相關申請案之交叉參考
本申請案主張2016年3月30日提出申請之美國專利臨時申請案第62/315,556號之益處，其揭示內容之全部內容以引用方式併入本文中且可視為本發明之一部分。 各個態樣現將更全面闡述於下文中。然而，該等態樣可以許多不同形式來體現且不應解釋為限於本文所陳述之實施例；而是，提供該等實施例，從而本發明將較為全面及完整，且將完全向熟習此項技術者傳達其範圍。 在本發明通篇中，參考各種專利、專利申請案及公開案。該等專利、專利申請案及公開案之揭示內容之全部內容以引用方式併入本發明中以更全面地闡述熟習此項技術者已知之在本發明日期之最新技術。在所引用之專利、專利申請案及公開案與本發明之間存在任何不一致之情況下，以本發明為準。
I. 定義
在提供值範圍之情形下，該範圍之上限與下限之間之每一插入值及該所陳述範圍中之任一其他陳述或插入值預計涵蓋於本發明內。舉例而言，若陳述1 μm至8 μm之範圍，則預計亦明確揭示2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm及7 μm以及大於或等於1 μm之值範圍及小於或等於8 μm之值範圍。 除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指示物。因此，舉例而言，所提及之「聚合物」包含單一聚合物以及兩種或更多種相同或不同聚合物，所提及之「賦形劑」包含單一賦形劑以及兩種或更多種相同或不同賦形劑，及諸如此類。 除非本發明之上下文另外指示或與詮釋不一致，否則在緊接於數值前面時，詞語「約」意指加或減該值之10%，舉例而言，「約50」意指45至55，「約25,000」意指22,500至27,500，等等。舉例而言，數值清單諸如「約49、約50、約55」，「約50」意指延伸至小於前值與後值之間之間隔之一半之範圍，例如大於49.5至小於52.5。另外，片語「小於約」某一值或「大於約」某一值應根據本文所提供術語「約」之定義來理解。 「實質上」或「基本上」意指全然或完全，例如80%-95%或更大之某一給定量，例如至少85%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或更大百分比之重量或體積或任一其他量測參數。「實質上不含」意指幾乎全然或完全不存在某一給定量，例如以小於某一給定量之約1%至約20%之含量存在，例如小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%、小於0.5%、小於0.1%或更小百分比之重量或體積或任一其他量測參數。在一些實施例中，「實質上不含」意指以小於或等於醫藥組合物之1-5重量%之含量存在。
II. 概述
本文提供用於治療及診斷傷口及管控傷口之組合物及系統，其中該組合物在使用時原位指示傷口中之升高酶濃度之存在。 如本文中所使用，「傷口」係指組織結構之連續性或完整性之物理破壞。「傷口癒合」係指恢復組織完整性。應理解，此可係指部分或完全恢復組織完整性。傷口治療由此係指一或多個與傷口癒合過程有關之階段或過程之促進、改良、進展、加速或另外之增進。 傷口可為急性或慢性。慢性傷口(包含受壓潰瘍、腿部靜脈潰瘍及糖尿病性足潰瘍)可簡要闡述為不能癒合之傷口。儘管慢性傷口之確切分子發病機制尚未完全理解，但可公認為多因素性。因急性損傷期間之定居細胞及移動細胞之正常反應變得受損，故該等傷口在特徵在於延長之發炎性反應、缺陷性傷口細胞外基質(ECM)重塑及重上皮化失敗。 傷口可為任一內部傷口(例如其中皮膚之外部結構完整性得以維持，例如在擦傷或內部潰瘍中)或外部傷口(尤其係皮膚傷口)，且因此組織可為任一內部或外部體組織。在一實施例中，組織係皮膚(例如人類皮膚)，亦即，傷口係皮膚傷口(例如真皮或表皮傷口)。 人類皮膚係由兩個不同層-表皮及真皮(在其下面係皮下組織)構成。皮膚之主要功能係保護內部器官及組織免於外部創傷及病原性感染、提供感覺及溫度調節。大部分哺乳動物之皮膚組織在結構上類似。 皮膚之最外層-表皮大約厚0.04 mm，無血管，包括4個細胞類型(角質細胞、黑素細胞、朗格漢斯細胞(Langerhans cell)及默克爾細胞(Merkel cell))，且分級至若干個上皮細胞層中。表皮之最內上皮層係基底膜，基底膜與真皮直接接觸，且使表皮錨向真皮。所有發生於皮膚中之上皮細胞分裂皆發生於基底膜處。在細胞分裂之後，上皮細胞朝向表皮之外表面遷移。在此遷移期間，細胞發生稱為角質化之過程，藉此損失細胞核且細胞轉變成堅韌、扁平、抗性非活性細胞。在細胞到達最外表皮結構-角質層(幫助防止基底組織之去水之乾燥、防水鱗狀細胞層)時，完成遷移。此死亡上皮細胞層連續脫落且由自基底膜移動至表面之角質化細胞代替。因表皮上皮無血管，故基底膜之營養物供應依賴於真皮。 真皮係向表皮供應營養物之高度血管化組織層。另外，真皮含有神經末梢、淋巴管、膠原蛋白及結締組織。真皮大約厚0.5 mm且主要由纖維母細胞及巨噬球構成。該等細胞類型主要負責膠原之產生及維持，膠原係發現於所有動物結締組織(包含皮膚)中之蛋白質。膠原主要負責皮膚之反彈、彈性性質。發現於富膠原真皮下方之皮下組織提供皮膚移動性、隔絕作用、卡路里儲存且提供血液至其上方組織。 傷口可分類成以下兩個一般種類中之一種：部分皮層傷口或全皮層傷口。部分皮層傷口限於表皮及表面真皮且並不損害真皮血管。全皮層傷口涉及破壞真皮且延伸至較深組織層，從而涉及破壞真皮血管。部分皮層傷口之癒合係藉由上皮組織之簡單再生來發生。全皮層傷口中之傷口癒合較為複雜。本文所涵蓋之皮膚傷口可為部分皮層傷口或全皮層傷口。 本文所涵蓋之傷口包含割傷及撕裂傷、手術切口或傷口、穿刺、擦傷、抓傷、加壓傷口、擦破、摩擦傷口(例如尿布疹、摩擦水泡)、褥瘡潰瘍(例如受壓潰瘍或褥瘡)；熱效應傷口(來自冷源及熱源(直接或經由傳導、對流或輻射)及電源之燒傷)、化學傷口(例如酸或鹼燒傷)或病原性感染(例如病毒、細菌或真菌) (包含開口或完整痂)、皮膚出疹、創痂及痤瘡、潰瘍、慢性傷口(包含糖尿病相關傷口，例如小腿及足潰瘍、腿部靜脈潰瘍及受壓潰瘍)、皮膚移植物(graft/transplant)供體及接受位點、免疫反應病狀(例如牛皮癬及濕疹)、胃或腸潰瘍、口腔傷口(包含口腔潰瘍)、軟骨或骨損害、切除術傷口及角膜病灶。
化學實體及其組合物
本文所闡述之實施例提供可用於診斷及/或治療慢性傷口之化學實體。將如本文所闡述之化學實體及其組合用於檢測哺乳動物傷口中一或多種酶之濃度之方法中。在一些實施例中，將如本文所闡述之化學實體及其組合物用於診斷哺乳動物中之慢性傷口之方法中。在一些實施例中，將本文所闡述之化學實體及其組合物用於診斷哺乳動物中之感染傷口之方法中。在其他實施例中，將本文所闡述之化學實體及其組合物用於治療哺乳動物中之傷口之方法中。在其他實施例中，將本文所闡述之化學實體及其組合物用於治療哺乳動物中之感染或慢性傷口之方法中。 在一實施例中，本文提供能夠檢測來自體液之酶活性之化學實體，該化學實體包括：錨區域(A)及指示劑區域(I)。在此實施例下，化學實體具有基本化學結構A-I (式I)，其中A係錨區域且I係指示劑區域。 在一些實施例中，錨區域(A)經由酶識別位點(S)與指示劑區域(I)締合。在此實施例下，酶識別位點係容許結合至酶之結構或模體。 在一實施例中，酶識別位點(S)天然存在於錨區域中。在另一實施例中，經由化學修飾將酶識別位點(S)引入錨區域中。或者，酶識別位點(S)可天然存在於指示劑區域(I)中或經由一或多種化學修飾以合成方式引入指示劑區域(I)中。 在一實施例中，式I化學實體包括與指示劑(I)共價或非共價締合之錨(A)。特定而言，錨區域(A)與指示劑區域(I)之間之締合係經由共價相互作用來調介。如業內所理解，共價鍵涉及共用鍵結原子之間之電子。與之相比，非共價鍵可包含(例如)離子相互作用、靜電相互作用、氫鍵結相互作用、生理化學相互作用、凡得瓦力(van der Waal force)、路易斯酸(Lewis-acid)/路易斯鹼(Lewis-base)相互作用或其組合。 在一實施例中，錨A經由共價相互作用與指示劑I締合以形成識別位點S。在另一實施例中，錨A經由並非識別位點S之一部分之共價相互作用與指示劑I締合。 在一些實施例中，化學實體進一步包括酶不穩定或酶反應性區域(R)。在一實施例中，反應性區域(R)係錨區域之一部分。在另一實施例中，反應性區域(R)係指示劑區域(I)之一部分。另外，反應性區域(R)係酶識別位點(S)之一部分。 在一實施例中，反應性區域(R)與一或多種選自由以下組成之群之靶酶相互作用：彈性蛋白酶、溶菌酶、細胞自溶酶G及髓過氧化物酶或其組合。 錨區域(A) 在式I化學實體之一些實施例中，錨區域包括係多醣、纖維素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、肽聚醣或幾丁聚醣或其單體、其衍生物、其混合物或組合之化合物。 在一實施例中，錨A包括係幾丁聚醣或其單體、其衍生物、其混合物或組合之化合物。非共價鍵可包含(例如)離子相互作用、靜電相互作用、氫鍵結胺基乙基(inetyl)-D-葡萄糖胺(乙醯化單元)。因此，幾丁聚醣單體可包括D-葡萄糖胺及N-乙醯基-D-葡萄糖胺。在另一實施例中，幾丁聚醣可包括至少2、至少3、至少4、至少5或更多個D-葡萄糖胺或N-乙醯基-D-葡萄糖胺或其組合之單元。通常藉由使用鹼性物質(例如氫氧化鈉)處理幾丁質且視情況水解個別單體單元之間之醣苷鍵聯來製造幾丁聚醣(包含其較短片段)。 在另一實施例中，錨A包括幾丁聚醣衍生物。實例性幾丁聚醣或幾丁聚醣衍生物包含幾丁聚醣鹽、水溶性幾丁聚醣、水溶性、隨機取代之部分N-、部分O-乙醯化幾丁聚醣、幾丁聚醣寡醣、羧甲基幾丁聚醣及羥基烷基幾丁聚醣。羥基烷基，幾丁聚醣之羥基烷基取代基及羧甲基幾丁聚醣之羧甲基取代基可附接至幾丁質或幾丁聚醣環亞單元上之任一懸垂氮或氧基團。代表性羥基烷基幾丁聚醣包含(但不限於)羥乙基幾丁聚醣(亦稱為乙二醇幾丁聚醣)、羥丙基幾丁聚醣、二羥基丙基幾丁聚醣、羥丁基幾丁聚醣及二羥基丁基幾丁聚醣。 在一實施例中，幾丁聚醣衍生物係隨機取代之部分N-、部分O-乙醯化幾丁聚醣。乙醯化幾丁聚醣衍生物通常藉由或乙醯化程度來定義。如業內所理解，乙醯化程度(DA)代表N-乙醯基-d-葡萄糖胺單元相對於幾丁聚醣分子中之總單元數之比例。參見Chatelet等人，
Biomaterials
, 22(3):261-8, 2001。術語「去乙醯化程度」意指水可溶性幾丁聚醣或幾丁聚醣衍生物上之游離胺基之百分比。可自去乙醯化值來計算N-乙醯化百分比。術語N-乙醯化或O-乙醯化亦稱為N或O上之C(O)CH
3
取代程度。如業內所理解，有時將DA值大於50% N-乙醯化之幾丁聚醣衍生物闡述為幾丁質。然而，術語「幾丁聚醣」在本發明通篇中用於包含幾丁聚醣且(若N-乙醯化大於50%)包含幾丁質。參見美國專利第7,683,039號。 在一實施例中，幾丁聚醣衍生物之DA至少為約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大%，例如介於約45%至95%之間、尤其介於約60%至約80%之間。特定而言，幾丁聚醣至少48%去乙醯化、尤其至少75%去乙醯化。 在一實施例中，本文所用之「幾丁聚醣衍生物」包含幾丁聚醣之鹽、醯胺、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、鹼、溶劑合物、水合物或前藥。熟習此項技術者可易於使用用於該衍生之已知方法來製備該等衍生物。在某些實施例中，可將衍生物投與動物或人類且並無實質性毒性效應，且該等衍生物係醫藥上活性或前藥。幾丁聚醣衍生物之代表性類型闡述於美國專利第9,012,429號、第5,773,608號及第3,911,116號中。 在另一實施例中，衍生物係聚合化合物之鹽，例如Li
+
、Na
+
、K
+
、Rb
+
、Mg
2+
、Ca
2+
、Sr
2+
或Ba
2+
、較佳地Na
+
、K
+
、Mg
2+
、Ca
2+
之鹽。業內已知幾丁質及幾丁聚醣之鹽(例如鈉或鈣鹽)。參見美國專利第5,599,916號。 在一些實施例中，錨化合物衍生物係鹵化錨化合物，例如鹵化多醣、鹵化纖維素、鹵化聚丙烯酸酯、鹵化聚乙烯亞胺、鹵化聚丙烯醯胺、鹵化肽聚醣或鹵化幾丁聚醣或其單體(例如鹵化D-葡萄糖胺及/或鹵化N-乙醯基-D-葡萄糖胺)。鹵素係選自由以下組成之群：Cl、Br、I；特定而言，鹵素係Cl。 在一些實施例中，衍生物化合物係錨化合物之異構體。術語「異構體」包含具有相同式但分子中之原子具有不同配置之化合物。在實施例中，化合物之異構體係化合物之「互變異構體」或「立體異構體」。術語「立體異構體」係指一或多個立體中心之對掌性有所不同之化合物。立體異構體包含對映異構體及非對映異構體。術語「互變異構體」係指質子位置有所不同之化合物之交替形式(例如烯醇-酮及亞胺-烯胺互變異構體)或錨化合物之互變異構體形式。 在一些實施例中，錨化合物可含有一或多種上文所提及之化合物之組合或混合物。術語「組合」包含含有一種以上組分之化合物，該等組分可彼此偶聯或不偶聯。在一實施例中，錨化合物包括一或多種上文所提及之化合物(其彼此(例如)經由共價或非共價相互作用偶聯)組合。作為一特定實例，錨可包括幾丁聚醣及氧化纖維素之組合。參見美國專利申請案公開案第2014/0045761號。 在一些實施例中，該等化合物包含上文所提及之聚合化合物之混合物。術語「混合物」係指混合至一起且不發生失去個別性質之反應之兩種或更多種物質。舉例而言，化合物A及化合物B之混合物可含有任一重量比率之化合物A及化合物B，從而混合物之總重量總計為100%，例如99:1重量比率之化合物A/化合物B或1:99重量比率之化合物A/化合物B。典型混合物可含有約2、3、4、5或更多種上文所提及之聚合物化合物。 在一些實施例中，錨A進一步包括離子化學基團、具有親水性部分之材料或具有疏水性部分之材料(例如脂肪族鏈或脂肪族醇)。在錨包括離子化學基團之實施例中，離子化學基團可帶正電或帶負電。在一些實施例中，錨區域包括用於共價附接至載體材料之反應性部分，例如光活性疊氮苯或環氧化物基團。參見美國專利申請案公開案第2016/0159777號。 業內已知將反應性基團引入幾丁聚醣及/或其他醣苷化合物(例如多醣、纖維素、聚醣等)中之方法。舉例而言，美國專利第7,125,968號揭示官能化幾丁聚醣衍生物，該等官能化幾丁聚醣衍生物包括幾丁質/幾丁聚醣且其中納入碳水化合物、光反應性官能基、兩親性基團(例如聚氧乙烯烷基醚)及葡糖胺基聚醣中之至少一者。可使用該等技術來衍生各種類型之其他錨化合物。 特定而言，錨區域A包括幾丁聚醣、N-乙醯基幾丁聚醣；寡-β-D-1,4-葡萄糖胺；乙醯基-D-吡喃葡萄糖苷；N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)；葡萄糖胺二聚體(GlcNAc)
2
；乙醯基-幾丁聚醣；幾丁二醣八乙酸酯；包括結構(GlcNAc)
n
之幾丁寡聚物，其中n=4、5或6；幾丁寡醣；2-乙醯胺基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖苷；2-去氧-3,4,6-三-O-乙醯基-D-吡喃葡萄糖苷；或其組合。 指示劑 在一些實施例中，化學實體包括一或多種指示劑，例如至少1、至少2、至少3、至少4或更多種指示劑。該等組合物可包含(例如)複數個偶聯至相同凝膠聚合物或不同凝膠聚合物之受質。 在某些實施例中，指示劑係標記。本文所用之術語「標記」係指任一附接至表位結合劑或其他受質材料之物質，其中該物質可藉由檢測方法檢測。適宜標記之非限制性實例包含發光分子、化學發光分子、螢光染料、螢光淬滅劑、有色分子、放射性同位素、閃爍體、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、蛋白質A、蛋白質G、抗體或其片段、多組胺酸、Ni2+、Flag標籤、myc標籤、重金屬及酶(包含鹼性磷酸酶、過氧化物酶及螢光素酶)。將標記附接至錨化合物之方法闡述於實例中。 在某些實施例中，使用係可檢測標記之標記來標記指示劑。可檢測標記係可直接或間接確定存在之部分。通常，標記之檢測涉及產生可檢測信號(例如能量發射)。標記可為化學、肽或核酸性質之標記，但並不限於此。所用標記之性質取決於各種因素，包含所實施分析之性質、能量來源及所用檢測器之類型及聚合物、分析物、探針與一級及二級分析物特異性結合配偶體之類型。 在一特定實施例中，標記在空間上且以化學方式與其所結合之組份(例如錨區域)相容。特定而言，標記之形狀及大小不阻礙酶識別位點(S)及/或酶反應性區域(R)。 在一實施例中，指示劑或其中附接至錨之模體係醣苷酶之受質。特定而言，指示劑或其中附接至錨之模體係用於溶菌酶之受質。 在另一實施例中，指示劑或其中附接至錨之模體係用於選自由以下組成之群之蛋白酶之受質：彈性蛋白酶、細胞自溶酶G或髓過氧化物酶(MAO)或其組合。 在另一實施例中，指示劑或其中附接至錨之模體係醣苷酶(其係溶菌酶)及選自由以下組成之群之蛋白酶之受質：彈性蛋白酶、細胞自溶酶G或髓過氧化物酶(MAO)或其組合。 在一實施例中，指示劑(I)或其中附接至錨之模體係過氧化物酶受質、芳基胺、胺基酚、胺基苯基醚、吲哚基、中性染料、帶電染料、奈米顆粒或膠質金顆粒。 在一些實施例中，指示劑(I)或其中附接至錨之模體係過氧化物酶受質。在一些實施例中，過氧化物酶受質係選自對胺基苯酚
、
ABTS (2,2胺基苯酚，ABTS (strate.在一些實施例中係酸)二銨鹽)、3,3’-二胺基聯苯胺、3,4二胺基苯甲酸、DCPIP、
N,N
-二甲基-對苯二胺、鄰聯茴香胺、對苯二胺、4-氯-1-萘酚、鄰苯二胺、
N
-(4-胺基丁基)-
N
-乙基異胺基苯二醯肼、3-胺基-9-乙基咔唑、4-胺基鄰苯二甲醯肼、5-胺基水楊酸、2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚基、靛、堅牢藍RR (Fast Blue RR)、4-氯-7-硝基苯并呋呫。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係芳基胺。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係胺基酚。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係胺基酚醚。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係吲哚基。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係中性染料。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係帶電染料。在一些實施例中，帶電染料係選自雷瑪唑亮藍、甲苯胺藍、活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5及活性橙16或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係雷瑪唑亮藍或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係甲苯胺藍。在一些實施例中，帶電染料係活性黑5或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係活性紫5或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係活性橙16或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係基於二氯三嗪之反應性染料，例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10。在一些實施例中，基於二氯三嗪之反應性染料表現為黑色。 在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係含有磺醯基乙基-硫酸氫酯反應性基團之反應性染料。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5或活性橙16。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5。在一些實施例中，反應性染料係雷瑪唑亮藍。在一些實施例中，反應性染料係活性紫5。在一些實施例中，反應性染料係活性橙16。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5、雷瑪唑亮藍或活性紫5。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5或雷瑪唑亮藍。 在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係奈米顆粒。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係膠質金顆粒。在一些實施例中，指示劑(I)或附接至其之標記係帶電染料、吲哚衍生物或發光胺衍生物。 特定而言，指示劑或其中附接至錨之模體包括含有磺醯基乙基-硫酸氫酯反應性基團之染料，例如活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5或活性橙16或其組合；或含有二氯三嗪反應性基團之染料，例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10或其組合。 錨-指示劑偶聯物 在各種酶中，錨A (例如)經由醣苷鍵聯與指示劑I直接偶聯。偶聯物之錨部分係選自由諸如以下組成之群：幾丁聚醣、N-乙醯基幾丁聚醣；寡-β-D-1,4-葡萄糖胺；乙醯基-D-吡喃葡萄糖苷；N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)；葡萄糖胺二聚體(GlcNAc)
