CN1138786C - 识别破骨细胞形成抑制因子结合蛋白的抗体及制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗体，该抗体可识别与破骨细胞形成抑制因子(OCIF)特异性结合的膜结合蛋白质分子(OBM)及/或缺损了该膜结合部位的可溶性OBM(sOBM)，所述抗体具有以下性质：a.分子量：约150,000Da；b.亚型：IgG1或IgG2；c.轻链：κ链，该抗体具有的解离常数为10-7或以下。本发明还涉及制备该抗体的方法、杂交瘤细胞、该抗体的用途和含有该抗体的骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。

Description

识别破骨细胞形成抑制因子结合蛋白的抗体及制备和用途
技术领域
本发明涉及与破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitoryfactor；以下，称其为OCIF)结合的新型蛋白质(OCIF结合分子，以下称为OBM)及其制备方法。
本发明还涉及编码该蛋白质的DNA、由该DNA编码的氨基酸序列的蛋白质、该蛋白质的基因工程制备方法，以及含有该蛋白质的医药组合物。
本发明还涉及用该蛋白质及DNA以调节该蛋白质表达的物质，抑制或改变该蛋白质生物活性的物质，或与该蛋白质结合、传递其作用的受体的筛选法，利用该方法获得的物质以及含有所得物质的医药组合物。
本发明还涉及该蛋白质的抗体及其制备方法、使用了该方法的该蛋白质的测定方法，以及含有抗体的医药品。
背景技术
骨代谢依赖于起骨成形作用的成骨细胞和起骨吸收作用的破骨细胞的综合活性。如果骨成形和骨吸收的平衡被破坏，则会引起骨代谢异常。众所周知，伴随骨代谢异常的疾病包括骨质疏松症、高钙血症、佩吉特骨疾病、肾性骨发育不全、慢性关节风湿病及变形性关节炎等。这些骨代谢异常疾病的代表症为骨质疏松症。该疾病是因破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨成形而造成的。其特征是骨钙质和骨基质的等量减少。然而，关于这种疾病的发生机制，目前仍未完全阐明。这种疾病会引起骨痛，还会使骨变得脆弱而造成骨折。因而，随着老龄人口的增加，这种疾病成为老人因骨折而卧床不起的原因，也已成为社会问题，所以其治疗药物的开发已成当务之急。这种因骨代谢异常所致的骨量减少症，可期望通过抑制骨吸收、促进骨成形或改善它们的平衡而加以治疗。促进与骨成形有关的成骨细胞的增殖、分化或激活，或抑制由破骨细胞的前体细胞至破骨细胞的分化或成熟，或抑制破骨细胞的骨吸收活性等功能可望促进骨成形。目前正致力于研究和开发具有这种活性的激素、低分子物质或生理活性蛋白质。
已用于骨疾病的治疗和缩短疗程的药品有降钙素制剂、活性维生素D3制剂、含有雌二醇的激素制剂、依普黄酮(ipriflavone)、维生素K2、双膦酸酯类化合物等。为了开发副作用更少、效果更好的治疗药，已开始了活性维生素D3衍生物、雌二醇衍生物、第2代或第3代双膦酸酯类化合物等的临床试验。
但用上述制剂治疗并不能获得满意的疗效，所以，人们期待更安全、更有效的新治疗药物。而且，在用于治疗骨代谢疾病的制剂中，有的因有副作用而限制了治疗的疾病范围。现在，治疗骨质疏松症等骨代谢疾病，主要是用同时使用多种药物的多剂并用疗法。从这个观点出发，人们希望能开发出与以往药品具有不同的作用机制、且效果更好、副作用更小的治疗药物。
如前所述，参与骨代谢的细胞是成骨细胞和破骨细胞。这些细胞紧密地互相作用，这种现象被称为偶联。有报道认为成骨细胞样基质细胞分泌的细胞因子(cytokine)、白介素1(IL-1)、3(IL-3)、6(IL-6)、11(IL-11)、成粒巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)等对破骨细胞的分化、成熟有促进或抑制作用(Raisz：Disorders of Bone and Mineral Metabolism，287-311，1992；Suda et al.：Princeples of Bone Biology，87-102，1996；Suda et al.：Endocrine Reviews，4，266-270，1995，Lacey et al.：Endocrinology，186，2369-2376，1995)。成骨细胞样基质细胞通过与未成熟破骨细胞的前体细胞及其破骨细胞的细胞间连接，分别对破骨细胞的分化、成熟和成熟破骨细胞的骨吸收等功能的表达起到重要作用。如果假设出现于成骨细胞样基质细胞膜上的破骨细胞分化诱导因子(osteoclastdifferentiation factor，ODF)(Suda et al.：Endocrine Rev.13，66-80，1992；Suda et al.：Bone 17，87s-91s，1995)为与细胞间连接而形成破骨细胞有关的因子，则在破骨细胞的前体细胞上存在ODF的受体。但是，目前ODF及其受体都未被精制或鉴定，还没有关于它们的性质、作用机制和结构的报道。所以，现在对破骨细胞分化、成熟的机制还不十分清楚，如果能够充分了解该机制，不仅对基础医学领域有极大的贡献，而且对以这种新的作用机制为基础，开发新型骨代谢异常症治疗药物也有很大贡献。
