JP2002529064A - 多糖類シンターゼによるポリマーグラフティング - Google Patents

多糖類シンターゼによるポリマーグラフティング

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Abstract

(57)【要約】 本発明は多糖類シンターゼによるポリマーグラフティング、とりわけパスツレラ・マルトシダ由来のヒアルロン酸シンターゼを用いるポリマーグラフティングの方法に関する。本発明はまたコーティングが生体適合物質に保護特性を提供し、および／または生体粘着剤として作用する生体適合物質のコーティングにも関する。かかるコーティングを電気的装置、センサー、カテーテルおよび哺乳動物内で使用することを企図できるいずれかの装置に適用できる。本発明はさらに生体適合性があり、生体適合物質または生体粘着剤および医薬品または医薬品含有リポソームの組合わせを含んでなることができる薬物分配マトリックスに関する。生体適合物質および／または生体粘着剤はパスツレラ・マルトシダ由来のヒアルロン酸シンターゼにより製造されるヒアルロン酸ポリマーである。本発明はまた、種々化合物とりわけ炭水化物またはヒドロキシル基含有物質に結合するヒアルロン酸またはヒアルロン酸様鎖を含有するキメラ分子の製造にも関する。本発明はまた、アクセプターまたはプライマー分子で多糖類ポリマーを生成できるパスツレラ・マルトシダ由来のコンドロイチンシンターゼにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は多糖類シンターゼによるポリマーグラフティング、とりわけパスツレ
ラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のヒアル
ロン酸シンターゼを用いるポリマーグラフティングに関する方法に関する。本発
明はまたコーティングが生体適合物質に保護特性を提供し、および／または生体
粘着剤として作用する、生体適合物質のコーティングにも関する。かかるコーテ
ィングを電気的装置、センサー、カテーテルおよび哺乳動物内で使用することを
企図できるいずれかの装置に適用できる。本発明はさらに生体適合性があり、生
体適合物質または生体粘着剤および医薬品または医薬品含有リポソームの組合わ
せを含んでなることができる薬物分配マトリックスに関する。生体適合物質およ
び／または生体粘着剤はパスツレラ・マルトシダ由来のヒアルロン酸シンターゼ
により製造されるヒアルロン酸ポリマーである。本発明はまた種々化合物とりわ
け炭水化物またはヒドロキシル基含有物質に結合するヒアルロン酸またはヒアル
ロン酸様鎖またはグリコサミノグリカン鎖を含有するキメラ分子の製造にも関す
る。
【０００２】 （従来の技術） 多糖類は約２５糖単位ないし数千糖単位から成る大きな炭水化物分子である。
動物、植物、菌類および細菌は構造構成要素、エネルギー貯蔵および細胞相互作
用媒介のような多くの重要な生物学的機能に関係する非常に多様な多糖類構造を
生成する。しばしば、多糖類の生物学的機能は多糖類とレセプターおよび成長因
子のようなタンパク質との相互作用による。ヘパリン、コンドロイタンおよびヒ
アルロン酸を含む多糖類のグリコサミノグリカンのクラスは哺乳動物における細
胞の挙動の決定（例えば遊走、付着）および細胞増殖の速度において重要な役割
を果たす。このように、これらの多糖類はヒト肉体の器官の正確な形成および維
持に必須である。
【０００３】 病原性細菌および菌類のいくつかの種では細胞の情報伝達において多糖類の役
割を利用しているものもある。これらの病原性微生物は宿主分子と同等または化
学的に類似する多糖類表面コーティングまたは莢膜を形成する。例えば、ストレ
プトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ＡおよびＣ群、およびパスツレラ
・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ａ型は真のヒア
ルロン酸莢膜を生成し、並びに病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）はコンドロイタンおよびヘパリンに非常に類似するポリマーから成る莢膜を
作ることが知られている。病原性微生物は多糖類表面コーティングまたは莢膜を
形成するが、それはかかるコーティングが非免疫原性であり、宿主の防御から細
菌を保護し、それにより分子のカムフラージュと同等にするためである。
【０００４】 酵素はまた別にシンターゼ、シンセターゼまたはトランスフェラーゼとも称さ
れ、生存生物に見出される多糖類の重合を触媒する。多くの既知の酵素はまた活
性化された糖ヌクレオチドをも重合する。最も優勢な糖供与体はＵＤＰを含有す
るが、（１）移動させるべき特定の糖および（２）生物に依存してＡＤＰ、ＧＤ
ＰおよびＣＭＰもまた使用される。多くの型の多糖類は、細胞表面または細胞表
面の外側で見出される。従って、ほとんどのシンターゼ活性は、典型的には細胞
辺縁の原形質膜かまたは分泌に関与するゴルジ装置膜のいずれかに関係している
。概してこれらの膜結合シンターゼタンパク質を典型的な方法により操作するの
は困難であり、生物化学的精製の後同定されている酵素は極わずかである。
【０００５】 非常に多くのシンターゼがクローン化され、タンパク質を特徴付けする前に遺
伝子または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が得られる「逆遺伝学的」研究法を用いて
ヌクレオチドレベルで配列決定されている。この配列情報にかかわらず、元来の
三次元構造、活性部位、および多糖類シンターゼの触媒作用のメカニズムに関連
する分子の詳細は、概して非常に限定的であるかまたは欠如している。例えば、
グリコーゲン合成の触媒メカニズムは、酵素が一昔前に見出されたにもかかわら
ず、詳細は未だに知られていない。別の例では、ヘテロ多糖類を生成する酵素が
１個のＵＤＰ糖結合部位を利用して両方の前駆体を移動させるのかどうか、また
別に各基質に２個の専用の部位が存在するのかどうかについて今なお議論されて
いる。
【０００６】 広範な種類の多糖類が多くの供給源から商業的に回収され、例えば細菌からキ
サン、海藻類からカラゲナン、および樹木からゴムなどが回収される。この重要
な産業はこれらの原材料数千トンをアイスクリームデザートから化粧用皮膚クリ
ームに至る数多くの消費者製品用に供給する。脊椎動物組織および病原性細菌は
医学の分野で外科の補助物質、ワクチンおよび抗凝固剤として利用されるさらに
新種の多糖類の供給源である。例えば二つのグリコサミノグリカン多糖類、ブタ
腸管粘膜由来のヘパリンおよびオンドリの鶏冠由来のヒアルロン酸を各々凝血阻
止および眼科手術などのいくつかの適用に用いる。細菌莢膜（例えば肺炎球菌（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の種々の株）から抽出し
た多糖類を用いて子供および成人の両方をワクチン接種し、種々の程度の成功を
得ている。しかしながら、たいていの場合、天然から得られる原材料に見出され
る既存の構造を使用しなければならない。多くの古い産業上の方法では、化学的
修飾（例えば加水分解、硫酸化、脱アセチル化）を用いて元来の多糖類の構造お
よび特性を変化させる。しかしながら、大容量の反応の合成制御および再現性は
いつも好結果であるとは限らない。
【０００７】 インビトロで炭水化物ポリマーを設計および構築するための現行のいくつかの
方法では、（ｉ）困難な多工程糖化学、または（ｉｉ）生合成に関与するトラン
スフェラーゼ酵素により誘導される反応、または（ｉｉｉ）グリコシル基転位を
触媒する炭水化物減成酵素を活用する反応を利用する。後者の二つの方法は天然
に生じる利用可能な酵素の特異性および特性により制限される。これらの酵素の
多くはとりわけ豊富でもなく、安定でもないが、ほとんどたいてい高価である。
包括的には、現行の方法では２から約１２糖を含有するポリマーを生成する。不
幸にも、ポリマーが２５、１００または数千もの単量体を含有するに至っては、
多糖類の物理学的および生物学的特性が明らかになっていない。
【０００８】 前記するように、多糖類は地球上で最も豊富な生物適合物質であるが、まだ多
くの生合成および機能に関する分子の詳細が明らかになっていない。ヒアルロン
酸すなわち「ＨＡ」はグリコサミノグリカンクラスの直鎖状多糖類であり、β（
１，４）ＧｌｃＵＡ−β（１，３）ＧｌｃＮＡｃの数千の反復から成る。脊椎動
物では、ＨＡは細胞外マトリックスの主要な構造構成要素であり、付着および認
識において役割を果たす。ＨＡは負電荷密度が高く、多くのヒドロキシル基を有
し、従って、溶液中で広がって水和したコンフォメーションをとる。軟骨および
滑液の粘弾性はある程度ＨＡ多糖類の物理学的特性の結果である。ＨＡはまたＣ
Ｄ４４、ＲＨＡＭＭおよびフィブリノーゲンのようなタンパク質と相互作用し、
それにより脈管形成、癌、細胞運動性、創傷の治癒および細胞付着のような多く
の天然のプロセスに影響を及ぼす。
【０００９】 ＨＡには非常に多くの医学的適用がある。例えばＨＡは、白内障患者に眼内レ
ンズを埋め込む間の眼科手術において、眼の硝子体液に代わる粘弾性置換物とし
て広く用いられている。またＨＡを直接関節に注射して関節炎に関係する痛みを
軽減する。また化学的架橋ゲルおよびフィルムを利用して腹部手術後の有害な癒
着を防御する。別の方法を用いる別の研究者はまた、吸着ＨＡコーティングが汚
損および組織剥離を低減することによりカテーテルおよびセンサーのような医療
用装置の生物適合性を改善することを示している。
【００１０】 ＨＡはまた、ヒトおよび動物において疾患を引き起こす特定の微生物により作
られる。ある種の細菌性病原体、主にグラム陰性パスツレラ・マルトシダＡ型お
よびグラム陽性ストレプトコッカスＡおよびＣ群は食作用のような宿主防御から
微生物を保護する細胞外ＨＡ莢膜を生成する。ＨＡ莢膜を生成しない変異型細菌
は莢膜化株に比較して１０2および１０3倍毒性が低い。さらに、パラメシウム・
ブルサリア（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）クロレラウイルス（Ｐ
ＢＣＶ−１）は藻類宿主細胞を指向し、感染の初期にＨＡ表面コーティングを生
成する。
【００１１】 ＨＡを重合する酵素である種々ＨＡシンターゼ（「ＨＡＳ」）は、２価Ｍｎま
たはＭｇイオンの存在下、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ糖ヌ
クレオチド前駆体を利用してＨＡの長鎖を重合する。ＨＡ鎖をかなり大きくでき
る（ｎ＝１０2ないし１０4）。とりわけＨＡＳは、細胞表面で脂質二重層に局在
する膜タンパク質である。ＨＡ生合成の間にＨＡポリマーは二重層を通って細胞
外空間に輸送される。全てのＨＡＳにおいて、ポリペプチドの一つの種は異なる
２個の糖の移動を触媒する。対照的に、その他の既知のグリコシルトランスフェ
ラーゼの大部分は１個の単糖類のみを移動させる。
【００１２】 化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群由来の
ＨａｓＡ（またはＳｐＨＡＳ）は、分子レベルで記載された最初のＨＡシンター
ゼであった。種々脊椎動物相同体（ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｆｒｏｇ）Ｄ
Ｇ４２またはＸＩＨＡＳ１；ネズミおよびヒトＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ
３）およびウイルス性酵素、Ａ９８Ｒはアミノ酸レベルでＨａｓＡポリペプチド
鎖の特定の領域によく類似している（全体で同等性〜３０％）。これらの酵素の
至る所に散らばっている少なくとも７個の短いモチーフ（５ないし９残基）は、
同等であるかまたはよく保存されている。
【００１３】 このような類似しない供給源に由来するこれらのＨＡシンターゼ間の発展的な
関係は現在のところ明らかになっていない。酵素が二重層において全体的に類似
したトポロジーを有すると予想される：アミノおよびカルボキシル末端の膜結合
領域は大きな細胞質中央ドメインをフランキングする（アミノ酸〜２００個）。
アミノ末端領域は２個の膜貫通セグメントを含有するようであるが、一方カルボ
キシル末端領域は種に依存して３ないし５個の膜結合または膜貫通セグメントを
含有するようである。これらのＨＡＳポリペプチド鎖で細胞外に露出していると
考えられるのは極わずかである。
【００１４】 この群の酵素により利用される反応経路に関しては、間接的な実験からの入り
混じった知見が報告されている。選択的標識および減成研究により決定されるよ
うに、ストレプトコッカスＡ群の酵素は伸長中の鎖の非還元末端に糖を付け加え
ることが報告されている。しかしながら、哺乳動物細胞からの酵素調製物を用い
て研究している二つの研究所が、新生鎖の還元末端に新しい糖が付け加えられる
という結論を下した。これら種々の研究を比較して、ストレプトコッカス系から
酵素的に放出される糖の分析により、これらを解釈する上でより厳密な助けが得
られた。別の型の実験では、32Ｐ標識ＵＤＰ糖から放出される低量の放射活性の
アニオン性ポリマーへの取り込みにより測定されるように、哺乳動物細胞で作ら
れたＨＡが共有結合的に結合するＵＤＰ基を有することが報告された。このデー
タは最後の糖がポリマーの還元末端に移動したことを意味した。このように、脊
椎動物およびストレプトコッカスに由来するこれらのむしろ類似したＨＡＳポリ
ペプチドが実際に異なる反応経路を利用するのかは依然明らかにされていない。
【００１５】 バイオテクノロジーによる医学上の進歩の展開を容易にするために、本発明は
人工的な成分または化合物を肉体の有害な応答から保護し、生存組織内で外来の
医療用装置の植付けを促進するＨＡの表面コーティングを適用する方法を提供す
る。かかるＨＡコーティングは、人工的に製造した物質と生存している新鮮な物
質との間の間隙を橋渡しするであろう（すなわち生物適合性が改善される）。ま
たＨＡを、非免疫原性である生物適合物質、例えば生体粘着剤またはリポソーム
のような医薬品分配系を含む生体粘着剤として用いることもできる。本発明はま
た多糖類ポリマーグラフティング方法、すなわちパスツレラ・マルトシダ由来の
ヒアルロン酸シンタターゼ（ＰｍＨＡＳ）またはコンドロイチンシンターゼ（Ｐ
ｍＣＳ）のいずれかを用いるＨＡまたはコンドロイタンをも包含する。ＰｍＨＡ
ＳまたはＰｍＣＳ酵素（遺伝学的または化学的）の修飾体を種々の大きさおよび
組成の多糖類のグラフティングに利用することもできる。
【００１６】 （発明の要旨） 家禽コレラ病原体、パスツレラ・マルトシダＡ型に由来する独特のＨＡシンタ
ーゼ、ＰｍＨＡＳが同定され、クローン化されて、１９９９年４月１日に出願さ
れた同時係属出願の米国特許第０９／２８３，４０２号にて、「パスツレラ・マ
ルトシダ由来のヒアルロン酸シンターゼをコードするＤＮＡおよび方法」という
標題で開示および特許請求されており、これは出展明示により本明細書の一部と
する。この単一の９７２個の残基のタンパク質の発現により大腸菌宿主細胞がイ
ンビボでＨＡ莢膜を生成できるようになる；通常大腸菌はＨＡを生成しない。適
当なＵＤＰ糖を供給した場合、組換え大腸菌の抽出物がインビトロでＨＡを生成
する。このようにＰｍＨＡＳは真のＨＡシンターゼである。
【００１７】 ＰｍＨＡＳが伸長中のポリマー鎖の非還元末端に糖を付け加えることも結論づ
けられた。正確な単糖類が新生鎖または適当な外来性ＨＡオリゴ糖に連続して段
階的に付け加えられる。しかしながら、ＰｍＨＡＳ配列はその他の既知ＨＡシン
ターゼとは有意に異なる。ＰｍＨＡＳおよびＡ群のＨＡＳすなわちＨａｓＡ間に
共通するするのは２個の短い潜在的配列モチーフ（［Ｄ／Ｎ］ＤＧＳ［Ｓ／Ｔ］
；ＤＳＤ［Ｄ／Ｔ］Ｙ）のみであるようだ。その代わり、新規酵素の中央の領域
の一部は、異なる莢膜多糖類またはリポ多糖類を生成するその他の細菌性グリコ
シルトランスフェラーゼのアミノ末端に対してより相同的である。さらに、Ｐｍ
ＨＡＳはその他のいずれかのＨＡＳ酵素の約２倍の長さであるが、〜３２０個の
残基により分けられる膜貫通らせん構造を２個だけ有すると予測される。このよ
うに、ポリペプチドの少なくとも３分の１が細胞質にないと予測される。
【００１８】 ＰｍＨＡＳの反応時間を長く延長する場合、少なくとも４００糖の長さのＨＡ
ポリマーが形成される。その他のいずれかの既知のＨＡＳ酵素と異なり、ＰｍＨ
ＡＳは、外来的に供給された短いＨＡオリゴ糖をインビトロで長いＨＡポリマー
に延長することもできる。酵素をこれらの短いＨＡオリゴ糖と共に供給する場合
、全ＨＡ生合成は外来性オリゴ糖がない反応の５０倍以上に増加する。ＰｍＨＡ
Ｓポリペプチドのポリマー保持メカニズムの特性は、この活性の原因因子である
かもしれない：すなわち重合中にＨＡ鎖を保持するＨＡ結合部位が存在するのか
もしれない。小型のＨＡオリゴ糖はまた組換え酵素のこの部位を占領でき、その
