TR201808152T4

TR201808152T4 - Kandan inter-alfa inhibitör proteinlerinin hazırlanması ve bunların bileşimi.

Info

Publication number: TR201808152T4
Application number: TR2018/08152T
Authority: TR
Inventors: Lim Yow-Pin; S Sirya Edward; Brne Peter
Original assignee: Prothera Biologics Inc
Priority date: 2008-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2018-07-23
Also published as: CA2726281A1; US10076559B2; US20160145318A1; DK2291654T3; ES2673005T3; US9758570B2; EP2291654B1; US20170157224A1; KR20170116196A; KR20160129914A; BRPI0913949A2; CA2726281C; US9139641B2; KR20110053404A; WO2009154695A1; EP2291654A1; CN102112876B; JP2018008941A; EP2291654A4; CN106928346B

Abstract

Mevcut buluş genel olarak İnter-alfa inhibitör proteinlerinin (I?Ip) ve bunların kandan bileşimlerinin saflaştırılması için işlemler sağlar.

Description

TARIFNAME KANDAN INTER-ALFA INHIBITÖR PROTEINLERININ HAZIRLANMASI VE BUNLARIN BILESIMI Açiklama ILGiLi BASVURULARA ÇAPRAZ REFERANS Bu basvurunun istemleri, 28 Mayis 2008'de kayda geçirilmis ABD Provizyonel Basvuru Numarasi: 6l/l30,269 sayili belgeden istifade etmektedir.

FEDERAL SPONSORLU ARASTIRMALAR ALTINDA YAPILAN BULUS HAKLARI BEYANI Bu çalisma National lnstitutes of Health/National Institute of General Medical Sciences Grants tarafindan desteklenmistir, Hükümet bulusta bazi haklara sahiptir.

BULUSUN GEÇMISI Sepsis ve Sistemik Inflamatuvar Yanit Sendromu (SIRS), her ikisi de enfeksiyöz bir ajana (Örn., Anthrax gibi bakteriyel toksin) maruz kaldiktan sonra veya yaralanmadan sonra veya travmadan sonra Ciddi biyokimyasal reaksiyona isaret eder. Sistemik yanit, kan basincinda hizli bir düsüs, septik soka yol açabilen, kardiyovasküler kollaps ve/veya çoklu organ yetmezligi ile karakterize edilmektedir. Elli yilli askin süre önce antibiyotik uygulanmasina ragmen, septik sok tanisi konan deneklerde mortalite orani, meme, kolon veya prostat kanserine göre %30-50 daha yüksektir. ABD'de, dünyanin geri kalaninda esit sayida olmakla birlikte, yilda 173 milyar dolarlik maliyeti olan yaklasik 800,000 sepsis vakasi bulunmaktadir. Sepsis ve SIRS, antibiyotik direnci ve artan biyolojik tehditler nedeniyle dünya çapinda hizla artmaktadir. Dünyadaki pandemikler (Örn., kus gribi) veya biyoterörizm gibi olasi etkileri düsünüldügünde, Biyoterörizmde veya savasa maruz kalmada ölüm oranlarinin çok daha yüksek olmasi beklenir. Geleneksel ilaçlarin kullanillanilarak hizli ve güvenilir bir sekilde sepsis, SIRS ve septik sok tedavisi zordur.

Inter-alfa inhibitör protein (Ide) ailesi, sepsis, enfeksiyon, travma ve yaralanmaya eslik eden siddetli sistemik inflamasyona karsi vücudun yanitini module eden bir plazma iliskili serin proteaz inhibitörleri grubudur. Inter-alfa inhibitör proteininin (Idlp), sarbon, Ebola ya da Dang Virüsü ile enfekte edilmis sepsis hastasi hayvanlarin hayatta kalmasini ya da kosullarini iyilestirdigini veya toksik kimyasallara veya iyonize radyasyona maruz kalmaya bagli akciger hasarindan muzdarip oldugunu gösterilmistir. Ide, kandan izole edilen büyük bir proteindir. lde'nin saflastirilmasi veya hazirlanmasina yönelik yöntemler, Sepsis ve SIRS tedavisinde inter-alfa inhibitör proteinlerin terapötik kullanimi nedeniyle acilen gereklidir. monoklonal antikorunu kullanarak. Ide 'nin saflastirilmasini tarif etmektedir, MAb 69.31. bir yöntemi tarif etmektedir.

Lim ("Inter-alpha inhibitors: From Laboratory to Market," 16 February 2006), sepsiste Ide seviyeleri ve mortalite arasinda bir korelasyon oldugunu tarif etmektedir.

BULUSUN ÖZETI Asagida tarif edildigi gibi, mevcut bulus, inter-alfa inhibitör proteinlerin (Ide) saflastirilmasi için bir yönteme ve bunlarin sepsis, akut inflamatuvar hastaliklar, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit,kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastaliklar ve erken dogum gibi gibi hastaliklar dahil olmak üzere hastalik veya semptomlarin tedavisi için kullanimi; veya sepsis, akut inflamatuvar hastaliklar, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastaliklar ve erken dogum ile iliskili mortalite riskinin azaltmasi ile Bulusun bir yönü, inter-alfa inhibitör proteiniin (Ide proteini) saflastirilmasi için bir yöntem saglar; bu yöntem, Idlp proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük (ör. 3.5, 3.4, 3.3, 3.1, 3.0, 2.9, 2.0) pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi içerir.

Bulusun bir yönü, Ide proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük bir pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi kapsayan bir yönteme göre saflastirilmis bir ldlp proteinini içeren bir bilesim Bulusun baska bir yönü, Ide proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük bir pH kosullarina ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyana maruz kaldigi bir adimi kapsayan bir yönteme göre saflastirilmis bir Idlp proteininin etkili bir dozunu içeren bir farmasötik bilesim saglar.

Bulusun yine baska bir yönü, bir denekteki hastalik veya hastalik semptomlarini tedavi etmek veya önlemek için, ldlp proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük bir pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi kapsayan bir yönteme göre saflastirilmis bir Ide proteinli bir bilesimin denege uygulamasini içeren bir yöntem Bulusun yine baska bir yönü, yaklasik 3.6 veya daha düsük bir pH degerine sahip en az bir tampon çözeltisine sahip olan bir IgIp proteinini saflastirmak için bir kit ve kitin kullanimina yönelik talimatlari saglar. Bir düzenlemede, kit yaklasik 3.6 veya daha düsük bir pH'a sahip bir yikama tamponu olan en az bir tampon çözeltisine sahiptir. Bir baska düzenlemede, kit yaklasik 3.6 veya daha düsük bir pH'a sahip bir yikama tamponu olan en az iki tampon çözeltisine sahiptir. Spesifik bir düzenlemede, bir birinci yikama tamponu yaklasik 3.6'lik bir pH'a sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 3.3'lük bir pH'a sahiptir. Baska bir spesifik düzenlemede, bir birinci yikama tamponu yaklasik 3.6'lik bir pH'a sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 2.9'lük bir pH'a sahiptir.

Bulusun ek bir yönü, Idlp proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük bir pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi kapsayan bir yönteme göre saflastirilmis bir Ide proteinini içeren bir bilesime sahip terapötik kullanim için bir kit saglar.

Bulusun ek bir yönü, Idlp proteininin yaklasik 3.6 ya da daha düsük bir pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi kapsayan bir yönteme göre saflastirilmis bir Ide proteinini içeren bir bilesime sahip analitik kullanim için bir kit saglar.

Bulusun ilgili bir yönünde bulus, bir inter-alfa inhibitör proteinin (Idlp protein) saflastirmak için bir yöntem saglar, bu yöntem sunlari içerir: kani, bir kan plazma fraksiyonunu veya bir ara plazma fraksiyonunun bir kromatografi kolonu üzerinde yerlestirilmesi, kolonun 3.6 ya da daha düsük bir pH ile bir yikama tamponuna tabi tutulmasi.

Bulusun yine baska bir yönünde bulus, Ide proteininin yaklasik 4.0 veya daha düsük olan pH kosullarina maruz birakildigi ve Idlp proteininin bir referansa kiyasla rekabetçi bir Enzime Bagli Bagisiklik Tahlilinde (ELISA) artan baglanma sagladigi bir adimi kapsayan bir yöntemle hazirlanan saflastirilmis inter-alfa inhibitör proteinlerinini (ldlp protein) saglar. Bir düzenlemede Idlp proteininin baglanmasi, referans ile karsilastirildiginda 1.5-, 2-, 3-, 4-, 5- veya - kat daha fazla arttirilir(örn., Idlp proteini düsük pH ile islenmemistir).

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, yöntem, Idlp proteininin yaklasik 3.6 veya daha düsük pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, Idlp proteininin yaklasik 3.3 veya daha düsük pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, Ide proteininin yaklasik 3.3 ila yaklasik 3.1 arasinda pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, Ide proteininin yaklasik 3.1 ila yaklasik 2.9 arasinda pH kosullarina maruz kaldigi bir adimi içerir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, yöntem, bir kromatografi adimi veya kati faz ekstraksiyon adimini içerir. Çesitli düzenlemelerde, kromatografi adimi sivi kromatografisi, kolon kromatografisi, anyon degisim kromatografisi veya bunlarin bir kombinasyonunu içerir. Çesitli düzenlemelerde, kromatografi, monolitik bir destegin veya partikül bazli destegin kullanimini içerir. Çesitli düzenlemelerde, monolitik destek veya partikül destegi, immobilize edilmis bir anyon degisim ligandini içerir. Çesitli düzenlemelerde, immobilize edilmis anyon degisim ligandi bir dietilaminoetan (DEAE) veya bir kuaterner amindir (Q).

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, yöntem, en az bir tampon yikama adimindaki yikama tamponunun yaklasik 3.6 veya daha düsük bir pH'a sahip oldugu en az bir tampon yikama adimini içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, en az bir tampon yikama adimindaki yikama tamponunun yaklasik 3.3 veya daha düsük bir pH'a sahip oldugu en az bir tampon yikama adimini içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, en az bir tampon yikama adimindaki yikama tamponunun yaklasik 3.1 veya daha düsük bir pH'a sahip oldugu en az bir tampon yikama adimini içerir. Çesitli düzenlemelerinde, yöntem, en az bir tampon yikama adimindaki yikama tamponunun yaklasik 3.1 ila yaklasik 2.9 arasinda bir pH'a sahip oldugu en az bir tampon yikama adimini içerir. Çesitli düzenlemelerde, inter-alfa inhibitör proteini (Idlp proteini) sütuna baglanir. Çesitli düzenlemelerde, inter-alfa inhibitör proteini (Ide proteini) sütuna baglanir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, yöntem, Idlp proteininin yaklasik 250 mM NaCl veya daha yüksek (örn., 260, 270, 280, tuz konsantrasyonlarina maruz kaldigi bir adimi içerir. Burada tarif edilen yukaridaki yönlerden herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, yöntem, yikama tamponu, yaklasik 250 mM NaCl ya da daha yüksek bir tuz konsantrasyonuna yikama adimini içerir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, ldlp proteini kandan saflastirilmistir. Çesitli düzenlemelerde, ldlp proteini kan plazmasindan veya kan plazmasi fraksiyonunda saflastirilmistir. Çesitli düzenlemeler, kan plazmasi kriyo fakir plazmadir veya kan plazmasi fraksiyonu ara plazma fraksiyonudur. Çesitli düzenlemelerde, ara plazma fraksiyonu bir Idlp içeren fraksiyondur. Çesitli düzenlemelerde kan, kan plazma fraksiyonu veya ara plazma fraksiyonu insan, primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi, köpek veya bunlarin kombinasyonlaridir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, ldlp proteini yaklasik 60 kDa ila yaklasik 280 kDa arasinda belirgin bir moleküler agirliga sahiptir. Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, Idlp proteini veya bilesimi, yaklasik yaklasik %100 saflik arasinda degisen bir safliga sahiptir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, veya bilesimi, yaklasik %85 ila yaklasik %100 arasinda degisen bir verime sahiptir. Bazi düzenlemelerde, Ide proteini veya bilesimi analitik kullanim için kullanilabilir için). Bazi aktivite bir aktivite veya düzenlemelerde, syonundaki bir numunede Ide miktarini (örn.,bilinmeyen ölçmek düzenlemelerde, lde proteini veya bilesimi Çesitli düzenlemelerde biyolojik sitokin inhibitör aktivite, kemokin inhibitör serin proteaz inhibitör aktivitedir. Çesitli yöntem, kromatografi adimindan önce veya sonra bir viral inaktivasyon adimi veya nanofiltrasyon adimini içerir.

Yukaridaki yönlerden veya burada tarif edilen herhangi bir baska bulusun herhangi birinin çesitli düzenlemelerinde, farmasötik bilesim, bunlara ihtiyaci olan bir denekte bilesim veya tedavi içindir. Çesitli düzenlemelerde, denek, bilesimle tedaviye ihtiyaç duyuldugu sekilde tanimlanir. denegin akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, Çesitli düzenlemelerde, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik 'veya erken doguni için tedaviye ihtiyaci oldugu tanimlanmistir. Yukaridaki yönlerden herhangi çesitli düzenlemelerinde, ihtiyaç duyan denek insan, sigir, at, domuz, koyun, kedi veya köpektir. primat, Bulus, inter-alfa inhibitör proteinin (Idlp) kan plazmasindan hazirlanmasi veya saflastirilmasi için yöntemler saglar. Bulusun diger özellikleri ve avantajlari, detayli açiklamadan ve istemlerden görülecektir.

Tanimlar Burada kullanildigi sekliyle "alterasyon" terimi, burada tarif edilenler gibi standart teknikte bilinen yöntemlerle edilen bir Idlp proteininin verimi, miktari, konsantrasyonu, aktivitesi, safligi veya seviyelerinde bir degisiklik (artis veya azalma) anlamina gelir. Burada kullanildigi sekliyle, bir alterasyon, verim, saflik veya aktivitede %10'luk bir degisim, tercihen %25'lik bir degisim, daha tercihen %40'lik bir degisim ve daha da %50 veya daha yüksek bir ekspresyon seviyelerinde degisiklik içerir. asit molekülünün fonksiyonuna sahip yapisal olarak iliskili bir polipeptit veya nükleik asit molekülü anlamaina gelmektedir. antikor, nükleik asit molekülü veya polipeptit veya bunlarin fragmanlari anlamina gelmektedir. az %10, %25, %50, %75 veya %lOO'lük bir negatif veya pozitif degisiklik anlamina gelmektedir. köpek gibi insan disi bir memeliyi veya bir insani içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir memeli anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi sekliyle “tedavi etme”, “tedavi” ve benzeri terimler, bunlarla iliskili bir bozukluk ve/veya semptomlarin azaltilmasi veya iyilestirilmesi anlamina gelir. Önlenmemesine ragmen, bir bozuklugun veya kosulun tedavi edilmesinin, bununla iliskili bozukluk, kosul veya semptomlarin tamamen ortadan kaldirilmasini gerektirmedigi anlasilacaktir.

Burada kullanildigi sekliyle “önleme”,”önlemek” “önleyen”, olmayan, ancak bir bozukluk ya da kosulda gelisme riski tasiyan ya. da bunlara yatkin olan bir denegin, bir` bozuklugun 'veya kosulun gelisme olasiligini azaltma ile ilgilidir.

Bu tarifnamede, “içerir”, “içermektedir” “kapsayan”ve “sahiptir” ve benzeri terimler, ABD Patent yasasinda atifta bulunulan anlama sahip olabilir ve “kapsar”, “dahil” ve benzeri terimleri ifade edebilir; “büyük oranda olusur”, “büyük oranda meydana gelir” terimleri ayni sekilde ABD Patent yasasinda atifta bulunulan anlama sahiptir ve terim açik uçlu olup tarif edilen temel ya da yeni karakteristikleri, tarif edilenden daha fazla varliginda degistirilmedigi, fakat önceki teknik uygulamalarini hariç tuttugu sürece, tarif edilenden daha fazlasinin varligina izin verir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil lA ila lB, tek bir kromatografik adim kullanilarak insan plazmasindan Idlp'nin saflastirilmasi için semalari göstermektedir. Sekil 1A, düsük bir pH yikama adimi kullanilarak insan plazmasindan Idlp'nin saflastirilmasi için semayi göstermektedir. Sekil lB, bir tuz tamponu yikama adimi ve düsük bir pH yikama adimi kullanilarak insan plazmasindan Ide'nin saflastirilmasi için semayi göstermektedir.