本发明者们对上述情况进行了认真探讨，结果发现在人胎儿肺成纤维细胞、IMR-90(ATCC CCL186)的培养液中存在破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)(WO96/26217号)。
进而，本发明者们成功地克隆了OCIF的DNA，并用动物细胞制备了基因重组型OCIF、还确认了基因重组型OCIF在体内的药效(改善骨代谢的效果)。人们期待OCIF是一种效果更好、副作用更小的防治骨代谢异常疾病的新型药物。
发明的揭示
本发明者们用破骨细胞形成抑制因子OCIF来探索其结合蛋白的存在，他们在活性维生素D3和甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)等骨吸收促进因子存在下培养的成骨细胞样基质细胞上发现了具有特异性的OCIF结合蛋白。而且，对该OCIF结合蛋白的性质和生理机能进行研究后发现，该蛋白质在未成熟破骨细胞的前体细胞发育成破骨细胞的分化、成熟过程中有支持或促进破骨细胞分化、成熟的因子的生物活性，这样就完成了本发明。此外，对本发明蛋白质的研究结果表明，在成骨细胞样基质细胞和脾细胞的共同培养系统中，该新型膜蛋白是一种在通过成骨细胞样基质细胞，使未成熟破骨细胞的前体细胞向破骨细胞分化、成熟过程中起了很大作用的蛋白质。通过对本发明的作为支持或促进破骨细胞分化、成熟的因子的蛋白质的鉴定和分离精制，能够筛选出利用了本发明蛋白质的以生物体骨代谢机制为基础的新型骨代谢异常症治疗药物。
因此，本发明的课题是提供与破骨细胞形成抑制因子OCIF结合的新型蛋白质(OCIF结合分子；OBM)及其制备方法。而且，本发明还提供了编码此蛋白质的DNA、由该DNA编码的氨基酸序列的蛋白质以及该蛋白质的基因工程制备方法。本发明进一步提供了含有该蛋白质的骨代谢异常症的预防/或治疗剂。本发明更进一步提供了用该蛋白质及其DNA以调节蛋白质表达的物质，抑制或改变该蛋白质生物活性的物质，或与该蛋白质结合，传递其作用的受体的筛选方法，以及利用该方法获得的物质和含有所得物质的医药组合物。最后，本发明还提供了该蛋白质的抗体及其制备方法、使用该方法的该蛋白质的测定方法以及含有抗体的医药品。
本发明的蛋白质有以下物理化学性质和生物活性：
即(a)亲和性：与破骨细胞形成抑制因子(osteclastogenesis inhibitory factor；OCIF)特异性结合，具有较高的亲和性(细胞膜上的解离系数、Kd值在10-9M以下)。
(b)分子量：用非还原型SDS-PAGE测得的分子量为30,000～40,000Da，与单一型OCIF偶联后的分子量约为90,000～110,000。
(c)生物活性：在活性维生素D3和甲状旁腺激素(PTH)等骨吸收促进因子存在下的小鼠成骨细胞样基质细胞和小鼠脾细胞的共同培养系统中，具有支持或促进破骨细胞分化和成熟的活性。
形成破骨细胞的具有代表性的体外培养系统有在活性维生素D3或PTH存在下的小鼠成骨细胞样基质细胞株、ST2和小鼠脾细胞的共同培养系统。对OCIF与在活性维生素D3存在下或不存在时分别培养的小鼠成骨细胞样基质细胞或小鼠脾细胞的结合性进行试验，可测定本发明蛋白质的表达细胞。本发明的蛋白质是在活性维生素D3或PTH等骨吸收促进因子存在下培养的成骨细胞样基质细胞上被特异性诱导的特定蛋白质。而且，由于在活性维生素D3存在下的上述共同培养系统中添加OCIF，能够在1～40ng/ml的用量范围内抑制破骨细胞的形成；在活性维生素D3存在下的ST2细胞上被诱导的本发明蛋白质表达的经时变化与破骨细胞形成的经时变化有关；而且，出现于ST2细胞的本发明蛋白质的多少和由ST2细胞对破骨细胞形成的影响的强弱一致；通过OCIF与ST2细胞上本发明蛋白质的结合可完全抑制破骨细胞形成，所以，能够确定本发明的蛋白质具有支持或促进破骨细胞分化、成熟的生物活性。
