CN1649901A - 人癌胚抗原(cea)的特异性抗体片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过重组DNA技术由抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体(Mab)CB/ior-CEA.1获得的单价和二价(二体)单链Fv型(scFv)抗体片段。该单抗对CEA具有高亲和力,可用于人体内结肠直肠肿瘤的诊断和监测。与原始Mab一样,单价scFv片段和二体对人CEA也有高亲和力,并且识别依赖碳水化合物的保留的表位。二体和单价scFv片段对CEA的亲和常数分别为(5.0±0.4)×109 L mol-1和(2.8±0.3)×1010 Lmol-1。这两种片段不显示与正常人组织和细胞有交叉反应性,其中偶尔存在CEA的正常结肠粘膜是个例外。可以首先克隆由生成MabCB/ior-CEA.1的杂交瘤获得的编码可变区的核酸序列,并通过重组微生物中的表达来生成所述片段。与原始Mab一样,单价scFv和二体能够用于鉴定在大鼠体内长成肿瘤的生成人CEA的细胞。单价scFv和二体不具有Fc结构域,而且所述单价scFv和二体的分子量分别比大鼠Mab低5倍和2.5倍。因此,上述单价scFv和二体在人体内能够更好的穿透组织,而且免疫原性更低。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学分支,具体而言,本发明涉及通过重组DNA技术由小鼠单克隆抗体获得的单价和二价(二体)形式的单链Fv型抗体片段,所述单抗具有已证明的临床功效,而且对人癌胚抗原是特异的。
发明背景
癌胚抗原(CEA)是一种180kDa糖蛋白,优先由人胃肠道肿瘤和其它癌细胞分泌的,然而也可以在一些非恶性组织像结肠粘膜中检测到。尚未完全阐明它的生理学作用,至今认为它在某些方面与细胞粘附过程有关(Gold P、Freedman SO,Journal of Experimental Medicine,122:467,1965;Zimmermann W等人,PNAS USA,84:2960-2964,1987;Paxton RJ等人,PNAS USA,84:920-924,1987;BeaucheminN等人,Molec Celluar Biol,7:3221-3230,1987;Gold P、GoldenbergNA,MJM,3:46-66,1997)。
由于其重复性结构域的结构特征,CEA被归为免疫球蛋白超家族的成员(Oikawa S等人,BBRC,144:634-642,1987;Thompson J、Zimmermann W,Tumor Biology,9:63-83,1988;Hammarstrom S,Seminars in Cancer Biology,67-81,1999)。CEA与该超家族的其它分子具有高度同源性,诸如NCA、阿片抗原(meconium antigen)、A型胆汁糖蛋白(biliar glycoprotein type A)、和妊娠特异性糖蛋白b(vonKleist S、Burtin P,Immunodiagnosis of Cancer,Marcel Dekker,322-341,1979;Buchegger F等人,Int J Cancer,33:643-649,1984;Matsuoka Y等人,Cancer Res,42:2012-2018,1982;Svenberg T,Int J Cancer,17:588-596,1976)。
多年来,对循环中CEA水平的评估被看作是因表达这种抗原的原发性结肠直肠肿瘤而进行手术的患者体内可能复发和/或转移的最佳指标之一(Gold P、Goldenberg NA,MJM,3:46-66,1997)。CEA循环水平的测量还延伸成为监测已经证实了这种肿瘤标记的显著术前水平的其它人癌症(乳房、肺)的方法(Gold P、Goldenberg NA,MJM,3:46-66,1997)。
由于单克隆抗体生成技术的开发(Mab;Kohler G、Milstein C,Nature,256:52-53,1975),用于测量循环CEA的免疫测定法的特异性得到了改进,它们的使用得到了广泛延伸。
多年来,还对CEA研究了作为特异引导放射性同位素用于体内诊断(Goldenberg DM,Int J of Biol Markers,7:183-188,1992)和原位放疗(Ledermann等人,Int J Cancer,47:659-664,1991)的可能“细胞靶”的情况。还预见了它引导毒素、药物、和其它生物活性产品到肿瘤细胞的用途(Bagshawe KD,Drug Dev Res,34:220-230,1995)。
抗CEA抗体已经成为用于这些目的主要载体,最初是多克隆制剂,随后是小鼠Mab、它们的Fab片段、通过遗传工程由小鼠Mab获得的抗体片段,以及最近由在丝状噬菌体中展示的鼠和人抗体文库获得的抗体片段(Hammarstrom S等人,Cancer Res,49:4852-4858,1989;Hudson PJ,Curr Opinion Immunology,11:548-557,1999;GriffithsAD等人,EMBO J,12:725-734,1993;Griffiths AD等人,EMBO J,13:3245-3260,1994;WO93/11236;Chester K等人,1995,WO95/15341;Allen DJ等人,1996,US5872215)。
抗体和抗体片段在原核细胞像大肠杆菌和其它微生物中的表达在本领域已经完全建立(Pluchthun A,Bio/Technology,9:545-551,1991;Gavilondo J、Larrick JW,Biotechiques,29:128-132,134-136,2000)。抗体和抗体片段在高等真核细胞培养物中的表达对于本领域熟练技术人员而言也是已知的(Reff ME,Curr Opinion Biotech,4:573-576,1993;Trill JJ等人,Curr Opinion Biotech,6:553-560,1995) 。
未区分地命名为CB-CEA.1或ior-CEA.1(下文称为CB/ior-CEA.1)的小鼠Mab在本领域现阶段是已知的。该Mab对人CEA具有高特异性,与诸如NCA等分子不具有不期望的交叉反应性,也不识别正常组织,但普遍发现CEA在其中被极化的正常结肠上皮细胞除外(Tormo B等人,APMIS,97:1073-1080,1989)。该Mab对CEA具有很高亲和力(PérezL等人,Applied Biochem Biotechnol,24:79-82,1996)。用99mTc标记的该Mab已经成功用于人结肠直肠肿瘤的诊断和监测。放射性免疫检测的临床研究显示它的灵敏度是91.3%,特异性是77.1%,而阳性预测值是82.8%(Oliva JP等人,Rev Esp Med Nucl,13:4-10,1994)。与目前世界上临床用于这些目的的唯一的另一种抗CEA单克隆抗体CEA-Scan(99mTc-Arcitumomab,Immunomedics,Morris Plains,NJ,USA)相比,上述数值使得该Mab的性能更佳。
1992年报道了通过聚合酶链式反应(PCR)由提取自生成MabCB/ior-CEA.1的杂交瘤的RNA开发单链Fv(scFv)抗体片段(Ayala M等人,Biotechniques,13:790-799,1992)。在随后的实验策略中,使用两个可变结构域框架区的简并寡核苷酸进行了CB/ior-CEA.1可变结构域的扩增。在大肠杆菌中生成了scFv,并在ELISA和细胞化学研究中证明了对CEA的识别,但是对固定化抗原的亲和力比通过天然方法获得的Fab低200倍(Pérez L等人,Applied Biochem Biotechnol,24:79-82,1996)。这同一种scFv片段在Pichia pastoris中得到了克隆、表达、和生成(Freyre FM等人,J Biotechnol,76(2-3):157-163,2000),但对人CEA的亲和力没有得到任何改进,而且使用放射性标记片段在实验动物中进行的研究指示其生物分布异常(Pimentel GJ等人,Nucl MedCommun,22:1089-1094,2001),因而没有继续其进一步开发。
发明概述
本发明涉及通过DNA重组技术由抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体CB/ior-CEA.1(Tormo B等人,APMIS,97:1073-1080,1989)获得的单价和二价(二体)形式的单链Fv(scFv)抗体片段。该Mab对CEA具有很高亲和力(Pérez L等人,Applied Biochem Biotechnol,24:79-82,1996),而且已经成功用于人结肠直肠肿瘤的诊断和监测(OlivaJP等人,Rev Esp Med Nucl,13:4-10,1994)。可以通过它们在重组微生物像细菌和酵母中的表达来生成本发明所报道的scFv单价和二体片段。就像最初的Mab一样,scFv单价和二体片段对人CEA上依赖碳水化合物保守结构的表位是特异的,并且展示对该抗原有高亲和力。scFv单价和二体片段对人正常和肿瘤细胞和组织的体外识别模式与原始Mab相似,因此,一旦放射性标记,它们有能力鉴定在先天无胸腺小鼠中生长的、表达人CEA的肿瘤细胞。scFv单价和二体片段不具有Fc结构域,分子量比小鼠Mab低,这使得它们在出于诊断或治疗目的而应用于人时有可能能更好的穿透体内组织且免疫原性更低。
与先前由相同Mab开发的其它scFv相比,本发明所报道的scFv单价和二体片段在重链(VH)和轻链(VL)可变结构域的氨基酸中具有重要差异,并且在对CEA的亲和力、识别细胞和组织的性能、以及定位在小鼠体内生长的生成人CEA的肿瘤的功效方面更为优越。
本发明所报道的重组scFv单价和二体片段是通过PCR以及重组微生物中的克隆和表达由提取自CB/ior-CEA.1杂交瘤的RNA开发的。使用与用于获得先前报道的scFv(Ayala等人,Biotechniques,13:790-799,1992)不同的寡核苷酸组扩增并分离编码Mab VH和VL结构域的碱基序列。与先前获得的scFv相比,本发明显示了新的单价和二体scFv在VH和VL结构域的氨基酸序列中具有重要差异,包括VH结构域框架区1(FR1)和3(FR3)及互补决定区2(CDR2)中的16个氨基酸,以及VL结构域FR1和FR3中的3个氨基酸。这指示这些结构域具有与先前报道(Ayala等人,Biotechniques,13:790-799,1992)不同的克隆来源。在二体的情况中,它在构建scFv型分子时所采用的联合区段(接头)的大小和氨基酸组成方面也与先前获得的scFv不同。