Sekil 2A ila 2C, düsük pH'li bir yikama adimi (pH 4.0 veya pH 3.3) kullanilarak DEAE kromatografisi ile plazmadan (Fraksiyon D ve Fraksiyon C) Ide proteininin saflastirilmasini göstermektedir. Sekil 2A, bir yikama tamponlu (25 mM Tris, bir yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (lOO mM Tris, lOOO mM NaCl, pH 7.6) DEAE kromatografisi (monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir plazmanin (25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8 içinde 1 mL'lik 1:100 seyreltme) UV izini göstermektedir. Sekil 2B, düsük pH'li bir yikama tamponu kullanilarak ( bir yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6) DEAE kromatografisi (monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir plazmanin (25 mM Tris, UV izini göstermektedir. Sekil 2G, düsük pH'li bir yikama tamponu kullanilarak ( bir yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6) DEAE kromatografisi (monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir plazmanin (25 mM Tris, izini göstermektedir.

Sekil 3, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama Tamponu #1: 150 mM Asetik Asit, pH 4.0; Yikama Tamponu #2: iki yikama adimi ve 100 mM Tris + 1000 mM NaCl, pH 7.6 ile elute edilmis DEAE kromatögrafisi (monolitik destek) ile ayrilmis bir kriyo fakir plazmanin (25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8 içinde 1 mL'lik 1:100 seyreltme) UV izini göstermektedir.

Sekil 4A ila 4D, düsük pH'li bir yikama adimi (pH 3.3) veya iki düsük pH'li yikama adimi (pH 4.0 veya pH 3.3) ve kullanilarak DEAE kromatografisi ile ara plazma fraksiyonunun(Fraksiyon D ve Fraksiyon C) ayrilmasini göstermektedir. Sekil 4A, düsük pH'li bir yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: bir yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, DEAE kromatografisi (monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazmanin oraninda Fraksiyon D seyreltmesi) UV izini göstermektedir.

Sekil 4B, düsük pH'li bir yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: bir yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7,6) DEAE kromatografisi (1 mL monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazma fraksiyonunun (25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,8 içinde 1 mL'lik 1:200 oraninda Fraksiyon C seyreltmesi) UV izini göstermektedir. Sekil 4C, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: 150 mM Asetik Asit, pH 4.0, adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, DEAE kromatografisi (1 mL monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazmanin (25 mM Fraksiyon D seyreltmesi) UV izini göstermektedir. Sekil 4D, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu Asetik Asit, pH 3.3) iki yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu ( DEAE kromatografisi (1 mL monolitik destek; akis hizi: 5 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazma fraksiyonünun (25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8 içinde 1 mL'lik 1:200 oraninda Fraksiyon C seyreltmesi) UV izini göstermektedir.

Sekil 5, Ide proteininin, Western blot yöntemi ile analiz edilen DEAE monolitik kolon kromatografisi ile saflastirilmasini göstermektedir. Ara plazma fraksiyonlarindan (Fraksiyon D ve Fraksiyon C) iki kromatografik ayirmanin analizi gösterilmektedir.

Baslangiç malzemesi (SM), her bir kromatografik ayirma için, Yikama #1 fraksiyonu (W#l), Yikama #2 fraksiyonu (W#2) ve Eluat (E)) serit basina esdeger miktarlar yüklenmis, SDS- PAGE (%6; denatüre olmayan) ile ayrilmistir. Kriyo fakir plazmanin kromatografik ayrimindan elde edilen Eluat (E), karsilastirma için gösterilmistir. SBS-PAGE ayrilmis proteinler, birincil antikor olarak insan disi ldlp (MAb 69.26) ile sondalanan nitroselüloz membrana aktarilmistir.

Sekil 6A ila 6F, düsük pH'li iki yikama adimi (pH 4.0 veya pH 3.3) kullanilarak DEAE kromatografisi ile kriyo fakir plazma veya ara plazmadan (Fraksiyon D ve Fraksiyon C) Ide proteininin saflastirilmasinin ölçeklenebilir oldugunu göstermektedir. Sekil 6A, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: 150 mM Asetik Asit, pH 4.0 , Yikama tamponu #2: iki yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, DEAE kromatografisi (8 mL monolitik destek; akis hizi: 40 mL/dak) ile ayrilmis bir kriyo fakir plazmanin (Baslangiç maddesi: 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,8 içinde 25 mL'lik 1:10 oraninda Fraksiyon C seyreltmesi) UV izini göstermektedir. Sekil 6B, SBS-PAGE (%4 ila %20 gradyan) ile analiz edilen DEAE monolitik kromatografisi (Baslangiç malzemesi (SM), Yikama #1 (W#1), Yikama #2 (W#2) ve Eluat (EL)) ile kriyo-fakir plazmanin ayrilmasindan elde edilen fraksiyonlari göstermektedir. Sekil 6C, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: 150 mM Asetik Asit, pH 4.0 , Yikama tamponu #2: 200 mM Asetik Asit, pH 3.3) iki yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu ( DEAE kromatografisi (8 mL monolitik destek; akis hizi: 40 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazmanin (Baslangiç maddesi: 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8 içinde 2 mL'lik 1:125 oraninda Fraksiyon D seyreltmesi) UV izini göstermektedir. Sekil 6D, SDS-PAGE (%4 ila %20 gradyan) ile analiz edilen DEAE monolitik kromatografisi (Baslangiç malzemesi (SM), Yikama #1 (W#1), Yikama #2 (W#2) ve Eluat (EL)) ile ara plazmanin (Fraksiyon D) ayrilmasindan elde edilen fraksiyonlari göstermektedir.

Sekil 6B, düsük pH'li iki yikama tamponu kullanilarak (Yikama tamponu #1: 150 mM Asetik Asit, pH 4.0 , Yikama tamponu #2: iki yikama adimi ve elute edilmis elüsyon tamponlu (100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6) DEAE kromatografisi (8 mL monolitik destek; akis hizi: 40 mL/dak) ile ayrilmis bir ara plazma fraksiyonunun (Baslangiç maddesi: 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8 içinde 2 mL'lik 1:125 oraninda Fraksiyon C seyreltmesi) UV izini göstermektedir. Sekil 6F, SDS-PAGE (%4 ila %20 gradyan) ile analiz edilen DEAE monolitik kromatografisi (Baslangiç malzemesi (SM), Yikama #1 (W#1), Yikama #2 (W#2) ve Eluat (EL)) ile ara plazmanin (Fraksiyon C) ayrilmasindan elde edilen fraksiyonlari göstermektedir.

Sekil 7A ve 7B, tuz tamponu (250mM NaCl'den daha büyük) ve düsük pH'li bir yikama adimi (pH 2.95) ile bir yikama adimi kullanilarak. DEAE kromatografisi ile kriyo fakir plazma veya ara plazma fraksiyonundan Ide proteininin saflastirilmasini göstermektedir. Sekil 7A, bir tuz yikama tamponu (10 kolon hacminde 40 mM Tris-HCl, 290 mM NaCl pH 7.6) ve bir düsük pH yikama tamponu (10 kolon hacmi 200 mM Sodyum-Asetat pH 2.95) kullanilarak iki yikama adimi ve yüksek tuz elüsyon tamponu (5 kolon hacmi, 40 mM Na-Sitrat pH 6.50, ile elute edilmis DEAE kromatografisi (monolitik destek) ile ayrilmis bir kriyo fakir plazmanin 12.5 kolon hacmi; UV izini göstermektedir. Sekil 7B, bir tuz yikama tamponu (10 kolon hacminde 40 mM Tris-HCl, ve bir düsük pH yikama tamponu (10 kolon hacminde 200 mM Sodyum-Asetat pH 2.95) kullanilarak iki yikama adimi ve yüksek tuz elüsyon NaCl) ile elute edilmis DEAE kromatografisi (monolitik destek) ile ayrilmis bir ara plazma fraksiyonunun oraninda seyreltme 2.5 kolon hacmi; UV izini göstermektedir. Kromatografiyi gerçeklestirmek için ticari olarak temin edilebilen, dakikada 2.5 kolon hacmi (cv) akis hizinda, 8 mL DEAE monolitik kolon (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) kullanildi. Akis toplandi. Akis tepe noktasi taban çizgisine dönene kadar` ek yükleme tamponu sütuna uygulandi (örn., Sekil 7A'da 7 kolon hacmi 25 mM Tris, . Yikamayla elute edilen bütün tepeler toplandi. Yüksek tuz elüsyon tamponu ile elute edilen tepe toplandi ve bu fraksiyon yüksek derecede saf Ide içeriyordu.

Sekil 8, düsük pH'li bir yikama adimi (pH 2.95) kullanilarak lalp proteininin saflastirilmasindan elde edilen fraksiyonlara kiyasla bir tuz yikama adimi ( ve düsük bir pH yikama adimi (pH 2.95) içeren Ide proteininin saflastirilmasindan elde edilen fraksiyonlarin SDS-PAGE analizini göstermektedir. Fraksiyonlar, yikama tamponu pH 2.95 (pH ile yikama), içeren Yikama tamponu ve içeren Elüsyon tamponu ile elüte edildi ve SBS-PAGE (%4 ila %12 gradyan; denatüre olmayan) ile ayrildi. Her iki kromatografik prosedürde, Ide proteini, ara plazma fraksiyonundan (Fraksiyon D) saflastirilmistir. Karsilastirma için standart Moleküler Agirlik Proteinleri (Std MW) kullanildi.

Oklar - 250 kDa Inter-alfa inhibitör ve 125 kDa Pre-alfa inhibitör.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, genel olarak, akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastalik ve erken dogum ile karakterize edilen bir hastaligi, bozuklugu veya hasari tedavi etmek için plazma ve terapötik bilesimlerden Ide'yi saflastirmak için bir yöntem saglar. Yöntem, saflastirilmasi sirasinda Iglp'nin düsük bir pH tamponuna maruz birakilmasini içerir.

Inter-alfa inhibitör protein (IaIp) Burada kullanildigi sekliyle "Inter-alfa inhibitör proteinleri (Idlp)", yapisal olarak iliskili serin proteaz inhibitörleri ailesindeki büyük, çok. bilesenli polipeptidleri ifade eder. modifikasyondan bagimsiz olarak herhangi bir amino asit zinciri anlamina gelmektedir. Kompleksin, nötrofil elastaz, plazmin, tripsin, kimotripsin, katepsin G ve tripsin tipi proteaz inhibitörlerini içeren akrozini kapsayan bir dizi proteazin inhibisyonunda önemli oldugu gösterilmistir. Insan plazmasinda, ila 800 mg/L arasinda). Diger inhibitör moleküllerin aksine, bu inhibitör ailesi, bir kondroitin sülfat zinciri ile tek basina kovalent olarak baglanan bir polipeptit zincirleri (hafif ve agir zincirler) kombinasyonundan olusur.

Inter-alfa. proteinlerinin (Hl, H2 ve HB) agir zincirleri de Hiyalüronik asit (HA) baglayici proteinler olarak adlandirilir.

Insan plazmasinda bulunan baslica formlar, bir agir (H3) ve bir hafif (L) zincirden olusan iki agir zincir (Hl & HZ) ve bir tek hafif zincir (L) ve pre-alfa inhibitörden (Pal) olusan inter- alfa inhibitördür (lal). Hafif zincir (ayni zamanda iki Kunitz alanina sahip olan bikunin (bi-kunitz inhibitörü) olarak adlandirilir), plazma serin proteazlarini genis ölçüde inhibe ettigi bilinmektedir. Plazma fraksiyonunda bulunan Idl ve Fal, yaklasik 60 kDa ila yaklasik 280 kDa arasinda bir belirgin molekül agirligina sahiptir. Moleküler agirlik, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SBS-PAGE) ile belirlenebilir. ldI ve PdI'nin ayrica bir baska agir Ide proteinleri olan H4 ile kompleksi bulunmustur. Herhangi bir bilimsel teoriyle sinirlanmak istenmemekle birlikte, Ide agir zincirlerinin, kompleksten salinmasindan sonra, HA'nin reseptörünü CD44'e baglamasini önleyen bagin (Hiyalüronik asit) HA olduguna inanilmaktadir. Ide agir zincirlerinin yoklugunda HA, CD44'e baglanir ve proinflamatuvar faktörlerin, örnegin TNF- alfa'nin salgilanmasini tetikler ve inflamasyona. neden olur.

Ayni anda, Ide'nin hafif zincirleri, bir zamanlar kompleksten salindi ve anti-proteaz aktivitesi sergiledi.

Sepsis ve Sistemik Inflamatuar Yanit Sendromu (SIRS) Sepsis ve Sistemik Inflamatuar Yanit Sendromu (SIRS), her ikisi de enfeksiyöz bir ajana (örn., Anthrax gibi bakteriyel toksin) veya travmaya /yaralanmaya maruz kaldiktan sonra ciddi fizikokimyasal reaksiyona isaret eder. Sepsis, bir kisinin, potansiyel olarak hayati tehdit edici sonuçlari olan ve tipik olarak neden olan ajandan dogrudan ortaya çikmayan bir ajana asiri reaksiyonudur. Sepsis, tedavi edilmezse, hastada ilerlemis çoklu organ yetmezligi, sok ve nihayetinde ölüm tehlikesi yaratan canli dokularda ciddi hasara yol açar.

Sepsis, SIRS ve septik sok, dogal bagisiklik. ve koagülasyon sistemlerinin aktivasyonu ile iliskilidir. Sepsis ve septik sok klinik olarak sistemik inflamasyon, koagülopati, hipotansiyon ve çoklu organ yetmezligi ile karakterizedir (J.-L. Vincent et al., sirasinda, spesifik proteazlarinin agi, pihtilasma, fibrinolitik ve tamamlayici faktörleri aktive eder. Bu proteazlar ayrica doku ve organ hasarini tetikleyebilir ve plazmada pihtilasma ve tamamlayici faktörlerin spesifik olmayan proteolizini arttirabilir (J. Wite et al., Intensive Care Medicine 8 (1982) 365-376). Vücudun baskin sistemik inflamatuvar yaniti nedeniyle, maruz kalan kisilerde “sepsis benzeri” semptomlar görülür. Asiri tepki, tipik olarak, çoklu organ yetmezligine yol açan metabolik, oksijenasyon, koagülasyon ve vasküler fonksiyonlardaki asiri sitokin üretimini ("sitokin firtinasi") ve yikici proteazlari ve rahatsizliklari içerir. sisteminin bir parçasidir. Idlp, sepsis, enfeksiyon, travma ve yaralanmaya eslik eden ciddi sistemik inflamasyona karsi vücudun yanitini module eder. Idlp, sepsis ve SIRS'ye karsi hayati bir dogal savunmadir ve bu nedenle, sistemik inflamasyonun etkilerine karsi vücudun savunmasini "asiri tepki" ye karsi modüle eder. Idlp, serin proteazlarin, pihtilasma, inflamasyon ve bagisiklik yaniti dahil olmak üzere Çok çesitli fizyolojik süreçlerde yer alan protein sindirici enzimlerin inhibitörleridir. Ide, bagisiklik yaniti düzenleyicileri (Sitokinler), lökositleri yaralanma veya inflamasyon (Kemokinler) alanlarina çeken proteinler ve etkilenen hastalarda ciddi morbidite ve asiri mortaliteye neden olan yikici proteazlar gibi salgilanan inflamatuvar maddelerin dolasim seviyelerini düzenleyen genis spektrumlu bir biyolojik yanit degistirici olarak hizmet eder. Idlp proteinleri, septik kosula neden olan ve devam ettiren dolasimdaki sitokinleri, kemokinleri ve proteazlari baglar. Ciddi inflamatuvar süreçler sirasinda vücudun Idlp seviyesi kontrolsüz bir hastalik süreci sonucunda hizla tükenir. Sepsis hastalarinda plazma Idlp düzeyleri ile hastalik siddeti ve mortalite arasinda oldukça önemli ölçüde, 926). ve toksik kimyasallara veya iyonize radyasyona maruz kalmanin ardindan akut akciger hasarindan muzdarip hayvanlarin hayatta kalmasini önemli ölçüde iyilestirdigi gösterilmistir (Yang et 73(8):SlOl-5105). Pihtilasma, metabolizma, karaciger hasari, inflamatuvar sitokin ve oksijenasyon fonksiyonlari üzerindeki terapötik etkiler, uyarici veya neden olan ajanlardan bagimsizdi. inflamasyon vakalarinda, kontrolsüz bir hastalik sürecine ilerlemenin Idlp'nin ekzojen uygulamasi ile kismen veya tamamen önlenebilecegini göstermistir (Yang et al., Crit Care Med 2002, Dolasimdaki sitokinler, kemokinler ve proteazlar, Ide uygulamasiyla giderilebilir veya inaktive edilebilir ve bu giderilem veya inaktivasyon, daha iyi bir hayatta kalma, düsük morbidite ve herhangi bir altta yatan hastalik kosulunu veya enfeksiyonu tedavi etmek için zamanin artmasiyla sonuçlanir.