2
；乙醯基-幾丁聚醣；幾丁二醣八乙酸酯；包括結構(GlcNAc)
n
之幾丁寡聚物，其中 n=4、5或6；幾丁寡醣；2-乙醯胺基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖苷；2-去氧-3,4,6-三-O-乙醯基-D-吡喃葡萄糖苷；或其組合。同樣，指示劑係選自由以下組成之群：活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5或活性橙16、活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10或其組合。醣苷鍵聯形成於錨化合物之羥基與指示劑化合物中之反應性基團之間。為模擬醣苷酶之天然受質，錨分子之糖主鏈中之1α-碳涉及醣苷鍵聯。 標記物 本文所闡述之實施例可利用分析存在於慢性或感染傷口中之各種生物標記物之化學部分。在一實施例中，標記物係傷口特異性標記物，其係選自由以下組成之群之酶：水解酶、蛋白酶、酯酶及過氧化物酶。 如本文中所使用，「傷口特異性酶」係差異性地表現於傷口中之酶。「差異表現」意指酶在傷口微環境中之濃度或活性高於或低於其他位點，例如正常組織或周圍組織。特定而言，差異表現暗指，酶在傷口微環境中之表現程度或活性高於正常或未受傷組織。可藉由常規方式來分析酶之差異表現。舉例而言，可藉由ELISA分析或其他免疫分析來分析試樣中之酶濃度。可藉由(例如)使用質譜或HPLC量測受質損失速率及/或產物形成速率來分析酶活性。業內已知該等技術且闡述於實例部分中。 在一實施例中，標記物係水解酶。如本文中所使用，「水解酶(hydrolase或hydrolytic enzyme)」係催化化學鍵之水解之酶，例如酯酶及核酸酶(斷裂酯鍵)；二醇酶(斷裂醣苷連接體)；肽酶(斷裂肽鍵)等。 在一具體實施例中，傷口特異性醣苷水解酶係溶菌酶。溶菌酶(UNIPROT登錄號P61626 [人類]及P08905 [小鼠])係醣苷水解酶且其主要功能係破壞細菌之細胞壁。其水解N-乙醯基胞壁酸及肽聚醣中之N-乙醯基-D-葡萄糖胺殘基之間亦及殼糊精中之N-乙醯基-D葡萄糖胺殘基之間的(1→4)-β-鍵聯。溶菌酶之天然受質係細菌細胞壁之肽聚醣層。然而，各種低分子質量受質(包含胞壁質降解產物以及合成化合物)已用於各種光度、同位素及免疫學溶菌酶分析。Höltje等人，
EXS,
75:105-10, 1996。亦參見Sigma目錄編號M5639及Sigma目錄編號N8638。 在一實施例中，化學部分之個別組分適於由傷口特異性水解酶(例如傷口特異性溶菌酶)識別。 或者或另外，化學部分之個別組分可經修飾以用於由其他傷口特異性酶識別。在一實施例中，另一傷口特異性酶係蛋白酶。如本文中所使用，「傷口特異性蛋白酶」係差異性表現於傷口中之蛋白酶。「差異表現」意指蛋白酶在傷口微環境中之濃度或活性高於或低於其他位點，例如正常組織或周圍組織。特定而言，差異表現暗指，蛋白酶在傷口微環境中之表現程度或活性高於未受傷組織。可藉由常規方式來分析蛋白酶之差異表現。舉例而言，可藉由ELISA分析或其他免疫分析來分析試樣中之蛋白酶濃度。可藉由(例如)使用質譜或HPLC量測肽受質損失速率及/或產物形成速率來分析蛋白酶活性。業內已知該等技術且闡述於實例部分中。 在一實施例中，傷口特異性蛋白酶係細胞自溶酶G (UNIPROT登錄號P08311 [人類]及P28293 [小鼠])，其係儲存於嗜苯胺藍細胞顆粒中之胰凝乳蛋白酶家族之三種絲胺酸蛋白酶之一。細胞自溶酶G特異性受質具有序列Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10)或Ala-Ala-Pro-Met (SEQ ID NO: 11) (Sigma Aldrich目錄編號S7388及M7771)。 在另一實施例中，傷口特異性蛋白酶係彈性蛋白酶(例如人類嗜中性球彈性蛋白酶或HNE) (UNIPROT登錄號P08246 [人類]及Q3UP87 [小鼠])。HNE係與胰凝乳蛋白酶相同家族中之絲胺酸蛋白酶且具有寬廣受質特異性。在發炎期間由嗜中性球及巨噬球分泌後，其會破壞細菌及宿主組織。在一實施例中，用於檢測HNE之受質係核心序列丙胺酸-丙胺酸-脯胺酸-纈胺酸(AAPV (SEQ ID NO: 9))。在另一實施例中，用於HNE之受質係Ala-Pro-Glu-Glu-Ile/Met-Arg-Arg-Gln (APEEI/MRRQ (SEQ ID NO: 12)) (Kasperkiewicz等人，
PNAS USA
, 111(7): 2518-2523, 2014；Korkmaz等人，
Methods Mol Biol
., 844:125-138, 2012)。 在另一實施例中，傷口特異性酶係過氧化物酶，更具體而言係髓過氧化物酶(MPO)。MPO (UNIPROT登錄號P05164 [人類]及P11247 [小鼠])係發現於嗜中性球顆粒球中之過氧化物酶。在存在過氧化氫(H2O2)及鹵化物(最通常係氯化物)下，其產生抗微生物物質次氯酸鹽、單態氧(1O2)、氯(Cl2)及羥基(OH•)。可使用四甲基聯苯胺或4-苯甲醯基胺基-2,5-二甲氧基苯胺檢測MPO。參見Andrews等人，
Anal Biochem
, 127(2):346-50, 1982；Klebanoff等人，
J. Leukocyte Biol
., 77, 598-625, 2005。 酶識別位點(S) 因本文所揭示之實施例係關於傷口特異性標記物之特異性檢測，故本文揭示含有用於傷口特異性標記物之酶識別位點(S)之受質。因此，在一實施例中，化學部分包括錨區域A或包括用於傷口特異性酶之識別位點(例如酶裂解位點)之指示劑(I)。 在一實施例中，酶識別位點包括醣苷鍵。如本文中所使用，「醣苷鍵」形成於糖(或衍生自糖之分子)之半縮醛或半縮酮基團與一些化合物(例如醇)之羥基之間。含有醣苷鍵之物質係醣苷。術語「醣苷」現擴展至亦涵蓋具有形成於糖之半縮醛(或半縮酮)基團與若干除羥基外之化學基團(例如-SR (硫基醣苷)、-SeR (硒基醣苷)、-NR1R2 (N-醣苷)或甚 -CR1R2R3 (C-醣苷))之間之鍵之化合物。 在一實施例中，本文所揭示之化學部分含有一或多個由二醇酶裂解之醣苷鍵。在一具體實施例中，化學部分包括直接或經由另一基團連接錨A及指示劑I之醣苷鍵。特定而言，錨A及指示劑I經由一或多個醣苷鍵直接連接，在該情形下，化學實體藉由二醇酶裂解且由此可用於檢測二醇酶。 在一實施例中，指示劑分子包括含有肽鍵之酶促可裂解肽。如本文中所使用，「肽鍵」係藉由兩個胺基酸之間之縮合反應所形成，其中一個胺基酸之酸部分與另一胺基酸之胺基部分發生反應以在兩個胺基酸之間產生肽鍵(-CO-NH-)。個別肽提供用於由序列特異性蛋白酶識別之模體。如本文中所使用，術語「序列特異性蛋白酶」意指對於消解而言識別肽之特異性序列之蛋白酶(例如卡斯蛋白酶(caspase))，且區別於自其一端依序分解肽或以序列非特異性方式消解肽之一般蛋白酶(例如胰蛋白酶)。對於序列特異性而言，肽受質之胺基酸序列可包括4個或更多個胺基酸(a.a.)殘基。 如本文中所使用，術語「肽」包含含有直鏈或具支鏈胺基酸之天然肽、擬肽以及其醫藥上可接受之鹽。通常，肽包括複數個經由共價鍵(例如肽鍵)彼此鍵結之胺基酸殘基，例如2、3、4、5、6、8、10或更多個胺基酸殘基。「胺基酸殘基」意指納入本發明肽中之個別胺基酸單元。如本文中所使用，術語「胺基酸」意指天然或合成胺基酸以及胺基酸類似物、立體異構體及功能類似於天然胺基酸之胺基酸模擬物。由此定義所包含者係天然胺基酸，例如：(1)組胺酸(His) (2)異白胺酸(Ile) (3)白胺酸(Leu) (4)離胺酸(Lys) (5)甲硫胺酸(Met) (6)苯丙胺酸(Phe) (7)蘇胺酸(Thr) (8)色胺酸(Trp) (9)纈胺酸(Val) (10)精胺酸(Arg) (11)半胱胺酸(Cys) (12)麩醯胺酸(Gln) (13)甘胺酸(Gly) (14)脯胺酸(Pro) (15)絲胺酸(Ser) (16)酪胺酸(Tyr) (17)丙胺酸(Ala) (18)天門冬醯胺(Asn) (19)天門冬胺酸(Asp) (20)麩胺酸(Glu) (21)硒基半胱胺酸(Sec)；且包含非天然胺基酸：(a)瓜胺酸；(b)胱胺酸；(c) γ-胺基丁酸(GABA)；(d)鳥胺酸；(f)茶胺酸；及胺基酸衍生物，例如甜菜鹼；肉鹼；肌肽肌酸；羥基色胺酸；羥基脯胺酸；N-乙醯基半胱胺酸；S-腺苷甲硫胺酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。在該等胺基酸中，含有反應性側鏈之胺基酸(例如半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、天門冬胺酸鹽/天門冬醯胺、麩胺酸鹽/麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸等)尤其用於修飾受質。 酶反應性位點(R) 在一些實施例中，化學實體含有一或多個用於檢測傷口特異性酶之酶不穩定或酶反應性區域(R)。 在一實施例中，其中酶係醣苷酶(例如溶菌酶)，酶不穩定或酶反應性區域包括具有至少3個葡萄糖胺或
N
-乙醯基葡萄糖胺或肽聚醣單元(其視情況經乙醯化)之醯基幾丁聚醣。酶反應性位點可含有(例如)3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20個或更多個葡萄糖胺單元或
N
-乙醯基葡萄糖胺或肽聚醣單元。在一實施例中，R包括至少3個葡萄糖胺或
N
-乙醯基葡萄糖胺或其組合，其中葡萄糖胺及/或
N
-乙醯基葡萄糖胺視情況經乙醯化。在另一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括肽聚醣，其中肽聚醣視情況經乙醯化。 在一些實施例中，化學部分包括用於一或多種上文所揭示傷口特異性蛋白酶(例如細胞自溶酶G及髓過氧化物酶、彈性蛋白酶或其組合)之酶反應性位點(R)。如本文中所使用，術語「用於蛋白酶之反應性位點」意指包括由蛋白酶識別為用於其蛋白酶活性之受質(例如可裂解成一或多種產物之受質)之蛋白質之胺基酸序列的肽。在一些實施例中，化學實體包括含有包括複數個胺基酸之肽序列之肽區域。術語「複數個」意指兩個或更多個單元(例如胺基酸)，但個別單元未必在結構上及/或在功能上不同。通常，化學實體之指示劑區域(I)包括用作用於傷口特異性蛋白酶之酶反應性位點之肽。 在一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括對於彈性蛋白酶、細胞自溶酶G、髓過氧化物酶或其組合不穩定之肽。 在一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)， 其中每一X獨立地係任一胺基酸， y各自獨立地係介於0與200之間之整數，且 Z包括可檢測標記。 在一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)， 其中每一X獨立地係任一胺基酸， y各自獨立地係介於0與200之間之整數，且 Z包括可檢測標記。 在另一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
AAP(V/F/A)X
y
- Z (SEQ ID NO: 3)， 其中每一X獨立地係任一胺基酸， y各自獨立地係介於0與200之間之整數，且 Z包括可檢測標記。 在又一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)， 其中每一X獨立地係任一胺基酸， y各自獨立地係介於0與200之間之整數， L係連接部分，且 Z包括可檢測標記。 在另一具體實施例中，反應性區域R包括肽序列X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)，其中X、L及Z各自係如上文所闡述，且y各自獨立地係1至50之整數。 在另一實施例中，反應性區域R包括肽序列X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)，其中X、L及Z各自係如上文所闡述，且y各自獨立地係1至10之整數。 特定而言，反應性區域R包括肽序列X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)，其中X、L及Z各自係如上文所闡述，且y各自獨立地係1至6之整數。 在一實施例中，每一上文所提及包括序列X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)之肽各自個別地對彈性蛋白酶不穩定。 在一些實施例中，胺基酸序列X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)中之一或多個胺基酸經(例如)胺保護基團(例如茀基甲基氧基羰基(Fmoc))保護。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括對細胞自溶酶G不穩定之肽。 在一實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)，其中 X各自獨立地任一胺基酸； y各自獨立地係選自0至6之數字； N
4
係選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸及麩醯胺酸； N
3
係選自丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、離胺酸及絲胺酸； N
2
係選自脯胺酸、丙胺酸及甘胺酸； N
1
係選自絲胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、精胺酸、白胺酸及甲硫胺酸；且 Z包括可檢測標記；且肽對細胞自溶酶G不穩定。 在一些實施例中，胺基酸序列中之一或多個胺基酸經保護。在一些實施例中，胺基酸序列中之一或多個胺基酸經fmoc基團保護。在一些實施例中，胺基酸序列中之一個胺基酸經fmoc基團保護。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括含有以下胺基酸序列之肽： X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中 X各自獨立地係任一胺基酸； y各自獨立地係選自0至6之數字； N
4
係選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸及麩醯胺酸； N
3
係選自丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、離胺酸及絲胺酸； N
2
係選自脯胺酸、丙胺酸及甘胺酸； N
1
係選自絲胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、精胺酸、白胺酸及甲硫胺酸；且 L係連接部分；且 Z包括可檢測標記。 在一實施例中，每一上文所提及包括序列X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)及X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)之肽各自個別地對細胞自溶酶G不穩定。 在一些實施例中，胺基酸序列X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)及X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)中之一或多個胺基酸經(例如)胺保護基團(例如茀基甲基氧基羰基(Fmoc))保護。 可檢測標記Z 在一些實施例中，Z係過氧化物酶受質、芳基胺、胺基酚、胺基苯基醚、吲哚基、中性染料、帶電染料、奈米顆粒或膠質金顆粒。 在一些實施例中，Z係選自以下之過氧化物酶受質：對胺基苯酚、ABTS
(
2,2胺基苯酚，ABTS (s，過氧化物酶受質酸)二銨鹽)、3,3’-二胺基聯苯胺、3,4二胺基苯甲酸、DCPIP、
N,N
-二甲基-對苯二胺、鄰聯茴香胺、對苯二胺、4-氯-1-萘酚、鄰苯二胺、
N
-(4-胺基丁基)-
N
-乙基異胺基苯二醯肼、3-胺基-9-乙基咔唑、4-胺基鄰苯二甲醯肼、5-胺基水楊酸、2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚基、靛、堅牢藍RR、4-氯-7-硝基苯并呋呫。 在一些實施例中，Z係芳基胺、胺基酚、胺基酚醚、吲哚基、中性染料、選自雷瑪唑亮藍、甲苯胺藍、活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5及活性橙16或其水解或氨解衍生物之帶電染料。特定而言，Z係選自雷瑪唑亮藍、甲苯胺藍、活性黑5或其水解或氨解衍生物之帶電染料。 在一些實施例中，Z係基於二氯三嗪之反應性染料，例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10。在一些實施例中，基於二氯三嗪之反應性染料表現為黑色。在一些實施例中，Z係含有磺醯基乙基-硫酸氫酯反應性基團之反應性染料。 在一些實施例中，Z係納米顆粒。在一些實施例中，Z係膠質金顆粒。 在一些實施例中，Z係帶電染料、吲哚衍生物或發光胺衍生物。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括酚、胺基酚、胺基苯基醚、吲哚基或醌。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括酚。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括胺基酚。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括胺基酚醚。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括吲哚基。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括醌。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域與髓過氧化物酶發生反應，但不與血紅素髮生反應。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括過氧化物酶受質、芳基胺、胺基酚、中性染料、帶電染料、奈米顆粒或膠質金顆粒。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括過氧化物酶受質。在一些實施例中，過氧化物酶受質係選自對胺基苯酚、ABTS