这些变化在新片段的生物化学和生物学特性中得到了出人意料的反映,使它们的特性与Mab CB/ior-CEA.1非常相似,而且比先前报道的scFv优越得多。除了可变结构域中的上述氨基酸变化以外,与先前报道的scFv(Ayala等人,Biotechniques,13:790-799,1992)具有相同接头的新单价scFv片段对人CEA的亲和常数比先前报道的scFv高得多。同样,二体对人CEA的亲和常数也优于这两种单价scFv形式。就CEA识别、肿瘤细胞和组织的鉴定、缺乏与NCA的交叉反应性、以及在移植到小鼠中的生成人CEA的肿瘤中选择性积累的能力而言,两种新的scFv单价和二体片段保留了原始Mab的特异性特性,而且所有性能都比先前获得的scFv优越得多。
两种新的单价和二体scFv的分子量分别比原始Mab低至少5倍和2.5倍,这一事实说明它们有可能在人体内更好的穿透组织且免疫原性更低,从而在引导同位素、药物、毒素、和其它生物活性元件指向表达人CEA的肿瘤方面比Mab CB/ior-CEA.1更有吸引力且可能更优越。
本发明显示了如何通过PCR使用与编码信号肽和恒定结构域CH1和Ck的碱基序列杂交的合成寡核苷酸扩增Mab CB/ior-CEA.1的VH和VL结构域。还显示了通过PCR有可能以这种顺序装配扩增得到的VH和VL结构域,并获得不同形式的scFv片段,操纵连接各个结构域的接头的大小。使用14个氨基酸构建了单价scFv形式,将该数目降至5而生成了二体scFv型形式。
本发明证明了有可能在细菌大肠杆菌和酵母Pichia pastoris中表达单价和二价scFv片段,而且这些片段以特异方式在体外鉴定与肿瘤细胞有关或无关的人CEA。本发明还证明了放射性标记的单价和二体scFv鉴定在小鼠中长成肿瘤的表达人CEA的体内肿瘤细胞,展示与MabCB/ior-CEA.1非常相似的性能,而且性能比先前获得的scFv优越得多。本发明还显示了纯化和鉴定这些新型scFv单价和二体片段的方法。
本发明所描述的抗体片段可用于癌症的诊断和治疗,优势在于它们衍生自已证明有临床功效的Mab,其较小的分子量和Fc结构域的缺乏使得它们能够更好的穿透组织,而且因诱发人抗小鼠免疫球蛋白应答的能力较低而能够用于重复治疗(HAMA;Schroff等人,Cancer Res,45:879-885,1985;DeJager等人,Proc Am Assoc Cancer Res,29:377,1988)。HAMA应答因所施用抗体生物学效应的中和、随后的剂量降低、以及它们能够引起变态反应、“血清”病、和肾病而难以治疗。
术语
抗体及其特异片段:该术语描述了免疫球蛋白或其具有抗原特异性的部分,它们是天然的,或者是部分或完全以合成方式生成的。该术语还覆盖具有结合结构域的多肽或蛋白质,所述结构域将是抗体的结合位点或与其同源。它们可以是天然生成的,或者是部分或完全以合成方式生成的。抗体的实例是不同类型和亚型的免疫球蛋白及其包含一个或多个抗原结合位点的片段,诸如Fab、scFv、Fv和二体。
抗体和抗体片段包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽,它可以是天然的,或者是完全或部分通过合成生成的,还包括包含与其它多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或其等同物的嵌合分子。
已经显示了完整抗体的片段能够执行结合抗原的功能。这些结合片段的实例是:(1)包含免疫球蛋白VL、VH、CL和CH1结构域的Fab片段;(2)由VH和CH1结构域构成的Fd片段;(3)由指定抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段;(4)由指定抗体的VH和VL结构域联合肽接头而构成的scFv片段,所述肽接头使得这两个结构域相连而形成抗原结合位点(Bird等人,Science,242:423-426,1988;Huston等人,PNAS USA,85:5879-5883,1988);(5)以与scFv相似的方式构建成的二体、多价或多特异性片段,但是其中小型接头不能使同一scFv分子上的VH和VL结构域在其中相关联,而是通过两个或多个scFv的结合来形成抗原结合位点(WO94/13804;Holliger P等人,PNAS USA,90:6444-6448,1993);(6)其它片段,像dAb(Ward SE等人,Nature,341:544-546,1989)、分离的CDR区、F(ab′)2片段和双特异性scFv二聚物(PCT/US92/09965;Holliger P、Winter G,Current OpinionBiotechnol,4:446-449,1993;de Haard H等人,Adv Drug DeliveryRev,31:5-31,1998)。
可以只使用可变结构域构建不含Fc区的二体和scFv,从而潜在降低在施用于人时抗独特型反应的作用。它们还因能在大肠杆菌和重组酵母中生成而特别有用。它们的分子量小于完整免疫球蛋白,从而提高了组织穿透潜力。
抗体结合位点:该术语描述了抗体中包含与所有抗原或其部分特异反应的区域的部分。当抗原较大时,抗体可以只结合抗原的特定部分,命名为表位。抗体结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域构成。优选的是,抗原结合位点包含抗体的轻链(VL)和重链(VH)的可变区(或结构域)。
特异性:指抗体或其片段与除了其特异结合配偶以外的其它分子不展示显著结合的情况。该术语还可用于抗原结合位点对许多相关或无关抗原中出现的特定表位是特异的情况,在这种情况中,结合位点将能够结合携带此表位的数种抗原。
发明详述
通过本发明获得了由一个或多个抗原结合位点形成的特异多肽分子,所述抗原结合位点来自对人CEA特异的小鼠Mab。根据构建多肽分子的方式,将抗原结合位点装配成单价、二价、和抗体片段的其它形式。
对人CEA特异的单价scFv片段形式的多肽分子展示对该抗原的亲和常数是(5.0±0.4)×109L mol-1,其中包含通过14个氨基酸的联合区段(接头)以这种顺序相连的VH和VL结构域,氨基酸序列如SEQ ID NO16所示。
对人CEA特异的二价scFv片段(二体)形式的多肽分子展示对该抗原的亲和常数是(2.8±0.3)×1010L mol-1,其中包含成对的两个相同分子,每一个都是由通过5个氨基酸的联合区段(接头)以这种顺序相连的VH和VL结构域形成的,氨基酸序列如SEQ ID NO 17所示。
在本发明的另一个方面,单价和二体scFv片段不结合或以非显著方式结合正常组织或来自下列正常组织的细胞:肝、肾、肺、睾丸、血液、脾和胰腺。就结肠黏膜而言,单价和二体scFv片段只与腔内分泌产物、以及某些腺体或顶端区反应。单价和二体scFv片段与正常淋巴细胞和中性白细胞缺乏反应性指示与NCA抗原无重要交叉反应性(von Kleist S,Burtin P.,Immunodiagnosis of Cancer。Marcel Dekker.322-341,1979;Buchegger,F.等,Int.J.Cancer 33:643-649,1984)。
单价和二体scFv片段能与可溶解的CEA、吸附于固体表面的CEA或其生产细胞和肿瘤组织相关的CEA结合,其中人结肠直肠、乳房、肺、胰腺和胃癌尤为突出。单价和二体scFv片段及Mab CB/ior-CEA.1可结合可溶性人CEA和结合在固体表面的人CEA结合,结合方式与人CEA糖基化的保守性有关,显示识别中涉及了此抗原的碳水化合物。
来自本发明所报道单价和二体scFv片段、保持了CEA结合能力、已报道的亲和力、特异表位识别能力和与本发明所述片段相似和相当的生物学和生化特性的多肽分子被认为是同等的变体形式,也包含于本发明范围内。这些多肽分子可采取其它重组抗体片段的形式,诸如VL结构域在VH之前的scFv,或Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Facb、三聚体和四聚体scFv等(Winter G,Milstein C,Nature 349:293-299,1991;WO94/13804;de Haard,H等,Adv.Drug Delivery Rev.31:5-31,1998),并使用了本领域中已知的其它联接区段(接头)。这些多肽分子还可以采取双特异抗体分子的形式,其中一部分保留了对CEA的特异性,另一部分具有不同的特异性。
本发明同样程度地包含符合以上段落所述特性的单价和二体scFv片段的变体形式,来自所谓的“免疫原性减小了的人源化”,其中可变区中存在的B和T细胞表位以未改变抗原识别的方式被修饰,但人体内所产生分子的免疫原性被降低了,如文献中所示的:Carr FJ等,2000EP983303A1和Rodriguez Perez R等,US5712120-A。本发明中同样包含的变体形式是由所谓“CDR移植物”所产生的变体形式,其中一种抗体的CDR序列被放置在并非来自此抗体的序列框架内,如文献EP-B_0239400、EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400中所述,并保持以相似的亲和力结合CEA的能力、竞争能力、特异表位识别能力和与本发明所述单价和二体scFv片段相似和同等的生物学和生化特性。
除了抗体序列外,本发明中所含的抗体分子可包含构成肽或多肽的其它氨基酸,或将不同于CEA抗原结合的功能特性添加到分子中的其它氨基酸,作为如纯化或鉴别的标签、酶或其片段、生物学反应调节物、毒素或药物,等等。
依照本发明,单价和二体scFv片段可以分离或纯化的形式施用。
本发明预见了一些上述多肽分子用作表达CEA的多种类型人癌症的诊断试剂的用途,例如结肠癌、肺癌、乳癌或其它腺癌。
特异于上述CEA的多肽分子可被放射性标记并用作成像试剂从而以特定方式证实在人体内表达CEA的肿瘤的存在和位置。本发明提供了测定表达CEA的细胞或肿瘤的存在情况的方法,包括将上述多肽分子与这些细胞接触并测定它们与细胞的结合。此方法可用于体内,或取自身体的细胞样品,即体外或离体进行。
