JP6324974B2 - タウの毒性オリゴマー形態を特異的に認識する抗体ベースの試薬 - Google Patents

タウの毒性オリゴマー形態を特異的に認識する抗体ベースの試薬 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、参照によって本明細書に取り込まれる２０１２年１０月１２日に提出された米国仮特許出願６１／７１３，４４１号に基づく優先権を、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより主張する。
アルツハイマー病（ＡＤ）の毒性種として、Ａβの小さな可溶性オリゴマー凝集体が多くの研究によって示唆され、ＡＤおよび前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）等のその他のタウオパチーの病因に直接的な役割を有するものとしてタウのオリゴマー形態を示唆する証拠も増加している。Ａβ研究の焦点が可溶性Ａβ種および機序にゆっくりと移行するにつれて、存在する様々な異なる凝集種を特異的に識別することができる新たな試薬が必要とされた。実際、ＡＤにおけるＡβ凝集の役割に関する多くの矛盾した研究が報告され、存在する凝集種を特徴づけるために適切に選択的な試薬を利用することができなかったため、進展を妨げていた。タウの線維状形態よりオリゴマー形態のほうが毒性があり、神経変性と相関していることを示す証拠が細胞および動物モデルから増え、ヒトの脳に存在するタウの形態の多様性を特異的に認識することができる十分に特徴付けられた試薬が、疾患のバイオマーカーとして使用するために、最も有望なタウ種を識別し、毒性機序の研究を推進するために極めて必要とされている。
微小管に関連するタンパク質であるタウは、ＡＤおよびタウの過剰リン酸化および凝集を特徴とするタウオパチーに関連付けられる神経原線維変化の主要な成分である。タウは、微小管の構築および安定化に重要な役割を果たしている。タウは、元々折り畳まれていないタンパク質であり、元々折り畳まれていないいくつかの他のタンパク質と同様であり、βシートが豊富な線維状形態を含む様々な凝集形態に異常に折り畳むことができる。ＡＤにおけるタウの翻訳後修飾の異なるタイプとして、リン酸化、グリコシル化、糖化、プロリル異性化、開裂または切断、ニトロ化、ポリアミノ化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、酸化および凝集が挙げられる。タウは、８５個の推定のリン酸化部位を有し、過剰なリン酸化が微小管の構築を妨害し得る。タウは、リン酸化により、またはとりわけ反応性窒素および酸素種により修飾することができる。様々なリン酸化タウ形態が存在し、およびＡβ４２に対するタウの比があるため、ＣＳＦ中のタウの総濃度の上昇は、ＡＤと相関している。反応性窒素および酸素が、オリゴマー種を含む凝集形態のタウ促進形成を修飾することができる。オリゴマータウのレベルも、ＡＤの早期診断の可能性として関与している。したがって、総タウ、リン酸化タウおよびオリゴマータウ濃度の測定はすべて、タウオパチーおよびＡＤを含む神経変性疾患の診断として潜在的価値を持っている。
タウは、投影領域、基本的なプロリンリッチ領域、および構築領域を含む非常に低い疎水含有量による本質的に非構造タンパク質である。タウの反復領域中のヘキサペプチドモチーフは、微小管を形成するためにチューブリンとの相互作用を促進し、および対せん状細線維（ＰＨＦ）等の病理学的凝集体を形成するために自己相互作用を促進するβシート構造を形成する傾向を、タンパク質に与える。特に構築領域のタウの過剰リン酸化は、微小管に対するタウの親和性を減少させ、微小管動態および軸索輸送を調節する能力を損なう。さらに、また、基本的なプロリンリッチ領域および擬似反復の部分も、その負に荷電した表面と相互作用することによって微小管を安定させる。タウの第２、第３および第１０エキソンの選択的スプライシングによって、ＣＮＳで長さを変える６個のタウアイソフォームが生じる。タンパク質のカルボキシル末端部分の構築領域は、エキソン１０の選択的スプライシングに応じて保存されたチューブリン結合モチーフの３つまたは４つの反復（３Ｒまたは４Ｒ）のいずれかが含まれている。タウ４Ｒアイソフォームは、３Ｒアイソフォームより、より大きな微小管結合および安定した能力を有する。３Ｒタウだけが胎児の段階で発現されるのに対し、ヒト成人の脳は、同じようなレベルの３Ｒと４Ｒのアイソフォームを有する。タウオパチーでは、タウ転写物のスプライシングおよび４Ｒタウアイソフォームに対する３Ｒの比を変化させる変異は、神経変性疾患を引き起こすのに十分である。したがって、ヒト脳組織のタウは、種々の異なる長さおよび形態で、複数の翻訳後修飾で存在することができる。
タウはＡＤの病因に重要な役割を果たしており、ＡＤ動物モデルにおけるタウのレベルの減少が、疾患表現型を逆転させ、Ａβの過剰発現により引き起こされるＡＤモデルにおける認知障害の進行にタウが必要であることを研究は示している。ＮＦＴがＡＤおよびタウオパチーにおける神経変性の媒介に関係してきたが、タウオパチーの動物モデルは、記憶障害およびニューロン損失はＮＦＴの蓄積とそれほど関連がないことを示している。動物研究は、ＮＦＴの蓄積、ニューロン損失およびＮＦＴ病理の地理的分離、並びに海馬のシナプスの喪失および機能不全および原繊維タウ封入体の蓄積の数ヶ月前にミクログリアの活性化があったにもかかわらず、記憶およびニューロン損失の低減に改善があることを示した。ＡＤの進行に最も密接に関連するタウの病理学的構造は、タウオリゴマーである。これら全ての研究は、タウのもつれが急性神経毒性ではないが、むしろプレタングルオリゴマータウ種が、オリゴマーＡβ種の毒性の役割と同様の神経変性表現型の原因であることを示唆している。
多くの研究は、細胞外タウ種が疾患進行の「感染」モデルによって神経毒性に寄与することを示唆している。例えば、タウ病理が早期から後期疾患にかけて脳全体に連続的に広がり、細胞外タウ凝集体は、細胞の外側から内側にタウの誤った折り畳みを伝播させることができ、凝集された変異ヒトタウを伴うトランスジェニックマウスからの脳抽出物が、正常なヒトのタウを発現するマウスの場合では、脳全体にタウ病理を送り、凝集前ヒトタウの誘導は、タウ凝集体およびヒトと正常なマウスのタウの両方から成るもつれ（共凝集）の形成を誘導し、ＡＤのＣＳＦでは、Ａβレベルが減少するのに対し、タウのレベルが上昇する。細胞外タウによるタウ病理の広がりについて受容体媒介性機序を記載している。
まとめると、これらの研究はすべて、細胞内および細胞外の両方のタウの凝集したオリゴマー種が、ＡＤおよび他のタウオパチーに極めて重要であることを示している。疾患の個々のタウの形状の役割をより明確に定義するために、個々の標的形態を選択的に認識する一連の明確に定義された試薬を開発する必要があり、どのタウの形状がＡＤにとって最良のバイオマーカーであるか、どの形状が細胞内および細胞外の両方の毒性に関与しているか、並びに脳組織およびＣＳＦ試料のどの形状が、健常者とＡＤ患者を区別することができるかを識別するためにこれらの試薬を使用する必要がある。
したがって、特異的にタウオリゴマーを標的にすることができる試薬は、ＡＤ、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーおよび外傷性脳損傷後の神経変性の診断および治療応用に貴重なツールとなる。
したがって、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチー、外傷性脳損傷後の神経変性の治療のための新たな治療法および試薬が必要とされ、特に、生理学的用量（例えば非毒性）で治療および診断の利益をもたらすことができる治療法および試薬が必要とされる。
本発明は、オリゴマータウを特異的に認識するが、単量体のタウ、原繊維タウまたは非疾患関連形態のタウと結合しない抗体または抗体断片を開示する。「オリゴマータウを特異的に認識する」とは、本明細書に使用するとき、非特異的タンパク質と結合しないまたは認識しないことを示す。用語「抗体」は、本明細書に使用するとき、ｓｃＦｖ（「ナノボディー」とも呼ばれる）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。用語「オリゴマー」は、本明細書に使用するとき、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、ウンデカマーまたはドデカマーを意味する。したがって、特定の実施形態では、オリゴマータウは、二量体タウ、三量体タウ、四量体タウ、五量体タウ、六量体タウ、七量体タウ、八量体タウ、九量体タウ、十量体タウ、十一量体タウまたは十二量体タウである。特定の実施形態では、オリゴマータウは、二量体タウまたは三量体タウである。特定の実施形態では、オリゴマータウは三量体タウである。特定の実施形態では、オリゴマーは可溶性である。
特定の実施形態では、抗体断片は、抗体の定常ドメインの領域を含まない。
特定の実施形態では、抗体断片は、長さが２００〜４５０アミノ酸、または長さが４００未満のアミノ酸等、長さが５００未満のアミノ酸である。
本発明の特定の実施形態は、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体断片を提供する。特定の実施形態では、抗体断片は、配列番号１、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
本発明の特定の実施形態は、オリゴマータウに結合し、単量体のタウ、原繊維タウまたは非疾患関連形態のタウと結合しない結合分子を提供し、結合分子は、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９の配列を含む。特定の実施形態では、結合分子は、配列番号１、配列番号９、または配列番号１１の配列を含む。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の抗体または抗体断片を提供し、当該抗体断片は、以下のステップを含む方法に従って単離される。
ａ． ｓｃＦｖファージライブラリのネガティブパニングであって、当該ネガティブパニングが望まない抗原と結合するファージを取り除き、当該ネガティブパニングは、ファージを、
（ｉ）一般的なタンパク質、および
（ｉｉ）タウの単量体形態、と連続的に接触させ、
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を使用して、前記ファージと一般的タンパク質およびタウの単量体形態との結合をモニターし、当該ＡＦＭによって抗原と結合するファージを観察しなくなるまで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し、一定分量のファージを産生し、
ｂ． 一定分量のファージをタウオリゴマーと接触させ、前記オリゴマーへのファージの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートし、並びに
ｃ． 結合したファージ粒子をステップ（ｂ）から溶出する。
本発明の特定の実施形態は、以下のステップを含む方法に従って単離された抗体または抗体断片を提供する。
（ａ） ファージを、
（ｉ）一般的なタンパク質、および
（ｉｉ）タウの単量体形態、と５％未満のファージが抗原と結合していることが観察されるまで連続的に接触させることを含む、ｓｃＦｖファージライブラリのネガティブパニングをし、
一定分量のファージを産生し、
（ｂ） ステップ（ａ）からの一定分量のファージをタウオリゴマーと接触させることを含むステップ（ａ）からのアリコットをポジティブパニングし、脳に由来する前記タウオリゴマーとファージが結合するのに十分な時間インキュベートし、並びに
（ｃ） 結合したファージ粒子をステップ（ｂ）から溶出する。
特定の実施形態では、ポジティブパニングに使用されるタウオリゴマーは、三量体タウ４Ｎ１Ｒある。
特定の実施形態では、一般的なタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
特定の実施形態では、ネガティブパニングは、さらにファージを、オリゴマータウを含まない脳由来の対照試料と連続的に接触させることを含む。
特定の実施形態では、抗原へのファージの結合の観察は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を使用することによる。特定の実施形態では、０〜１０％未満のファージが、ステップ（ａ）の抗原に結合していることがＡＦＭ画像によって観察されるまで、ネガティブパニングを繰り返す。
本発明の特定の実施形態は、タウ単量体を含む組成物を、本明細書に記載の抗体、抗体断片または結合分子と接触させることを含む、タウの凝集を阻害する方法を提供する。特定の実施形態では、タウの凝集は、細胞内にある。特定の実施形態では、タウの凝集は脳組織にある。特定の実施形態では、抗体、抗体断片または結合分子と接触することによって、組成物または結合分子の非存在下での速度と比較して、タウ凝集体の形成速度が減少する。
本発明の特定の実施形態は、生体試料中のタウの存在を検出する方法を提供し、抗体の試料を本明細書に記載の抗体、抗体断片または結合分子と接触させ、前記組成物と前記組織試料の結合を測定することを含み、前記組織試料への前記組成物の結合は、前記組織試料中のタウオリゴマーの存在を示し、前記タウオリゴマーの前記存在が、初期ＡＤ、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーまたは外傷性脳損傷後の神経変性を示す。特定の実施形態では、生体試料は、脳組織、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿または唾液である。
本発明の特定の実施形態は、哺乳動物の脳にタウが蓄積することを予防または阻害する方法を提供し、当該哺乳動物に本明細書に記載の抗体断片または結合分子を含む組成物を投与することを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴマータウを特異的に認識するが、単量体タウ、原繊維タウまたは非疾患関連形態のタウと結合しない抗体または抗体断片。
（項目２）
オリゴマータウは二量体または三量体タウである、項目１に記載の抗体または抗体断片。
（項目３）
オリゴマータウは三量体タウである、項目２に記載の抗体または抗体断片。
（項目４）
オリゴマータウは可溶性である、項目１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
（項目５）
項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片であって、前記抗体断片は、以下のステップ：
ａ． ｓｃＦｖファージライブラリのネガティブパニングであって、当該ネガティブパニングが望まない抗原と結合するファージを取り除き、当該ネガティブパニングは、ファージを、、
（ｉ）一般的なタンパク質、および
（ｉｉ）タウの単量体形態、と連続的に接触させ、
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を使用して、前記ファージと一般的タンパク質およびタウの単量体形態との結合をモニターし、当該ＡＦＭによって抗原と結合するファージを観察しなくなるまで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し、一定分量のファージを産生し、
ｂ． 一定分量のファージをタウオリゴマーと接触させ、前記オリゴマーへのファージの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートし、並びに
ｃ． 結合したファージ粒子をステップ（ｂ）から溶出する、を含む方法に従って単離される、抗体または抗体断片。
（項目６）
以下のステップ：
（ａ） ファージを、
（ｉ）一般的なタンパク質、および
（ｉｉ）タウの単量体形態、と５％未満のファージが抗原と結合していることが観察されるまで連続的に接触させることを含む、ｓｃＦｖファージライブラリのネガティブパニングをし、
一定分量のファージを産生し、
（ｂ） ステップ（ａ）からの一定分量のファージをタウオリゴマーと接触させることを含むステップ（ａ）からのアリコットをポジティブパニングし、脳に由来する前記タウオリゴマーとファージが結合するのに十分な時間インキュベートし、並びに
（ｃ） 結合したファージ粒子をステップ（ｂ）から溶出する、を含む方法に従って単離された抗体または抗体断片。
（項目７）
タウオリゴマーは三量体タウ４Ｎ１Ｒである、項目５または６に記載の抗体または抗体断片。
（項目８）
一般的なタンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、項目５〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
（項目９）
ネガティブパンニングが、ファージを、オリゴマータウを含まない脳に由来する対照試料と連続して接触させることをさらに含む、項目５〜８のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１０）
抗原へのファージの結合は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を使用することによって観察される、項目６〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１１）
０〜１０％未満のファージがステップ（ａ）の抗原に結合しているのをＡＦＭ画像によって観察されるまで、ネガティブパニングを繰り返す、項目６〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１２）
前記抗体断片は、抗体の定常ドメイン領域を含まない、項目１〜１１のいずれか１項に記載の抗体断片。
（項目１３）
配列番号１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体断片。
（項目１４）
抗体断片は、配列番号１、配列番号９または配列番号１１を含む項目１３のアミノ酸配列に記載の抗体断片。
（項目１５）
オリゴマータウに結合し、単量体のタウ、原繊維タウまたは非疾患関連形態のタウと結合しない結合分子であって、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９の配列を含む、前記結合分子。。
（項目１６）
タウオリゴマーを含む組成物を、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体、抗体断片または結合分子と接触させることを含む、タウの凝集を阻害する方法。
（項目１７）
前記タウの凝集は細胞内にある項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記タウの凝集は脳組織内にある項目１６に記載の方法。
（項目１９）
抗体、抗体断片または結合分子と接触することは、組成物または結合分子の非存在下での速度に比べ、タウ凝集体の形成速度を減少させる、項目１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
生体試料中のタウの存在を検出する方法であって、試料を、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体、抗体断片または結合分子と接触させ、前記組成物と前記組織試料との結合を測定し、前記組成物と前記組織試料との結合は、前記組織試料中のタウオリゴマーの存在を示し、前記タウオリゴマーの前記存在が、初期ＡＤ、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーまたは外傷性脳損傷後の神経変性を示す、方法。
（項目２１）
生体試料は、脳組織、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿または唾液である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
タウオリゴマーは二量体または三量体タウである、項目１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
タウオリゴマーは三量体タウである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
タウオリゴマーは可溶性である項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
哺乳動物に、項目１〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片または結合分子を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物の脳内のタウの凝集を予防または阻害する方法。
ＡＦＭ画像から得られた種々のタウ試料の高さ分布分析。ＡＤタウ＃１およびＡＤタウ＃３は、ＡＤ脳組織から精製された得られたタウ試料を表す。タウ４１２Ｍおよびタウ４４１Ｍは３Ｒ（タウ４１２）および４Ｒ（タウ４１２）タウ試料の単量体試料を表す。タウ４４１Ｏは表し、タウ４４１のオリゴマー試料。試料間の高さとオリゴマーの状態の差を容易に検出する。 ＳＨＳＹ−５Ｙヒト神経芽腫細胞の種々のタウ種の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）検定。（Ａ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞に対する単量体、二量体および三量体タウ１Ｎ４Ｒ（別名タウ４１２）の毒性。（Ｂ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞に対する単量体、二量体および三量体タウ２Ｎ４Ｒ（別名タウ４４１）の毒性。（Ａ）と（Ｂ）の両方で、左から右の各グループについて、第一のバーは３時間であり、第二のバーは１８時間であり、第三のバーは２４時間であり、第四のバーは４８時間である。 （Ａ）Ｆ９Ｔ ｓｃＦｖのアミノ酸配列。（Ｂ）Ｆ９ｓｃＦｖ（修復前）とＦ９Ｔ−７ｓｃＦｖ（修復後）についてのＤＮＡ配列の比較。（Ｃ）Ｆ９Ｔ、Ｆ９、Ｆ９Ｔ−７ＬおよびＦ９Ｔ−７Ｆ−ＲＣについてのＤＮＡ配列。 同上。 同上。 （Ａ）Ｆ９Ｔ、（Ｂ）Ｄ１１Ｃ、（Ｃ）Ｄ４Ｇ、（Ｄ）Ｇ１２Ｃ、（Ｅ）Ｈ２Ａおよび（Ｆ）Ｈ７Ｔを含む、三量体タウ（上）および対応するアミノ酸配列（下）に特異的な６個のｓｃＦｖクローンからのＤＮＡ配列。 同上。 同上。 同上。 （Ａ）Ｃ６Ｔ、Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、Ｄ４Ｇ、Ｇ１２Ｃ、Ｈ２、Ｈ２ＡおよびＨ７ＴについてのＤＮＡ配列。（Ｂ）Ｃ６Ｔ、Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、Ｄ４Ｇ、Ｇ１２Ｃ、Ｈ２、Ｈ２ＡおよびＨ７ＴについてのＤＮＡ配列の比較。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 新しいバイオパニングプロセスは、ファージミドｓｃＦｖライブラリからサブトラクティブパニングおよびポジティブパニング並びにＡＦＭを用いた単一クローニングスクリーニングを組み合わせる。（Ａ）パニング工程の概略、特にサブトラクティブパニングの間、無関係のファージ粒子を迅速に取り除くために、イムノチューブによって雲母担体を、ＢＳＡ等の大量の望まない抗原に置き換えることができる。（Ｂ）非特異的ファージを除去するために行われるＢＳＡに対するサブトラクティブパニング。左、中央、右の画像は、それぞれＢＳＡチューブ＃１、＃３、および＃５の後のファージプール親和性チェックである。右手側の画像のファージ結合の非存在は、ＢＳＡに対してサブトラクティブパニングが達成されたことを意味する。１μｍのスケールバーは、３つすべての画像に適用する。（Ｃ）タウ三量体に対するポジティブパニングを行い、ＡＦＭで画像にした。純粋な所望の抗原と比較して、ポジティブパニングの複製は、抗原にファージがないこと、および望まない抗原結合剤が枯渇したファージプールが、所望の抗原に特異的に結合するファージをまだ含んでいることを証明している。左の画像は、雲母に固定化された精製された三量体タウ１Ｎ４Ｒであり、右の画像は、サブトラクティブパニングの残りのファージプールが堆積し、非結合粒子は洗い流された雲母の同片である。１μｍのスケールバーは、両方の画像に適用する。 ｒｈＴａｕ ２Ｎ４Ｒ混合凝集体からの単一クローンのｓｃＦｖが表示されたファージによって捕捉されたオリゴマータウの粒径分析。精製されたｒｈＴａｕ単量体、二量体および三量体と比較したクローンファージ標的のサイズ。ファージを捕捉する個々の粒子は、ナノスコープの分析セクション関数によってサイズを測定した。各クローンのファージ標的の平均値は、ｒｈＴａｕ ２Ｎ４Ｒ三量体のサイズ範囲に応じて、２．５ｎｍ〜３．０ｎｍである。（エラーバー：＋／−標準偏差） ｓｃＦｖ形態の３つのクローン、Ｆ９Ｔ、Ｄ１１ＣおよびＨ２Ａは、ＡＴ８と免疫反応性である９ヵ月の３×ＴＧ−ＡＤマウスの海馬の異常なリン酸化タウ種から保持する。負対照は、標的分析物としてＰＢＳであり、正規化の基準として使用される１．０に設定する。２．０以下の信号は負として記録され、２．０以上の信号は正として記録される。（エラーバー：＋／−標準偏差） 一次抗体ｓｃＦｖの３種類によって捕捉された、９ヵ月の３×ＴＧ−ＡＤマウスの脳の抽出物に対する二次抗体親和性の比較。平均の比較は、同一次抗体の各グループ内で行った。（エラーバー：＋／−標準偏差） オリゴマータウは、Ｆ９ＴｓｃＦｖファージによって検出される異なる３×ＴＧ−ＡＤマウスの脳抽出物に対するオリゴマータウ標的ｓｃＦｖクローン（Ｆ９Ｔ、Ｄ１１ＣおよびＨ２Ａ）の親和性。各年齢について２つのマウスを三つ組で試験した。