(
2,2-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)、3,3’-二胺基聯苯胺、3,4二胺基苯甲酸、DCPIP、
N,N
-二甲基-對苯二胺、鄰聯茴香胺、對苯二胺、4-氯-1-萘酚、鄰苯二胺、
N
-(4-胺基丁基)-
N
-乙基異胺基苯二醯肼、3-胺基-9-乙基咔唑、4-胺基鄰苯二甲醯肼、5-胺基水楊酸、2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)及4-氯-7-硝基苯并呋呫、堅牢藍RR、N-(2-羥基)十四烷基-堅牢藍RR。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括芳基胺。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括胺基酚。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括中性染料。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括帶電染料。在一些實施例中，帶電染料係選自雷瑪唑亮藍、甲苯胺藍、活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5及活性橙16或該等染料中之每一者之水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係雷瑪唑亮藍或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係甲苯胺藍。在一些實施例中，帶電染料係活性黑5或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係活性紫5或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，帶電染料係活性橙16或其水解或氨解衍生物。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括基於二氯三嗪之反應性染料，例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括奈米顆粒。在一些實施例中，Z係膠質金顆粒。 在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括帶電染料、吲哚衍生物或發光胺衍生物。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括吲哚衍生物。在一些實施例中，酶不穩定或酶反應性區域包括發光胺衍生物。 在一些實施例中，指示劑區域包括在正常環境照明中呈現可見色彩變化之染料。在一些實施例中，染料對傷口產物具有對比色彩，該色彩通常係紅色、黃色或褐色。在其他實施例中，染料係紫色、藍色或深綠色。在一些實施例中，染料係紫色。在一些實施例中，染料係藍色。在一些實施例中，染料係深綠色。在一些實施例中，染料具有低分子量，帶電，含有反應性或可連接基團，對γ輻照穩定，且深度著色。在一些實施例中，染料係選自汽巴龍(cibracron)系列染料、偶氮染料及雷瑪唑染料，或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，染料係選自汽巴龍系列染料。在一些實施例中，染料係選自偶氮染料。在一些實施例中，染料係選自雷瑪唑染料或其水解或氨解衍生物。在一些實施例中，染料係選自玫瑰紅、香豆素、青色素、𠮿
、多甲川、芘、氟化硼二吡咯、萘二甲醯亞胺、藻膽蛋白、多甲蟲屬葉綠素蛋白、螢光黃、6-FAM、玫瑰紅、德克薩斯紅(Texas Red)、加州紅(California Red)、iFluor594、四甲基玫瑰紅、羧基玫瑰紅、羧基玫瑰紅6F、羧基對甲胺基苯酚、羧基玫瑰紅110、瀑布藍、瀑布黃、香豆素、Cy2®、Cy3®、Cy3.5®、Cy5®、Cy5.5®、Cy7®、Cy-Chrome、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、藻紅素、PerCP (多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE (6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基螢光黃)、NED、ROX (5-(及-6-)-羧基-X-玫瑰紅)、HEX、螢蝦黃、瑪麗娜藍(Marina Blue)、俄勒岡綠(Oregon Green) 488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、Alexa Fluor® 350、Alex Fluor® 430、Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 532、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 568、Alexa Fluor® 594、Alexa Fluor® 633、Alexa Fluor® 647、Alexa Fluor® 660、Alexa Fluor® 680、7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY® FL、BODIPY® FL-Br
2
、BODIPY® 530/550、BODIPY® 558/568、BODIPY® 630/650、BODIPY® 650/665、BODIPY® R6G、BODIPY® TMR、BODIPY® TR及二甲基胺基偶氮苯磺酸(丹磺醯基)或其偶聯物或其組合。 在一些實施例中，指示劑區域包括基於二氯三嗪之反應性染料(例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10)。在一些實施例中，基於二氯三嗪之反應性染料表現為黑色。 在一些實施例中，指示劑區域包括含有磺醯基乙基-硫酸氫酯反應性基團之反應性染料之反應產物。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5或活性橙16。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5。在一些實施例中，反應性染料係雷瑪唑亮藍。在一些實施例中，反應性染料係活性紫5。在一些實施例中，反應性染料係活性橙16。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5、雷瑪唑亮藍或活性紫5。在一些實施例中，反應性染料係活性黑5或雷瑪唑亮藍。 在一些實施例中，指示劑區域包括在正常環境照明中呈現色彩變化之顆粒(例如膠質金屬或量子點)。在一些實施例中，指示劑區域包括奈米顆粒。在一些實施例中，指示劑區域包括膠質金顆粒。 在一些實施例中，指示劑區域包括在UV光下呈現可見色彩變化之染料。在一些實施例中，指示劑區域包括螢光染料。在一些實施例中，指示劑區域包括發光染料。 在一些實施例中，指示劑區域包括酶反應性部分。在一些實施例中，酶反應性部分與輔助酶相互作用以產生肉眼可見或可藉由電子方式檢測之產物。在一些實施例中，酶反應性部分與輔助酶相互作用以產生肉眼可見之產物。在一些實施例中，酶反應性部分與輔助酶相互作用以產生可藉由電子方式檢測之產物。在一些實施例中，指示劑區域包括端視所用末端糖由胺基己醣苷酶、葡糖醛酸醣苷酶、葡醣苷酶或半乳醣苷酶裂解以產生靛之吲哚基醣苷。在一些實施例中，指示劑區域包括由輔助酶氧化以產生可見產物之酚。在一些實施例中，指示劑區域包括由漆酶氧化以產生可見產物之酚。在一些實施例中，指示劑區域包括可藉由電子方式檢測之金屬模體。在一些實施例中，指示劑區域包括可藉由電子方式檢測之二茂鐵或二茂鐵類似物。在一些實施例中，輔助酶係選自脂肪酶、酯酶、己糖胺酶、過氧化物酶、氧化酶、醣苷酶、葡醣苷酶及漆酶。在一些實施例中，輔助酶並不存在於傷口液中。在一些實施例中，輔助酶存在於傷口液中。在一些實施例中，酶反應性部分與輔助酶相互作用以產生在UV光下可見之產物。 化學實體含有複數個酶識別位點(S)及反應位點(R) 在其他實施例中，本文揭示含有個別地或一起包括複數個酶識別位點(S)及酶反應基團(R)之錨A、指示劑I之化學實體。通常，採用該等化學實體來分析複數種酶(例如包括至少一種蛋白酶及至少一種醣苷酶之組合)。 在一實施例中，本文揭示含有個別地或一起包括複數個酶識別位點(S)及酶反應位點(R)之錨A、指示劑I之化學實體，其中至少一個反應性位點對醣苷酶(例如溶菌酶)具有特異性；且至少一個酶反應位點對於選自由以下組成之群之蛋白酶具有特異性：彈性蛋白酶、細胞自溶酶G、髓過氧化物酶或其組合。先前已闡述用於該等酶之個別反應位點及識別位點。 在一實施例中，本文揭示含有個別地或一起包括複數個酶識別位點(S)及酶反應位點(R)之錨A、指示劑I之化學實體，其中至少一個反應性位點對醣苷酶(例如溶菌酶)具有特異性；且至少一個酶反應位點對選自由彈性蛋白酶組成之群之蛋白酶具有特異性。先前已闡述用於該等酶之個別反應位點及識別位點。 在一實施例中，本文揭示含有個別地或一起包括複數個酶識別位點(S)及酶反應位點(R)之錨A、指示劑I之化學實體，其中至少一個反應性位點對醣苷酶(例如溶菌酶)具有特異性；且至少一個酶反應位點對於選自由細胞自溶酶G組成之群之蛋白酶具有特異性彈性蛋白酶。先前已闡述用於該等酶之個別反應位點及識別位點。 在一實施例中，本文揭示含有個別地或一起包括複數個酶識別位點(S)及酶反應位點(R)之錨A、指示劑I之化學實體，其中至少一個反應性位點對醣苷酶(例如溶菌酶)具有特異性；且至少一個酶反應位點對選自由髓過氧化物酶(MPO)組成之群之蛋白酶具有特異性。先前已闡述用於該等酶之個別反應位點及識別位點。 因採用酶受質之組合之較大預測能力，預計與包括單一(例如單一類型)之反應及識別位點之實體相比，如上文所概述包括複數個反應及識別位點之化學實體之診斷用途將大大增強。最低限度地，包括複數個反應/識別位點之實體允許同時診斷至少2、至少3、至少4個或更多種標記物。舉例而言，可使用本文所揭示之多倍體化學實體同時檢測及監測傷口部位處之溶酶體及蛋白酶活性。 載體材料 在一些實施例中，化學實體之錨區域(A)使化學實體(例如)經由以下作用結合至載體材料：共價相互作用、離子相互作用、疏水性相互作用、靜電相互作用、氫鍵結相互作用、生理化學相互作用、凡得瓦力、路易斯酸/路易斯鹼相互作用或其組合。 在一些實施例中，載體基質包括右旋糖酐、瓊脂糖、二氧化矽、合成聚合物或右旋糖酐、瓊脂糖、二氧化矽或共價偶合至抗體、配體或表位標籤之合成聚合物。 在一些實施例中，錨區域係聚苯乙烯珠粒、矽膠珠粒、多醣珠粒、聚丙烯醯胺珠粒、纖維素珠粒、多醣、衍生纖維素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、UV可活化反應性基團、肽聚醣或幾丁聚醣衍生物或其組合。在一些實施例中，在短時段之UV輻照之後，錨區域結合至載體材料。 在一些實施例中，將化學實體印刷於載體材料(例如濾紙或能夠由傷口液潤濕且顯示毛細管作用之織物或非織物材料)上或其中。在一些實施例中，報告實體或化學實體以化學方式鍵結於載體材料(例如濾紙或能夠由傷口液潤濕且顯示在所有維度上類似之毛細管作用之織物或非織物材料)上或其中。在一些實施例中，化學實體以離子方式結合於載體材料(例如濾紙或能夠由傷口液潤濕且顯示毛細管作用之織物或非織物材料)於或其中。在一些實施例中，化學實體共價結合於載體材料(例如濾紙或能夠由傷口液潤濕且顯示毛細管作用之織物或非織物材料)於或其中。載體材料包含(但不限於)纖維素、聚醯胺、聚酯、聚丙烯酸酯及其他可用作纖維之類似聚合物。在一些實施例中，載體材料係纖維素。在一些實施例中，載體材料係聚醯胺。在一些實施例中，載體材料係聚酯。在一些實施例中，載體材料係聚丙烯酸酯。 其他部分 在一些情況下，傷口之pH可影響許多傷口癒合因素，例如血管生成、蛋白酶活性、氧釋放及細菌毒性。慢性非癒合傷口可具有升高之鹼性環境。隨著傷口朝向癒合進展，傷口之pH移動至中性且然後變為酸性。監測傷口之pH可提供評價傷口病狀(例如感染或無感染)之方法且有助於測定傷口對治療之反應。 因此，在一些實施例中，用於檢測傷口中之感染之化學實體包括含有呈現可見色彩變化之pH敏感性部分的指示劑區域。在一實施例中，pH敏感性部分在鹼性pH下呈現可見色彩變化，例如pH = 7.2-9.5；pH = 7.2-9.0；pH = 7.2-8.5；pH = 7.2-8.0；pH = 7.5-8.5；pH = 7.5-9.0；pH = 8.0-9.0。在其他實施例中，pH敏感性部分在pH = 7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5或其0.1增量下呈現可見色彩變化。 在一些實施例中，pH敏感性部分在中性pH範圍(例如在pH = 6.9、7.0或7.1，或其0.05增量)內呈現可見色彩變化。 在一些實施例中，pH敏感性部分在酸性pH下呈現可見色彩變化，例如pH = 4.5-6.8；pH = 4.5-6.5；pH = 5.0-6.8；pH = 5.4-6.8；pH = 5.4-6.5。在其他實施例中，pH敏感性部分在pH = 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9或其0.1增量下呈現可見色彩變化。 在一些實施例中，pH敏感性部分係選自由以下組成之群：溴百里酚藍、酚紅、溴酚紅、氯酚紅、百里酚藍、溴甲酚綠、溴甲酚紫；硝嗪黃；及磺酞染料或其組合。 組合物 本文所闡述之實施例另外係關於含有式I化合物之組合物。該等組合物可使用習用方法製得。 在調配後，可使用習用方法(例如使用載劑、膠凝劑、軟化劑、表面活性劑、保濕劑、黏度增強劑、乳化劑等)將式I化合物之所得儲備組合物進一步改質成期望形式(例如凝膠、香膏、洗劑、乳霜、膏、軟膏等)。例如參見WO 2013/004953。 用於組合物中之載劑可包含(但不限於)水、甘油、二甘油、甘油衍生物、二醇、二醇衍生物、糖、乙氧基化及/或丙氧基化酯及醚、尿素、PCA鈉、醇、乙醇、異丙醇及其組合。在一實施例中，載劑係丙二醇。通常，組合物以以下量含有載劑：約1重量%組合物至約99.9重量%組合物、更通常約2重量%組合物至約95重量%組合物及更通常約5重量%組合物至約90重量%組合物。 熱可逆膠凝劑定義為在升高溫度(例如50℃下)可溶、部分地可溶或可混溶於親水性載劑中之成分，其中該等試劑能夠在冷卻至25℃時稠化載劑，但在需要施加至受質時於50℃下黏性較小。適宜親水性載劑包含水、二醇(例如丙二醇)。用於組合物中之熱可逆膠凝劑可包含脂肪酸鹽，例如硬脂酸鈉、棕櫚酸鈉、硬脂酸鉀。該等鹽可添加至組合物中或可藉由添加脂肪酸且使用適當鹼中和原位產生。原位形成組合物之一實例係提供硬脂酸及氫氧化鈉以產生硬脂酸鈉。其他常用熱可逆膠凝劑可包含(例如)聚乙二醇及衍生物(例如PEG-20、PEG-150二硬脂酸酯、PEG-150戊赤蘚醇四硬脂酸酯)、disteareth-75 IPDI、disteareth-100 IPDI、脂肪醇(例如鯨蠟醇)、脂肪酸(例如硬脂酸)、羥基硬脂酸及其衍生物及其組合。 除載劑及熱可逆膠凝劑外，組合物可含有各種其他成分及組分。可包含於組合物內之其他成分之實例係軟化劑、固醇或固醇衍生物、天然及合成脂肪或油、黏度增強劑、流變改良劑、多元醇、表面活性劑、醇、酯、聚矽氧、黏土、澱粉、纖維素、微粒、潤濕劑、成膜劑、滑動改良劑、表面改良劑、皮膚保護劑、保濕劑、防曬劑及諸如此類。 醫藥組合物及/或製劑： 本文所闡述之實施例另外係關於包括一或多種上文所提及之式I化合物及載劑之醫藥組合物及/或製劑。本文所用之片語「醫藥上可接受」係指彼等化合物、鹽、組合物、劑型等在合理醫學判斷範圍內適於與人類及/或其他哺乳動物之組織接觸使用且無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相稱。在一些態樣中，「醫藥上可接受」意指已獲得聯邦或州政府管理機構批准或列示於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於哺乳動物(例如動物)且更特定而言人類中者。 醫藥組合物可藉由業內已知之任一適宜方式製得。該等組合物之實例包含適用於以下情形者：(a)局部施加，物件(例如紗布、墊、拭子、敷料)、乳霜、軟膏、凝膠、洗劑等；(b)非經腸投與，例如皮下、肌內或靜脈內注射無菌溶液或懸浮液；(c)經口投與、外部施加(例如灌劑，包含水性及非水性溶液或懸浮液)、錠劑、大丸劑、粉劑、粒劑、與飼料混合之團粒、用於施加至舌之膏等。 在某些實施例中，醫藥組合物可包括一或多種抗生素劑。如本文中所使用，術語「抗生素」或「可微生物劑」係指抑制微生物生長或破壞微生物之物質。較佳地，抗生素可用於抑制傳染原之毒力及/或治療感染性疾病。抗生素亦係指由微生物(例如酵母或真菌)產生之天然形式在結構上經修飾之半合成物質。 較佳地，抗生素係選自由以下組成之群：β-內醯胺(包含β-內醯胺酶抑制劑及頭孢菌素(cephalosporin))、氟喹諾酮、胺基醣苷、四環素(tetracycline)及/或甘胺醯環素(glycylcycline)及/或多黏菌素(polymyxin)。亦可採用抗微生物劑之任一組合，例如至少一種β-內醯胺及至少一種氟喹諾酮；至少一種胺基醣苷及一種頭孢菌素；至少一種β-內醯胺及一種β-內醯胺酶抑制劑視情況以及胺基醣苷等。 如本文中所使用，術語「β-內醯胺」抑制劑包含天然及半合成青黴素(penicillin)及青黴素衍生物，例如苄星青黴素(benzathine penicillin)、苄基青黴素(青黴素G)、苯氧基甲基青黴素(青黴素V)、普魯卡因青黴素(procaine penicillin)及扼煞西林(oxacillin)；甲氧西林(methicillin)、二氯噻青黴素(dicloxacillin)及氟氯西林(flucloxacillin)；替莫西林(temocillin)；阿莫西林(amoxicillin)及胺苄青黴素(ampicillin)；阿洛西林(azlocillin)、卡本西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)及必倍西林(piperacillin)；比阿培南(biapenem)、多尼培南(doripenem)、厄他培南(ertapenem)、亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、帕尼培南(panipenem)及PZ-601；頭孢力新(cephalexin)、噻吩頭孢菌素(cephalothin)、頭孢若林(cefazolin)、頭孢可若(cefaclor)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢孟多(cefamandole)、西弗特坦 (cefotetan)、頭孢西丁 (cefoxitin)、頭孢噻肟(cefotaxime)及頭孢泊肟(cefpodoxime)；頭孢吡肟(cefepime)及頭孢匹羅(cefpirome)；頭孢羥胺苄(cefadroxil)、希復欣敏(cefixime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢力新、噻吩頭孢菌素、頭孢呋辛、頭孢孟多、頭孢吡肟及頭孢匹羅；頭孢西丁、西弗特坦、頭孢美唑(cefmetazole)及氟氧頭孢(flomoxef)；替吉莫南(tigemonam)、諾卡菌素A (nocardicin A)及煙毒素(tabtoxin)；克拉維酸(clavulanic acid)、拉氧頭孢(moxalactam)及氟氧頭孢(flomoxef)。