本发明提供了上述多肽分子与人CEA结合的方法。此结合可发生在体外、离体或体内。如果结合发生在体内,此方法可包括将多肽分子施用于哺乳动物,可以是一个或数个个体。正如此处实验所证实的,本发明的单价和二体scFv片段与被转染小鼠肿瘤细胞所表达的人CEA结合,所说的肿瘤细胞一旦被移植到小鼠体内就会长成肿瘤,这为具有特异结合性的分子及其特性的研究、调查和开发提供了有用的实验模型。
所述抗体对细胞样品的反应性可通过任何合适的方式进行探测。用个别报道分子进行标记是其中的一种可能性。报道分子可产生能被直接或间接检测且优选被测量的信号。报道分子的偶联可以是直接或间接的、共价或非共价的。通过肽键进行的联接可由偶联抗体和报道分子的基因融合体的重组表达产生。确定偶联的方式不是本发明的特征,本领域的技术熟炼人员能根据其偏爱和综合知识选择适当模型。
当放射性核素如125I、111In或99mTc被用于标记单价和二体scFv片段及其同等物时,如果这些核素优选定位于肿瘤内而非正常组织中,肿瘤组织中放射性标记的存在情况可用伽马摄相机进行探测和定量。所获肿瘤影像的质量与信号:背景的比率直接相关(Goldenberg DM,Int.J.ofBiol.Markers 1992,7;183-188)。本文中以125I的实验性使用为例作了说明。
本发明还提供了有关的基本原则,以便单价和二体scFv片段及其上述等同变体形式在某些情况下,例如与具有治疗效力的分子偶联、缀合或结合时或作为重组融合蛋白产生时可用作治疗试剂。依照本发明,单价和二体scFv片段及其同等变体形式可用于将毒素、放射性、T和NK细胞或其它分子定向于表达CEA的肿瘤,或在生物体内产生能导致预期治疗效应的抗独特型反应。与此相一致的是,本发明的其它方面涉及治疗方法的有关要素,包括将单价和二体scFv片段或其等同应变体形式作为药物或药用组合物施用。
依照本发明,组合物优选以“治疗有效”量施用于个体,在至少改善一个症状的方面足以证实对病人是有益的。所施用剂量、频率和施用时间间隔的有关细节取决于待治疗疾病的特性和严重性,专家和其它医生负责作出这些决定。合适的抗体剂量是本领域众所周知的(LedermannJ.A.等,Int J.Cancer 47:659-664,1991;Bagshawe KD等,抗体、免疫结合和放射性药物4:915-922,1991)。
组合物可以单独施用或与其它疗法联合同时或相继施用,还取决于待治疗的疾病。
与本发明相符且按本发明应用的药用组合物除了活性成分外,还可以包括赋形剂、缓冲液、稳定剂或可接受的药用载体、或本领域技术熟炼人员众所周知的其它材料。这些材料应该无毒,不干扰活性成分的功效,而它们的确切特性可取决于施用的途径,可以是口服或注射,例如静脉内注射。
符合本发明的scFv单价和二体片段及其等同变体形式可通过编码核酸的表达产生。编码任何这些前述多肽分子的核酸是本发明的一部分,因为其中包括这些核酸表达的方法。在不同的实施方案中,所说的核酸可编码SEQ ID No.16和17中所示的氨基酸序列。
为了重组表达单价和二体scFv及其等同变体形式,可选择或构建合适的载体,该载体具有适当的调控序列,包括启动子、终止子、增强子、聚腺苷酸化信号、标记基因和其它适当的序列。载体可以是质粒。可使用许多已知的核酸操作方法和技术,例如,核酸构建体的制备、聚合酶链式反应、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、蛋白质分析,以及许多文献中详述的其它方法,如分子克隆:实验室手册;第二版,Sambrook等,冷泉港实验室出版社,1989或分子生物学简要方法,第二版,Ausubel等编辑,John Wiley&Sons,1992或Erlich HA PCR技术,Stockton出版社,1989。这些文献中的公开内容均在此收编作为参考。
本发明的另一方面提供了含外源核酸的宿主细胞和在这些宿主细胞中引入所说核酸的方法。核酸的引入可应用已知用于此目的的任何技术。对于细菌和酵母细胞而言,此技术可以是电穿孔。核酸引入后可刺激或允许核酸的表达,例如,在对基因表达有利的条件下培养宿主细胞。在某实施方案中,本发明的核酸整合入宿主细胞的基因组中。
在产生后,单价和二体scFv片段及其等同变体形式可以此处所展现的任何形式使用,诸如作为药物组合物的形式、或诊断产物,或如上所述用于一套试剂中,其中除了特异结合成分外,还包含一种或多种试剂以测定所说成分与细胞或未联接细胞的CEA的结合。
本发明的其它方面及其有关认识对于本领域专家而言是显而易见的。为了对本发明有完整的了解,且不限制其范围和影响,本文提供了以下实施例。参照以下图表:
附图简述
图1展示了用于在大肠杆菌中表达单价scFv和二体的pJG-1m载体的示意图。对应于用宽水平条标记的载体区展示了片段克隆位点、c-myc肽、六组氨酸结构域、以及一些结构域间和结构域后区域的碱基序列(SEQ ID NO:13)。
图2展示了由(1)单价scFv片段(SEQ ID NO 16)和(2)二价片段(二体)(SEQ ID NO 17)的核苷酸序列推导的氨基酸序列(单字母密码)的比对。两个构建物中的结构域顺序都是VH-接头区段-VL。两个分子中所采用的接头区段的氨基酸以粗体出现。
图3通过间接免疫荧光技术例示了(A)Mab CB/ior-CEA.1、(B)单价scFv、和(C)二体对培养肿瘤细胞AsPC-1(ATCC CRL-1682)中表达的CEA的识别。在A、B、和C中,观察到了特征性的膜和附近细胞质的荧光。放大倍数是200x。
图4展示了二体的蛋白水解消化的层析图谱和通过质谱获得的胰蛋白酶肽的命名。上图:二体胰蛋白酶消化的层析图谱。下图:二体胰蛋白酶肽命名的概述表。m/z实验值:实验分子量;m/z理论值:理论分子量;Z:电荷。在得到的质谱中,没有检测到对应于不正确接头半胱氨酸的信号。
图5概述了对二体(SEQ ID NO 21)氨基酸序列的验证。以粗体概述了通过质谱得到确认的蛋白质序列区,而胰蛋白酶消化后未能回收的序列区域以斜体出现。粗体区域完全符合由二体碱基序列推导的氨基酸序列。在C端部分还看到了由pJG-1m载体(图1)提供的c-myc肽和最后六个组氨酸的序列。
图6展示了给携带表达人CEA的肿瘤的小鼠接种用125I放射性标记的下列分子24小时后(条纹柱)和48小时后(无条纹柱)每克组织中注射剂量的百分比:由左至右,以四条双柱分组:(a)二体、(b)scFv、(c)F3、和(d)Mab CB/ior-CEA.1。每条柱代表由得自12只小鼠的器官回收的计数的平均值。结果证明在24和48小时之间,二体、scFv、和Mab维持肿瘤中的放射性:血液中的放射性的高比率,后者维持的比值最高,然后是二聚体分子。F3显示很低的比值,体内性能不足,这可能与它对CEA的亲和力较低有关。
收入本文提及的所有文件作为参考。
实施例
1.Mab CB/ior-CEA.1可变结构域的PCR扩增、克隆和测序
2.scFv和二体的装配、在大肠杆菌中的表达以及它们识别人CEA的证明
3.scFv和二体在Pichia pastoris中的表达以及它们识别人CEA的证明
4.细菌中产生的scFv和二体的纯化
5.通过蛋白水解和质谱对二体进行定性分析
6.去糖基化CEA识别的研究
7.在正常组织和肿瘤组织中进行的免疫细胞化学和组织化学研究
8.亲和常数的测定
9.测定在携带因接种B16-CEA13细胞所诱发的肿瘤的C57BI/6小鼠中125I所标记的片段和抗体的体内特异识别
实施例1.Mab CB/ior-CEA.1可变结构域的PCR扩增、克隆和测序
步骤(a) RNA的纯化和可变区的扩增
用TriPureTM试剂(Boehringer-Mannheim)提取来自106个小鼠杂交瘤CB/ior-CEA.1细胞的总RNA(Tormo B等,APMIS.97:1073-1080,1989)。以寡dT作为引物,用来自RT-PCR试剂盒(Boehringer-Mannheim)的第一链cDNA合成系统合成互补DNA(cDNA)。用聚合酶链式反应技术(PCR)特异扩增重链和轻链可变区基因。依照Kabat E等人的报道(US Department of Health and HumanServices,NIH,1991)以及该实验室先前所进行的实验(Coloma,MJ等,Biotechniques11:152-156,1991),以小鼠IgG和kappa链的共有序列为基础设计所应用的合成引物。PCR中所用的寡核苷酸序列如表1所示。
表1.用于Mab CB/ior-CEA.1重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)编码序列的PCR扩增的合成寡核苷酸。
重链
寡核苷酸1.VH的信号肽(SEQ ID No.1)
5′...GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT...3′
寡核苷酸2.CH1区(SEQ ID No.2)
5′...AYCTCCACACACAGGRCCAGTGGATAGAC...3′
轻链
寡核苷酸3.VL的信号肽(SEQ ID No.3)
5′...GGGGATATCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA...3′
寡核苷酸4.Ck恒定区(SEQ ID No.4)
5′...ACTGGATGGTGGGAAGATGGA...3′
使用了PCR Core试剂盒(Boehringer-Mannheim)进行PCR。PCR的条件为:94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行25个循环,最后一个循环延伸后再以同样温度延伸5分钟,所有循环均在MJ Research Minicycler装置中进行。反应终体积为100μL。使用的所有寡核苷酸的终浓度是1μM。
用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,GmbH)在低熔点琼脂糖凝胶(Sigma)中纯化具有约320-530bp预期大小的DNA扩增片段,并独立克隆入设计成DNA片段“平端”克隆的pMOS载体(AmershamPharmacia Biotech)中。
步骤(b).可变区的核苷酸序列
为了测定克隆入载体pMOS的轻链和重链可变区的核苷酸序列,使用了制造商所推荐的寡核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech)。用Pharmacia的ALFexpress II装置(Amersham Biosciences)和“ThermusSequences 5 Cy Terminator Kit”通过自动化的方式获得碱基序列。分别选择质粒pVL2和pVH5作为VL和VH序列的代表。