後より長い多糖鎖に延長される。
【００１９】 たいていの膜タンパク質は水性溶液への難溶性のために比較的研究するのが困
難であり、ＨＡＳも例外ではない。ストレプトコッカス細菌のＡおよびＣ群に由
来する酵素のみが界面活性剤により可溶化され、少量で活性な状態で精製されて
いる。比較的純粋な形態で一度単離されると、ストレプトコッカスの酵素の安定
性は非常に限定される。ＰｍＨＡＳ−Ｄと称するパスツレラ・マルトシダ由来の
可溶性組換え体は元来のＰｍＨＡＳ酵素の９７２残基のうち１ないし７０３を含
んでなり、ＰｍＨＡＳ−Ｄのアミノ酸配列を配列番号：１に示し、ＰｍＨＡＳ−
Ｄのヌクレオチド配列を配列番号：２に示す。ＰｍＨＡＳ−Ｄを大腸菌において
多量に生成でき、クロマトグラフィーにより精製できる。ＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素は
長いＨＡポリマーを短いＨＡプライマーに付け加える親酵素の能力を保持してい
る。さらに、精製されたＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素は、最適化されたバッファー中氷上
で数日間、通常の反応温度で数時間安定である。最適なバッファーの一つの処方
は、１Ｍエチレングリコール、０．１ないし０．２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７．２および典型的な反応条件で糖移動の安定性および特異性を
許容するプロテアーゼインヒビターから成る。反応用にＵＤＰ糖およびマンガン
（１０ないし２０ｍＭ）を加える。ＰｍＨＡＳ−ＤはまたＨＡポリマーを固定化
された短いＨＡプライマーを有するプラスティックビーズに付け加える。
【００２０】 本発明は、多糖類に基づく種々の独特な生物適合性分子およびコーティングを
製造する方法を包含する。多糖類とりわけグリコサミノグリカンクラスのものは
構造構成要素およびシグナル伝達分子として体内で多くの役割を果たしている。
一つ以上のポリマーバックボーンから成るハイブリッド分子をグラフティングま
たは作ることにより、不自然な化学反応または残基に頼らないで別個の物理学的
および生物学的特性を単一の分子に融合することが可能になる。
【００２１】 本発明はまた無垢の状態で調製される場合、特定の組換え酵素がさらにポリマ
ーを伸長させるための種として種々アクセプター分子を利用する性質をも含んで
いる：天然に生じるまたは生存宿主生物に存在する酵素形態はこの能力を表さな
い。このように、本発明により、結果的に（ａ）ハイブリッド多糖類の生成およ
び（ｂ）多糖類コーティングの形成に至る。かかるハイブリッドポリマーは「分
子糊」として提供できる、すなわち二つの細胞型またはその他の生物適合物質が
ハイブリッド分子の各半分と相互作用する場合、次いで二相の各々が橋渡しされ
る。
【００２２】 かかる多糖類コーティングは、外来性の物質を周囲の組織マトリックス内に組
み込むのに有用である。例えば人工器管が天然の付着性多糖類でコーティングさ
れた場合、より強固に肉体に結合する。加えて、装置の人工成分を生体適合性コ
ーティングにより遮蔽することにより免疫反応性または炎症を低減することがで
きる。本発明の別の態様は分配、半減期、残留性、標的化および／または毒性を
改善および／または変化させるのための種々薬物分配マトリックスまたは生体粘
着剤または適当な医薬品へのＨＡのコーティングまたはグラフティングである。
【００２３】 （発明の詳細な説明） 本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明がその適用
において下記の説明に記載されている、又は図面に例示されている構成要素の構
造及び配列の細部に制限されていないことが理解されなければならない。本発明
は他の実施形態であってもよい、又は様々な方法で実践又は実行されることも可
能である。さらに、この中で使用する言葉使い及び専門用語は説明を目的として
いると理解されるべきであって、限定的なものと判断すべきではない。
【００２４】 ここで使用する用語「核酸セグメント」及び「ＤＮＡセグメント」は交換可能
に使用されており、特定種の全ゲノムＤＮＡから離れて単離されているＤＮＡ分
子を意味する。このために、ここで使用する用語「精製」ＤＮＡ又は核酸セグメ
ントは、ヒアルロン酸シンターゼ（「ＨＡＳ」）コード配列又はコンドロイチン
シンターゼ（「Ｃ」）コード配列を含有するが、例えば完全パスツレラ・ムルト
シダのような無関係のゲノムＤＮＡから離れて単離又は精製されたＤＮＡセグメ
ントを意味する。用語「ＤＮＡセグメント」に含まれるのは、ＤＮＡセグメント
及びそのようなセグメントの小さなフラグメント、及びさらに例えばプラスミド
、コスミド、ファージ、及びウイルス等を含む組換えベクターである。
【００２５】 同様に、単離又は精製ＰｍＨＡＳ−Ｄ又はＰｍＣＳ遺伝子を含有するＤＮＡセ
グメントは、他の天然型遺伝子又はタンパク質エンコード配列から実質的に離れ
て単離されたＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼコード配列を含むＤＮＡセグ
メントを意味する。この点で、用語「遺伝子」は分かり易くするために機能的タ
ンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドエンコード単位を意味するために使用
される。当業者には理解されるように、この機能的という用語にはゲノム配列、
ｃＤＮＡ配列又はそれらの組み合わせが含まれる。「他のコード配列から実質的
に離れて単離された」は、今回の場合にはＰｍＨＡＳ−Ｄ又はＰｍＣＳである問
題の遺伝子がＤＮＡセグメントのコーディング領域の重要な部分を形成すること
、及びＤＮＡセグメントが例えば大きな染色体フラグメント又はその他の機能的
遺伝子若しくはＤＮＡコーディング領域のような天然型コーディングＤＮＡの大
きな部分を含有していないことを意味する。当然ながら、これは最初に単離され
たＤＮＡセグメントを意味するが、さらにヒトの手によってセグメント内に後か
ら付加された、又は故意に残された遺伝子又はコーディング領域を除外しない。
【００２６】 原核生物起源の使用には一定の長所が結び付いているので、当業者であればお
そらく原核生物Ｐ．ムルトシダからＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝子
を単離することに極めて大きな利点があることを完全に理解するであろう。その
ような利点の1つは、典型的には、真核生物酵素は重大な翻訳後修飾を必要とす
るがこれは真核生物宿主においてしか達成できない可能性があることにある。こ
れは、入手される真核生物ＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝子の適用可
能性を制限する傾向を示すであろう。さらにその上、当業者であればおそらく、
原核生物酵素遺伝子を使用することが目指された場合には遺伝子操作の所要時間
及び容易さに関して追加の利点があることを完全に理解するであろう。これらの
追加の利点には、（ａ）ゲノムのサイズが比較的に小さいため、及びそのために
対応するゲノムライブラリーのスクリーニング総量が小さくなるための原核生物
遺伝子の単離が容易であること、及び（ｂ）イントロンが欠如しているために原
核生物遺伝子のコーディング領域の全体サイズが有意に小さいために操作が容易
であることが含まれる。さらにその上、ＰｍＨＡＳ−Ｄ又はＰｍＣＳ遺伝子の生
成物（即ち、酵素）が翻訳後修飾を必要とする場合には、これは該遺伝子が引き
出されたのに類似する原核細胞環境（宿主）において最も好都合に達成されるで
あろう。
【００２７】 好ましくは、本発明に従ったＤＮＡ配列はさらに、選択された組換え宿主内で
の配列の発現を許す遺伝子制御領域を含んでいるであろう。当然ながら、使用さ
れる制御領域の性質は一般に、想定される特定使用（例、宿主のクローニング）
に依存して変化する。
【００２８】 特定実施形態では、本発明はそのアミノ酸配列内に各々配列番号１又は３に従
ったアミノ酸配列を含有する、ＰｍＨＡＳ−Ｄ又はＰｍＣＳ遺伝子をエンコード
する単離ＤＮＡセグメント及びＤＮＡ配列を組み込んでいる組換えベクターに関
する。さらに、他の特定実施形態では、本発明はそのアミノ酸配列内にＨＡＳ若
しくはコンドロイチンシンターゼ遺伝子又はＤＮＡのアミノ酸配列を含有する遺
伝子をコードする単離ＤＮＡセグメント及びＤＮＡ配列を組み込んでいる組換え
ベクター、及び特にパスツレラ・ムルトシダＨＡＳ又はコンドロイチンシンター
ゼに対応するＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝子若しくはｃＤＮＡに関
する。例えば、ＤＮＡセグメント又はベクターが全長ＨＡＳ又はコンドロイチン
シンターゼタンパク質をコードする場合、又はＨＡＳ又はコンドロイチンシンタ
ーゼタンパク質を発現させるために使用することが意図される場合、好ましい配
列は本質的に各々配列番号１又は３に定義されている配列である。
【００２９】 短縮ＰｍＨＡＳ−Ｄもまた配列番号１の好ましい配列の定義の範囲内に含まれ
る。例えば、カルボキシル末端ではおよそ２７０−２７２アミノ酸を配列から取
り除くことができるが、それでもまだ機能的ＨＡＳを有している。当業者であれ
ば、ＰｍＨＡＳ−Ｄ配列のいずれか一方の端からの単純なアミノ酸除去を遂行で
きることは理解するであろう。そのような短縮配列がまだＨＡＳを産生すること
ができるかどうか判断するためには、短縮バージョンの配列がＨＡＳ活性につい
て単純にチェックされなければならない。
【００３０】 ＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ活性を有する核酸セグメントはここで説
明する方法によって単離することができる。用語「配列番号Ｘに本質的に定義さ
れた配列」は、該配列が実質的に配列番号Ｘの一部分に対応しており、さらに配
列番号Ｘのアミノ酸と同一ではない、又は生物学的機能的に等価である比較的に
少数のアミノ酸を有することを意味する。用語「生物学的機能的に等価である」
は技術においては明瞭に理解されており、さらにここでは配列番号Ｘに本質的に
定義された配列を有する遺伝子である、及びＨＡ又はヒアルロン酸コート又はコ
ンドロイチンを産生する原核生物の能力に関連していると詳細に定義されている
。上記の例では、「Ｘ」は配列番号１、２、３又は４のいずれかを意味する。
【００３１】 技術においては、熟練者が核酸セグメントに構造的変化を加える（即ち、保存
又は半保存アミノ酸置換をコードすること）及びさらにその酵素的又は機能的活
性を保存する能力を有する例が存在する。例えば下記を参照：（１）Ｒｉｓｌｅ
ｒら、「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒａｌｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａ Ｐａｔｔｅｒｎ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ．（構造関連タンパク質におけるア
ミノ酸置換。パターン認識アプローチ）」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０４
：１０１９−１０２９（１９８８）［「．．．観察されたアミノ酸側鎖の交換可
能性に従うと、４個のグループしか叙述できない；（ｉ）Ｉｌｅ及びＶａｌ、（
ｉｉ）Ｌｅｕ及びＭｅｔ、（ｉｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｎ、及び（ｉｖ
）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。」］；（２）Ｎｉｅｆｉｎｄら、「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｄｅｒ
ｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｍａｉｎ−Ｃｈａｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ Ａｎｏｌｅｓ．
（タンパク質モデリングのためのアミノ酸類似性係数及び主要鎖折り畳みアノー
ルに由来する配列アライメント）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：４８１−４
９７（１９９１）［類似性パターンがアミノ酸置換の設計を可能にする］；及び
（３）Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎら、「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｔａｂｌｅｓ：Ｔｅｒｔ
ｉａｒｙ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｓ（環境特異的アミノ酸置換表：第３テンプレート及びタン
パク質折り畳みの予測）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：２１６−２２
６（１９９２）［「局地的環境の関数としての観察された置換パターンの解析は
、明確なパターンがあることを示している．．．」矛盾のない変更を加えること
ができる。］ これらの参考文献及び無数のその他の参考文献は、当業者は、１つの核酸配列
が与えられれば、その機能性を変更させることなく核酸配列を置換させて変更さ
せることができることを示している。さらに、置換された核酸セグメントはその
純粋の親と比較して高度に同一であり、その酵素活性を保持しているが、それで
もそれにハイブリダイズすることには失敗する可能性がある。
【００３２】 そこで本発明は、各々Ｐ．ムルトシダに由来する酵素的に活性なＨＡＳ又はコ
ンドロイチンシンターゼ−各々ＰｍＨＡＳ及びＰｍＣＳをエンコードしている核
酸セグメントを開示する。当業者であれば、本発明の範囲及びクレームから逸脱
することなく、各々配列番号２及び４に列挙されたＰｍＨＡＳ又はＰｍＣＳ核酸
セグメントを置換させられることは理解するであろう。標準化かつ容認された機
能的に等価のアミノ酸置換物は表Ｉに示されている。
【００３３】
【表１】
【００３４】 本発明のまた別の好ましい実施形態は、各々配列番号１又は３に従ったタンパ
ク質をエンコードしており、さらに組換えベクターであると定義される精製核酸
セグメントである。ここで使用する用語「組換えベクター」は、ＨＡＳ又はコン
ドロイチンシンターゼタンパク質をコードする核酸セグメント、又はそれらのフ
ラグメントを含有するように修飾されているベクターを意味する。組換えベクタ
ーはさらに、前記ＨＡＳをエンコードする核酸セグメントに操作可能に結合され
たプロモーターを備える発現ベクターであると定義することができる。
【００３５】 本発明のさらにまた別の好ましい実施形態は、ＨＡＳ又はコンドロイチンシン
ターゼ遺伝子を含有する組換えベクターを用いて組換え型にされた宿主細胞であ
る。好ましい組換え宿主細胞は原核細胞であってよい。別の実施形態では、組換
え宿主細胞は真核細胞である。ここで使用する用語「改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄ）」又は「組換え」細胞は、例えばＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼをエ
ンコードする遺伝子のような組換え遺伝子がその中に導入されている細胞を意味
する。このために、改変細胞は組換え的に導入された遺伝子を含有していない天
然型細胞から識別することができる。従って改変細胞は、ヒトの手によって導入
された１個又は複数の遺伝子を有する細胞である。組換え的に導入された遺伝子
はｃＤＮＡ遺伝子、ゲノム遺伝子のコピーの形であるか、又は特定の導入遺伝子
と自然には結び付いていないプロモーターに隣接して配置された遺伝子を含有す
るかのどちらかであろう。
【００３６】 好ましい実施形態では、ＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼをコードするＤ
ＮＡセグメントはさらに、技術において機能的に複製のオリジン又は特定宿主に
よる隣接配列の複製を可能にする「レプリコン」として知られているＤＮＡ配列
を含んでいる。そのようなオリジンは、それにＨＡＳ又はコンドロイチンシンタ
ーゼＤＮＡ配列が連結される、染色体外に局在して複製するキメラセグメント又
はプラスミドの調製を可能にする。より好ましい例では、使用されるオリジンは
バイオテクノロジー適用のために適切な細菌宿主における複製が可能なオリジン
である。しかし、クローン化ＤＮＡセグメントをより多用性にするためには、そ
の使用が予期される（例えばシャトルベクターにおけるように）他の宿主系によ
って認識されるオリジンを代わりに使用する又は追加して使用することさえ望ま