Idrardan izole edilen Ide'nin bir proteaz fragmani, septik hastalarda mortaliteyi azaltmada önemli bir etki göstermistir Kontrolü yeniden saglayarak Idlp ile replasman (yerine koyma) tedavisi, hayatta kalmayi iyilestirme, morbiditeyi azaltma ve altta yatan hastalik kosulunu veya enfeksiyonu tedavi etmek için zaman saglama potansiyeline sahiptir. Ide normal olarak kanda nispeten yüksek seviyelerde bulundugundan dolayi replasman tedavisi yüksek. bir güvenlik sinirina sahiptir. Ide, hemodinamik kararliligi sürdürmek, organ yaralanmasini önlemek ve sepsis hastalarinda ve "sitokin firtina” ya maruz kalanlarda hayatta kalmayi arttirmak için yararli ve güvenli bir ajandir.

Terapötik Yöntemler Burada, akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastalik ve erken dogumu tedavi etmek için bir denege saflastirilmis Idlp uygulanmasi için terapötik bir yöntem açiklanmaktadir. Bulus, bir denekte Inter-alfa inhibitör protein (Idlp) seviyelerinde bir azalmayla iliskili neredeyse her hastaligin tedavisi için kullanilabilir. Inter-alfa inhibitör proteinleri (Ide) seviyelerindeki azalma, kemokinler, sitokinler veya proteazlarda istenmeyen bir artis ile iliskili olabilir. Örnegin, memeli, kemokinler, sitokinler veya proteazlardar istenmeyen bir artisa. neden olan bir hastalik, rahatsizlik veya kosula sahip olabilir. Örnek niteliginde tedavi edilen kosullar, akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser` metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik veya erken dogumu kapsamaktadir. Diger düzenlemelerde memeli, yöntem tarafindan geciktirilen. veya önlenen. bir hastalik, bozukluk. veya kosul gelistirme artan riske sahiptir.

Bulusa ait yöntemler, terapötik açidan etkili bir dozda Idlp uygulanmasini içerir. Çesitli düzenlemelerde, denekteki Ide seviyesini, bir referansa oranina kadar artirir. Baska düzenlemelerde yöntem, bir kiyasla en yöntem, bir referansa kiyasla, bir sitokin, kemokin veya proteaz seviyesini en az %5, %10, %20 daha fazla oranina kadar azaltir. Biyolojik bilesiklerin istenilen en seviyelerini etme yöntemleri rutindir` ve teknikte uzman kisilerce bilinmektedir (örn., Guyton Guyton et al., Textbook of Medical Physiology, i bir teoriye bagli olmamakla birlikte, Tenth edition, W.B. Saunders Co., 2000). burada referans olarak verilen bir patolojide yüksek seviyelerde sitokinler, yol açan lokal ve sistemik yanitlara neden olur. nler ve proteazlarin etkileri, sonuç olarak doku hasarina Doku hasari yetmezligine yol açabilir. Tercih edilen düzenlemelerde yöntem, doku veya organin biyolojik aktivitesini, karsilik gelen, karsil olarak meydana gelen bir doku astirildiginda organla fonksi için uygun doku veya organin yonlari, sindirimi, atik atilimini, biyolojik salgilanmayi, elektriksel aktiviteyi, kas aktivitesini, hormon üretimini veya biyolojik aktivitesini tahlil etme yöntemleri metabolik aktiviteleri içerir. Dokular teknikte uzman kisilerce bilinmektedir (örn., ve organlarin rutindir ve Guyton et. al., Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, W.B. Saunders Co., 2000).

Bulusa ait yöntemler, bir doku veya organi etkileyen bir kosul, hastalik veya bozuklugu bir hastada (örn., bir insan veya memeli) tedavi etmek veya stabilize etmek için yararlidir. örnegin tedavi edilen dokunun veya organin Terapötik kemik, beyin, meme, kikirdak, özofagus, fallopi tüpü, kalp, pankreas, bagirsaklar, safra kesesi, böbrek, karaciger, akciger, sinir dokusu, yumurtaliklar, prostat, iskelet kasi, deri, omurilik, dalak, mide, testis, timus, tiroid, nefes borusu, üreter, üretra, ürogenital sistem ve uterus) biyolojik fonksiyonunun ölçülmesiyle istege bagli olarak tahlil edilir. Bu tür yöntemler teknikte standarttir. Örnegin idrar tutulmasi ve atilimi ölçülerek mesane fonksiyonu tahlil edilir. Beyin, omurilik veya sinir dokusu fonksiyonu, nöral aktivitenin (örn., elektriksel aktivite) ölçülmesiyle tahlil edilir. Yemek borusu fonksiyonu, yemek borusunun mideye besin iletme kabiliyeti ölçülerek analiz edilir. Kalp fonksiyonu elektrokardiyogram ile tahlil edilir. Insülin üretiminin ölçülmesi ile pankreas fonksiyonu tahlil edilir. Bagirsak içeriginin bagirsaktan geçebilme kabiliyeti ölçülerek bagirsak islevi tahlil edilir ve bir baryum lavman veya gastrointestinal dizi kullanilarak degerlendirilebilir. Safra kesesi fonkisyonu, safra kesesi radyonüklid taramasi kullanilarak tahlil edilir. Böbrek fonksiyonu, kreatinin düzeylerini, idrar kreatinin seviyelerini veya kreatinin klerensi veya kan üresi nitrojeni için klinik testler yaparak ölçülür. Karaciger fonksiyonu, karaciger fonksiyon testleri veya karaciger enzim seviyelerini, bilirubin seviyelerini ve albümin seviyelerini ölçen bir karaciger paneli kullanilarak tahlil edilir. Akciger fonksiyonu, spirometri, akciger hacmi ve difüzyon kapasitesi testleri kullanilarak tahlil edilir. Yumurtalik fonksiyonu, yumurtalik hormonlarinin düzeylerinin (örn., Folikül uyarici hormon) ölçülmesi ile tahlil edilir. Prostat spesifik antijeni ölçülmesi ile prostat anormalligi tahlil edilir. Dalak fonkisyonu, karaciger` dalak taramasi kullanilarak tahlil edilir. Mide fonksiyonu, bir mide asidi testi kullanilarak veya mide bosalmasinin tahlil edilmesi ile tahlil edilir. Testiküler fonksiyon. testis hormonlarinin düzeylerinin (örn., testosteron) ölçülmesi ile tahlil edilir.

Organ fonkisyonunu tahlil etmek için diger yöntemler, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir ve örnegin Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, (Guyton et al., W.B. Saunders Co., 2000) referansli yayinda tarif edilmistir.

Burada kullanildigi sekliyle “Ide bilesimi”, fizyolojik oranlarda IdI ve Fal dahil, Idlp proteinlerinin bir preparatini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle fizyolojik oranlarin, bir enfeksiyon veya kosuldan muzdarip olmayan bir insanda veya hayvanda bulunan oranlar ve/Veya insan plazmasinda dogal olarak görülen Idl ila Pal oranini içermesi amaçlanmistir. Fizyolojik oranlar genellikle yaklasik %60 ila yaklasik %80 arasinda ve yaklasik %40 ila yaklasik %20 arasindadir. Denegin genetik yapisindaki normal varyasyonlardan dolayi fizyolojik oranlar bu araliklardan farkli olabilir.

Burada kullanildigi sekliyle “Ide kompleksi” terimi, çikarmalar, yerlestirmeler, eklemeler ve ornatimlar içeren proteinler dahil, aktif varyantlarini kapsar. Bir Idlp proteininin bir “dogal varyanti”, bir veya daha fazla amino asit tarafindan degistirilmis bir diziye sahip olan plazmadan elde edilen bir peptit olarak tanimlanir. Varyant, "konservatif" degisikliklere sahip olabilir, burada ornatilmis bir amino asit, örnegin lösin izolösin ile degistirilmesi gibi benzer yapisal veya kimyasal özelliklere sahiptir. Baska düzenlemelerde, bir varyant, örnegin bir glisinin bir triptofan ile degistirilmesi gibi “konservatif olmayan” degisikliklere sahip olabilir. Benzer varyasyonlar, amino asit çikarmalarini veya yerlestirmelerini veya her ikisini de içerebilir. Biyolojik veya immünolojik etkiyi ortadan kaldirmadan, hangi ve kaç amino asit kalintisinin ornatilabilecegi, yerlestirilebilecegi veya çikarilabilecegini belirleme rehberi, örnegin, DNASTAR yazilimi gibi teknikte iyi bilinen bilgisayar programlari kullanilarak bulunabilir. Burada kullanildigi sekliyle "fonksiyonel olarak esdeger" terimi, burada tarif edilen Ide proteinleri gibi canli içi veya yapay ortaminda aktiviteyi önemli ölçüde benzer gösteren, yani, örnegin sepsiste bir azalmayi etkileyebilen herhangi bir proteine karsilik gelir.

Burada kullanildigi sekliyle “inter-alfa inhibitör protein (Idl) ve pre-alfa proteini (Pal) karisimi” hem Idl hem de Pal komplekslerini içeren bir bilesimi ifade eder. Karisim ayrica ldlp kompleksini izole etmek için kullanilan tamponlar, tuzlar veya baska bilesenler de içerebilir. Belirli yönlerde ldl ve Fal karisimda mevcut durumda fizyolojik bir oranda bulunur.

Plazma fraksiyonunda bulunan IdI ve Fal, yaklasik 60 kDa ila yaklasik 280 kDa arasinda bir belirgin molekül agirligina sahiptir. Moleküler agirlik, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile belirlenebilir.

Bulusa ait Idlp bilesimleri, yüksek bir tripsin inhibitör spesifik aktiviteye sahip olabilir. Bulusa göre Ide bilesimlerinin tripsin inhibitör spesifik aktivitesi yaklasik 100 IU/mg ila yaklasik 200 IU/mg arasinda degisebilir. Tercihen, tripsin inhibitör spesifik aktivitesi 120 IU/mg'in üzerinde ve hatta daha tercihen 150 IU/mg'in üzerindedir. Tripsin inhibitör spesifik aktivitesi, örnegin L-BAPA bir substrat olarak kullanilarak tripsin inhibitör testi ile tahlil edilir.Bakiniz, H U Bergmeyer, ed: cilt 5, 3. baski. 119 (1984) Verlag Chemie, Weinheim: Tripsin tahlili için kromojenik substrat: R. Geiger, H. Fritz, Enzimatik Analiz Yöntemleri. ldlp'in bir bilesimi, inter-alfa inhibitör protein (ldl) ve pre- alfa proteininin (Pal) bir karisimi olabilir, burada ldl ve Pal, bahsedilen karisimda, üç agir zincir* Hl, H2 \K3 H3'ün en. az biriyle iliskili bir inter-alfa inhibitör protein hafif zincirini içeren fizyolojik bir oranda bulunur. Bulusa göre bir bilesim, ayni zamanda, dört agir zincir Hl, HZ, H3 ve H4'ten en az biriyle iliskili bir inter-alfa inhibitör protein hafif zincirine de sahip olabilir. Ide kompleksindeki her proteinin örnekleri su sekildedir: BikuninGenBank erisim numarasi: Inter-alfa inhibitör proteininin saflastirilmasi (IaIp) sekliyle "saflastirma" terimi, saflastirilmis bir Idlp üretmek için istenmeyen veya bulastirici proteinlerin veya bilesenlerin bir Ide'den ayrilmasi adimlarini veya islemlerini ifade eder. Örnegin, fizyolojik oranda IdI ve Fal içeren bir plazma fraksiyonu, Ide'yi saflastirmak için en az bir kromatografi adimindan geçirilebilir. Burada kullanildigi sekliyle içerebilir. Teknikte, kromatografinin, karsilikli olarak hariç tutulmayan bir çok tanimlama ve/veya siniflandirmaya sahip oldugu bilinmektedir. Örnegin, bir sütun üzerinde sivi kromatografisi gerçeklestirilebilir. Kolon kromatografisi anyon degisim kromatografisini içerebilir.

Tipik olarak, ldlp preparati, numunenin izolasyonunu ve ilgili proteinleri içermek üzere belirlenen fraksiyonlarin toplanmasini içerir. Izolasyon yöntemleri örnegin, kati faz ekstraksiyonu, kromatografi, örnegin anyon degisim kromatografisi, büyüklük dislanim kromatografisi, iyon degisim kromatografisi, heparin kromatografisi, afinite kromatografisi, ardisik ekstraksiyon, jel elektroforezi ve sivi kromatografisini içerir. Hazirlama ayrica, kromatografinin adimlarini, örnegin, iyon degistirme kromatografisini, heparin kromatografisini, afinite kromatografisini, sirali ekstraksiyonu, jel elektroforezini ve sivi kromatografisini kapsayabilecek olan saflastirmayi da içerebilir. baska bir sekilde eklenebilen kati bir maddeyi ifade eder. Örnek kati destekler arasinda monolitik destekler, partikül bazli destekler, problar ve mikrotitre plakalari bulunur. Burada kullanildigi sekliyle “monolitik destekler” tek parça gözenekli bir kati destegi ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle üzere bir kromatografi kolonunun paketlenmesi için homojen partikülleri ifade eder. bilesenini belirtir. Terim, tek bir bilesene veya numunedeki birçok bileseni ifade edebilir. reaktifi için saptanabilir kovalent olmayan bagini ifade eder.

Bir adsorban yüzey, bir adsorbani (bir "kaptür reaktifi" veya bir "afinite reaktifi" olarak da adlandirilir) baglayan bir yüzeyi ifade eder. Bir adsorban, bir analiti (örn., bir hedef polipeptid veya nükleik asit) baglayabilen herhangi bir materyaldir.

Kromatografik bir adsorban, tipik olarak kromatografide kullanilan bir malzemeyi ifade eder. Kromatografik adsorbanlar, Örnegin, iyon degistirme materyalleri, metal selatorlar (örn., nitriloasetik asit veya iminodiasetik asit), hareketsiz metal selatlar, hidrofobik etkilesim adsorbanlari, hidrofilik etkilesini adsorbanlari, boyalar, basit biyomoleküller (örn., nükleotitler, amino asitler, basit sekerler ve yag asitleri) ve karisik mod adsorbanlari (örn., hidrofobik çekim/elektrostatik itme adsorbanlari) içerir.

Biyospesifik bir adsorban, bir nükleik asit molekülü (örn., bir aptamer), bir polipeptid, bir polisakarit, bir lipit, bir steroid veya bunlarin bir konjugati (örnegin, bir glikoprotein, bir lipoprotein, bir glikolipid, bir nükleik asit (örn., DNA ) -protein konjugati) için bir biyomolekül içeren bir adsorban anlamina gelir. Bazi durumlarda, biyospesifik adsorban, bir multiprotein kompleksi, bir biyolojik membran veya bir virüs gibi makromoleküler bir yapi olabilir. Biyosepektif adsorbanlarin örnekleri arasinda, antikorlar, reseptör proteinleri ve nükleik asitler bulunur. Biyospesifik adsorbanlar tipik olarak bir hedef analit için kromatografik adsorbanlara kiyasla daha yüksek özgüllüge sahiptir. adsorpsiyonunu etkilemek veya degistirmek için ve/veya yüzeyden baglanmamis materyalleri çikarmak için kullanilan. bir ajan, tipik olarak bir çözeltiyi ifade eder. Yikama tamponunun veya eluent maddesinin eluent özellikleri, örnegin pH, iyonik mukavemet, hidrofobiklik, kaotropik, temizlik kuvveti ve sicaklik derecesine bagli olabilir. Bulusa ait bazi düzenlemelerde, saflastirma yöntemi en az bir tampon yikama adimini içerir. Bulusa ait yöntemlerde, bir tampon yikama adimi, sahip olan bir yikama tamponunun uygulanmasini içerir. Bir düzenlemede, düsük pH yikama tamponu yaklasik 3.6'dan daha az bir pH degerine sahiptir. Daha da fazla tercih edilen bir düzenlemede, yikama çözeltisi yaklasik 3.3'dan daha az bir pH degerine sahiptir. En çok tercihen, yikama çözeltisi yaklasik 3.3 ila yaklasik 2.9'dan daha düsük bir pH'a sahiptir. Baska düzenlemelerde, saflastirma yöntemi birden fazla tampon yikama adimini içerir. Sonraki tampon yikama adiminin, önceki tampon yikama adimindan daha düsük bir pH degerine sahip olmasi tercih edilir. Bir düzenlemede, bir birinci yikama tamponu yaklasik 4.0'lik bir pH'a sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 3.6'lük bir pH'a sahiptir. Baska bir düzenlemede, bir birinci yikama tamponu yaklasik 4.0'lik bir pH'a sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 3.1'lük bir pH'a sahiptir. Baska bir düzenlemede, bir birinci yikama tamponu yaklasik 4.0'lik bir pH'a sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 2.9'lük bir pH'a sahiptir. Bulusa ait düzenlemelerde, yikama tamponu asetik asit ya da sodyum asetattir. Bulusta kullanilmasi için uygun diger yikama tamponlari sitrik asit, glisin veya fosfat tamponu içerir. Yine baska düzenlemelerde, saflastirma yöntemi, bir tuz içeren tampon ile bir yikama adimini içerir. Tuz içeren tampondaki tuz konsantrasyonunun 250 mM NaCl'den daha yüksek Olmasi tercih edilir (örn., 260, 270, 280, . Bir düzenlemede, bir birinci yikama tamponu 290 mM NaCl'lik bir tuz konsantrasyonuna sahiptir ve bir ikinci yikama tamponu yaklasik 2.9'lük bir pH'a sahiptir. Tuz yikama adiminin düsük bir pH adimi içeren saflastirma protokolüne eklenmesinin, tuz yikama adiminin olmadigi zamana kiyasla Idlp'nin verimini ve safligini arttirdigi kesfedilmistir. Bulusa ait düzenlemelerde, tuz içeren yikama tamponu içindeki tuz sodyum klorürdür (NaCl). Bulusta kullanilmasi için uygun diger tuz, potasyum klorürdür (KCl).