データは、マウスの年齢によって分類した。平均の比較は、同マウスの年齢の各グループ内で行った。（エラーバー：＋／−標準偏差） 年齢をマッチさせたヒトの中側頭回（ＭＴＧ）から脳ホモジネートでＦ９Ｔ ｓｃＦｖのドットブロット反応性の濃度測定分析。ドット信号の濃度測定値は、０から１のスケールに基づいており、０はバックグラウンド信号に等しく、１は抗ｐＬＢ ｓｃＦｖのドットの正シグナルと等しい。２群の平均を比較して一要因分散分析で統計分析を行う。（Ａ）認知障害のない（ＮＤ）とアルツハイマー病（ＡＤ）として生前診断によってグループ分けされた患者を比較する。ＡＤ群の平均がＮＤ群の平均（ｐ＜０．０５）と異なるということは、Ｆ９Ｔ ｓｃＦｖがＮＤからＡＤを検出することができることを意味する。（Ｂ）死後の検査結果によってＢｒａａｋ病期によって定義された、グループ分けされた患者と、ＡＤの進行を直接的に意味する老人斑の頻度とを比較する。Ｂｒａａｋ病期Ｉ−ＩＩ（初期段階）は両方とも非認知症と診断されたが、ケースの半分は、斑がない他の半分と比較するとわずかに斑があった。Ｂｒａａｋ病期ＩＩＩ−ＩＶ（ＡＤ中期）は中程度の斑を示し、Ｂｒａａｋ病期Ｖ−ＶＩ（ＡＤ後期）は深刻な斑を示す。これらのＭＴＧ抽出物に対するＦ９ＴのｓｃＦｖの親和性は、Ｂｒａａｋ病期および斑の頻度によって定義されるＡＤの進行と直接的に相関する。（Ｃ）非認知症とアルツハイマー病患者からの均質化されたＭＴＧ組織で精製されたＦ９Ｔ ｓｃＦｖのドットブロット親和性試験を標本抽出する。 シートライブラリから選択されたｓｃＦｖおよびシートが開発された汎用ライブラリからの標準ｓｃＦｖの開始領域および第一の重鎖フレームワーク領域（ＨＣＦＲ１）のＤＮＡ配列。Ｆ９、Ｈ７、Ｄ４、Ｄ１１およびＧ１２は、ｒｈＴａｕ １Ｎ４Ｒ三量体を標的にする選択された５つのｓｃＦｖであり、残りは標準ｓｃＦｖである。各クローン毎に欠落している塩基対がフレームシフトを引き起こすことを除いて、シートライブラリからのすべてのこれらのｓｃＦｖは、汎用ライブラリからのものと同様のＦＲ領域を含む。欠落しているこれらの塩基対のすべて（暗い背景で強調表示）は、ＨＣＦＲ１の先頭、またはＨＣＦＲ１、および制限部位のＮｃｏＩ、ｓｃＦｖ発現開始または相補性決定領域（ＣＤＲ）に影響を与えないメチオニン開始コドンの接続のどちらかに存在する。汎用ライブラリ内で、選択されたクローン配列のアミノ酸配列を保持する欠落した塩基対を挿入することによって、これらのクローンは、エピトープ結合部位を妨害することなく、可溶性ｓｃＦｖを発現し、その特異性を維持することができる。 クローン配列変更のために設計されたプライマー。順方向プライマーは、ｓｃＦｖ配列と、欠落している塩基対（下線）のＮｃｏＩ（イタリックで５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）の上流を含む。逆方向プライマーは、ｓｃＦｖ配列のＮｏｔＩ（イタリックで５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）の下流を含む。プライマー対および対応するクローンのＤＮＡ鋳型を用いたポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、修正されたクローンのｓｃＦｖ ＤＮＡ断片は、大腸菌にサブクローニングし、ｓｃＦｖおよびファージを産生するために最大２３０のコピーを製造することができる。 タウタンパク質構造的特徴の線形図。４４１アミノ酸（タウ４４１またはタウ２Ｎ４Ｒ）との完全長タウタンパク質を示す。アミノ酸の総数またはＮ’末端エキソンの数（Ｎ）および微小管結合反復（Ｒ）数のいずれかによって表される計６つのアイソフォームの結果を、黄色の長方形で示した選択的スプライシング。 非反応性単量体、反応性単量体、および反応性オリゴマーの模式図。反応性は、分子間ジスルフィド結合を形成する能力を意味する。分子内ジスルフィド結合は、非反応性タウ単量体の形成を引き起こす。反応性単量体中の遊離チオールは、分子間または分子内ジスルフィド結合の形成を可能にする。反応性オリゴマーは、オリゴマーを延長するために、反応性単量体のタウとジスルフィド結合を容易に形成する１つ以上の遊離チオールを有する。 ｒｈＴａｕ １Ｎ４Ｒ（ａ）およびタウ２Ｎ４Ｒ（ｂ）の単量体、二量体、および三量体画分の高さ分布のプロット。Ｇｗｙｄｄｉｏｎを用いて各粒子の高さの値を測定した。連続したサイズ範囲になる粒子の数を計算し、カウント百分率（ｃｏｕｎｔ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）に正規化した。ピーク値は、各タウ種の粒子サイズの近似値を与える。予想されるように、高次オリゴマーは、同じアイソフォーム内の低度のオリゴマーよりも大きく、より長いアイソフォームからの対応するオリゴマーの凝集体は、より短いアイソフォームの凝集体よりも大きい。 １Ｎ４Ｒと２Ｎ４Ｒタウ変異体の細胞外１５．５ｎＭの単量体、二量体、および三量体形態の（ａ）未分化ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙおよび（ｂ）レチノイン酸分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する神経毒性は、ＬＤＨアッセイを使用して４８時間のインキュベーション後に測定した。４回反復のタウアイソフォームの両方について、三量体形態は、いずれかのニューロンタイプの単量体と二量体型よりも神経毒性が高い（Ｐ＜０．００１）。全長の三量体ｒｈＴａｕは１Ｎ４Ｒ三量体ｒｈＴａｕよりも神経毒性が強い。（Ｐ＜０．０５）。 ＬＤＨアッセイにより測定した神経芽腫細胞に対する三量体ｒｈＴａｕ（１Ｎ４Ｒと２Ｎ４Ｒ）によって誘導された神経毒性の時間および濃度依存性。（ａ）１Ｎ４Ｒタウおよび（ｂ）２Ｎ４Ｒタウと共にインキュベートされた未分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、並びに（ｃ）１Ｎ４Ｒタウおよび（ｄ）２Ｎ４Ｒタウと共にインキュベートレチノイン酸分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞。 未分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とレチノイン酸−（ＲＡ−）分化ＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対するｒｈＴａｕ誘導神経毒性の比較。データは、１Ｎ４Ｒと２Ｎ４Ｒタウ変異体の両方の１５．５ｎＭの単量体、二量体、および三量体の形態の毒性結果を組み合わせる。（ａ）３時間のインキュベーション後、ＲＡ分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、未分化ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞よりも、細胞外三量体ｒｈＴａｕ毒性に対してより脆弱である（Ｐ＜０．０５）。（ｂ）４８時間のインキュベーションの後、未分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＲＡ分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞よりも、細胞外三量体ｒｈＴａｕ毒性に対してより脆弱である（Ｐ＜０．０５）。
タウは、脳内の微小管機能に関与するタンパク質である。タウの凝集は、神経損傷、認知症および外傷性脳損傷につながる可能性がある。タウの小さな可溶性オリゴマー凝集帯の形態は、解剖時に見られる大きな線維状凝集体より、毒性種ではあり得ることが多くの証拠によって示唆される。これらの種に対する試薬の開発は、潜在的な治療の選択肢を表す。本発明では、低量（ピコモル）のタウオリゴマーに対して、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ、ナノボディとも呼ばれる）を同定するために、バイオパニングプロトコルを使用して、本発明者らは、治療及び診断特性を有する結合試薬を識別した。具体的には、本発明者らは、タンパク質タウのオリゴマー形態を選択的に認識する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖまたはナノボディ）を生成した。神経変性のための診断、治療、および造影剤としての潜在的価値を有するこれらの単離されたｓｃＦｖ。診断薬として、これらの抗体断片は、神経変性の発症前の指標として、血清、ＣＳＦ、または他の体液試料中のオリゴマーのタウの存在を検出するために使用することができる。オリゴマータウは、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーおよび外傷性脳損傷後の神経変性の早期指標になり得る。抗体断片はまた、毒性オリゴマータウ凝集体を選択的に標的とする治療薬として使用することができ、損傷からニューロンを保護する。最後に、試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏで、タウ凝集および神経変性の存在を検出するための造影剤としても使用することができる。抗体断片は、ＰＥＴスキャンまたは他の画像技術のために容易に標識することができる。
異なるタウ種に対する単鎖可変断片（ナノボディ）を単離するために、バイオパニングの研究を行った。使用されたバイオパニングプロトコルは、ＡＦＭの画像能力とファージ表示抗体技術を組み合わせる。標的タンパク質の特定のオリゴマー形態に対するナノボディを単離するために、プロトコルを、望ましくないタンパク質形態に結合するクローンを除去するネガティブパニングのステップを含むように変更した。オリゴマータウに対するナノボディを分離するために２つのネガティブパニングのステップを組み込んだ。第一のネガティブパニング工程で、全ての非特異的「粘着性」クローンは、一般的なタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するパニングによって除去した。第二のネガティブパニング工程で、タウの望ましくない単量体形態に結合するクローンを全て除去した。単量体タウを結合するファージクローンを除去するためにネガティブパニングのために、純粋な単量体タウの試料を得て、一定分量の残りのファージを使用して、それぞれ、二量体および三量体の特定のクローンをスクリーニングした。ヒト神経細胞株に対して、三量体タウ種は単量体または二量体よりもはるかに毒性があることが認められたため、本発明者らは、三量体タウ４Ｎ１Ｒに選択的であるファージクローンを単離することに注力した。ＢＳＡおよび単量体タウに対するネガティブパニングの後、約１００個のクローンを三量体タウ４Ｎ１Ｒに対して正の選択から得た。異なるタウ種への結合についてＡＦＭにより、各ファージクローンをスクリーニングした。各ファージ試料は、以前に雲母基板に固定されていた単量体、二量体および三量体タウ試料で同時インキュベートした。未結合ファージを過剰に厳しいリンスにより除去し、残った結合したファージを、ＡＦＭによって画像化した。このように、１００個のクローンすべてをスクリーニングした後、単量体のタウではないが、二量体または三量体タウのどちらかを選択的に結合したクローンを同定した。１００個のファージクローン全てをスクリーニングした後、三量体タウについて最も高い特異性に基づいてさらに研究するために６個のクローンを選択した。
６個のクローンそれぞれのＤＮＡ配列を、全長のｓｃＦｖがコードされたことを確認するために検証した。６例の各々で、単一の塩基対は、コード配列の開始で欠落していた。さらなる特徴付けのために可溶性ｓｃＦｖを産生するためにフレームシフトを補正し、ｓｃＦｖの効率的な発現を可能にする必要があった。クローンのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図３〜５に示す。特に、選択されクローン化された６個のｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下である、Ｆ９Ｔ（配列番号１）、Ｆ９Ｔ（配列番号９）、Ｄ１１Ｃ（配列番号１１）、Ｄ４Ｇ（配列番号１３）、Ｇ１２Ｃ（配列番号１５）、Ｈ２Ａ（配列番号１７）、またはＨ７Ｔ（配列番号１９）。ＤＮＡ配列も図３〜図５に含まれる。
修正されたＦ９クローン、Ｆ９Ｔは、非常に高いレベルで発現し、容易に精製され、ＡＦＭによって観察したファージの形で単量体タウおよび原線維タウに比べてオリゴマータウに対する高い特異性を維持し、そのため、当該クローンをさらなる研究に選択した。Ｄ１１クローンは、三量体タウに選択的に結合するが、単量体のタウでは結合しないことも確認された。両クローンはまた、反応性プロファイルがわずかに異なるものの、タウのもつれを含む死後のヒト脳組織中のタウ凝集体も選択的に認識するが、同年齢の正常な組織中のものは認識しない。したがって、Ｆ９ＴとＤ１１Ｃナノボディの両方は、ＴＢＩ後のタウの天然に存在する凝集体によって誘導されるニューロン毒性を遮断する治療薬として有望である。
広義には、本発明のｓｃＦｖ組成物（例えば、Ｆ９ＴとＤ１１Ｃ）がタウ結合化合物である化合物として説明することができる。そのため、これらの化合物を、診断および治療用途に使用することができ、患者に投与するか、患者の組織試料に使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｖｏでタウの画像に使用することができ、有毒なタウの形を有する神経学的組織と正常な神経組織を区別することができる。このように、本発明のナノボディ組成物を使用して、例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチー、外傷性脳損傷後の神経変性を含む疾患において、タウオリゴマーを検出し、定量化することができる。別の実施形態では、化合物を神経変性疾患の治療または予防に使用することができる。また、本明細書では、化合物を脳組織に分布させ、脳組織を画像化する方法も提供し、脳組織への化合物の結合の増加は、結合の正常な対照レベルと比較して、哺乳動物が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチー、外傷性脳損傷後の神経変性疾患等の神経変性を罹患または発症する危険性にあることを示す。
本発明の方法は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、外傷性脳損傷後の神経変性疾患の早期診断を提供するために行われる。本明細書で説明したように、本発明のナノボディ（例えば、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ）は、タウオリゴマー（例えば、三量体タウ）を特に認識するものである。したがって、これらの抗体および抗体断片を含む組成物は、アルツハイマー病等タウオパチーについて検査を受ける患者からの生体試料中のタウオリゴマーの存在を識別するために使用することができ、試料中のタウオリゴマーの存在によって、その患者がタウオパチー（例えばアルツハイマー病）を発症している、または発症する可能性があることを示す。特定の実施形態では、使用される構築形式は、抗体組成物を一般に使用する任意の構築形式であってもよい。したがって、例えば、免疫組織法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法等を用いて生体試料を検査することができる。
本発明の診断方法のために、本発明の組成物（例えば、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ）は、ｓｃＦｖを容易に検出する検出試薬に結合させてもよい。例えば、実施例では、検出試薬は、直接標識または間接標識であり得る。標識は、化学的または組換え法により、検出試薬に直接付着させるまたは組み込むことができる。
一実施形態では、標識は、化学リンカーによってｓｃＦｖに連結されている。リンカー領域は、典型的に、約５〜２００個のアミノ酸の間のポリグリシン配列等のポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、プロリン残基をリンカーに組込み、リンカーによって有意な二次構造要素の形成を防ぐ。ある実施形態では、リンカーは、ＲＮＡ認識領域を含む組換え融合タンパク質の一部として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。一実施形態では、柔軟なリンカーは、ｘが約３〜約１００の数であるＧｌｙ（ｘ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ｘ）等のプロリンを含むアミノ酸部分配列である。他の実施形態では、合成または組換えによって作製された認識領域部分配列と標識ドメインの部分配列を接続するために、化学リンカーを使用する。このような柔軟なリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社、ハンツビル、アラバマ州から入手可能である。これらのリンカーは、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有していてもよい。
検出可能な標識を本発明のアッセイに使用して、アルツハイマー病等の神経変性疾患を診断することができ、これらの標識は、本発明のｓｃＦｖに結合し、一次標識（標識は直接検出される素子、または直接的に検出可能な素子を作製する素子を含む）または二次標識（検出される標識は例えば免疫学的標識に多く見られるように、一次標識に結合する）になることができる。標識への導入、標識の手順および標識の検出については、Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ （１９９７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．及びＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ中， ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．に認められ、当該標識の使用を記載した特許として、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号が挙げられる。
一次および二次標識は検出されない要素および検出された要素を含むことができる。本発明に有用な一次および二次標識として、緑色蛍光タンパク質、蛍光染料（例えば、フルオレセイン並びにフルオロセインチオイソシアネート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）等の誘導体、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッド、テトラロジミンイソチオシン酸塩（ＴＲＩＴＣ）等）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ．ＴＭ．等）等のスペクトル標識、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、等）、酵素（例えば、セイヨウワサビ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、コロイド金または着色されたガラスまたはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）ビーズ等のスペクトル熱量標識を挙げられる。当該技術分野に周知の方法に従って、検出アッセイの成分（例えば検出試薬）を直接または間接的に結合することができる。上述したように、広範な種々の標識は、必要な感受性、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な機器、および廃棄規定に依存して、標識の選択と共に使用することができる。
使用できる例示的な標識として以下を使用するものが挙げられ、１）例えば、分子プローブ、アマシャム、ベーリンガー・マンハイム、およびライフテクノロジーズ／ギブコＢＲＬから利用可能なキットを伴う化学発光（上記のように分解産物として光子を生成する基質と共に、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび／またはアルカリホスファターゼを用いて）、２）（着色された沈殿物を産生する基質（ライフテクノロジーズ／ギブコＢＲＬ、およびベーリンガー・マンハイムから入手可能なキット）と共に西洋ワサビおよび／またはアルカリホスファターゼを用いた）発色、３）例えば、基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ（アマシャム）または、蛍光産物を産生するその他の基質と共に、アルカリホスファターゼ等の酵素を使用した蛍光、４）（例えば、Ｃｙ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、フルオレセイン、および他の蛍光タグを使用した）蛍光、５）放射能。標識および検出するための他の方法は、当業者に容易に明らかであろう。
本発明のｓｃＦｖベースの組成物（例えば、Ｆ９ＴおよびＤ１１Ｃ）を臨床現場で使用することを意図する場合には、標識は、好ましくは非放射性であり、精巧な計装を必要とせずに検出される。ある実施形態では、標識の検出は、目視検査の際にすぐに識別可能な可視信号をもたらす。検出可能な二次標識戦略の一例は、（典型的には、組換えまたは共有化学結合によって）抗体が酵素に結合するタウオリゴマーを認識する抗体を使用する。抗体は、酵素がその基質と反応して検出可能な産物を産生するときに検出される。ある実施形態では、本発明の検出試薬に結合することができる酵素として、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。ルシフェラーゼの化学発光基質は、ルシフェリンである。β−ガラクトシダーゼの蛍光基質の一つの態様は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドである。アルカリホスファターゼ基質の実施形態として、分光光度計で検出されるｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）および視覚的に検出されるファーストレッド／ナプトールＡＳ−ＴＲリン酸塩、並びにルミノメーターで検出される４−メトキシ−４−（３−ホスホノフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］が挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質の実施形態として、分光光度計で検出される２，２’アジノ−ビズ（３−エチルベンズチアゾリン−６スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、ｏ−ジアニシジン、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、並びに視覚的に検出される３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’ジアミノベンジジンＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）、および４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ）が挙げられる。他の適切な基質は、当業者に周知である。酵素−基質反応および生成物の検出は、当業者に周知の標準的な手順に従って行われ、酵素免疫測定法を実施するキットは、上述のように利用可能である。
目視検査することによって標識の存在を検出することができ、または特定のプローブまたはプローブの組み合わせをモニターする検出器を使用して、検出試薬の標識を検出する。典型的な検出器として、分光光度計、光電管およびフォトダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルム等、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な検出器の例は、当業者に周知の様々な商業的供給源から広く入手することができる。一般に、結合した標識部分を含む基板の光学像は、その後のコンピューター解析のためにデジタル化される。
本明細書全体で述べたように、本発明のｓｃＦｖ（例えば、Ｆ９ＴとＤ１１Ｃ）は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチー、または外傷性脳損傷後の神経変性に特徴的であるタウオリゴマーを特異的に標的にする。このように、本発明のｓｃＦｖはまた、特に、治療組成物をタウ凝集の部位に標的化するために使用することができる。当該実施形態では、アルツハイマー病等のタウオパチーの治療に典型的に使用される治療薬は、治療薬の標的送達を達成するために、ｓｃＦｖに結合してもよい。ＡＤの治療のための種々の薬は、研究下で、および規制が検討されている下で、現在利用可能である。薬物は、一般に、コリンエステラーゼ阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、抗酸化剤または抗炎症剤の広いカテゴリーに収まる。ガランタミン（レミニル）、タクリン（コグネックス）、セレギリン、フィゾスチグミン、ｒｅｖｉｓｔｉｇｍｉｎ、ドネペジル、（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）、メトリホナート、ミラメリン、キサノメリン、サエルゾール、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、ＥＮＡ−７１３、ｍｅｍｒｉｃ、クエチアピン、ｎｅｕｒｅｓｔｒｏｌおよびｎｅｕｒｏｍｉｄａｌは本発明のｓｃＦｖの組成物に結合することができ、ＡＤの治療介入の標的にすることができるＡＤの治療的薬として提案される薬のいくつかである。