しい場合がある。
【００３７】 例えば多数の高等生物においてクローニング又は発現のために使用できるＳＶ
４０、ポリオーマ又はウシパピローマウイルスオリジンのような他の複製オリジ
ンの単離及び使用は当業者にはよく知られている。従って一定の実施形態では、
本発明は適切な複製オリジンと一緒にかつ選択された制御領域の制御下でＨＡＳ
又はコンドロイチンシンターゼをコードする遺伝子配列を含有する組換え形質転
換ベクターによって定義することができる。
【００３８】 従って、当業者には本発明の開示を考慮に入れてＨＡＳ又はコンドロイチンシ
ンターゼ遺伝子又はｃＤＮＡを入手するために他の手段を使用できることは理解
されるであろう。例えば、パスツレラノの他の菌株を含む数多くの起源若しくは
ｃＤＮＡライブラリーのような原核生物起源からの遺伝子又はｃＤＮＡの全補体
を含有するポリメラーゼ連鎖反応若しくはＲＴ−ＰＣＲ産生ＤＮＡフラグメント
を入手することができる。本発明に従ってＤＮＡフラグメントを生成させるため
には、実質的にあらゆる分子クローニングアプローチを使用することができる。
従って、ＤＮＡ単離のために使用される特定方法に関する概して唯一の制限は、
単離核酸が生物学的機能的に等価のＨＡシンターゼをエンコードしなければなら
ないことである。
【００３９】 ＤＮＡがいったん単離されると、それは選択されたベクターと一緒に連結され
る。本発明に従った長所を実現するためには、実質的にあらゆるクローニングベ
クターを使用できる。典型的に有用なベクターには、原核生物において使用する
ためのプラスミド及びファージ、さらに原核生物において使用するためのウイル
スベクターさえ含まれる。実施例には、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＡ３、組換えラ
ムダ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス及びレ
トロウイルスが含まれる。しかし、特定の利点は最終的にはラクトコッカス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株及び大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）の両方において複製可能なベクターが使用される場合に実現される
であろうと考えられる。
【００４０】 Ｄａｏ及びＦｅｒｒｅｔｔｉのｐＳＡ３ベクター又はＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら
のｐＡＴ１９ベクターによって例示されるこれらのようなベクターは、例えば大
腸菌のような容易に操作される宿主においてクローンコロニー選択を実行するこ
とを可能にし、その後にはＨＡ又はコンドロイチンの産生のために食品等級ラク
トコッカス又はバチルス菌株内への引続いての逆移動が行われる。これらは一定
の食品及びバイオテクノロジー産物の製造において使用される良性かつ明確に調
査された生物である。これらは、遺伝子量化（即ち、増幅によってＨＡＳ又はコ
ンドロイチンシンターゼ遺伝子の追加コピーを提供すること）及び／又はＨＡ又
はコンドロイチン前駆体の利用可能性を増大させるために追加の遺伝子を包含す
ることを通してＨＡ又はコンドロイチンを合成するラクトコッカス又はバチルス
菌株の能力を増大させることができる点で有益である。細菌がＨＡ又はコンドロ
イチンを合成する固有の能力もまた、ＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝
子を有するプラスミドの特別コピーの形成、又は増幅を通して増大させることが
できる。この増幅は、プラスミドコピー数及びそのためにＨＡＳ又はコンドロイ
チンシンターゼ遺伝子コピー数の１０倍までの増加を説明することができる。
【００４１】 さらにＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝子コピー数を増大させるであ
ろう別の方法は、プラスミド内への遺伝子の複数コピーの挿入である。別の方法
には、ＨＡＳ又はコンドロイチンシンターゼ遺伝子を染色体ＤＮＡ内に統合する
ことが含まれるであろう。この特別増幅は、細菌ＨＡＳ又はコンドロイチンシン
ターゼ遺伝子のサイズが小さいので、特に実現可能であろう。幾つかのシナリオ
では、染色体ＤＮＡ連結ベクターは大腸菌のようなクローンスクリーニング目的
のために選択される宿主を選択された宿主内に挿入されたＤＮＡを発現させるこ
とのできるベクターの使用を通してトランスフェクトするために使用されている
。
【００４２】 一定の他の実施形態では、本発明はそれらの配列内に配列番号１、２、３又は
４で本質的に定義された核酸配列を含有する単離ＤＮＡセグメント及び組換えベ
クターに関する。配列番号１、２、３又は４で「本質的に定義された」は、上記
のような同一の意味で使用され、核酸配列が実質的に配列番号１、２、３又は４
の一部分に対応しており、さらに配列番号１、２、３又は４のコドンと同一では
ない、又は機能的に等価である比較的に少数のコドンを有していることを意味し
ている。用語「機能的に等価のコドン」は、ここでは例えば表Ｉで定義されてい
るアルギニン又はセリンに対する６個のコドンのような同一アミノ酸をコードす
るコドンを意味する、及びさらに生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドン
を意味する。
【００４３】 さらにまた、アミノ酸及び核酸配列は例えば追加の−若しくはＣ−末端アミノ
酸又は５’若しくは３’核酸配列のような、タンパク質発現及び酵素活性が関係
する場所で生物学的タンパク質活性の維持を含んでいる配列が上記に定義した基
準を満たす限りは本質的にはここで開示される配列の１つに定義されている追加
の残基を含む場合がある。末端配列の追加は、特に例えばコーディング領域の５
’又は３’部分のどちらかの様々な非コード配列フランキングを含む可能性があ
る、又は遺伝子内で発生することが知られている様々な内部配列を含む可能性が
ある核酸配列に適用される。さらにその上、Ｎ若しくはＣ末端アミノ酸から残基
を取り除くことができるが、それでもこれらの配列は同様に上記に定義された基
準を満たす限り、ここで開示される配列の１つに本質的に定義されたものである
可能性がある。
【００４４】 遺伝コード並びに保存及び半保存置換の縮退を考慮に入れると、約４０％から
約８０％の間；より好ましくは約８０％から約９０％の間；又はいっそうより好
ましくは約９０％から約９９％の間のヌクレオチドを有する配列は配列番号２又
は４のヌクレオチドと同一である、又は配列番号２又は４に「本質的に定義され
ている」配列であろう。配列番号２又は４に定義されている配列と本質的に同一
である配列はさらにまた、標準以下の厳しいハイブリダイジング条件下で配列番
号２又は４の補体を含有する核酸セグメントにハイブリダイズすることのできる
配列であると機能的に定義することもできる。適切な標準ハイブリダイゼーショ
ン条件は当業者にはよく知られており、ここで明確に定義されている。
【００４５】 ここで使用する用語「標準ハイブリダイゼーション条件」は、その下で実質的
に相補的核酸セグメントが標準ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ
）塩基対合を形成する条件を説明するために使用される。例えばｐＨ、温度、塩
濃度、例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシドのような物質の存在、及び
ハイブリダイズするセグメントの長さ等のような結合又はハイブリダイゼーショ
ンの特異性を決定する多数の因子が知られている。ハイブリダイゼーションのた
めに例えば約１４から約１００ヌクレオチドのフラグメントの短い核酸セグメン
トが使用されることが想定される場合は、ハイブリダイゼーションのための塩及
び温度の好ましい条件は４０〜５０℃での１．２〜１．８×ＨＰＢを含むであろ
う。
【００４６】 当然ながら、本発明はさらにまた配列番号２又は４に定義された配列と相補的
である、又は本質的に相補的であるＤＮＡセグメントを含んでいる。「相補的」
である核酸配列は、標準ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補
性規則に従って塩基対合が可能である核酸配列である。ここで使用する用語「相
補的配列」は、上記で定義された同一ヌクレオチド比較によって評価することの
できるように、又は配列番号２又は４の核酸セグメントにハイブリダイズするこ
とができると定義されたように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【００４７】 本発明の核酸セグメントは、コード配列自体の長さとは無関係に、それらの全
長を相当に大きく変化させることができるように、例えばプロモーター、ポリア
デニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数クローニング部位、エピトープタ
グ、ポリヒスチジン領域、及びその他のコーディングセグメント等のような他の
ＤＮＡ配列と組み合わせることができる。このために、好ましくは調製の容易さ
及び意図された組換えＤＮＡプロトコルにおける使用によって制限された全長を
有する、ほとんどあらゆる長さの核酸フラグメントを使用できることが想定され
ている。
【００４８】 当然ながら、さらにまた本発明は配列番号１、２、３又は４の特定アミノ酸及
び核酸配列には限定されないと理解されるであろう。このために組換えベクター
及び単離ＤＮＡセグメントは、コーディング領域が基本コーディング領域におい
て選択された変化又は修飾を有しているときに様々にＨＡＳ又はコンドロイチン
シンターゼコーディング領域自体を含む可能性がある、又はそれらはそれでもＨ
ＡＳ又はコンドロイチンシンターゼコーディング領域を含有するより大きなポリ
ペプチドをエンコードすることができる、又は種々のアミノ酸配列を有する生物
学的に等価のタンパク質又はペプチドをエンコードすることができる。
【００４９】 本発明のＤＮＡセグメントは生物学的機能的に等価のＨＡＳ又はコンドロイチ
ンシンターゼタンパク質及びペプチドを含有する。そのような配列は、核酸配列
内で自然に発生することが知られているコドン冗長性及び機能的等価性の結果と
して発生する可能性があり、従ってタンパク質がエンコードされる。或いはまた
、機能的に等価のタンパク質又はペプチドは、タンパク質構造における変化が変
更させられるアミノ酸の特性についての考慮に基づいて改変することのできる組
換えＤＮＡテクノロジーの適用によって作製することができる。ヒトによって設
計された変更は、例えばＨＡＳ若しくはコンドロイチンシンターゼタンパク質の
酵素活性の抗原性に改良を導入するため、又は分子レベルでのＨＡＳ若しくはコ
ンドロイチンシンターゼ活性を調査する目的でＨＡＳ若しくはコンドロイチンシ
ンターゼ変異体を試験するために、部位特異的突然変異誘発法の適用を通して導
入することができる。
【００５０】 伝統的には、２種の異なる材料を結合させるためには多糖類の化学的又は物理
的処理が必要とされた。例えば、１種のポリマー又は表面の反応性求核基が他の
材料の活性化受容体基に曝露させられた。しかしこのアプローチに関しては２つ
の大きな問題が存在する。第１に、化学反応の制御を洗練させることが不可能で
あり、温度及び活性化レベルにおける相違はしばしばロット毎の調製で相違する
数種の最終生成物の分布を生じさせる。例えば、数個の鎖が少数のランダムな境
界の明瞭でない領域で架橋結合する可能性があり、結果として生じるサンプルは
均質ではない。第２に、分子を結合させるために化学反応を使用するとしばしば
生体材料の結合部に不自然又は非生物学的残基が残る。例えば、アミン及び活性
化カルボキシル基の使用はアミド連鎖を生じさせるであろう。炭水化物中に包埋
されたこの不適切な残基は毒性レベルへ蓄積する、又は免疫反応を誘発する可能
性がある分解産物のような生物学系との問題を提示する可能性がある。
【００５１】 ほとんどの多糖類ポリマーは、それらの物理的又は生物学的特性が明白になる
前に一定長さのポリマーでなければならない。しばしば多糖類は少なくとも２０
〜１００糖単位を含有していなければならない。外来ポリマーと反応する一定の
酵素がこれまでに利用可能であったが、典型的には１糖単位しか付け加えない。
本発明で記載されるユニークな酵素ＰｍＨＡＳは、長さが少なくとも１００〜４
００糖単位のポリマーを形成する。従って本発明は、天然グリコシド連鎖だけか
らなる長い明確に線状のポリマーを生じさせる。
【００５２】 パスツレラ・ムルトシダ菌に由来する２種の既知のグリコサミノグリカン合成
酵素は、通常は脊椎動物ポリマーに類似の又は同一のポリマーを作製する。これ
らの細菌は分子偽装として機能する細胞外コーティング剤としてＨＡ（Ａ型細菌
）又はコンドロイチン（Ｆ型細菌）のどちらかの多糖を使用する。天然酵素は、
通常は単一型の糖リピート（反復配列）のポリマー鎖を作製する。しかし組換え
ＨＡシンターゼ酵素が使用される場合は、酵素は強制的に外来受容体分子に作用
することができる。例えば、組換え酵素はポリマー受容体と一緒にインキュベー
トすることができ、組換え酵素はその後ＵＤＰ糖前駆物質を用いて受容体を伸長
させるであろう。既知の天然酵素は、それらが既に成長ポリマー鎖を含有してい
るのでこの反応を実行しない。
【００５３】 パスツレラ・ムルトシダ由来の９７２アミノ酸残基タンパク質であるＰｍＨＡ
Ｓは組換え大腸菌内で作られる。例えば、ＰｍＨＡＳ−Ｄと呼ばれる酵素である
ＰｍＨＡＳの他の機能的誘導体は可溶性に産生されてきた。可溶形は天然型全長
酵素より大量かつより純粋な状態で調製することができる。好ましい大腸菌菌株
は、ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼを有していないので、このためにこの組換
え酵素は異種宿主内でＨＡ鎖を作成しない。そのために、この酵素は、空受容体
部位が異種ポリマーで占有される可能性があるので「処女」状態にある。例えば
、この組換え酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、２０ｍＭ ＭｎＣｌ2、
１５０〜１６００μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、２００〜１５００μＭ ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ、及び適切な受容体を含有する混合物中において３０℃で３０〜１８
０分間、インキュベートすることができる。適切な受容体は、短いＨＡ鎖（２糖
単位以上）又は短いコンドロイチン硫酸塩鎖（５糖単位）又は長いコンドロイチ
ン硫酸塩鎖（〜１０2糖単位）であってよい。後者の２種の受容体の場合は、Ｐ
ｍＨＡＳ及びその誘導体類はその後４００糖までの真正ＨＡ鎖を用いてそれらの
非還元末端で異種受容体（即ち長い、又は短いコンドロイタン多糖類）を伸長さ
せる。受容体に付け加えられたＨＡ鎖の長さはＵＤＰ糖の濃度及び／又は反応時
間を変えることによって制御される。ビーズ又はその他の結合受容体オリゴ糖を
含む固形物体のような固定化受容体もまたＵＤＰ糖を使用するＰｍＨＡＳ酵素に
よって延長させることができる。この方法では、ＰｍＨＡＳはいずれかの適切な
受容体分子に多糖類鎖を付着させるために使用することができる。
【００５４】 Ｐ．ムルトシダＡ型はＨＡ被膜［ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃリピート］を産生
し、ＰｍＨＡＳ酵素を有する。他方、Ｐ．ムルトシダＦ型はコンドロイタン又は
コンドロイタン様ポリマー被膜［ＧｌｃＵＡ−ＧａＮＡｃリピート］を産生する
。タンパク質レベルでＰｍＨＡＳに８７％同一である読み取り枠（ＧｅｎＢａｎ
ｋ受入番号＃ＡＦ１９５５１７）をコードするＤＮＡはクローン化されている；
この新規酵素はＰｍＣＳと呼ばれるＰ．ムルトシダ由来コンドロイタンシンター
ゼである。ＰｍＣＳのアミノ酸配列は配列番号３に定義されており、ＰｍＣＳヌ
クレオチド配列は配列番号４に定義されている。ＰｍＣＳ酵素の配列はＰｍＨＡ
Ｓに極めて類似しているので、当業者であればＰｍＨＡＳに対してと同一方法で
ＰｍＣＳを操作することができ、さらにＰｍＨＡＳに関して良好な結果が得られ
たあらゆる操作は、ＨＡの代わりにコンドロイタン連鎖がグラフト化されること
を除いて、ＰｍＣＳについても実行できるであろう。ＨＡ又はコンドロイタン連
鎖は、両方の受容体がＰｍＨＡＳに対して同様に良好に機能するように、どちら
もＰｍＣＳに対する受容体として機能することができる。
【００５５】 ＨＡ及びコンドロイチンの両方からなるそのようなハイブリッドの多糖類材料
は、現在ある他のプロセスによっては（１）不自然な残基を残すこと、及び／又