氟喹諾酮包含環丙沙星(ciprofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)及莫西沙星(moxifloxacin)。胺基醣苷包含(例如)卡那黴素(kanamycin)、阿米卡星(amikacin)、妥布黴素(tobramycin)、地貝卡星(dibekacin)、慶大黴素(gentamicin)、西索米星(sisomicin)、西索米星(netilmicin)、新黴素(neomycin) B、新黴素C、新黴素E (巴龍黴素(paromomycin))及鏈黴素(streptomycin) (包含合成衍生物克拉黴素(clarithromycin)及阿奇黴素(azithromycin))。四環素類包含天然化合物(例如四環素、氯四環素(chlortetracycline)、氧四環素(oxytetracycline)、地美環素(demeclocycline))或半合成藥劑(例如賴甲環素(lymecycline)、甲氯環素(meclocycline)、甲烯土黴素(methacycline)、米諾四環素(minocycline)、羅利環素(rolitetracycline))。甘胺醯環素(例如米諾四環素/替吉環素(tigecycline))係衍生自四環素。多黏菌素包含(例如)多黏菌素B及多黏菌素E (黏菌素(colistin))。 在某些實施例中，組合物可以以下濃度含有抗生素：0.1 mg/mL、0.5 mg/L、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL、16 mg/mL、17 mg/mL、18 mg/mL、19 mg/mL、20 mg/mL、21 mg/mL、22 mg/mL、23 mg/mL、24 mg/mL、25 mg/mL、26 mg/mL、27 mg/mL、28 mg/mL、29 mg/mL、30 mg/mL、31 mg/mL、32 mg/mL、33 mg/mL、34 mg/mL、35 mg/mL、36 mg/mL、37 mg/mL、38 mg/mL、39 mg/mL、40 mg/mL、41 mg/mL、42 mg/mL、43 mg/mL 44 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/m、90 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL、500 mg/mL或更高濃度。舉例而言，亞胺培南及厄他培南可以50、30、20、15、10、5及1 mg/mL之濃度使用。 傷口敷料： 在某些實施例中，本文揭示包括如本文所闡述之傷口敷料材料(例如式I化合物)之傷口敷料。在一些實施例中，傷口敷料基本上由如本文所闡述之傷口敷料材料(例如式I化合物)組成。 在一實施例中，本文所揭示之傷口敷料係生物相容、生物可降解、非免疫原性且易於購得。 在一實施例中，式I化合物係以視情況含有藥劑之顆粒形式提供，例如纖維顆粒或粉末顆粒。特定而言，材料較佳地含有CMC纖維。 組合物可較佳地包括敷料材料及其他化合物之均勻混合物。舉例而言，在一實施例中，均勻混合物包括敷料材料及適宜媒劑(例如溶劑)之混合溶液或分散液或藉由自此一溶液或分散液去除溶劑而產生之固體組合物。在此實施例下，敷料材料構成材料之至少5重量%、更佳地至少10重量%、20重量%、30重量%、50重量%、75重量%、90重量%或更大重量%。在某些較佳實施例中，材料基本上由敷料材料組成。 材料之其他組分可包含0-25重量% (例如約1重量%至約20重量%)之一或多種其他生物相容多醣、(例如)海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、澱粉衍生物(例如羥基乙酸澱粉鈉)、纖維素衍生物(例如甲基纖維素或羧甲基纖維素)或葡糖胺基聚醣(例如透明質酸或其鹽)、硫酸軟骨素或硫酸乙醯肝素。材料亦可包括最多約25重量% (例如約1重量%至約20重量%)之一或多種選自由以下組成之群之結構蛋白：纖連蛋白、纖維蛋白、層黏蛋白、彈性蛋白、膠原及其混合物。較佳地，蛋白質包括膠原，且更佳地其基本上由膠原組成。材料亦可包括最多約20重量%、較佳地約2重量%至約10重量%之水。材料亦可含有 0-40重量% (例如約5重量%至約25重量%)之增塑劑、較佳地多元醇(例如甘油或山梨醇)。 在某些實施例中，材料亦可包括最多約10重量% (例如約0.01重量%至約5重量%、通常約0.1重量%至約2重量%)之一或多種治療性傷口癒合劑，例如非類固醇抗發炎性藥(例如對乙醯胺基酚(acetaminophen))、類固醇、局部麻醉劑、抗微生物劑或生長因子(例如纖維母細胞生長因子或血小板源生長因子)。抗微生物劑可(例如)包括抗菌劑、抗生素或其混合物。較佳抗生素包含四環素、青黴素、土黴素(terramycin)、紅黴素(erythromycin)、桿菌肽(bacitracin)、新黴素、多黏黴素B (polymycin B)、莫匹羅星(mupirocin)、克林達黴素(clindamycin)及其混合物。較佳抗菌劑包含銀(包含膠質銀)、銀鹽(包含構成材料之一或多種陰離子聚合物之鹽)、銀磺胺嘧啶(silver sulfadiazine)、洛赫西定(chlorhexidine)、聚維酮碘(povidone iodine)、三氯沙(triclosan)、硫糖鋁(sucralfate)、四級銨鹽及其混合物。隨著根據所揭示技術之該等藥用傷口敷料材料在使用中分解，該等傷口敷料材料提供治療劑之持續釋放。 所有上述百分比皆係以乾燥重量計。較佳地，傷口敷料材料對其他輔助藥劑及材料之重量比率為約1:99至約99:1。更佳地，該重量比率在約1:9至約9:1範圍內，更佳地其在約4:1至約1:4範圍內，仍更佳地在約2:1至約1:2範圍內。 材料可呈任一便利形式，例如粉末、微球體、片材、墊或膜。 在某些實施例中，材料係呈用於局部施加之半固體或凝膠軟膏形式。 在某些實施例中，材料係呈用於施加至慢性傷口之凍乾或溶劑乾燥之生物吸收性海綿。較佳地，海綿之平均孔徑在10-500 μm、更佳地約100-300 μm範圍內。藉由凍乾或溶劑乾燥包括式I化合物以及適宜治療劑之水性分散液來製備適宜海綿。 在其他實施例中，材料係呈撓性膜形式，其可為連續或中斷性(例如多孔)。撓性膜較佳地包括增塑劑(例如甘油)以使其為撓性。 具有多種可控性質之凝膠形成聚合物(例如纖維素衍生物)之立即可用性意指，可將所揭示技術之組合物之性質控制至罕見程度。特定而言，可控制材料之生物吸收速率、孔隙率及密度。 在一實施例中，本文提供呈薄片形式之傷口敷料材料，其包括含有式I化合物之組合物之活性層。活性層在使用時通常為傷口接觸層，但在一些實施例中，其可與傷口由液體滲透性頂部薄片間隔開。在一實施例中，活性層之面積為約1cm
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至約400 cm
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、尤其約4 cm
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至約100 cm
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。 在另一實施例中，傷口敷料材料進一步包括延伸於活性層上面且與活性層之傷口面向側相對之背襯薄片。較佳地，背襯薄片大於活性層，從而寬1 mm至50 mm、較佳地5 mm至20 mm之邊緣區域圍繞活性層延伸以形成所謂的島敷料。在該等情形下，背襯薄片較佳地至少在其邊緣區域中經壓敏性醫學等級黏著劑塗覆。 在敷料材料包括背襯薄片之實施例中，背襯薄片實質上係液體不可滲透性。在另一實施例中，背襯薄片係半滲透性，舉例而言，背襯薄片較佳地可滲透水蒸氣，但不可滲透液體水或傷口滲出物。較佳地，背襯薄片亦係微生物不可滲透性。適宜連續可構形背襯薄片較佳地在37.5℃下於100%至10%相對濕度差異下對於單獨背襯薄片而言具有300-5000 g/m
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/24 hr、較佳地500-2000 g/m
2
/24 hr之水蒸氣透過速率(MVTR)。背襯薄片厚度較佳地在10微米至1000微米、更佳地100微米至500微米範圍內。 形成背襯薄片之適宜聚合物包含聚胺基甲酸酯及聚丙烯酸烷氧基烷基酯及甲基丙烯酸酯。較佳地，背襯薄片包括主要係閉孔之高密度嵌段聚胺基甲酸酯發泡體之連續層。適宜背襯薄片材料係聚胺基甲酸酯膜。 在包括含有黏著劑之背襯層之傷口敷料中，黏著劑層應為水蒸氣透過性及/或經圖案化以容許通過水蒸氣。黏著劑層較佳係常用於島型傷口敷料之類型之連續水蒸氣透過性、壓敏性黏著劑層，例如基於丙烯酸酯共聚物、聚乙烯基乙基醚及聚胺基甲酸酯之壓敏性黏著劑。可選擇性使用基於聚胺基甲酸酯之壓敏性黏著劑。 在另一實施例中，敷料可包括多層吸收性物件之其他層，該等層可構建於活性層與保護薄片之間。舉例而言，該等層可包括具孔塑膠膜以在使用中支持活性層，在該情形下，膜中之孔口較佳地與水凝膠層中之孔口對齊。 另外，在其他實施例中，敷料可在活性層與保護薄片之間包括吸收劑層，尤其在敷料係用於滲出傷口。可選吸收劑層可為在傷口癒合中常用於吸收傷口液、血清或血液之任一層，包含紗布、不織布織物、超強吸水劑、水凝膠及其混合物。較佳地，吸收劑層包括吸收劑發泡體(例如開孔親水性聚胺基甲酸酯發泡體)之層。在其他實施例中，吸收劑層可為不織布纖維性網片，例如纖維膠短纖維之梳理網片。 在某些實施例中，傷口敷料可由可去除蓋片保護。蓋片通常係自撓性熱塑性材料形成。適宜材料包含聚酯及聚烯烴。較佳地，蓋片之黏著劑面向表面係釋放表面。亦即，釋放表面係僅弱黏著至活性層及背襯薄片上之黏著劑以幫助自蓋片剝離水凝膠層之表面。舉例而言，蓋片可自非黏著性塑膠(例如氟聚合物)形成，或其可提供有釋放塗層(例如聚矽氧或氟聚合物釋放塗層)。 在一實施例中，傷口敷料無菌且包裝於微生物不可滲透性容器中。 套組： 在某些實施例中，所揭示技術提供在一個或單獨腔室中包括式I化合物(視情況)以及賦形劑、載劑或油之套組。套組可在一或多個腔室中進一步包括其他成分，例如膠凝劑、軟化劑、表面活性劑、保濕劑、黏度增強劑、乳化劑等。套組可視情況包括用以調配用於診斷、檢測或治療傷口(例如慢性或感染傷口)之物件之說明書。套組亦可包括用於個別地或一起使用組分來治療傷口之說明書。 在一相關實施例中，所揭示技術提供包括包裝及至少一個包括上文所提及組合物之吸收性物件(闡述於上文中)之套組。或者，套組可單獨、視情況與可用於包裝中或與包裝一起使用之二級資訊一起包括個別組分。 本文所揭示之其他實施例係關於組合物應以製備用於治療傷口之敷料之用途。較佳地，傷口係慢性傷口，例如選自由以下組成之群之傷口：靜脈潰瘍、褥瘡潰瘍及糖尿病性潰瘍。 表面： 所揭示技術之實施例另外提供包括上文所提及之式I化合物之表面，其中報告基因或肽經定向以允許結合至配偶體(例如酶)。較佳地，表面係固體載體之表面。熟習此項技術者已知諸多不同固體載體。有用固體載體包含天然聚合碳水化合物及其合成改質、交聯或取代衍生物，例如瓊脂、瓊脂糖、交聯海藻酸、經取代及交聯瓜爾膠、纖維素酯(尤其含有硝酸及羧酸)、混合纖維素酯及纖維素醚；含有氮之天然聚合物，例如蛋白質及衍生物，包含交聯或改質明膠；天然烴聚合物，例如乳膠及橡膠；可使用適宜多孔結構製得之合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包含聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解衍生物、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、上述縮聚物(例如聚酯、聚醯胺及其他聚合物(例如聚胺基甲酸酯或聚環氧化物))之共聚物及三元聚合物；多孔無機材料，例如鹼土金屬及鎂之硫酸鹽或碳酸鹽(包含硫酸鋇、硫酸鈣、碳酸鈣)、鹼金屬及鹼土金屬、鋁及鎂之矽酸鹽；及鋁或矽之氧化物或水合物，例如黏土、氧化鋁、滑石粉、高嶺土、沸石、矽膠或玻璃(該等材料可與上述聚合材料一起用作過濾劑)；及上述種類之混合物或共聚物，例如藉由在預存在天然聚合物上引發合成聚合物之聚合獲得之接枝共聚物。 在一實施例中，載體係陣列板(例如微陣列)之孔。業內已知構築該等陣列之方法，例如Cao等人，
Appl Environ Microbiol
., 77(23): 8219-8225, 2011。可一式三份點樣每一式I化合物(或單獨之肽指示劑)以消除由陣列中之物理缺陷所致之不規則數據。 系統： 所揭示技術之實施例另外提供包括上文所提及之組合物及/或套組之診斷系統。 診斷系統之各種組分可以各種形式來提供。舉例而言，式I化合物(例如含有肽報告基因之化合物)可提供為凍乾試劑。可在凍乾之前預混合該等凍乾試劑，從而在重構時其與適當比率之備用於分析中之每一組分形成完整混合物。另外，所揭示技術之診斷系統可含有用於重構套組之凍乾試劑之重構試劑。 核酸 在一實施例中，本文包含編碼下列肽之核酸： X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述。 在另一實施例中，本文包含編碼用於以下之多肽序列之核酸：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段及/或其免疫原性片段。 在特定實施例中，本文包含編碼表4中所陳述之多肽序列(用於ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM_His、CatGSub1_CBM_His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM_His、CatGSub2_CBM_His)或酶可裂解片段其及/或其免疫原性片段之核酸。 本文所用之片語「核酸」或「核酸序列」係指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任一片段、可為單鏈或雙鏈且可代表有義或反義鏈之基因體或合成起源之DNA或RNA、肽核酸(PNA)或任一DNA樣或RNA樣材料。在本上下文中，「片段」係指彼等長度大於約10個核苷酸及最佳地長度為至少約40個核苷酸、至少約100個核苷酸或至少約300個核苷酸之核酸序列。 本文所揭示之實施例另外係關於上文所提及之多核苷酸之變體。 在一實施例中，本文包含上文所提及之核酸之變體，該等包括與(例如)編碼下列肽之核酸至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大百分比一致之核苷酸序列或替代地由其組成：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述。 在一實施例中，本文包含上文所提及之核酸之變體，該等變體包括與(例如)編碼以下中之序列之核苷酸至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大百分比一致之核苷酸序列或替代地由其組成：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM His或其互補鏈或其RNA等效物或其互補RNA等效物。 在一相關實施例中，本文包含上文所提及之核酸之核苷酸序列變體，該等核苷酸序列變體包括與(例如)編碼表4中所陳述多肽序列(用於ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM_His、CatGSub1_CBM_His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM_His、CatGSub2_CBM_His)或其互補鏈或其RNA等效物或其互補RNA等效物之核苷酸至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大百分比一致之核苷酸序列或替代地由其組成。熟習此項技術者可使用常規軟體(例如Three-to-One Sequence Manipulation Suite，其生成用於每一輸入多肽序列之三個潛在核酸序列)來編碼核酸序列。Three-to-One軟體可自bioinformatics(dot)org自由獲得。 片語「一致性百分比」或「%一致性」係指在比較兩個或更多個胺基酸或核酸序列時發現之序列類似性百分比。可以電子方式(例如藉由使用MEGALIGN程式(LASERGENE軟體包，DNASTAR))來測定一致性百分比。MEGALIGN程式可根據不同方法(例如Clustal方法(Higgins, D. G.及P. M. Sharp (1988) Gene 73:237-244))來比對兩個或更多個序列。Clustal算法藉由檢驗所有對之間之距離來將序列分組成簇。成對比對簇且然後分組。藉由以下方式來計算兩個胺基酸序列(例如序列A及序列B)之間之類似性百分比：序列A之長度-序列A中之間隙殘基數-序列B中之間隙殘基數/序列A與序列B之間之匹配殘基總和×100。在測定類似性百分比時並不包含兩個胺基酸序列之間具有低或無同源性之間隙。亦可藉由Clustal方法或藉由業內已知之其他方法(例如Jotun Hein方法(例如參見Hein, J. (1990) Mehtods Enzymol. 183:626-645))來計算核酸序列之間之一致性百分比。亦可藉由業內已知之其他方法(例如藉由不同雜交條件)來測定序列之間之一致性。 在另一實施例中，本文包含在嚴格雜交條件或較低嚴格度條件下雜交至一或多種核酸分子之變體多核苷酸。本文所用之術語「雜交」係指核酸鏈與互補鏈經由鹼配對鍵結之任一過程。舉例而言，高嚴格度條件下之雜交可在約37℃至42℃下發生於約50%甲醯胺中。雜交可發生於約30℃至35℃及35%至25%甲醯胺之減小之嚴格度條件下。特定而言，雜交可發生於42℃、50%甲醯胺、5×SSPE、0.3% SDS及200 μg/ml剪切及變性鮭精DNA之高嚴格度條件下。雜交可發生於如上文所闡述之減小之嚴格度條件下(35%甲醯胺及35℃之減小溫度除外)。可另外藉由計算所關注核酸之嘌呤對嘧啶比率且相應地調節溫度來使對應於特定嚴格度之溫度範圍變窄。上文範圍及條件之變化在業內已眾所周知。 本文所用之術語「雜交複合物」係指藉助在互補鹼基之間形成氫鍵而形成於兩個核酸序列之間之複合物。雜交複合物可形成於溶液中或形成於存在於溶液中之一種核酸序列與另一固定於固體載體(例如固定細胞或其核酸之紙、膜、過濾器、晶片、銷或載玻片或任一其他適當基質)上之核酸序列之間。 在另一實施例中，本文包含係上文所提及之核酸之多核苷酸片段之變體。 本文亦包含雜交至一或多種核酸之寡核苷酸，例如PCR引子。本文所用之術語「寡核苷酸」係指具有至少約6個核苷酸至60個核苷酸、較佳地約15至30個核苷酸及最佳地約20至25個核苷酸之核酸序列，其可用於PCR擴增或雜交分析或微陣列中。如本文中所使用，術語「寡核苷酸」實質上等效於術語「擴增引物」、「引子」、「寡聚物」及「探針」，如該等術語在業內通常所定義。 本文亦包含經修飾核酸，例如PNA。