本発明のｓｃＦｖ組成物は、タウオリゴマーの存在を決定するために、診断アッセイ形式で使用することができる。免疫検出の様々な方法は、当該実施形態のために企図される。当該免疫検出法として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットがあげられ、いくつかの他の方法は当業者に周知である。種々の有用な免疫検出法のステップは、科学文献に記載されている。
一般に、免疫結合法は、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、本発明に従って、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含有すると思われる試料（この場合タウオリゴマー）を得ること、試料を一次抗体、モノクロナール、またはポリクローナル（この場合Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖ）に接触することが含まれる。
免疫結合法は、試料中のタウオリゴマー成分の量を検出し、定量化する方法および結合プロセスの間に形成された任意の免疫複合体の検出および定量化を含む。ここで、タウオリゴマーを含有すると思われる試料を得て、試料をＦ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明の抗体断片に接触させ、その後、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出し、定量化する。
有効な条件下、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にする十分な時間、選択された生体試料を抗体と接触させることは、一般的に、単に試料に抗体組成物を添加し、抗体が免疫複合体を形成するのに十分な長さの時間、混合物をインキュベートし、免疫複合体をいわゆる、存在する任意の抗原に結合することである。当該時間の経過後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロット等の試料−抗体組成物は、一般に、洗浄され、非特異的に結合した抗体種を除去し、一次免疫複合体内に特に結合されるｓｃＦｖ分子だけを検出することができる。
一般に、免疫複合体形成の検出は、当該技術分野に周知であり、多数のアプローチを適用することによって達成され得る。これらの方法は一般に、任意のそれらの放射性、蛍光、生物学的および酵素的タグ等の標識またはマーカーの検出に基づく。当該標識の使用に関する米国特許として、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が挙げられ、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。もちろん、当技術分野に周知のように、第二の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置等の二次結合リガンドの使用によりさらなる利点を見出すことができる。
上述したように、本発明のｓｃＦｖは、それ自体が検出可能な標識に連結することができ、当該標識を単純に検出し、それによって、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することができる。あるいは、一次免疫複合体内で結合されるようになる第一の抗体は、抗体に結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出することができる。これらの場合では、第二の結合リガンドは、検出可能な標識に連結することができる。第二の結合リガンドは、それ自体抗体であることが多く、そのため、「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体は、効果的な条件下、二次免疫複合体の形成を可能にするのに十分な時間、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。二次免疫複合体は、その後、一般に洗浄され、任意の非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを取り除き、その後、二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。
さらなる方法は、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。ｓｃＦｖ（例えば、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ）について結合親和性を有する抗体等の第二の結合リガンドは、上記のように、二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、二次免疫複合体を、再び有効な条件下で、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な時間、第二の抗体について結合親和性を有する第三の結合リガンドまたは抗体と接触させる。第三のリガンドまたは抗体は、このように形成された三次免疫複合体の検出を可能にする、検出可能な標識に連結されている。所望される場合、この系は信号増幅を提供し得る。
チャールズ・カンターによって設計された免疫検出の一つの方法は、２つの異なる抗体を使用する。第一段階のビオチン化、モノクローナルまたはポリクローナル抗体（本例では、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖ）は、標的抗原を検出するために使用され、第二段階の抗体は、次いで複合化ナノボディに結合したビオチンを検出するために使用される。この方法では、試験対象の試料を、まず、第一段階のナノボディを含有する溶液中でインキュベートする。標的抗原が存在する場合には、いくらかのナノボディを抗原と結合させ、ビオチン化ナノボディ／抗原複合体を形成する。ナノボディ／抗原複合体は、その後、各ステップで、ナノボディ／抗原複合体に追加のビオチン化部位を添加しながら、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチニル化ＤＮＡの連続した溶液にインキュベーションされることによって増幅される。増幅の適切なレベルが達成されるまで、増幅ステップを繰り返し、その時点で、ビオチンに対する第二段階抗体を含む溶液中で試料をインキュベートする。当該第二段階抗体は、例えば、色素原基質を用いる組織酵素学によって、抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用することができる酵素と同様に標識される。適切な増幅では、コンジュゲートは、肉眼で見えるものを製造することができる。
免疫検出の別の周知の方法は、免疫ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法論を利用する。ＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまではＣａｎｔｏｒ法と類似しているが、複数回のストレプトアビジンおよびビオチン化ＤＮＡインキュベーションを使用する代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を、低ｐＨまたは抗体を解放する高塩緩衝液を用いて洗浄する。得られた洗浄溶液は、適切な調節で適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うために使用される。少なくとも理論的には、ＰＣＲの莫大な増幅能および特異性は、単一の抗原分子を検出するために利用することができる。
上記で詳述したように、イムノアッセイは、最も単純および／または直接的な意味では、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、当技術分野で周知の様々なタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学的検出もまた特に有用である。しかし、検出が当該技術に限定されないことが容易に理解され、並びに／またはウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析、および／若しくは同様のものを用いることもできる。
本発明に使用することができる診断アッセイ形式は、ＥＬＩＳＡ、またはルミネックスまたはバイオセンサー等の他のプラットフォーム等の任意の従来の形式を取ることができる。本発明は、Ｆ９Ｔ（配列番号１）、Ｆ９Ｔ（配列番号９）、Ｄ１１Ｃ（配列番号１１）、Ｄ４Ｇ（配列番号１３）、Ｇ１２Ｃ（配列番号１５）、Ｈ２Ａ（配列番号１７）、またはＨ７Ｔ（配列番号１９）のｓｃＦｖの配列を示す。これらの配列は、診断アッセイを容易に改変することができ、例えば、感度を高めるために、タグ（ＧＦＰ等）をこれらのｓｃＦｖに追加することができる。ある例示的なＥＬＩＳＡでは、抗体を（Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖの本発明の場合には）、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル等のタンパク質親和性を示す選択された表面に固定する。その後、臨床サンプル等、タウオリゴマーを含有すると思われる試験組成物（例えば、対象から得られた生体試料）を、ウェルに添加する。非特異的に結合した免疫複合体を除去するために結合および／または洗浄後、結合した抗原を検出することができる。検出は、一般に、検出可能な標識に連結されている別の抗体を添加することによって達成される。当該タイプのＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、二次抗体を添加し、次に、第三抗体が検出可能な標識に連結しながら、二次抗体に対する結合親和性を有する第三の抗体を添加することによっても達成することができる。
別の例示的なＥＬＩＳＡでは、抗原を含有すると思われる試料を、ウェル表面上に固定化し、および／またはその後、結合剤（例えばＦ９ＴやＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖ）と接触させる。非特異的に結合した免疫複合体を除去するために結合および／または洗浄の後、結合した抗結合剤が検出される。最初の結合剤が、検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体を直接検出してもよい。再び、二次抗体は検出可能な標識に連結しながら、第一の結合剤に対して結合親和性を有する二次抗体を用いて、免疫複合体を検出してもよい。
抗原が固定化される別のＥＬＩＳＡは、検出における抗体競合の使用を含む。当該ＥＬＩＳＡでは、抗原に対する標識抗体（またはナノボディ）を、ウェルに添加し、結合させ、および／またはそれらの標識を用いて検出される。未知の試料中の抗原の量を、コーティングされたウェルとのインキュベーション中に、試料を抗原に対する標識抗体と混合することによって決定する。試料中の抗原の存在は、ウェルへの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量を減少させるように作用し、最終的なシグナルを減少させる。また、非標識抗体が抗原コーティングウェルに結合し、標識抗体に結合するのに利用可能な抗原の量も減少する場合に、未知の試料中の抗原に対する抗体を検出するにも適切である。
用いる形式に関係なく、ＥＬＩＳＡは、コーティング、インキュベートおよび結合、非特異的結合種を除去するために洗浄し、結合した免疫複合体を検出する等、共通の特徴を有する。
タウオリゴマーまたは本発明のｓｃＦｖ（例えば、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ）のいずれかでプレートをコーティングするときには、一般的に、一晩または指定した時間のどちらかで、抗原またはｓｃＦｖの溶液でプレートのウェルをインキュベートする。その後、不完全に吸着された物質を除去するためにプレートのウェルを洗浄する。ウェルの残りの利用可能な表面は、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「コーティング」される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉乳の溶液が挙げられる。コーティングは、固定表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、したがって、表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
ＥＬＩＳＡでは、直接の手順より、第二または第三検出手段を使用するほうがおそらく通例である。したがって、ウェルへのタンパク質または抗体の結合、バックグラウンドを減少させるために非反応性材料でコーティングし、非結合物質を除去するために洗浄した後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするのに有効な条件下で、試験対象の生体試料と接触させる。免疫複合体の検出は、標識された三次抗体または第三結合リガンドと併せて、標識された第二結合リガンドまたは抗体、および第二結合リガンドまたは抗体を必要とする。
「免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするのに有効な条件下」とは、好ましくは、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ｔｗｅｅｎ等の溶液でタウオリゴマーおよび／またはｓｃＦｖ組成物を希釈することを含むことを意味する。これらの追加の薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。
「適切な」条件はまた、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温度または時間で行われることを意味する。インキュベーションのステップは、好ましくは、約２５℃〜２７℃の温度で、典型的には約１〜２〜４時間程度であり、または約４℃程度で一晩行ってもよい。
ＥＬＩＳＡでのすべてのインキュベーションステップの後に、非複合体化物質を除去するために接触した表面を洗浄する。洗浄手順の例は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液等の溶液による洗浄が含まれる。試験試料と元々結合されている材料で特異的免疫複合体を形成し、洗浄した後に、微量の免疫複合体の発生を決定することができる。
検出手段を提供するために、第二または第三の抗体は、検出を可能にする関連付けられた標識を有することになる。これは、適切な発色性基質でインキュベートする際に発色を生成する酵素であってもよい。したがって、例えば、第一および第二の免疫複合体を、一定の期間、さらなる免疫複合体形成を進めるのに有利な条件下で（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等のＰＢＳ含有溶液中、室温で２時間インキュベートする）、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ結合抗体と接触させ、またはインキュベートすることが望まれる。
標識抗体とのインキュベーション後、未結合物質を除去するための洗浄に続いて、例えば、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には、尿素等の発色性基質、またはブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、またはＨ２Ｏ２でインキュベーションすることによって、標識の量を定量化する。定量化は、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて、生成された色の程度を測定することによって達成される。
本発明の様々な態様では、それは、さらに、患者にＡＤ等のタウオパチーについて伝統的な診断アプローチをすることが望ましい。診断のための一般的なアプローチは以下の通りである。
初期の（軽度）認知障害とＡＤの両方の診断は主に臨床的判断に基づいている。しかし、様々な神経心理学的検査は、臨床医が診断に達成できるように支援する。他の認知症は、記憶障害や他の徴候を呈することがあるため、唯一の記憶障害の早期発見は、ＡＤの初期兆候を示唆するのに役立ち得る。初期の包括的な認知機能障害を評価する認知能力試験は、ワーキングメモリ、エピソード記憶、意味記憶、知覚速度と視空間能力の測定と同じように、有用である。これらのテストは、単独または組み合わせて、臨床的に行うことができる。認知領域に応じた認知試験の例は、例として示されており、「Ｄｉｇｉｔｓ Ｂａｃｋｗａｒｄ」および「Ｓｙｍｂｏｌ Ｄｉｇｉｔ」（注意）、「Ｗｏｒｄ Ｌｉｓｔ Ｒｅｃａｌｌ」および「Ｗｏｒｄ Ｌｉｓｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」（記憶）、「ボストン・ネーミング」および「Ｃａｔｅｇｏｒｙ Ｆｌｕｅｎｃｙ 」（言語）、「ＭＭＳＥ１−１０」（方向性）、および「ラインオリエンテーション」（視空間）が挙げられる。このように、神経心理学的検査および教育調整ランキング（ｅｄｕｃａｔｉｏｎ−ａｄｊｕｓｔｅｄ ｒａｔｉｎｇ）は、努力、教育、職業、運動および感覚消失の情報と組み合わせて評価される。臨床的に軽度認知障害を診断するための合意基準が存在しないため、上記に加えて、経験豊富な神経心理学者または神経科医による臨床検査の様々な組み合わせが、適切な診断の鍵となる。疾患が顕在化すると（すなわち、むしろ軽度認知障害より認知症になる）、臨床医は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ ＤｉｓｏｒｄｅｒｓおよびＳｔｒｏｋｅ／ＡＤ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ）の合同ワーキンググループが定めた認知症およびＡＤの基準を使用することができる。臨床診断の必要条件ではないが、時に臨床医は、脳葉萎縮の程度を評価するために、頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または頭部磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を要求することができる。
上述したように、様々な薬物が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーまたは外傷性脳損傷後神経変性の治療に使用され、または現在開発中である。本発明は、治療の有効性をさらに評価する「診断」方法に基づいて、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖを使用することを企図する。これらの疾患におけるタウの役割があるとすれば、これらの形態が毒性を示すように、オリゴマータウの量を減少させる特定の療法の能力は、効果的な治療の指標となるであろう。
本発明は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーまたは外傷性脳損傷後神経変性を有する対象へ送達するために、Ｆ９ＴまたはＤ１１Ｃ等の本発明のｓｃＦｖに結合する薬剤を含む医薬組成物の使用を含むことができる。当該薬剤は、理想的には、薬学的に許容される担体に処方される。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」として、当業者に周知のように、任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素等の材料とその組み合わせが挙げられる。任意の従来の担体が活性成分と不適合であることを除き、治療組成物または薬学的組成物に使用することが意図される。
本明細書に記載の抗体または抗体断片のアミノ酸配列の「変異体」、または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下の配列と実質的に類似する配列である、以下、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１。変異体アミノ酸配列および核酸配列は、合成的に誘導されたアミノ酸配列および核酸配列、または組換え由来のアミノ酸または核酸配列を含む。一般に、本発明のアミノ酸または核酸配列変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１と、少なくとも４０、５０、６０、７０％を有し、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、一般に少なくとも８０％、例えば、８１％−８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一の配列を有する。
本発明は、本明細書に記載の抗体および抗体断片のアミノ酸配列の変異体、ならびに当該アミノ酸配列をコードする核酸配列の変異体を含む（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１）。「変異体」は、Ｎ末端および／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）または添加、および／または核酸配列の５’または３’末端への１つ以上の塩基の添加、配列の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸／核酸の欠失または添加、または配列の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸／核酸の置換を含むことが意図される。本明細書に記載の抗体および抗体断片は、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法で変更することができる。当該操作のための方法は当技術分野で一般に周知である。例えば、酵素のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の改変の方法は、当該分野で周知である。置換は、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、類似の側鎖を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換することである。保存的置換は、酵素全体が空間形態を保持するが、生物活性を変化させるように、アミノ酸の役割またはアミノ酸の側鎖のサイズ（あるいは、側鎖内のサイズ、電荷または一種の化学基）を最小に変化させることを可能にする変化アミノ酸との置換である。例えば、一般的な保存された変化は、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎに対するＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅに対するＨｉｓ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕに対するＡｓｐおよびＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙに対するＳｅｒであってもよい。アラニンは、一般的に他のアミノ酸に置換するために使用される。以下のように２０個の必須アミノ酸を分類することができる、以下、非極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン、非荷電極性側鎖を有するグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン、酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸、並びに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニン、およびヒスチジン。
２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈での「配列同一性」または「同一性」は、本明細書に使用するとき、配列比較アルゴリズムによって、または目視検査によって測定すると、特定の比較ウインドウにわたって最大一致のために整列したときに同じである２つの配列の残基の特定の割合を意味する。配列同一性の割合をタンパク質に関して使用するとき、同一でない残基の位置は、保存アミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）でその他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性の割合は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整することができる。当該保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。通常、完全なミスマッチより部分として保存的置換をスコアリングすることを含み、それにより配列同一性の割合を増加させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換に０のスコアを与えられる場合では、保存的置換は０と１の間のスコアを与える。例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）で実行するように、保存的置換のスコアを計算する。
実施例１