は（２）望ましくない架橋結合反応を産生することを伴わずに形成することがで
きない。ハイブリッド多糖類材料は人工組織又は臓器における細胞／細胞相互作
用に対する生体適合性分子接着剤として機能することができ、さらにＨＡ／コン
ドロイチンハイブリッドは通常はポリマー鎖の中間で追加のタンパク質を含有す
る天然プロテオグリカンを模倣する。このために、本発明はタンパク質中間物に
対する要件を不要にする。そのような中間タンパク質が欠けている組換えＨＡ／
コンドロイチンハイブリッド多糖類は、動物起源の分子が潜在的に免疫原性であ
るために望ましい。ハイブリッド多糖類は宿主に対して「異種」には見えないの
で、従って免疫反応が発生しない。
【００５６】 多糖類合成の固有かつ本質的特徴は成長ポリマーに糖モノマー単位を繰り返し
付加することである。グリコシルトランスフェラーゼは未完成鎖に関連して残留
すると予想される。この特徴は、ＨＡ多糖類産物はこれまでに知られている全て
の場合において細胞の外へ輸送されるために、特にＨＡ生合成にとって重要であ
る；ポリマーが放出されてしまうと、ＨＡＳが別の機会にその特定分子を伸長さ
せることはないであろう。成長ポリマー鎖を該酵素の活性部位で保持するために
考えられる３つの機序は極めて明白である。第１に、該酵素は炭水化物ポリマー
結合嚢又は裂を有する。第２に、未完成鎖はその合成中に該酵素に共有的に付着
させられる。第３に、未完成ポリマー鎖がまだ共有的に付着させられている間に
該酵素はヌクレオチド塩基又は前駆体の脂質部分へ結合する。
【００５７】 Ｐ．ムルトシダ膜調製物中において所見される天然ＰｍＨＡＳ酵素のＨＡＳ活
性はＨＡオリゴ糖の付加によっては刺激されない；理論的には、ｉｎ ｖｉｖｏ
で開始された内生未完成ＨＡ鎖は外生的に供給される受容体を不要にする。しか
し、ＵＤＰ−ＧＬｃＵＡ前駆体が欠けている、及び従って未完成ＨＡ鎖が欠けて
いる大腸菌菌株中で産生する組換えＰｍＨＡＳは、外来ＨＡオリゴ糖に結合して
これを伸長させることができる。上記のように、未完成ＨＡ鎖を活性部位又はそ
の近傍に保持するためには３種の有望な手段がある。ＰｍＨＡＳの場合には、Ｈ
Ａ結合部位は糖トランスフェラーゼ触媒部位又はその近傍に存在すると思われる
。
【００５８】 ＰｍＨＡＳと糖鎖の間の相互作用の性質を識別するためには、サイズ及び組成
が様々である定義されたオリゴ糖が使用される。例えば、ＰｍＨＡＳの推定ＨＡ
ポリマー結合嚢は少なくとも無損傷ＨＡ三糖（還元テトラマー）に結合してこれ
を伸長させるであろう。しかし単糖類ＧｌｃＵＡ又はＧｌｃＮＡｃは高濃度で組
み合わせた場合でさえ有効な受容体ではない。ＰｍＨＡＳへのオリゴ糖結合は幾
らか選択的であると思われるが、それはＨＡ由来オリゴ糖からのグリコシド連鎖
においてのみ相違しているハパロサンペンタマーが受容体として機能しないため
である。しかし、コンドロイタン［ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃリピート］はＰｍ
ＨＡＳに対する受容体として機能する。
【００５９】 現在までにＰｍＨＡＳ以外の他のＨＡシンターゼで外来受容体又はプライマー
糖を利用することが証明されているものはない。セルフリーＨＡ合成システムに
関する早期の試験では、天然グループＡストレプトコッカスＨＡＳの調製は精巣
ヒアルロニダーゼ消化物由来ＨＡテトラマーを含有する種々のＨＡオリゴ糖類の
付加によっては阻害されも刺激されもしなかった。これらの膜調製物は、大量の
ＨＡ多糖類を産生していた培養液から単離された。これらの細胞には操作を容易
にするためにヒアルロニダーゼ処理が施された。このために、天然ＰｍＨＡＳの
場合において疑われたように、天然ストレプトコッカス酵素は極めておそらくタ
ンパク質に大量に付着又は結合させられた小さな未完成ＨＡ鎖を用いて単離させ
られたと思われる。理論的には、ｉｎ ｖｉｖｏで形成された存在する未完成鎖
はｉｎ ｖｉｔｒｏで単離された酵素によって外来受容体の進入及び引続いての
利用を遮断するであろう。分子クローン化ＨＡＳ遺伝子の出現に伴って、発現の
ために適切な宿主が利用されれば未完成ＨＡ鎖が欠けている処女酵素を調製する
ことが可能である。
【００６０】 哺乳動物系におけるヘパリン及びコンドロイチンはどちらも、ポリマー鎖の非
還元末端へ糖単位を付加することによって合成される。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、グ
リコシルトランスフェラーゼはプロテオグリカンコア分子のセリン残基へ付着さ
せられているプライマー四糖類［キシロース−ガラクトース−ガラクトース−Ｇ
ｌｃＵＡ］上で鎖伸長を開始させる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、酵素抽出物は単糖
を外生的に付加されたヘパリン又はコンドロイチンオリゴ糖へ移動させる；あい
にくなことに、その後の二糖単位の糖は通常は付加されず、より長いポリマーへ
の前進的伸長は発生しない。このために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ系では一部のコンポ
ーネントは変化させられる、又は失われると思われる。ヘパリン生合成の場合に
は、単一酵素がＧｌｃＵＡ及びＧｌｃＮＡｃの両方の糖を共精製又は発現試験に
基づいてグリコサミノグリカン鎖へ移動させると仮定されている。
【００６１】 ハパロサンを重合する大腸菌由来Ｋ５ＫｆｉＣ酵素に関する近年の研究は、単
一タンパク質がこれら２種の糖をｉｎ ｖｉｔｒｏで受容体分子の非還元末端へ
移動させられることを指摘している。しかし、これらの実験では前進的伸長は証
明されなかった；粗細胞溶解液は単糖を定義された偶数又は奇数オリゴ糖へ移動
させた。しかし、それらの初期突然変異原性実験は２種の単糖類の移動には少な
くとも２つの独立部位が含まれることを示唆している。
【００６２】 組換えＰｍＨＡＳは連続的方法で単一単糖類を未完成ＨＡ鎖の非還元末端へ付
加する。数百種の糖類を含有するＨＡポリマーの伸長はｉｎ ｖｉｔｒｏで証明
されている。ＨＡ分子のまた別の構造を生成するために二糖リピート単位の同時
形成は必要とされない。各半反応（例、ＧｌｃＵＡがＧｌｃＮＡｃ残基へ付加さ
れる、又はその逆）の固有の特異性及び忠実度は真正ＨＡ鎖を合成するためには
十分である。
【００６３】 ＨＡのまた別の二糖構造の結果として生じる大きな技術的利点は、ＵＤＰ糖ヌ
クレオチドの利用可能性を制御することによってこの反応を分析できることであ
る。前駆体を反応混合液から除外する又は反応混合液に供給することによって、
ヘテロ多糖類の合成の様々な段階でグリコシルトランスフェラーゼを停止及び開
始させることができる。これとは対照的に、例えば、キチン、セルロース、デン
プン、及びグリコーゲンのような重要なホモ多糖類を産生するグリコシルトラン
スフェラーゼを段階的方法で制御するための手軽な方法は存在しない。
【００６４】 重合を制御するためのまた別の方法は、短いＨＡオリゴ糖上に１つの糖連鎖を
付加するだけの変異体を作製することによって遂行されてきた。例えば、ＰｍＨ
ＡＳ−Ｅ［ＰｍＨＡＳ残基１−６５０］は受容体の非還元末端（即ち、ＨＡ四糖
［ＧｌｃＮＡＣ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡＣ−ＧｌｃＵＡ］）上に単糖ＧｌｃＮ
Ａｃを付加することだけできる。他方では、短いＨＡオリゴ糖類の非還元末端Ｇ
ｌｃＮＡｃ基上に単一のＧｌｃＵＡ残基だけを移動させる変異体が作製され、Ｐ
ｍＨＡＳ−Ｄ−Ｄ４７７Ｎ［４７７位でアスパラギン酸塩と置換されたアスパラ
ギンを有するＰｍＨＡＳ残基１−７０３］と呼ばれてきた。そのような２種の変
異体の抽出物をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの存在下で受容体
と一緒に混合すると、重要な重合が達成される。さらにまたＧｌｃＮＡｃ又はＧ
ｌｃＵＡ移動のステップを個別かつ連続的に実行することによって、ほとんどあ
らゆるＨＡ鎖長さが可能であることは明白である。これと同じことは、ＰｍＣＳ
に関しても単独又はＰｍＨＡＳと組み合わせた場合のどちらでも当てはまる。
【００６５】 上記のように、ＰｍＨＡＳタンパク質を含有する組換え大腸菌からの膜調製物
は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＭｎイオンの両方と一緒にコインキュベートした
ときにポリマー内へのＵＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＵＡからの放射標識の取り込みに
よって判定されるようなＨＡシンターゼ活性を有していた。数種のリポ多糖類ト
ランスフェラーゼへのＰｍＨＡＳのアミノ酸レベルでの類似性のために、ＨＡオ
リゴ糖がＧｌｃＵＡ及びＧｌｃＮＡｃ移動に対する受容体として機能するという
仮説が立てられた。組換えＰｍＨＡＳを用いての反応混合物への非標識偶数ＨＡ
テトラマー（精巣ヒアルロニダーゼ消化物由来）の付加は、図１に示されている
ようにオリゴ糖を用いない反応と比較してＨＡポリマー内へのＵＤＰ−［14Ｃ］
ＧｌｃＵＡからの放射標識の取り込みを〜２０倍から６０倍まで刺激する。
【００６６】 図１では、ＰｍＨＡＳ（３０μｇ総膜タンパク質）を含有する一連の反応溶液
が糖付加なし（なし）又は種々のオリゴ糖類（ＨＡ４、４μｇのＨＡテトラマー
；ｕｎｓＨＡ４／６、４μｇの未飽和ＨＡΔテトラマー及びΔヘキサマー；ｃｈ
ｉｔｏ４、５０μｇのチトテトラオース；ｈｅｐ５、２０μｇのヘパロサンペン
タマー）の存在下でアッセイ緩衝溶液（反応量５０μｌ）中でＵＤＰ−［14Ｃ］
ＧｌｃＵＡ（２×１０4ｄｐｍ、１２０μＭ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（４５
０μＭ）と一緒にインキュベートされた。１時間後、反応溶液は下降ペーパーク
ロマトグラフィーによって解析された。高分子量ＨＡ内へのＵＤＰ−［14Ｃ］Ｇ
ｌｃＵＡからの放射標識の取り込みが証明されている。無損傷テトラマー（ＨＡ
４）だけが受容体として機能した。ヘパロサン及びチトオリゴ糖、並びにＧｌｃ
ＮＡｃ及び／又はＧｌｃＵＡ（示されていない）との反応溶液は、受容体を用い
ない平行反応と同量の放射標識を取り込んだ。単独又は１００μＭまでの濃度で
組み合わせるかのいずれかの遊離単糖類ＧｌｃＵＡ及びＧｌｃＮＡｃは受容体と
して機能しない；同様に、これらの糖のベータ−メチルグリコシド類もまたＨＡ
Ｓ活性を刺激しない。
【００６７】 同一方法で、ＰｍＨＡＳはコンドロイタンペンタマー受容体上に糖類を付加す
ることが証明されている。ＰｍＨＡＳ及び試薬類は、コンドロイタンペンタマー
が受容体分子として使用されたこと以外は、図１に示された方法と同一方法で調
製された。この実験の結果は表Ａに示されている。
【００６８】
【表２】
【００６９】 従って、ＰｍＨＡＳが多糖類ポリマー鎖を形成するための基礎として多数の受容
体又はプライマー分子を利用できることが理解できる。
【００７０】 組換えＰｍＨＡＳの活性は、ＵＤＰ糖前駆体及びＭｎ2+イオンの両方との同時
インキュベーションに左右される。取り込みのレベルは、図２に示されているよ
うにタンパク質濃度、ＨＡオリゴ糖濃度、及びインキュベーション時間に左右さ
れる。図２では、偶数ＨＡオリゴ糖類（計４．４μｇのＨＡヘキサマー、オクタ
マー及びデカマーの混合物を含む１０５μｇ膜タンパク質／点；黒丸）又はオリ
ゴ糖受容体を含まない６倍以上のＰｍＨＡＳ（６３０μｇタンパク質／点；白丸
）を含有する２種の平行反応が比較された。酵素調製物は、アッセイ緩衝溶液中
にＵＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＵＡ（２４０μＭ ６×１０4ｄｐｍ／点）及びＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ（６００μＭ）を含有する前加温反応混合液に付加された。種
々の時点に、５０μｌのアリコートが引き出され、停止させられ、ペーパークロ
マトグラフィーによって解析された。外生的に供給された受容体はＰｍＨＡＳに
よるポリマー生成物内への糖前駆体のバルク取り込みを加速させたが、しかし受
容体は絶対的には必要とされなかった。
【００７１】 ＨＡオリゴ糖の存在下又は不在下で合成されたＨＡはＨＡリアーゼ（＞９５％
が破壊された）に感受性であり、≧１−５×１０4Ｄａ（〜５０−２５０単糖類
）の分子量を有する。バシトラシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）もツニカマイシン（０
．２ｍｇ／ｍｌ）も阻害剤を含まない平行反応と比較して取り込みのレベルを変
化させないので、脂質連結中間物に対する要件は観察されなかった。
【００７２】 組換えＰｍＨＡＳ、3Ｈ−ＨＡテトラマー、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ
−ＧｌｃＵＡを含有する反応のゲル濾過クロマトグラフィー解析は、図３に示さ
れているように〜０．５から５×１０4Ｄａ（２５−２５０単糖類）の標識ポリ
マーが作製されることを証明している。図３では、ＰｍＨＡＳ−ＤがＨＡテトラ
マー受容体及びＵＤＰ糖類を使用してＨＡ多糖を作製することをセファクリルＳ
−２００（２０ｍｌカラム、０．７ｍｌ分画）についてのゲル濾過解析が証明し
ている。８０ｋＤａ（〜４００単糖類）以上のデキストランが間隙容積内に溶離
する（Ｖｏ矢印）。開始テトラマーは包含容積内に溶離する（Ｖｉ矢印）。膜（
１９０μｇ総タンパク質）、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（２００μＭ）、ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ（６００μＭ）、及び放射標識3Ｈ−ＨＡテトラマー（１．１×１０5ｄ
ｐｍ）はゲル濾過（黒い四角）前に３時間に渡ってインキュベートされた。陰性
対照として、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ以外の全コンポーネントを含有する平行反応
が解析された（白い四角）。小さなプライマーは、両方の前駆体が供給された場
合には高分子量生成物へ伸長させられた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含有しない平
行反応では、標識テトラマーの溶離プロフィールは変化させられない。
【００７３】 しかし、Ｐ．ムルトシダ膜由来の天然ＰｍＨＡＳの活性は、同様の条件下でＨ
Ａオリゴ糖類の付加によって刺激されない。天然ＰｍＨＡＳ酵素は膜分離前に細
菌内で開始される付加又は結合未完成ＨＡ鎖を有している。他方、組換え酵素は
、大腸菌宿主がＨＡ多糖類を作製するために必要とされるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを
産生しないので、そのような未完成ＨＡ鎖を有していない。このために、外来Ｈ
Ａ由来オリゴ糖はＰｍＨＡＳの活性部位に接近して、伸長することができる。
【００７４】 ＨＡのウシ精巣ヒアルロニダーゼ消化物からのテトラマーはＧｌｃＵＡ残基を
持つ非還元末端で停止し、この分子はＰｍＨＡＳによるＨＡ伸長のための受容体
として機能した。他方、ストレプトマイセスＨＡリアーゼの作用によって産生し
たΔテトラマー及びΔヘキサマーオリゴ糖類は図１に示されているようにＨＡ重
合を刺激しなかった；「ｕｎｓＨＡ４／６」。リアーゼ除去開裂の結果として、
末端未飽和糖には通常はＨＡシンターゼによって伸長されるであろうＧｌｃＵＡ
のＣ４ヒドロキシル基が欠けている。この末端未飽和糖上でのその後の重合の欠
如はＤＮＡ合成中に存在する場合に連鎖停止反応を惹起するジデオキシヌクレオ
チドの場合と類似である。ホウ化水素による還元は受容体として機能するＨＡテ
トラマーの能力に影響を及ぼさず、従ってオリゴ糖の最終結果を観察するための
三ヨウ化ホウ素標識の使用を可能にするので、還元末端での閉鎖ピラノース環は
ＰｍＨＡＳによって必要とされなかった。
【００７５】 組換えグループＡ ＨａｓＡも組換えＤＧ４２も酵母中でより大きなポリマー
へ伸長したＨＡ由来オリゴ糖を産生させなかった。第１に、ＨＡテトラマー（又
は一連のより長いオリゴ糖類）はＨＡへの放射標識ＵＤＰ糖前駆体の取り込みを
有意には刺激も阻害もしなかった（≧対照値の±５％）。平行実験では、Ｈａｓ
Ａ又はＤＧ４２のＨＡＳ活性はキチン由来オリゴ糖類の付加によって影響を受け
なかった。第２に、組換え酵素はＵＤＰ糖の存在下で放射標識ＨＡテトラマーを
伸長させなかった（表ＩＩ）。しかしこれらの同一の酵素調製物は、放射標識Ｕ
ＤＰ糖がＨＡ内に重合される従来型ＨＡＳアッセイでは高度に活性であった。
【００７６】
【表３】
【００７７】 表ＩＩに示されているように、様々な組換え酵素がＨＡテトラマーを分子量生
成物へ転換する能力について試験された。これらの反応は放射標識ＨＡテトラマ