本文所用之「肽核酸」 (PNA)係指包括長至少約5個核苷酸且連接至止於離胺酸之胺基酸殘基肽主鏈之寡核苷酸的反義分子或抗基因劑。末端離胺酸賦予組合物溶解性。PNA優先結合互補單鏈DNA及RNA且停止轉錄物延長，且可經聚乙二醇化以延長其在細胞中之壽命。(例如參見Nielsen, P. E.等人(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63。) 載體 本文亦包含含有一或多種上文所提及之核酸之載體。在一實施例中，載體包括至少一種編碼核酸之蛋白質，該核酸係(例如)編碼用於以下之多肽序列(與一或多種其他序列可操作地鍵聯)之核酸：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或酶可裂解片段其及/或其免疫原性片段。其他序列可為合成性質。本文所用之術語「可操作地締合」或「可操作地連接」係指功能相關之核酸序列。若啟動子控制編碼多肽之轉錄，啟動子與編碼序列可操作地締合或可操作地連接。儘管可操作地締合或可操作地連接之核酸序列可鄰接且位於讀取框中，但某些基因元件(例如抑制基因)並不鄰接連接至編碼多肽，但仍結合至控制多肽表現之操縱因子序列。 密碼子最佳化序列 本文包含上文所提及之核酸序列及載體之密碼子最佳化序列。通常可使用可自Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa自由獲得之密碼子最佳化工具(CodonOpt)來實施用於表現於宿主細胞(例如細菌(例如大腸桿菌(E. coli))或昆蟲Hi5細胞)中之密碼子最佳化。 宿主細胞 本文包含含有上文所提及之核酸序列及載體之宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞能夠在標準培養條件下以重組方式表現含於載體中之基因序列以生成多肽產物，例如用於以下之多肽序列：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段及/或其免疫原性片段。在一具體實施例中，宿主細胞係大腸桿菌。 多肽 在一實施例中，本文包含含有下列胺基酸序列之多肽：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述。 在另一實施例中，本文包含用於ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段及/或其免疫原性片段之多肽序列。 在特定實施例中，本文包含表4中所陳述之多肽序列(用於ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM_His、CatGSub1_CBM_His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM_His、CatGSub2_CBM_His)或其酶可裂解片段及/或其免疫原性片段。 在另一實施例中，本文包含上文所提及之多肽之變體，該等變體包括與(例如)下列多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大百分比一致之胺基酸序列或替代地由其組成：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述。 在另一實施例中，本文包含含有與(例如)多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大百分比一致之胺基酸序列或替代地由其組成之變體多肽：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段。特定而言，該片段包括針對用於本文所闡述之水解酶(例如溶菌酶、彈性蛋白酶、細胞自溶酶G、MAO或其組合)酶識別位點(S)或酶反應性位點(R)之最小結構模體。或者或另外，片段肽係可由抗體或其抗原結合結構域識別之免疫原性分子。 同系物 在另一實施例中，本文包含上文所提及之肽及多核苷酸之同系物。本文所用之術語「同源性」係指互補性程度。可存在部分同源性或完全同源性。詞語「一致性」可代替詞語「同源性」。至少部分地抑制一致序列雜交至靶核酸部分之互補序列稱為「實質上同源」。可使用雜交分析(南方印漬((southern blot)或北方印漬(northern blot)、溶液雜交及諸如此類)在減小嚴格度之條件下檢驗完全互補序列至靶序列之雜交之抑制。實質上同源序列或雜交探針與完全同源序列在減小嚴格度之條件下競爭結合至靶序列且抑制該結合。此並非說減小嚴格度之條件允許非特異性結合，此乃因減小之嚴格度條件需要兩個序列之彼此結合係特異性(亦即選擇性)相互作用。可藉由使用甚至缺乏部分互補性程度(例如小於約30%之同源性或一致性)之第二靶序列來測試非特異性結合之不存在。在不存在非特異性結合下，實質上同源序列或探針並不雜交至第二非互補靶序列。 突變體 在另一實施例中，本文包含在用於以下之核心多肽序列中包括突變之變體肽：ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段。 在一實施例中，突變係取代、缺失、添加1-3個胺基酸。較佳地，突變不改變由此所形成突變體肽之酶識別位點。若突變使得識別位點或裂解位點之組成發生改變，則預計突變係源於保守胺基酸取代。 本文所用之詞語「插入」或「添加」係指使得在發現於天然分子中之序列中分別添加一或多個胺基酸殘基或核苷酸之胺基酸或核苷酸序列變化。本文所用之「取代」係指一或多個胺基酸或核苷酸分別由不同胺基酸或核苷酸代替。 抗體 本文所揭示之實施例進一步包含特異性結合至一或多種上文所提及之免疫原性肽之抗體。 在一實施例中，抗體結合至包括下列胺基酸序列之多肽：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述。在另一實施例中，抗體結合至該等多肽之片段。本文涵蓋該等抗體之抗原結合片段，例如F(ab)結構域、F(ab)
2
結構域、scFv結構域，包含以合成方式生成之抗體(例如使用相顯示技術)。 在一實施例中，抗體結合至用於ElaSub1_CBM、CatGSub1_CBM、ElaSub1_CBM His、CatGSub1_CBM His、ElaSub2_CBM、CatGSub2_CBM、ElaSub2_CBM His、CatGSub2_CBM His、ElaSub1_PDM、CatGSub1_PDM、ElaSub1_PDM His、CatGSub1_PDM His、ElaSub2_PDM、CatGSub2_PDM、ElaSub2_PDM His、CatGSub2_PDM或其酶可裂解片段及/或其免疫原性片段之多肽序列。本文涵蓋該等抗體之抗原結合片段，例如F(ab)結構域、F(ab)
2
結構域、scFv結構域，包含以合成方式生成之抗體(例如使用相顯示技術)。 純化分子 本文包含純化生物分子，例如核酸、蛋白質、肽及/或抗體分子(包含其偶聯物)。本文所用之術語「實質上純化」係指自天然環境取出核酸、胺基酸或抗體且進行分離(isolated或separated)，且至少約60%不含、較佳地約75%不含及最佳地約90%不含其天然締合之其他組分。 在本文所闡述之實施例中，可藉由與化學實體之各種組分(例如錨區域及/或指示劑區域)進行組合來改變生物分子，從而其形式及/或功能性與任何天然對應體相比顯著改變。 製備式I化合物之方法： 本文所提供之實施例另外係關於製備式I化合物(包含其前體)之方法。術語「前體」包含任一用作反應物以生成中間或最終產物之化合物。 在一實施例中，本文提供製備包括結構A-I(其中A係如上文所闡述之錨且I係如上文所闡述之指示劑)之式I化合物之方法，其包括使錨與指示劑分子(例如)經由共價鍵偶聯。在一實施例中，錨或指示劑可包括用於如先前所闡述之傷口特異性標記物(例如傷口特異性酶，例如水解酶及更具體而言蛋白酶或醣苷酶)之識別位點(S)或反應/不穩定位點(R)。在此實施例下，用於傷口特異性標記物之受質包括(例如)可水解受質，例如胺基酸、糖、肽、多醣、核酸、脂質或其組合。 在一實施例中，錨經由肽鍵聯、醣苷鍵聯、醯胺鍵聯、酯鍵聯、醚鍵聯、酐鍵聯或類似鍵聯偶聯至報告基因分子。如本文中所使用，「肽鍵」係藉由兩個胺基酸之間之縮合反應所形成，其中一個胺基酸之酸部分與另一胺基酸之胺基部分發生反應以在兩個胺基酸之間產生肽鍵(-CO-NH-)。在一實施例中，肽鍵經傷口特異性蛋白酶(例如彈性蛋白酶、細胞自溶酶G或MAO或其組合)裂解。如本文中所使用，「醣苷鍵」形成於糖(或衍生自糖之分子)之半縮醛或半縮酮基團與一些化合物(例如醇)之羥基之間。在一實施例中，肽鍵經傷口特異性醣苷酶(例如溶菌酶)裂解。 業內已知偶聯反應性部分以生成醣苷、肽、酯、氧基酯、醯胺、醯胺基、氧基醯胺基、醚、磺醯基、亞磺醯基、磺醯胺或其他鍵聯(例如烷氧基、烷硫基、烷基胺基等)之方法且進一步闡述於實例中。 在另一實施例中，本文提供製備包括結構A-I (其中A及I各自係如先前所闡述)之式I化合物之方法。 在一實施例中，A經由醣苷鍵聯偶聯至I。 在另一實施例中，A經由親水性或疏水性鍵聯偶聯至I。 在一實施例中，藉由首先使錨區域A與指示劑區域I偶聯以生成式I化合物來合成具有結構A-I之式I化合物。 在另一實施例中，首先經由基因重組技術(例如在適宜宿主細胞中表現編碼指示劑區域之核酸及組合指示劑與錨區域)來合成指示劑。在此實施例下，在一種情況下，指示劑區域經設計以含有結合至錨區域(例如親水性或疏水性)之核酸序列。親水性相互作用之一代表性實例包括使用含有極性基團之錨(例如部分去乙醯化(例如 DA ＜30%)幾丁聚醣、纖維素或羧甲基纖維素(或其衍生物))，該錨與來自纖維二糖水解酶I (裡氏木黴)之親水性碳水化合物結合模組(CBM)相互作用。疏水性相互作用之另一代表性實例包括使用含有非極性基團之錨(例如聚對苯二甲酸乙二酯(或其衍生物))，該錨與來自糞產鹼菌聚羥基烷酸酯解聚酶(PDB)之疏水性結合模組相互作用。 在一實施例中，肽指示劑(例如包括下列胺基酸序列之多肽：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述(包含變體多肽))可經由宿主表現系統合成。此一方法可包括(例如)：生成編碼一或多種上文所提及之多肽或變體之構築體，將該構築體置於適宜載體(例如質體載體或桿狀病毒載體)中，使用載體轉染宿主細胞(例如大腸桿菌或昆蟲Hi5細胞)；在容許表現該載體之適宜條件下培養宿主細胞；及視情況純化來自該培養物之所表現多肽。 在另一實施例中，肽指示劑(例如包括下列胺基酸序列之多肽：X
y
AAPX
y
-Z (SEQ ID NO: 1)、X
y
AAPX
y
-L-Z (SEQ ID NO: 2)、X
y
AAP(V/F/A)X
y
-Z (SEQ ID NO: 3)或X
y
AAP(V/F/A)X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 4)、X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-Z (SEQ ID NO: 5)或X
y
N
4
N
3
N
2
N
1
X
y
-L-Z (SEQ ID NO: 6)，其中X、N1、N2、N3、N4、L及Z各自係如上文所闡述(包含變體多肽))可使用固相肽合成來合成(參見Merrifield等人，
J. Am. Chem. Soc
. 85 (14): 2149-2154)。 另外，可在單一反應室或多個反應室中合成具有結構A-I之式I化合物。 診斷及治療方法： 在一實施例中，本文所闡述之組合物、敷料材料、物件、套組及系統可用於診斷或治療傷口、尤其慢性或感染傷口。儘管可診斷及/或治療任一類型之傷口，但實施例尤其適於診斷及治療滲出傷口液之傷口。舉例而言，傷口可為慢性或急性傷口。慢性傷口之代表性實例包含(例如)靜脈潰瘍、受壓潰瘍、褥瘡潰瘍、糖尿病性潰瘍及未知病因之慢性潰瘍。急性傷口之代表性實例包含(例如)可能源自刻意手術切口之急性創傷性撕裂傷。 如本文中所使用，術語「傷口液」係指存在於傷口表面或自傷口表面藉由抽吸、吸收或洗滌取出之任何傷口滲出物或其他流體(適宜地實質上不含血液)。對自患者身體取出之傷口液適宜地實施測定、量測或量化，但亦可在傷口液上原位實施。術語「傷口液」通常不係指遠離傷口位點之血液或組織血漿。傷口液係哺乳動物傷口液，適宜地係人類傷口液。 在一實施例中，診斷方法包括：使傷口與本文所闡述之至少一種包括式I或式II之化合物之組合物、包括該等化合物之敷料材料、包括該等材料或化合物之物件、包括該等材料或化合物之套組或包括該等材料或化合物之系統接觸；及量測與傷口有關之參數。在一具體實施例中，所量測參數係傷口特異性水解酶之濃度或活性。特定而言，所量測參數係水解酶之活性。 在上文所提及之實施例中，可原位或離位進行量測。如本文中所使用，術語「原位」係指存在或發生於系統或器件背景(包含周圍環境)內之過程、事件、目標或組分，例如與組合物、物件、系統或器件接觸之生物材料。作為一實例，原位反應可係指存在於器件中之各種組分(例如式I或式II之化合物) (包含由人類皮膚組織提供之組分，例如含有酶之傷口滲出物))之反應。該術語與離位相對，後者係指環境外側。 在第二實施例中，離位實施量測，例如自傷口取出流體以用於在所揭示技術之裝置或器件中進行分析。 適宜地，原位進行量測。 在一診斷實施例中，該方法包括測定報告基因(例如由傷口特異性酶作用受質之產物)之濃度。更具體而言，該方法包括測定水解酶產物之濃度。如本文中所使用，術語「測定」包含量測該水解酶之活性或濃度之數值；確立活性或濃度是否高於或低於預定範圍；及/或比較活性或濃度之數值與對照標準。對照標準可包括測定水解酶在自未受傷位點或自健康個體獲得之生檢材料中之濃度或活性。 在一具體實施例中，術語「測定」包括：量測至少一種選自由以下組成之群之傷口特異性蛋白酶之參數(例如活性或濃度)：MMP-1 (膠原酶)、MMP-2 (明膠酶A)、MMP-3 (溶基質素1)、MMP-8 (嗜中性球膠原酶)、MMP-9 (明膠酶B)、人類嗜中性球彈性蛋白酶(HNE)、細胞自溶酶G、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)及溶菌酶或其組合；確立該參數是否超過第一預定臨限值；及/或比較參數數值與對照標準。對照標準可包括測定蛋白酶在自未受傷位點或自健康個體獲得之生檢材料中之參數。在相關實施例中，術語「測定」包括確立與複數種上文所提及之蛋白酶有關之參數之加權平均值(加權和)是否超過該加權平均值的預定臨限值。 在一特定實施例中，參數係分析物(例如蛋白酶)在傷口液中之活性值。通常，將個別分析物之活性表示為單位/mL形式。 在另一實施例中，參數係分析物(例如蛋白酶)在傷口液中之濃度。通常，術語量亦指示特定分析物之活性。 在用於本文中時，術語「組合量」或「組合活性」係指藉由將數學函數應用至複數個值(例如針對諸多個別分析物所獲得之彼等量)所得到之單一數值。舉例而言，術語「組合量」或「組合活性」可係指一組個別值之總和或乘積。通常，術語「組合量」或「組合活性」係關於一組個別值之總和。舉例而言，在適宜實施例中，彈性蛋白酶之量係指彈性蛋白酶樣活性(例如U/mL)且金屬蛋白酶(MMP)之量係指各別分析物之總濃度(例如以ng/mL表示)。 在用於本文中時，術語「量化」係指在實驗誤差容限內量測特定分析物或受質在試樣中之絕對數值量。 術語「標記物」或「分析物」係指使用本文所定義之裝置、器件、套組或方法鑑別或測定之任一化學實體。藉由所揭示技術之裝置、器件、套組或方法測定或鑑別之標記物或分析物係上文所提及之酶的裂解產物。 在用於本文中時，術語「預定範圍」係指熟習此項技術者所理解指示患者之特定子類之數據範圍或特徵。舉例而言，預定範圍可為對特定傷口治療(例如抗生素療法)充分反應之傷口之典型數據範圍或特徵。或者，預定範圍可適宜地係指對特定傷口治療(例如抗生素療法)並不充分反應之傷口之典型數據範圍。 在用於本文中時，術語「預定臨限值」係指熟習此項技術者基於針對已知癒合及非癒合傷口所測定值之統計學分析所測定指示非癒合傷口之最小值，例如如上文進一步所闡釋。對於擬用於臨床上之測試而言，臨限值應設定於適當值，從而正確地鑑別具有高蛋白酶活性之非癒合傷口。增加臨限值將增加僅非癒合傷口超過臨限值之機會。然而，若臨限值過高，則不能鑑別因高濃度蛋白酶而不能癒合之傷口且在臨床上此意味著其不能接受所需蛋白酶調節治療。 在用於本文中時，術語「對照標準」或「對照」係指可用作參考或對比以定義或正規化另一數據點或數據組之數據組或特徵。舉例而言，術語「對照」或「對照標準」可為指示患者之特定子類之數據組或特徵。適宜地，對照標準可為指示癒合或非癒合傷口狀態之數據組或特徵。 適宜地，在所揭示技術之其他態樣或實施例中，「對照」或「對照標準」可為可用作對比工具以容許熟習此項技術者測定傷口是否可能對傷口治療(例如抗生素療法)具有反應或無反應之數據組或特徵。在一實施例中，對照標準係指示患者對傷口治療不充分反應之數據組或特徵。通常，對照標準係指示患者對傷口治療充分反應之數據組或特徵。對如本文所揭示之傷口治療往往充分反應之患者所展現水解酶之組合量或活性低於對治療往往並不充分反應的患者。舉例而言，對如本文所揭示之傷口治療往往充分反應之患者展現較低組合量之至少一種傷口特異性水解酶。 在一實施例中，臨限人類嗜中性球彈性蛋白酶活性為約5 U/mL至約30 U/mL (包含其間之所有值，例如約6 U/mL、約7 U/mL、約8 U/mL、約9 U/mL、約10 U/mL、約11 U/mL、約12 U/mL、約13 U/mL、約14 U/mL、約15 U/mL、約16 U/mL、約17 U/mL、約18 U/mL、約19 U/mL、約20 U/mL、約21 U/mL、約22 U/mL、約23 U/mL、約24 U/mL、約25 U/mL或更高)，其指示慢性傷口感染。 在一具體實施例中，至少9.6之臨限人類嗜中性球彈性蛋白酶活性值指示慢性傷口感染。在一些實施例中，至少22.9 U/mL之人類嗜中性球彈性蛋白酶活性值指示慢性傷口感染。 在一實施例中，約1000 U/mL至約10000 U/mL (包含其間之所有值，例如約1100 U/mL、約1200 U/mL、約1300 U/mL、約1400 U/mL、約1500 U/mL、約1600 U/mL、約1700 U/mL、約1800 U/mL、約1900 U/mL、約2000 U/mL、約2100 U/mL、約2200 U/mL、約2300 U/mL、約2400 U/mL、約2500 U/mL、約2600 U/mL、約2700 U/mL、約2800 U/mL、約2900 U/mL、約3000 U/mL、約3250 U/mL、約3500 U/mL、約3750 U/mL、約4000 U/mL、約4250 U/mL、約4500 U/mL、約4750 U/mL、約5000 U/mL、約5250 U/mL、約5500 U/mL、約5750 U/mL、約6000 U/mL或更高)之臨限溶菌酶活性值指示慢性傷口感染。在一具體實施例中，至少4800 U/mL之溶菌酶活性值指示慢性傷口感染。 在一實施例中，約10 U/mL至約100 U/mL (包含其間之所有值，例如約15 U/mL、約20 U/mL、約25 U/mL、約30 U/mL、約35 U/mL、約40 U/mL、約45 U/mL、約50 U/mL、約55 U/mL、約60 U/mL、約65 U/mL、約70 U/mL、約75 U/mL、約80 U/mL、約85 U/mL、約90 U/mL、約95 U/mL、約100 U/mL、約110 U/mL、約120 U/mL或更高)之臨限細胞自溶酶G活性值指示慢性傷口感染。在一些實施例中，至少50 U/mL、至少40 U/mL、至少30 U/mL、至少20 U/mL、至少15 U/mL或至少10 U/mL之細胞自溶酶G活性值指示慢性傷口感染。 本文所揭示之實施例另外係關於使用本文所闡述之組合物、材料、物件、敷料套組及/或系統來治療慢性或感染傷口。治療實施例包含使所揭示技術之組合物、材料、物件、敷料、套組、系統或器件與有需要之個體接觸。視情況，該方法可包含測定個體是否對治療具有反應。 熟習此項技術者能夠容易地鑑別傷口是否「對治療具有反應」。特定而言，熟習此項技術者能夠易於測定本發明技術方案中所鑑別蛋白酶預測或指示對傷口治療、尤其對使用包括氧化纖維素之傷口敷料之治療之良好反應或較差反應的濃度。本文所用之術語「反應性」及「反應者」係指可視為對傷口治療、尤其對使用藥理學藥劑(例如抗生素)之治療充分反應之傷口。類似地，「無反應性」及「無反應者」係指不視為對傷口治療、尤其對使用藥理學藥劑(例如抗生素)之治療充分反應之傷口。舉例而言，在治療傷口4週之後展現優於50%傷口閉合之患者可視為對該治療具有反應性。 在某些實施例中，可使用本文所闡述之組合物、物件、系統或器件同時診斷及治療患者。在用於本文中時，術語「同時」意指一起實施所陳述目標(例如診斷及治療)。 在某些實施例中，可使用本文所闡述之組合物、物件、系統或器件依序診斷及治療患者。在用於本文中時，術語「依序」意指所陳述目標(例如診斷及治療)在時間或空間上分離，例如在治療之前診斷或在治療後診斷或其組合，例如第1診斷==＞治療==＞第2診斷。 本文所闡述之實施例另外使得照護者或患者能夠迅速且可靠地測定傷口是否可能不癒合，且基於此測定來選擇適當療法。舉例而言，非癒合傷口可需要施加特殊傷口敷料(例如包括特定治療劑之傷口敷料)以促進癒合。因此，本文所闡述之實施例另外提供治療傷口(例如慢性或感染傷口)之方法，其包括測定傷口係癒合抑或非癒合，隨後在非癒合時向傷口施加包括治療劑 之傷口敷料。 本文所闡述之實施例提供診斷或檢測感染傷口之方法及分析。該等方法適於檢測細菌傳染原。在一實施例中，傷口經革蘭氏(gram)陰性細菌感染。典型革蘭氏陰性細菌包含變形菌門(proteobacteria)，例如大腸桿菌、沙門桿菌屬(