膨大な数の研究が、タンパク質凝集を、ＡＤ、パーキンソンおよびレビー小体型認知症を含む神経変性疾患と関連付けた。数多くの近年の研究は、これらのタンパク質の特定のオリゴマー形態がニューロン毒性に関連し、長期増強作用を含む重要な機能を妨げ得ることを示唆する。種々の可溶性オリゴマー種のＡβおよびａ‐ｓｙｎは、ＡＤおよびＰＤの過程中の早期に生じることを示し、ますます増える証拠が、ＡＤおよび他のタウオパチーにおけるタウのオリゴマー形態を関係付ける。
ＣＳＦにおけるタウオリゴマー含有量を研究するための分析が開発され、最初の結果は、非ＡＤ抗体と比較して、ＡＤのＣＳＦにおける増加したレベルのタウオリゴマーを示唆する。我々は、組換え型ヒトタウアイソフォームを精製し、ジスルフィド結合により形成されるそれらのオリゴマー構造を安定させるための新規な方法を開発した。また、我々は、その過剰リン酸化を保持するヒトＡＤ脳からタウを精製した。これらの調製物は、単量体ではなく細胞外タウオリゴマーが、海馬シナプスの長期増強および連想型の恐怖の記憶の形成を阻害したことを示すために、マウスにおいて使用された。ＡＤタウのオリゴマー調製物は、タウの過剰リン酸化が記憶の阻害に影響しないことを示す類似の効果を生み出した。タウオリゴマーとともにとられるのは、疾患関連の影響を生み出し、創薬のための標的としてこれらの構造を検証するのに必要なタウの形態であった（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１０． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ中， Ｍｏｅ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｕ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．， ＣＡ）。
また、我々は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）のイメージング性能を抗体ライブラリーの多様性と組み合わせる、新規なバイオパニング技術を開発した。抗体の多様性とイメージング性能のこのユニークは組み合わせは、我々が、Ａβおよびアルファ−シヌクレイン（ａ‐ｓｙｎ）を含む神経変性疾患を伴うキータンパク質の形態のアレイへの単鎖抗体可変ドメインフラグメント（ｓｃＦｖまたはナノボディ）試薬を単離することを可能にした。我々は、単量体（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３： ｐ． ２８７１−２８７８）、原線維（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９： ｐ． ４９７−５０２）、および２つの異なるオリゴマーａ‐ｓｙｎ形態（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １１０４８−５８）を特異的に認識するナノボディを単離した。抗オリゴマーａ‐ｓｙｎナノボディは、オリゴマーＡβと交差反応せず、ＰＤ脳組織を特異的に標識するが、ＡＤまたは健康な組織を標識しない（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １１０４８−５８）。また、我々は、ナノボディを、全長Ａβの異なる領域に（Ｌｉｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ （Ａｂｅｔａ） ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ Ａｂｅｔａ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３： ｐ． ６９５９−６７）、および３つの別個の天然由来のオリゴマーＡβ形態に（Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａｂｅｔａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８． ３８４： ｐ． ９１７−２８）単離した。１つの、Ａ４は、より大きなオリゴマーＡβ種を特異的に認識し、Ａβの細胞外毒性および凝集を阻害し、オリゴマーａ‐ｓｙｎと交差反応せず、ヒトＡＤ脳サンプルにおけるＡβ凝集体を特異的に標識するが、ＰＤまたは健康な脳組織を標識しない（Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａｂｅｔａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８． ３８４： ｐ． ９１７−２８）。第２のナノボディ、Ｅ１は、より小さな三量体または四量体Ａβ種を認識し、並びにＡ４と同様に、Ａβの細胞外毒性および凝集を阻害し、オリゴマーａ‐ｓｙｎと交差反応せず、ヒトＡＤにおけるＡβ凝集体を標識するが、健康な脳組織を標識しない。Ｄｒ． Ｓｅｌｋｏｅから得たＡＤ脳由来オリゴマーＡβ調製物を利用して（Ｗａｌｓｈ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００２． ４１６： ｐ． ５３５−９； Ｗａｌｓｈ， Ｄ．Ｍ． ａｎｄ Ｄ．Ｊ． Ｓｅｌｋｏｅ， Ａｂｅｔａ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ − ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ２００７）、我々は、ヒトＡＤ脳組織由来のオリゴマーＡβ種を特異的に認識するが、インビトロで生成されたＡβ凝集体を認識しない、第３のナノボディ、Ｃ６を単離した。各ナノボディの異なる特異性は、それぞれのナノボディが糸状バクテリオファージの表面に発現される場合に容易に観察され得、抗体／抗原複合体が、ＡＦＭにより結像される（Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｆｏｒｍ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ， ２０１０．）。よって、抗体ライブラリーおよびＡＦＭイメージング技術の組み合わせは、我々が、４つの異なる天然由来の凝集された形態のａ‐ｓｙｎおよび４つの異なる天然由来の凝集された形態のＡβを含む特定のタンパク質変異体を認識する試薬を単離し、かつ注意深く特徴づけることを可能にする。
我々のＡＦＭパニングプロトコルの別の強力な利点は、我々が特定のタンパク質形態に対する試薬を単離して特徴づけ得ることだけでなく、我々は、よって、たった数ピコグラムまたはそれ以下の材料を用いて行うことができることである。また、サンプルは、精製されることを必要とせず、タンパク質は、何らかの方法で化学的に変更される必要がない。我々は、実際に、標的抗原の単一分子に対するナノボディを単離することができる（Ｓｈｌｙａｋｈｔｅｎｋｏ， Ｌ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００７． ３： ｐ． １９２−７）。異なるタウアイソフォームを単離するための、および個々のタンパク質変異体を特異的に認識する試薬を生成して特徴づけるための性能の、このユニークな組み合わせは、我々に、ヒトＡＤ脳に存在する異なるタウ変異体のアレイを特異的に認識する試薬を生成するための手段を提供する。
単量体およびリン酸化タウを認識し得るいくつかの試薬がすでに存在しているが、これらの試薬は、異なる凝集された状態のタウの間の区別ができない。タウの特定の形態を検出し得る試薬は、ＡＤおよび他のタウオパチーの診断を促進させるための、およびこれらの病気の進行をフォローし、または治療ストラテジーを評価するための非常に強力なツールを提供し得る。多くの神経変性疾患は、臨床症状並びに炎症のマーカーにおける増加のような細胞および生化学的メカニズム、並びに類似のタンパク質の凝集が重複するが、本明細書で我々が開発することを提案する試薬は、選択されたタウ形態についての特異性および選択性を十分に定義し、ＡＤおよび他のタウオパチーの特異的な診断を促進するはずある。Ａβおよびａ‐ｓｙｎ種に対する形態に特異的な試薬と他のタンパク質との組み合わせにおいて、これらの試薬は、ＡＤ、ＰＤ、ＦＴＤ、およびＬＢＤを含む多くの関連される神経変性疾患を容易に検出して区別し得る、バイオマーカーの存在を検出するために使用され得る。
ヒトＡＤ脳組織由来の異なるサイズのオリゴマータウ種の単離。
異なるタウアイソフォームのアレイおよび凝集されたアッセンブリが、ＡＤおよび他のタウオパチーにおいて決定的に重要であることが示された。異なるタウ種を特異的に標識し得る試薬は、異なる形態の役割を明らかにするために必要とされる。可溶性タウオリゴマーが、過剰リン酸化、トランケーション、ニトロシル化、ユビキチン化、およびグリケーションのようなＡＤと関連する複数の翻訳後修飾並びに異なる数のサブユニットおよびアイソフォーム組成物を有するオリゴマーを単離するために、免疫親和性およびサイズ分画を用いて精製される。ある実施形態のオリゴマーは、ベータアミロイド、ＡｐｏＥ、およびアルファ‐シヌクレインのような既知のタウ関連タンパク質を含む異種性である。ＡＤに関連される他のタンパク質とのタウの異常な結合は、また、ナノボディの選択について疾患特異的形態を生成することを促進することが予期される。さらに、ナノボディは異なるタウ変異体に対して生成され、ナノボディは、どの形態のタウが脳およびＣＳＦサンプルにおける健康な組織からＡＤを最も区別するのかを識別するために使用される。
方法。脳由来オリゴマータウの調製。タウオリゴマーは、ニューヨーク脳バンク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ）（Ｔｈｅ Ｔａｕｂ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から取得されたタウ病理により、正常な脳およびＡＤ脳検体から精製される。１０グラムの組織が、異なるサイズの種のタウオリゴマーを単離するための変更を有する、Ｉｖａｎｏｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．により開発された方法（Ｉｖａｎｏｖｏｖａ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｔａｕ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００８． ３３９： ｐ． １７−２２）を用いて各調製のために使用されるであろう。この方法の利点は、産生物のタウリン酸化の保持、簡素性、および高い純度を含む。我々は、すでに、ＡＤ脳検体からタウを単離するために、この方法の変更されたバージョンを使用し、リン酸化状態が保持されることを示した。ＡＤ脳から精製されたタウおよび組換え型タウ４４１のイムノブロット分析は、ＡＤタウによるチロシン２３１および２１７に対するタウホスホ‐エピトープ‐特異的抗体の特異的な相互作用を示すが、組換え型タウによる反応は示さず、一方、総タウに対するホスホ‐独立モノクローナル抗体ＨＴ７は、組換え型およびＡＤタウの両方と相互作用する。
脳組織は、冷却した１％過塩素酸中でホモジナイズされ、２０分間氷上でインキュベートされ、２０分間１５，０００×ｇで遠心分離される。清澄な上清が濃縮されて、バッファが、Ａｍｉｃｏｎ遠心力装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）に交換される。清澄な上清のゲルおよびイムノブロット分析は、二量体および三量体とサイズにおいて一致するいくつかの主なバンドを有するスメアの出現を生じさせる、多様なタイプの変更を有するタウの多様なサイズの凝集体の存在を示した。これらの種は、以下に記載される非変性方法により精製された。還元剤による調製の処理は、少なくともいくつかのタウオリゴマーが、ジスルフィド結合により安定されたことを示す、より少ない量のより高分子量な種をもたらす。インキュベーション時間は、より高いオーダーのオリゴマータウの含有量を増加または減少させるために変更され得る。
オリゴマータウの精製および特徴づけ。他のタンパク腫由来のオリゴマータウを精製するための親和クロマトグラフィーが、モノクローナル抗体ＨＴ‐７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行われる。我々は、ＨＴ‐７により認識されるタウエピトープは、それがリン酸化の状態と独立してタウと結合するために、タウオリゴマーにおける結合に使用できることを観察した。抗体（６ｍｇ）は、製造者のプロトコルに従って、ＣＮＢｒ活性化セファロースに結合され、Ｐｏｌｙ‐ＰｒｅｐカラムＣ１０／１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内に充填されるであろう。脳の抽出物は、０．２ｍｌ／分の流量で濾過され、非結合タンパク質がバッファで洗い落とされる。タウは、非還元のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析前に、５０μｌの１ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ９で中和される０．５ｍｌ分画において、０．１Ｍグリシン ｐＨ２．６で溶出される。
タウオリゴマーは、高圧液体クロマトグラフィー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ３２Ｋａｒａｔ ＨＰＬＣ）を用いて特徴づけられ、分画されるであろう。高分解能（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ゲル濾過コラム（Ｂｉｏｓｅｐ−ＳＥＣ−３０００， Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）は、単量体（４５．９ダルトン）から十二量体（５５２ＫＤ）までのサイズ範囲にわたるタウオリゴマー種を分離するために使用される。Ｂｉｏｓｅｐ‐ＳＥＣ‐３０００は、天然の条件下で５から７００ｋＤａの除外範囲を有する。カラムは、室温で均一濃度の条件、および４０分のランタイムを用いる１×ＰＢＳバッファを用いて流される。ＢＳＡ（６８ｋＤａ）は、これらの条件下で、２４．８分の保持時間で移動する。様々なオリゴマー（二量体、三量体、四量体…十二量体）が、存在する種によっていくつかの重複が予期されるが、カラムを用いて分離されことが期待される。非還元のＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび免疫ブロットが、分画におけるタウ含有量を分析するために使用される。ＡＦＭが示されるように、分画におけるタウオリゴマーのサイズ分布を測定するために使用される（図１参照）。
ＡＤ脳組織から単離された特定の脳由来オリゴマータウ形態に対するナノボディの生成および特徴づけ。
我々が特定のタンパク質形態を認識するファージディスプレイライブラリーから個々のクローンを容易に単離することを可能にするプロトコルを我々は開発した。我々は、精製できないまたは不安定である限られた量において使用できる、標的に対する試薬の単離を促進させる我々のパニングプロトコルを洗練させることを継続した。単量体、原線維およびａ‐ｓｙｎの２つの異なるオリゴマー形態、並びに単量体、原線維および２つの異なるオリゴマーβアミロイド種に対するナノボディの単離がこれまで行われた。また、第３の別個のオリゴマーベータアミロイド形態に対するナノボディの単離が行われてきた。ここで、我々は、非特異的かつ望ましくない結合活性を除去するために追加のネガティブなパニングステップを含み、そのため事実上すべてのクローンが、標的抗原を特異的に認識するたった１つのラウンドのパニング後に単離した。この技術を用いて、我々は、たった数ナノグラムの標的を用いて、種々の形態特異的リガンドを単離し得る。また、我々は、リガンド結合を特徴づけるために、ＡＦＭによるプロトコルを開発し（Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ＡＦＭ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２００８）、そのため我々は、最小の材料のみにより形態特異的リガンドを単離することができるたけでなく、我々は、そのうえ、限定された材料で結合特性を特徴づけることができる。このユニークな技術は、我々が論証してきた特定のタンパク質形態に対するリガンドを単離することに理想的に適している。
我々は、合成的な架橋結合タウ単量体により生成された異なる形態のタウに対するナノボディを単離するために類似のパニングプロトコルを行ってきた。研究では、我々は、合成二量体タウを特異的に認識するが、単量体または合成三量体タウを認識しないナノボディを単離した。
方法。タウ凝集体に対するＡＦＭパニング。脳由来のタウ凝集形態に対するナノボディが、以前記載したように単離される（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９： ｐ． ４９７−５０２； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １１０４８−５８； Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａｂｅｔａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８． ３８４： ｐ． ９１７−２８）。たった数ナノグラムの材料が、本パニングプロトコルのために必要とされる。パニングプロトコルから単離されたナノボディがオリゴマータウを認識することを確実にするために、脳由来のオリゴマータウサンプルでのポジティブセレクションの前に、一連のネガティブセレクションが行われた。まず、ネガティブパニングステップが、すべての非特異的な粘着性のナノボディを取り除くために、対照タンパク質ＢＳＡで行われる。次に、ネガティブパニングステップが、すべてのナノボディ結合単量体タウを取り除くために、脳由来単量体タウを用いて行われる。その後、ネガティブパニングステップが、タウとともに精製するかもしれないあらゆる脳タンパク質および非疾患関連形態のタウ（主に異なる単量体形態）に結合するナノボディを取り除くために、ＡＤ脳サンプルと同様に調製された、対照の非疾患の脳サンプルを用いて行われる。非標的サンプルに結合するすべてのファージがＡＦＭにより取り除かれている、各ネガティブパニングステップ後に検証が行われる。残りのファージのアリコートが、非標的サンプルおよび非結合ファージが取り除かれている新鮮なアリコートを含み、マイカに添加される。あらゆるファージが、まだ、オフターゲットのサンプルに結合していることが確認される場合には、第２のラウンドのネガティブパニングが実行される。プロセスは、オフターゲットサンプルに結合する残りのファージなくなるまで繰り返される。ネガティブパニングステップ後に、残りのファージは、記載されるように回収されたポジティブクローンおよびポジティブ脳由来のタウオリゴマーサンプルに添加される（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９： ｐ． ４９７−５０２； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １１０４８−５８； Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａｂｅｔａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８． ３８４： ｐ． ９１７−２８）。
ナノボディの特徴づけ。標的抗原の可用性および安定性により異なる標的タウ形態に対して単離されたそれぞれのナノボディの結合特異性を測定するために使用し得る、数多くの技術がある。
ビアコア、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはドットブロットを用いる特異性。適正な量で取得し得るこれらのタウ形態について、急性の結合キネティクスビアコアＸバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴により測定され得る。化学的固定化は、種々の凝集されたタンパク質形態に影響を及ぼすかもしれないため、結合特異性は、標的凝集形態を精製することがどのように容易となるかにより、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはドットブロットにより測定され得る。これらの分析のそれぞれについてのプロトコルが公開されている（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３： ｐ． ２８７１−２８７８； Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ２５−３５ Ａｂｅｔａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｂｅｔａ４２． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００６． ４５： ｐ． １１５３２−９； Ｌｉｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ （Ａｂｅｔａ） ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ Ａｂｅｔａ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３： ｐ． ６９５９−６７； Ｚｈｏｕ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００４． １０： ｐ． １０２３−３１； Ｌｉｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｉｄｕｅｓ １７−２０ ａｎｄ ３０−３５ ｏｆ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｙ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ， ２００４． ７５： ｐ． １６２−７１； Ｌｉｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ａｌｔｅｒ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３： ｐ． ９９９９−１０００７）。
ＡＦＭを用いる特異性。オリゴマータウサンプルが、上記のようなウエスタンブロットのような従来の手段によりナノボディ特異性について測定することができない場合、異なるＡＦＭによる方法が、上記のような分析について適切ではない、またはわずかな限られた量で使用可能である、抗原標的についての抗体特異性を測定するために使用され得る。ナノボディの特異性は、記載されているように高さ分布分析により（Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ＡＦＭ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２００８）、結像を認識することにより（Ｍａｒｃｕｓ， Ｗ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｓｃＦｖ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＢＲＧ１ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＭ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００６． ３４２： ｐ． １１２３−９）、またはファージディスプレイナノボディを用いることにより測定され得る（図１参照）。
健康なものおよびＡＤ患者由来のＣＦＳおよび脳組織間を区別するオリゴマータウ特異的ナノボディの識別。
個々のナノボディが、健康なものとＡＤ症例とを区別するための最も高い可能性を有する、これらのナノボディ試薬を識別するために、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、および免疫組織化学を用いて正常なおよびＡＤ脳組織検体に対してスクリーニングされる。
方法。ウエスタンおよびドットブロット分析：全ての分析が、基本的に記載されるように行われる（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １１０４８−５８）。
脳組織の免疫組織化学。脳組織は、３０分間、０．１％トリトンＸ‐１００で前処理される。その後、ナノボディが脳切片に添加され（０．２ｍｇ／ｍｌ）、室温で１時間インキュベートされる。一次抗体（ＢＳＡ３％において、マウス抗ｃ‐Ｍｙｃおよび抗シナプトフィシン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）１／５００希釈）が、その後、アプライされて、室温で１時間インキュベートされる。脳切片は、ＰＢＳで３回洗浄され、ＢＳＡ３％において、１／１０００希釈の二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、４５分間室温でインキュベートされる。画像が６０×の倍率で、共焦点顕微鏡により撮られる。
実施例２