实施例2.scFv和二体的装配、在大肠杆菌中的表达以及它们识别人CEA的证明
步骤(a).可变区的再扩增以及scFv和二体的装配
用PCR将质粒pVH5和pVL2中所包含的VH和VL结构域装配成scFv和二体的形式。
以质粒pVH5和pVL2中的VH和VL序列为基础设计合成的寡核苷酸。这些包括用于载体pJG-1m中克隆和掺入14个氨基酸和5个氨基酸长的接头片段以供单体scFv和二体装配的限制性位点(表II和III)。
表II.用于scFv和二体片段构建的连接区段(接头)的氨基酸序列。
scFv -接头L1:EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID No.5)
二体.-接头L2:GGGGS(SEQ ID No.6)
表III.用于scFv和二体装配PCR中的合成寡核苷酸。
寡核苷酸5:ApaL1-FR1 VH(SEQ ID No.7)
5′...TCTCACAGTGCACAGGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGG...3′
寡核苷酸6:14个氨基酸长的接头/FR4 VH(SEQ ID No.8)
5′...GTCGACTTTGGATTCGGAGCCTGATCCTGAGGATTTACCCTCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT...3′
寡核苷酸7:14个氨基酸长的接头/FR1 VL(SEQ ID No.9)
5′...GAGGGTAAATCCTCAGGATCAGGCTCCGAATCCAAAGTCGACGACATTGTGATGACCCAGTC...3′
寡核苷酸8:NotI-FR4 VL(SEQ ID No.10)
5′...AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTTCAGCTCCAGCTTGGTT...3′
寡核苷酸9:5个氨基酸长的接头/FR4 VH(SEQ ID No.11)
5′...AGAGCCGCCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT...3′
寡核苷酸10:5个氨基酸长的接头/FR1 VL(SEQ ID No.12)
5′...GGTGGCGGCGGCTCTGACATTGTGATGACCCAGTCT...3′
为了装配片段,第一步先进行独立的PCR扩增:
1.对于会产生单价scFv的结构域-
反应1:用质粒pVH5为模板,寡核苷酸5和6为引物(表III)。
反应2:用质粒pVL2为模板,寡核苷酸7和8为引物(表III)。
2.对于会产生二体的结构域-
反应3:用质粒pVH5为模板,寡核苷酸5和9为引物(表III)。
反应4:用质粒pVL2为模板,寡核苷酸8和10为引物(表III)。
PCR所用的条件和试剂上文已有描述。所有使用的寡核苷酸的终浓度均为1μM。
为进行scFv的装配,进行新的PCR,即将4μL的反应溶液1和反应溶液2与终浓度1μM的寡核苷酸5和8(表III)以及终浓度0.01μM的寡核苷酸6和7(表III)混合。
为进行二体的装配,进行新的PCR,即将4μL的反应溶液3和反应溶液4与终浓度1μM的寡核苷酸5和8(表III)以及终浓度0.01μM的寡核苷酸6和7(表III)混合。
如先前所述,检测所扩增DNA片段主要为约700bp的条带,并从低熔点琼脂糖凝胶中分离此条带。
步骤(b).克隆入pJG-1m载体中。
载体pJG-1m是设计成在大肠杆菌周质中表达抗体片段的质粒(图1)。它的主要元件有LacZ启动子、信号肽、用于插入基因片段的限制性酶切位点ApaL I和Not I、c-myc肽和编码6个组氨酸的序列。最后一个元件用作通过固定化金属离子亲和层析进行表达产物纯化的标签(IMAC;Porath J.Port.Expr.Purif.3:263-281,1992)。用于将所述scFv克隆入载体的限制性酶切位点碱基序列和被添加入scFv的C-末端氨基酸的碱基序列如图1所示(SEQ ID No.13)。
用ApaL I和Not I(Promega)限制性内切酶消化相应于scFv和二体的DNA片段以及pJG-1m载体,并用T4 DNA连接酶(Promega)独立连接各条带和载体。用电穿孔将连接反应产物转化入大肠杆菌感受态细胞(XL-1 Blue菌株;Stratagene),将所转化的细胞在固体选择性培养基(LB琼脂,含100μg/mL氨苄青霉素)中37℃培养16小时。所用的方法参见分子克隆,实验室手册,第二版,Sambrook,Fritsch,Maniatis.1989。
从数个菌落中纯化质粒DNA后选择重组的质粒(QIAGENMiniPrep试剂盒),用针对预期连接产物已描述的限制性内切酶进行消化来做相应的检查。在限制性酶切分析中,得到相应于线性化载体的约3.5kb的条带和相应于scFv和二体抗体片段编码基因的约700bp的条带。
通过前述步骤,用特异地设计成从外部与载体pJG-1m克隆区杂交的引物(表IV)对各构建体的5个克隆进行测序。
表IV.经PCR装配并克隆入载体pJG-1m中的scFv和二体碱基测序的合成寡核苷酸。
寡核苷酸11.(SEQ ID No.14)
5′...GTTGTTCCTTTCTATTCTCAC...3′
寡核苷酸12.(SEQ ID No.15)
5′...CTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC...3′
衍生自单价scFv(克隆pJG1m-25)和二体(克隆pJG1m-18)碱基序列的氨基酸序列如图2所示(SEQ ID No.16和SEQ ID No.17)。相对于先前所研究出的scFv(Ayala M等,Biotechniques13:790-799,1992),现在获自新的单价scFv和二体的VH和VL序列在VH FR1、CDR2和FR3结构域内显出有16个不同的氨基酸,在VL FR1和FR3结构域内显出有3个不同的氨基酸。
这些结果显示,用于构建新的单价scFv和二体、扩增和克隆自杂交瘤CB/ior-CEA.1的可变结构域可来自与先前所报道的scFv克隆扩增中所用RNA不同的RNA。
新的单价scFv的接头区段与先前所报道的scFv的接头区段相同。新的二价scFv(二体)的连接区段与先前所获得的scFv的连接区段不同,因为它只包括5个氨基酸。在这些实验中也证实了接头区段L1和L2的序列,如表II中所示。
步骤(c)用SDS-PAGE和Western印迹法证实scFv和二体在大肠杆菌中
的表达
用含两种抗体片段信息的质粒pJG1m-25和pJG1m-18独立转化大肠杆菌TG1感受态细胞。此菌株允许异源蛋白质在周质中表达或分泌到培养基中。
将被转化的细菌铺于固体选择性培养基上并在37℃培养16小时。将两个构建体各自的代表性菌落在液体培养基中培养至OD530nm=1,在培养基中加入1mM IPTG诱导12小时。将细胞离心,并用渗压休克法和短暂的超声处理(数秒)分离细胞周质成分,用于在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳分析。此试验显示了在两个构建体中有预期分子大小(约27kDa)的蛋白质表达,随后用Western印迹法对此进行了检验,检验中使用特异于此蛋白质所含之c-myc肽的Mab(9E10)作为一抗,随后使用与辣根过氧化物酶缀合的兔抗鼠IgG抗体(Sigma)。蛋白质从SDS-PAGE凝胶向Hybond C Extra硝酸纤维素膜的转移在半干的转移装置(BioRad)上进行。在显影中使用了DAB(Sigma)不溶性底物。
对于两个构建体,用Mab 9E10鉴别到了具有所述大小的重组蛋白质。
步骤(d)用ELISA检验scFv和二体对人CEA的特异识别
用浓度1μg/mL的人CEA(Calbochem219369)包被聚乙烯平板(Costar,96孔乙烯检测平板)进行ELISA检验。在用脱脂牛奶封闭平板后,加入以1∶5、1∶10和1∶20稀释于PBS-2%脱脂牛奶中、相应于两种构建体的细菌周质样品,并在室温保温2小时。
为了检测片段与CEA的连接,使用了Mab 9E10(1μg/mL),随后用来自Sigma的与过氧化物酶缀合的鼠抗鼠IgG抗体。洗涤数次后,将OPD(Sigma)和H2O2作为生色团和底物用于使反应液呈色,在LabSystem Multiskan MS中492nm波长处读数,以对反应液进行定量分析。
在此检测中,将Mab CB/ior-CEA.1用作阳性对照。将经无插入片段的载体pJG-1m转化的TG1细胞的周质部分和不相关Mab作为阴性对照。此外,用以下无关抗原包被平板:10μg/mL牛血清白蛋白(BSA,Sigma)、10μg/mL卵清蛋白、10μg/mL溶菌酶、10μg/mL匙孔血蓝蛋白(Sigma)。所有平板上都包括了只放置无抗原的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(空白)的孔。吸收值至少比阴性对照所产生吸收值大4倍的样品被认为是阳性的。
在这些实验中,scFv和二体构建体的周质样品就其识别吸附在聚乙烯板上的人CEA的能力而言的结果是阳性的。这些相同样品对所有无关抗原是阴性的。
步骤(e)在ELISA和间接免疫荧光中通过scFv和二体识别与细胞有关
联的人CEA
将所有在培养物中表达CEA的人肿瘤细胞系LoVo(ATCCCCL-229)、AsPC-1(ATCC CRL-1682)和LS 174T(ATCC CL-188)接种于96孔聚乙烯板(Costar)上。一旦细胞汇合,用PBS将孔漂洗两次,倾去溶液,在空气中晾干。然后用1∶1混合的冷丙酮-甲醇将细胞固定于塑料制品上3分钟。用蒸馏水漂洗数次除去残余物后,平板用作ELISA检测中的固相,其中加入了按1∶2、1∶8和1∶16稀释于PBS-2%脱脂奶中的相应于两个构建体的细菌周质样品,在室温保温2小时。漂洗数次后,使用Mab 9E10(1μg/mL),然后使用缀合了过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体(Sigma)检测片段与CEA的联接。漂洗数次后,用生色团OPD(Sigma)和作为底物的H2O2使反应显色,用LabSystems MultiskanMS阅读仪在492nm波长处对反应物进行定量分析。为进行阅读步骤,将上清转移到新鲜平板上。在检测中将Mab CB/ior-CEA.1用作阳性对照。将相应于用无插入片段的载体pJG-1m所转化的TG1细胞的周质部分和无关Mab用作阴性对照。具有不表达CEA的人细胞HEK293(ATCCCRL-1573)的平板也用作阴性对照。阳性的标准与先前步骤中所述ELISA中用的标准相似。