Salmonella
)
、
假單胞菌屬(
Pseudomona
s)及螺桿菌屬(
Helicobacter
)及藍藻細菌(
cyanobacteria
)。在結合醫學進行分類時，其包含引起呼吸系統障礙之銅綠假單胞菌(
Pseudomonas aeruginosa
)及流行性感冒嗜血桿菌(
Hemophilus influenzae
)、引起泌尿系統障礙之大腸桿菌及奇異變形桿菌(Proteus
mirabilis
)及引起消化系統障礙之幽門螺旋桿菌(
Helicobacter pylori
)及格特納桿菌(
Bacillus Gaertner
)及微球菌屬(例如腦膜炎雙球菌(
Neisseria meningitidis
)
、
卡他莫拉菌(
Moraxella catarrhalis
)及奈瑟氏淋球菌(
Neisseria gonorrhea
))
。
在另一實施例中，傷口經革蘭氏陽性細菌感染。「革蘭氏陽性細菌」意指在細胞壁中含有磷壁酸(例如脂磷壁酸及/或細胞壁磷壁酸)或功能等效之醣聚物(例如鼠李糖聚醣、糖醛酸磷壁酸、阿拉伯半乳聚醣、脂化甘露聚醣及脂阿拉伯甘露聚醣)之一或多種細菌。功能等效之醣聚物之非限制性實例闡述於Weidenmaier等人，
Nature
,
6
:276-287, 2008中。 細菌包含感染哺乳動物宿主(例如牛、鼠類、馬、靈長類動物、貓、犬類及人類宿主)之病原性細菌。該等病原性細菌之實例包含(例如)諸如以下等細菌物種之成員：類桿菌(
Bacteroides
)
、
梭菌
、
鏈球菌屬(
Streptococcus
)
、
葡萄球菌屬(
Staphylococcus
)
、
假單胞菌屬
、
嗜血桿菌屬(
Haemophilus
)
、
軍團菌屬(
Legionella
)
、
分枝桿菌屬(
Mycobacterium
)
、
埃希氏菌屬(
Escherichia
)
、
沙門桿菌屬(
Salmonella
)
、
志賀桿菌屬(
Shigella
)
、
弧菌屬(
Vibrio
)或李氏菌屬(
Listeria
)。引起人類宿主之疾病之病原性細菌之一些臨床相關實例包含(但不限於)炭疽芽孢桿菌(
Bacillus anthracis
)、蠟狀芽孢桿菌(
Bacillus cereus
)、百日咳博德氏菌(
Bordetella pertussis
)、伯氏疏螺旋體(
Borrelia burgdorferi
)、流產布魯氏桿菌(
Brucella aborus
)、犬布氏桿菌(
Brucella canis
)、地中海熱布魯氏桿菌(
Brucella melitensis
)、豬布魯氏桿菌(
Brucella suis
)、空腸曲桿菌(
Campylobacter jejuni
)、肺炎披衣菌(
Chlamydia pneumoniae
)、鸚鵡披衣菌(
Chlamydia psittaci
)、沙眼披衣菌(
Chlamydia trachomatis
)、肉毒梭菌(
Clostridium botulinum
)、難養芽胞梭菌(
Clostridium difficile
)、產氣莢膜梭菌(
Clostridium perfringens
)、破傷風梭菌(
Clostridium tetani
)、白喉棒桿菌(
Corynebacterium diphtheriae
)、糞腸球菌(
Enterococcus faecalis
)、萬古黴素抗性糞腸球菌(
vancomycin-resistant Enterococcus faecalis
)、屎腸球菌(
Enterococcus faecium
)、大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌(
Enterotoxigenic Escherichia coli
)
(ETEC)
、腸道病原性大腸桿菌(
Enteropathogenic Escherichia coli
)、大腸桿菌
O157:H7
、土倫病弗朗西斯氏菌(
Francisella tularensis
)、流感嗜血桿菌(
Haemophilus influenzae
)、幽門螺旋桿菌(
Helicobacter pylori
)、嗜肺軍團菌(
Legionella pneumophila
)、問號鉤端螺旋體(
Leptospira interrogans
)、單核球增多性李氏菌(
Listeria monocytogenes
)、麻瘋分枝桿菌(
Mycobacterium leprae
)、結核分枝桿菌(
Mycobacterium tuberculosis
)、肺炎支原體(
Mycoplasma pneumoniae
)、淋病雙球菌(
Neisseria gonorrhoeae
)、腦膜炎雙球菌(
Neisseria meningitidis
)、變形桿菌、綠膿桿菌(
Pseudomonas aeruginosa
)、立氏立克次氏體(
Rickettsia rickettsii
)、傷寒沙門氏菌(
Salmonella typhi
)、鼠傷寒沙門氏菌(
Salmonella typhimurium
)、宋氏志賀菌(
Shigella sonnei
)、金黃色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus
)、表皮葡萄球菌(
Staphylococcus epidermis
)、腐生性葡萄球菌(
Staphylococcus saprophyticus
)、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(
methicillin-resistant Staphylococcus aureus
)
(MRSA)
、萬古黴素抗性金黃色葡萄球菌(
vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VSA)
)、無乳鏈球菌(
Streptococcus agalactiae
)、肺炎鏈球菌(
Streptococcus pneumoniae
)、釀膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes
)、梅毒密螺旋體(
Treponema pallidum
)、霍亂弧菌(
Vibrio cholerae
)及鼠疫耶爾辛氏菌(
Yersinia pestis
)。 在另一實施例中，感染性細菌係選自由以下組成之群：難養芽胞梭菌(
Clostridium difficile
)、碳青黴烯抗性腸桿菌科(Carbapenem-Resistant
Enteroobacteriaceae
)(CR-克雷伯菌屬(
Klebsiella
spp)；CR-大腸桿菌)及淋病雙球菌(
Neisseria gonorrhoeae
)。在另一實施例中，感染性細菌係選自由以下組成之群：多藥物抗性不動桿菌(
Acinetobacter
)、藥物抗性彎曲桿菌(
Campylobacter
)、產生超廣譜β-內醯胺酶(ESBL)之腸桿菌科(
enterobacteriaceae
)、萬古黴素抗性腸球菌(
enterococcus
)、多藥物抗性銅綠假單胞菌、藥物抗性非傷寒性沙門桿菌屬、藥物抗性傷寒沙門菌(
Salmonella enterica serovar Typhi
)、藥物抗性志賀桿菌屬、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)、藥物抗性肺炎鏈球菌及藥物抗性結核症。在另一實施例中，感染性細菌係選自由以下組成之群：萬古黴素抗性金黃色葡萄球菌、紅黴素抗性A群鏈球菌屬、克林達黴素抗性B群鏈球菌屬。 在某些實施例中，慢性或感染傷口發現於宿主個體中。較佳地，宿主係哺乳動物，例如齧齒類動物、人類、家畜動物、伴侶動物或非家養或野生動物。在一實施例中，個體可為齧齒類動物，例如小鼠、大鼠、天竺鼠等。在另一實施例中，個體可為家畜動物。適宜家畜動物之非限制性實例可包含豬、母、馬、山羊、綿羊、駱馬及羊駝。在再一實施例中，個體可為伴侶動物。伴侶動物之非限制性實例可包含寵物，例如狗、貓、兔及鳥。在又一實施例中，個體可為動物園動物。如本文中所使用，「動物園動物」係指可發現於動物園中之動物。該等動物可包含非人類靈長類動物、大型貓科動物(large cat)、狼及熊。在一實例性實施例中，個體係人類。 在一態樣中，本文提供檢測哺乳動物傷口中之一或多種酶之濃度之方法，該方法包括以下步驟：(a)使本文所闡述之傷口敷料材料與哺乳動物傷口接觸；(b)目測比較與哺乳動物傷口接觸之傷口敷料材料與一或多種參考試樣；及(c)獲得與哺乳動物傷口接觸之傷口敷料材料中之報告基因分子之濃度的定性測定。 較佳地，原位實施診斷及治療。本文所闡述之實施例由此容許以容易之非侵襲性方式來診斷及治療傷口。舉例而言，可實時進行診斷且可將治療施加至感染傷口或患者(全身性)，且實時監測傷口治療之進展(例如由報告基因分子生成之信號因傷口癒合所致之消散)。 在另一態樣中，本文提供使用化學實體檢測傷口中之蛋白酶活性之方法，其中化學實體包括一或多種選自由以下組成之群之組分：錨區域、酶不穩定或酶反應性區域及指示劑區域。在另一態樣中，該方法包括將用於MPO、彈性蛋白酶、溶菌酶、磷脂酶及過氧化氫酶之受質置於固體表面上，從而可肉眼觀察任一反應。在另一態樣中，該方法用於經由使各種體液(包含傷口、淚液、玻璃體、CSF、氣道抽吸物或痰、滑膜、血液、血漿、血清、尿、腹膜腔、間質、皮下、膽汁、腸或類似之流體)與含有受質之材料接觸來評價該等體液且然後評價受質變化。
實例
本文所闡述之結構、材料、組合物及方法意欲係代表性實例，且應理解，本發明範圍並不由實例範圍限制。熟習此項技術者應認識到，可使用所揭示結構、材料、組合物及方法之變化實踐實施例及所揭示技術，且該等變化可視為在本發明內。
實例 1 ： 幾丁聚醣之純化
將幾丁聚醣(10 g，來自蝦殼)溶於2%乙酸溶液(1 L)中。將溶液在室溫下攪拌過夜且然後使用耐綸(nylon)過濾器(0.45 µm)過濾。隨後，藉由添加4M NaOH來將pH調節至8以沈澱幾丁聚醣。藉由離心(10000 rpm, 10 min)分離所獲得沈澱物且使用蒸餾水充分洗滌直至洗滌溶液之pH達到約7為止。然後，使用90%乙醇洗滌沈澱物，蒸發剩餘乙醇且凍乾幾丁聚醣。藉由FTIR (1560 cm
-1
, 1640 cm
-1
)分析純化產物且進一步使用大致DA為48%之材料。
實例 2 ： 幾丁聚醣之選擇性 N - 乙醯化
將純化幾丁聚醣(實例1)溶於10%乙酸溶液中以獲得1%幾丁聚醣溶液。添加等體積之96%乙醇以及乙酸酐。將反應液攪拌1 h，然後將pH調節至7。藉由離心分離沈澱物且凍乾。隨後，使用蒸餾水洗滌所獲得乙醯化幾丁聚醣若干次且再次凍乾。藉由
1
H-NMR及FTIR (1560 cm
-1
, 1640 cm
-1
)分析
N
-乙醯化程度(DA)且發現DA為40-60%，如下圖中所指示。產生具有不同DA之幾丁聚醣衍生物，但僅進一步使用DA為48%之材料。
實例 3 ： 活性黑 5 在乙醯基 - 幾丁聚醣上之偶聯
將乙醯化幾丁聚醣(DA = 48%, 100 mg；實例2)懸浮於蒸餾水中，然後添加活性黑5之0.5% (w/w)溶液(0.5 mL)。添加由於蒸餾水中之2.5% (w/v) Na
2
SO
4
及1% (w/v) Na
2
CO
3
組成之溶液，且將混合物遵在25℃下培育10 min。在65℃下進行後續培育步驟之後，藉由離心(7800 rpm, 5 min)分離固體。使用蒸餾水洗滌沈澱物直至洗滌溶液保持無色為止，且隨後凍乾。藉由在完成反應之後量測未結合活性黑5來測定染料含量。染料與沈澱物及高MW部分極為有關。醯基化程度為48%。
實例 4 ： 水解幾丁聚醣以獲得幾丁寡醣
將純化幾丁聚醣(2.5 g；實例1)溶於乙酸鹽緩衝液(100 mM, pH 5)中以獲得1%幾丁聚醣溶液。然後，添加來自灰色鏈黴菌(
Streptomyces griseus
)之幾丁聚醣酶(1單位)且將反應混合物在熱混合器(37℃, 150 rpm)上攪拌5 d。在真空中濃縮溶液且使用1等效體積之96%乙醇沈澱非寡聚幾丁聚醣。再次濃縮上清液且隨後藉由添加9等效體積之丙酮來沈澱寡醣。藉由離心來分離寡醣，使用50%丙酮水溶液洗滌若干次，且在並不預先洗滌下凍乾。藉由TLC及SEC (TSK凝膠G5000 PWXL，使用支鏈澱粉作為標準)來測定聚合程度，從而指示5360之平均MW締合至約24之聚合程度。
實例 5 ：幾丁寡醣之選擇性 N - 乙醯化
將幾丁寡醣混合物(7 g) (實例4)溶於蒸餾水(200 mL)中，然後添加96%乙醇(400 mL)。將溶液攪拌5 min且添加乙酸酐(4.12 mL，1莫耳當量(針對游離胺所計算))。將混合物在室溫下再攪拌2 h，然後使用 10% NaOH溶液將pH調節至7。去除溶劑，且凍乾剩餘沈澱物。藉由
1
H-NMR、FTIR (1560 cm
-1
, 1640 cm
-1
)分析
N
-乙醯化程度且測得染料含量(光度計量方式，626 nm)。發現N-乙醯化程度為48%。
實例 6 ： 甲苯胺 O 藍在幾丁寡醣上之偶聯
將乙醯化幾丁寡醣(DA = 48%, 7 g；實例5)分散於1%乙酸(500 mL)中。然後，添加甲苯胺O藍(3.9 g)且使其溶解，然後添加1ml戊二醛溶液。將混合物攪拌2 h且使用10% NaOH將pH調節至7。藉由過濾分離固體部分，使用蒸餾水洗滌若干次，且凍乾。藉由
1
H-NMR、FTIR及光度計量方式分析
N
-乙醯化程度。發現乙醯化程度為48%。發現染料含量為0.74。 染色幾丁聚醣衍生物之溶菌酶消解。以以下不同介質中探究合成受質：磷酸鉀緩衝液(66 mM, pH 6.2)以及含有來自雞蛋白之5000 U溶菌酶之人工傷口液及來自感染傷口之人類傷口液(參見圖5及6)。 將2毫克溶菌酶受質懸浮於各別測試介質中且在35℃下培育。對於時間量測而言，將試樣短暫離心，將200 µL上清液轉移至96孔板中且在各別染料之最大吸收下以光度計量方式進行分析。在分析之後，將汲取試樣返回反應小瓶中且進一步培育。 人工傷口液之組合物含有人類血清白蛋白(2%)、氯化鈉(0.36%)、碳酸氫鈉(0.05%)、檸檬酸鈉(0.02%)、乳酸鈉(0.1%)、葡萄糖(0.1%)、二水合氯化鈣(0.01%)、氯化鎂(0.02%)及脲(0.01%)。
實例 7 ： 用於檢測傷口感染之基於吲哚 / 幾丁寡聚物之受質之合成。
(GlcNAc)
n
-吲哚 (n = 4-6)之合成
幾丁質之乙醯解
將幾丁質(2 g)懸浮於冷卻乙酸酐(20 mL)中且逐滴添加濃磷酸(2,3 mL)。將懸浮液攪拌過夜且使其達到室溫。使用乙酸鈉(12 g)中和溶液，然後使用冰冷水稀釋。過濾溶液且使用氯仿萃取濾液。使用碳酸氫鹽洗滌氯仿相，藉由硫酸鎂乾燥並在真空中濃縮。 藉由MPLC (SiO
2
, 40g)使用氯仿:乙醇梯度(98:2 → 90:10)分級分離不同聚合程度(DP)之所得幾丁寡醣(COS)。
實例 8 ： 1- 氯 ,3-O,6-O- 二乙醯基 -4-O-[3-O,4-O,6-O- 三乙醯基 -2-( 乙醯基胺基 )-2- 去氧 - β -D- 吡喃葡糖基 ]-2-( 乙醯基胺基 )-2- 去氧 - α -D- 吡喃葡萄糖苷 ( 化合物 7)
將幾丁二醣八乙酸酯2 (20 mg)懸浮於乙醯氯中且使用HCl氣體使溶液飽和並攪拌30 h。然後，蒸發溶液且未經進一步純化即使用。
實例 9 ： 1-(5- 溴 -4- 氯 -N- 乙醯基 -3- 吲哚基 ),3-O,6-O- 二乙醯基 -4-O-[3-O,4-O,6-O- 三乙醯基 -2-( 乙醯基胺基 )-2- 去氧 - β -D- 吡喃葡糖基 ]-2-( 乙醯基胺基 )-2- 去氧 - α -D- 吡喃葡萄糖苷 ( 化合物 13)
將化合物7 (0,028 mmol)溶於DCM (2.5 mL)中，添加11 (82.87 mg)並溶解。然後添加四丁基-硫酸氫銨(9.7 mg)及1 mL 1 M碳酸鉀溶液。在劇烈攪拌下，將反應液在室溫下保持1 h。分離有機相且在壓力下去除溶劑。 使用12 g MPLC管柱利用純氯仿至15份數氯仿與一份數乙醇之梯度以10管柱體積進行分離。然後使用等梯度之5管柱體積之15份數氯仿與一份數乙醇。最終沖洗步驟為5管柱體積之10份數氯仿與一份數乙醇。
實例 10 ： N- 乙醯基葡萄糖胺 (GlcNAc) 噁唑啉 15
將GlcNAc 14 (100 mg)溶於H
2
O (1,8 mL)中且添加三乙胺(0,6 mL)。將溶液冷凍於冰浴中，然後添加2-氯-1, 3-二甲基氯化物咪唑鎓(DMC, 230 mg)。將溶液攪拌30 min。藉由MPLC (C18)使用H
2
O作為洗脫劑去除DMC及TEA。彙集產物部分並在真空中濃縮。
GlcNAc二聚體(化合物
17)
將化合物
15
(27 mg)溶於磷酸鈉緩衝液(50 mM, pH 8,0)中且添加幾丁質酶(25 mU/mL)。培育溶液且藉由TLC (CHCL3:MeOH 2:1)監測反應進展。
(GlcNAc)
2
-吲哚(化合物
18)
將化合物
15
(27 mg)及GlcNAc -吲哚
16
溶於磷酸鹽鈉緩衝液(50 mM, pH 8,0)中且添加幾丁質酶(25 mU/mL)。培育溶液且藉由TLC (CHCL3:MeOH 2:1)監測反應進展。
實例 11 ： 2- 乙醯胺基 -3,4,6- 三 -O- 乙醯基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡糖基氯 將
N- 乙醯基 - β -D- 葡萄糖胺
四乙酸酯(391 mg, 1.00 mmol)懸浮於乙醯氯(7 mL)中，同時使用冰浴冷卻。使用氬將混合物脫氣5 min。然後經兩小時時段逐滴添加MeOH (1.00 mL)。在前15 min MeOH添加期間，使用氬將反應混合物脫氣；然後將其保持於氬氣氛下(始終在冰浴中攪拌)。在完成MeOH之添加之後，將反應混合物再攪拌10 min且在冰浴中冷卻。然後將其升溫至室溫且在室溫下攪拌過夜。將混合物濃縮至乾燥，吸收於DCM (10 mL)中，再次濃縮至乾燥，吸收於二異丙基醚(15 mL)中並再次濃縮至乾燥以產生黃色固體，該黃色固體未經進一步純化即使用。