アルツハイマー病（ＡＤ）は、蔓延している神経変性疾患であり、進行性ニューロン損失および認知障害が観察される。約５００万人のアメリカ人がＡＤを有して生きており、この数字は、２０５０年までに３倍になると考えられている。残念なことに、治療法はまだ見つかっていない。主な薬理学的アプローチは、アセチルコリン抑制物質のような症状の治療である。ＡＤは、２つの神経病理学的特徴、アミロイドベータ原線維の細胞外沈着または拡散および細胞内のタウの神経原線維変化（ＮＦＴ）を有する。ますます増える証拠は、タンパク質の誤った折りたたみ、凝集、および原繊維形成の特徴がともにＡＤの病因に密接に関連することを示唆する。正常なタウは、ニューロンの微小管をアセンブルし、かつその構造および生理学的機能を安定化することにおいて重要な役割をはたしているが、異常に過剰リン酸化したタウおよびそのオリゴマー並びに凝集形態は、シナプス損失と関連付けられると考えられる。正常なタウ機能を乱すことなく凝集プロセスにより潜在的に妨げる、単量体または凝集されたタウまたはあらゆる非特異的タンパク質を上回ってオリゴマータウを標的とする試薬が必要とされる。その上、そのような試薬により、凝集されたタウではなく、タウオリゴマーを検出することは、ＡＤ症例の早期ステージにおける有望な診断上のアプローチである。
本明細書に記載されるように、タウオリゴマーに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、このような試薬である。抗原でのたった１つのエピトープに対して特異的である１つの抗原結合部位を作成するためのｓｃＦｖは、一対の重鎖および軽鎖可変ドメインの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の融合物である。ｓｃＦｖ特異性は、親和性成熟により増加され得る。ｓｃＦｖは、ＡＤの後期において損なわれる前に、血液‐脳‐バリアを潜在的に透過する、より小さな分子量（２９ｋＤ）を有する。定常ドメインの欠失により、ｓｃＦｖは、臨床検査において炎症を誘導する見込みはない。ｓｃＦｖスクリーニング、回復（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ）、複製を遂行するために、６．７×１０９バラエティまでのヒトファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーであるシートファージミドライブラリーを我々は使用した。個々のファージディスプレイｓｃＦｖクローンは、その表面に発現されて、ｇ３ｐと結合されたｓｃＦｖの分子を有する糸状バクテリオファージである。遺伝子改変を促進するための一般的な大腸菌系統への感染および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）により識別されることは容易である。
我々のラボで使用可能なタウ種のすべてのうち、最も毒性のあることを乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）試験において示す、三量体タウに特異的なｓｃＦｖクローンを得るために、ファージディスプレイライブラリーとＡＦＭを組み合わせる新規なバイオパニングを、我々は成功的に行った。ＤＮＡ配列の変更後に、Ｆ９Ｔは、オリゴマータウに対する特異性を保持し、効率的な可溶性ｓｃＦｖの発現および精製を示す。また、Ｆ９Ｔは、その両方がＡＤにおける異常なタウに富む、ヒト中側頭回（ＭＴＧ）組織およびヒト脳脊髄液でＮＤからＡＤを判別する可能性を論証する。
結果
Ｉ．ＡＦＭバイオパニングプロトコルを用いて、精製されたタウ二量体、三量体、混合されたオリゴマー、および単量体サンプルを使用する異なるタウオリゴマー形態に対するｓｃＦｖを選択する。
Ａ．ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫株およびそのコリン作動性分化形態でＬＤＨ試験によるタウの最も毒性のある形態を選択する。
我々の抗体断片ライブラリーにより標的とするための最も有望なオリゴマータウ種を識別するために、我々は、まず、どのタウ種が神経細胞系に対して毒性があるのかを試験した。我々は、単量体、二量体、または三量体タウで処理された未分化かつコリン作動性様のＳＨ‐ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞を用いて細胞生存率分析を行った。我々は、タウの異なる２つのアイソフォーム、４Ｎ１Ｒと４Ｎ２Ｒを試験し、記載されているようにＬＤＨ分析用いて毒性を測定した。図２（Ａ）および（Ｂ）に示されているように、三量体タウ４Ｎ１Ｒと４Ｎ２Ｒは、未分化のＳＨＳＹ‐５Ｙ細胞に対する毒性があったが、単量体および二量体タウではなかった。本質的に同じ結果が、ＳＨＳＹ‐５Ｙ細胞が単量体、二量体、または三量体タウにより処理する前にコリン作動性様表現型（データは示さない）へと最初に分化される場合に得られた。三量体タウにより引き起こされる毒性は、濃度依存性を示した。これらの結果は、三量体タウがＡＤの進行において決定的に重要な種であるかもしれないことを示唆する。
Ｂ．シートファージミドライブラリーを用いる精製された合成三量体タウ４Ｎ１Ｒに対するバイオパニング。
我々は、異なるタウ種に対する単鎖可変フラグメント（ナノボディ）を単離するためのバイオパニング研究を行った。我々は、ファージディスプレイ抗体技術の結合多様性をＡＦＭの結像性能と組み合わせる新規なバイオパニングプロトコルを利用する。標的タンパク質の特定のオリゴマー形態に対するナノボディを単離するために、我々は、所望でないタンパク質形態に結合するクローンを取り除くためにネガティブパニングステップを含むプロトコルを変更した。オリゴマータウに対するナノボディを単離するために、我々は、２つのネガティブパニングステップを組み込んだ。第１のネガティブパニングステップでは、我々は、一般的なタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するパニングにより、すべての非特異的な「粘着性の」クローンを取り除く。第２のネガティブパニングステップでは、我々は、所望でない単量体形態のタウに結合するすべてのクローンを取り除く。我々のネガティブパニング中に、我々は、できる限り多くの所望でないクローンを取り除いた。我々は、このステップ中にオリゴマータウクローンを損失したくなかったため、単量体タウの純度は重大であった。我々は、単量体タウと結合するファージクローンを取り除くためのネガティブパニングのために、純粋な単量体タウのサンプルを得て、その後、二量体および三量体特異的クローンをぞれぞれスクリーニングするために残りのファージのアリコートを使用した。我々は、三量体タウ種が単量体または二量体よりもヒト神経細胞系により一層の毒性があることを発見したため、我々は、三量体タウ４Ｎ１Ｒについて選択的なファージクローンを単離することに我々の努力を集中した。
Ｃ．ＡＦＭによる三量体タウ４Ｎ１Ｒに特異的なモノクローナルファージのスクリーニング
ＢＳＡおよび単量体タウに対するネガティブパニング後に、我々は三量体タウ４Ｎ１Ｒに対するポジティブセレクションから約１００のクローンを回収した。オリゴメトリクス（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｘ）により我々に提供されるタウサンプルの量は制限されていたため、我々は、その１００のクローンが単量体タウを上回る三量体についての高い特異性を有することを測定するために、従来のＥＬＩＳＡによるそれぞれのファージをスクリーニングすることはできなかった。代わりに、我々は、異なるタウ種を結合するためにＡＦＭにより、それぞれの個々のファージクローンをスクリーニングした。我々は、マイカ基板にこれまで固定されていた単量体、二量体、および三量体タウサンプルにより各ファージサンプルをコインキュベートした。非結合ファージが過剰なストリンジェントなリンスにより取り除かれ、残りの結合ファージはＡＦＭにより結像された。このような方法で、すべての１００のクローンをスクリーニングした後に、二量体または三量体タウのいずれかには選択的に結合するが、単量体タウには結合しないクローンを我々は識別した。分析はかなりの時間がかかるが、ＡＦＭパニングプロトコルは、我々が、たった数ナノグラムの抗原を用いて、結合特異性についてすべての１００のクローンをスクリーニングすることを可能にする。すべての１００のファージクローンをスクリーニングした後に、我々は、三量体タウについての最も高い特異性に基づくさらなる研究のために６つのクローンを選択した。
Ｄ．単離されたクローンのＤＮＡ配列およびフレームシフト修正。
我々は、全長ｓｃＦｖがコードされたことを確実にするために、６つのクローンのそれぞれのＤＮＡ配列を検証した（図４）。６つのケースのそれぞれにおいて、１つの塩基対がコード配列の始めにて欠失していた。さらなる特徴づけのため可溶性ｓｃＦｖを産生するために、我々は、ｓｃＦｖの効率的な発現を可能にするためにフレームシフトを修正することを必要とした。我々が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりそれぞれのｃＦｖ配列を変更し、フレームシフトを修正することを可能にする、フォワードおよびリバースプライマーを我々は設計した（例えば、図３参照）。我々は、その後、識別のためのｃ‐ｍｙｃタグおよび精製のためのポリヒスチジンタグをも含んだ修正されたｓｃＦｖ配列を発現プラスミドでクローニングした。修正されたＦ９クローン、Ｆ９Ｔは、非常に高いレベルで発現し、容易に精製され、かつＡＦＭによりみられるファージ形態において、単量体タウおよび原線維タウを上回るオリゴマータウについての高い特異性を維持し、そのため、このクローンは、さらなる研究のために選択された。
ＩＩ．ＡＤ脳切片における疾病特異性を示すフラグメントを選択する。
Ａ．年齢のアルツハイマー病および認知障害のない脳切片での選択されたナノボディの予備的特異性および親和性試験
単量体タウは、微小管アッセンブリおよび安定性において重要な役割を果たすが、オリゴマータウは細胞に対して毒性がある。オリゴマータウは、タウの過剰リン酸化および他の翻訳後修飾（ｐｏｓｔｔｒａｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらかもしれない。オリゴマータウは微小管から外れて（ｄｅｔｔａｃｈ）、その後、アルツハイマー病の顕著な特徴である、神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）を形成するためにさらに凝集するかもしれない。タウの誤った折り畳みおよび凝集が、アミロイド‐ベータ（Ａβ）の凝集および誤った折り畳みで親密に結合され、そのため、これらのタンパク質の異なるオリゴマー形態検出は、アルツハイマー病の診断および治療における見込みを有するであろう。我々は、神経外のプラーク度数（ｐｌａｑｕｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）により定義された、異なるＢｒａａｋ病期アルツハイマー病の脳の中側頭回から得られた、ホモジナイズされた死後の脳組織を用いて、三量体タウに対するＦ９Ｔナノボディの反応性を分析した。すべての脳のサンプルは同齢のものであり、バナー・サン・ヘルス研究所（Ｂａｎｎｅｒ Ｓｕｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からＴｈｏｍａｓ Ｇ． Ｂｅａｃｈにより寛大に提供された。我々は、認知障害のないソースから得られた６つのサンプルを分析した（ＮＤ１からＮＤ６）。ＮＤサンプル、痴呆の明白な症状（ｓｙｍｐｔｏｎ）がないことを論証された患者は、Ａβプラークの存在：ＮＤ１、ＮＤ２、およびＮＤ３がＡβプラークを有しない（Ｂｒａａｋ病期ＩからＩＩ）が、ＮＤ４、ＮＤ５、およびＮＤ６のすべてがわずかなプラーク度数を有する（Ｂｒａａｋ病期ＩからＩＩ）に基づく２つのカテゴリーに入れられた。６つのアルツハイマー病の脳組織試料（ＡＤ１からＡＤ６）がアルツハイマー病を有すると診断された患者由来であった。サンプルはプラーク度数により分けられ、ＡＤ１、ＡＤ２、およびＡＤ３脳サンプルが中程度の度数のプラーク（Ｂｒａａｋ病期ＩＩＩからＩＶ）を示し、一方、ＡＤ４、ＡＤ５、およびＡＤ６脳サンプルが最も深刻なプラーク度数（Ｂｒａａｋ病期ＩＩＩからＩＶ）を示す。両方のＦ９Ｔ調製物は類似の反応性を示し、最も強いシグナルはＡＤ２およびＡＤ３から得られるが、強いシグナルが６つのＡＤサンプルのうち５つにより得られる。興味深いことに、いずれのＡβプラークも含まない認識的に正常な組織試料のいずれによっても、ほとんど反応性はない。プラークを含む３つの認識的に正常なサンプルは、上記のように、Ａβ凝集とタウ凝集間の相互作用を示唆する反応性を示した。別の興味深い傾向は、ＡＤ１〜３サンプルがＡＤ４〜６サンプルよりも平均的により高い反応性を有することである。ＡＤ４〜６サンプルの高いプラーク度数が、より多い神経原線維のタウおよびより少ないオリゴマータウの存在を示すかもしれない。
Ｂ．潜在的診断技術としてのヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）で選択されたナノボディディスプレイファージＦ９Ｔの予備的特異性試験
ＣＳＦにおける総タウ（Ｔ‐タウ）およびリン酸化されたタウ（Ｐ‐タウ）レベルは、いくつかの理由のためにアルツハイマー病についての重要なバイオマーカーである。ＡＤのＣＳＦにおけるＴ‐タウレベルの増加は、高い感受性を有する認知障害のない同齢の対照から、散発性のＡＤを判別し得る。Ｔ‐タウレベルは、また、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）およびレビー小体病（ＬＢＤ）のような、ＡＤ以外の他の痴呆へのより広い使用を可能にする、ニューロンのおよび軸索変性を反映する。他の一般的な痴呆および通常の加齢における正常なレベルのＰ‐タウと比較して、Ｐ‐タウレベルがＡＤにおいてきわだって増加する。この特徴をＣＳＦにおける減少したＡβ４２と組み合わせ、有望な診断アプローチを得ることができる。アミロイドの他の形態を上回ってタウを認識するＦ９Ｔの性能が、そのようなアプローチの重要な部分となり得る。ヒトＣＳＦタンパク質とのＦ９Ｔナノボディディスプレイファージの相互作用が原子間力顕微鏡法により結像される。予備的な結果は、ＡＤのＣＳＦが増加したレベルの総タウを含むという事実に従っている、ＮＤにおいてファージがないのに対してＡＤにおいて結合するファージの存在を論証する。パラメータが調製されるかもしれないが、このテストが必要とするのは、ＣＳＦタウレベルを検出する潜在的により感受性のある方法並びにＡＤおよび他のタウオパチーについての有望な診断技術である。
実施例３
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が、毎年１７０万人に影響を及ぼし、２３０，０００の兵士が戦場でＴＢＩを被っている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｖｂｉｃ．ｏｒｇ／ｔｒａｕｍａｔｉｃ−ｂｒａｉｎ−ｉｎｊｕｒｙ−ｔｂｉ−ａｗａｒｅｎｅｓｓ−ａｎｄ−ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。イラクおよびアフガニスタンで勤める兵士の約１０〜２０％が、異なるソースからＴＢＩを被っている。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が認知機能を崩壊させ得ることが十分に確立される。脳はストレスおよび損傷に対して非常に敏感であり、種々の神経形態的および神経化学的変化を発現することにより応答する。ＴＢＩはタンパク質輸送メカニズムへのダメージおよび軸索損傷を誘発し、そのため、ＴＢＩに続いて軸索にて蓄積するタウのようなニューロフィラメントタンパク質は、ＴＢＩにおいて重要な役割を果たす。ＴＢＩに続いて、脳液、ＣＳＦ、および血清サンプルにおけるタウの増加したレベルは、すべて、予測の有害な長期の臨床結果である。神経原線維のタウ凝集体が、ＴＢＩを被っている兵士並びに繰り返しの頭部外傷を被るフットボールプレイヤーのような多くのアスリートにおいて識別されており、これらの傷害の後ろに類似のメカニズムを示唆する。タウの凝集体は、また、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳における顕著な特徴である主な神経原線維変化の成分であり、ＴＢＩは、ＡＤについてのリスク因子である。よって、タウは、明らかに、脳機能、特に認知機能において重要な役割を果たし、認知機能をサポートするタウの性能は、ＴＢＩに続いて害される。
軽い外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）は、頻繁に、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびＡＤ、パーキンソン病（ＰＤ）、および筋萎縮性側索硬化症を含む他の神経変性疾患に導く。ＣＴＥおよび他の神経変性疾患に転換するためのｍＴＢＩの進行のメカニズムおよび危険因子は十分に知られてはいないが、脳の種々の領域におけるグリア変化および神経原線維変化（ＮＦＴ）におけるタウ凝集体の蓄積は、タウがＴＢＩに続いて神経変性を防止するための実行可能な治療上の標的であることを示す共通の特徴である。タウは、ＮＦＴでおよび異なるオリゴマー種でみられるβシート含有原線維形態を含む種々の凝集体形態へと異常に折り畳まれ得る、天然では折り畳まれていないタンパク質である（Ｇａｒｃｉａ−Ｓｉｅｒｒａ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔａｎｇｌｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ， ２００３． ５： ｐ． ６５−７７； Ｇｈｏｓｈａｌ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔａｕ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ， ２００２． １７７： ｐ． ４７５−９３； Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ （ｔａｕ） ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９８６． ８３： ｐ． ４９１３−７； Ｓｃｈｗｅｅｒｓ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗ ｎｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｂｅｔａ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９４． ２６９： ｐ． ２４２９０−７）。ＮＦＴはＡＤおよびタウオパチーにおける神経変性を媒介することに関係しているが、タウオパチーの動物モデルは、記憶の障害およびニューロン損失が、ＮＦＴの蓄積とは関連しないが、オリゴマー形態のタウ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔａｕ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｅｍｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００５． ３０９： ｐ． ４７６−８１）、並びにＮＦＴ病理とニューロン損失の領域的分離と十分に関連することを示している。ＡＤの進行に最も密接に関連するタウの病理的構造は、タウオリゴマーであることが示された（Ｂｅｒｇｅｒ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｕ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｌｏｓｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔａｕｏｐａｔｈｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２００７． ２７： ｐ． ３６５０−６２； Ｍａｅｄａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｒａｎｕｌａｒ ｔａｕ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ： ａｎ ｅａｒｌｙ ｓｉｇｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ， ２００６． ５４： ｐ． １９７−２０１； Ｓａｈａｒａ， Ｎ．， Ｓ． Ｍａｅｄａ， ａｎｄ Ａ． Ｔａｋａｓｈｉｍａ， Ｔａｕ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ： ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔａｕ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓ， ２００８． ５： ｐ． ５９１−８）。ニューロンの機能障害における原線維形態のＡβよりもむしろオリゴマーに関係する多くの研究と同様に、これらの研究はすべて、タウ変化よりもむしろオリゴマータウ凝集体が急性的神経毒性があり、神経変性表現型の原因であることを示す。よって、毒性のオリゴマータウ種は、ＴＢＩに続いて神経変性における重大な役割を果たすようである。オリゴマータウ種は、疾病進行の「感染性」のモデルにより神経毒性の一因となることが示されている。細胞外タウ凝集体は、細胞内でタウの誤った折り畳みを開始し得（Ｆｒｏｓｔ， Ｂ．， Ｒ．Ｌ． Ｊａｃｋｓ， ａｎｄ Ｍ．Ｉ． Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｉｄｅ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４： ｐ． １２８４５−５２）、タウの病理が早期から後期の疾病の脳にわたって連続して広がり（Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔ， Ｂ．， Ｒ． Ｚａｒｓｋｉ， ａｎｄ Ｔ．Ｇ． Ｏｈｍ， Ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｑｕｅｓ ａｎｄ ｔａｎｇｌｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ， ２００４． ２５： ｐ． ６９７−７１１）、正常なヒトタウを発現するマウスの脳内に導入される場合に、凝集された突然変異体のヒトタウを有するトランスジェニックマウスからの脳抽出物がタウの病理に伝達する（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｕｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２００９． １１： ｐ． ９０９−１３）。細胞外タウによるタウの病理の拡散についてのレセプター媒介メカニズムが記載されている（Ｇｏｍｅｚ−Ｒａｍｏｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｅｕｒ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００９． １９： ｐ． ７０８−１７）。これらの研究は、さらに、ＴＢＩ‐神経変性についての特に有望な治療上の標的としてオリゴマータウをサポートする。
本発明者らは、我々が、標的タンパク質の特定の形態に結合する試薬を単離することを可能にするユニークな技術を開発した。発明者らは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の結像性能を、ファージディスプレイ抗体技術の結合多様性と組み合わせて、我々が、特定のタンパク質形態の存在を識別し、その後、標的形態に結合する試薬を単離することを可能にした（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９： ｐ． ４９７−５０２）。発明者らは、異なる神経変性疾患間を区別することについて、および特定の毒性の凝集体種を標的とすることについて、非常に見込みがあり、毒性のオリゴマータウ種に選択的に結合する、単離されたいくつかのナノボディを近年有する、一連の形態特異的単鎖抗体断片（ナノボディ）を開発した。ナノボディは、ＡＤと健康な死後のヒト組織を区別し、死後のＡＤのＣＳＦサンプルにおけるオリゴマータウを検出し得る。ここで、発明者らは、マウスモデルにおいて、ＴＢＩに続いてタウの毒性をブロックするための治療としてオリゴマータウ特異的ナノボディを利用する。形態特異的ナノボディのプールは、また、異なる凝集されたタンパク質種の存在についてマウスの脳組織を分析するために使用される。
