, 14일 또는 37℃, 24시간). 두 방출 방법 모두 0.01% 이하로 LC/MS에 의한 불순물 분석에 충분한 물질을 생성하였다. 방출은 불순물을 생성하지 않는 것으로 입증되었다.

t=0 및 전체 방출 시간에서 링커-펩티드 대조군을 분석하였다. t=0에서 링커-펩티드에 대해 높은 수준의 불순물이 관찰되었다. 방출된 펩티드의 LC/MS를 분석하여 불순물 분석을 수행하였다.

전체 결론

LC/MS 방법 검증이 성공적으로 완료되고 구현되었다. 완전한 AspN 분해를 생성하기 위한 분해 조건이 입증되었다. 매트릭스는 문제가 되지 않는 것으로 나타났다. 방법의 양호한 재현성 및 선형성이 입증되었다.

LC/MS로 얻은 결과는 직교 NMR 방법으로 얻은 결과와 일치하였다. 2세대 압력 사이클러를 사용한 방법은 총 분석 시간을 크게 단축하였다. 이 방법은 기준 방법으로서 적용될 뿐만 아니라 제형 최적화 연구를 보조하기 위해 적용된다. 불순물의 방출 및 분석 방법이 확립되었고, 예를 들어 방출 조건이 확립되었고, 불순물이 검출되고 확인되었다.

균등물

본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특성을 벗어남 없이 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 구현예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 모든 면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해 표시되고, 이에 따라 청구범위의 균등물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변경은 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION <120> METHODS FOR QUANTIFYING DRUG CONCENTRATION IN A PRODRUG COMPOSITION <130> 705173: SA9-230PC <140> PCT/US2020/031605 <141> 2020-05-06 <150> 62/844,579 <151> 2019-05-07 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro 1 5 10 15 Pro Pro Ser <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Glu-palm <400> 2 Asp Leu Ser Lys Gln Lys Xaa Glu Ser Lys Ala Ala Gln 1 5 10

Claims

가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법으로서,
xHA-L-P 전구약물 제형의 샘플을
히알루로노글루코시다제와 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계;
oHA-L-P를 제2 효소와 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계; 및
펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 2개 아미노산 내지 약 100개 아미노산의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 3개 아미노산 내지 약 75개 아미노산의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 4개 아미노산 내지 약 50개 아미노산의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 6개 아미노산 내지 약 30개 아미노산의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 15개 아미노산 내지 약 20개 아미노산의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 19개 아미노산 또는 이들의 임의의 조합의 길이인, 방법.
제1항에 있어서, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석(LC-HRMS), 자외선(UV) 흡광도 및 형광 검출 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 히알루로노글루코시다제는 히알루로니다제(HAase)인, 방법.
제9항에 있어서, HAase는 HAase 1, HAase 2, HAase 3, HAase 4, HAase 5, 및 HAase 6로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제10항에 있어서, HAase는 HAase 1 또는 HAase 2인, 방법.
제11항에 있어서, HAase는 HAase 2인, 방법.
제1항에 있어서, 히알루로노글루코시다제는 히알루로네이트(HA) 리아제 EC 4.2.2.1인, 방법.
제1항에 있어서, oHA-L-P는 엔도프로테이나제와 접촉되는, 방법.
제14항에 있어서, 엔도프로테이나제는 Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제15항에 있어서, 엔도프로테이나제는 Asp-N인, 방법.
제1항에 있어서, 내부 표준물질의 사용을 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 내부 표준물질은 하나 이상의 중동위원소를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 존재하는 약물의 양은 검량선을 사용하여 구해지는, 방법.
제1항에 있어서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 히알루로노글루코시다제와 접촉되는, 방법.
제20항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제21항에 있어서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI인, 방법.
제1항에 있어서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 제2 효소와 접촉되는, 방법.
제23항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제24항에 있어서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI인, 방법.
가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법으로서,
xHA-L-P 전구약물 제형의 샘플을 히알루로노글루코시다제와 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계;
oHA-L-P를 엔도프로테이나제와 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계; 및
펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석(LC-HRMS), 자외선(UV) 흡광도 및 형광 검출 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는, 방법.
제26항에 있어서, 히알루로노글루코시다제는 HAase 1 또는 HAase 2인, 방법.
제26항에 있어서, 히알루로노글루코시다제는 HA 리아제 EC 4.2.2.1인, 방법.
제26항에 있어서, 엔도프로테이나제는 Glu-C, Asp-N, Lys-C, Arg-C, 트립신, 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제30항에 있어서, 엔도프로테이나제는 Asp-N인, 방법.
제26항에 있어서, 내부 표준물질의 사용을 추가로 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 내부 표준물질은 하나 이상의 중동위원소를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 존재하는 약물의 양은 검량선을 사용하여 구해지는, 방법.
제26항에 있어서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 히알루로노글루코시다제와 접촉되는, 방법.
제35항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제36항에 있어서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI인, 방법.
제26항에 있어서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 엔도프로테이나제와 접촉되는, 방법.
제38항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제39항에 있어서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI인, 방법.
가교된 히알루론산-링커-펩티드(xHA-L-P) 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 방법으로서,
xHA-L-P 전구약물 제형의 샘플을 HA 리아제 EC 4.2.2.1과 접촉시켜 올리고머 히알루론산-링커-펩티드 약물(oHA-L-P)을 생성하는 단계;
oHA-L-P를 Asp-N과 접촉시켜 약물의 펩티드 분해 산물을 생성하는 단계; 및
펩티드 분해 산물을 검출하여 xHA-L-P 전구약물 제형에 존재하는 약물의 양을 구하는 단계를 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 펩티드 분해 산물은 약 2개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 3개 아미노산 내지 약 75개 아미노산, 약 4개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 6개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 15개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 또는 약 19개 아미노산의 길이인, 방법.
제41항에 있어서, 펩티드 분해 산물을 검출하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석(LC-HRMS), 자외선(UV) 흡광도 및 형광 검출 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는, 방법.
제41항에 있어서, 내부 표준물질의 사용을 추가로 포함하는 방법.
제44항에 있어서, 내부 표준물질은 하나 이상의 중동위원소를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 존재하는 약물의 양은 검량선을 사용하여 구해지는, 방법.
제41항에 있어서, xHA-L-P는 압력 사이클러에서 HA 리아제 EC 4.2.2.1과 접촉되는, 방법.
제47항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제48항에 있어서, 압력은 약 5 KPSI, 약 10 KPSI, 또는 약 15 KPSI인, 방법.
제41항에 있어서, oHA-L-P는 압력 사이클러에서 Asp-N과 접촉되는, 방법.
제50항에 있어서, 압력 사이클러의 압력은 대기압보다 높은, 방법.
제51항에 있어서, 압력은 약 35 KPSI, 약 40 KPSI, 또는 약 45 KPSI인, 방법.