Anyon degisini kromatografisi, monolitik destek ile, örnegin, DEAE-CIM veya Q-CIM (BIA. Ayrimlari) gibi immobilize edilmis anyon degistirici ligandlari olan CIM ile olabilir. Anyon degisim kromatografisi ayrica, örnegin DEAE Sefaroz, DEAE Sefadeks ASO, Toyopearl DEAE, TMAE Fractogel, DEAE Fractogel veya Q-Sefaroz gibi partikül bazli olabilir. SEPHAROSE, makromoleküllerin jel filtrasyonu ile ayirma için yüksek molekül agirlikli. bir madde için New Jersey'deki Pharmacia, Inc.'in ticari adidir. Anyon degisim kolonlari iki bilesene, bir matrise ve bir ligana sahiptir. Matris, örnegin, selüloz, dekstran, agaroz veya polistiren olabilir. Immobilize edilmis anyon degisim ligandi, dietilaminoetan (DEAE), polietilenimin (PEI) veya bir kuaterner amin fonksiyonel grup (Q) olabilir. Bir anyon degisim kolonunun kuvveti, ligandin iyonizasyon durumunu ifade eder. Kuvvetli anyonik degisim kolonlar, bir kuaterner amonyum ligandina sahip olanlar gibi genis bir pH araliginda kalici bir pozitif yük tasirlar. DEAE ve PEI gibi zayif anyon degisim kolonlarinda, pozitif yükün varligi kolonun pH'ina baglidir. Q Sefaroz FF veya metal selatli Sefaroz (örn., Cu2+- selatli Sefaroz) gibi kuvvetli anyon degisim kolonlari tercih edilir.

Anyon degisim kolonlari genellikle saflastirilacak proteinin pI'sinin üzerinde bir pH degerinde düsük tuzlu bir tampon ile yüklenir. Tamponlarin, tampon konsantrasyonlarinin, tuz konsantrasyonlarinin ve eluentlerin seçimi, teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinmektedir (örn., bkz. Scopes "Protein Purification: Principles and Practice" Springer; 3rd ed. edition (November 19, 1993)).

Bulusa ait bir düzenlemede, bir numune anyon degisim kromatografisi ile saflastirilabilir. Anyon degisim kromatografisi, bir numunedeki proteinlerin, kabaca yük özelliklerine göre saflastirilmasini saglar. Örnegin bir Q anyon degisim reçinesi kullanilabilir (ör., Q HyperD F, Biosepra) ve bir numune farkli pH'lara sahip olan eluantlarla sirayla elute edilebilir. Anyon degisim kromatografisi, diger biyomolekül tiplerinden daha negatif yüklü bir numunede biyomoleküllerin ayrilmasina izin verir. Yüksek bir pH degerine sahip bir eluant ile elute edilen proteinlerin zayif bir sekilde negatif olarak yüklenecegi ve düsük bir pH degerine sahip bir eluant ile elute edilen bir fraksiyonun kuvvetli bir sekilde negatif olarak yüklenebilecegi muhtemeldir. Bu nedenle, bir numunenin karmasikliginin azaltilmasina ek olarak, anyon degisim kromatografisi proteinleri baglanma özelliklerine göre ayirir.

Yine bir baska düzenlemede, bir numune heparin kromatografisi ile daha da saflastirilabilir. Heparin kromatografisi, heparin ve yük özellikleri ile afinite etkilesimi temelinde bir numunede Sülfatlanmis bir mukopolisakkarid olan heparin, pozitif yüklü kisimlarla Idlp komplekslere baglanir ve bir numune, farkli pH'lar veya tuz konsantrasyonlarina sahip olan eluantlarla sirayla elute edilebilir. Düsük bir pH'a sahip olan bir eluant ile elute edilen Ide kompleksleri, zayif bir sekilde pozitif olarak yüklüdür. Yüksek bir pH'a sahip olan bir eluant ile elute edilen Ide kompleksleri, kuvvetli bir sekilde pozitif olarak yüklüdür. Böylece, heparin kromatografisi ayrica bir numunenin karmasikligini azaltir ve Ide komplekslerini baglanma özelliklerine göre ayirir. Bir baska düzenlemede, bir numune hidroksiapatit kromatografisi ile daha da saflastirilabilir.

Yine bir baska düzenlemede, bir numune hidroksiapatit etkilesim kromatografisi ile daha da saflastirilabilir. problanan herhangi bir biyoçip, bir çoklu mikrotitre plakasi, bir reçine veya nitroselüloz membranlar gibi bir destege immobilize edilmis kaptür reaktifleri ile yakalanabilir. Özellikle, mevcut bulusa ait Ide kompleksleri, Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI) protein biyoçipleri üzerinde yakalanabilir. Kaptür, kromatografik bir yüzeyde veya biyospesifik bir yüzey üzerinde olabilir. Reaktif yüzeyleri içeren SELDI proteini biyoçiplerinden herhangi biri, mevcut bulusun Ide komplekslerini yakalamak ve tespit etmek için kullanilabilir. Bu biyoçipler, Ide komplekslerini spesifik olarak yakalayan antikorlar ile türevlenebilir veya immünoglobulinleri baglayan protein A veya protein G gibi kaptür reaktifleri ile türevlenebilir. Daha sonra Ide kompleksleri, spesifik antikorlar kullanilarak çözelti içinde yakalanabilir ve yakalanan Ide kompleksleri kaptür reaktifi yoluyla çip üzerinde izole edilir. ölçeklendirilebilir. Bazi düzeneklerde Idlp'yi saflastirmak için 1 mL veya 8 mL'lik bir kolon kullanilir. Diger düzenlemelerde, 80 ml, 800 mL kolon veya 8 L kolon Ide'yi saflastirmak için kullanilir.

Tipik olarak saflastirilmis Ide, kolondan elute edildikten sonra kararliligi veya aktiviteyi korumak için bir tampona dönüstürülür. Saflastirilmis Ide ayrica düsük moleküler agirlikli protein bulastirici maddelerin uzaklastirilmasi için ultrafiltrasyon veya diafiltrasyon ile islenebilir. Bazi düzenlemelerde, viral inaktivasyon adimlari saflastirmaya dahil edilir. Kromatografik ayirmadan önce, virüs partiküllerini inaktif hale getirmek için bir çözücü ve plazmanin aritici tedavisi kullanilabilir. Ultrafiltrasyon veya diafiltrasyondan sonra, saflastirilmis Ide, nanofiltrasyon (Örn., virüsleri inaktive etmek için) ile daha da islenebilir. Saflastirilmis lde ayrica liyofilize edilebilir ve uzun süreli depolama için stoklanabilir (yigili stok).

Bulusa ait Ide bilesimleri tercihen yaklasik %85 ila yaklasik %100 arasinda saftir. Burada kullanildigi sekliyle “saf” terimi, dogal ortamindan uzaklastiriklmis, izole edilmis veya ayrilmis olan ve en azindan dogal olarak iliskili oldugu diger bilesenlerden en az yaklasik %85 ila yaklasik %100 arasinda dogal, tercihen %90 dogal ve daha tercihen %95 dogal olan Ide bilesimini ifade eder. Tercih edilen düzenlemelerde, büyük ölçüde saflastirilmis bir protein, daha fazla protein olusturacaktir.

Mevcut bulusa uygulandigi sekliyle “homojenlik için saflastirilan” bir peptit, polipeptit veya protein, peptidin, polipeptidin veya proteinin, peptidin, polipeptidin veya proteinin büyük oranda diger proteinler ve biyolojik bilesenlerden saflastirilmis oldugu bir saflik seviyesine sahip oldugu anlamina gelir. Saflastirilmis Idlp elde etmek için izolasyon adimini veya kan plazmasinin adimlarini gerçeklestirmekr için herhangi bir uygun materyal ve yöntem kullanilabilir.

Proteinlerin, polipeptitlerin veya peptitlerin saflastirilma derecesinin nicellestirilmesi için çesitli yöntemler, mevcut tarfinamenin isiginda teknikte uzman kisilerce bilinir. Bunlar, Örnegin, bir fraksiyonun spesifik protein aktivitesinin belirlenmesi veya jel elektroforezi ile bir fraksiyon içindeki polipeptitlerin sayisinin degerlendirilmesidir. “Biyolojik olarak aktif” terimi, dogal olarak olusan bir Idlp kompleksinin yapisal, düzenleyici veya biyokimyasal fonksiyonlarina sahip olmasini ifade eder. Benzer sekilde, “immünolojik açidan aktif”, dogal, rekombinant veya sentetik Ide kompleksinin veya herhangi bir oligopeptidinin, uygun hayvanlarda veya hücrelerde spesifik bir bagisiklik tepkisini indükleme ve spesifik antikorlarla baglanma yetenegini tanimlar. Ide konsantrasyonlari, Lim ve ark. (J. of Infectious Diseases, 2003) tarafindan tarif edildigi gibi MAb 69.31 kullanilarak bir kompetitif Enzime Bagli Bagisiklik Tahlili (ELISA) ile ölçülebilir. Kompetitif ELISA'da, lde'nin hafif zincirine baglanan antikorlar, örn., MAb 69.26 ve MAb aktif kullanilabilir. Kompetitif ELISA'da Ide'nin hafif zincirine baglanan antikorlar kullanildiginda, protein konsantrasyonuna dayali olarak tahmin edilenden daha yüksek bir ölçüm elde edilmesi, Ide'nin aktif bölgesinin açiga çiktigini gösterebilir.

Anti-Ide antikorunun saflastirilmis Ide'ye baglanmasi, kompetitif ELISA ile belirlendigi uzere, 1.5-, 2-, 3-, 4-, 5-, veya 10- kat daha fazla arttirilir. Protein konsantrasyonunun Ölçülmesi için yöntemler teknikte bilinmektedir ve ayrica ticari olarak ilasilabilir protein tahlilleri (Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlilleri; BioRad protein tahlilleri) ile de ölçülebilir. Idlp ürün yapisi ve safligi, örnegin, HPLC veya teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinen diger kromatografik yöntemle teyit edilebilir. Saflastirilmis Ide'nin spesifik inhibe edici aktivitesi, kromojenik substrat L-BAPA (N(alfa)- Benzoil-L-arjinin-4-nitroanilid hidroklorürü (Fluka Kimyasallari) kullanarak bir tripsin inhibisyon tahlilinde ölçülebilir. Bu tahlil, Ide'nin L-BAPA'nin hidrolizini inhibe etme kabiliyetine dayanmaktadir. Inhibisyon 410 nm'de A absorbans/dakika oraninda bir azalma ile izlenebilir.

Saflastirilmis Ide, yaklasik 60 kDa ila yaklasik 280 kDa arasinda bir belirgin molekül agirligina sahiptir. Moleküler agirlik, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile belirlenebilir. Saflastirilmis Ide ayrica burada tarif edilen veya teknikte bilinen yöntemler ile belirlenebilen biyolojik aktiviteye (örn., sitokin inhibitör aktivitesi, kemokin inhibitör aktivitesi veya serin proteaz inhibitör aktivitesi) de sahiptir. Saflastirilan Idlp, kan, plazma veya plazma fraksiyonlarinda mevcut olan Ide veya diger yollarla saflastirilan Ide dahil olmak üzere düsük pH ile islem görmeyen sahiptir.

Yöntem ayrica, bilinmeyen Idlp konsantrasyonunun bir numunesinde kendisini inter-alfa inhibitör proteininin (Idlp) miktarina belirlemeya dayandirmaktadir. Bilinmeyen Ide konsantrasyonu numunesi bir kromatografi kolonuna uygulanir. Bazi düzenlemelerde, kromatografi kolonunun hacmi lmL'den daha azdir.

Numunenin uygulandigi kolon, düsük. bir pH tamponuyla (örn., 3.6'dan küçük pH) yikanir. Kolon daha sonra yüksek bir tuz tamponuyla (örn.,> elute edilir. Büyük oranda Ide (örn., saflik > %90) içeren elute edilmis protein, protein konsantrasyonunun saptanmasi için teknikte bilinen yöntemlerle ölçülür. Bu yöntemler, burada tarif edildigi gibi UV absorbansi, protein tahlilleri veya Idlp konsantrasyonunu belirlemek için kompetitif ELISA'yi içerebilir. Numunede bulunan Ide miktari, proteinin miktarinin bir veya daha fazla referans ile karsilastirilmasiyla elde edilebilir. Bu tür referanslar, bilinmeyen Ide konsantrasyonunun numunesini islemek için kullanilan yöntemle islenmis bilinen miktarlarda Ide içeren numuneleri içerir.

Kan, Plazma ve Plazma Fraksiyonlari plazmasi veya kan plazmasindan izole edilen bir kan plazmasi fraksiyonundan saflastirilir. Burada kullanilan sekliyle “izole etmek” terimi, fizyolojik oranlarda IdI ve Fal içeren kan plazmasindan bir plazma fraksiyonunun üretilmesi anlamina gelir. Örnegin, bir plazma fraksiyonunun izole edilmesi, bulusa göre, kan plazmasinin kromatografi edilemsiyle basarilabilir. Izole edilmis, orijinal ortamindan (örnegin, dogal olarak olusuyorsa dogal ortamdan) çikarilmis materyali belirtir ve böylece “insan eliyle" dogal halinden degistirilir. Örnegin, izole edilmis bir polipeptit veya protein kan plazmasinin bir bileseni olabilir veya bir hücre içinde bulunabilir ve "izole edilmis" olarak kabul edilebilir, çünkü bu kan plazmasi veya özel hücre polipeptidin orijinal ortami olmayabilir.

Burada kullanildigi sekliyle "kan plazmasindan türetilen", orijinal olarak izole edilmekte veya kan plazmasindan saflastirilmaktadir. Yani, bilesimin dogal ortami kan plazmasidir.

Burada kullanildigi sekliyle "bir plazma fraksiyonu", örnegin aslinda kan plazmasindan türetilen kromatografi gibi bir izolasyon veya saflastirma adimindan elde edilen bir fraksiyondur. Bulusa göre olan plazma fraksiyonlari, örnegin, pihtilasma faktörü IX'un saflastirilmasindan elde edilen bir yan fraksiyon, bir protrombin kompleks konsantresinin saflastirilmasindan elde edilen bir yan fraksiyon, kan plazmasinin kriyopresipitasyonundan (Hoffer ve ark., Journal of edilen) veya bir kriyo-fakir plazmadan kaynaklanan bir kriyo- süpernatant olabilir. Burada kullanildigi sekliyle “kriyo-fakir plazma” ya da “kriyosupernatant”, plazmanin kriyopresipitasyonundan elde edilen süpernatanttir. Kriyo-fakir plazma, taze donmus plazmanin eritilmesiyle hazirlanabilir (örn., 4 derece Celcius'ta ve 30 dakika boyunca 10k rpm'de santrifüjleme).

Plazma yerine, bu saflastirma protokolü ayrica Ide içeren herhangi bir plazma fraksiyonunda da kullanilabilir. Ide içeren plazma fraksiyonlari, pihtilasma faktörlerinin ve diger plazma türevlerinin endüstriyel olarak islenmesi sirasinda veya pihtilasma faktörleri gibi diger terapötik proteinlerin saflastirma süreci sirasinda yan fraksiyonlari veya plazma ara ürünlerini içerir. Bulusa göre bir yan fraksiyon örnegi, pihtilasma faktörü IX'un saflastirilmasindan elde edilir. Faktör bir IdI/Pdl karisiminin mevcut oldugu gösterilmistir. Pihtilasma faktörü IX'un. saflastirilmasindan, elde edilen yan fraksiyonu elde etme yöntemi, Hoffer et al.., Journal of Chromatography B fraksiyonlarin diger örnekleri, D. Josic et al., Thrombosis gibi bir protrombin kompleksi konsantresinin saflastirilmasindan elde edilen FIX `un saflastirmasindan yan fraksiyonlar veya bir yan fraksiyonu içerir. Diger yan fraksiyon örnekleri, Fraksiyon D ve Fraksiyon C olarak adlandirilan FIX saflastirilmasindan elde edilen yan fraksiyonlari içerir. Fraksiyon D ve Fraksiyon C, FIX ve diger` pihtilasma faktörleri, vs, anyon degistirme kromatografisi ile saflastirilmasi sirasinda elde edilen Ide içeren fraksiyonlari belirtir. Fraksiyon D, anyon degisim kolonundan yüksek tuz kosullari altinda (örn.,> 500mM NaCl) elute edilen bir Idlp içeren fraksiyondur. Fraksiyon C, bir anyon degisim kolonundan saflastirilan ve pH 6.0'da, 25 mM Sitrat, 0.5 M NaCl ile elute edilen bir plazma fraksiyonundan türetilen bir kolonuna anyon degisim kolonundan (25 mM Sitrat, pH 6.0, 0.5 M NaCl içinde) eluantin uygulandigi bir anti-Faktör IX afinite saflastirma adimindan gelen baglanmamis bir fraksiyondur, yani akistir.