通过标记OCIF、测试该标记体与动物细胞膜表面的结合性，可对本发明蛋白质与OCIF的亲和性进行评估。用放射性同位素或荧光标记等常用蛋白质标记法可对OCIF进行标记。例如，用放射性同位素标记OCIF时可采用酪氨酸残基的125I标记等碘标记法、氯胺T法和酶法等标记法。被标记的OCIF与动物细胞膜表面的结合性试验可按照常用方法进行。而且，可在所用的结合性试验培养基中添加浓度为标记OCIF100倍～400倍的未标记的OCIF以测定非特异性结合量。从标记OCIF的总结合量减去非特异性结合量就可算出OCIF的特异性结合量。改变标记OCIF的添加量，可对表达于细胞膜上的本发明蛋白质的亲和性进行测试，通过Scatchardplot的解析可评估特异性结合量。这样求得的本发明蛋白质对OCIF的亲和力约为100～500pM，所以本发明蛋白质是一种对破骨细胞形成抑制因子OCIF具有较高亲和性(细胞膜上的解离系数、Kd值在10-9M以下)的特定蛋白质。采用凝胶过滤法和SDS-PAGE等可对OBM的分子量进行测定。为了更加精确地测定分子量，最好是用SDS-PAGE，在还原条件下测得OBM分子量约为40,000Da(40,000±4,000)。
由小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2，小鼠前脂肪细胞株P6，其他的人成骨细胞样细胞株或采自人体、小鼠、大鼠等哺乳动物并浓缩的成骨细胞样细胞可获得本发明蛋白质。而且，为了使上述细胞表达本发明蛋白质，还需要必要的诱导物质，如活性维生素D3(Calcitriol)、甲状旁腺激素(PTH)、白介素(IL)-1、IL-6、IL-11、制瘤素M及白细胞增殖抑制因子(LIF)等骨吸收促进因子。又，这些诱导物质的添加浓度如下：活性维生素D3和PTH为10-8M，IL-11和制瘤素M分别为10ng/ml和1ng/ml，IL-6为20ng/mlIL-6和500ng/mlIL-6的可溶性受体。较好是将小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2在添加了10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM中培养1周以上，用经过融合的细胞。然后用细胞铲等将经过培养的细胞剥离，回收。回收的细胞在使用前可保存在-80℃的温度下。
精制回收细胞的细胞膜部分就能有效地提纯本发明的蛋白质。膜部分的制备可采用常用的制备细胞内器官的方法。调制细胞膜部分所用的缓冲液最好添加各种蛋白酶抑制剂。所添加的蛋白酶抑制剂包括PMSF、EDTA、邻菲绕啉、亮肽素、胃蛋白酶抑制素A、抗蛋白酶酞、大豆胰蛋白酶抑制剂等丝氨酸蛋白酶抑制剂、硫蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等。细胞粉碎可使用Daunce均化机、多变均化机和超声波粉碎装置等。将经过粉碎的细胞悬浮于添加了0.5M蔗糖的缓冲液中，以600×g离心分离10分钟，将细胞核和未粉碎细胞作为沉淀部分分离出来。以150,000×g再次离心分离上次离心分离所得的上清液，获得作为沉淀的细胞膜部分。用各种表面活性剂对获得的细胞膜部分进行处理，可有效地溶出存在于细胞膜的本发明蛋白质，然后萃取。可采用常用于细胞膜蛋白质可溶化的各种表面活性剂，例如CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate)、Triton X-100、Nikkol、正辛基糖苷等。最好是添加0.5％CHAPS，于4℃搅拌2小时，然后用其溶出本发明蛋白质。以150,000×g、60分钟离心分离上述试样，能够获得可溶化细胞膜部分的上清液。
用固定化OCIF柱子、凝胶、树脂等，能够有效地从可溶细胞膜部份上清中提纯本发明蛋白质。被固定的OCIF是按照WO96/26217号记载的方法，从人体胎儿肺成纤维细胞株IMR-90的培养液中分离出来的，或是通过遗传工程的方法获得的(rOCIF)。按照常用方法将人体、大鼠或小鼠的cDNA重组入表达媒介物，可使rOCIF表达于CHO细胞、BHK细胞、Namalwa细胞等动物细胞或昆虫细胞中，并能够精制、获得rOCIF。所得OCIF的分子量约为60kDa(单体型)和120kDa(二聚体型)。用于固定的OCIF最好为二聚体型OCIF。为使OCIF固定化而使用的凝胶、树脂包括ECH琼脂糖4B、EAH琼脂糖4B、硫丙基琼脂糖6B、CNBr-活化琼脂糖4B、活性CH琼脂糖4B、环氧化活性琼脂糖6B、活性硫醇琼脂糖4B(以上由pharmacia公司生产)，TSK凝胶AF-环氧トヨパ-ル650、TSK凝胶AF-氨基トヨパ-ル650、TSK凝胶AF-甲酰トヨパ-ル650、TSK凝胶AF-羧基トヨパ-ル650、TSK凝胶AF-トレシルトヨパ-ル650(以上由东曹公司生产)，氨基-纤维素(细)、羧基-纤维素(细)、FMP活性纤维素(细)、甲酰纤维素(细)(以上由生化学工业公司生产)，アフィ凝胶10、アフィ凝胶15、アフィプレップ10(以上由BioRad公司生产)等。用于OCIF固定化的柱子包括Hi Trap NHS-活化柱(pharmacia公司)、TS凝胶Tresyl-5PW(东曹公司)等。