神経変性のマウスモデルの神経行動学的、生化学的、および神経病理学的特徴づけが（Ａｂｄｕｌｌａｈ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ＣＮＳ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｄｅｌａｙｅｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ Ｇｕｌｆ Ｗａｒ ａｇｅｎｔｓ． Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ． １３： ｐ． ２７５−８８； Ａｂｄｕｌｌａｈ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｂｒａｉｎ Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ Ａｎｘｉｅｔｙ−Ｌｉｋｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ Ｇｕｌｆ Ｗａｒ Ａｇｅｎｔｓ． Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ； Ｔｏｄｄ Ｒｏａｃｈ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ ｐａｔｈｗａｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ＰＳＡＰＰ ｍｉｃｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ２００４． １０１５： ｐ． １６１−８）、特に異なるＴＢＩモデルにおいて（Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ＴＢＩ ｏｕｔｃｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ａｎ ＡＰＯＥ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ． ２９： ｐ． ２４６−６０； Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２００９． １５９： ｐ． １３４９−６２； Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｆ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＡＰＰｓｗ）． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ２００７． １１８５： ｐ． ４５−５８； Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． １６８： ｐ． ８１１−９）、近年開発された単一の（ｓ‐ＴＢＩ）および反復性の（ｒ‐ｍＴＢＩ、４８時間の間隔で付与された５つの損傷）損傷の軽いＴＢＩ（ｍＴＢＩ）モデルを含み（Ｍｏｕｚｏｎ， Ｂ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｍｉｌｄ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ）、これまでに公開されている。野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、この損傷は、両方のパラダイムにおける急性のモーターおよび認知障害を論証するが、ｒ‐ｍＴＢＩに続いてより重要な欠損、および神経病理学的分析は、ｒ‐ｍＴＢＩマウスにおいて、より明らかに、軸索損傷および反応的なグリオーシスを示す。進行中の研究は、６、１２、および１８カ月におけるｒ‐ｍＴＢＩモデルにおける、進行性の神経病理学的変化および神経行動学的欠損の持続性を明らかにし、一方、ｓ‐ｍＴＢＩは、麻酔対照群の性能レベルに回復した。また、我々は、ヌルのマウスのタウバックグラウンドで非突然変異体ヒトタウのすべてのアイソフォームを発現する、ｈＴａｕトランスジェニックマウスに対するこのｍＴＢＩパラダイムを管理した。若いｈＴａｕマウスにおいて、ｒ‐ｍＴＢＩは、過剰リン酸化のタウを沈殿させるようにみえ、一方、高齢のｈＴａｕマウス（１８カ月）ｒ‐ｍＴＢＩは、グリアの活性化およびタウ病理の既存の負担を悪化させる。ｈＴａｕマウスにおけるこのｒ‐ｍＴＢＩモデルは、よって、タウ病原性を標的とする潜在的なＴＢＩ治療を評価するために理想的なプラットホームである。ＴＢＩに続いて、タウ起因性の毒性および記憶欠損は、炎症反応を開始しない組換え型抗体断片を用いて、毒性のオリゴマータウ種を選択的に標的とすることにより安全に低減され得る。
実施例４
神経毒性のオリゴマータウ種について選択的な単鎖可変フラグメントの単離および特徴づけ
アルツハイマー病（ＡＤ）は、影響を受けた個体において、脳萎縮、記憶低下、および認識（ｃｏｇｎｉｔｖｅ）の損失を引き起こす、破壊的な進行性の神経変性疾患である。アメリカで６番目の死亡の主因であり、現在、医療において２０００億ドルを超える年間コストにより、５４０万人以上のアメリカ人に影響を及ぼしている。ＡＤは、１００年以上前に初めて発見されたが、実質的な前進は、疾病の病因を理解することにおいてなされ、使用可能である有効な治療または決定的な診断アプローチはまだない。ＡＤは、２つの顕著な特徴の病態：アミロイド‐ベータ（Ａβ）の不溶性原線維凝集体を含む細胞外神経突起のプラーク、およびタウの原線維凝集体を含む細胞内の神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在により特徴づけられる。これらの不溶性凝集種は、ＡＤの主要な毒性の要素として長く考えられてきたが、ますます増える証拠は、Ａβおよびタウの両方の小さな可溶性オリゴマー形態が、原線維凝集体よりもＡＤの進行および発症において重大な役割を果たすことを示す。ＡＤにおけるＡβ凝集の役割は、特に広範囲にわたって研究されており、しかしながら、動物モデルにおける非常に有望な結果にもかかわらず、Ａβ凝集を標的とする種々の治療経路は、臨床試験において非常に限られた成功のみであった。Ａβを標的とする治療試験から得られたより期待外れの結果に部分的に起因して、タウの異なる変異体および凝集体形態の役割を解明するための研究を含む、ＡＤの進行におけるタウの役割がより注目を得ている。
タウは微小管に関連するタンパク質であり、一般的に、ニューロンの軸索に配置され、チューブリンからの微小管の安定化およびアセンブリを伴う。ヒトタウは、クロモソーム１７ｑ２１上の単一の遺伝子によりコードされるが、６つの主なタウアイソフォームは、エクソン２、３、および１０のオルタナティブスプライシングにより形成され得る。タウは、また、インビボで存在し得る幅広い種類の異なるタウ種をもたらす、とりわけ、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）、またはグリケーションにより翻訳後に変更され得る。過剰リン酸化したタウ種は、顕著な特徴のＮＦＴにおいて優勢にみられるため、タウのリン酸化が、広範囲にわたって研究されており、タウのリン酸化を伴うキナーゼを阻害することが、潜在的な治療のアプローチとして探究されてきた。過剰リン酸化したタウのレベルは、また、ＡＤについてのバイオマーカーとして研究されており、異なるタウアイソフォームの割合、特にリン酸化された変異体は、ＡＤおよびＦＴＤを含むタウオパチーと十分に関連がある。タウの微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）の過剰リン酸化は、生理学的機能の損失および誤った折り畳みを促進するコンホメーション変化をもたらす。しかしながら、タウのリン酸化は、また、新規な成体新生のグラニュールニューロンが相当量の過剰リン酸化した３つの繰り返しタウ変異体を含むので、成体神経新生を含むいくつかの細胞の機能のために必要とされるかもしれない。キナーゼ活性を調節することを目的とする治療ストラテジーは、タウの機能に依存する正常なリン酸化を中断するリスクを持つ。インビボで生じ得るタウの多くの異なる潜在的なアイソフォームの複雑性並びにタウ過剰リン酸化および凝集の生理学的効果に関する不確定性を与えられ、ＡＤにおける異なる過剰リン酸化したおよび凝集されたタウ変異体の役割は、議論の余地があるままであり、最も有望な診断または治療の標的はまだ未知のままである。
Ａβの可溶性オリゴマー凝集体により観察される神経毒性の効果と同様に、数多くの研究が、タウの可溶性凝集体がＡＤの病理において重要な役割を果たすことを示す。脳由来および組換え型オリゴマータウ凝集体種はともに、細胞内のカルシウムレベルを崩壊させ、細胞外で添加された場合に、培養されたヒトニューロン細胞に毒性がある。ヒトタウを発現する動物モデルにおいて、行動性の障害、ニューロンの喪失、およびシナプス傷害を含む、神経変性に関連する表現型は、原線維のＮＦＴレベルよりも、可溶性タウオリゴマーおよびプレフィラメント（ｐｒｅｆｉｌａｍｅｎｔ）種の存在とより関連する。ニューロンの喪失は、また、オリゴマータウ変異体のような他の種の併発を示唆するＮＦＴの形成を先行する。死後のヒト脳における、高いオリゴマータウレベルが、ＮＦＴの存在前に、ＡＤの早期のステージにて前頭葉皮質で検出された。オリゴマータウは、また、内在性タウの凝集をもたらす他の領域に、オリゴマータウにより播種された脳領域からＮＦＴタウ病理が広がる場合に、プリオン様メカニズムによる病理の伝染についての原因であるかもしれない。我々は、これまで、三量体であるが、単量体または二量体ではない凝集体が、ヒトニューロン細胞に毒性がある、非リン酸化組換え型ヒトタウ（ＮＰｒｈＴａｕ）を用いること示してきた。
ここで、我々は、毒性のＮＰｒｈＴａｕ三量体種を選択的に認識する試薬による抗体の単離を記載する。我々は、三量体タウ種と選択的に結合するｓｃＦｖを単離するための選択ツールとして、バイオパニングプロトコルによる原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）および結合多様性のソースとして（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９（１１）： ｐ． ４９７−５０２； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３６８（４）： ｐ． １１３２−４４； Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４（１７）： ｐ． １１０４８−５８； Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｎｏｎｔｏｘｉｃ ｆｏｒｍ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ， ２０１２． ３３（７）： ｐ． １３２０−８； Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｎｏｇｒａｍ ａｎｔｉｇｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ， ２０１３． ２９（２）： ｐ． ４６３−７１； Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ２５−３５ Ａｂｅｔａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｂｅｔａ４２． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００６． ４５（３８）： ｐ． １１５３２−９）、単鎖可変ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）ライブラリー（Ｓｈｅｅｔｓ， Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ： ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９８． ９５（１１）： ｐ． ６１５７−６２）を用いた。我々は、単量体タウおよび他のオフターゲットタンパク質によるすべてのｓｃＦｖ交差反応の除去を確実にするために、セレクションプロトコルにおいて、いくつかのサブトラクティブパニングステップを利用した。我々は、三量体に結合するが、単量体または原線維タウと結合しない、３つの異なるｓｃＦｖを識別した。３つの異なるｓｃＦｖは、すべて、三量体タウ凝集体で別個のエピトープと結合した。ｓｃＦｖは、Ａβとタウの両方を過剰発現するトランスジェニックＡＤマウスモデル由来の脳組織における天然由来のオリゴマータウと反応し、有意なレベルのオリゴマータウが、ＮＦＴが検出されるよりかなり前に、このマウスモデル由来の脳組織に存在することを示した。ｓｃＦｖは、また、死後のヒトＡＤ脳組織に天然に存在するオリゴマータウと反応した。死後のヒトＡＤ脳組織におけるオリゴマータウのレベルは、オリゴマータウレベルがＢｒａａｋ病期により増加するため、ＡＤの進行と関連付けられた。
材料と方法
ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー‐シートファージディスプレイｓｃＦｖライブラリー（Ｓｈｅｅｔｓ， Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ： ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９８． ９５（１１）： ｐ． ６１５７−６２）は、６．７×１０９の見込まれた多様性を有し、Ｄｒ． Ｙｕ Ｚｈｏｕにより寛大に提供され（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、バイオパニングのために使用した。ファージは、これまでに記載されているように産生されかつ精製された（Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９１． ２２２（３）： ｐ． ５８１−９７）。１０１３〜１０１４ｐｆｕ／ｍＬの最終的な力価がバイオパニングについて使用された。
凝集されたタウ種‐非リン酸化組換え型ヒトタウ（ＮＰｒｈＴａｕ）種の２つのアイソフォーム（１Ｎ４Ｒおよび２Ｎ４Ｒ）が、パニングプロトコルについて使用された。タウの単量体およびオリゴマー形態が上記のように生成された。原線維２Ｎ４Ｒ凝集体ストックが、脱イオン水（ＤＩ水）において、ｒｈＴａｕ２Ｎ４Ｒ単量体（４μＭの最終モル濃度）および最終的に２０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７．４における低分子量ヘパリン（４μＭの最終モル濃度）および最終的に５ｍＭのＤＬ‐ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を混合することにより、ヘパリン原繊維形成プロトコルに続いて調製された。混合物は、３７℃で２週間、ときおりの撹拌とともにインキュベートされた。
ＮＰｒｈＴａｕ １Ｎ４Ｒ三量体に対するバイオパニング‐バイオパニングプロセスは、以下の変更とともに、これまでに記載されているように基本的に行われた（Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｎｏｇｒａｍ ａｎｔｉｇｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ， ２０１３． ２９（２）： ｐ． ４６３−７１）。バイオパニングプロセスは、「サブトラクティブパニング」および「ポジティブパニング」ステップに分けられる（図６）。サブトラクティブパニングステップは、非特異的な結合ファージを除去するために使用される対照タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびタウの非凝集リニアエピトープと結合するすべてのファージを除去するために使用される単量体タウを含む、所望でない抗原に結合するすべてのｓｃＦｖ‐ディスプレイファージをライブラリープールから取り除くために設計される。ポジティブパニングステップは、その後、三量体タウと選択的に結合する残りのファージプールからあらゆるｓｃＦｖ−ディスプレイファージを回収する。各ステップは、基本的に単量体タウおよびＢＳＡに結合するすべてのファージが取り除かれて、三量体タウに結合するファージが回収されることを確実にするために、ＡＦＭによりモニターされる。
サブトラクティブパニングステップ‐一組の高い親和性のイミュノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）が、炭酸塩／重炭酸塩コーティングバッファ ｐＨ９．６における２ｍＬ／チューブの１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡによりコートされ、他の一組が同じコーティングバッファにおける２ｍＬの１２μｇ／ｍＬタウ１Ｎ４Ｒ単量体によりコートされ、４℃で一晩インキュベートされた。抗原の固定化後に、イミュノチューブがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で広範囲にわたって洗浄され、湿性を保持するためにシールされた。０．５ｍＬのファージディスプレイライブラリーの総量が、ＢＳＡによりコートされた第１のチューブに添加された。チューブは、その後、シールされ、ファージ溶液がイミュノチューブにおける非コート領域に接触しないことを確実にするために、穏やかな撹拌とともに３０分間、室温でインキュベートされた。インキュベーション後に、ファージ溶液が取り除かれて、追加の非結合ファージが１００μｌのＰＢＳで洗い流された。ファージおよびリンス溶液が組み合わされて、ＢＳＡを含む第２のチューブに、その後、各チューブについての同じ手順に続く一連のチューブに添加された。最終的に回収されたファージ溶液の量は、約１ｍＬであった。各チューブでインキュベーション後に回収された１０μＬのファージ溶液のアリコートが、ＢＳＡを含むマイカに添加され、ＢＳＡにまだ結合し得る、ファージプールに残っているどのようなファージがあるのかを測定するためにＡＦＭにより結像された。結合されたファージが観察されなかった場合には、サブトラクティブパニングステップが、標的抗原、この場合にはＢＳＡに結合する、実質的にすべてのファージ結合を成功的に取り除いた。第２のサブトラクティブパニングラウンドが、単量体タウに結合するすべてのファージを取り除くために、単量体１Ｎ４ＲｒｈＴａｕによりコートされたイミュノチューブを用いて行われた。上記のように、プロセスが行われ、かつモニターされた。第２のラウンドのサブトラクティブパニング後に、最終的に残るファージ溶液は、−８０℃で、１００μＬアリコートで保存された。
ポジティブパニング‐６０μｇ／ｍＬのポジティブ標的抗原、三量体ｒｈＴａｕ１Ｎ４Ｒの１０μＬアリコートが、新鮮に切断されたマイカの一片に沈着され、室温で１０分間インキュベートされ、その後、ＤＩ水により広範囲にわたって洗浄されて乾燥された。サブトラクティブパニング後に得られた残りのファージプールの２００μＬアリコートが、マイカに添加され、室温で１０分間インキュベートされ、その後、２ｍＬの０．１％のｔｗｅｅｎ／ＤＩ水および少なくとも１０ｍＬのＤＩ水で洗浄されて、すべての非結合ファージを取り除いた。ポジティブパニングステップは、三量体タウに結合するファージの存在を検証するために、ＡＦＭによる分析について二重に行われた。結合されたファージは、１．４％トリエチルアミン（ＴＥＡ）により溶出され、同じ量の１ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．４バッファにより５分後に中和された。溶出されたファージのストックは、記載されるように回収された（Ｅｍａｄｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９． ２８４（１７）： ｐ． １１０４８−５）。単一のコロニーが収集され、個々に増殖されて、かつ−８０℃で保存された。
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）結像‐ＡＦＭ結像および分析が、これまでに記載されているように行われた（Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ＡＦＭ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２００９． ２５（２）： ｐ． ９１２−８）。アリコートは、室温で、新鮮に切断されたマイカ上で沈着されて、１０分間インキュベートされ、その後、マイカ表面がＤＩ水で広範囲にわたって洗浄され、圧縮された窒素流により乾燥された。異なるタウアイソフォームについてのファージ結合特異性を結像するために、０．１％のｔｗｅｅｎ／ＤＩ水による追加のストリンジェントな洗浄が、非特異的な結合ファージを取り除くために実行された。コートされたマイカサンプルが、シリコンＡＦＭプローブ（ＶＩＳＴＡｐｒｏｂｅｓ， ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてタッピングモードで操作するマルチモードＡＦＭナノスコープＩＩＩＡシステム（Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）を用いて空中で結像された。
ＡＦＭによる単一のクローンスクリーニング‐ポジティブパニングに続いて、それぞれの個々の回収されたクローン由来のファージ調製物は、ＡＦＭにより、標的結合特異性について分析された。アリコートの各ファージは、ＢＳＡ、単量体、または三量体タウのいずれかによりコートされたマイカに添加された。ＢＳＡまたは単量体タウへの反応性を示さないが、三量体タウへの最も高い結合レベルを示すサンプルが、さらなる特徴づけのために選択された。
ＤＮＡ配列の修正‐回収されたクローンのＤＮＡ配列が得られ、他の既知のｓｃＦｖ配列と比較された（Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９１． ２２２（３）： ｐ． ５８１−９７）。ポジティブパニングステップから回収されたクローンのすべては、リーディングフレームにおけるシフトをもたらす、ｓｃＦｖ配列のアミノ末端近くに欠失している塩基対を含んだ（図１２）。得られたフレームシフトは、カスタマイズされたプライマーにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、選択されたクローンにおいて修正された（図１３）。フォワードプライマーは、ＮｓｃＦｖ配列上流のＮｃｏＩ部位（５’‐ＣＣＡＴＧＧ‐３’）を包含して欠失塩基を含み、一方、リバースプライマーは、ｓｃＦｖ配列下流のＮｏｔＩ部位（５’‐ＧＣＧＧＣＣＧＣ‐３’）を包含する。修正されたｓｃＦｖ遺伝子配列が、所望のＤＮＡ配列を確認するためのシーケンシングのためにｐＧＥＭＴプラスミドベクターに連結され、その後、タンパク質発現についてのヘキサヒスチジンタグおよびｃ‐ｍｙｃタグを含む、ｐＩＴ２プラスミドベクターに連結された。ｐＩＴ２プラスミドは、ｓｃＦｖ発現についての大腸菌株ＨＢ２１５１またはファージ発現についてのＴＧＩのいずれかに変換された。
ファージ結合特異的分析‐配列修正ファージクローンの結合特異性は、ＡＦＭにより検証された。精製されたファージは、異なるタウ種でコートされたマイカ上で沈着されてインキュベートされ、上記のような結合特異性を確認するために結像された。
可溶性ｓｃＦｖ産生および精製‐配列修正ｓｃＦｖタンパク質の産生および精製がこれまで記載したように行われた（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２００６． １９（１１）： ｐ． ４９７−５０２）。濃縮された上清、ペリプラズム、および細胞可溶化物の分画が別個に調製されて、ｓｃＦｖの存在について試験された。ほとんどのｓｃＦｖが、予想されるように、上清に対してより少ない排出量で、ペリプラズムの分画に位置された（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ， Ｓ．Ｍ．， Ｇ． Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｌｉｔｔｌｅ， Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ−ｓｃａｌｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９７． ２００（１−２）： ｐ． ６９−７７）。ｓｃＦｖを含むすべての分画が、本質的には記載されるように、イミダゾール溶出およびＮｉ‐ＮＴＡアガロースビーズカラム（Ｑｉａｇｅｎ、１Ｌの発現培養について５ｍＬのビーズ）を用いて、プールされて、精製された（Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， Ｓ． Ｂｏｄｄａｐａｔｉ， ａｎｄ Ｍ．Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｒｅｄｕｃｅ Ａｂｅｔａ ｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１０． ４９（２１）： ｐ． ４５０１−８）。
ヒト脳組織によるドットブロット分析‐認識的に正常な認知障害のない（ＮＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）症例の中側頭回（ＭＴＧ）由来の死後のヒト脳サンプルは、Ｄｒ． Ｔｈｏｍａｓ Ｂｅａｃｈにより寛大に提供された（Ｄｉｒｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｂａｎｎｅｒ／Ｓｕｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ）。同齢のＮＤおよびＡＤ患者のＭＴＧ由来の脳抽出物は、プロテアーゼ抑制物質とともにトリス‐ＨＣｌ／ＥＤＴＡバッファでホモジナイズされた。ホモジネートはスピンダウンされて固形物が取り除かれ、すべての可溶性タンパク質を含む上清が収集されて総タンパク質濃度３ｍｇ／ｍＬに調製された。３ｍｇ／ｍＬ脳組織の２μＬのアリコートが、本質的には記載されるように、格子状のニトロセルロース膜上に点在させ、抗オリゴマータウｓｃＦｖにより探索された（Ｚａｍｅｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａｂｅｔａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８． ３８４（４）： ｐ． ９１７−２８））。サンプルは、精製されたｓｃＦｖを用いて３重に分析された。ｓｃＦｖの脳組織試料との反応性が、ＩｍａｇｅＪを用いて分析され、濃度測定値の形態で記録された（Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｎｏｇｒａｍ ａｎｔｉｇｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ， ２０１３． ２９（２）： ｐ． ４６３−７１）。それぞれの値は、０から１のスケールで校正され、０はバックグラウンドを示し、１は抗ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓ）ｂ（ｐｌｂ）ｓｃＦｖの陽性対照を示す。