Kan plazmasinin kriyopresipitasyonundan kaynaklanan bir kriyo- süpernatant olarak izole edilen bir yan fraksiyon örnegidir. Örnegin, uygun kriyopresipitasyon yöntemleri Hoffer` ve ark., yayinda tarif edilmistir.

Kan ve kan plazmasi insan, primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi veya köpek kaynaklarindan elde edilebilir. Kan, örnegin, kan bankalari, hastaneler, darülacezeler, özel sirketler, arastirma kurumlari veya baska herhangi bir kan kaynagindan elde edilebilir ve/veya satin alinabilir.Kan plazmasi, örnegin, kan bankalari, hastaneler, darülacezeler, özel sirketler, arastirma kurumlari veya baska herhangi bir kan kaynagindan elde edilebilir ve/veya satin alinabilir. Alternatif' olarak, kan alindiktan sonra kan plazmasi da kandan izole edilebilir. Kan plazmasini izole etmek için uygun yöntemler arasinda yerçekimi ve santrifüjleme bulunur. Bulusa ait plazma fraksiyonlari insan, primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi veya köpek kaynaklarindan elde edilebilir.

Yan fraksiyonlardan önceki bazi Idlp saflastirmalari, Western blot analiz yöntemi ile 80 kDa bandinda ve bir pihtilasma tahlilinde saptanan faktör X (FX) ile kontaminasyon içermektedir.

FX'in uzaklastirilmasi önemlidir çünkü FX trombojeniktir ve insanlara uygulandiginda zararli olabilir. Burada tarif edilen kaldirir. Ek olarak, plazmada veya plazma fraksiyonunda bulunan herhangi bir virüsün inaktive edilmesi için kromatografik ayirmadan önce plazmanin bir çözücü ve temizleyici islemi gerçeklestirilebilir.

Terapötik Yöntemler Bulus, Ide seviyelerinde bir azalma veya bir kemokin, sitokin veya proteaz seviyesinde bir artis ile iliskili hastaliklarin ve bozukluklarin tedavisini saglar. Hücre sayisinda bir eksiklik ile iliskili birçok hastalik veya kosul, bir kemokin, sitokin veya proteaz seviyesinde bir artis ile karakterize edilir. Bu tür hastaliklar veya patolojik kosullar arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, inflamasyon, travma/yaralanma, tümör invazyonu, tümör metastazi, sepsis, septik sok veya enfeksiyöz bir hastalik yer alir. Bulusa ait yöntemler, kemokin, sitokin veya proteazin seviyesini veya aktivitesini azaltarak bu tür hastaliklari, bozukluklari veya yaralanmalari iyilestirir.

Mevcut bulus, burada bir denege (örn., bir insan gibi bir memeliye) saflastirilmis bir Idlp proteini içeren farmasötik bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren hastalik ve/veya bozukluklarin veya semptomlarin tedavi edilmesine yönelik yöntemler saglar. Bu nedenle, bir uygulama, ldlp'de bir eksiklik ile karakterize edilen bir hastalik veya bozukluga ya da semptomuna maruz kalan ya da bunlara yatkin olan bir denegin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemdir. Yöntem, hastaligin veya bozuklugun tedavi edilecegi kosullar altinda, hastaligin veya bozuklugun veya semptomunun tedavi edilmesi için yeterli olan, bulusa ait bir bilesimin terapötik bir miktarinin, memeliye uygulanmasi adimini içerir. Çesitli düzenlemelerde, bulusa ait ajanlar, lokal enjeksiyonla bir hastalik bölgesine veya yaralanmalara, sürekli infüzyonla veya cerrahi kosullar altinda mikro enjeksiyonla uygulanir ajanlar, Ide'de bir eksiklige sahip olan bir hastanin bir doku veya organina sistemik olarak uygulanir.

Buradaki yöntemler, denege (böyle bir tedaviye ihtiyaç duydugu tanimlanan bir denek dahil) , burada tarif edilen etkili miktarda saflastirilmis Ide proteini veya bu etkiyi üretmek için burada tarif edilen bir bilesimin uygulanmasini içerir. Bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir denegin tanimlanmasi, bir denegin veya bir saglik uzmaninin kararinda olabilir ve öznel (örn., fikir) veya objektif (örnegin bir test veya teshis yöntemiyle Ölçülebilir) olabilir.

Bulusa ait terapötik yöntemler (profilaktik tedavi içeren) genel olarak burada kullanilan bilesiklerin terapötik olarak etkili bir Iniktarinin, buradaki formüllerin bir' bilesigi gibi, bir memeli, özellikle bir insan da dahil olmak üzere ihtiyaç duyan bir denege (örnegin, hayvan, insan) uygulanmasidir. Denek ayrica primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi veya köpek olabilir. Idlp ile tedaviye uygun olan kisiler, inflamasyon, travma/yaralanma, tümör invazyonu, tümör metastazi, sepsis, septik sok veya enfeksiyöz bir hastaliga sahip olarak tanimlanabilir. Bu tür bir tedavi uygun olarak, özellikle de bir hastaliga, bozukluga veya semptomuna maruz kalan, sahip olan,yatkin olan ya da risk altindaki deneklere, uygulanacaktir. “Risk altindaki” deneklerin belirlenmesi, bir teshis veya bir denegin veya saglik hizmeti saglayicisinin (örnegin, genetik test, enzim veya protein markörü, Markör (burada tanimlandigi gibi), aile öyküsü ve benzerleri) görüsüyle herhangi bir nesnel veya öznel belirleme ile yapilabilir. Denek, bir pratisyen hekim tarafindan inflamasyon, tümör invazyonu, tümör metastazi, sepsis, septik sok veya enfeksiyöz bir hastaliga sahip olarak tanimlanabilir veya teshis edebilir. Denekler primatlar, insanlar veya bunlardan baska olarak hayvanlar olabilir. Buradaki bilesimler, hücre sayisindar bir eksikligini söz konusur olabilecegir baska herhangi bir bozuklugun tedavisinde de kullanilabilir.

Bir düzenlemede bulus, tedavinin ilerlemesinin izlenmesi için bir yöntem saglar. Yöntem, Ide seviyelerinde bir eksiklik veya kemokin, sitokin veya proteaz seviyelerinde bir artis ile iliskili bir bozukluga veya semptomlara muzdarip olan veya bunlara yatkin bir denekte bir teshis markör seviyesinin (Markör) (örn., burada tarif edilen bir bilesik, bunun bir proteini veya indikatörü ile modüle edilen herhangi bir hedef, vb.) veya teshis ölçümünün (örn., tarama, tahlil) belirlenmesi adimini içerir.

Denege, hastaligi veya semptomlari tedavi etmek için yeterli miktarda bir bilesigin terapötik bir miktari uygulanmis olabilir.

Yöntemde belirlenen Markör seviyesi, saglikli normal kontrollerde veya denegin hastalik durumunun tespiti için diger etkilenmis hastalarda bilinen Markör seviyeleri ile karsilastirilabilir. Tercih edilen düzenlemelerde, denekte ikinci bir Markör seviyesi, birinci seviyenin belirlenmesinden sonra bir zaman noktasinda belirlenir ve iki seviye, hastaligin seyrini veya tedavinin etkinligini izlemek için karsilastirilir.

Tercih edilen bazi düzenlemelerde, mevcut bulusa göre tedaviye baslanmadan önce denegin ön tedavi Markör seviyesi belirlenir; bu tedavi öncesi Markör seviyesi tedavinin etkinligini belirlemek için tedavi basladiginda denekteki Markör seviyesi ile karsilastirilabilir.

Farmasötik Bilesimler Mevcut bulus, sitokinlerin, kemokinlerin ve proteazlarin aktivitesinin seviyesini azaltma veya önleme kabiliyetine sahip olan ajanlari içeren farmasötik preparatlar sunmaktadir. Bu gibi preparatlar hem terapötik hem de profilaktik uygulamalara sahiptir. Burada tarif edilen yöntemlerde yararli ajanlar, bir sitokin, kemokin veya proteaz seviyesini azaltanlari içerir.

Istenirse, bulusa ait bilesimler, bir denegin dolasiminda bulunan sitokinler, kemokinler ve proteaz seviyelerini azaltan ajanlar ile birlikte formüle edilir. Sitokin veya kemokin yanitini azaltan ajanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, anti-TNF-alfa antikoru veya TNF inhibitörleri bulunur.

Bulusa ait bilesikler, farmasötik bir bilesimin bir* parçasi olarak uygulanabilir. Bilesimler steril olmali ve bir denege uygulama için, bulusa ait ajanlarin terapötik olarak etkili bir miktari uygun bir agirlik veya hacim birimi içermelidir. Bulusa ait bilesimler ve kombinasyonlar, bilesiklerin her birinin ayri ayri dozaj miktarlarinda mevcut oldugu bir farmasötik paketin parçasi olabilir.

Profilaktik veya terapötik uygulama için kullanilacak olan bulusa ait farmasötik bilesimler steril olmalidir.

Sterillik, steril filtrasyon membranlari (örn., 0.2 um membranlar), gama isinimi veya teknikte uzman kisilerce bilinen herhangi bir baska uygun araç ile filtrasyon yoluyla kolayca gerçeklestirilebilir. Terapötik polipeptid bilesimleri genelde steril erisim noktasina sahip bir kap içerisine, mesela bir intravenöz solüsyon torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile parçalanabilen. bir tipaya sahip bir Viyal içine yerlestirilir. Bu bilesimler normalde ünite veya çok dozlu kaplarda, örnegin, sizdirmaz ampuller veya Viyaller, sulu bir çözelti olarak veya sulandirma için liyofilize bir formülasyon halinde depolanacaktir.

Bilesikler istege bagli olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan ile birlestirilebilir. Burada kullanildigi sekliyle “farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan” terimi, bir insana uygulanmasi için uygun olan bir veya daha fazla uyumlu kati veya sivi dolgu maddesi, seyreltici veya kapsülleyici madde anlamina gelir. Eksipiyan tercihen, izotonikligi ve kimyasal kararliligi arttiran maddeler gibi az miktarda katki maddeleri içerir. Bu tür malzemeler, kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik degildir ve fosfat, sitrat, süksinat, asetat, laktat, tartrat ve diger organik asitler veya bunlarin tuzlari gibi tamponlari; tris- hidroksimetilaminometan (TRIS), bikarbonat, karbonat ve diger organik bazlar ve bunlarin tuzlari; askorbik asit gibi antioksidanlari; düsük molekül agirlikli (örn., yaklasik on kalintidan daha az) polipeptitler, örnegin poliarginin, polilisin, poliglutamat ve poliaspartati; serum albümini, jelatin veya immünoglobulinler gibi proteinleri; polivinilpirolidon (PVP), polipropilen glikoller (PPG'ler) ve polietilen glikoller (PEG'ler) gibi hidrofilik polimerleri; glisin, glutamik asit, aspartik asit, histidin, lisin veya arginin gibi amino asitleri; monosakkaritler, disakkaritler ve selüloz veya türevleri, glikoz, mannoz, sükroz, dekstrinler veya heparin, kondroitin sülfat veya dekstran sülfat gibi sülfatlanmis karbonhidrat türevleri dahil olmak üzere diger karbonhidratlari; kalsiyum iyonlari, magnezyum iyonlari ve manganez iyonlari dahil divalent metal iyonlari gibi polivalent metal iyonlari; etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) gibi kenetleme ajanlari; mannitol veya sorbitol gibi seker alkolleri; sodyum veya amonyum gibi tersyükün iyonlar; ve/Veya polisorbatlar veya poloksamerler gibi naniyonik yüzek aktif maddeleri içerir. Geleneksel katki maddelerinde mevcut olabilen stabilizatörler, anti-mikrobiyaller, inert gazlar, sivi ve besin takviyeleri (yani, Ringer dekstrozu), elektrolit takviye maddeleri ve benzerleri gibi diger katki maddeleri de dahil edilebilir.

Yukarida tarif edildigi gibi bilesimler, etkili miktarlarda uygulanabilir. Etkili miktar uygulama sekline, tedavi edilen özel duruma ve istenilen sonuca bagli olacaktir. Ayni zamanda kosullarin asamasina, denegin yasina ve fiziksel kosullarina, es zamanli tedavinin yapisina, eger varsa, tip doktoru tarafindan iyi bilinen faktörlere de bagli olabilir. Terapötik uygulamalar için bu, tibbi olarak istenilen bir sonuca ulasmak için yeterli miktardir. ldlp'de bir azalma ile karakterize olan bir hastalik veya rahatsizliga sahip bir denek ile ilgili olarak, kemokin, sitokin veya proteazin seviyelerini veya aktivitesini azaltmak için etkili bir miktar yeterlidir; veya bir patoloji ile baglantili bir semptomu stabilize etmek, yavaslatmak veya azaltmak için yeterlidir. Mevcut bulusa ait bilesimler, akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastalik veya dogrudan belirlenebilen erken dogumun tedavi edilmesinde kullanilabilir.

Genel olarak, mevcut bulusa ait bilesiklerin dozlari günde yaklasik 0.01 mg/kg ila günde lOOO mg/kg arasinda olacaktir.

Yaklasik 50 ila yaklasik 2000 mg/kg arasinda degisen dozlarin uygun olmasi beklenir. Daha düsük dozlar, intravenöz uygulama gibi bazi uygulama sekillerinden kaynaklanir. Bir denekteki bir yanitin uygulanan ilk dozlarda yetersiz olmasi durumunda, hasta toleransinin izin verdigi ölçüde daha yüksek dozlar (veya farkli, daha lokalize bir dagitim yolu ile daha yüksek dozlar) kullanilabilir. Mevcut bulusa ait bir bilesimin uygun sistemik seviyelerini elde etmek için gün içinde çoklu dozlar düsünülmektedir. Çesitli uygulama yollari mevcuttur. Genel olarak bahsedilen bulusa ait yöntemler, tibbi olarak kabul edilebilir herhangi bir uygulama biçimi kullanilarak uygulanabilir; bu, klinik olarak kabul edilemez yan etkilere neden olmadan etkin bilesiklerin etkili seviyelerini üreten herhangi bir biçim anlamina gelir.

Diger uygulama biçimleri arasinda oral, rektal, topikal, intraoküler, bukkal, intravajinal, intrasisternal, intraserebroventriküler, intratrakeal, nazal, transdermal, implant içi/üzeri veya parenteral yollar bulunur. “Parenteral” terimi deri alti, intratekal, intravenöz, intramüsküler, intraperitoneal veya infüzyonu içerir. Oral uygulama, hastaya uygun oldugu kadar dozlama programina da uygun oldugundan profilaktik tedavi için tercih edilebilir.

Bulusa ait farmasötik. bilesimlert istege bagli olarak ayrica istenildigi gibi bir veya daha fazla ek protein içerebilir.

Teknikte uzman kisiler için uygun ve mevcut olan saflastirma yöntemlerinden herhangi biri ile, uygun proteinler veya biyolojik materyaller insan veya memeli plazmasindan elde edilebilir; standart rekombinant DNA tekniklerine göre introduit bir insan veya memeli proteinini eksprese eden bir gen içeren rekombinant doku kültürü, virüsler, maya, bakteri veya benzerlerinin süpernatantlarindan, özütlerinden veya lizatlarindan; veya insan biyolojik sivilarindan (örn., kan, süt, lenf, idrar veya benzeri) veya standart transgenik tekniklere göre introduit bir insan proteinini eksprese eden bir gen içeren transgenik hayvanlardan elde edilir.

Bulusa ait farmasötik; bilesimler, formülasyonun pH degerini, yaklasik 5.0 ila yaklasik 8.0 arasinda oldugu gibi fizyolojik pH degerini yansitan önceden belirlenmis bir seviyede tutmak için bir veya daha fazla pH tamponlama bilesigi içerebilir. Sulu sivi formülasyonda kullanilan pH tamponlama bilesigi, bir amino asit veya histidin veya histidin ve glisin gibi amino asitlerin bir karisimi gibi amino asitler olabilir. ,Alternatif' olarak, pH tamponlama bilesigi, tercihen, formülasyonun pH' degerini, yaklasik 5.0 ila yaklasik 8.0 arasinda olan ve kalsiyum iyonlarini selatlamayan, önceden belirlenmis bir seviyede tutan bir ajandir. Bu gibi pH tamponlama bilesiklerinin açiklayici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte imidazol ve asetat iyonlari bulunur. pH tamponlama bilesigi, formülasyonun pH degerini önceden belirlenmis bir seviyede tutmak için uygun herhangi bir miktarda mevcut olabilir.