使用Hi Trap NHS-活化柱(1ml，pharmacia公司)的OCIF固定化的具体方法列举如下，即将含有13.0mgOCIF的0.2MNaHCO3/0.5M NaCl(pH8.3)溶液1ml加入柱子中，于室温使其进行30分钟偶联反应。然后，依次加入0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH8.3)和0.1M乙酸/0.5M NaCl(pH4.0)，最后再次置换成0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH8.3)，于室温放置1小时，封闭过量的活性基团。接着，用0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH8.3)和0.1M乙酸/0.5M NaCl(pH4.0)洗涤2次，再用50mM Tris/1M NaCl/0.1％CHAPS缓冲液(pH7.5)置换，制得OCIF固定化柱。使用上述制得的OCIF固定化柱、OCIF固定化凝胶或树脂等，能够有效地精制本发明蛋白质。为了抑制本发明蛋白质的分解，还在用于精制的缓冲液中添加各种蛋白酶抑制剂。将上述可溶化膜部分装入OCIF固定化柱中，或与OCIF固定化凝胶、树脂等混合而吸附，再利用酸、各种蛋白质变性剂、二甲胂酸缓冲液等，可从OCIF固定化柱、凝胶或树脂中溶出本发明蛋白质。为将本发明蛋白质的变性控制在最小限度，最好是用酸使其溶出后，马上中和。用于溶出的酸性缓冲液包括0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)、0.1甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.0)及0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)等。
采用常用的生物试样蛋白质精制的方法，利用本发明蛋白质的物理化学性质，可对本发明蛋白质作进一步提纯。浓缩本发明蛋白质溶液可采用超滤、冻干及盐析等常用方法。最好是使用Centricon-10(BioRad公司生产)等的离心超滤装置。而且，对本发明蛋白质进行精制时，还可并用离子交换层析法、凝胶过滤法、疏水层析法、逆相层析法、制备电泳等通常用于蛋白质纯化的各种方法。更具体地讲，可通过并用Superose12柱(pharmacia公司)等的凝胶过滤法和逆相层析法，对本发明蛋白质进行纯化。又，在抗OCIF抗体的免疫沉降后，利用SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)可分析出精制过程中的本发明蛋白质与固定化OCIF的结合活性或与OCIF的结合物。
利用所得本发明蛋白质的活性，可使该蛋白质有效地作为骨代谢异常症，例如骨硬化病等的治疗剂或研究、诊断用试剂。
此外，本发明涉及编码与破骨细胞形成抑制因子OCIF结合的新型蛋白质(OCIF结合分子；OBM)的DNA、由该DNA编码的氨基酸序列的蛋白质以及在基因工程上制备与OCIF特异性结合的蛋白质的方法，以及含有该蛋白质的骨代谢治疗剂。本发明还涉及调节OBM表达的物质的筛选方法，与OBM结合、抑制或改变其作用的物质的筛选方法，与OBM结合、传递OBM作用的受体的筛选方法，以及含有经过上述筛选的物质的医药组合物。
本发明DNA编码的新型蛋白质OBM有以下物理化学性质和生理活性：
a.与破骨细胞形成抑制因子(OCIF)特异性结合；
b.利用还原条件下的SDS-PAGE进行分子量测定，其分子量约40,000Da(±4,000)，而且，使单体OCIF发生交联后的分子量约为90,000～110,000；
c.具有支持、促进破骨细胞分化和成熟的活性。
为鉴定本发明的OCIF结合分子、编码OBM的DNA，并对OBM的性质进行评估而使用的破骨细胞形成抑制因子(OCIF)可从WO/26217号记载的人体胎儿成纤维细胞株IMR-90的培养液中分离出来。OBM的DNA分离和鉴定也可采用重组基因型人OCIF、重组基因型小鼠OCIF、重组基因型大鼠OCIF等。按照常用方法，分别将上述重组基因型OCIF的DNA重组入表达媒介物，使这些重组基因型OCIF表达于CHO细胞、BHK细胞、Namalwa细胞等动物细胞或昆虫细胞等，并经精制就可获得。