在此实验中,scFv和二体构建体的周质样品只识别LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞。所有的阴性对照都是阴性的。用这种方式,证实了scFv和二体通过细胞-ELISA对固定于聚苯乙烯板上的表达此抗原的人肿瘤细胞上的人CEA进行鉴定的能力。
在另一实验中,将LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞接种于35mm直径的聚苯乙烯板(COSTAR)上并培养至细胞汇合。用PBS漂洗平板两次,倾去溶液,在空气中晾干,然后用1∶1混合的冷丙酮-甲醇将细胞固定于塑料制品上。用蒸馏水漂洗数次以除去残余物后,将平板用作间接免疫荧光检测中的固相。为了进行此检测,在表面上以固定化小室确定一些环形区域,在其中将相应于两个构建体的细菌周质样品以1∶2、1∶4和1∶8稀释于PBS-3%BSA中的稀释液独立进行保温。使用了与细胞-ELISA中所用同样的阳性和阴性对照。
在潮湿的容器内室温(RT)保温1小时,然后用冷的PBS-3%BSA漂洗数次,添加Mab 9E10(10μg/mL)至所有的单层细胞上,仍在潮湿的容器中室温保温1小时。用冷PBS-3%BSA漂洗数次后,将单层细胞与缀合了异硫氰酸荧光素(FITC,Sigma)并1∶64稀释于PBS-3%BSA的抗小鼠IgG抗体在黑暗潮湿的容器中保温30分钟,然后用PBS-3%BSA漂洗5次,再用PBS洗一次,最后用Evans Blue溶液染色几分钟。
用BS-10%甘油覆盖细胞单层,用盖玻片封闭,然后用安装在Olympus BHT显微镜中的荧光附件Olympus BH2-RFL进行检测。HEK293人细胞培养平板也用作阴性对照。在膜和细胞质中出现苹果绿荧光被确定为阳性结果的标准,条件是这种现象不会出现于阴性对照样品中或对CEA呈阴性的人细胞中。
在此实验中,scFv和二体构建体的周质样品只识别LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞。阴性对照的结果是阴性的。用这种方式证实了利用scFv和二体通过间接的免疫荧光鉴定固定于聚苯乙烯板上的表达此抗原的人肿瘤细胞上的人CEA的能力。实施例的结果如图3所示。
实施例3.scFv和二体在Pichia pastoris中的表达和它们识别人CEA的证明
步骤(a)scFv和二体的再扩增以及在载体pPS7中的克隆
分别以构建体pJG1-25和pJG1-18为模板,通过PCR扩增编码scFv和二体的基因,所用寡核苷酸设计成在基因的5’和3’末端添加NcoI位点(寡核苷酸13和14;表V),其目的是克隆入Phchia pastoris表达载体pPS7中。扩增的步骤与先前所述的相同。质粒pPS7是整合载体,包含相应于醇氧化酶(AOX.1)启动子的1.15kb片段,随后是编码酿酒酵母蔗糖转化酶(sucII)分泌信号的基因、NcoI单克隆位点、保证转录完成的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapt)960bp片段以及作为选择标记的酿酒酵母HIS3基因。另外此载体还包含一2.1kb片段,相应于AOX.1基因的3’序列。所有这些元件均被插入载体pUC18中(Herrera Martinez LS等,EP0438200 A1)。
表V.在扩增和修饰编码VH最初几个碱基和VL最后几个碱基的序列、在pPS7载体中克隆scFv和二体以及这些克隆测序的PCR中应用的合成寡核苷酸。
寡核苷酸13.NcoI-FR1 VH(SEQ ID No.18)
5′...CATGCCATGGGGAATCCGAAGTGAAGCTGGTGGAG...3′
寡核苷酸14.NcoI-6个组氨酸(反义)(SEQ ID No.19)
5′...CATGCCATGGATCCCGGGGTGATGGTGATGGTGATG...3′
寡核苷酸15.醇氧化酶pAOX.1启动子(SEQ ID No.20)
5′...GACTGGTTCCAATTGACAAGC...3′
在用NcoI(Promega)消化相应于scFv和二体的扩增条带后,将它们分别与事先已用此酶消化的载体pPS7连接,连接产物以独立的方式转化入大肠杆菌XL-1Blue菌株中。用菌落PCR分析相应于各重组载体转化的菌株的分离菌落,所用引物中的一个与启动子杂交(寡核苷酸15,表V),而另一个与VL的3’末端杂交(寡核苷酸8,表III)。选择包含插入方向正确的片段的菌落。依照先前所述的步骤(实施例1步骤b)用寡核苷酸15(表V)进行克隆基因的测序。获自重组质粒pPSM2(scFv)和pPSM3(二体)VH和VL结构域的序列与先前在SEQ ID No.16和SEQID No.17所列举的序列一致。
事先用限制性酶PvuII(Promega)消化两种已提及的质粒,通过电穿孔转化MP36his3野生型菌株,并在组氨酸缺陷型基本培养基上进行选择,由此获得具有这两种质粒的Pichia pastoris重组菌株。由于在Pichiapastoris基因组中具有特异位点的重组质粒的重组机制不同,对于每个构建体而言可能分离到两个不同表型的分泌菌株:(a)在重组过程中AOX.1基因不受影响,并因此在甲醇培养基中生长且长势与野生型菌株相似的菌株(Mut+),和(b)其中的AOX.1基因被表达盒取代且在甲醇存在时显示生长较慢的菌株(Mut s)。
步骤(b)表达研究
对抗体片段表达的研究是从生长于选择性MD培养基(酵母氮碱、生物素、葡萄糖)平板中的原养型菌落His+开始。将所选择的菌落在50mL试管内接种于10mL富BMGY的缓冲培养基(酵母提取物、蛋白胨、磷酸钾、酵母氮碱、生物素和甘油)中,28℃150rpm旋转培养。当培养物以SPECTRONIC GENESIS 2装置检测到600nm处的吸收值达到2个OD单位时,将这些培养物用2000rpm离心10分钟。将细胞沉淀悬浮于以甲醇(BMMY)代替甘油作为唯一碳源的10mL丰富培养基中。从此刻开始在96个小时内每天在培养物中添加纯甲醇至终浓度达到1%,诱导目的蛋白质。用无插入片段的载体所转化的MP36his3菌株被用作阴性对照。
培养结束后,将细胞离心,收集在诱导阶段代谢产生的培养基,再次离心使其最终变得澄清,在15%SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中进行电泳以检测scFv或二体。此检测显示了在两种情况下均有符合预期分子量(约27kDa)的蛋白质表达,这一点后来通过Western印迹法,以Mab 9E10为一抗,缀合了辣根过氧化物酶的兔抗鼠IgG抗体(Sigma)为二抗进行了检测。如上所述进行转膜。在显色过程中,用DAB(Sigma)作为不溶性底物。对于所说的两种构建体,用Mab 9E10鉴定重组蛋白质。
步骤(c)在ELISA中scFv和二体对人CEA的识别
ELISA检测与先前所述用于大肠杆菌来源材料的ELISA非常相似,其中用相似的固相、试剂以及包被、保温、显影和阳性对照条件。将被诱导的重组菌株的代谢培养物样品稀释于PBS-1%牛奶中,以100μL/孔的量添加到各孔中,室温保温2小时。将相应于菌株MP36his3的代谢培养基和无关Mab用作阴性对照。当吸收值比阴性对照所产生的值至少大4倍时,此样品被认为是阳性的。
在此实验中,表达于Pichia pastoris中的scFv和二体构建体诱导阶段代谢培养基样品对于其吸附于聚苯乙烯板上的人CEA的识别能力而言是阳性的。
步骤(d)用细胞-ELISA和间接免疫荧光识别与细胞相关联的人CEA
ELISA检测与先前所述用于大肠杆菌来源材料的ELISA非常相似,其中用相似的固相、试剂以及包被、保温、显影和阳性对照条件。将被诱导的重组菌株的代谢培养物样品稀释于PBS-2%牛奶中并添加到固定有LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞的平板中,室温温和搅拌2小时。在检测中将Mab CB/ior-CEA.1用作阳性对照。将用无插入片段的载体pPS7转化过的菌株MP36his经过代谢的诱导阶段培养物和无关的Mab作为阴性对照。另外,用具有人HEK293细胞的平板作为阴性对照。
在此实验中,通过ELISA证实了scFv和二体特异识别固定于聚苯乙烯支持物上的人肿瘤细胞上的人CEA的能力。
间接免疫荧光检测与先前所述用于大肠杆菌来源材料的检测非常相似,其中使用了相似的培养细胞、固定条件、试剂、保温、显影、设置、显微镜观察和阳性标准。在具有固定的LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞的平板上确定独立的区域,向其中施加稀释于PBS-3%BSA、0.02%叠氮化钠中的对应于两个构建体的重组菌株原种诱导培养物样品和阴性对照。
在潮湿的容器内室温(RT)保温1小时,随后用冷的PBS-BSA-叠氮化钠漂洗数次,在室温添加Mab 9E10至所有的细胞单层上1小时,仍在潮湿的容器中进行。用冷PBS-3%BSA漂洗数次后,在黑暗潮湿的容器中将细胞单层与1∶64稀释于PBS-3%BSA中的缀合了异硫氰酸荧光素的抗小鼠IgG抗体(Sigma)一起保温30分钟。用PBS 3%BSA漂洗平板5次,用PBS洗一次,最后用Evans Blue溶液染色几分钟。在覆盖了PBS-10%甘油的细胞单层上放上盖玻片,并用紫外光显微镜检测。
在此检测中,将Mab CB/ior-CEA.1用作阳性对照。用经无插入片段的pPS7转化的MP36his3被诱导培养基和无关Mab作为阴性对照。具有HEK293细胞的载玻片也用作阴性对照。在此实验中,分泌重组scFv和二体的被诱导培养物样品只识别LoVo、AsPC-1和LS 174T细胞。阴性对照的结果是阴性的。通过间接免疫荧光法证实了产生于Pichiapastoris中的scFv和二体特异识别固定于聚苯乙烯板上的表达此抗原的人肿瘤细胞上的人CEA的能力。
实施例4.-纯化细菌中产生的scFv和二体
步骤(a)用固定化离子金属亲和层析(IMAC)和离子交换纯化scFv
和二体片段
由载体pJG-1m提供的、重组蛋白质中存在的6组氨酸结构域被用于纯化。这些序列使蛋白质对金属离子(例如Zn2+、Cu2+、Ni2+)具有极高的亲和力,所说的金属离子能螯合到不同的层析支持物上,从而能简单并可再现地进行纯化。