ー（５〜８×１０5ｄｐｍ）、７５０μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、３６０μＭ
ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、２０ｍＭ ＸＣｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７〜７
．６（各酵素に対して使用された各Ｘカチオン及びｐＨ値は次の通りであった：
ＰｍＨＡＳ、Ｍｎ／７．２；Ｘｅｎｏｐｏｕｓ ＤＧ４２、Ｍｇ／７．６；グル
ープＡ ストレプトコッカスＨａｓＡ、Ｍｇ／７．０）、及び酵素（単位／反応
は列挙されている）を含有していた。対照として、金属イオンがキレート化され
る平行反応が試験された（２２ｍＭエチレンジアミン四酢酸最終；ＥＤＴＡカラ
ム、＋が記載された列）；遊離金属イオンを含まない場合は、ＨＡＳ酵素は重合
を触媒しない。１時間のインキュベーション後、反応溶液は停止させられ、下降
ペーパークロマトグラフィーを受けた。従来型ＨＡＳアッセイでは全３種の膜調
製物が極めて活性であったが、ＨＡテトラマーを伸長させることができたのはＰ
ｍＨＡＳ−Ｄだけであった（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが供給されたときにＵＤＰ−
ＧｌｃＵＡからポリマー内への［14Ｃ］ＧｌｃＵＡの取り込み）。
【００７８】 3Ｈ標識オリゴ糖及び種々の組み合わせのＵＤＰ糖ヌクレオチドを含有するＰ
ｍＨＡＳ触媒伸長反応を観察するために薄層クロマトグラフィーが利用された。
図４は、反応混合液中で次の適切なＵＤＰ糖前駆体が利用可能な場合にはＰｍＨ
ＡＳが単糖によってＨＡ由来テトラマーを伸長させることを証明している。ペン
タマーを形成するためにテトラマー受容体の非還元末端でＧｌｃＵＡ残基上にＵ
ＤＰ−ＧｌｃＵＡ由来ＧｌｃＮＡｃが付加された。他方では、ＵＤＰ−ＧｌｃＵ
Ａだけの包含はオリゴ糖の移動性を変化させなかった。両方のＨＡ前駆体が供給
された場合には、様々な長い生成物が作製される。平行反応では、ベクタープラ
スミドを用いて宿主細胞から調製された制御膜はいかなる状況下でも放射標識Ｈ
Ａテトラマーの移動性を変化させなかった。ＴＬＣによって観察された類似の解
析では、ＰｍＨＡＳは標識チトペンタオースを受容体として利用しなかった。
【００７９】 図４に示されているように、ＰｍＨＡＳはＨＡテトラマーを伸長させた。図４
では、非還元末端でＧｌｃＵＡを含む放射標識ＨＡテトラマー（ＨＡ４ ８×１
０3ｄｐｍ 3Ｈ）がアッセイ緩衝溶液中で６０分間に渡って様々な組み合わせの
ＵＤＰ糖類（Ａ、３６０μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ；Ｎ、７５０μＭ ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃ；０、ＵＤＰ糖なし）及びＰｍＨＡＳ（５５μｇ膜タンパク質）と
一緒にインキュベートされた。反応溶液（計７μｌ）は１分間に渡って摂氏９５
°で加熱して遠心分離によって浄化することによって停止させられた。上清部分
（２．５μｌ）がシリカＴＬＣプレートのアプリケーションゾーン上にスポット
され、溶媒（ブタノール／酢酸／水［１．２５：１：１］）を用いて展開させら
れた。分析層の開始は矢印でマークされている。奇数ＨＡオリゴ糖（Ｓレーン）
の位置は単糖類単位の数としてマークされている。このオートラジオグラム（曝
露：４日間）は、引続いての前駆体だけが供給された場合にＨＡテトラマー受容
体上へのＧｌｃＮＡｃ糖（Ｎ）の単回付加がペンタマーを形成することを示して
いる。標識テトラマーの移動性は、不適切な前駆体ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（Ａ）だ
けが存在する場合、又はＵＤＰ糖が存在しない（０）場合には変化させられない
。両方のＵＤＰ糖が供給された場合は、５、７、９、１１及び１３糖のサイズの
生成物のラダー（はしご）が形成される（＋ＡＮ）。平行実験では、チトペンタ
オース（８×１０4 ｄｐｍ 3Ｈ）が受容体基質として試験された。いかなる条
件下でも、これはＰｍＨＡＳによって伸長させられる構造関連分子ではなかった
。
【００８０】 非還元末端でＧｌｃＵＡ又はＧｌｃＮＡｃのどちらかを有するＨＡ由来オリゴ
糖はＰｍＨＡＳのための受容体として機能した（図５）。図５では放射標識ＨＡ
ペンタマー（ＨＡ５、５×１０3 ｄｐｍ 3Ｈ）又はＨＡテトラマー（ＨＡ４、
２５×１０3 ｄｐｍ 3Ｈ）が２又は２０分間に渡ってＰｍＨＡＳ及び様々な組
み合わせのＵＤＰ糖類（図４と同様）と一緒にインキュベートされた。上清の部
分（１．５μｌ）がＴＬＣプレート上にスポットされ、１．５：１：１の溶媒中
で展開させられた。このオートラジオグラム（曝露：１カ月間）は、適切な前駆
体だけが供給されたとき（ＨＡ４、Ｎレーン及びＨＡ５、Ａレーン）に受容体上
への糖の単回付加を示している。両方のＵＤＰ糖類が供給された場合は（＋ＡＮ
レーン）、２分間でＨＡ４又はＨＡ５のどちらかから６、８及び１０糖の最終サ
イズを有する生成物のラダーが形成される。２０分後には、ＨＡ４及び両方のＵ
ＤＰ糖を用いた反応においてある範囲の奇数及び偶数生成物糖が観察される。Ｈ
Ａ５及び両方のＵＤＰ糖を用いた２０分間の反応においては、ＨＡ生成物が極め
て大きいので、それらはアプリケーションゾーンから移動しない。
【００８１】 ２分間以内に２から６糖単位が付加され、さらに２０分後に９から≧１５単位
が付加された。ＨＡテトラマー及び両方の糖類を用いた実験では、偶数及び奇数
生成物のラダーが２０分後の時点で生成する。このために、単一ＵＤＰ糖実験の
結果と組み合わせると、ＰｍＨＡＳ酵素は重合反応中に個々の単糖類を連続して
移動させる。
【００８２】 １．ＨＡシンターゼの単離およびアッセイ。組換えＰｍＨＡＳ（ＧｅｎＢａｎ
ｋ ＡＦ０３６００４）を含む膜調製物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（ｐＰｍＨ
ＡＳ）から単離した。天然のＰｍＨＡＳを含む膜調製物を、Ｐ．マルトシダ Ｐ
−１０５９株（ＡＴＣＣ番号＃１５７４２）から得た。ＰｍＨＡＳを、３０℃の
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、２０ｍＭ ＭｎＣｌ2、およびＵＤＰ−糖
（ＵＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＵＡ、０．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ、およびＵＤＰ
−ＧｌｃＮＡｃ）中でアッセイした。反応産物を、以下に記載の種々のクロマト
グラフィーによって分析した。他の組換えＨＡＳ酵素（酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生させた群Ａ連鎖球菌ＨａｓＡまた
はＸｅｎｏｐｕｓＤＧ４２）を含む膜調製物を調製した。
【００８３】 ２．アクセプターオリゴ糖。ウロン酸をカルバゾール法で定量した。１１の番
号が付けられたオリゴ糖［（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ）n］を、ウシ精巣ヒア
ルロニダーゼＶ型（ｎ＝２〜５）またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕ
ｒｏｎｉｔｉｃｕｓ ＨＡリアーゼ（ｎ＝２または３）のいずれかを用い、３０
ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ５．２、３０℃で一晩のＨＡ（群Ａ連鎖球菌）の消
化によって作製した。後者の酵素は、鎖の切断に排出機構を用いることにより、
各フラグメントの非還元末端に不飽和ΔＧｌｃＵＡ残基が得られる。さらなる精
製および脱塩のために、いくつかの調製物を、０．２Ｍ蟻酸アンモニウム中にＰ
−２樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を備えたゲル濾過に供して、凍結乾燥した。ＧｌｃＮ
Ａｃ残基で終結する奇数番号のＨＡオリゴ糖［ＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｕｃＵＡ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ）n］末端を、ＨＡリアーゼ（ｎ＝２〜７）で作製した部分的ＨＡ消
化物の酢酸水銀処理によって調製した。ＨＡオリゴ糖の質量を、基質補助レーザ
ー脱離イオン化飛行時間型質量分析法によって評価した。水中の糖を等量の５ｍ
ｇ／ｍｌ ６−アゾ−２−チオチミンの５０％アセトニトリル／０．１％トリフ
ルオロ酢酸溶液と混合し、標的プレート上で迅速に風乾した。パルス窒素レーザ
ー照射によって発生した陰イオンを、直線モード（２０ｋＶ加速、Ｐｅｒｃｅｐ
ｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒa）で分析した。
【００８４】 ＨＡと構造が類似した他のオリゴ糖も、ＨＡＳアッセイで試験した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ５夾膜多糖類由来のヘパロサン五量体は、β（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−
α（１，４）ＧｌｃＵＡ］2−β（１，４）ＧｌｃＮＡｃであり、この炭水化物
は、ＨＡと同一成分を有するが、単糖類管のグリコシド結合が異なる。キチン由
来のオリゴ糖であるキトテトラオースおよびキトペンタオースは、それぞれ４ま
たは５つの単糖類からなるβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃポリマーである。
【００８５】 種々のオリゴ糖を、４〜６等量のボロトリチドナトリウム（２０ｍＭ、ＮＥＮ
、０．２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の１５ｍＭ ＮａＯＨ溶液で３０℃で２時間の還元に
よって放射能標識した。3Ｈ−オリゴ糖を、０．２Ｍ蟻酸アンモニウム平衡化Ｐ
−２カラムで脱塩して、組み込まれなかったトリチウムを取り除き、凍結乾燥し
た。いくつかの標識オリゴ糖を、アクセプターとして使用する前に、Ｗｈａｔｍ
ａｎ１を用いたペーパークロマトグラフィーでピリジン／酢酸エチル／酢酸／水
（５：５：１：３）での展開によってさらに分離精製した。
【００８６】 ３．ＨＡシンターゼ反応産物のクロマトグラフィーによる分析。エタノール／
１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）（６５：３５）中で展開させたＷｈａｔｍ
ａｎ ３Ｍでのペーパークロマトグラフィーを用いて、ＵＤＰ−および小さなア
クセプターオリゴ糖から高分子量のＨＡ産物（最初から残存する）を分離した。
従来のＨＡＳアッセイでは、放射性ＵＤＰ−糖を、ＨＡに重合化する。ＨＡ重合
産物のサイズ分布を得るために、いくつかのサンプルを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、
５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって分離した。カ
ラムを、デキストラン標準で較正した。ポリマー産物の同一性を特異的ＨＡリア
ーゼに対する感受性および反応中の両ＵＤＰ−糖前駆体の同時存在の要求によっ
てアッセイした。ブタノール／酢酸／水（１．５：１：１または１．２５：１：
１）展開溶液を用いたアプリケーションゾーン（Ｗｈａｔｍａｎ）を有する高性
能シリカプレートでの薄層クロマトグラフィーによって、反応混合物中の3Ｈ標
識オリゴ糖を分離した。放射性分子を、ＥｎＨａｎｃｅスプレー（ＮＥＮ）での
含浸および−８０℃でのフルオログラフィー後に視覚化した。
【００８７】 ウェスタンブロットまたは免疫アッセイによってタンパク質を日常的に監視す
る抗ＰｍＨＡＳ単一特異性抗体試薬も同定した。この試薬を使用してタンパク質
の発現レベルを標準化することができる。スクリーニングで選択した目的の変異
体由来の酵素配列をエンコードするＤＮＡインサートをサブクローン化し、完全
に配列決定して、変異部位を評価および同定することができる。
【００８８】 物理学的性質の変化（すなわち、高レベルの発現および精製により役立つタン
パク質）および機能の変化（すなわち、単一のトランスフェラーゼ活性）を有す
るタンパク質を産生するＰｍＨＡＳの一連の短縮変異体（通常、９７２残基の膜
タンパク質）を作製した。真正Ｎ末端配列に対応するプライマーおよび終止コド
ンで終結する内部コード領域に対応するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）を用いて、ＰｍＨＡＳ遺伝子の一部を増幅させた。短縮タンパク質
のコード領域を、ｔａｃプロモーターの調節下で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ発現プラスミド（ｐＫＫ２２３−３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローン化
した。ＤＮＡ配列を、自動配列決定によって評価した。
【００８９】 短縮シリーズを作製し、活性について試験した。全てのタンパク質を予想され
る分子量で作製したが、全てが活性であるわけではなかった。
【００９０】
【表４】
【００９１】 ７０３残基の読み取り枠を有するプラスミドを含む誘導細胞培養物の分析によ
り、新規の８０−ｋＤａのタンパク質（ＰｍＨＡＳ−Ｄと呼ぶ）が大量に産生さ
れることが明らかになった。さらに、機能的ＰｍＨＡＳは、細胞可溶化物の溶解
性画分に存在するので、酵素の迅速な抽出およびアッセイが可能であった。Ｐｍ
ＨＡＳ−Ｄを、図６に記載の連続的クロマトグラフィー工程によって精製した。
図６では、ＨＡシンターゼの可溶性活性形態を分子生物学的技術によって構築し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換え酵素を、２０ｍｇ／リットルまでの細胞培養を用
いた従来のクロマトグラフィーによって精製した。図６は、異なる段階のクロマ
トグラフィー中のＰｍＨＡＳ−Ｄのサンプルをロードした電気泳動ゲルの染色（
星印で示す）である。この触媒（および改良変異体バージョン）を使用して、人
工的な表面へのＨＡ被覆または適切なアクセプター分子上のＨＡ拡張を作製した
。
【００９２】 ＰｍＨＡＳ−Ｄは、活性が高く変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると
少なくとも９５％の純度である。質量分析により、ＰｍＨＡＳ−Ｄは、計算値と
見かけの質量値が非常に一致しているので、望ましいタンパク質であることが示
された。０℃〜３７℃の範囲で酵素活性を安定化させるための緩衝系も開発した
。
【００９３】 次いで、部位特異的変異誘発を使用して、酵素活性の異なる種々のＰｍＨＡＳ
−Ｄを調製した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ系を使用し
、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた複数
ラウンドの伸長を使用して、クローニング領域に変異を添加した。一定の位置で
混合塩基を有するプライマーの使用によって、広範な種々のアミノ酸の変化を作
製した。次いで、ＤＮＡ配列決定を使用して、残基の変化を同定した。糖トラン
スフェラーゼ活性が変化したいくつかのＰｍＨＡＳ−Ｄ変異体も得た。類似の方
法を使用して、ＰｍＨＡＳ−ＤのＨＡ−アクセプター結合も変化させた。
【００９４】 ＰｍＨＡＳ−Ｄ配列の２つの位置を、最初の試験で変異させた。１９６または
４７７のアスパラギン酸残基の保存は、ＨＡＳ活性に重要であった。
【００９５】
【表５】
【００９６】 変異酵素は、適切なアクセプターオリゴ糖への１つのＧｌｃＮＡｃまたは１つの
ＧｌｃＵＡの添加に有用である。ＰｍＨＡＳは各糖の導入用の２つのドメインま
たは２つの分子を有するようである。当業者は、本明細書を参照して種々のドメ
インを変化または組み合わせて、異なる構造を有する新規の多糖類を産生するこ
とができる新規の多糖類シンターゼを作製することができるであろう。このよう
な用途では、ＰｍＨＡＳを原型として種々のグラフティング技術が得られる。Ｐ
ｍＨＡＳ−Ｄ配列に関連する各々の変異のグラフ図を、図７に示す。
【００９７】 図８は、変異組み合わせアッセイのグラフ図である。野生型ＰｍＨＡＳのみ、
Ｄ１９６変異体のみ、Ｄ４７７変異体のみの存在下またはＤ１９６およびＤ４７
７変異体の両方の存在下で、ＨＡＳ酵素アッセイを行った。３０℃の典型的な反
応緩衝液中で少量のＨＡアクセプター糖を用いて、糖量の各酵素を試験した。各