分离编码目的蛋白质的cDNA(cDNA克隆)的方法除了通过决定蛋白质构成的氨基酸序列、并以与其相应的碱基序列为基础，由杂交法来分离出目的cDNA的方法之外，还有即使蛋白质氨基酸序列不明确，也能够在表达媒介物中构筑cDNA库、将它们导入细胞中，通过筛选法识别目的蛋白质是否被表达来分离目的cDNA的方法(表达克隆法)(D′Andrea et al.：Cell 57，277-285，1989；Fukunaga etal.：Cell 61，341-350，1990)。表达克隆法中，可根据目的产物的不同分别选用细菌、酵母和动物细胞等作为宿主细胞。本发明中，在克隆编码存在于动物细胞膜表面的蛋白质的cDNA时，大多使用动物细胞作为宿主。而且，通常使用的都是DNA导入效率高、被导入的DNA表达频率高的宿主。具有上述特征的细胞之一就是本发明使用的猴子的肾细胞COS-7细胞。由于COS-7细胞表达了SV40 largeT antigen，所以，具有SV40复制启动点的质粒作为多复制的游离体存在于细胞中，比一般情况的表达频率更高。又，由于在导入DNA后的数天内就达到最高表达水平，所以能够迅速地进行筛选。把可高表达的质粒整合到这种宿主细胞中，则可极高水平地表达遗传子。在质粒上，对遗传子表达量影响最大的因素是启动子。常用的高表达用启动子有SRα启动子和来自巨细胞病毒的启动子等。通过表达克隆对膜蛋白的cDNA进行筛选时所用的筛选方法包括结合法(binding法)、淘选法(panning法)和薄膜乳化法等。
本发明涉及用表达克隆法和结合法所得的OCIF特异性结合的蛋白质(OBM)的编码DNA和表达蛋白质、以及利用DNA或表达蛋白质的生理活性物质所进行的筛选。通过标记OCIF、对该标记物与动物细胞膜表面的结合性进行测试，可检测本发明的DNA编码的OBM。OCIF的标记法包括放射性同位素标记和荧光标记等，可采用常用的蛋白质标记法。例如，放射性同位素标记OCIF可采用酪氨酸残基的125I标记法，具体的标记方法有碘原法、氯胺T法和酶法等。可用常规方法进行标记OCIF与动物细胞膜表面的结合性试验。而且，在所用的结合性试验培养基中添加浓度为标记OCIF的100倍～400倍的未标记的OCIF，可对非特异性结合量进行测定。从标记OCIF的总结合量减去非特异性结合量就可算出OCIF的特异性结合量。
本发明者们基于与破骨细胞分化有关的因子能与OCIF相互作用的假设为了用基因重组型OCIF分离与OCIF结合的蛋白质，通过下述方法对由吸收成骨细胞样基质细胞株ST2的mRNA制得的表达文库进行了筛选。将以ST2m RNA为模板合成的DNA插入用于动物细胞表达的介质中，然后将它们导入猴子肾脏细胞COS-7细胞。以125I标记的OCIF为探针，筛选出表达于COS-7细胞的目的蛋白质。其结果是，在分离得到编码与OCIF特异性结合的蛋白质的DNA的同时，又确定了编码OCIF结合分子(OCIF结合分子；OBM)的DNA的碱基序列。另外，还发现被DNA编码的OBM在细胞膜上与OCIF紧密而特异性结合。
本发明所谓的在比较温和的条件下进行的DNA杂交是指例如按照常用方法，将DNA转移到尼龙薄膜上固定后，在杂交用缓冲液中，与经放射性同位素标记了的探针DNA在40～70℃，杂交2小时～1晚，然后以0.5×SSC(0.075M氯化钠和0.0075M柠檬酸钠)，于45℃洗涤10分钟。具体来讲就是按照常用方法，用ハイボンド N(sigma公司)尼龙薄膜，将DNA转移并固定其上后，在快速杂交缓冲液(sigma公司)中，与经32P标记的探针DNA在65℃下杂交2小时，然后以0.5×SSC(0.075M氯化钠和0.0075M柠檬酸钠)，于45℃洗涤10分钟。
众所周知，具有代表性的形成破骨细胞的体外培养体系是在活性维生素D3或PTH存在下的来源于小鼠的成骨细胞样基质细胞株ST2和小鼠脾脏细胞的共培养体系。本发明的OBM是被特异性诱导于活性维生素D3或PTH这样的骨吸收促进因子存在下培养的成骨细胞样基质细胞上的蛋白质。而且，由于在活性维生素D3或PTH这样的骨吸收促进因子存在下的脾脏细胞培养体系中添加本发明DNA编码的蛋白质而促进了破骨细胞的形成，所以，本发明DNA编码的OBM与破骨细胞的分化和成熟有关。
将本发明的DNA插入表达介质，制得OBM表达质粒，将其导入各种细胞或菌株使其表达，就能够制得重组型OBM。用于表达的哺乳动物细胞的宿主可有COS-7、CHO、Namalwa等或作为细菌宿主的大肠杆菌等。此时，使用全长DNA作为膜结合型蛋白质表达，或除去编码膜结合部位的部分，也可作为分泌型或可溶化型蛋白质来表达。这样制得的重组型OBM可通过常用蛋白精制法，如用OCIF固定化柱的亲和层析法、离子交换层析法或凝胶过滤法等可进行有效的精制。利用本发明蛋白质的活性，其用作骨代谢异常症，例如大理石病等的治疗剂等医药品或作为研究、试验用试剂是很有用的。