将如前文所述获得的重组细菌进行离心并通过渗压休克和短暂的超声波处理(数秒)分离周质内容物,然后在偶联缓冲液(Tris-HCl20mM、1M NaCl、20mM咪唑,pH7.0)中透析72小时。将含scFv和二体的细菌周质制品直接分别施加到Sepharose-IDA-Cu2+基质(Pharmacia)上。一旦蛋白质被偶联后,首先用10倍体积的偶联缓冲液漂洗凝胶,然后以相似的方式用漂洗缓冲液(Tris-HCl 20mM、1MNaCl、150mM咪唑,pH7.0)漂洗,以去除大肠杆菌污染蛋白质。用Tris-HCl 20mM、1M NaCl、250mM咪唑,pH7.0洗脱scFv和二体。将洗脱峰部分的样品进行12%SDS-PAGE电泳以证实目的蛋白质的存在。在UltraFree 15(Amicon)设备中浓缩含scFv和二体的洗脱组分,在含Tris-HCl 20mM,pH8.7的缓冲溶液中进行透析,然后用离子交换柱进行第二步纯化。为了进行这一步,将样品加到Mono Q柱(Pharmacia)上,并用线性NaCl梯度(0-1M)进行洗脱。将所收集峰的样品在12%SDS-PAGE中检查。证实了存在预期大小(约27kDa)的scFv和二体。通过SDS-PAGE和银染方法估计最终获得的两种分子的纯度非常相似,都接近95%。在UltraFree 15(Amicon)设备中将纯scFv和二体峰浓缩至高达2mg/mL。在完成与本发明前述步骤相似的步骤后用ELISA检验纯化制品的生物学活性。所有的样品均保存于4℃。
步骤(b)通过凝胶过滤分析scFv和二体
用分子筛色谱法研究依照前述步骤纯化的scFv和二体,以确定样品的均一性和多聚体的存在。为此使用了Superdex 200(Pharmacia)和HPLC装置中的凝胶过滤常规方法。确定了scFv浓缩于约27kDa的主峰中,这相应于单体的形式。二体主要呈现为约45kDa的大小,相应于二聚物的形式。
实施例5.-通过蛋白水解和质谱对二体进行定性分析
将纯化的二体用含pH8.3的1%NH4HCO3和2mol/L浓度尿素的缓冲溶液在4℃透析过夜。用测序级的胰蛋白酶(Promega)以1∶50的酶∶底物比率在37℃将透析后的蛋白质消化4小时。通过用等体积的1%三氟乙酸水溶液酸化来终止蛋白水解,然后贮存于-20℃待进行与质谱仪偶联的液相色谱(LC-MS)分析。
在液相色谱AKTA Basic(Amersham Pharmacia Biotech)中100分钟内用0%-80%溶液B的线性梯度通过反相色谱分离胰蛋白酶消化产物。用于产生梯度的溶液是:A:H2O/TFA 0.05%和B:乙腈/TFA 0.05%。
通过在线地与LC-MS混合质谱仪的色谱系统与正交几何QTOF-2(Micromass Ltd.)系列联合的方式,用电喷射离子化质谱(ESI-MS)分析蛋白水解消化产生的组分。在LC-MS检测中,在0.98秒内记录350-1800的质谱,每隔0.02秒进行一次扫描。用碘化钠和碘化铯混合物组成的盐溶液校准质谱仪。圆锥体和毛细管内所用的电压分别为50和3000伏。用软件包MassLinx v 3.5(Micromass Ltd.)处理光谱。
在图4及其附表中可见二体胰蛋白酶水解产物的色谱图和二体胰蛋白酶水解肽的分布概要。从图4附表的组分8和12的概要中明显可见,在ESI-MS色谱中未检测到显示有错误连接的半胱氨酸的信号,包括分别在第22和第95位以及第147和第212位半胱氨酸之间通过二硫键(-S-S-)连接的肽(20Phe-Arg31)-S-S-(87Ser-Arg97)和(143Val-Lys148)-S-S-(186Ile-Lys228)。
用ESI-MS来分析肽,通过单一的胰蛋白酶水解就可获得92%的二体序列(图5)。此序列与从碱基序列推断的氨基酸序列完全一致,所说序列包括通过PCR扩增自产生Mab CB/ior-CEA.1的杂交瘤的总RNA的VH和VL结构域(SEQ ID No.16和17)、5个氨基酸长的接头区段(SEQID No.10)以及C-末端部分,由载体pJG-1m所提供的c-myc肽序列和最后6个组氨酸(图2)。
实施例6.-有关去糖基化CEA识别的研究
用特异于N-糖基化的内切糖苷酶PNGase F(New England Biolabs)将人CEA(Calbochem)进行酶促去糖基化。将CEA溶于20mM pH7.8的磷酸盐缓冲液中并用SDS和2-巯基乙醇在100℃变性5分钟。然后加入NP40和1μl PNGase F,于37℃2小时。在SDS-PAGE中用考马斯蓝染色分析对照样品和去糖基化样品,用内切糖苷酶消化后分子大小有了显著的减小(近50%)。用(a)Mab CB/ior-CEA.1、(b)纯化的二价scFv(二体)或(c)获自小鼠的抗人CEA抗血清作为一抗,随后对于(a)和(b)来说使用缀合了辣根过氧化物酶的抗Mab CB/ior-CEA.1的Fab的多克隆抗体,而对于(c)来说使用缀合了辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体,进行Western印迹杂交。转膜和呈色与本发明前文中Western印迹法的有关描述相似。Mab CB/ior-CEA.1和二体只识别未去糖基化的抗原。多克隆抗血清识别去糖基化前和去糖基化后的CEA。
通过识别特异外源凝集素的斑点印迹系统分析天然的人CEA样品。所应用的外源凝集素是Sambucus nigra凝集素(SNA)和Maackiaamurensis凝集素(MAA),分别特异于α2,6和α2,3连接的末端syalicacid。应用于这些实验中的外源凝集素已经与洋地黄毒苷连接,它可以被标记了碱性磷酸酶的抗洋地黄毒苷抗体识别。对外源凝集素-寡糖相互作用呈阳性的样品通过与特异于磷酸酶的底物(4-硝基四唑蓝氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐混合物)反应而被显色。胎球蛋白在此实验中被用作两种外源凝集素的阳性对照。天然CEA被SNA识别而不被MAA识别,这一事实显示了α2,6连接的末端syalic酸非常普遍。
然后用酶NANAsaII和能水解末端syalic acid α2,6的外切糖苷酶(syalidase)消化人CEA。消化产物在SDS-PAGE中分离,然后用MabCB/ior-CEA.1和获自小鼠的抗人CEA抗血清作为一抗,通过Western印迹法进行有关它们识别作用的研究。结果显示两种样品均识别天然CEA对照,而只有小鼠抗CEA抗血清识别用NANAsaII消化过的CEA。
实施例7.-在人正常组织和肿瘤组织中进行的免疫细胞化学和组织化学研究
用来自尸检材料的正常组织和肿瘤组织个体的样品进行组织研究。用最小份的组织块证实已描述的Mab CB/ior-CEA.1的识别(Tormo B等,APMIS 97:1073-1080,1989)。样品包括:肺癌、皮肤癌、乳腺癌、子宫颈癌、食道癌和肾癌;结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌和胃癌;神经系统、造血系统和肉瘤来源的肿瘤,以及正常的结肠黏膜和正常的组织,如肝、肾、肺、睾丸、脾和胰腺,还包括血液细胞。
对过去所报道的方法(Tormo B等,APMIS 97:1073-1080,1989)作一些修改后进行研究。依照常规步骤将组织样品在10%缓冲甲醛中固定、脱水、清洗并包埋于石蜡中。用苏木精-曙红将切片染色进行组织病理学研究。通过组织病理学分析包埋块的连续切片被用作免疫过氧化物酶技术。
用3%的H2O2处理去石蜡、再水合的切片30分钟以封闭内源性的过氧化物酶,在磷酸缓冲盐水(PBS)中漂洗,随后与稀释于PBS-1%牛血清白蛋白(稀释缓冲液)中的样品一起保温1小时。然后,将玻片与1∶100稀释的生物素化多克隆IgG兔抗体一起保温30分钟,所说的抗体是用Mab CB/ior-CEA.1免疫而获得的,之后与1∶500稀释的过氧化物酶-链霉亲和素复合物(Amersham)一起保温相似的时间。
被检测的样品是:
(a)浓度为20μg/mL的Mab CB/ior-CEA.1(阳性对照)
(b)如实施例4中步骤(a)所述、浓度为50μg/mL的已纯化的大肠杆菌scFv
(c)如实施例4中步骤(a)所述、浓度为50μg/mL的已纯化的大肠杆菌二体
(d)先前获得的scFv,它在这些实施例中被称为“F3”(Ayala等,Biotechniques 13:790-799,1992;Perez L等,AppliedBiochem.Biotechnol.24:79-82,1986),已纯化且浓度为50μg/mL和100μg/mL。
所有的稀释均在稀释缓冲液中进行,温育是在潮湿容器内室温下进行的。在各步之前用稀释缓冲液或PBS漂洗3次,1分钟/次。通过与含3mg二氨基联苯胺、5mL PBS和5mL 30%H2O2的溶液一起保温5-10分钟使免疫过氧化物酶反应显色。用Meyer氏苏木精复染玻片。特征性的褐色反应表现为:阴性,三个渐增的强度水平(1+、2+、3+)的阳性。在各张玻片上含待测样品的部分被标记,而含稀释缓冲液的邻近区作为阴性对照。
为了进行血液细胞中的研究,首先要去除红血球,然后将白细胞铺于包被了明胶的玻璃载片上,用1∶1(V∶V)的丙酮∶甲醇固定。操作的其余部分基本上如上文所述进行。
有关被研究组织的已获结果总结于表VI中。所研究的正常组织(肝、肾、肺、睾丸、血液、脾、胰腺)不被所说片段或Mab识别。在结肠粘膜的情形中,与先前已获得的对于Mab CB/ior-CEA.1、F3 scFv以及新型scFv和二体的结果一致,专门与腔内分泌产物以及某些腺体的顶端区域反应。F3 scFv的反应强度较低,这种现象随后在对于几种肿瘤的实验中也观察到了。在血液细胞的情况中,Mab、scFv和二体未显示出与正常淋巴细胞和嗜中性粒细胞的反应,表明它们缺乏与NCA抗原的重要交叉反应性。与此相反,F3 scFv显示出对这些细胞有较少的识别。
Mab、scFv和二体与大部分胃肠来源的肿瘤反应,在多数情形中在肿瘤细胞的顶端表面和细胞质中均观察到强的标记。这些样品均不标记造血和肉瘤来源的肿瘤,或来自上皮的其它肿瘤,但乳房微管癌和肺大细胞癌是例外。在分化良好的结肠癌情形中,在细胞质顶端区和腔内分泌产物中有强标记,而在中等分化和分化不足的腺癌中则在全部细胞质内均观察到有标记。只有少数样品例外,相对于这三个分子而言染色强度非常类似。
在F3的情形中,观察到了染色强度的普遍降低,即使在某些情况下应用了比scFv和二体所用量高两倍的浓度,仍能观察到此现象。较低的染色强度可能造成被其它抗体识别的某些样品不被F3识别。
表VI.用不同抗体进行的免疫细胞化学和组织化学研究。