アッセイについて２つの時点で測定した（斜線、２５分間、黒塗り、１．５時間
）。２つの変異体が共に作用してＨＡポリマーを作製するが、それ自体（単一の
変異体）では、ＨＡポリマーを作製することができない。
【００９８】 ＰｍＨＡＳ−Ｄの酵素活性を、図９に示す。変異体の抽出物を、３種全てのア
ッセイ（ＨＡポリマー産生、ＧｌｃＵＡターゼ活性、およびＧｌｃＮＡｃターゼ
活性）に使用した。等量のＰｍＨＡＳ−Ｄタンパク質（ウェスタンブロット分析
に基づく）をアッセイした。活性を、野生型ＰｍＨＡＳ−Ｄの活性に対する百分
率として示した。
【００９９】 新規の生体物質および生体模倣物（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）の出現と共に、
医学分野で貢献するハイブリッド多糖物質が必要である。生物工学の主な目的は
、ヒトの身体を修復または監視するための人工的グラフティングデバイスの設計
である。多用途半導体、高強度ポリマー、および耐久性合金は、生物工学の課題
に所望のこれらの物質を作製する多くの性質を有する。しかし、ヒトの身体は、
現代の人工物質の利用の妨げとなる広範な防御および応答を有する。異なる組織
および器官を生物工学のさらなるレシピエントと同定するには、接着または保護
コーティングとして作用することができる非免疫原性ポリマーとの組み合わせが
必須である。工業的乳化または接着処理もまた、本発明の用途に十分に適切であ
り、他のより適切な酵素を使用して有用な分子をグラフティングすることができ
る。
【０１００】 電気化学的反応を利用した化学センサーは、多くの生物学的応用に有望である
。特に、糖尿病のホームモニタリング用の血液グルコース測定は、非常に興味深
い。不運にも、グルコースおよび他の生化学物質用のバイオセンサーは、その予
想レベルに達していない。センサーの信頼性、選択性、および物質の安定性にま
つわる問題がバイオセンサー市場の実現を遅らせている。電子物質上に選択物質
を蓄積させる一方で、生物系との適合性を維持する新規の方法が必要である。本
発明は、このような方法を提供する。ＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素の使用により、適切な
外因性ＨＡオリゴ糖でプライムされる電子物質または金属物質を、ＨＡの層で被
覆することができる。このようなＨＡ層は、生物学的免疫系から電子物質を保護
する一方で、電子物質または金属物質の機能を十分に発揮することができる。
【０１０１】 現在、市販のグルコースセンサーは、患者の血液中に見出されるグルコースオ
キシダーゼの電気化学的酸化および還元によって操作する。典型的には、患者は
、センサーに必要な血液サンプルを得るために、毎日数回指を突き刺さなければ
ならない。一旦センサー中に入ると、フルコースオキシダーゼはグルコースと反
応してグルコン酸が形成される。この酵素の還元形態がフェリシアン化物などの
電子媒介物と反応して、フェロシアン化物を形成する。センサー電極はフェロシ
アン化物を酸化して、血液中のグルコース濃度と比例して電流を生じる。
【０１０２】 多くのバイオセンサーと同様に、ミクロ電子工学的能力を十分に組み込む一方
で生体適合性を維持する浸潤性の低いまたはグラフティング可能なセンサーデバ
イスを用いた継続的監視への有意に変化させることは、グルコースセンサー開発
における将来動向である。センサー配列のマイクロ加工を用いたグルコースマイ
クロセンサーは従来のグラフティング手段であり、高い感受性閾値を有する。現
在、市販のグルコースマイクロセンサーは存在しない。センサーの選択性および
安定性などの問題が、グラフティング可能なグルコースマイクロセンサーの開発
の妨げとなっている。ヒトの身体は過酷な環境であるので、バイオセンサーの安
定性および信頼性に対する生体適合性が重要な問題となる。当該分野で身体から
センサーを保護する種々のポリマーを検索する作業が行われている。そのポリマ
ーいくつかは、電子メディエーターおよび酵素をポリマー物質に直接結合させて
電気が接続されるので、ｉｎ ｖｉｖｏ用のセンサーの安定性および安全性が改
良された。生体物質をセンサーの表面に組み込む一方でセンサー機能を維持する
手段が有利であろう。本発明は、このようなセンサー用の非免疫原性被覆法なら
びに他の生体物質を提供する。
【０１０３】 本発明では、当業者に公知の化学的性質および類似の反応工程を使用して無機
物質上にＨＡオリゴ糖および他の新規のプライマー物質を蓄積させる。例えば、
ＨＡオリゴ糖由来のアミノ化合物と同様に反応することができる反応性エポキシ
表面を作製することができる。一旦プライマー物質が無機物質上に蓄積されると
、ＰｍＨＡＳ−Ｄを使用して、無機基質上にＨＡ−ポリマーの保護被覆が形成さ
れる。したがって、ＨＡポリマー被覆は、身体の免疫系から物質を保護する一方
で、物質が感知、検出、または薬物送達などの医学的目的を果たすことができる
。
【０１０４】 グラフティング片およびセンサーに適切な人工物質の存在の大部分は、いくら
かの程度で、通常（ａ）組織または体液との反応による異物反応を引き起こすか
、（ｂ）その相対的不活性による身体のとの実質的結合性が欠如する。本発明の
ＨＡポリマー被覆は、これらの遭遇する２つの障壁を克服する。天然に存在する
ＨＡの均一な被覆により、身体にグラフティングされた人工成分の副作用（免疫
応答、不適切な凝血、および／または炎症など）の発生を防止する。さらに、Ｈ
Ａは組織の完全性の維持および創傷治癒に関連するので、ＨＡ多糖類被覆は、体
内の人口構造物の受容を促進する。
【０１０５】 バイオセンサーに結合させたＨＡポリマーは、体内環境からセンサーを保護す
る外部バリアとして作用する。しかし、任意の感知用途で、化学分析物はセンサ
ー物質に接触することができなければならない。したがって、ＨＡポリマー層は
、グルコースをセンサー内領域に輸送できなければならない。他の分子はまた、
センサー応答を干渉し得る血液中に存在する。血液中の成分とＨＡポリマーとの
間の相平衡は、センサー層の局所的環境を決定する。薄いＨＡポリマー層の輸送
特性により、パッケージング物質としてＨＡポリマーを使用することができる。
ＨＡポリマーによる外部被覆により、核酸調節様式でグルコース分析物を輸送す
る一方で、生体物質による電子デバイスの損傷を防止することができる。蓄積さ
れるＨＡポリマーは、もつれた直鎖の親水性糖であるグルコースおよび層内を比
較的自由に移動する他の小さな化合物からなる。一方、センサーを汚染し得る巨
大タンパクに対する媒体はＨＡ層から排除される。
【０１０６】 先に記載のように、ヒトの医学的治療へのＨＡを利用した前例が存在する。現
在、ＨＡは、目の手術、滑液置換、およびいくつかの手術の補助に使用されてい
る。生物デバイスを被覆するためのＨＡの使用に対する十分な調査も進行中であ
る。先に記載した被覆法では、典型的には、動物または細菌供給源が抽出したＨ
Ａを、表面に化学的に架橋させるか物理的に吸収させる。これらの方法に伴う潜
在的な問題は、以下を含む：（ａ）動物の夾雑物および／または移入した化学的
架橋基との免疫反応、および（ｂ）被覆の配置の再現性の欠陥。本発明では、Ｈ
Ａポリマー鎖を、精製生合成酵素ＰｍＨＡＳ−Ｄを用いてｉｎ ｓｉｔｕで産生
させる（図１０）。図１０では、シリコンへの第１世代ＨＡ被覆の略図を示す。
次いで、シランおよび糖プライマーをシリコン表面に結合させる。次いで、Ｐｍ
ＨＡＳ−Ｄは、プライマーで適切な糖を伸長して、生体適合性被覆を形成する。
特定の被覆用途に適合するように、ＨＡポリマーの長さ（１００〜１０3個の糖
）を調整する。
【０１０７】 外来成分または人工部分が相対的に存在しないので、免疫学的問題は起こらな
い。特定の適用に依存して、ポリマーの長さおよび鎖の配向を、正確に調節する
ことができる。本発明の多糖類表面被覆により、人工物質の生体適合性、細胞環
境下でのデバイスの寿命の延長、および宿主組織との自然な相互作用の促進が改
良される。
【０１０８】 固体物質上の表面被覆に関して、ポリアクリルアミドビーズを、ＰｍＨＡＳ−
Ｄを触媒として用いてＨＡポリマーで被覆した。第１に、アミノエチルビーズを
、還元的アミン化によってＨＡオリゴ糖（４、６、および８糖鎖長の混合物）で
化学的にプライムした。ビーズ、ＨＡオリゴ糖、および７０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ 4 の０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を、４２℃で２日間インキュベートした。
ビーズを、高塩および低塩緩衝液で洗浄した後、次の工程で使用した。プライム
する糖またはキトペンタオース［（ＧｌｃＮＡｃ）5］を含まない対照ビーズも
調製した。ＨＡを含まないビーズは、ＨＡ合成をプライムしなと予想され、キト
ペンタオースは、ＰｍＨＡＳのアクセプターとして作用しない。第２に、種々の
ビーズ調製物（１５μｌ）を、ＰｍＨＡＳ−Ｄ（３μｇ）、１５０ｍＭ ＵＤＰ
−［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、６０ｍＭ ＵＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＵＡ、２０ｍＭ
ＭｎＣｌ2の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）溶液中、３０℃で６０分間イン
キュベートした。次いで、ビーズを、高塩および低塩緩衝液で洗浄した。次いで
、ビーズに結合した放射能（糖に対応する）を、表Ｖの液体シンチレーション計
数によって測定した。
【０１０９】
【表６】
【０１１０】 ＨＡオリゴ糖でプライムし、ＰｍＨＡＳ−ＤでインキュベートしたＨＡビーズ
のみが、両ＵＤＰ糖前駆体由来の放射標識を組み込み、これは、ビーズに結合し
た短いＨＡ糖が酵素によってより長いＨＡポリマーに伸長したことを示す。これ
までは、他の公知のＨＡ合成は、プライムした基質上へのＨＡポリマーの被覆を
適用する所望の触媒活性を保有していない。
【０１１１】 したがって、上記のように、真正ＨＡオリゴ糖プライマーを、ポリアクリルア
ミド表面に化学的に結合させ、次いで、プライマーを、ＰｍＨＡＳ酵素およびＵ
ＤＰ−糖を用いてさらに伸長させた。基質に依存して、当業者によって反応条件
を最適化することができる。例えば、半導体の改変、緩衝液条件、ＨＡ伸長反応
時間、および化学量論の様式を、任意の単一または複数の反応バリエーションを
考慮して変化させることができる。次いで、得られた被覆物を、効率および用途
について評価することができる。
【０１１２】 医療用デバイスとして将来的に実用的なレベルに生体適合性ＨＡ被覆工程をス
ケールアップおよび容易にするために、（ａ）元のＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素でＨＡオ
リゴ糖を置換する新規の合成分子を使用するか、または（ｂ）プライマーとして
「類似の」有機分子を使用するＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素の変異形態を使用する。
【０１１３】 現在、ＨＡオリゴ糖アクセプターまたはプライマー分子の重要な構造エレメン
トが、試験および同定されている。これまでのところ試験された活性を有する最
小のアクセプター分子は、ＨＡ四量体［ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ
−ＧｌｃＮＡｃ−還元末端］である。最近のデータにより、ＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素
はヘキソサミン基の同一性に関連していくらか過動性を有する、すなわち、他の
イソ型がＧｌｃＮＡｃ糖と置換されることが示唆される。例えば、コンドロイタ
ン五量体［ＧａｌＮａｃ−ＧａｌＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＵＡ−ＧａｌＮＡ
ｃ］は、組換えＰｍＨＡＳの有効なアクセプターとして作用する。したがって、
いくつかの水酸基、負電荷の基の対（ＧｌｃＵＡ糖の対応するカルボキシル基）
、および疎水性パッチ（糖の環の炭素が豊富な側鎖のアナログ）からなる合成分
子は、プライマーとして作用することができる。ヘパリン（グリコサミノグリカ
ン）の合成としてのこのようなアプローチは前例がなく、複雑なプロテオグリカ
ンのコアの代わりに比較的単純な芳香族キシロシドでプライムすることができる
。
【０１１４】 ＨＡオリゴ糖のコンピュータモデリングにより、潜在的な分子型を視覚化する
ことができる。しかし、いくつかのタンパク質は、結合の際に糖鎖が変形するの
で、コンピュータモデリングをいくらか複雑にする。人工プライマーの最も有効
な発見法は、化学的組み合わせアプローチである。密接に関連する一連の分子を
、ＨＡ伸長を検出するための高処理法によってスクリーニングする。次いで、天
然のＰｍＨＡＳ−Ｄを、典型的な９６ウェルプレート形式において、合成プライ
マー候補物へのＨＡポリマーの添加能力について試験した。例えば、従来のＦmo c 化学を使用して、ＧｌｃＮＡｃ基で終結させた一連の合成ペプチド（６〜８残
基）を作製した。このようなペプチドは、種々の高次構造に適合し、誘導した適
合機構を介してＰｍＨＡＳ−Ｄ ＨＡ結合ポケット内で適合することができるの
で特に有望である。合成ペプチドの化学的性質はまた、炭水化物の化学適性性質
より扱いやすい。当業者は、本明細書を参照して公知の合成ペプチド化学技術を
用いることができる。
【０１１５】 ＨＡのＧｌｃＮａｃＧｌｃＵＡ糖反復の性質を模倣する目的でアミノ酸を選択
する。例えば、ＧｌｃＵＡの酸性基の置換基としてのグルタミン酸またはアスパ
ラギン酸の使用またはＧｌｃＮＡｃの酸性基の置換基としてのグルタミン酸また
はアスパラギン酸の使用、セリン、トレオニン、またはチロシンを、一般異に水
酸基および糖の環の置換基として使用することができる。ＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素結
合部位および触媒中心に対する要求が過度に紛らわしくならないように、ペプチ
ドライブラリーをＧｌｃＮＡｃ糖基で終結させる。並行して、組み合わせアプロ
ーチ（例えば、各位置で１〜３個の異なるアミノ酸を含む推定の６〜７残基ペプ
チド（可能なペプチドが何百も存在する）を用いる）を用いて種々の明確なペプ
チドを作製する。ペプチド組み合わせライブラリーを、プラスチック製のピンま
たはプレートのいずれかに固定する。
【０１１６】 本発明はまた、プライマーとしてＨＡオリゴ糖よりも単純な分子を使用するＰ
ｍＨＡＳ−Ｄの変異型バージョンの開発を含む。キトペンタオース（β１，４−
ＧｌｃＮＡｃホモポリマー）は、このような潜在的な変異型プライマーの１つで
ある。天然のＰｍＨＡＳ−Ｄは、プライマーとして使用することができないが、
変異体ＰｍＨＡＳ−Ｄは、キトペンタオースを潜在的に伸長することができ、よ
り容易に利用可能な物質である。キトペンタオースプライマーを、通常のプラス
チック製プレート上への工程のために、アミノ含有プレートまたはキャリアタン
パク質（アルブミン）に対する還元的アミン化によって固相に結合させる。次い
で、種々の変異体を、機能についてスクリーニングすることができる。使用目的
の他の潜在的な非糖模倣物は、スチレン、スルホン酸、アクリル酸、および／ま
たは安息香酸基を含む短鎖ポリ（エチレングリコール）ベースのコポリマーであ
る。
【０１１７】 光親和性標識を使用して、アリールアジドを含む放射性ＨＡオリゴ糖をＰｍＨ
ＡＳ−Ｄタンパク質に架橋する。ＰｍＨＡＳ−Ｄタンパク質の結合部位を、ペプ
チドマッピングおよびエドマン配列決定によって得る。この情報を用いて、結合
部位が変化した変異体を調製する。キトペンタオースを例として、ＨＡ結合部位
のいくつかの塩基性残基（通常、ＧｌｃＵＡのカルボン酸塩に接触する）の除去
および無極性残基の置換を選択する。上記のように、一定の位置に混合した塩基
を有する変異原性オリゴヌクレオチドを使用した種々の部位特異的変異体を作製
した。このような混合塩基アプローチは、通常のオリゴヌクレオチド数および必
要な形質転換を節減する。次いで、高処理スクリーニングを使用して、変異体Ｐ
ｍＨＡＳのＨＡ鎖での合成プライマーの伸長能力を評価する。無作為な変異体Ｐ
ｍＨＡＳ（化学的変異誘発物質または変異誘発遺伝子株の継代のいずれか）に経
験的なアプローチを使用し、その後スクリーニングすることもできる。
【０１１８】 ９６ウェル形式でＨＡ伸長反応の成功を測定するように、アッセイを設計した
（図１１）。図１１に、グラフ図でアッセイを示す。このアッセイを使用して、
多くの変異体を並行してスクリーニングすることができる。このスクリーニング
法を、以下の事実によって容易である：（ｉ）９６ウェルプレート中のＥ．ｃｏ
ｌｉ培養物から最小の処理で機能的組換えＰｍＨＡＳ−Ｄを容易に抽出するプロ