利用本发明DNA编码的蛋白质OBM，能够(1)筛选调节OBM表达的物质；(2)筛选与OBM特异结合，抑制或改变OBM生物活性的物质；以及(3)筛选存在于破骨细胞的前体细胞，传递OBM生物活性的蛋白质(OBM受体)。而且，能够对作用于该OBM受体的拮抗剂或激动剂进行开发。在用OBM或OBM受体所作的蛋白质-受体相互作用的研究中，研究、探索拮抗剂或激动剂所必需的OBM肽文库，可通过以下方法制得。其中之一是分离法(Lam et al.；Nature 354，82-84，1991)。该方法是在合成载体(空心颗粒)中再分别合成结合了各氨基酸(单位)的各单位。将所有合成载体混合，然后按照单位数等分，再分别使各单位结合。重复上述操作n次后，就制得在载体上结合了n个单位的文库。由于这样合成的一个载体群中只合成了1种序列，所以，能以使用本发明蛋白质的上述筛选法，选出显示阳性的载体群，如果确定了其氨基酸序列，就可对特异性结合的肽进行鉴定。此外，另一种方法是噬菌体显示法。该方法由于通过噬菌体能表达编码任意肽的合成基因，所以与上述合成文库相比，可有文库中分子数较多的优点，但厌噬菌体序列就不能够存在于文库中，所以具有分子多样性不够的缺点。噬菌体显示法同样也可以用本发明蛋白质的筛选体系，通过热处理使与蛋白质特异结合的噬菌体浓缩，再用大肠杆菌使该种具有特异结合性的噬菌体增幅，决定编码肽的碱基序列。而且，欲用前述(2)和(3)的筛选体系，从肽文库选出对OBM或OBM受体具有特异性和高亲和性的肽时，筛选时使OCIF和OBM共存，在提高它们各自浓度的同时，可选出显阳性的载体或噬菌体，这样就能够获得具有特异性，且具有极高亲和性的肽。例如，用已作为造血激素的促红细胞生成素(EPO)的受体，通过对来源于多个种类的肽文库的具有EPO样活性的低分子肽激动剂的筛选及其立体结构解析，并通过基于其立体结构的有机合成成功地创制了具有EPO活性的低分子物质(激动剂)(Nicholas et al.：Science，273，458-463，1996)。
此外，本发明者们已经发现使用破骨细胞形成抑制因子OCIF，能使其结合蛋白在活性维生素D3和甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)存在下培养的成骨细胞样基质细胞株ST2的细胞上特异性表达。而且，还发现该蛋白质与从未成熟的破骨细胞的前体细胞向破骨细胞的分化、成熟有关，就是所谓的具有作为支持或促进破骨细胞分化、成熟的因子的生物活性，通过精制该蛋白质能明确其物理化学性质及其生物活性。本发明者们为了明确通过本发明DNA表达的基因重组型蛋白质OBM和前述的与OCIF特异性结合的精制天然型蛋白质的异同，比较了它们物理化学性质和生物活性。其结果是，这两种蛋白质(1)都为膜结合蛋白，与OCIF特异性结合；(2)SDS-PAGE测得的分子量约为40,000 Da；(3)与单体型OCIF发生交联时的分子量约为90,000～110,000Da。由于它们的各种物理化学性质一致，而且都具有支持或促进破骨细胞分化和成熟的生物活性，所以提示这两种蛋白质可能是相同的。此外，用遗传工程学方法制备的，由本发明DNA表达的该精制蛋白质(基因重组型OBM)为抗原而制得的兔抗OBM多克隆抗体对用前述方法制得的精制天然型蛋白质具有交叉作用，不仅会抑制OBM和OCIF的特异性结合，同样还会抑制前述精制天然型蛋白质和OCIF的特异性结合。从上述结果可看出，由本发明DNA表达的基因重组型蛋白质OBM和前述与OCIF特异性结合的天然型蛋白质是相同的。
此外，为了分离出编码与OCIF特异性结合，与天然型或基因重组型小鼠OBM同样具有支持和促进来源于脾脏细胞的破骨细胞的分化、成熟的活性的来源于人体的OCIF结合蛋白质分子(以下称为人OBM)的基因(cDNA)，本发明者们使用前述由小鼠OBM cDNA制得的引物，以来源于人体淋巴结的cDNA为模板，进行聚合酶链反应(PCR)，以所得人OBM cDNA片断为库，筛选上述cDNA文探针。其结果是，成功地分离了编码与OCIF特异性结合的来源于人体的蛋白质的cDNA，并确定了编码来源于人体的OCIF结合蛋白分子，即人OBM的cDNA的碱基序列。由cDNA编码的人OBM与小鼠OBM相同，具有在细胞膜上与OCIF紧密，且特异性结合的特性，而且还具有支持、促进来源于小鼠脾脏细胞的破骨细胞的分化和成熟的生物活性。即，本发明的课题是提供编码与破骨细胞形成抑制因子OCIF结合的新型的来源于人体的蛋白质人OBM的DNA、具有DNA编码的氨基酸序列的蛋白质，使用该DNA、采用遗传工程学方法制备具有与OCIF特异性结合的性质、还具有支持、促进来源于小鼠脾脏细胞的破骨细胞分化、成熟的活性的蛋白质的方法，以及含有该蛋白质的骨代谢异常症治疗剂。此外，本发明还提供了筛选调节人OBM表达的物质的方法，筛选与人OBM结合、抑制或改变其作用的物质的方法，筛选与人OBM结合、传递其作用的受体的方法，以及含有利用上述筛选方法获得的物质的医药组合物。
本发明涉及编码具有与OCIF特异性结合的特性、且具有支持、促进破骨细胞分化和成熟的生物活性的新型人体蛋白质人OBM的DNA、具有DNA编码的氨基酸序列的蛋白质，使用该DNA、采用遗传工程学方法制备具有与OCIF特异性结合的性质、还具有支持、促进破骨细胞分化、成熟的活性的蛋白质的方法，以及含有该蛋白质的骨代谢异常症治疗剂。此外，本发明还提供了筛选调节人OBM表达的物质的方法，筛选与人OBM结合、抑制或改变其作用的物质的方法，筛选与人OBM结合、传递其作用的受体的方法，以及含有利用上述筛选方法获得的物质的医药组合物，还有来源于人体的OCIF结合蛋白的抗体以及使用了该抗体的骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。