マウス脳組織‐生後５、８、１１カ月の野生型マウスおよびヒトタウＰ３０１Ｌを過剰発現する生後５、９，１３カ月の３×トランスジェニックアルツハイマー病（３×ＴＧ‐ＡＤ）マウス由来の脳は（Ｏｄｄｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｔａｎｇｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ， ２００３． ２４（８）： ｐ． １０６３−７０）、Ｄｒ． Ｔｒａｖｉｓ Ｄｕｎｃｋｌｅｙにより寛大に提供された（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐｈｏｅｎｉｘ， ＡＺ）。マウス海馬が、ヒト脳サンプルについて、上記のようにホモジナイズされた。
ファージビオチン標識‐ファージは、ＥＺ‐リンクペンチルアミン‐ビオチンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡでの増強されたシグナル検出のためにビオチン標識された。１０１１ｐｆｕ／ｍＬアリコートのファージストック（０．７２９ｍｇ／ｍｌ）は、ペンチルアミン‐ビオチン（４．８６ｍＭ最終濃度）および０．１Ｍ最終濃度の１−エチル‐３‐［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とともに、室温で２時間撹拌しながらインキュベートされた。過剰なペンチルアミン‐ビオチンおよびＥＤＣは、脱塩カラムにより取り除かれた。
捕捉ＥＬＩＳＡ‐高い親和性のポリスチレンマイクロタイター９６ウェルプレートは、０．３ｍｇ／ｍｌの精製された単一のクローンｓｃＦｖ（捕捉抗体）の１００μｌ／ウェルでコートされ、３７℃で２時間インキュベートされた。非結合ｓｃＦｖが取り除かれた後に、プレートは、０．１％ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄された。プレートは、その後、２％ノンファットミルク／ＰＢＳにより、３７℃で１時間ブロックされた。ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄した後に、１００μｌ／ウェルの０．２ｍｇ／ｍｌマウス脳ホモジネート（標的分析物）のアリコートが添加され、３７℃で２時間インキュベートされ、その後、ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄された。ＰＢＳは、陰性対照として使用された。１０７ｐｆｕ／ｍｌビオチン標識されたファージ（検出抗体）の１００μｌ／ウェルのアリコートは、３７℃で２時間、コーティングのためにインキュベートされた。ウェルはｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄され、その後、０．５μｇ／ｍｌアビジン‐ＨＲＰの１００μｌ／ウェルのアリコートが添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。プレートは、ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで再度洗浄されて、化学発光のＥＬＩＳＡキットを用いて結合モニタリングされた（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））。化学発光のシグナルは、混合物への添加後１分間読み取られた。免疫反応性のシグナルが、サンプルの化学発光の読み取りの絶対値をＰＢＳ対照のそれで割ることにより正規化された。各別個の実験内で、すべての野生型マウスサンプルから得られた平均シグナルは、トランスジェニックマウスのシグナルを正規化するためのベースラインとして使用された。
単離されたｓｃＦｖがマウス脳組織試料においてオリゴマータウと結合することを検証するために、我々はサンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、ｓｃＦｖが、過剰リン酸化したタウ凝集体に対する市販のモノクローナル抗体および捕捉抗体として使用され、ＡＴ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、検出抗体として使用された。ＡＴ８は、ＰＨＦ‐タウにおいてみられるリン酸化されたＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５を有するタウ形態と結合する。ホースラディッシュ過酸化物（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合した抗マウス抗体は、結合したＡＴ８を検出するために使用された。
個々のファージ標的のサイズ分析‐個々のファージ粒子により結合される標的抗原のサイズを測定するために、上記のように、原線維タウ凝集体混合物の１０μｌアリコート（１９．５μｇ／ｍＬ、オリジナル調製ストックの１０×希釈）がマイカに沈着され、１０１２ｐｆｕ／ｍｌファージの１０μｌアリコートが添加され、インキュベートされ、洗い流された。ｒｈＴａｕ２Ｎ４Ｒの凝集された混合物は、単量体、オリゴマー、および原線維を含んだ。ＡＦＭイメージ（５μｍ２）が得られ、ナノスコープ分析を用いて処理された。ファージの先端に結合される各標的抗原粒子の直径が、粒子の最大高さおよび調節されたベースライン間の差をとることにより算出された。各個々のクローンについての少なくとも６つの異なる抗原粒子が、標的抗原の粒子の高さを測定するために計測されて平均化された。
統計的分析‐サンプルは、ｐ＜０．０５スタンダードでワンウェイＡＮＯＶＡおよびＬＳＤ事後有意差検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｔｅｓｔ）により分析された。すべての分析は、ＳＰＳＳ２１．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｍｏｎｋ， ＮＹ）により行われた。
結果および考察
オリゴマータウに選択的に結合するｓｃＦｖの単離
我々は、毒性のある三量体タウ種と選択的に結合するｓｃＦｖを単離するために、連続的なサブトラクティブおよびポジティブパニングステップ（図６Ａ）を組み込むＡＦＭによるパニングプロトコルを利用した。まず、我々は、ｓｃＦｖライブラリープールから、対照タンパク質（ＢＳＡ）と反応するｓｃＦｖを含むすべてのこれらのファージを除去し（図６Ｂ）、その後、単量体タウを除去した。サブトラクティブパニングステップ後に、我々は、単一のポジティブパニングステップを用いて、三量体ｒｈＴａｕ１Ｎ４Ｒタウと選択的に結合するファージを単離した。我々は、三量体タウに対するポジティブパニングステップから９６のファージクローンを回収した（図６Ｃ）。各９６のクローン由来のファージは、別個に調製されて、ＡＦＭにより、三量体タウ、単量体タウ、およびＢＳＡについての結合特異性を検証するために使用された。我々は、さらなる研究のために三量体タウを選択的に認識する２０のクローンを選択した。２０のクローンのＤＮＡ配列は、全長ｓｃＦｖの存在を検証するために得られ、６つの別個の全長ｓｃＦｖ（Ｈ２、Ｆ９、Ｄ１１、Ｇ１２、Ｈ７、Ｄ４、およびＧ１２）がさらなる分析のために選択された。すべての６つのクローンが完全なｓｃＦｖ配列を含んだが、それらはすべて、リーディングフレームシフトをもたらす、Ｎ末端ＮｃｏＩ部位のすぐ下流のＤＮＡ塩基対およびメチオニン開始コドン（図１２）をそれぞれ欠失していた。ｐｅｌＢリーダー配列は、Ｎ末端で欠失している塩基対からもたらされる変更されたリーディングフレームに関わらず、全長ｓｃＦｖの発現を促進するかもしれない異なるリーディングフレームにおける複数のメチオニン開始コドンを含む。可溶性ｓｃＦｖ発現を効率的に高めるために、我々は、ＰＣＲを用いてリーディングフレームシフトを修正した。我々は、その後、ＡＦＭにより、各配列が修正されたｓｃＦｖが、オリジナルのクローンと同じ結合特異性を維持することを検証した。３つの配列が修正されたクローンＦ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２Ａは、その後、結合特異性および別個のＣＤＲ配列に基づいて、さらなる研究のために選択された。
タウ三量体に対する結合特異性の検証
Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２ＡｓｃＦｖが三量体タウと選択的に結合していることを検証するために、我々は、凝集されたタウのサンプルとともに各ｓｃＦｖのファージディスプレイバージョンをインキュベートし、各ファージ粒子により結合された粒子の平均高さを測定するためにＡＦＭを使用した。我々は、その後、異なるタウ凝集体種の既知の高さの値と、結合分子の高さを比較した。各ｓｃＦｖについての少なくとも６つの異なる結合抗原の平均高さが測定され、既知のオリゴマータウ凝集体のサイズと比較された。すべての３つのｓｃＦｖについての標的抗原サイズは、ｓｃＦｖが選択的に三量体タウを標的とする（図７）ことのさらなる証拠を提供する、ｒｈＴａｕ２Ｎ４Ｒ三量体のサイズ（２．５ｎｍから３．０ｎｍ）に対応する。
結合エピトープの特徴づけ
それぞれの修正されたｓｃＦｖ配列についての精製された可溶性のｓｃＦｖタンパク質は、見込みで２９ｋＤａ、ｓｃＦｖについての全長サイズを有した。ｓｃＦｖは、合成のオリゴマータウ変異体に対して単離されたので、我々は、その後、精製されたＦ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２ＡのｓｃＦｖが、ＡＤマウスモデルの脳組織における天然由来のタウ凝集体を認識し得るかどうか、およびそれらが脳でランダムなタンパク質と交差反応するかどうかを試験した。オリゴマータウ凝集体と結合したすべての３つのｓｃＦｖクローンが、野生型マウスと比較して、生後９か月の３×ＴＧＡＤマウスモデル由来の海馬組織ホモジネートにおいて優先的に存在する（図８）。結合された凝集体は、ｓｃＦｖがタウ凝集体に選択的に結合していることを検証するために抗タウ抗体ＡＴ８を用いて検出された。ＡＴ８による検出は、Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２Ａにより標的とされた脳組織試料におけるタウ凝集体は、また、最初の抗原標的がリン酸化されていない場合であっても、リン酸化され得ることも示す。
３つの選択されたクローン（つまり、Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２Ａ）は別個のＣＤＲ配列を含むため、我々は、それらが三量体タウ上で類似のまたは異なるエピトープに結合するのかどうかを、精製されたｓｃＦｖが捕捉抗体として使用され、各ｓｃＦｖのファージディスプレイバージョンが検出抗体として使用される、捕捉ＥＲＩＳＡプロトコルを用いて測定した。我々は、抗原として３×ＴＧ‐ＡＤマウス脳ホモジネートを用いて、ｓｃＦｖを捕捉しおよび検出する異なる組み合わせを試験した。Ｆ９Ｔ‐ディスプレイファージが検出抗体として使用される場合、強いシグナルが、すべての３つのｓｃＦｖが捕捉抗体として使用されるときに得られた。これに対し、Ｄ１１Ｃ‐ディスプレイファージが検出抗体として使用される場合、より低いシグナルが、捕捉抗体としてのＤ１１ＣおよびＨ２Ａにより得られ、Ｆ９Ｔによるシグナルは得られず、Ｈ２Ａ‐ディスプレイファージが検出抗体として使用される場合、より低いシグナルが、捕捉抗体としてのＤ１１Ｃにより得られ、捕捉抗体としてのＦ９ＴまたはＨ２Ａによるシグナルは得られなかった（図９）。Ｆ９Ｔ‐ディスプレイファージは、Ｆ９ＴｓｃＦｖが捕捉抗体として使用される場合でさえ、強いシグナルを付与するので、Ｆ９Ｔは、タウ凝集体で複数の位置において生じる三量体特異的エピトープを認識する。Ｄ１１Ｃにより認識された抗原は、また、Ｄ１１ＣファージがＤ１１ＣｓｃＦｖにより捕捉されたタウ凝集体に対する反応性を示したため、複数のエピトープを有するかもしれない。しかしながら、Ｈ２Ａにより認識される抗原は、Ｈ２ＡｓｃＦｖにより捕捉されるタウ凝集体によっていかなるシグナルも得られなかったので、単一のエピトープのみを有するかもしれない。Ｆ９Ｔファージが、捕捉抗体としてのすべての３つの捕捉抗体により保持される、脳抽出物との最も強い免疫反応性を産生したので、我々は、すべてのさらなる捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、検出抗体として、Ｆ９Ｔファージを使用した。
ＡＤマウス脳組織におけるオリゴマータウの時間依存性の存在
我々は、どのようにオリゴマータウ濃度が、オリゴマータウに対する３つのｓｃＦｖを用いて、３×ＴＧ‐ＡＤマウスにおいて時間とともに変化するのかを分析した。３×ＴＧマウスモデルにおいて、不溶性タウ変化は、典型的に、生後約１２〜１５カ月で検出され、しかしながら、我々は、オリゴマータウレベルは、生後５カ月ですでに高く、９カ月でピークとなり、１３カ月までに減少することを発見する（図１０）。予期されるように、各ｓｃＦｖが同じオリゴマータウ種の異なるエピトープを認識するため、我々はすべての３つのｓｃＦｖにより類似の傾向をみる。同齢の野生型マウス由来のサンプルは、これらのｓｃＦｖと反応するあらゆるオリゴマータウの存在を示さなかった。このマウスモデルから得られた結果は、オリゴマータウ種の濃度が、不溶性タウ変化が形成を開始する前に、早期のポイント（５〜９カ月）で増加し、その後、神経原線維変化が形成を開始した後（１２〜１５カ月）に減少することを示し、オリゴマータウ種がＮＦＴに組み込まれるかもしれないことを示唆する。オリゴマータウ凝集体は、ＮＦＴの存在する十分に前の５カ月にすでに存在しているので、それらはＡＤについての早期の診断としての見込みを有する。
死後のヒト脳組織の分析
ｓｃＦｖは、ＡＤマウスモデル由来の脳組織に存在するオリゴマータウ種を有効に検出したため、我々は、次に、Ｆ９ＴｓｃＦｖを用いて、オリゴマータウの存在についての異なるＢｒａａｋ病期から死後のヒト中側頭回（ＭＴＧ）抽出物を探索した（図１１）。オリゴマータウは、Ｆ９Ｔを用いて、ヒト脳サンプルにおいて、容易に検出された。興味深いことに、サンプルにおけるオリゴマータウの濃度は、ＮＤのＢｒａａｋ病期Ｉ‐ＩＩサンプルにおいて最小のオリゴマータウのみ、軽度のプラークを有するＮＤのＢｒａａｋ病期Ｉ‐ＩＩサンプルにおいてより高い値、中程度のプラークを有するＡＤサンプルにおいて再びより高い値（Ｂｒａａｋ病期ＩＩＩ‐ＩＶ）、および重度のプラークを有するＡＤサンプルにおいて最も高いシグナル（Ｂｒａａｋ病期Ｖ‐ＶＩ）があるので、Ｂｒａａｋ病期の増進とともに増加する。プラークを有さないＮＤサンプルおよび軽度のプラークを有するＮＤサンプルの両方と比較して、ＡＤサンプルにおけるオリゴマータウのレベルとの間で有意な差がある。これらの結果は、Ｆ９Ｔのような形態特異的試薬は、ヒトサンプルにおけるオリゴマータウ種の存在を検出するために使用され得、ＡＤについての早期診断としてのみならず、疾病のステージの進行を補助するための見込みを有することを示す。
サマリー
タウおよびＡβの凝集体は、顕著な老化プラークおよびＡＤの神経原線維変化の主なタンパク質成分である。多くの研究が、Ａβ凝集に続く、下流の事象であると考えられるタウ機能障害によるＡＤの病因およびニューロンの死における、開始因子としてのＡβの蓄積および凝集に注目し、一方、他の研究は、タウがＡＤの進行を促進するためにＡβと相互作用すること、および低減された凝集タウレベルは、また、ＡＤの症状を寛解させるために重要であることを示唆する。Ａβおよびタウ凝集は、共通する上流の原因により駆動されるメカニズムを分離することによりリンクされるかもしれない。数多くの研究は、ＡＤにおける毒性を媒介する可溶性オリゴマーＡβ種の役割に関し、証拠は、ここで、オリゴマータウが、また、ＡＤにおける毒性の役割を果たすかもしれないことを示唆している。近年の研究は、オリゴマー、プレフィブリル、および未熟なプレフィラメントの形態を含む可溶性タウ種が、むしろ適応性および保護の役割を代わりに果たすかもしれない、顕著なＮＦＴよりもＡＤにおいてより重大な役割を果たすことを示す。オリゴマータウは、プリオン様の自己繁殖の特徴を有することが示され、ニューロン内に形質膜陥入され得、それらは、インビボで、内在性タウ病理を誘発し得る。よって、ＡＤ進行におけるオリゴマーおよび原線維タウ種の役割は、高まる注目を得ており、オリゴマータウはＡＤについての有望な治療の標的である。起こるかもしれない代替的な転写後のスプライシングおよび翻訳後修飾に起因して、ヒト脳に存在するかもしれないタウ種の多様性のために、疾病の進行における種々の形態の役割を探索するために、および診断および治療の標的としてそれらの値を評価するために、個々のタウ凝集体変異体を選択的に識別し得る試薬を開発するための重大な必要性がある。
我々は、これまで、単量体または二量体ではなく三量体タウ種が、低ナノモルレベルで神経毒性があることを報告した。ここで我々は、この毒性の三量体タウ種を選択的に認識する３つの異なるｓｃＦｖ（Ｆ９Ｔ、Ｄ１１Ｃ、およびＨ２Ａ）を単離した。すべての３つのｓｃＦｖは、ユニークなＣＤＲ配列を有し、タウ凝集体上で異なるエピトープと結合し、生後５カ月までにＡＤマウスにおけるオリゴマータウ種を検出する。ＮＦＴはＡＤの顕著な特徴であるが、オリゴマータウ種は、タウ凝集における中間の役割を果たすかもしれず、ニューロン毒性における重要な役割を果たすことが示され、そのためオリゴマータウ変異体の識別および定量がＡＤの早期診断についてのバイオマーカーとして大きな見込みを有する。ここで、我々は、オリゴマータウレベルが、死後のヒトＡＤ脳組織試料を同齢の認識的に正常な症例から区別するために使用され得ることを示す。オリゴマータウの定量は、また、Ａβプラークおよび異常なタウの免疫組織化学的染色に基づく、Ｂｒａａｋ病期に従って死後のヒトサンプルを区別する。
実施例５
三量体タウは、低ナノモル濃度でヒトニューロン細胞に対して毒性がある
アルツハイマー病（ＡＤ）は、診断後４から８年で一般的に生じる死とともに、進行性の認識の障害、大脳の萎縮、およびニューロンの喪失により特徴づけられる、最も一般的な痴呆の形態である。ＡＤの２つの病理的に顕著な特徴、主にアミロイドベータ（Ａβ）からなる細胞外の神経突起のプラークおよび主にタウタンパク質からなる細胞内の神経原線維変化（ＮＦＴ）は、Ｄｒ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒにより１９０７年に最初に識別された。顕著な特徴のプラークおよび変化へとタウおよびＡβの凝集を促進するメカニズムを理解することにおいて大きな進歩がなされ、一方、比較的わずかな前進が疾病を停止および治療することにおいて達成された。家族性ＡＤ症例の分析は、Ａβの誤った折り畳みおよび凝集がＡＤ病因を開始し、タウのリン酸化、凝集、および変化形成のような他の影響の引き金を引くことを述べるアミロイドカスケード仮説の浮上を導く、ＡＤの進行における主要因としてＡβの産生に関係する。アミロイド仮説は、１０年間以上そのフィールドを支配し、Ａβを標的とするいくつかの免疫化研究を含む治療の介入についての数多くの臨床研究を動かした。しかしながら、Ａβを標的とするいくつかの臨床試験の失敗は、治療の標的としてのその妥当性に疑いをかけた。ますます増える証拠は、タウもまたＡＤの進行に重要な役割を果たすことを示す。タウの誤った折り畳みおよび凝集が、独立したアミロイド形成を生じさせ得、多くの症例で、タウ病変の存在が、Ａβ凝集体の存在なしにＡＤと関連される。可溶性タウレベルの低減なしのＡβプラークのクリアランスが、ＡβおよびタウＰ３０１Ｌを過剰発現する二重のトランスジェニックマウスにおける認識の減退を寛解させるのに不十分である。とりわけこれらの結果は、オリゴマータウがＡＤについての重要な治療の標的であるかもしれないことを示す。
その単量体形態におけるタウは、微小管アッセンブリおよび安定化について重大な微小管関連タンパク質である。６つの主なタウアイソフォームは、Ｎ末端プロジェクションドメイン上のエクソン２およびエクソン３、並びに構築領域上のエクソン１０（リピート２）の代替的な転写後のスプライシングにより生成され得る（図１４）。タウは、結合し、かつ微小管安定性および機能の促進を補助する、微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）における３つまたは４つの類似の繰り返しを含む。例えば、リピート２およびリピート３は、それぞれＰＨＦ６＊およびＰＨＦ６のヘキサペプチドのモチーフを含む（図１４）。これらのモチーフは、微小管を形成するチューブリンと相互作用し得るβ‐シート構造を形成する傾向を増加させ、また、オリゴマーおよびより高いオーダーの凝集体を生成するための自己アッセンブリを促進する。第２の微小管結合リピートを有するまたは有しないタウアイソフォームが凝集し得るが、第２のリピートを有するアイソフォームのみが、第２のリピートにおける追加のシステインに起因して、ジスルフィド結合により媒介される伸長されたオリゴマー形態を形成し得る（図１４および１５）。よって、この研究において、我々は、神経毒性におけるタウ凝集の役割を研究するために、第２のリピートユニットを含むタウアイソフォームを利用した。
タウの過剰リン酸化は、微小管からのタウの放出のために必要とされ、細胞体樹状突起コンパートメントへのその誤った局在化は、タウが、オリゴマーおよびより高いオーダーの凝集体内で自己会合することを可能にする。しかしながら、タウの過剰リン酸化は、その毒性に直接関連しないが、微小管に沿う輸送を調節するためおよび微小管を安定させるために、チューブリンとのその相互作用を調節するためのメカニズムにむしろ関連する。成熟した海馬ニューロンにおける外因性タウの発現は、微小管トラックを非ブロック化するためのキナーゼＭＡＲＫ２によるタウのリン酸化により救われ得るシナプスの変性および微小管に沿う輸送の妨害へと導く。重要なことに、細胞外スペースにおけるタウは、その脱リン酸化状態において、より毒性があり、および細胞内のタウよりもより少なくリン酸化されることが報告される。組換え型全長ヒトタウタンパク質の細胞外オリゴマーは、マウスにおいて神経毒性であり、記憶強化を損なうことが示され、他のラボでの類似の研究が、ＡＤ脳由来の過剰リン酸化されたタウからなるタウオリゴマーおよび組換え型タウオリゴマーによる類似の効果を示した。このように、疾病に関連されるタウの過剰リン酸化は、オリゴマー内でのタウの自己会合における原因となる因子であるかもしれないが、それ自体のまたはそれ自体におけるタウの過剰リン酸化は、細胞外タウオリゴマーの毒性についての根拠とはならないかもしれない。
神経原線維変化（ＮＦＴ）は、ニューロンの喪失と典型的に関連付けられ、ＡＤのキーとなる細胞内インジケーターであると考えられる。タウ凝集を標的とするためのアプローチは、過剰リン酸化および原繊維形成を阻害すること、総タウレベルを低減すること、または微小管を安定化することにフォーカスした。しかしながら、蓄積する証拠は、不溶性原線維タウ種よりもむしろ可溶性オリゴマーが神経毒性があり、ＡＤの進行および発症において重要な役割を果たすことを示唆する。ＮＦＴはＡＤの顕著な特徴であるが、それらは死後の確認前２０から３０年までの間ＡＤニューロンにおいて存在し得、よって、ＡＤ脳において即時の毒性を誘発しそうにない。タウオパチーの動物モデルにおいて、ＮＦＴの存在は、ニューロンの喪失および記憶の欠損と十分には関連付けられない。ニューロン喪失における低減および記憶性能における向上が、ＮＦＴにおける増加に関わらず観察される。また、マイクログリアの活性化がＮＦＴの存在の十分前に生じるとともに、ＮＦＴ病理の存在は、海馬におけるニューロン喪失、シナプス損失、または機能障害の領域により十分に局在化されない。これに対して、オリゴマータウは、神経毒性および神経変性の一次イニシエータであること、およびＡＤ進行における重要な役割を果たすとして数多くの研究において意味づけられた。オリゴマータウは、ＡＤにおけるニューロンの細胞病理の早期のステージにおいて識別され、微小管結合部位での過剰リン酸化と密接に関連付けられる。タウオリゴマーは、プリオンと同様に脳にわたって内在性タウ病理を伝播し得え、それらのニューロン毒性を論証する。２つのタウオリゴマー（１４０ｋＤａおよび１７０ｋＤａ）の存在および濃度は、種々の年齢のｒＴｇ４５１０マウスにおける記憶の喪失と関連する。また、オリゴマータウは、シナプスおよびミトコンドリア機能障害を誘導する。タウは細胞内で優勢であるが、細胞外タウの役割は、細胞外オリゴマータウが海馬の断片における長期の増強で急性的影響を有し、健康なニューロンに病理を伝送し得るため注目を得ている。ヒトＣＳＦおよび血液におけるオリゴマータウレベルの検出は、また、総および過剰リン酸化したタウレベルとともに有望なＡＤ診断のバイオマーカーである。ＡＤにおけるオリゴマータウの重要な役割および疾病における細胞外タウの重要性の認識のため、疾病の病因における重要な毒性のタウ種を識別することが重大である。ここで、我々は、ＡＤの発症および進行に伴われる重要なタウ種を識別することを補助する２、４リピート組換え型ヒトタウ変異体の単量体、二量体、および三量体形態の細胞外の神経毒性の我々の研究を示す。
２．材料および方法