Bulusa ait farmasötik bilesimler ayrica, bir veya daha fazla ozmotik modülasyon ajani, yani formülasyonun ozmotik Özelliklerini (örn., tonisite, ozmolalite ve/veya ozmotik basinç), alici bireylerin kan hücreleri ve kan akimi için kabul edilebilir bir seviyeye modüle eden bir bilesik içerebilir.

Ozmotik modülasyon ajani, kalsiyum iyonlarini kenetlemeyen bir ajan olabilir. Ozmotik modülasyon ajani, formülasyonun ozmotik özelliklerini module eden, teknikte uzman kisilerce bilinen bir bilesik 'veya, mevcut herhangi bir› bilesikr olabilir. Teknikte uzman bir kisi, bulus konusu formülasyonda kullanilmak üzere belirli bir ozmotik modülasyon ajaninin uygunlugunu deneysel olarak belirleyebilir. Uygun tipteki ozmotik modülasyon ajanlarinin açiklayici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, asagidakileri içerenler bulunur: sodyum klorür ve sodyum asetat gibi tuzlar; sakaroz, dekstroz ve mannitol gibi sekerler; glisin gibi amino asitler; ve bu ajanlarin bir veya daha fazlasinin ve/veya ajan tiplerinin karisimlari. Ozmotik modülasyon ajan(lar)i, formülasyonun ozmotik özelliklerini modüle etmek için yeterli herhangi bir konsantrasyonda mevcut olabilir.

Mevcut bulusa ait bir bilesigi içeren bilesimler, kalsiyum iyonlari, magnezyum iyonlari ve/veya manganez iyonlari gibi multivalent metal iyonlari içerebilir. Bilesimi kararli hale getirmeye yardimci olan herhangi bir nmltivalent metal iyonu alici bireyleri olumsuz yönde etkilemeyecek kullanilabilir. Bu iki kritere dayanan uzmanlar, uygun metal iyonlarini deneysel olarak belirleyebilir ve bu bilinen metal iyonlari gibi uygun kaynaklarini ve inorganik ve organik tuzlari içerdigini bilir.

Bulusa ait farmasötik bilesimler ayrica sulu olmayan bir sivi formülasyon olabilir. Uygun herhangi bir sulu olmayan sivi, içinde bulunan aktif ajan(lar)a kararlilik saglamasi sartiyla kullanilabilir. Tercihen, sulu olmayan sivi hidrofilik bir sividir. Uygun sulu olmayan sivilarin açiklayici örnekleri, gliserol; dimetil sülfoksit (DMSO): polidimetilsiloksan (PMS); etilen glikol, dietilen. glikol, trietilen. glikol, polietilen glikol ("PEG") 200, PEG 300 ve PEG 400 gibi etilen glikolleri; ve dipropilen glikol, tripropilen glikol, polipropilen glikol gibi propilen glikolleri içerir.

Bulusa ait farmasötik bilesimler ayrica karistirilmis sulu/sulu olmayan bir sivi formülasyon olabilir. Yukarida tarif edilenler gibi herhangi bir uygun sulu olmayan sivi formülasyon, karistirilmis sulu/sulu olmayan sivi formülasyonun içinde bulunan bilesige kararlilik saglamasi kosuluyla, yukarida tarif edilenler gibi herhangi bir sulu sivi formülasyon ile birlikte kullanilabilir. Tercihen, bu tür formülasyondaki gibi sulu olmayan sivi hidrofilik bir sividir. Uygun sulu olmayan sivilarin açiklayici Örnekleri, gliserol; DMSO; PMS; PEG 200, Uygun kararli formülasyonlar aktif ajanlarin donmus veya donmamis sekilde sivi halde depolanmasina izin verebilir.

Kararli sivi formülasyonlar en az -70 °C'lik bir sicaklikta depolanabilir, ancak bilesimin özelliklerine bagli olarak en az 0 °C veya yaklasik 0.1 °C ila yaklasik 42 °C arasinda daha yüksek sicakliklarda da depolanabilir. Genellikle proteinlerin ve polipeptidlerin pH, sicaklik ve terapötik etkinligini etkileyebilecek çok sayida baska faktörlerdeki degisikliklere duyarli oldugu, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir.

Diger iletim sistemleri, zamaninda salinim, gecikmeli salinim veya sürekli salinim iletim sistemleri içerebilir. Bu tür sistemler, bulusa ait bilesimlerin tekrarlanan uygulamalarindan kaçinarak, denege ve doktora kolaylik saglar. Birçok salinim iletim sistemi tipi, teknikte uzman kisilerce kullanislidir ve bilinmektedir. Polilaktitler (ABD Patenti 3,773,919; Avrupa Patenti No. 58,481), kopolioksatlar, polikaprolaktonlar, poliesteramidler, polyorthoesterler, poli-D-(-)-3- hidroksibutirik asit (Avrupa Patenti No. 133, 988), L-glutamik asit kopolimerleri ve gama-etil-L-glutamat (Sidman, K.R. ve ark., Biopolymers 22: 547-556) , poli (2-hidroksietil metakrilat) veya etilen Vinil asetat (Langer, R. et al. J. Biomed. Mater. Res. polianhidridler gibi polimerik baz sistemleri içerir.

Sürekli salimli bilesimlerin diger örnekleri arasinda, biçim verilmis ürünler, örnegin filmler veya mikrokapsüller formunda yari geçirgen polimer matrisleri bulunur. Iletim sistemleri ayrica polimer disi, kolesterol, kolesterol esterleri ve yag asitleri gibi sterolleri veya mono-, di- ve tri-gliseritler gibi nötr yaglari içeren lipitler; biyolojik olarak türetilmis biyorezorbabl hidrojel (örnegin kitin hidrojelleri veya kitosan hidrojelleri) gibi hidrojel salim sistemleri; silastik sistemler; peptit bazli sistemler; balmumu kaplamalar; baglayicilar ve eksipiyanlar kullanilarak tabletler; kismen kaynasmis implantlar; ve sistemleri içerir. Bazi örnekler, bunlarla sinirli geleneksel sikistirilmis benzerleri gibi birlikte asagidakileri içerir: (a) maddenin, U.S. Patent tarif edilenler gibi bir matris içinde bir formda bulundugu asindirici sistemler ve (b) bir aktif bilesenin, U.S. gibi bir polimerden kontrollü bir hizda nüfuz ettigi difüzyon sistemleri.

Bulusa ait yöntem ve bilesimler ile kullanilabilen baska bir tasiyici sistem tipi, bir koloidal dispersi Kolloidal dispersiyon sistemleri arasinda yon sistemidir. su içinde yag emülsiyonlari, miseller, karistirilmis miseller ve lipozomlar dahil lipit bazli sistemler bulunur. Lipozomlar yapay ortaminda bir iletim vektörü olarak yararli olan yapay membran damarlaridir. Büyük tek lamelli kaplar (LUV), büyüklügü 0.2 um ila 4.0 um arasinda degisebilir, sulu iç kisimda büyük makromolekülleri kapsülleyebilir ve hücrelere biyolojik olarak aktif bir biçimde iletebilir (Fraley, R., and Papahadjopoulos, D., Trends Biochem. Sci. 6: 77-80).

Lipozomlar, lipozomun bir monoklonal antikor, seker, glikolipid veya protein gibi spesifik bir ligandla birlestirilmesiyle belirli bir dokuya hedeflenebilir. Lipozomlar, (2,3-dioleyoksi)-propil]-N,N,N-trimetilamonyum örnegin, ve dimetil dioktadesilamonyum bromür (DDAB) gibi katyonik lipidlerden olusan LIPOFECTINTM ve LIPOFECTACETM olarak Gibco BRL'den ticari olarak ulasilabilir. Lipozom yapim yöntemleri, teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin DE 3,218,121; Epstein ve 102,324 referansli yayinlar gibi birçok yayinda tarif edilmistir.

Lipozomlar, Gregoriadis, G., Trends Biotechnol., 3: 235-241) tarafindan da gözden geçirilmistir.

Baska bir araç türü, memeli aliciya implantasyon için uygun olan, biyouyumlu bir mikro partikül veya implanttir. Bu yönteme göre yararli olan örnek niteligindeki biyoasinabilir implantlar PCT Uluslararasi basvuru no. PCT/US/03307 ("Polimerik Gen Tasiyici Sistem" baslikli WO 95/24929 sayili yayin) sayili belgede tarif edilmistir. PCT/US/O307 sayili belge, uygun bir düzenleyicinin kontrolü altinda eksojen bir gen içermek için biyouyumlu, tercihen biyolojik olarak parçalanabilir polimerik matrisleri tarif eder. Polimerik matrisler, denekte eksojen gen veya gen ürününün sürekli salimini saglamak için kullanilabilir.

Polimerik matris tercihen bir mikro partikül (burada ajan bir kati polimerik matris boyunca dagitilmistir) veya bir mikrokapsül (burada mikrokapsül bir polimerik kabugun çekirdeginde depolanir) formundadir. Yukarida belirtilen polimerlerin ilaç içeren mikrokapsülleri, örnegin, ABD Patent ,075,109 sayili belgede tarif edilmistir. Bir ajani içeren polimerik matrisin diger biçimleri arasinda filmler, kaplamalar, jeller, implantlar ve stentler bulunur. Polimerik matris cihazinin boyutu ve bilesimi, matrisin içine sokuldugu dokuda uygun salim kinetigine yol açacak sekilde seçilir. Polimerik matrisin boyutu ayrica kullanilacak olan iletilm yöntemine göre seçilir. Tercihen, bir aerosol yolu kullanildiginda, polimerik matris ve bilesim bir yüzey aktif madde aracinda kapsanmaktadir.

Polimerik matris bilesimi, hem uygun bozunma oranlarina sahip olacak hem de transferin etkinligini daha da artirmak için bir biyoyapiskan olan bir materyalden olusturulacak sekilde seçilebilir. Matris bilesimi ayrica, bozunmamak için degil, uzun bir süre boyunca difüzyon ile salim yapacagi sekilde seçilir.

Iletim sistemi ayrica, lokal, olan bir biyouyumlu mikro partüküller olabilir. Bu tür mikro partiküler Chickering, D.E., ve ark., Biotechnol. Bioeng., 52: yayinda tarif edilmektedir.

Hem, biyo-bozunmayan hem de biyo-bozunur polimerik matrisler bulusa ait bilesimleri denege vermek için kullanilabilir. Bu tür polimerler dogal veya sentetik polimerler olabilir. Polimer, salinimin istenildigi, genellikle birkaç saat ila bir yil veya daha uzun bir süre boyunca, süreye bagli olarak seçilir. Tipik olarak, salinim, en çok birkaç saat ile üç ila on iki ay arasinda degisen bir süre boyunca istenir. agirliginin yaklasik %90'ina ayrica istege bagli olarak, Polimer, istege bagli olarak, kadar su içinde emilebilen ve polimerler ile çapraz baglanabilen bir hidrojel formundadir.

Biyobozunur iletim sistemini olusturmak için kullanilabilen Örnek niteligindeki sentetik polimerler sunlardir: poliamidler, polikarbonatlar, polialkilenler, polialkilen glikoller, polialkilen oksitler, polialkilenetereptalatlar, polivinil alkoller, polivinil eterler, halojenürler, polivinilpirolidon, poliglikolitler, polisiloksanlar, poliüretanlar ve bunlarin kopolimerleri, alkil selüloz, hidroksialkil selülozlar, selüloz eterler, selüloz esterleri, nitro selülozlar, akrilik ve netakrilik esterlerin polimerleri, metil selüloz, etil selüloz, hidroksipropil selüloz, hidroksibütil metil selüloz, selüloz asetat, selüloz propiyonat, selüloz asetat bütirat, selüloz asetat ftalat, karboksiletil selüloz, selüloz triasetat, selüloz sülfat sodyum tuzu, poli (metil metakrilat), poli (etil metakrilat), poli (bütilmetakrilat), poli (izobütil metakrilat), poli (heksilmetakrilat), poli (izodesil metakrilat), poli (lauril metakrilat), poli (fenil metakrilat), poli (metil akrilat), poli (izopropil akrilat), poli (izobütil akrilat), poli (oktadesil akrilat), polietilen, polipropilen, poli (etilen glikol), poli (etilen oksit), poli (etilen tereftalat), poli (Vinil alkoller), polivinil asetat, poli Vinil klorür, polistiren, polivinilpirrolidon ve laktik asit ve glikolik asitin polimerleri, polianhidritler, poli (orto) esterler, poli (butik asit), poli (valerik asit) ve poli (laktit-kokaprolakton) ve aljinat gibi dogal polimerler ve dekstran ve selüloz, kollajen, bunlarin kimyasal türevleri (ornatim maddeleri, kimyasal gruplarin eklenmesi, örnegin alkil, alkilen, hidroksilasyonlar, oksidasyonlar ve teknikte uzman kisilerce rutin olarak yapilan diger modifikasyonlar), albümin ve diger hidrofilik proteinler gibi diger polisakkaritler, zein ve diger prolaminler ve hidrofobik. proteinler, kopolimerler> ve bunlarin, karisimlari.

Genel olarak, bu materyaller ya enzimatik hidroliz ya da canli içi suya maruz kalma, yüzey ya da kütlesel asinma ile bozulur.

Akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, enfeksiyöz hastalik veya erken dogumun tedavi edilmesi için mevcut bulusa ait bilesiklerin kullanilmasi için en iyi tedavi rejimlerinin açikça belirlenebilecegi teknikte uzman kisiler tarafindan onaylanacaktir. Bu, deneysel bir sorun degil, tip alaninda rutin olarak yürütülen bir optimizasyondan ibarettir. Çiplak farelerde canli içi çalismalar genellikle dozaj ve iletiHi rejimlerini optimize etmeye baslayacaklari bir baslangiç noktasi saglar.

Bazi fare çalismalarinda oldugu gibi enjeksiyon sikligi, baslangiçta haftada bir kez olacaktir. Bununla birlikte, bu siklik, baslangiç klinik çalismalarindan ve belirli bir hastanin gereksinimlerinden elde edilen sonuçlara bagli olarak, bir günden iki haftaya kadar her ay en uygun sekilde ayarlanabilir.

Insan için dozaj miktarlari baslangiçta, farelerde kullanilan bilesik miktarindan ekstrapolasyon yapilarak belirlenebilir, çünkü teknikte uzman bir kisi, hayvan modellerine kiyasla insanlarin dozajini degistirmenin teknikte rutin bir islem oldugunu bilir. Bazi düzeneklerde dozajin yaklasik 1 mg bilesik/Kg vücut agirligi ila yaklasik 5000 mg bilesik/Kg Vücut agirligi arasinda; veya yaklasik 5 Hg/Kg Vücut agirligi ila yaklasik 4000 mg/Kg Vücut agirligi veya yaklasik 10 mg/Kg Vücut agirligi ila yaklasik 3000 mg/Kg Vücut agirligi; veya yaklasik 50 mg/Kg vücut agirligi ila yaklasik 2000 mg/Kg vücut agirligi arasinda; veya yaklasik 100 mg/Kg vücut agirligi ila yaklasik 1000 mg/Kg vücut agirligi arasinda; veya yaklasik 150 mg/Kg Vücut agirligi ila yaklasik 500 mg/Kg vücut agirligi arasinda degisebilecegi öngörülmektedir. Baska düzenlemelerde bu doz Kg Vücut agirligi olabilir. Diger düzenlemelerde, daha yüksek oranlarin kullanilabilecegi öngörülür, bu gibi dozlar yaklasik mg bilesik/Kg Vücut agirligi ila yaklasik 20 mg bilesik/Kg Vücut araligi arasinda olabilir. Baska düzenlemelerde, dozlar Tabii ki, bu dozaj miktari, baslangiçtaki klinik Çalismalarin sonuçlarina ve belirli bir hastanin ihtiyaçlarina bagli olarak, bu tür tedavi protokollerinde rutin olarak yapildigi gibi yukari veya asagi dogru ayarlanabilir.