由本发明DNA编码的新型的来源于人体的OCIF结合蛋白分子，即人OBM显现出以下物理化学性质和生物活性。
即，a.与破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)(WO96/26217号)特异性结合；
b.还原条件下的SDS-PAGE测得的分子量约为40,000(±5,000)，与单体型OCIF交联时的分子量约为90,000～110,000；
c.具有支持、促进破骨细胞分化和成熟的生物活性。
按照前述方法，能够从小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2的cDNA文库分离出为分离鉴定编码本发明的人OBM的cDNA而作为探针使用的来源于小鼠的OCIF结合蛋白小鼠OBMcDNA。另外，为评估由表达人OBM cDNA而获得的蛋白质的特性和生物活性所必须的人体破骨细胞形成抑制因子OCIF可按照WO96/26217号记载的方法从人体成纤维细胞株IMR-90的培养液中分离获得，或用DNA由遗传工程学方法制得。评估人OBM的特性和生物活性时，可使用基因重组型人OCIF、基因重组型小鼠OCIF、基因重组型大鼠OCIF等。按照常用方法将各自的cDNA插入表达介质，使这些基因重组型OCIF被表达于CHO细胞、BHK细胞、Namalwa细胞等动物细胞或昆虫细胞等，然后精制得到。
分离编码目的蛋白质的人cDNA(cDNA克隆)的方法包括以下4种，(1)精制蛋白质，确定部分氨基酸序列，将具有对应于这些氨基酸序列的碱基序列的DNA作为探针使用，利用杂交法分离目的cDNA的方法；(2)即使不明确目的蛋白质的氨基酸序列，只要在表达介质中构筑cDNA文库，将它们导入细胞中，观察是否有目的蛋白质的表达，也可分离出目的cDNA(表达克隆法)；以及(3)假设想要克隆的人源型目的蛋白质的cDNA与非人源型的哺乳类动物的蛋白质(该蛋白质与人源型目的蛋白有相同的特性和生物活性)的编码遗传子cDNA有高度的同一性，则可用编码动物蛋白的cDNA为探针，用杂交法或聚合酶链反应(PCR)法从人体细胞或组织中构筑的cDNA文库中，分离人源型目的蛋白的编码cDNA。
假设人OBM cDNA与前述小鼠OBM cDNA具有较高的相同性，则以后一cDNA为探针，通过北方杂交法可调查产生人OBM的细胞或组织。使用由小鼠OBM cDNA制得的小鼠OBM引物，以经过上述鉴定的产生人OBM的组织，例如由人体淋巴结等获得的cDNA为模板，经PCR，获得人OBM cDNA片断，然后以该人OBM cDNA片断为探针，筛选经过上述鉴定的产生人OBM的细胞或组织的cDNA文库，可获得人OBMcDNA。本发明涉及上述所得具有与OCIF特异性结合的性质，还具有支持、促进破骨细胞分化和成熟的生物活性的来源于人体的蛋白质、即人OBM的编码DNA。由于本发明的DNA编码膜区域的膜结合型蛋白质，所以标记OCIF，通过标记OCIF和表达本发明的cDNA的动物细胞表面的结合可检出本发明DNA表达的人OBM。作为OCIF标记法可使用放射性同位素标记和荧光标记等常用蛋白质标记法。
本发明的人OBM cDNA表达的蛋白质分子量可用凝胶过滤法和SDS-PAGE等测得。为了更精确地测定分子量，较好是使用SDS-PAGE，还原条件下，人OBM特定为分子量约40,000Da(40,000±5,000)的蛋白质。
本发明所谓的在比较温和的条件下进行的DNA杂交是指例如按照常用方法，将DNA转移到尼龙薄膜上固定后，在杂交用缓冲液中，加入经放射标记的探针DNA在40～70℃，杂交2小时～1晚，然后以0.5×SSC(0.075M氯化钠和0.0075M柠檬酸钠)，于45℃洗涤10分钟。具体来讲就是按照常用方法，使用ハイボンド(sigma公司)作为尼龙薄膜，将DNA转移并固定后，在快速杂交缓冲液(sigma公司)中，用32P标记的探针DNA在65℃下杂交2小时，然后以0.5×SSC，于45℃洗涤10分钟。
众所周知，具有代表性的形成破骨细胞的体外培养体系为在活性维生素D3或PTH存在下的来源于小鼠的成骨细胞样基质细胞株ST2和小鼠脾脏细胞的共培养体系。在体外共培养体系中形成破骨细胞时，成骨细胞样基质细胞株和脾脏细胞间的粘合，以及活性维生素D3或PTH等骨吸收促进因子的存在是必须的。如果体外共培养体系中没有骨吸收促进因子存在，而且在没有破骨细胞形成支持能的猴子肾脏细胞株COS细胞上，表达本发明cDNA的基因重组COS细胞株能够与成骨细胞样基质细胞株ST2一样从脾脏细胞获得破骨细胞形成支持能。此外，由于本发明的cDNA编码了膜结合型蛋白质，所以除去编码膜部位的部分也能够作为分泌型和可溶型蛋白来表达。在骨吸收促进因子不存在的上述体外培养体系中只添加分泌型人OBM也可引起破骨细胞形成。从上述结果可看出，本发明的cDNA编码的人OBM是与破骨细胞的分化和成熟有关的因子。