组织 | scFv F3 | scFv | 二体 | CB/ior-CEA.1 |
正常组织: | ||||
肺 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
胸腺 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
肾 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
肝 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
脾 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
睾丸 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
结肠 | 2/2(a)* | 2/2* | 2/2* | 2/2* |
血液 | 0/2(b) | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
肿瘤组织: | ||||
ADC胃 | 1/2(a) | 2/2 | 2/2 | 2/2 |
ADC胰腺 | 1/3(a) | 2/3 | 2/3 | 2/3 |
ADC胆囊 | 0/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |
食道癌 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
ADC肠 | 1/2(a) | 2/2(a) | 2/2 | 2/2 |
肺癌(大细胞) | 1/1(a) | 1/1 | 1/1 | 1/1 |
ADC结肠(BD、MD、PD) | 5/6(a) | 6/6(c) | 6/6 | 6/6 |
乳癌 | 0/1 | 1/1 | 1/1(a) | 1/1 |
ADC前列腺 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
子宫颈癌 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
肾癌 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
皮肤癌 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
HDG淋巴瘤 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
非HDG淋巴瘤 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
横纹肌肉瘤 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
脂肪肉瘤 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
注:表中的数字代表染色阳性的情形/被研究情形的总数目。如果没有括号存在,阳性样品的染色强度在2+和3+之间;Ca:癌;ADC:腺癌;HDG:Hodgkin;BD:分化良好;MD:中等程度分化;PD:分化不良。(*):标记出现局现于腔内分泌产物和某些腺体的顶端区;(a):染色强度可归为1+级别的阳性情形;(b)识别淋巴细胞和嗜曙红细胞的强度可归为1+级别;(c)6个阳性情形中有2个显示的染色强度可归为1+级别。
实施例8.-亲和常数的测定
为了测定亲和常数,使用了基于质量作用定律的非竞争性ELISA方法(Beatty JD等,J.Immunol Meth.100:173-184,1987)。亲和常数Kaff等于[AgAb]/[Ag][Ab],其中AgAb是抗原-抗体复合物的L/mol(M-1),[Ag]是游离抗原的浓度(mol),而[Ab]是游离抗体的浓度(mol)。
用4个系列稀释度且均为双份的人CEA(Calbochem)包被聚乙烯ELISA平板(Costar)。用PBS-1%脱脂奶封闭平板。将样品(scFv F3、scFv、二体、Mab CB/ior-CEA.1,均已纯化)以不同的浓度施加到平板上。漂洗后,将相应于上述前三个样品的孔与Mab 9E10(10μg/mL)一起保温,而在相应于Mab CB/ior-CEA.1的孔中则施加了封闭液。下一步是将1∶2500稀释的缀合了过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体(Sigma),37℃保温1小时。所使用的底物是OPD,反应显色15分钟。在LabSystemsMultiskan MS装置中读取492nm处的吸收值。
将各种情形下的光密度值(OD)作为绘图的纵坐标(y),ng/mL浓度的常用对数值作为横坐标(x)。将OD100作为信号保持最大值时的OD。对于各条曲线,计算OD100的一半值(OD50)。测定对于各条曲线而言在OD50处各样品的浓度值,用以下公式进行亲和力计算:Kaff=(n-1)/2(n),其中的n=[Ab’]t/[Ab]t。[Ab’]t是相应于最高待比较抗原浓度时OD50值处的样品浓度,而[Ab]t是相应于最低待比较抗原浓度时OD50值处的样品浓度。对于4条已获得的曲线,进行6次可能的亲和测定,最终的Kaff为这几次测定的平均。
表VII反应了对于被检测的各变体计算得到的Kaff值。scFv的Kaff值为(5.0±0.4)×109L mol-1,比F3的Kaff值(Kaff=(9.2±0.8)×107L mol-1)高1个半数量级。后一个值基本上与用不同方法测定F3所计算得到的Kaff相符(Perez L等,Applied Biochem.Biotechnol.24:79-82,1996)。二体的Kaff值为(2.8±0.3)×1010L mol-1,而Mab CB/ior-CEA.1的Kaff值则为(6.1±0.5)×1010L mol-1。
表VII.由已进行的实验计算的亲和值。
被检测样品 | Kaff(L mol-1) |
Mab CB/ior-CEA.1 | (6.1±0.5)×1010 |
二体 | (2.8±0.3)×1010 |
scFv | (5.0±0.4)×109 |
scFv F3 | (9.2±0.8)×107 |
Kaff:亲和常数,由6次测定的平均值±标准偏差(括弧内)计算得到。实施例9.-在患有通过接种B16-CEA13细胞而诱发的肿瘤的C57Bl/6小鼠内测定被125I所标记的片段和抗体的特异体内识别
为了测定抗体片段的体内特异识别,通过lodogen方法用125I(Amersham,UK)标记以下分子(Fraker PJ,Speck JC Jr,BiochemBiophys Res Comm 80:849-857,1978):
(a)纯化自大肠杆菌的scFv;(比活:1.1MBq/5μg)
(b)纯化自大肠杆菌的二体;(比活:1.2MBq/5μg)
(c)Mab CB/ior-CEA.1;(比活:1.8MBq/5μg)
(d)纯化的scFv F3(Ayala等,Biotechniques 13:790-799,1992;Perez L等,Applied Biochem.Biotechnol.24:79-82,1996)(比活:1.0MBq/5μg)。
用薄层层析分析放射性标记产物来确定蛋白质的掺入,发现了95-98%的放射性。在以下体系中检测放射标记的产物探测CEA的能力:用CEA(5μg/mL;Calbochem)包被聚苯乙烯管,封闭并加入放射标记的样品,调节抗体的量使其能被固相材料上所俘获。保温后漂洗一次,对于上述样品(a)-(d),分别测定到80%、79%、83%和81%的放射性被固相材料所俘获,证明了放射标记步骤未明显影响抗体的生物学活性。
为了研究生物分布,将实验动物分成4组,每组有12只C57Bl/6小鼠(CENPALAB,Cuba)。用腋下注射的方式以1×106个B16-CEA13细胞/只的量接种动物。7天后肿瘤可见且可触摸(约为0.3-0.5g),此后将待检测的放射性标记产物从尾静脉注射入小鼠,在12、24、48小时后处死小鼠,手术取出肿瘤和以下正常组织:脾、肝、肾、肠、肌肉、骨髓和血液。放射性的积聚表示为注射剂量的百分率/克组织。通过标准样品的注射剂量进行校正。用伽马闪烁计数器测定放射性。
通过用克隆于pDisplayTM载体(目录号V660-20,Invitrogen)中的编码人CEA胞外结构域的基因进行转染来获得这些实验中所用的B16-CEA13细胞。用提取自CRL-1682细胞的RNA,通过设计成改变已公布的人CEA序列的寡核苷酸进行PCR得到该基因。纯化重组质粒pDisplay-CEA并用Lipofectamine PLUSTM(Gibco-BRL)转染入C57Bl/6小鼠B16-F10黑素瘤细胞(ATCC CRL-6475),每次转染用5μg DNA。用4.0mg/mL硫酸遗传霉素(G418;Gibco-BRL)对稳定的转染子进行14天的选择,之后通过有限稀释法将继续存活的培养细胞进行克隆,以Mab CB/ior-CEA.1为一抗通过间接的免疫荧光法鉴定在其表面表达人CEA的那些克隆,利用缀合了FITC的抗小鼠IgG抗体(Sigma)进行显色。发现有73%的克隆中有80%以上的细胞呈现特异的膜荧光,显示了人CEA经正确折叠和糖基化后暴露于其表面。
将B16-F10未转染细胞用作对照。将通过间接免疫荧光法选择为阳性的克隆复制品进行增殖并通过腋下途径分别注射入C57BI/6小鼠,每只动物注射1×106个细胞。在产生肿瘤的10个克隆中选择具有较快和渐进性生长特征的克隆(命名为B16-CEA13),用于此处报道的实验中。
图6显示了在不同时间从每种被研究组织中回收的放射性百分率(相对于所注射的整体而言),以及肿瘤中放射性:血液中放射性的比率。表VIII的结果证实了在24小时和48小时之间,对于二体、scFv和Mab而言,肿瘤中放射性:血液中放射性的比率保持较高的水平,后者最高,其次是二聚物分子。先前获得的F3 scFv显示了非常低的值,它对CEA的亲和力的降低可能与其体内表现不好相关。
表VIII.移植了表达人CEA的小鼠B16-CEA13黑素瘤的C56Bl/6小鼠血液中放射性:肿瘤放射性的比率。测定了用125I放射性标记的不同分子注射动物后24小时和48小时的值。每个比率都是计算由12只小鼠回收的组织的平均值得到的。
分子 | 24小时 | 48小时 |
scFv | 43.60 | 53.50 |