トコールが存在すること、（ｉｉ）固相マイクロタイタープレート上のＨＡの感
度の高い検出法が存在すること。培養物および抽出物を、並行して多チャネルピ
ペットに移す。１０〜３０μｌの誘導細胞培養によって産生されたＨＡＳ活性（
６００ｎｍでの吸光度＝１）が日常的に検出され、ウェルは２００〜３００μｌ
作業量を有するので、複数のアッセイまたは低ＨＡ産生の検出が可能である。細
胞可溶化物中の他の成分は、ＨＡＳアッセイを干渉しない。抽出物は、−８０℃
での長期保存で安定である。ＨＡ伸長の検出用に、ＨＡ結合タンパク質プローブ
［ＨＡＢＰ］（ビオチン化アグレカン）の特異性を利用する。このプローブは、
高親和性であるが小さなＨＡプライマー（４〜６糖長）でＨＡタンパク質を伸長
させる。結合したＨＡＢＰプローブを、蛍光、放射標識、または酵素結合アビジ
ン（ビオチン結合タンパク質）を用いて測定したビオチンタグによって検出する
。
【０１１９】 活性の低い酵素または不十分なプライマーでの反応を同定するために、ＨＡＢ
Ｐプローブの使用の代わりに放射性糖（ＵＤＰ−［3Ｈ］ＧｌｃＮＡＣまたはＵ
ＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＵＡ）の取り込みを測定する。勿論、大部分の変異体およ
びプライマーは、所望の特徴を有していないが、高処理スクリーニングにより容
易に同定されるＨＡ被覆工程を容易にする稀な標的分子が得られる。
【０１２０】 生体物質はまた、組織操作の分野で中心的な役割を果たす。特異的細機能を誘
発し、組織再生を誘導する基質として作用することができる最初無細胞であるグ
ラフティング片および細胞グラフティングを支持するグラフティング片の両方に
おける細胞−細胞相互作用を指向するような生体模倣合成ポリマーを作製した。
生体模倣アプローチは、生体接着性レセプター結合ペプチドならびに単糖類およ
びオリゴ糖が付与されたポリマーに基づいている。これらの物質を、二次元およ
び三次元で模倣してモデル多細胞組織構築物を作製した。このアプローチは、多
細胞型の複合体の組織化を作製する今後の試みに有用であり得る。天然ポリマー
もこれらの試みに重要な役割を果たし、天然ポリマーの有利な態様と多数の望ま
しい特徴を有する合成ポリマーとを組み合わせた組換えポリマーを設計して産生
した。生体物質を使用して、別の天然に存在する現象（創傷治癒または健常な被
験体における組織の再生など）を誘導および促進し、通常存在しない細胞応答（
罹患した被験体の治癒またはその後に細胞グラフティングを受けるための新規の
血管床の再生など）を誘導し、天然の現象（他の種由来の細胞グラフティング片
の免疫拒絶または瘢痕形成を刺激する成長因子のシグナル伝達など）を阻止する
。
【０１２１】 約１０年前、生体接着の概念は、薬学分野の文献で紹介され、学究的世界およ
び産業界双方での多くの研究および開発の刺激となっている。生体接着薬物送達
系（ＢＢＤＳ）の第一世代は、いわゆる粘膜付着ポリマー（すなわち、湿ってい
るか水分の多い粘膜組織表面への顕著な「固着」能力を示す、他の目的で薬学的
賦形剤として既に十分に受容および使用されている天然または合成高分子）に基
づく。これらの新規の投薬形態は、主に、粘膜組織表面への伸長、より良好な局
在化、または強い接触を可能にすることを期待する一方で、これらの目的を少な
くともこのような比較的簡単な技術によってしばしば非常に容易に達成されるこ
とを実現しなければならない。しかし、常に「接着剤」として確証的ではないに
もかかわらず、生体接着ポリマーのいくつかは、他のさらに重要な生物活性（す
なわち、タンパク質分解酵素の阻害および／または通常強固な上皮組織障壁の透
過性の調整）を示すことが見出された。このような特徴は、ペプチドおよびタン
パク質薬物送達分野で特に有用であることが見出された。
【０１２２】 生体接着調節薬物送達の主な目的は、部位特異的様式で薬物吸収プロセスを向
上させるために体内の送達デバイスを局在化することである。生体接着は、生物
学的環境、ポリマー放出調節デバイス、および薬物自体の存在の相乗作用に影響
を受ける。送達部位およびデバイス設計は、薬物の分子構造およびその薬理学的
挙動に影響を受ける。
【０１２３】 当該分野で公知のこのような生体接着の１つはフィブリン「接着剤」であり、
薬物と組み合わせた１つまたは複数の型のフィブリン接着剤を含む組成物が研究
されている。例えば、２成分のフィブリン接着剤の取扱適性に対する効果を試験
するために、フィブリン接着剤の粘度をヒアルロン酸ナトリウムで増加させ、接
着剤をラット中の微小血管吻合に塗布した。各ラットの大腿動脈を、３つの異な
る縫合糸で吻合し、フィブリン接着剤で密封した。以下の異なる粘度の３つの接
着剤を試験した：元のＴｉｓｓｅｅｌフィブリン接着剤（Ｉｍｍｕｎｏ ＡＧ、
Ｖｉｅｎｎａ）、フィブリノゲン成分に０．９％塩化ナトリウムを添加したＴｉ
ｓｓｅｅｌ、およびフィブリン成分に高分子量のヒアルロン酸ナトリウム（１０
ｍｇ／ｍｌ、Ｈｅａｌｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を添加したＴ
ｉｓｓｅｅｌ。ヒアルロン酸塩を添加したフィブリン接着剤の粘度の増加により
、縫合完了から２０分後に開存度が有意に高くなり（ｐ＜０．０１）、血管に侵
入するフィブリンの量が減少した。Ｗａｄｓｔｒｏｍら、「Ｆｉｂｒｉｎ ｇｌ
ｕｅ（Ｔｉｓｓｅｅｌ） ａｄｄｅｄ ｅｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒ
ｏｎａｔｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｎｇ（
微小血管吻合においてヒアルロン酸ナトリウムが添加されたフィブリン接着剤（
Ｔｉｓｓｅｅｌ））」、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕ
ｒｇ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇ、１９９３年２月２７日、４、２５７〜６１。
【０１２４】 上記の生体接着フィブリン系の典型的な性質は、その生理学的性質による。創
傷への充填により、天然の生物学的治癒プロセスが促進する。塗布した組織フィ
ブリン凝塊に対する組織の反応は良好である。治療した柔細胞器官、肝臓、およ
び脾臓は、滑らかな瘢痕となって治癒した。脾臓治療後の公知の全ての治療実験
動物の腹腔における接着数は類似していた。ウサギの肝臓損傷修復に生体接着剤
を使用した場合、接着はより少なかった。瘢痕の巨視的外観は類似しており、瘢
痕は、肝臓の柔組織よりも明確ではない。組織学的外観は類似していた。生体接
着は、柔組織周囲の組織を損傷せず、異物として作用しなかった。これらの結果
により、フィブリン接着剤の生体適合性ならびに生体接着剤に対して反応しない
組織耐性および安全な治癒が確認される。典型的には、治癒後、生体接着剤を天
然の線維組織と交換する。
【０１２５】 欧州では、医師によってフィブリン接着剤の使用が有効且つ成功したにもかか
わらず、ＡＩＤＳに関連するＨＩＶなどのフィブリノゲン調製物中に脂質で覆わ
れたウイルス、ＨＢＶおよびＨＣＶなどの肝炎を発症するウイルスならびにサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、および単純
ヘルペスウイルスで汚染されたプールした血液製剤による一般的な感染の危険性
および問題により、合衆国では現在フィブリン接着剤およびその必須成分である
フィブリノゲンは一般に使用されていない。したがって、プールした血液供給源
由来ではない天然に存在するか組換えにより産生された生体接着剤が積極的に考
察されている。本発明の生体接着剤はこのような必要性を満たしている。
【０１２６】 例えば、本発明の１つの実施形態は、フィブリノゲン接着剤と生み合わせた物
質の表面または全体にグラフティングされたＨＡ鎖を備える縫合糸または包帯の
使用である。免疫化ＨＡは、現在の処方物のように拡散しないで、むしろ治癒を
促進および刺激するために創傷部位に維持される。
【０１２７】 有機物質もまた、生体接着剤としての用途が想定されている。水分膨張ポリ（
アクリル酸）ナノおよびミクロ粒子の生体接着剤格子を、逆（Ｗ／Ｏ）乳濁液重
合法を用いて合成した。これらは、脂肪族炭化水素中に分散されたＳｐａｎＴＭ
８０およびＴｗｅｅｎＴＭ８０からなる共乳化剤系によって安定化される。最初
の重合溶媒は、乳濁液滴および単量体溶液の一部を安定化させる逆ミセルを含む
。次いで、フリーラジカルによって重合を開始させ、狭いサイズ分布の粒子分散
が得られる。粒子サイズは、使用したラジカル重合開始剤の型に依存する。水溶
性重合開始剤（例えば、過硫酸アンモニウム）を使用すると１〜１０μｍのサイ
ズ範囲のミクロ粒子が得られ、これは、Ｗ／Ｏ乳濁液の液滴サイズが類似の分散
を示すのでこれらのミクロ粒子が乳濁液滴に由来することを示す。親油性ラジカ
ル重合開始剤（アゾビス−イソブチロニトリルなど）を使用した場合、親油性連
続相中のオリゴマーのポリ（アクリル酸）鎖の溶解性が限られているので、８０
〜１５０ｎｍの範囲の直径のナノ粒子が排他的に得られる。これらのポリ（アク
リル酸）ミクロ粒子およびナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける優れ
た生体接着性が得られたので、ペプチドおよび他の親水性薬物のカプセル化に適
切であり得る。
【０１２８】 本発明では、ＨＡまたはコンドロイチン鎖は、ポリ（アクリル酸）ベースの物
質との天然の置換物である。ＨＡはポリ（アクリル酸）のように負電荷のポリマ
ーであるが、ＨＡは脊椎動物の体内に天然に存在する分子であり、ポリ（アクリ
ル酸）物質のような免疫応答を誘発しないであろう。
【０１２９】 「真の」生体接着を実現における興味は続いている。粘膜接着性ポリマーの代
わりに、植物または細菌レクチン（すなわち、上皮細胞膜の糖部分に特異的に結
合する接着分子）は現在薬物送達アジュバントとして広範に調査されている。こ
れらの第二世代の生体接着剤は、細胞結合するだけでなく、エンドサイトーシス
およびトランスサイト−シスも行われる。これにより、アンチセンスまたは遺伝
子治療の分野で調節されたＤＮＡ／ＲＮＡの送達を特に目的とする新規で特異的
に生体接着性を有する分子が得られる。
【０１３０】 非経口ではない経路、特に、胃腸（ＧＩ）管によるペプチド、タンパク質、お
よび生物薬剤の有効な送達のために、有意な酵素および拡散障壁を克服する新規
の概念が必要である。この文脈では、生体接着技術が新規の展望を提供する。経
口生体接着薬物送達系の元の意図は、放出調節投薬形態と胃または腸の粘膜との
間の接触を延長および／または強化することであった。しかし、このような目的
での薬学的ポリマーの使用による過去１０年間で得られた結果は、やや失望させ
られるものであった。主に、ＧＩ粘膜の生理学的特性に関する困難に直面した。
それにもかかわらず、この領域の研究は、粘膜接着性ポリマーの可能性に新規の
光が当てられている。第１に、粘膜接着性ポリマーの重要なクラスの１つ（ポリ
（アクリル酸））をタンパク質分解酵素の強力なインヒビターとして同定するこ
とができた。第２に、種々の型の生体（粘膜）接着性ポリマーと上皮細胞との間
の相互作用が粘膜上皮の浸透性に直接影響を与えるという証拠が増加した。した
がって、粘膜接着性ポリマーは単なる接着剤というより生物活性薬物送達アジュ
バントとしての用途で多数の所望の性質を有する新規のクラスの多機能高分子と
みなすことができる。
【０１３１】 本発明では、ＨＡまたは他のグリコサミノグリカン多糖類を使用する。ＨＡが
健常な身体および罹患した身体の全てで見出される多数のタンパク質（すなわち
、ＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４）と相互作用することが公知であるので、天然に存在す
る接着相互作用を使用して、標的化、安定化、または他の薬理学的パラメーター
を得ることができる。同様に、コンドロイチンは、タンパク質の異なるサブセッ
ト（すなわち、血小板因子４、トロンビン）と相互作用するので、このポリマー
はＨＡと異なる性質を得て、この技術の視野を広げるようである。
【０１３２】 ＧＩ粘膜に関する問題を克服し、ＧＩ内腔内での固定をより長くさせるために
、おそらく、特異的生体接着分子を用いて生体接着剤をより良好に接着させるこ
とができる。理想的には、これらは、レセプター−リガンド様相互作用によって
粘膜よりも上皮細胞自体の表面構造に結合する。このような化合物を、今後、新
規の植物レクチン、新規の合成ポリマー、および細菌またはウイルス接着／侵入
因子の中から見出すことができる。ＧＩ内腔内の薬物キャリアの単純な固定とは
別に、頂端細胞膜への直接的な生体接着性接触を使用して、膜駆動小胞による能
動輸送プロセス（エンドサイトーシスおよびトランスサイト−シス）を誘導する
ことができる。上皮といくつかの粘膜接着ポリマーとの間の非特異的相互作用に
より、傍細胞経路に沿ったより小さなペプチド薬物の迅速な吸収に適切な強固な
細胞間結合の一時的な緩みが誘導される。それに対して、特異的エンドサイトー
シスおよびトランスサイトーシスにより、最終的に、対立する上皮または内皮細
胞の強固な集団を横切る非常に巨大な生物活性分子（ポリペプチド、多糖類、ま
たはポリヌクレオチド）または薬物キャリアの選択性が向上した輸送が可能であ
るのに対して、他の全ての溶質に対するこのような組織の圧倒的な障壁機能は無
傷のままである。
【０１３３】 生体接着系は、現在、有効成分が連続的に放出される制限時間の延長用の身体
側での正確な投薬形態を維持するその能力のために、医学および生物学分野での
主要な役割を果たしている。生体接着剤のさらなる用途は以下である：胃腸管へ
の薬物送達における生体接着剤および粘膜接着剤、胃接着性薬物送達系としての
ナノ粒子、ペプチド送達用の粘膜接着性舌下パッチ、舌下／歯肉投与用の生体接
着投与形態、舌下生体接着剤としての半個体投薬形態、経鼻投与用の生体接着投
与形態、眼球生体接着送達系、生体接着性眼球薬物送達系としてのナノ粒子、お
よび膣内および子宮内塗布用の生体接着形態。
【０１３４】 生体接着剤はまた、リポソームを含むことができる。リポソームは、水溶液の
有意な機能包括する単層または多層の脂質小胞である。リポソームの小胞微小貯
蔵庫は種々の水溶性物質を含むことができるので、乳濁液中に懸濁される。リポ
ソームの調製および生物系でのリポソームの種々の用途は、米国特許第４，７０
８，８６１号、同第４，２２４，１７９号、および第４，２３５，８７１号に開
示されている。一般に、リポソームは、水溶性緩衝液中での長鎖カルボン酸、ア
ミン、およびコレステロールならびにリン脂質との混合によって形成される。有
機成分は、リポソームと呼ばれる多層二重膜構造を自発的に形成する。その組成
物および保存条件に依存して、リポソームは種々の安定性を示す。リポソームは
細胞膜モデルとして貢献し、薬物送達系としても使用される。
【０１３５】 薬物送達賦形剤としてのリポソーム使用の主な意図は、その分解によってその
内部の水溶性薬物含有成分がゆっくり放出されて一定の細胞または組織によって
取り込まれる、血液中に循環する実体としてのリポソームを想定することである
。所与の標的組織によるリポソームの取り込みを補助する試みでは、外面への特
異的抗体または抗原の結合によっていくつかのリポソームを「仕立てた」。リポ
ソームを、ｉｎ ｖｉｖｏでのその内容物の送達用の放出調節系としても考案し
た。リポソーム内容物の徐放用に、生物活性剤を含むリポソームをポリマー物質
、例えばメチルセルロース、コラーゲン、およびアガロース中に維持および固定
した組成物は、Ｐｏｐｅｓｃｕらに付与された米国特第４，７０８，８６１号に
記載されている。
【０１３６】 この様式で、本発明は、ＰｍＨＡＳから産生させたＨＡを含む生体接着剤を意
図する。本発明はまた、ＰｍＨＡＳから産生されたＨＡを含む生体接着剤および
有効量の薬物を含み、この薬物をＨＡ接着剤内に包括もしくは直接グラフティン
グすることができるか、ＨＡ接着剤中に包括またはグラフティングされたリポソ
ーム内に懸濁することができる組成物を意図する。これらの組成物を、特に薬物
放出の調節に適用する。
【０１３７】 このような組成物は、組成物が接着する動物の身体、例えばヒトの組織、皮膚
、および粘性のある膜（粘膜）に有用である。粘膜、皮膚、または他の組織にこ
のようにして接着した組成物は、接触した身体の領域に比較的長時間でゆっくり
と放出し、接触した身体の領域の少なくとも近傍で治療薬が吸収または吸着され
る。このような時間は、ＨＡ生体接着剤を含まない類似の組成物の放出時間より
も長い。
【０１３８】 本明細書中で有用な治療薬を、一般に、医薬品または化粧品のクラスから選択
する。実質的に、雰囲気温度で個体であるこれら２つのクラスの任意の薬剤を、
本発明の組成物または方法に使用することができる。雰囲気温度で液体である治
療薬、例えば、ニトログリセリンを、本発明の組成物で使用することができるが