Kombinasyon Tedavileri Bulusa ait bilesimler ve yöntemler, teknikte bilinen herhangi bir standart tedavi ile kombinasyon halinde uygulanabilir. Örnegin, ilave terapötik ajanlar, anti-kanser ajanlari, anti- inflamatuvar ajanlar, antikoagülanlar veya immünomodülatörler olabilir. Örnegin dideoksinükleozitler, örn., zidovudin (AZT), 2',3'-dideoksiinosin (ddI) ve 2',3'-dideoksisitidin (ddC), lamivudin (3TC), stavudin (d4T) ve TRIZIVIR (abakavir + zidovudin + lamivudin), nükleosit olmayanlar, örn., efavirenz (BMP-266, DuPont Pharmaceuticals/Bristol Myers Squibb), nevirapin (Boehringerlngleheim) ve delaviridin (Pharmacia- inhibitörleri, örn., indinavir (Merck), ritonavir (Abbott), sakinavir (Hoffmann LaRoche), nelfinavir (Agouron Pharmaceuticals), 141 W94 (Glaxo-Wellcome), atazanavir (Bristol Myers Squibb), amprenavir (GlaxoSmithKline), fosamprenavir (GlaxoSmithKline), tipranavir (Boehringerlngleheim), KALETRA (lopinavir + ritonavir, Abbott) ve 9-(2- hidroksietoksimetil)guanin (asiklovir) gibi diger ajanlar, interferon, örn., alfa-interferon, interlökin II ve fosfonoformat (Foskarnet) veya giris inhibitörleri, örn., TZO (enfuvirtide, Roche/Trimeris) veya UK-, levamisol veya timozin, sisplatin, karboplatin, dosetaksel, paklitaksel, fluorourasil, kapesitabin, gemsitabin, irinotekan, topotekan, etoposid, mitomisin, gefitinib, Vinkristin, Vinblastin, doksorubisin, siklofosfamid, selekoksib, rofekoksib, valdekoksib, ibuprofen, naproksen, ketoprofen, deksametazon, prednizon, prednizolon, hidrokortizon, asetaminofen, misonidazol, amifostin, tamsulosin, fenazopiridin, ondansetron, granisetron, alosetron, palonosetron, prometazin, proklorperazin, trimetobenzamid, aprepitant, atropin ile difenoksilat ve/Veya loperamid. Anti-trombin III, aktive edilmis Protein C ve furin inhibitörleri gibi proteaz inhibitörleri gibi antikoagülanlar.

Istenilirse, doku tamirini veya yenilenmesini indükleyen veya hücre ölümünü önleyen bir ajan, bir Ide proteini ile birlikte uygulanir. Bu tür ajanlar arasinda kök hücreler, kolajenler, fibronektinler, lamininler, integrinler, anjiyogenik faktörler, anti-inflamatuvar faktörler, glikozaminoglikanlar, Vitrojen, antikorlar ve bunlarin fragmanlari, bu ajanlarin fonksiyonel esdegerleri ve bunlarin kombinasyonlari bulunur. Bulusa ait kombinasyonlar, ayni anda veya birkaç saat, gün veya hafta içinde uygulanabilir. Bir yaklasimda, doku tamirini veya yenilenmesini indükleyen veya hücre ölümünü önleyen bir ajan, burada tarif edilen geleneksel bir terapötik maddenin uygulanmasindan önce veya ondan sonra uygulanir.

Kitler Bulus, bir Ide proteininin saflastirilmasi için kitler saglamaktadir. Bir düzenlemede, kit Idlp proteininin kromatografik saflastirilmasi için reaktifler içerir. Bazi düzenlemelerde, kit düsük pH degerine sahip bir yikama tamponu (örn., pH 3.1 ila 4.0) içeren bir steril kap içerir; bu kaplar, ampuller, siseler, viyaller, tüpler, torbalar, posetler, blister paketleri veya teknikte bilinen diger uygun kap formlari olabilir. Bu kaplar, plastik, cam veya reaktifleri tutmak için uygun baska malzemelerden yapilabilir.

Istenilirse, bulusa ait bir kit, Ide proteininin saflastirilmasi için saflastirma protokolü ile birlikte reaktifler saglar. Talimatlar genel olarak saflastirma protokolünde kullanilan tampon kosullari ve hacimleri hakkinda bilgi içerecektir. Diger düzenlemelerde, talimatlar asagidakilerden en az birini içerir: reaktiflerin tarifi veya reaktiflerin kombinasyonu; önlemler; uyarilar; bilimsel çalismalar; ve/veya referanslar. Talimatlar dogrudan ayri bir sayfa, brosür, kart veya klasör olarak veya bir kapta (mevcut oldugunda) veya kitte veya kitle birlikte verilen bir kaba etiketlenmis olarak basilabilir.

Bulus, bir denekte inter-alfa inhibitör protein (Idlp) seviyelerinin artmasi veya bir denekte sitokin, kemokin veya proteaz seviyelerinin azalmasi için kitler saglar. Bulus ayrica bir hastadaki lde düzeylerinin azalmasi vey sitokin, kemokin veya proteaz düzeylerinin a bir hastada artmasi ile baglantili bir hastaligin, bozuklugun veya semptomlarin tedavisi veya önlenmesi için kitler saglar. Hastaliklar, bozukluklar veya semptomlari arasinda akut inflamatuvar Siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik, sepsis, kanser, kanser hastalik veya erken dogum sayilabilir. Bir düzenlemede, kit etkili bir miktarda saflastirilmis Idlp içeren bir farmasötik paket içerir. Tercihen, bilesimler birim dozaj formunda bulunurlar. Bazi düzenlemelerde, kit terapötik veya profilaktik bilesim içeren bir steril kap içerir; bu kaplar, kutular, ampuller, siseler, viyaller, tüpler, torbalar, posetler, blister paketleri diger uygun kap formlari olabilir. Bu lamine kagit, knikte bilinen plastik, cam, metal folyo veya ilaçlari tutmak için uygun baska malzemelerden yapilabilir.

Istenilirse bulusa ait bilesimleri veya bunlarin kombinasyonlari, ihtiyaç duyan bir denege uygulanmasi için talimatlar ile birlikte temin edilir. Talimatlar genel olarak Idlp ile tedaviye uygun bir hastalik veya bozuklugun tedavisi veya önlenmesi için bilesiklerin kullanimi hakkinda bilgi içerecektir (örn., akut inflamatuvar romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, hastalik, sepsis, siddetli sok, enfeksiyöz hastalik veya erken dogum). septik sok, travma/yaralanma, Diger düzenlemelerde, talimatlar asagidakilerden en az birini içerir: bilesigin veya bilesiklerin kombinasyonunun tarifi; bir denekte Idlp seviyelerini arttirmak ve/Veya bir hastada sitokin, kemokin veya proteaz seviyelerini azaltmak için dozaj çizelgesi ve uygulama; akut inflamatuvar hastalik, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik ya da erken dogum ya da semptomlarinin tedavisi için dozaj çizelgesi ve uygulama; önlemler; uyarilar; endikasyonlar; kontrendikasyonlar; doz asimi bilgisi; ters tepkiler; hayvan farmakolojisi; klinik çalismalar; ve/veya referanslar. Talimatlar dogrudan kabin üzerine (mevcut oldugunda) yazdirilabilir` veya kaba yapistirilan bir etikete veya kabin içine veya içinde bulunan ayri bir tabaka, brosür, kart veya klasör olarak yazdirilabilir.

Bulus ayrica bir numunede inter-alfa inhibitör proteininin (Ide) analizine yönelik kitler saglar. Bir düzenlemede, kit bilinen bir miktarda saflastirilmis Idlp içerir. Bilinen miktarda saflastirilmis Idlp, bilinmeyen Ide konsantrasyonunun bir numunesinde Idlp ölçümü için analitik bir referans olarak kullanilabilir. Tercihen, bilesimler alikuotlar olarak bulunurlar. Bazi düzenlemelerde, kit saflastirilmis Idlp'nin bir alikuotunu içeren bir steril kap içerir; bu kaplar, kutular, ampuller, siseler, viyaller, tüpler, torbalar, posetler, blister paketleri veya teknikte bilinen diger uygun kap formlari olabilir. Bu kaplar, plastik, cam, lamine kagit, metal folyo veya bilesikleri veya çözeltileri tutmak için uygun baska malzemelerden yapilabilir. Diger düzenlemelerde, talimatlar asagidakilerden en az birini içerir: bilesigin veya bilesiklerin kombinasyonunun tarifi. Talimatlar dogrudan kabin üzerine (mevcut oldugunda) yazdirilabilir veya. kaba. yapistirilan. bir etikete veya kabin içine veya içinde bulunan ayri bir tabaka, brosür, kart veya klasör olarak yazdirilabilir. ÖRNEKLER Örnek 1. Ide, düsük pH tamponu ile yikanmayi içeren tek bir kromatografik adimda saflastirildi.

Tek bir kromatografik adim kullanilarak insan plazmasindan elde edilen Idlp'nin saflastirilmasi için bir sema düsük bir pH yikamasini içerir (Sekil 1A). Kriyo-fakir plazmadan Idlp'yi saflastirmak için düsük pH'li bir yikama adimina sahip olan lde saflastirma protokolü kullanildi. Kriyo-fakir plazma (25 mM Tris + 200 mM NaCl'de lle'luk seyreltme, pH 7.6'de; 0.2 uM filtrelenmistir). Seyreltilmis plazma (elli (50) kolon hacmi), dakikada biri 5 kolon hacmi (cv) akis hizinda ticari olarak ulasilabilen 1 mL DEAE monolitik kolonuna (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) uygulandi. Kolonun baglama kapasitesinin, l mL'lik kolon hacmi basina yaklasik 50 mL seyreltilmis plazma olmasi öngörülmüstür. Akis toplandi. Baslangiç malzemesinin kolondan tamamen geçmesine izin vermek için kolana ilave plazma seyreltme tamponu (20 kolon hacmi 25 mM Tris, uygulanmistir. Akisin tepe noktasi taban çizgisine döndügünde, kolon yikama tamponuyla (5 kolon hacmi 150 mM Asetik asit, pH 4.0 veya yikandi ve tepe toplandi.

Düsük pH'li yikamadan sonra kolon, elüsyona hazirlanirken düsük pH'li yikamadan önce (15 kolon hacmi 100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.6) pH degerinin arttirilmasi için bir tampon ile yikanmistir.

Baglanan protein, yüksek bir tuzlu elüsyon tamponu (15 kolon hacmi 25 mM Tris, ile elute edilmistir.

Tepe toplandi ve bu fraksiyon son derece saf Idlp içeriyordu.

Tamponu degistirmek ve düsük molekül agirlikli çözücü ve tuzlari uzaklastirmak için, ultrafiltrasyon veya diyafiltrasyon, 30 kDa'lik bir kesilmis membran kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Saflastirilmis Ide ayrica liyofilize edilebilir. Üç ayri yikamada üç farkli yikama tamponu kullanilarak DEAE monolitik kromatografiyle özdes plazma miktarlarinin fraksiyonlanmasi, Ide proteininin saflastirilmasi için yikama adimi sirasinda pH degerinin düsürülmesinin etkisini belirlemek için kullanildi. Düsük pH'li bir yikama (pH 7.6) kullanilmadan DEAE monolitik kromatografi ile plazmanin fraksiyonlanmasi, 1000 mM NaCl (pH 7.6) (Sekil 2A) ile elute edildiginde nispeten büyük bir tepenin elüsyonuna yol açmistir. Saflastirilan Ide, %10 ila %15 arasinda bir saflikla %95 Ide'den daha büyük bir verime sahipti. Düsük bir pH yikamasinin (pH 4.0) uygulanmasi, 1000 mM NaCl (pH 7.6) ile elüsyondan önce düsük pH yikamasiyla baska kontaminantlarin ayrilmasini gösteren büyük bir tepe ile sonuçlanmistir. Yaklasik %95 Ide elute edilen fraksiyonda, %40 ila %50 arasinda bir saflik (Sekil 2B) ile geri kazanilmistir.

Yikama adiminin pH degeri pH 3.3'e düsürülmesi, pH 4.0'a kiyasla elüsyon tepesinin boyutunda bir azalmaya neden olmustur (Sekil 2C). Elüsyondan elde edilen verim, %80 ila %90 (Sekil 2C) safliginda yaklasik %90 Idlp olmustur. Bu çalismalar, yikama adimi sirasinda pH degerini düsürmek, yerimde daha az saflik ile Kriyo-fakir plazma, DEAE monolitik kromatografisi ile ayrildi, iki düsük pH yikama tamponu (150 mM Asetik Asit, pH 4.0 ve 200 mM Asetik Asit, pH 3.3) kullanilarak, proteinlerin fraksiyonlanmasi üzerindeki etki incelendi (Sekil 3). Her bir düsük pH yikamasi, bir miktar proteinin kolondan uzaklastirilmasiyla sonuçlandi. Iki düsük pH yikama tamponu uygulamasina karsilik gelen iki tepe gözlendiginden, bu sonuç pH 3.3'te ikinci bir düsük pH yikamasinin pH 4.0'da birinci düsük pH yikamasiyla uzaklastirilamayan kontaminantlari daha da uzaklastirabilecegini gösterdi. Baslangiç malzemesi olarak Fraksiyon D ve Fraksiyon C kullanildiginda, ikinci bir düsük pH yikama adimi ile diger proteinlerin uzaklastirildigini gösteren benzer sonuçlar gözlemlenmistir (Sekil 4A-4D).

DEAE monolitik kolon kromatografisi ile Fraksiyon D baslangiç maddesinden lde proteininin saflastirilmasindan elde edilen fraksiyonlar da Western blot yöntemi ile analiz edildi (Sekil ). Birinci düsük pH yikamasinda ( kolondan bagimsiz hale geldi ve baglanmamis halde elute edildi.

Bununla birlikte, saflastirilmis Ide protein miktari, eluatta tespit edildi. Iki düsük pH yikamasi kullanilarak DEAE monolitik kolon kromatografisi ile Fraksiyon (3 baslangiç inalzemesinden gözlemlenmistir.

DEAE monolitik kolon kromatografisi (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) ile iki düsük pH yikama asamasi (pH 4-0 ve pH 3-3) kullanilarak Fraksiyon D baslangiç maddesinin ayrilmasindan elde edilen fraksiyonlar için verim ve saflik miktarlari da belirlenmistir Toplam Toplam IaIp'nin %'si Toplam Protein IaIp (saflik) IaIp'nin %'si (mg) (mg) (Verim) Baslangiç 48.0 13.6 %26 - Maddesi Fraksiyonlarin analizi, baslangiç maddesi içindeki lde'nin >%99'unun, kolonun 25mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.6'da, toplam Ide'nin yaklasik %0.007'si kadar fazla oldugu akista göstermistir. Kolona birinci yikama adiminin (150 mM Asetik Asit, pH 4.0) uygulanmasi, Ide kaybi ile (%4.4 toplam Ide) büyük miktarda kontaminantin (~%50 toplam. protein) giderilmesiyle sonuçlanmistir. Kolona ikinci yikama adiminin (200 mM Asetik Asit, pH 3,3) uygulanmasi, kabul edilebilir Ide kaybi ile (%15 toplam Ide) büyük miktarda kontaminantin (~%l9 toplam protein) daha fazla giderilmesiyle sonuçlanmistir. Geri kalan bagli proteinin yüksek tuz (25 mM Tris + ile elüsyonu, toplam Idlp'nin %76'sini %90 oraninda saflastirmistir.

Fraksiyonlarin analizi, benzer fraksiyonlarin Western blot analizi ile iliskilidir (Sekil 5). Bu analiz, Ide'nin düsük bir pH tamponu ile yikanmasindan sonra tek bir kromatografik adimda büyük ölçüde saflastirildigini göstermektedir. Örnek 2. Düsük bir pH yikama adimiyla IuIp proteininin kromatografik saflastirilmasi ölçeklendirilebilir.

Düsük pH yikama adimiyla Ide saflastirma protokolünün, daha büyük bir kolon hacmine kadar ölçeklendirilip ölçeklenemeyecegini belirlemek için, kriyo-fakir plazma ve ara plazma fraksiyonlarinin kromatografisi (Fraksiyon D ve Fraksiyon C), 8 ml DEAE monolitik bir kolon üzerinde gerçeklestirildi. UV, kriyo-fakir plazma ve 1 ml DEAE monolitik kolon üzerinde ayrilmis ara plazma fraksiyonlarina benzerdi. (Sekil 6A, 6C, ve 6E). Her bir kromatografik ayirmadan elde edilen fraksiyonlar, denatüre edici olmayan SBS-PAGE ile ayrica analiz edildi (Sekil 6B, 6D ve 6F). Çesitli baslangiç malzemelerinin saflastirilmasi için elüte edilen fraksiyonlar, IgIp proteininin moleküler agirliklarina karsilik gelen 250 kDa ve 125 kDa bantlarinin varligini gösterdi.