實例 12 ： (N
- 乙醯基 -5- 溴 -4- 氯 - 吲哚 -3- 基 ) 2- 乙醯胺基 -3,4,6- 三 -O- 乙醯基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡萄糖苷 (12a) 及 (5- 溴 -4- 氯 - 吲哚 -3- 基 ) 2- 乙醯胺基 -3,4,6- 三 -O- 乙醯基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡萄糖苷 (12b) 使用氬將DMF (無水，4 mL)脫氣5 min，然後添加乙酸1-乙醯基-5-溴-4-氯-3-吲哚基酯(100 mg, 0.30 mmol)。使用氬將混合物再脫氣5 min，然後一次性添加NaOMe (51 mg, 0.94 mmol)。在室溫下攪拌，同時使用氬繼續脫氣25 min，然後一次性添加2-乙醯胺基-3,4,6-三-
O
-乙醯基-2-去氧-D-吡喃葡糖基氯(110 mg, 0.30 mmol)。在室溫及避光(鋁箔)下攪拌反應混合物，同時使用氬脫氣1 h，然後在氬氣氛、室溫及避光下攪拌過夜。將混合物濃縮至乾燥且使用甲苯(3 × 20 mL)共蒸發。然後將其吸收於EtOAc (30 mL)中且過濾。將濾液濃縮至乾燥以產生150 mg粗產物。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
: 597 (
14b
)及[M+Na]
+
：639 (
12a
)。
實例 13 ： ( 吲哚 -3- 酸甲酯 ) 2- 乙醯胺基 -3,4,6- 三 -O- 乙醯基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡萄糖苷 在室溫下，將2-乙醯胺基-3,4,6-三-O-乙醯基-2-去氧-D-吡喃葡糖基氯(1.00 mmol，實例13)、TBAHS (339 mg, 1.00 mmol)及甲基-3-羥基-1 H-吲哚-2-甲酸酯(210 mg, 1.10 mmol)溶於DCM (無水，10 mL)中。然後一次性添加K
2
CO
3
溶液(12 mL)且將混合物在室溫下攪拌2.5 h。添加DCM (20 mL)及水(20 mL)。在萃取之後，乾燥(Na
2
SO
4
)有機相並濃縮至乾燥。藉由管柱層析(30.0 g矽膠，洗脫劑：於DCM中之5% MeOH)純化粗產物，分離出250 mg純產物及92 mg含雜質產物。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
: 543, [M+ K]
+
: 559。
實例 14 ： ( 吲哚 -3- 基酸甲酯 ) 2- 乙醯胺基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡萄糖苷 在室溫下，將(吲哚-3-基酸甲酯) 2-乙醯胺基-3,4,6-三-O-乙醯基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖苷(250 mg, 0.48 mmol)懸浮於MeOH (7 mL)中。添加NaOMe (催化量)且將混合物在室溫下攪拌1 h 45 min。過濾掉沈澱物。因沈澱物及濾液之MS相同，故將其再次組合並濃縮至乾燥。將產物懸浮於DCM/MeOH (9:1, 10mL)中且保持於冰箱中3h。過濾掉無色固體以產生90 mg無色固體。將濾液再次濃縮至乾燥以產生105 mg微褐色固體。固體及濾液皆未經進一步純化即使用。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
: 417。
實例 15 ： ( 吲哚 -3- 基酸 ) 2- 乙醯胺基 -2- 去氧 -D- 吡喃葡萄糖苷 將(吲哚-3-基酸甲酯) 2-乙醯胺基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖苷(105 mg, 0.25 mmol)懸浮於NaOH溶液(0.1 M於水中，10 mL)中並在室溫下攪拌3.5 h。將反應混合物濃縮至乾燥且產物未經進一步純化即使用。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
: 403。
實例 16 ： (N
- 乙醯基 - 吲哚 -3- 基 ) 2- 去氧 -3,4,6- 三 -O- 乙醯基 -D- 吡喃葡萄糖苷 將(吲哚-3-基酸) 2-乙醯胺基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖苷(105 mg, 0.25 mmol)、AgOAc (125 mg, 0.75 mmol)、K
2
CO
3
(207 mg, 1.50 mmol)及Ac
2
O (6 mL)加熱至118℃ (油浴溫度)保持1 h。然後將反應混合物冷卻至室溫。添加DCM (40 mL)及水(30 mL)。在萃取之後，使用飽和NaHCO
3
-溶膠(3 × 30 mL)洗滌有機相，乾燥(Na
2
SO
4
)，並濃縮至乾燥。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
: 527。
實例 17 ： 乙醯基 - 寡 - β -D-1,4- 葡萄糖胺 將吡啶(500 µL)及乙酸酐(500 µL)添加至幾丁聚醣寡聚物(寡聚物及乙酸鈉之比率為5:4.1之混合物) (101 mg，鏈長度介於1與4之間)且將混合物在室溫下振盪過夜。因並非所有材料皆溶解，故將混合物再次振盪過夜。然後將其在冰箱中保持10天。添加DCM (20 mL)且將混合物傾倒於冰冷檸檬酸(10%於水中，20 mL)中。在萃取之後，使用冰冷檸檬酸(10%於水中，20 mL)洗滌有機相，隨後使用鹽水(15 mL)洗滌。乾燥(Na2SO4)有機相並濃縮至乾燥(64 mg粗產物)。粗產物未經進一步純化即使用。MS數據： ESI-MS (陽離子)：[M+Na]+ (二聚體)：699，[M+Na]+ (三聚體)：986。
實例 18 ： 1- 氯 - 過乙醯基 - 寡 -ß-D-1,4- 葡萄糖胺 將實例19之粗產物在氬氣氛下溶於乙醯氯(1 mL)中並在冰浴中冷卻。在大約1 min內逐滴添加MeOH (55 µL)。在完成添加之後，將混合物在冰浴中再攪拌10 min，然後將溶液升溫至室溫；添加額外乙醯氯(05 mL)。將混合物在室溫下攪拌過夜。然後將其濃縮至乾燥，吸收於二氯甲烷(5 mL)中，再次濃縮至乾燥，懸浮於二異丙基醚中並再次濃縮至乾燥以產生55 mg粗產物。粗產物未經進一步純化即用於下一步驟中。
實例 19 ： O -(2- 羧甲基 -3- 吲哚基 )- 過乙醯基 - 寡 -β-D-1,4- 葡萄糖胺 在室溫下，將實例20之粗產物(55 mg粗產物)、四丁基硫酸氫銨(20 mg)及3-羥基-1H-吲哚-2-甲酸甲酯(13 mg)溶於DCM (無水，1.5 mL)中；添加K
2
CO
3
(1 M於水中，1 mL)且將混合物在室溫下攪拌過夜。添加DCM (20 mL)及水(15 mL)。在萃取之後，乾燥(Na
2
SO
4
)有機相並濃縮至乾燥(39 mg粗產物)。藉由管柱層析純化粗產物。洗脫劑：於DCM中之5% MeOH。分離：1.8 mg具有一個糖部分之產物，1.2 mg具有兩個糖部分之產物。ESI-MS (陽離子)：[M+Na]
+
(單體)：543, [M+Na
+
] (dimer): 830。
實例 20. 用於檢測傷口感染之基於酚 / 幾丁聚醣 / 漆酶之受質之合成。
使用芥子酸(SA)接枝之N-乙醯基幾丁聚醣。 將N-乙醯基幾丁聚醣溶於乙酸鈉緩衝液(100mM, pH 5,0)中以獲得1%溶液 (w/v)。將20 mL此溶液與20 mL於乙醇中之芥子酸溶液(20 mM)混合。添加EDC及NHS (各1,3 g)且將溶液攪拌2 h。藉由逐滴添加NaOH (1M)來停止反應，使用水洗滌所得沈澱物直至在洗滌溶液中不可檢測到酚為止。然後凍乾產物。 N-乙醯基幾丁聚醣/胺基甲氧基苯酚奈米顆粒 將N-乙醯基幾丁聚醣溶於乙酸鈉緩衝液(100 mM, pH 5,0)中且添加胺基甲氧基苯酚(溶於乙醇中)以獲得20 mM之總濃度。將2,3 mL此溶液與1,6 mL十二烷混合且施加至超音波器中以產生乳液。 藉由溶菌酶水解SA接枝N-乙醯基幾丁聚醣 將SA接枝N-乙醯基幾丁聚醣(5 mg)懸浮於500 µL含有溶菌酶(0,1 mg/mL)之磷酸鉀緩衝液(62 mM, pH 6,2)中。將溶液培育一小時。將反應上清液與漆酶(1 U/mL)一起培育且觀察到瞬時色彩變化。 藉由溶菌酶水解N-乙醯基幾丁聚醣/胺基甲氧基苯酚奈米顆粒 將N-乙醯基幾丁聚醣/胺基甲氧基苯酚奈米顆粒乳液(50 µL)與450 µL含有溶菌酶(0,1 mg/mL)及漆酶(1 U/mL)之磷酸鉀緩衝液(62 mM, pH 6,2)混合。奈米顆粒在15 min之後遭到破壞(產生澄清溶液)，從而產生較強色彩。
實例 21. 用於檢測傷口感染之肽聚醣之染色
可使用不同反應性染料來染色肽聚醣(表1)。較佳者係含有磺醯基乙基-硫酸氫酯反應性基團之反應性染料(例如活性黑5、雷瑪唑亮藍、活性紫5或活性橙16)。患者，可使用含有二氯三嗪反應性基團之染料(例如活性藍4、活性紅120、活性藍2、活性綠19及活性棕10)。藉由考慮與肽聚醣之反應程度及在將染色肽聚醣與溶菌酶一起培育時染料之釋放速度來評估染料(關於染色可參見實例7之較早部分且關於消解分析可參見實例6)。
表 1.
反應性染料之評估
肽聚醣染色程序1： 用於使用反應性染料染色之肽聚醣之製備及滅菌： 將來自無動物發酵之溶壁微球菌(Micrococcus lysodeicticus)細胞培養液在4000 g及4℃下離心15 min以得到濕潤細胞團粒。使用ddH2O (800 ml)將細胞團粒(20 g)洗滌兩次以去除任何剩餘培養基組分(恆定離心條件)。 將濕潤溶壁微球菌細胞團粒(20 g，濕潤:乾燥比率為4:1，5 g乾燥溶壁微球菌細胞)懸浮於1 M HCl (80 g)中且在60℃及720 rpm下培育1 h。然後將滅菌及中斷細胞在4000 g及4℃下離心15 min。再懸浮肽聚醣團粒且使用硫酸鈉緩衝液(400 ml, 100 mM, pH 7.0)洗滌以將懸浮液之pH調節至中性pH且去除破壞過程之細胞組分(恆定離心條件)。使用500 ml ddH2O實施另一洗滌步驟以去除經破壞細胞組分及緩衝液鹽。將在最後洗滌步驟之後之所獲得團粒備用於染色程序。 將肽聚醣(50 mg)、活性黑5 (5 mg)、Na2CO3 (10 mg)及Na2SO4 (25 mg)溶解/懸浮於雙蒸餾水(ddH2O) (2 mL)中。在振盪1 min之後，將反應混合物在25℃及750 rpm下培育10 min，隨後在65℃及750 rpm振盪下再進行第二培育步驟30 min。 將染色肽聚醣在10000g下離心10 min。收集上清液，且將團粒再懸浮於ddH2O中並在10000g下再次離心10 min。重複洗滌程序直至上清液澄清為止。可使用不同緩衝液或有機溶劑(例如乙醇)進行洗滌程序。在597 nm下量測所有上清液之吸光度值。若吸光度低於0.05之值，則將上清液定義為澄清。使用校準曲線及上清液之所量測吸光度值來計算上清液中之未結合染料之量。由此計算肽聚醣結合染料之量。將染色肽聚醣儲存於4-8℃下最長2 wk或經由凍乾來乾燥保持較長儲存時段。 肽聚醣染色程序2： 將活性黑5 (200 mg)及肽聚醣(300 mg)溶於ddH2O (40 mL)中。將反應溶液在50℃下攪拌30 min。在30 min期間，每6 min添加Na2SO4 (1 g) (總量：4 g)。在前30 min培育之後，將Na3PO4 (200 mg)添加至反應溶液中，在50℃下再次攪拌30 min。 將染色肽聚醣在10000g下離心10 min。收集上清液，且將團粒再懸浮於ddH2O中並在10000g下再次離心10 min。重複洗滌程序直至上清液澄清為止。可使用不同緩衝液或有機溶劑(例如乙醇)進行洗滌程序。在597nm下量測所有上清液之吸光度值。若吸光度低於0.05之值，則將上清液定義為澄清。使用校準曲線及上清液之所量測吸光度值來計算上清液中之未結合染料之量。由此計算肽聚醣結合染料之量。將染色肽聚醣儲存於4-8℃下(其中其表現地較為穩定)或經由凍乾乾燥。 肽聚醣染色程序3： 將肽聚醣(150 mg，乾重)懸浮於ddH2O (20 ml)中且加熱至50℃。藉由添加活性黑5來開始反應(根據表X使用不同量之反應性染料之7種不同變體)。將反應液在50℃下攪拌(210 rpm) 1 h。在前10 min之後，每10分鐘週期性添加Na2CO3 (5 × 100 mg，在10、20、30、40及50 min反應時間之後)。在最後添加Na2CO3之後，將反應混合物再攪拌10 min。將反應溶液在4000 g及4℃下離心15 min。再懸浮團粒且在ddH2O (40 g)中洗滌3次並總是如上所述進行離心。可使用不同緩衝液或有機溶劑(例如乙醇)進行洗滌程序。將所有上清液稱重且用於測定未結合染料濃度並進一步由此用於測定染色程度。因此，將1 ml每一上清液轉移至1.5 ml埃彭道夫管(Eppendorf tube)中且在10000 g及環境溫度下離心5 min。將3× 100 µl每一上清液轉移至96孔板中且在597 nm下量測吸光度濃度。若吸光度低於0.05之值，則將上清液定義為澄清。使用校準曲線及上清液之所量測吸光度值來計算上清液中之未結合染料之量。結合染料之百分比列示於表2中。整個染色肽聚醣構築體(LPG-RB5)之活性黑5之百分比亦列示於表2中。
表 2 ：染色肽聚醣之不同變體 實例 22. 用於檢測傷口感染之溶菌酶活性量測
染色肽聚醣： 製備(NaCl溶液， 0.9%)每一LPG-RB5變體(實例21) (1.5 mg/ml)之一份懸浮液且分成各61 ml之試樣(3陽性，3陰性)。將陽性對照與溶菌酶儲備溶液(10 µl, 1,000,000 U/ml)混合直至最終溶菌酶活性為10,000 U/ml。將所有試樣在37℃下培育60 min且然後離心(5 min, 10000 g)。在上清液中檢測藍色之出現。將100 µl每一上清液轉移至96孔板中且在597 nm下量測吸光度。不同變體之上清液之吸光度展示於圖8中。染色程度之影響展示於圖9中。
染料 :PG 比率之計算 ： 未結合染料之量 ： AbsWL…不同洗滌溶液在597nm下之所量測吸光度 d…染料校準曲線之線性回歸之截距 k…染料校準曲線之線性回歸之斜率 z…所量測洗滌溶液之稀釋因子 y…洗滌溶液之體積(ml) x…洗滌溶液中之RB5之量(mg)
結合染料之量 ： a
=(
所用染料量
)-(
未結合染料量
) a…結合染料之量
染料容器中之染料含量之考慮 ： c…結合染料之量(mg) (所考慮染料含量) 0.85… 85%染料含量 a…結合染料之量(mg)
由反應性染料 ( 活性黑 5) 之離去基團所致之重量損失之考慮 ： f…結合染料之最終量(mg) (-反應性基團) c…結合染料之量(mg) (所考慮染料含量)
PG 與 RB5 之間之比率 ： R…純PG與RB5之間之比率 L…乾燥PG-RB5之產量(mg) f…結合染料之最終量(mg)
實例 23 ： 用於檢測髓過氧化物酶活性之比色酶分析
可使用諸如3,4-二胺基苯甲酸、3-胺基-4-羥基苯甲酸、4-胺基-3-羥基苯甲酸、2,3-二胺基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸、2-胺基苯酚、2-胺基-3-甲氧基苯甲酸、3,4-二胺基苯甲酸甲酯及2-胺基-4-甲氧基苯酚等試劑來檢測MPO活性(表2)。分析條件：將1 mg/mL DABA或等效物溶於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.4)中。添加H
2
O
2
直至最終濃度為5 mM。將受質/H
2
O
2
溶液(95 µL)以及5 µL含MPO試樣添加至96孔微量滴定板中。在MPO氧化時，溶液變為微褐色。在450 nm下使用標準光度計量讀板儀來監測反應。
表 3. 新穎 MPO 受質之評估 實例 24. 使用聚合物結合序列構築人類白血球彈性蛋白酶 (HLE) 及人類細胞自溶酶 G (CatG) 受質
合成編碼來自纖維二糖水解酶I (裡氏木黴)之親水性碳水化合物結合模組(CBM)或來自聚羥基烷酸酯解聚酶(糞產鹼菌)之疏水性結合模組(PDB)之1至4個多聯體的嵌合基因變體。具有親水性結合模組(CBM)之嵌合變體使得能夠附接於基於纖維素之濾紙/織物上，與之相比，具有疏水性結合模組(PDM)之嵌合變體使得能夠附接於基於PET (聚對苯二甲酸乙二酯)之條帶上。 為賦予適當重組蛋白表現，設計TrxA-ElaSub1_CBM_ His融合蛋白之變體。構築體係由
trxA
(硫氧還蛋白)基因、編碼6xHis標籤之短間隔體序列(SEQ ID NO: 7)及腸激酶裂解位點(Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 8)) (用於分離TrxA融合標籤與所關注蛋白質)組成。在腸激酶位點之後，將新設計
elasub1_cbm
編碼序列引入構築體中。
elasub1
序列編碼暴露一些官能基(硫醇、羥基、胺基或羧基)之胺基酸。該等胺基酸(半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、麩胺酸、天門冬胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸)應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。用於天然親水性結合模組(CBM)之編碼序列緊接
elasub1
序列之(稱為
elasub1_cbm
)下游。另外，將用於HLE (Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))或用於CatG (Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10))之兩個或更多個識別/裂解位點引入
elasub1
編碼序列中。為觀察HLE或CatG之作用，將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子(例如雷瑪唑亮藍)附接至上文所列示胺基酸之官能基。嵌合肽經由HLE或CatG進行之酶促裂解使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽片段。經由離子交換，可藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段來觀察酶反應(HLE或CatG)。為純化嵌合肽，將編碼His標籤(6xHis (SEQ ID NO: 7))之額外重複序列延伸體附接至
elasub1_cbm
融合構築體之C-末端。 融合構築體trxA__elasub1_cbm_his之DNA序列；將來自表現載體pET32b(+)之序列加下劃線：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGG
GTGGTAGCTGCGGTGGTGGTGGTAGCGCAGCACCGGTTGGTGGTGGCGGTTCAGCTGCTCCTGTGGGTGGCGGTGGTTCACCGCCTGGTGGTAATCGTGGTACAACCACCACCCGTCGTCCGGCAACCACAACCGGTAGCAGTCCGGGTCCGACCCAGAGCCATTATGGTCAGTGTGGTGGTATTGGTTATAGCGGTCCGACCGTTTGTGCAAGCGGCACCACCTGTCAGGTTCTGAATCCGTATTATAGCCAGTGTCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA (SEQ ID NO: 13) TrxA_ElaSub1_CBM-His融合蛋白之蛋白質序列： MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMGGSCGGGGSAAPVGGGGSAAPVGGGGSPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCLLEHHHHHH* (SEQ ID NO: 14) 天然ElaSub1_CBM_His融合蛋白之蛋白質序列： MGGSCGGGGSAAPVGGGGSAAPVGGGGSPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCLLEHHHHHH* (SEQ ID NO: 15) 如表4中所展示來設計親水性結合模組之下列變體。
表 4 ： 具有親水性結合模組 (CBM) 以及可能具有疏水性結合模組之變體
變體1：ElaSub1_CBM。 ElaSub1構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub1蛋白質序列(稱為ElaSub1_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於HLE之兩個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))引入親水性間隔體區域中。為觀察HLE之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由HLE進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段來觀察HLE酶反應。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體2：CatGSub1_CBM。 CatGSub1構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub1蛋白質序列(稱為CatGSub1_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於CatG之兩個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10))引入親水性間隔體區域中。為觀察CatG之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由CatG進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段來觀察CatG酶反應。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體3：ElaSub1_CBM_His。 ElaSub1構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub1蛋白質序列(稱為ElaSub1_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於HLE之兩個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))引入親水性間隔體區域中。為觀察HLE之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由HLE進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段來觀察HLE酶反應。為純化此嵌合變體，將編碼His標籤之重複序列延伸體附接於編碼碳水化合物結合模組之序列之後。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體4：CatGSub1_CBM_His。 CatGSub1構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub1蛋白質序列(稱為CatGSub1_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於CatG之兩個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10))引入親水性間隔體區域中。為觀察CatG之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由CatG進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段來觀察CatG酶反應。為純化此嵌合變體，將編碼His標籤之重複序列延伸體附接於編碼碳水化合物結合模組之序列之後。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體5：ElaSub2_CBM。 ElaSub2構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub2蛋白質序列(稱為ElaSub2_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之三個密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於HLE之三個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))引入親水性間隔體區域中。為觀察HLE之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由HLE進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽/肽片段/片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段/片段來觀察HLE酶反應。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體6：CatGSub2_CBM。 CatGSub2_CBM構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接CatGSub2蛋白質序列(稱為CatGSub2_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之三個密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於CatG之三個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10))引入親水性間隔體區域中。為觀察CatG之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由CatG進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽/肽片段/片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段/片段來觀察CatG酶反應。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體7：ElaSub2_CBM_His。 ElaSub2構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接ElaSub2蛋白質序列(稱為ElaSub2_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之三個密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於HLE之三個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))引入親水性間隔體區域中。為觀察HLE之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由HLE進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽/肽片段/片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段/片段來觀察HLE酶反應。為純化此嵌合變體，將編碼His標籤之重複序列延伸體附接於編碼碳水化合物結合模組之序列之後。此變體之胺基序列展示於表4中。 變體8：CatGSub2_CBM_His CatGSub2_CBM構築體編碼主要係親水性之胺基酸之延伸體。用於天然親水性結合模組(CBM)之序列緊接CatGSub2蛋白質序列(稱為CatGSub2_CBM)下游。在此區域內插入用於半胱胺酸之三個密碼子。半胱胺酸之硫醇基團應促進染料或前染料至嵌合肽之偶合。另外，將用於CatG之三個識別/裂解位點(Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 10))引入親水性間隔體區域中。為觀察CatG之作用，可將某些包括帶正電或帶負電基團之染料分子附接至半胱胺酸之硫醇基團。嵌合肽經由CatG進行之酶促裂解應使得釋放攜載偶合染料或前染料之肽/肽片段/片段。經由離子交換，應藉由經由染料之帶電基團結合釋放肽片段/片段來觀察CatG酶反應。為純化此嵌合變體，將編碼His標籤之重複序列延伸體附接於編碼碳水化合物結合模組之序列之後。此變體之胺基序列展示於表5中。 可以與變體1至變體8相同之方式來設計變體9至變體16，只是將親水性碳水化合物結合模組(CBM)變為疏水性結合模組(PDB)。
表 5 ： 具有親水性碳水化合物結合模組之嵌合蛋白變體之胺基酸序列。 實例 25 ： 具有聚合物結合序列之彈性蛋白酶 (HLE) 受質之表現。
變體3 (實例9)：BL21 Gold (
DE3
) [pET32b(+)
ela sub1_cbm his
] 使用
Nco
I及
Xho
I限制位點/酶將嵌合基因選殖至pET32b(+)表現系統中。在大腸桿菌BL21 Gold (
DE3
) (一種蛋白酶缺失表現宿主，其使得能夠基於pET32b(+)表現載體之T7啟動子達成適當蛋白質表現)實施嵌合肽之最終蛋白質表現。使用補充有100 µg ml
-1
安比西林(ampicillin) (用於維持質體)之2xTY培養基來發酵含有重組[pET32b(+)
ela sub1_cbm
]構築體之BL21 Gold (
DE3
)宿主菌株。使用在30℃及振盪下生長之過夜培養物來接種主要培養物。使細胞在37℃下(快速誘導方案)及30℃下(緩慢誘導方案)及振盪下生長，直至600 nm下光學密度達到大約0.6為止。藉由添加0.5 mM IPTG (最終濃度)來誘導重組構築體之表現，而在37℃下實施蛋白質表現4小時(快速誘導)且在18℃下實施20小時(緩慢誘導)。兩個方案(快速及緩慢誘導)顯示關於可溶性重組蛋白之產率之相同結果。在蛋白質表現之後，藉由離心收穫細胞且藉由溶菌酶處理且隨後進行超音波處理來破壞細胞。使用SDS-PAGE監測重組蛋白之適當蛋白質表現，且與以相同方式表現之空 pET32b(+)載體進行比較。使用IBA Ni-NTA瓊脂糖重力流動管柱(1ml)根據IBA方案來純化來自粗製裂解物之嵌合構築體。使用SDS-PAGE檢驗含有純化蛋白之部分。為防止在洗脫之後蛋白質暴露於高咪唑濃度，使用來自GE Healthcare之PD 10去鹽管柱實施緩衝液交換。可使用30 mg蛋白質/2 g初始細胞團粒來計算純化嵌合融合構築體之產率。為使嵌合構築體與TrxA融合標籤分離，使用來自Merck Millipore之重組表現牛類腸激酶。藉由SDS-PAGE驗證期望嵌合構築體與TrxA標籤之分離。使用含有兩次HLE識別/裂解位點之所分離嵌合蛋白進行與不同染料或前染料(pro dye)之偶合程序，該等染料或前染料展現關於其暴露帶正電及帶負電基團之能力之不同性質。 經由親水性碳水化合物結合模組將最終嵌合構築體吸附於基於纖維素之濾紙(或織物)上。將含有嵌合肽之濾帶與含有0.05 U/ml HLE之0.1 M磷酸鈉緩衝液溶液(pH 7.4)以及人類傷口液一起培育30 min。最初，端視所附接染料，展現彈性蛋白酶活性之無色試樣(澄清上清液)出現藍色。因一或二個內部HLE限制位點(Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 9))處之酶促裂解，具有附接雷瑪唑亮藍染料分子之肽片段變得未偶合，從而產生藍色上清液。或者，可使用具有疏水性結合模組(PDB)之嵌合構築體來吸附基於PET (聚對苯二甲酸乙二酯)之載劑材料。產生含有CatG裂解位點代替HLE裂解位點之嵌合變體容許與如針對擁有HLE限制位點之構築體所指示在相同需求下來檢測人類CatG酶。
實例 26 ： 使用乙烯基碸染料作為彈性蛋白酶受質來染色純化 Trx-Ela-Sub1
將經純化且凍乾之Trx-Ela-Sub1溶於H
2
O (0.01g/2.5ml)中(蛋白質濃度約為0.2mg/ml)。使用PD-10管柱將緩衝液自Tris-HCl交換至Na
2
PO
4
/Na
2
SO
4
溶液。 使用乙烯基碸染料(雷瑪唑亮藍R，RBB)之染色：將210 µl RBB (7.7 mg，溶於1.5 ml Na
2
PO
4
/Na
2
SO
4
中)溶液添加至1900 µl蛋白質溶液中且在37℃下振盪(750 rpm) 80 min。 經由His標籤純化實施純化。 Trx-Ela-Sub1-RBB與彈性蛋白酶之反應： 將經染色且純化之肽構築體施加於纖維素表面上並在37℃下乾燥2 h。使用H
2
O去除未結合Trx-Ela-Sub1-RBB。將含有所施加彈性蛋白酶受質之條帶分別與及不與含有彈性蛋白酶之緩衝液一起培育。彈性蛋白酶反應性染料釋放可見於圖10中。
實例 27 ： 硝嗪黃及溴甲酚紫之固定
經由(3-縮水甘油基氧基丙基)三甲氧基矽烷(GPTMS)將硝嗪黃及溴甲酚紫固定於纖維素上。使上述染料之15 mM溶液與GPTMS (300 mM)在25℃下反應過夜。將完整反應混合物(5 µL)移液於濾紙條帶上且在80℃下乾燥30分鐘並在170℃下乾燥5 min。然後，在水中充分洗滌染色條帶。可藉由在不同pH之溶液中培育條帶來觀察條帶之pH反應。在pH 4.5、7.2或8.5中培育之後之色彩反應指示於圖7中。兩種染料混合物皆不展示色彩反應(在pH 8.5緩衝液中除外)，從而展示其pH轉變位於pH 7.2與pH 8.5之間。
實例 28 ： 溴甲酚紫在富 OH 表面 ( 例如纖維素 ， 作為 pH 指示劑 ) 之 3 步驟固定。
第1步驟：使GPTMS (9 mM - 450 mM)在環境溫度及攪拌條件下於乙酸(57 µM)中反應10 - 180 min。 第2步驟：將富OH表面(例如纖維素)浸泡於反應溶液中。將浸泡材料80 - 120℃下培育5 - 20 min。 第3步驟：將溴甲酚紫(0.1 - 3.3 mg/ml)施加於預處理材料上且在120℃下乾燥20 min。 不同pH值下之不同色彩列示於表6中。
表 6 ： 不同 pH 值及固定溴甲酚紫之相應色彩 實例 29 ：基於磷脂酶 C 之測試 - 液體系統
診斷系統之製備 對於此診斷工具而言，使用對硝基苯基磷醯膽鹼作為用於磷脂酶C之受質。將對硝基苯基磷醯膽鹼溶於水(50-100 mM)中。使用含有70% pH 7.2山梨醇之250 mM Tris/HCl緩衝液作為分析緩衝液。將230 μl緩衝液及100 µl受質移液至微量滴定板中。 診斷：將5 - 12 μL體積傷口液試樣添加至測試系統中(優先介於8 µl與10 µl之間)且藉由人工振盪混合10秒。將此混合物在室溫下培育30分鐘。然後，藉由色彩自無色變為黃色來指示感染。 測試方案及結果： 將感染傷口液試樣(A、B、C)及未感染試樣(D、E、F)與IA中所闡述之診斷系統一起培育。在培育30分鐘之後試樣之目測檢查指示僅在感染試樣A、B及C中色彩變為黃色。
實例 30 ：基於磷脂酶 A2 之測試 - 液體系統
診斷系統之製備。對於此診斷工具而言，使用4-硝基-3-辛醯基苯甲酸作為用於磷脂酶A2 -受質。將4-硝基-3-辛醯基苯甲酸(1,7 mM)溶於含有50 mM pH 7,2 Tris/HCl緩衝液、150 mM KCL及10 mM CaCl2之分析緩衝液中。將190 μl緩衝液移液至微量滴定板中。 診斷：將5 - 12 μL體積傷口液試樣添加至測試系統中(優先介於8 µl與10 µl之間)且藉由人工振盪混合10秒。將此混合物在室溫下培育30分鐘。然後，藉由色彩自無色變為黃色來指示感染。 測試方案及結果：將感染傷口液試樣(A、B、C)及未感染試樣(D、E、F)與IA中所闡述之診斷系統一起培育。在培育30分鐘之後試樣之目測檢查指示僅在感染試樣A、B及C中色彩變為黃色。
實例 31 ：基於過氧化氫酶之測試 - 液體系統
診斷系統之製備： 對於此診斷工具而言：使用普爾帕德(Purpald)作為用於過氧化氫之受質酶。將普爾帕德溶於水(50-100 mM)中。將200 μl受質溶液移液至微量滴定板中。 診斷：將5 - 12 μL體積傷口液試樣添加至測試系統中(優先介於8 µl與10 µl之間)且藉由人工振盪混合10秒。將此混合物在室溫下培育30分鐘。然後，藉由色彩自無色變為深紫色來指示感染。 測試方案及結果：將感染傷口液試樣(A、B、C)及未感染試樣(D、E、F)與IA中所闡述之診斷系統一起培育。在培育30分鐘之後試樣之目測檢查指示僅在感染試樣A、B及C中色彩變為紫色。
實例 32 ：測試體液
使含有用於MPO、彈性蛋白酶、溶菌酶、磷脂酶及過氧化氫酶及視情況pH指示劑中之一或多者之受質之材料與體液(例如傷口、淚液、玻璃體、CSF、氣道抽吸物或痰、滑膜、血液、血漿、血清、尿、腹膜腔、間質、皮下、膽汁、腸或類似之流體)接觸。來自感染有機體或組織之試樣往往展示較高反應程度。使用一或多種反應之組合來檢測感染及其程度。 其他實施例： 可藉由使用此揭示技術之一般或特異性闡述反應物及/或操作條件代替用於前述實例中者來重複前述實例且獲得類似成功。 根據前述闡述，熟習此項技術者可容易地確定此揭示技術之基本特性，且在不背離其精神及範圍下可對所揭示技術作出各種變化及修改以使其適用於各種應用及條件。 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習所揭示技術所屬技術領域者通常所理解相同之含義。儘管所揭示技術之實踐或測試中可使用類似或等效於本文所闡述之方法及材料的方法及材料，但前述段落闡述適宜方法及材料。另外，材料、方法及實例僅為闡釋性而並不意欲具有限制性。倘若出現衝突，則以本說明書(包含定義)為準。 本文所引用之所有美國專利及公開或未公開美國專利第號專利申請案皆以引用方式併入本文中。本文所引用之所有公開外來專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中。本文所引用之所有公開參考文獻、文件、原稿、科學文獻皆以引用方式併入本文中。關於本文所引用NCBI、基因庫、EBI、PUBMED資料庫之所有鑑別符及登錄號皆以引用方式併入本文中。 儘管已在本文中展示並闡述了本發明所揭示技術之較佳實施例，但熟習此項技術者將瞭解，該等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者現將構想出許多變化、改變及替代，此並不背離所揭示技術。應理解，可在實踐所揭示技術時採用本文中所述之所揭示技術之實施例的各種替代方案。下列申請專利範圍意欲定義所揭示技術之範圍且意欲由此涵蓋該等申請專利範圍及其等效形式之範圍內之方法及結構。