、処方物中に含有させることが困難であるので好ましくない。治療薬を、単独ま
たは２つまたはそれ以上のこのような薬剤との混合物として使用することができ
る。
【０１３９】 １つまたは複数のアジュバントも治療薬と共に含めることができ、このように
して使用する場合、アジュバントは、「治療薬」または「薬物」の句の意味に含
まれる。有用なアジュバントの例は、カルシウムイオンに結合し、粘膜全体およ
び血流への薬物の通過を補助するキレート剤（ＥＤＴＡなど）である。アジュバ
ントの別の例示的な基は、粘膜全体および血流への薬物の通過も補助する塩化ベ
ンザルコニウムなどの第四級窒素含有化合物である。
【０１４０】 治療薬は、本発明の組成物が投与された所望の期間疾患を予防、治癒、および
／または治療するのに十分な量、この量を本明細書中では「有効量」という、で
本発明の組成物中に存在する。周知のように、特に医学分野では、含まれる特定
の薬物、治療される疾患、および薬物を含む組成物が身体から排出される速度、
ならびに使用される動物および動物の体重による変化によって薬物の有効量は変
化する。したがって、治療薬の有効量は、各薬剤で定義することができない。し
たがって、有効量は、本発明の組成物が所望の期間治療を受ける動物の身体の内
部または外部に治療薬の必須の活性を得るための十分な治療薬の量を提供する量
であり、この量は、典型的には通常の使用量よりも少ない。
【０１４１】 化粧品で使用される治療薬の適切な量と同様に、特定の疾患の治療に適切な血
流中の特定の治療薬の量が公知であるので、本発明の特定の組成物用のこのよう
な治療薬の範囲を含む、本発明の一連の放出調節組成物を処方するのは比較的容
易な研究課題である。
【０１４２】 本発明のこの実施形態の第２の有効成分は、一定量のＰｍＨＡＳ由来のヒアル
ロン酸（ＨＡ）またはＰｍＣＳ由来のコンドロイチンを含む生体接着剤である。
このようなグリコサミノグリカン生体接着剤を、所望の薬理学的性質を有する分
子上に直接重合したＨＡもしくはコンドロイチン鎖または薬物を同様に含むか結
合する基質もしくはリポソーム上に重合したＨＡもしくはコンドロイチン鎖から
作製した。
【０１４３】 上記の発明は理解を明白にする目的で例示および実施例によっていくらか詳細
に記載しているが、本明細書に記載され且つ添付の特許請求の範囲に定義のよう
に、本発明の精神および範囲を逸脱することなく一定の変更および修正を行うこ
とができることが当業者に明白である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＡテトラマーがＰｍＨＡＳ重合を刺激することを示すグラフ図である。
【図２】 ＨＡ重合がＨＡオリゴ糖類によって実施されることを示すプロット図である。
【図３】 ＰｍＨＡＳ−Ｄによるより大きなポリマーへのＨＡテトラマーの伸長を示すプ
ロット図である。
【図４】 ＰｍＨＡＳによるＨＡテトラマーの伸長についての薄層クロマトグラフィー解
析のグラフ図である。
【図５】 初期のＨＡ伸長についての薄層クロマトグラフィー分析のグラフ図である。
【図６】 ＰｍＨＡＳ−Ｄの精製を示す電気泳動ゲルである。
【図７】 ＰｍＨＡＳ−Ｄ変異体の概説図である。
【図８】 変異体組み合わせアッセイのグラフ図である。
【図９】 ＰｍＨＡＳ−Ｄ変異体の酵素活性を示す図表である。
【図１０】 シリコン上の第一世代のＨＡコーティング剤の概略図である。
【図１１】 ＰｍＨＡＳ−Ｄ変異体についての高スループットアッセイのグラフ図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月２２日（２００１．５．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA10 BA12 CA04 CA06 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL01 LL05 4B064 AF21 CA21 CC03 CC24 CD09 CD19 DA01 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 BB18 CA27 CA44 4C076 BB31 BB32 EE30G FF17

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵素的プロセスを利用してプライマー分子またはアクセプタ
    ー分子に糖を移動させる方法。
  2. 【請求項２】 プライマー分子またはアクセプター分子が短い多糖類である
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 多糖類がオリゴ糖である請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 プライマー分子またはアクセプター分子が長い多糖類である
    請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 プライマー分子またはアクセプター分子が固体基質である請
    求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 固体基質を半導体、金属、天然または人工ポリマーおよびそ
    れらの組合わせからなる群から選択する請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 酵素的プロセスが多糖類シンターゼを利用する請求項１に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 酵素的プロセスがグリコサミノグリカンシンターゼを利用す
    る請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 酵素的プロセスがヒアルロン酸シンターゼを利用する請求項
    １に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ヒアルロン酸シンターゼをＰｍＨＡＳ−Ｄ、ＰｍＨＡＳ−
    Ｄの変異体、ＰｍＨＡＳの化学的修飾体およびそれらの組合わせからなる群から
    選択する請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ＰｍＨＡＳ−Ｄのアミノ酸配列が配列番号：１に基づく請
    求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ＰｍＨＡＳ−Ｄのヌクレオチド配列が配列番号：２に基づ
    く請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 酵素的プロセスがコンドロイチンシンターゼを利用する請
    求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 コンドロイチンシンターゼをＰｍＣＳ、ＰｍＣＳの変異体
    、ＰｍＣＳの化学的修飾体およびそれらの組合わせからなる群から選択する請求
    項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ＰｍＣＳのアミノ酸配列が配列番号：３に基づく請求項１
    ４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＰｍＣＳのヌクレオチド配列が配列番号：４に基づく請求
    項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 糖を天然または人工単糖類、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＡ、Ｇ
    ａｌＮＡｃ、ＧａｌＡおよびそれらの組合わせからなる群から選択する請求項１
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 酵素的プロセスが天然の異型または変種、化学的修飾、遺
    伝学的修飾、反応条件の変化およびそれらの組合わせからなる群から選択される
    少なくとも一つの条件により変化されている多糖類シンターゼを利用する請求項
    １に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 酵素的に活性なＰｍＨＡＳ−Ｄをエンコードするコーディ
    ング領域を有する精製された核酸セグメント。
  20. 【請求項２０】 精製された核酸セグメントが配列番号：２に基づくヌクレ
    オチド配列を含んでなる請求項１９に記載の精製された核酸セグメント。
  21. 【請求項２１】 酵素的に活性なＰｍＨＡＳ−Ｄをエンコードするコーディ
    ング領域を有する精製された核酸セグメントであって、配列番号：２のヌクレオ
    チド配列にハイブリダイズできる精製された核酸セグメント。
  22. 【請求項２２】 プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスベクター、ま
    たは染色体に組み込まれた発現カセットからなる群から選択した組換えベクター
    であって、さらに酵素的に活性なＰｍＨＡＳ−Ｄをエンコードするコーディング
    領域を有する精製された核酸セグメントを含んでなる組換えベクター。
  23. 【請求項２３】 精製された核酸セグメントが配列番号：２に基づくヌクレ
    オチド配列を含んでなる請求項２２に記載の組換えベクター。
  24. 【請求項２４】 組換えベクターがプラスミドである請求項２２に記載の組
    換えベクター。
  25. 【請求項２５】 プラスミドがさらに発現ベクターを含んでなる請求項２４
    に記載の組換えベクター。
  26. 【請求項２６】 発現ベクターが酵素的に活性なＰｍＨＡＳ−Ｄコーディン
    グ領域に機能的に結合したプロモーターを含んでなる請求項２５に記載の組換え
    ベクター。
  27. 【請求項２７】 組換え宿主細胞であって、酵素的に活性なＰｍＨＡＳ−Ｄ
    をエンコードするコーディング領域を有する精製された核酸セグメントを含んで
    なる組換えベクターで形質転換された原核細胞である組換え宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 多糖類プライマーがそこに固定されている基質を提供して
    、プライミングされた基質を提供するステップ； 反応培地中でプライミングされた基質をＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素と組み合わせるス
    テップであって、ここで反応培地はＵＤＰ−ＧｌｃＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
    ｃからなる群から選択される少なくとも一つの糖前駆体を含有するステップ；お
    よび ＰｍＨＡＳ−Ｄ酵素をプライミングされた基質と反応させてそこに多糖類ポリ
    マーがコーティングされている基質を製造するステップ からなる基質上で多糖類ポリマーを製造する方法。
  29. 【請求項２９】 多糖類ポリマーがヒアルロン酸である請求項２８に記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】 多糖類ポリマーがコンドロイチンである請求項２８に記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２８の方法により製造される多糖類ポリマーでコー
    ティングされた基質。
  32. 【請求項３２】 多糖類ポリマーがヒアルロン酸である請求項３１に記載の
    基質。
  33. 【請求項３３】 多糖類ポリマーがコンドロイチンである請求項３１に記載
    の基質。
  34. 【請求項３４】 ＰｍＨＡＳ−ＤおよびＰｍＣＳからなる群から選択した酵
    素を反応培地と組合わせるステップであって、ここで反応培地はＵＤＰ−Ｇｌｃ
    Ａ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからなる群から選択する
    少なくとも一つの糖前駆体を含有するステップ；および 酵素を反応培地と反応させるステップであって、ここで酵素は少なくとも一つ
    の糖前駆体をポリマー鎖に連続的に結合させることにより生体粘着性シーラント
    として使用できる多糖類ポリマーを製造するステップ からなる多糖類生体粘着性シーラントの製造方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３４の方法により製造された多糖類生体粘着性シー
    ラント。
  36. 【請求項３６】 医薬品分配アセンブリを含有する多糖類生体適合物質を製
    造する方法であって、 ＰｍＨＡＳまたはＰｍＣＳからなる群から選択した酵素から多糖類ポリマーを
    調製するステップであって、ここで多糖類ポリマーは生体粘着剤として作用でき
    るステップ； その中に捕えられ、創傷部位または外科手術部位で分配できる一つまたはそれ
    以上の医薬品を含有する少なくとも一つの医薬品分配アセンブリを提供するステ
    ップ；および 調製した多糖類生体粘着剤を少なくとも一つの医薬品分配アセンブリと混合す
    るステップであって、ここで調製した多糖類生体粘着剤が少なくとも一つの医薬
    品分配アセンブリを捕えて、医薬品分配系を含有する多糖類生体適合物質を製造
    するステップ からなる方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３６の方法により製造された医薬品分配アセンブリ
    を含有する多糖類生体適合物質。
  38. 【請求項３８】 創傷、潰瘍、損傷または外科的手術部位で投与するための
    医薬品分配系を含有する多糖類生体適合物質を製造する方法であって、 ＰｍＨＡＳまたはＰｍＣＳからなる群から選択する酵素から多糖類を調製する
    ステップであって、ここで調製した多糖類ポリマーは生体粘着剤として作用でき
    るステップ； そこに捕えられた一つまたはそれ以上の医薬品を含有する少なくとも一つの医
    薬品分配アセンブリを提供するステップ；および 調製した多糖類生体粘着剤を少なくとも一つの医薬品分配アセンブリと混合す
    るステップであって、ここで調製した多糖類生体粘着剤が少なくとも一つの医薬
    品分配アセンブリを捕え、医薬品分配アセンブリを含有する多糖類生体適合物質
    を提供するステップ からなる方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３８の方法により製造された医薬品分配系を含有す
    る多糖類生体適合物質。
  40. 【請求項４０】 哺乳動物の損傷、創傷または外科的手術部位で医薬品分配
    アセンブリ含有多糖類生体適合物質組成物の凝固を誘起し、それにより損傷、創
    傷、または外科的手術部位をシールし治癒させる方法であって、 ＰｍＨＡＳまたはＰｍＣＳからなる群から選択される酵素から医薬品分配アセ
    ンブリ含有多糖類生体粘着剤組成物を調製するステップ； 哺乳動物に医薬品分配アセンブリ含有多糖類生体粘着剤組成物を投与するステ
    ップであって、ここで医薬品分配アセンブリ含有多糖類生体粘着剤組成物の凝固
    が部位で医薬品分配アセンブリを捕えるためのメジウムを形成し、多糖類生体適
    合物質組成物に医薬品分配アセンブリを包埋するステップ からなる方法。
  41. 【請求項４１】 創傷または手術による切開部を止血的にシールし治癒させ
    、創傷または手術による切開部に医薬品を分配する方法であって、 分配アセンブリを含有する医薬品を有する多糖類生体適合物質組成物を調製す
    るステップであって、ここでＰｍＨＡＳまたはＰｍＣＳからなる群から選択する
    酵素から多糖類生体粘着剤組成物を調製するステップ；および 創傷または切開部の表面に組成物を投与するステップであって、ここで組成物
    の凝固が部位で医薬品分配アセンブリを捕えるためのメジウムを形成し、組成物
    に医薬品分配アセンブリを包埋し、医薬品分配アセンブリの内容物を創傷または
    切開部に徐放させるステップ からなる方法。
  42. 【請求項４２】 ＰｍＨＡＳ−ＤおよびＰｍＣＳからなる群から選択する酵
    素から製造される多糖類ポリマーの有効量；および 少なくとも一つの医薬品を含有する少なくとも一つの医薬品分配アセンブリで
    あって、ここで少なくとも一つの医薬品分配アセンブリが多糖類ポリマーに包埋
    され、少なくとも一つの医薬品が多糖類ポリマー生体粘着剤組成物内に局在する
    医薬品分配アセンブリ からなる生体適合物質組成物。
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