Bu nedenle, Idlp saflastirmasi, daha büyük bir kolon hacmine 8 kat büyütülebilir. Sonuçlar, Ide proteininin daha düsük bir ölçekte (örnegin düsük pH yikama yöntemi ile saflastirilabilecegini göstermektedir. Örnek 3. Düsük bir pH yikama adimi ile saflastirilan IaIp proteini, kompetitif bir ELISA tahlilinde antikorun insan DEAE monolitik kolon kromatografisi ile saflastirilan IgIp miktarini ve kalitesini belirlemek için, düsük pH'li bir yikama ile, her iki kosulda saflastirilan Idlp konsantrasyonlari, Lim ve ark. (J. Enfeksiyon Hastaliklari, 2003) tarafindan tarif edildigi gibi MAb 69.31 kullanilarak kompetitif bir Enzime Bagli Bagisiklik Tahlili (ELISA) ile analiz edilmistir. Saflastirilmis fraksiyon, ayrica toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için ticari olarak ulasilabilen bir bisinkoninik asit (ECA) protein testi ile kanitatif olarak ölçülmüstür. Sasirtici bir sekilde, kompetitif ELISA ile ölçülen saflastirilan Idlp için BCA protein tahlili ile ölçülen toplam protein konsantrasyonundan bile daha yüksekti. Düsük pH'li yikama kullanilarak saflastirilan Ide, kolonda yüklenen baslangiç malzemesinin esdeger bir miktarina veya düsük bir pH yikama kosulu kullanilmadan esdeger miktarda Idlp ile saflastirilana kiyasla, öngörülen. %300 daha yüksek. bir konsantrasyona sahip olmak için kompetitif ELISA'da gözlenmistir.

Kompetitif ELISA'da arttigi görülen Ide konsantrasyonu, pH 3.6 ve 3.3'ün düsük pH yikama kosullari kullanilarak saflastirilmis kullanilarak Idlp için saflastirilmadigi gözlenmistir.

Toplam protein, kompetitif ELISA ile tahlil edilen numunelerde sabit kaldigindan, bu sonuç, saflastirma sirasinda bazi degisikliklerin, hatta aktivasyonun tetiklenebilecegini ortaya koymustur. Herhangi bir özel teoriye bagli kalmaksizin, Ide'nin aktif bölgesinin düsük pH kosullarina maruz kaldigina inanilmaktadir. Kompetitif ELISA'da kullanilan MAb 69.31 antikoru, moleküllerin aktif bölgesinde bulunan bir epitopu tanir. Aktif bölge maruz kalirsa, ölçülmüs olan protein miktari kontrol edilirken, kompetitif ELISA'dan elde edilen konsantrasyon, düsük. pH kosullari altinda saflastirilan Idlp için belirgin sekilde artacaktir. Bu nedenle düsük pH kosullari, aktiviteyi arttirabilir. lde'nin inhibe edici aktivitesinin düsük pH kosullari ile degistirilip degistirilmedigini belirlemek, Idlp'nin biyolojik aktivitesi, kromojenik substrat L-BAPA (N(alfa)-Benzoil-L- arjinin-4-nitroanilid hidroklorürü (Fluka Kimyasallari) kullanarak bir tripsin inhibisyon tahlili ile ölçüldü. Bu tahlil, lde'nin L-BAPA'nin hidrolizini inhibe etme kabiliyetine dayanan spesifik inhibe edici aktiviteyi ölçer. Inhibisyon 410 nm'de A absorbans/dakika oraninda bir azalma ile izlenebilir. Düsük pH'li yikama ile saflastirilan Ide'nin spesifik inhibe edici aktivitesi hesaplandi ve düsük pH'li yikama olmadan saflastirilan Idlp ile karsilastirildi. Kromatografi sirasinda düsük pH kosullari (yani, yaklasik 3.3'ün üzerindeki pH), düsük pH kullanilmadan saflastirilan Idlp ile karsilastirildiginda saflastirilmis Idlp'nin biyolojik aktivitesini inaktive etmedi veya düsürmedi. Bu sonuçlar, düsük. pH'li yikama adimi ile saflastirilan Ide'nin, en azindan düsük pH kosullarini kullanmadan saflastirilan biyolojik olarak aktif oldugunu göstermektedir. Örnek 4. IaIp, tuz içeren tampon ve düsük pH tamponu ile yikanmayi içeren tek bir kromatografik adimda saflastirildi.

Tek bir kromatografik adim kullanilarak insan plazmasindan elde edilen Ide'nin saflastirilmasi için bir sema, tuz tamponlu bir yikama adimi ve düsük pH'li bir yikama adimi içerir (Sekil lB).

Kriyo-fakir plazmadan ldlp'yi saflastirmak için tuz tamponlu bir yikama adimi ve düsük pH'li bir yikama adimina sahip olan lde saflastirma protokolü kullanildi (Sekil 7A). Kriyo-fakir plazma kolon hacmi; . Seyreltilmis plazma dakikada bir 2.5 kolon hacmi (cv) akis hizinda ticari olarak ulasilabilen 8 mL DEAE monolitik kolonuna (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) uygulandi. Akis toplandi. Baslangiç malzemesinin kolondan tamamen geçmesine izin vermek için kolana ilave yükleme tamponu (7 kolon hacmi 25 mM Tris, uygulanmistir. Akisin tepe noktasi taban çizgisine döndügünde, kolon tuz içeren yikama tamponuyla (lO kolon hacmi 40mM Tris- HCl, 290mM NaCl, pH 7.6) yikandi ve tepe toplandi. Tuzla yikamadan sonra kolon ek olarak düsük bir pH tamponu (10 kolon hacmi 200mM Na-Asetat, pH 2.95) ile yikandi ve tepe toplandi.

Takip eden ikinci yikamadan sonra, baglanmis protein, yüksek tuz NaCl) ile elute edilmistir. Tepe toplandi ve bu fraksiyon son derece saf Idlp içeriyordu.

Ara plazma fraksiyonundan (Fraksiyon D) Ide'yi saflastirmak için tuz tamponlu bir yikama adimi ve düsük pH'li bir yikama adimina sahip olan Ide saflastirma protokolü kullanildi (Sekil 7B). Ara plazma fraksiyonu (2.5 kolon hacmi, 40 mM Tris + 200 mM NaCl içinde 1:10 seyreltme, pH 7.6; , dakikada bir 2.5 kolon hacmi (cv) akis hizinda ticari olarak ulasilabilen 8 mL DEAE monolitik kolonuna (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) uygulandi. Akis toplandi. Baslangiç malzemesinin kolondan tamamen geçmesine izin vermek için kolona yükleme tamponu uygulanmistir. Akisin tepe noktasi taban çizgisine döndügünde, kolon tuz içeren yikama tamponuyla (lO kolon hacmi 40mM Tris-HCl, 290mM NaCl, pH 7.6) yikandi ve tepe toplandi.

Tuzla yikamadan sonra kolon ek olarak düsük bir pH tamponu (10 kolon hacmi 200mM Na-Asetat, pH 2.95) ile yikandi ve tepe toplandi. Takip eden ikinci yikamadan sonra, baglanmis protein, yüksek tuz elüsyon tamponu (5 kolon hacmi 40mM Na-Sitrat pH 6.50, ile elute edilmistir. Tepe toplandi ve bu fraksiyon Tuz içeren bir tampon yikama adimi ( ve düsük pH yikama adimi (pH 2.95) kullanilarak DEAE monolitik kolon kromatografisi (DEAE-CIM; BIA Ayrimlari) ile Fraksiyon D baslangiç maddesinin ayrilmasindan elde edilen fraksiyonlar için verim ve saflik miktarlari da belirlenmistir (Tablo 2).

Toplam Toplam Toplam Protein IaIp IaIp'nin %'si (saflik) _ (mg) (mg) (Verim) Baslangiç 28.7 5.6 %19.5 - Maddesi Akis 0.2 n.d. n.d. - Tamponlu 9.0 0.38 %4.2 %6.8 (n.d = algilanamaz) Bu analiz, düsük pH'li bir tampon yikama adimini içeren bir saflastirma protokolüne bir tuz tamponu yikama adiminin eklenmesinin, bir plazma fraksiyonundan Idlp'nin %88.2 verimle saflastirildigini göstermektedir. Tablo l'in sonuçlarina kiyasla, düsük pH'li bir tampon yikama adimini içeren bir saflastirma protokolüne bir tuz tamponu yikama adiminin eklenmesi, plazma veya bir plazma fraksiyonundan saflastirilan Ide verimini Bunlara ek olarak, iki yöntemin fraksiyonlarinin SBS-PAGE analizi, düsük bir pH yikama adimi (pH 2.95) gerçeklestirildiginde, elüte edilmis fraksiyonda bir ~75 kDa ila 80 kDa bandin varligini gösterdi, ancak bir tuz yikama adimi ( her ikisi de gerçeklestirildiginde göstermedi (Sekil 8). Bir tuz yikama adimi ve düsük pH'li bir adim ile Idlp saflastirma protokolünün elute edilmis fraksiyonu, inter-alfa inhibitörüne ( ve pre- alfa inhibitörüne ( karsilik gelen iki protein bandindan olusmustur. Bu nedenle, saflastirilmis protokol bir tuz yikama adimi ve düsük pH'li bir adim içerdiginde, elute edilmis fraksiyon yüksek derecede saf Ide içerir.

Kriyo-fakir Plazma veya Ara Plazma Fraksiyonlari i çözeiti/Temizieyici DEAE-CIM Düsük pH'li yikama Elüsyon Ultraf'iltrasyon veya Diyafiltrasyon Nanofiltrasyon Liyof'i Iizasyon Kriyo-fakir Plazma veya Ara Plazma Fraksiyonlari l ÇözeltilTemizIeyici DEAE-CIM Tuz tamponu yikamasi Düsük pH”li yikama Elüsyon Ultrafiltrasyon veya Diyafiltrasyon Nanofiltrasyon Liyofil izasyon Sekil 1,in devami .-5.1__ \_ ç `. ` 1 \` "i-'L __ . L ... Akis Yikama pH 33 1757 '. p : ..

Llkama Tamponu s Yikama Tamponuisf Tam ponu \ 4 .L ;'JL'MQ \-~M__ia ,.

Elüsyon .4.:. \ Yikama Tamponu Elüsyon i I " B A ..› Yikama Tamponu #1 Yikama Tamponu ll Elüsyon , i mi 5.“ u i:;i i; tozu (:'OILZW v4; _ \_ u Ihrki Sekil 4*ün devami 4F 3F-D4/FT &2% 250 !(08 mm 5_ 5..." mg::: W" 1 ' ;iiwcg'm ' __ 1.50- Yikama Akis Tamgâonu 125.. v.-- --P'n 100.. .1. j 075 - , 0.50.. -i , TI 0 25 î :' 5 I Elusyon 0.00.._'I \._i `M -~- _Né/"khm v . Jk. 10 15 20 mm 100", 0.75“: Sekil 6'nin devami Tamponu 1& YIkamaTamponu Tampyonu 10 15 20 mm /12 Tamponu 0.50.- I I Elüsyon l Tamponu - 0.25,,l | F ; - î YIkamaTamponu ?I 15 20 min Sekil 6'nin ' _. devami Absorbaris 280 nm] Absorbans 280 nm] 11/12 ~ Kondüktibilrte DÜ Ük H'Ii Yikama i `213% wa& i` * I f m a ) Düsük %H'Ii Yikama li 1.): II. 1 IJ` n 11 L_ ll` " 4.0 Pin ;I 12/12 Tuz & Düsük Sadece Düsük yikama süreci yikama süreci Std pH Tuz Elüs- pH Elüs- l 3,34”- 220 .l I ”- - _i- (_ '(1' 120 -I . b -! »N Ara Plazma D Fraksiyonunun saflastirimasi SDS PAGE Std MW = Standart Moleküler Agirlikli Proteinler pH yikama = Yikama tamponu pH 2.95 Tuz Yikama = 290 mM NaCl içeren yikama tamponu Elüsyon = 1000 mM NaCl içeren elüsyon tamponu Oklar - 250 kDa Inter-alfa inhibitör ve 125 kDa Pre-alfa inhibitör

Claims

ISTEMLER

1. Inter-alfa inhibitör proteinlerini (Idlp proteinleri) saflastirmak için bir yöntem olup, özelligi; yöntemin asagidakileri içermesidir: bir kromatografi adiminda veya bir kati faz özütleme adiminda, kandan türetilen Ide proteinlerinin, bir kan plazma fraksiyonu veya bir ara plazma fraksiyonunun bir immobilize edilmis anyon degisim ligandini içeren bir monolitik veya partikül bazli destege baglanmasi; ve yikama adiminda, Ide proteinlerinin, 3.6 veya daha düsük bir pH'a sahip olan bir yikama tamponuna maruz birakilarak destege baglanmasi.

2. Istem l'e göre yöntem olup, özelligi: a) yikama tamponunun 3.3 veya daha düsük bir pH degerine sahip olmasi, tercihen, burada yikama tamponunun yaklasik 3.3 ila yaklasik 2.9 arasinda bir pH'a sahip olmasi; ve/Veya b) yikama tamponunun yaklasik 250 mM NaCl veya daha yüksek bir tuz konsantrasyonuna sahip olmasi; ve/Veya c) kromatografi adiminin, tercihen immobilize edilmis anyon degisim, ligandinin bir dietilaminoetanr (DEAE) veya bir kuaterner amin (Q) oldugu sivi kromatografisi, kolon kromatografisi, anyon degisim kromatografisi veya bunlarin bir kombinasyonunu içermesidir.

3. Istemler 1 ila Z'den herhangi birine göre yönteme olup, özelligi: a) Ide proteinlerinin kandan saflastirilmasi, tercihen, fraksiyonundan saflastirilmasi, tercihen kan plazmasinin kriyo-fakir plazma olmasi veya kan plazma fraksiyonunun bir ara plazma fraksiyonu olmasi, tercihen, ara plazma fraksiyonunun bir Ide içeren fraksiyon olmasi, tercihen kanin, kan plazma fraksiyonunun veya ara plazma fraksiyonunun insan, primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi, köpek veya bunlarin kombinasyonlari olmasi ve/veya b) Ide proteinlerinin yaklasik 60 kDa ila yaklasik 280 kDa arasinda bir molekül agirligina sahip olmasi, tercihen Ide proteinlerinin biyolojik aktiviteye sahip olmasi, tercihen biyolojik aktivitenin bir sitokin inhibitör aktivitesi, kemokin inhibitör aktivitesi veya bir serin proteaz inhibitörü aktivitesi olmasidir.

4. Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre yöntem› olup, özelligi; yöntemin yaklasik %85 ila yaklasik %100 lde proteinleri arasinda bir verime sahip olmasi, tercihen ayrica bir viral inaktivasyon adimi veya nanofiltrasyon adimi içermesi, tercihen viral inaktivasyon adiminin veya nanofiltrasyon adiminin, kromatografi adimindan Önce meydana gelmesi, tercihen Viral inaktivasyon adiminin veya nanofiltrasyon adiminin kromatografi adimindan sonra meydana gelmesidir.

5. Istemler 1 ila 4'e ait yönteme göre saflastirilmis Idlp proteinlerini içeren bir bilesim› olup, özelligi; bahsedilen bilesimin, %85 ila %100 arasinda degisen ve bir insana uygulama için uygun olan bir Idlp proteinleri safligina sahip olmasi ve bir yikama tamponuna maruz birakilmayan Idlp proteinlerine kiyasla kompetitif bir Enzime Bagli Bagisiklik Tahlilinde (ELISA) bir anti- Idlp antikorunar artan Ibaglanmayar sahip olmasi ile karakterize edilmesidir.

6. Bilesim olup, özelligi; Istem 5'in bilesiminin etkili bir dozunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan içermesidir.

7. Istem 6'ya göre farmasötik bilesim olup, özelligi; ihtiyaç duyan bir denegin tedavisinde kullanilmasi, tercihen ihtiyaç duyan denegin insan, primat, sigir, at, domuz, koyun, kedi veya köpek olmasi, tercihen ihtiyaç duyan denegin akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid artrit, kanser, kanser metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik veya erken dogum için tedaviye ihtiyaç duyulan bir insan olmasidir.

8. Istem 5'e göre bilesim olup, özelligi; bir hastada hastalik veya hastalik semptomlarinin tedavisinde veya önlenmesinde kullanim için olmasidir.

9. Istem 8'e göre kullanim için bilesim olup, Özelligi; denegin akut inflamatuvar hastalik, sepsis, siddetli sok, septik sok, romatoid. artrit, kanser, kanser* metastazi, travma/yaralanma, enfeksiyöz hastalik 'veya erkenr doguma için tedaviye ihtiyaci oldugunun tanimlanmasidir.

10. Istem 5'e ait bilesimin talimatlarini içeren bir kit olup, özelligi; kitin terapötik kullanim veya analitik kullanim için talimatlari içermesidir.

11. Istem 5'e göre bilesim olup, özelligi; kompetitif ELISA'daki baglanmanin, 3.6 ya da daha düsük bir pH'a sahip olan bir yikama tamponuna maruz kalmayan Ide proteinlerine kiyasla 1.5-, 2-, 3-, 4-, 5- ya da 10- kat daha fazla artirilmasidir.

12. Kit olup, özelligi; istem ll'in ldlp protein bilesimini ve analitik kullanim için talimatlari içermesidir.

13. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; bahsedilen yöntemin kan, kan plazma fraksiyonu veya ara plazma fraksiyonunun destek üzerine yerlestirilmesini içermesidir.