２．１．組換え型ヒトタウ（ｒｈＴａｕ）調製および精製。ｒｈＴａｕは、ｐＥＴ２１ＢおよびｐＥＴ２９ａベクターにおけるタウ構造によるバクテリア（ＢＬ２１ ＤＥ３）クローン由来の単量体として精製された。標準的な方法が、１ｍＭのＩＰＴＧによりタンパク質を増殖させかつ誘導するために使用された。ペレットにされた細胞は、製造者のプロトコルに従って、ＣｅｌＬｙｔｉｃＢ溶解バッファ、リゾチーム、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）、およびプロテアーゼ抑制物質により溶解された（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。陽イオン交換（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が、両方のタウ構造についてのＳＰセファロース樹脂による精製の第１のステップについて使用され、タウタンパク質を溶出するために３００ｍＭのＮａＣｌ入りの２５ｍＭのトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７．４が使用された。Ａｍｉｃｏｎウルトラ遠心力装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）がタンパク質調製物を５０ｍＭのトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７．４にバッファ交換するために使用された。タンパク質濃度が、ＢＳＡ分析を用いて測定された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。タウオリゴマーが、３７℃で一晩、１００ｍＭのＮａＣｌ入りの５０ｍＭのトリスバッファ ｐＨ７．４中に５μＭの濃度で、タウ単量体をインキュベートすることにより生成された。単量体およびオリゴマー種が、６％ＰＡＧＥにより分離され、溶出され、５０ｍＭのトリス‐ＨＣｌにバッファ交換された。分画は、オリゴマータンパク質の劣化を最小限にするための非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにシグナルを高めるためにおよびタウ変異体の純度を検証するために銀染色法により分析された。タンパク質濃度がＢＳＡ分析を用いて測定された。
２．２．高さ分布分析 ＡＦＭサンプル調製およびイメージングがこれまでに記載したように行われた（Ｈ． Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｓ． Ｅｍａｄｉ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ｖｏｌ． １９， ｎｏ． １１， ｐｐ． ４９７−５０２， ２００６； Ａ． Ｚａｍｅｅｒ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， Ｍ． Ｓ．Ｗａｎｇ， ａｎｄ Ｍ．Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ２５−３５Ａβ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａβ４２，” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ４５， ｎｏ． ３８， ｐｐ． １１５３２−１１５３９， ２００６； Ｓ． Ｅｍａｄｉ， Ｈ． Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ， Ｍ． Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３６８， ｎｏ． ４， ｐｐ． １１３２−１１４４， ２００７； Ａ． Ｚａｍｅｅｒ， Ｓ． Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｓ． Ｅｍａｄｉ， Ｓ． Ｖ． Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ Ａβ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３８４， ｎｏ． ４， ｐｐ． ９１７−９２８， ２００８； Ｓ． Ｅｍａｄｉ， Ｓ． Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｍ． Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２８４， ｎｏ． １７， ｐｐ． １１０４８−１１０５８， ２００９； Ｍ． Ｓ．Ｗａｎｇ， Ａ． Ｚａｍｅｅｒ， Ｓ． Ｅｍａｄｉ， ａｎｄＭ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ＡＦＭ，” Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ｖｏｌ． ２５， ｎｏ． ２， ｐｐ． ９１２−９１８， ２００９．）。５０ｍＭのトリス‐ＨＣｌバッファにおける０．５０μＭの精製されたタウ変異体の１０μＬのアリコートが、シリコンＡＦＭプローブ（ＶＩＳＴＡ ｐｒｏｂｅｓ， Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備え、タッピングモードでセットされる、マルチモードＡＦＭナノスコープＩＩＩＡシステム（Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）を用いて結像するために、分離されたマイカ片に沈着された。異なるタウサンプルの高さ分布分析は、Ｇｗｙｄｄｉｏｎ２．２０を用いて、正規分布確率モデルに適合された。すべての検出可能なタンパク質分子は、球形であることが想定され、高さの値がそれらの直径に近似する。
２．３．細胞培養および処理。ＳＨ‐ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が、組織培養フラスコで培養された（Ｆａｌｃｏｎ ｂｙ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）。細胞は、４４％ｖ／ｖハムのＦ‐１２（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４４％ｖ／ｖＭＥＭイーグルの塩（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ｖ／ｖ変性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ｖ／ｖＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１％ｖ／ｖ抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地で培養された。培地は、２から３日に１回新しくされた。細胞は、それらがフラスコでコンフルエントになったときに、新しいフラスコに継代された。毒性の研究のために、ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞が４８ウェルの細胞培養クラスタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ｂｙ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に、３００μＬの新鮮な培地中で５×１０４細胞／ウェルで播種された。各実験が３重に行われた。細胞密度が、血球計数器で決まった量を読み取ることにより推定された。２４時間３７℃のインキュベータでの増殖後、組織培養培地は、非分化細胞での神経毒性試験用の新鮮な無血清培地に交換された。コリン作動性ニューロンでのタウ毒性を研究するために、２重のセットの培養された細胞は、３から５日間、１０μＭの最終濃度でレチノイン酸でのインキュベーションによるコリン作動性様表現型に誘導された（Ｓ． Ｅｍａｄｉ， Ｓ． Ｋａｓｔｕｒｉｒａｎｇａｎ， Ｍ． Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２８４， ｎｏ． １７， ｐｐ． １１０４８−１１０５８， ２００９； Ｓ． Ｐａｈｌｍａｎ， Ｊ． Ｃ． Ｈｏｅｈｎｅｒ， Ｅ． Ｎａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，” Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ａ， ｖｏｌ． ３１， ｎｏ． ４， ｐｐ． ４５３−４５８， １９９５； Ｍ． Ｅｎｃｉｎａｓ， Ｍ． Ｉｇｌｅｓｉａｓ， Ｙ． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ｆｕｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ， ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ７５， ｎｏ． ３， ｐｐ． ９９１−１００３， ２０００；］ Ｓ． Ｐ． Ｐｒｅｓｇｒａｖｅｓ， Ｔ． Ａｈｍｅｄ， Ｓ． Ｂｏｒｗｅｇｅ， ａｎｄ Ｊ． Ｎ． Ｊｏｙｃｅ， “Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｇｏｎｉｓｔｓ，” Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． ５， ｎｏ． ８， ｐｐ． ５７９−５９８， ２００３．）。培養された非分化かつコリン作動性様ニューロンは、２．２６ｎＭ、４．５０ｎＭ、１１．１５ｎＭ、および１５．５０ｎＭの最終濃度で単量体、二量体、および三量体の変異体の１Ｎ４Ｒおよび２Ｎ４Ｒにより処理された。ＰＢＳ陰性対照が、その後のＬＤＨアッセイ分析についてのスタンダードとして使用された。培養は、３７℃でタウ種とともにインキュベートされ、５つの培養上清の３０μＬ／ウェルアリコートを採取することにより、３、１８、２４、および４８時間の時点でサンプリングされた。
２．４．ＬＤＨ分析。ＬＤＨプロトコルが、ＤｅｃｋｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓの一般的なプロトコルに基づく市販のキットから適用される（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＬＤＨ分析は、これまでに記載されるように行われた（Ａ． Ｚａｍｅｅｒ， Ｐ． Ｓｃｈｕｌｚ， Ｍ． Ｓ．Ｗａｎｇ， ａｎｄ Ｍ．Ｒ． Ｓｉｅｒｋｓ， “Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ２５−３５Ａβ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａβ４２，” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ４５， ｎｏ． ３８， ｐｐ． １１５３２−１１５３９， ２００６．）。吸光度は、４９０ｎｍで測定された（参照波長６９０ｎｍ）。相対的な吸収度の値は、４９０ｎｍで得られた値からの参照値を差し引くことにより算出された。１５０より大きいＬＤＨ％値が毒性であると考えられる。
２．５．統計的分析。すべてのサンプルの相対的な吸収度の値は、それぞれの個々の実験について１００％としてセットされる対照のものに正規化された。グループの平均値が、ｐ＜０．０５スタンダードでワンウェイＡＮＯＶＡおよびＬＳＤ事後有意差検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｔｅｓｔ）により分析された。すべての分析は、ＳＰＳＳ２１．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｍｏｎｋ， ＮＹ）により行われた。
３．結果
３．１．ｒｈＴａｕ凝集体分析。我々は、タウあらゆる翻訳後のリン酸化を除去し、よって、リン酸化が機能の損失またはタウの凝集を有するかもしれないあらゆる潜在的な影響を取り除くための、細菌ホストシステムにおける組換え型ヒトタウを表現した。得られた非リン酸化されたヒト組換え型タウ（ＮＰｒｈＴａｕ）単量体は、遊離チオール類を有する反応性システイン基を含み、タウオリゴマーおよびより高い程度の凝集体を産生するための分子間ジスルフィド結合の形成、および安定した非反応性単量体を作成するための分子内ジスルフィド結合の形成を促進する（図１５）。重合反応が、インキュベーション時間およびタンパク質濃度により制御される。２Ｎ４Ｒおよび１Ｎ４Ｒスプライス変異体の両方の、非反応性単量体、二量体、および三量体形態は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびＡＦＭ高さ分布分析により証明されるように、スプライス変異体の長さおよびオリゴマー形成の程度に応じて定義されたサイズのプロファイルを有する安定した凝集体形態を生成する（図１６）。各追加の単量体タウユニットについてのオリゴマー高さの増分は、１Ｎ４Ｒ変異体について０．５ｎｍおよび２Ｎ４Ｒ変異体について１．０ｎｍである、所定のアイソフォーム内に固定される（図１６）。また、各２Ｎ４Ｒ種のサイズは、それぞれ、タウ２Ｎ４Ｒが、１Ｎ４Ｒ変異体と比較して、余分なＮ末端インサート含むとすると、予想されるように、対応する１Ｎ４Ｒ種（図１６）よりも大きい。
３．２．細胞外ｒｈＴａｕ誘導神経毒性試験。１Ｎまたは２Ｎのいずれかのスプライス変異体由来のタウの単量体または二量体形態のいずれも検出可能な毒性が示さなかったが、両方の変異体の三量体形態は、低ナノモル濃度（１１．１５ｎＭ、および１５．５０ｎＭ）で１５０の毒性の閾値を十分に超えるＬＤＨ値により非分化（図１７（ａ））およびレチノイン酸誘導コリン作動性様ニューロン（図１７（ｂ））に対して著しい毒性を発現した。全長２Ｎ４Ｒ三量体タウ形態は、非分化ニューロンに対する１Ｎ４Ｒ三量体形態よりも有意により高い毒性を示したが（図１７（ａ））、効果がコリン作動性様ニューロンにおいて減少される（図１７（ｂ））。三量体タウが非分化のＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞に添加された場合に、毒性における増加が、１Ｎ４Ｒ（図１８（ａ））、および２Ｎ４Ｒ（図１８（ｂ））三量体変異体の両方について、最も高い濃度で、継時的に観察された。しかしながら、三量体タウがコリン作動性様ニューロンに添加された場合に、１Ｎ（図１８（ｃ））および２Ｎ（図１８（ｄ））変異体の毒性は、最初の２４時間比較的一貫していたが、４８時間後に増加した。三量体タウの両方の変異体は、短いインキュベーション時間で非分化ニューロンと比較して、コリン作動性様ニューロンへの増加した毒性を示した（図１９（ａ））が、より長いインキュベーション時間で逆が観察された（図１９（ｂ））。
４．考察
アミロイドカスケード仮説は、少なくとも１０年間またはそれ以上にわたって、ＡＤの病因への研究を主導し、ＡＤの発症および進行におけるタウの重要性は、着実により明らかになってきている。タウの病理は、子供および若年成人の症例におけるＡβ沈着がないことが観察され、嗅内の海馬領域におけるタウ凝集体は、Ａβ病理の発症に先行する。数多くの研究は、Ａβの種々のオリゴマー形態がニューロンに対して毒性があり、かつ認識の性能を損ない得ることを示し、よって、ＡＤを診断するための有益なバイオマーカーとしてのそれらの潜在的な役割と関係する。ＡＤにおける種々の可溶性オリゴマーＡβ種の重要な役割と同様に、タウの異なる可溶性オリゴマー形態は、また、ニューロンの喪失および認知障害をも生じさせ、ＡＤにおいて重大な役割を果たすかもしれない。よって、ＡＤについての診断および治療の療法を促進するために、疾病の発症および進行を伴うキーとなるタウ種を識別することが重要である。タウが複数のスプライス変異体および翻訳後の変更部位を有するので、我々は、２つの非リン酸化ヒト組換え型タウアイソフォーム、１Ｎ４Ｒおよび２Ｎ４Ｒに注目することにより、タウ形態の複合体の多様性を単純化しようとした。これらの２つのタウの４リピート（４Ｒ）アイソフォームは、ともに、微小管関連ドメインのすべての４つの繰り返しを有し、凝集体を安定させるためにジスルフィド結合を形成する追加のシステインおよびヘキサペプチドのモチーフを増強する、微小管‐親和性を有するリピート２の存在に起因して、３つのみのリピート（３Ｒ）によるものよりも脳タンパク質キナーゼにより容易にリン酸化された凝集体を形成する傾向がよりある。
細胞外タウ形態の毒性を研究するために使用される、最も疾病に関連するタウ物質は、リン酸化、グリケーション、ユビキチン化、凝集、およびトランケーションを含む、それらの翻訳後の変更を維持するための方法を用いて、ＡＤ脳脊髄液（ＣＳＦ）から精製されるタウオリゴマーを十分に特徴づけられるであろう。いくつかの非ＡＤおよびＡＤ症例由来の調製物は、結果の有意性を理解するために必要であろう。ここで、我々は、細胞外毒性に対するオリゴマー構造の関連を具体的に理解するために、非変更タウタンパク質オリゴマーおよび対照単量体に特に注目して最初の研究を行った。
我々は、どのように凝集体のサイズおよび細胞の表現型が毒性の影響を受けたのかを測定するために、非分化およびコリン作動性様神経芽細胞腫株の両方を用いて、異なるタウ変異体の毒性を測定した。コリン作動性細胞は、特に、Ｍｅｙｎｅｒｔの基底核（ＮＢＭ）、つまり、海馬および皮質における有意なニューロンの喪失を有するＡＤにおいて傷つきやすい。ＮＢＭは、コリン作動性細胞で豊富にあり、ＡＤにおけるアセチルコリン産生の有意な低下および変性を被る。低減されたレベルのアセチルコリンおよび多くの他の皮質のコリン作動性マーカーが、認知機能における障害および臨床的な痴呆を導き、コリン作動性細胞がＡＤにおいて特に傷つきやすいことを示す。ここで、我々は、単量体や二量体ではない、三量体のタウが、低ナノモル濃度でニューロン細胞に対して毒性があること、および全長２Ｎタウ変異体が非分化ニューロンに対して、より短い１Ｎ変異体よりもより毒性があることを示す（図１７）。三量体タウ変異体はともに、タウがナノモル濃度のレベルで細胞外にアプライされた場合に、非分化ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞およびレチノイン酸誘導コリン作動性様ニューロンの両方に毒性を生じさせる（図１８）。しかしながら、培養されたコリン作動性様ニューロンは、類似の非分化ニューロンと比較して、短いインキュベーション時間で毒性が誘導された三量体タウへの増加した感受性を示し（図１９（ａ））、おそらく、ＡＤにおけるコリン作動性様ニューロンの増加した脆弱性について部分的に理由を与える。非分化細胞は、より長いインキュベーション時間で毒性を誘導される三量体タウに等しく影響を受けやすく（図１９（ｂ））、これらの結果は、細胞外三量体タウの毒性が、コリン作動性細胞に特異的に関連しないタンパク質またはレセプターに依存しないが、毒性はそれらにより促進されるかもしれないことを示唆する。我々の結果は、単量体タウを除外する低分子量（ＬＭＷ）の誤って折り畳まれたタウ種がニューロンにより細胞内に取り込まれ、かつインビボで内在性タウ病理を誘導するために順行的におよび逆行的に輸送され得、一方、原線維タウおよび脳由来の糸状のタウは細胞内に取り込まれ得ないこと示す近年の結果と一貫性がある。このことは、タウ毒性が三量体およびより大きなオリゴマー形態のタウを細胞内取り込みによりある脳の領域における細胞にわたって広がるかもしれないこと、並びにこの取り込みがコリン作動性ニューロンにおいて促進されることを示唆する。オリゴマータウのニューロン毒性は、オリゴマーＡβのそれと類似の特性を共有しているかもしれず、ニューロン毒性を伴う重大な特徴は、翻訳後の変更よりも多いタンパク質の凝集状態である。
異なる翻訳後の変更、スプライス変異体、および凝集種を含むインビボで生じる幅広い種類のタウ変異体があり、一方、この研究は、ＡＤにおける選択されたタウ変異体の役割をより体系的に探索することを開始する。さらなる研究は、タウ変異体の毒性に対して細胞外タウでみられるＡＤ特異的翻訳後変更およびスプライス変異体の寄与、およびこれらのタウ変異体が、どのように、一次ニューロンまたは誘導された多能性幹細胞を含む他のニューロンモデルに影響を及ぼすのかを測定するために必要とされる。特定のタウ変異体および形態を選択的に識別し得る十分に特徴づけられた試薬は、これらのさらなる研究のために有用であろう。
すべての刊行物、特許、および特許出願が、参照により本明細書に組み込まれる。上記の明細書において、本発明は、その所定の実施形態に関して記載され、かつ多くの詳細が例示の目的のために記載されるが、本発明が追加の実施形態が可能であること、および本明細書に記載された所定の詳細は、本発明の基本原理を逸脱することなく相当に変更されるかもしれないことは当業者にとって明らかであろう。
本明細書の記載に関連して、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その」および類似の参照の使用は、本明細書で別途示されまたは明らかに文脈により否定されない限り、単数形と複数形の両方を範囲とすると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別途の記載がない限り、オープンエンドな用語として解釈されるべきである（つまり、「含むが、限定されない」ことを意味する）。本明細書での列挙の範囲は、本明細書に別途示されない限り、単に範囲内のそれぞれの別個の値を個々に参照する省略された方法として供され、それぞれの別個の値は、まるで本明細書に個々に列挙されているように明細書内に組み込まれることが意図される。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別途示されまたは明らかに文脈により否定されない限り、あらゆる適切なオーダーで行うことができる。あらゆるおよびすべての実施例の使用、または本明細書で提供される例示的な用語（例えば、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）は、単に本発明をよりよく照らすことを意図されており、別途の請求がない限り、本発明の範囲の限定を主張しない。明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に対して必須であるとして、あらゆるクレームされていない要素を示すと解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は、本発明を行うために発明者に知られるベストモードを含んで、本明細書に記載される。これらの実施形態のバリエーションは、上記の明細書を読むに際し、当業者にとって明らかとなるであろう。発明者は、適切にそのようなバリエーションを採用することを当業者に期待し、発明者は、本明細書に具体的に記載される以外にも本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により許容される、ここに付加される請求の範囲に挙げられる構成要素の均等物およびすべての変更を含む。さらに、そのすべての可能なバリエーションにおける上記要素のあらゆる組み合わせが、本明細書で別途示されまたは明らかに文脈により否定されない限り、本発明により包含される。

Claims (16)

  1. 配列番号１、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む抗体断片。
  2. 抗体断片は、配列番号１、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体断片。
  3. オリゴマータウに結合し、単量体のタウ、原繊維タウまたは非疾患関連形態のタウと結合しない結合分子であって、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１７の配列を含む、前記結合分子。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、抗体断片または結合分子を含む、タウの凝集を阻害するための組成物。
  5. 前記タウの凝集は細胞内にある請求項４に記載の組成物。
  6. 前記タウの凝集は脳組織内にある請求項４に記載の組成物。
  7. 抗体、抗体断片または結合分子は、組成物または結合分子の非存在下での速度に比べ、タウ凝集体の形成速度を減少させる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 生体試料中のタウの存在を検出する方法であって、試料を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、抗体断片または結合分子と接触させ、前記組成物と前記組織試料との結合を測定し、前記組成物と前記組織試料との結合は、前記組織試料中のタウオリゴマーの存在を示し、前記タウオリゴマーの前記存在が、初期ＡＤ、前頭側頭型認知症、他のタウオパチーまたは外傷性脳損傷後の神経変性を示す、方法。
  9. 生体試料は、脳組織、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿または唾液である、請求項８に記載の方法。
  10. タウオリゴマーは二量体または三量体タウである、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. タウオリゴマーは三量体タウである、請求項１０に記載の方法。
  12. タウオリゴマーは可溶性である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体断片または結合分子を含む、哺乳動物の脳内のタウの凝集を予防または阻害するための組成物。
  14. 前記抗体、抗体断片または結合分子は、タウオリゴマーを認識し、前記タウオリゴマーは二量体または三量体タウである、請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記タウオリゴマーは三量体タウである、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記タウオリゴマーは可溶性である、請求項１４または１５に記載の組成物。

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