二体 | 47.10 | 61.17 |
scFv F3 | 1.79 | 2.62 |
Mab CB/ior-CEA.1 | 51.70 | 71.30 |
序列表
<110>Center for Genet ic Engineering and Biotechnology
<120>对人癌胚抗原(CEA)特异的抗体片段
<130>序列表实例
<140>01
<141>2002-04-03
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>1
ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>2
ayctccacac acaggrccag tggatagac 29
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>3
ggggatatcc accatggagw cacakwctca ggtctttrta 40
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>4
actggatggt gggaagatgg a 21
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:接头I
<400>5
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:接头II
<400>6
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>7
tctcacagtg cacaggaagt gaagctggtg gagtctggg 39
<210>8
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>8
gtcgactttg gattcggagc ctgatcctga ggatttaccc tctgaggaga ctgtgagagt 60
ggt 63
<210>9
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>9
gagggtaaat cctcaggatc aggctccgaa tccaaagtcg acgacattgt gatgacccag 60
tc 62
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>10
aaggaaaaaa gcggccgctt tcagctccag cttggtt 37
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>11
agagccgccg ccacctgagg agactgtgag agtggt 36
<210>12
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>12
ggtggcggcg gctctgacat tgtgatgacc cagtct 36
<210>13
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:载体
<400>13
cctttctatt ctcacagtgc acaggaaatc aaagcggccg cagggtccga acaaaaactc 60
atctcagaag aggatctgaa ttcccatcat catcaccatc actaataa 108
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>14
gttgttcctt tctattctca c 21
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>15
ctcttctgag atgagttttt gttc 24
<210>16
<211>241
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:scFv
<400> 16
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Glu Ser Lys Val Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met
130 135 140
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln
145 150 155 160
Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
165 170 175
Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro
180 185 190
Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys
<210>17
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:二体
<400>17
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser
130 135 140
Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
195 200 205
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly
210 215 220
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
225 230
<210>18
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>18
catgccatgg ggaatccgaa gtgaagctgg tggag 35
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:寡聚物
<400>19
catgccatgg atcccggggt gatggtgatg gtgatg 36
<210>20
<211>21
<212>DNA
<<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:二体MS
<400>20
gactggttcc aattgacaag c 21
<210>21
<211>255
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:二体MS
<400>21
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ile Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser
130 135 140
Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
195 200 205
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly
210 215 220
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys
225 230 235 240
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His His
245 250 255
Claims (14)
1.由提取自产生Mab CB/ior-CEA.1的杂交瘤的RNA获得的单体scFv型抗体片段,所述抗体片段对可溶性形式、吸附于固体表面、或细胞中存在的人癌胚抗原(CEA)是特异的,而且显示对CEA的亲和常数是(5.0±0.4)×109Lmol-1,对这种抗原的识别依赖其糖基化的保留。
2.依照权利要求1的单体scFv型抗体片段,特征为其氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示。
3.由提取自产生Mab CB/ior-CEA.1的杂交瘤的RNA获得的二价(二体)scFv型抗体片段,所述抗体片段对可溶性形式、吸附于固体表面、或细胞中存在的人癌胚抗原(CEA)是特异的,而且显示对CEA的亲和常数是(2.8±0.3)×1010Lmol-1,对这种抗原的识别依赖其糖基化的保留。
4.依照权利要求3的二价(二体)scFv型抗体片段,特征为其氨基酸序列如SEQ ID NO 17所示。
5.依照权利要求1-4的抗体片段,特征为它们用于鉴定表达人CEA的肿瘤细胞。
6.对人CEA特异的重组或合成重组抗体,特征为它们包含SEQID NO 16和SEQ ID NO 17所示可变结构域VH和VL的氨基酸序列,并人工连接成Fab片段的形式,其它scFv变体,双特异性抗体,或者与生物学或生物化学活性结构域融合。
7.依照权利要求1-6的抗体片段,特征为它们是在重组细菌或酵母中、在经转染昆虫或哺乳动物细胞中、或者在经遗传修饰的生物体中生成的。
8.依照权利要求1-7的抗体片段,特征为它们额外包含放射性标记或通过其它方法可检测的标记物,或者具有抗肿瘤潜力的化学或生物学试剂。
9.包含依照权利要求1-8的抗体片段的药物组合物,其可用于治疗表达CEA的人肿瘤。
10.包含依照权利要求1-8的抗体片段的药物组合物,其可用于经成像技术对表达CEA的人肿瘤进行体内放射性定位。
11.包含依照权利要求1-8的抗体片段、用于体外或离体诊断的试剂,用于检测与细胞相关联或无关联的人CEA。
12.通过重组DNA的遗传操作获得的、表达依照权利要求1-8的抗体片段的细胞,这些细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、或植物细胞。
13.通过重组DNA的遗传操作获得的、表达依照权利要求1-8的抗体片段的多细胞生物体,这些生物体是转基因动物或转基因植物。
14.通过重组DNA的遗传操作获得的、编码依照权利要求1-8的抗体片段的载体,这些载体是质粒或能够整合到宿主细胞中的序列。
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