将本发明的cDNA插入表达介质，制得人OBM表达质粒，将其导入各种细胞或菌株使其表达，就能够制得重组型人OBM。表达时的哺乳动物细胞的宿主可使用COS-7、CHO、Namalwa等或作为细菌宿主的大肠杆菌等。此时，使用全长DNA作为膜结合型蛋白质使其表达，或除去编码膜结合部位的部分，作为分泌型或可溶化型表达。这样制得的重组型人OBM可通过常用蛋白精制法，如用OCIF固定化柱的亲和层析法、离子交换法或凝胶过滤法等进行精制。利用本发明的人OBM活性，作为骨代谢异常症，例如大理石病等的治疗剂等医药品或研究、试验用试剂很有用。
利用本发明cDNA编码的蛋白质、人OBM，能够(1)筛选出调节人OBM表达的物质；(2)筛选出与人OBM特异性结合，抑制或改变OBM生物活性的物质；以及(3)筛选出存在于破骨细胞的前体细胞，传递人OBM生物活性的蛋白质(人OBM受体)。而且，能够对利用了该人OBM受体的拮抗剂或激动剂进行开发。在用人OBM或OBM受体所作的蛋白质一受体相互作用的研究中，研究探索拮抗剂或激动剂所必须的人OBM肽文库可用与小鼠OBM的筛选法相同的方法制得。用人OBM代替小鼠OBM，对肽文库进行同样的筛选，能够获得具有特异性，且具有极高亲和性的肽。
此外，如前所述，OBM为很有用的蛋白质，但对该蛋白质进行测定时，必须制备能够特异性识别OBM的抗体和用该抗体的酶免疫测定法。但是，到目前为止还没有发现对OBM测定有用的抗体。而且，假设中和OBM或sOBM的生物活性的抗OBM/sOBM抗体对OBM或sOBM具有抑制作用，即抑制促进破骨细胞形成的作用，则这种抗体可作为骨代谢异常症的治疗剂进行开发。但目前还没有获得这样的抗体。
本发明者们对上述情况进行了认真研究的结果是，发现了能够识别与破骨细胞形成抑制因子(OCIF)特异性结合的膜结合蛋白质(OCIF结合分子；OBM)和膜结合部位缺损的可溶性OBM(sOBM)这两种抗原的抗体(抗OBM/sOBM抗体)。因此，本发明的课题是提供识别与破骨细胞形成抑制因子OCIF特异性结合的膜结合蛋白质和膜结合部位缺损的可溶性OBM(sOBM)这两种抗原的抗体(抗OBM/sOBM抗体)及其制备方法，使用了该抗体的OBM和sOBM的测定方法，以及以该抗体为有效成分的骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。
本发明涉及识别与破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor；OCIF)特异性结合的膜结合蛋白质(OCIF binding molecule；OBM)和膜结合部位缺损的可溶性OBM(sOBM)这两种抗原的抗体(抗OBM/sOBM抗体)及其制备方法、使用了该抗体的OBM和sOBM的测定方法，以及以该抗体为有效成分的医药品，特别是骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。
本发明的抗体具有中和作为OBM和sOBM的生物活性的破骨细胞形成促进活性的作用，由具备以下性质的抗体构成。
即，由a.识别小鼠OBM和小鼠sOBM这两种抗原的多克隆抗体(抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体)
b.识别人OBM和人sOBM这两种抗原的多克隆抗体(抗人OBM/sOBM多克隆抗体)
c.识别小鼠OBM和小鼠sOBM这两种抗原的单克隆抗体(抗小鼠OBM/sOBM单克隆抗体)
d.识别人OBM和人sOBM这两种抗原的单克隆抗体(抗人OBM/sOBM单克隆抗体)
e.对小鼠OBM和小鼠sOBM这两种抗原具有交叉作用的抗人OBM/sOBM单克隆抗体。
识别小鼠OBM和小鼠sOBM这两种抗原的多克隆抗体(以下称为抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体)以及识别人OBM和人sOBM这两种抗原的多克隆抗体(以下称为抗人OBM/sOBM多克隆抗体)可通过以下方法获得。作为免疫用抗原的精制小鼠OBM可利用前述方法获得。即，用活性维生素D3处理小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2，用OCIF固定化柱亲和层析法和凝胶过滤法精制细胞膜上的OBM，获得天然型小鼠OBM(nativeOBM)。此外，按照常用方法将前述小鼠OBMcDNA(序列表序列号15)或人OBM cDNA(序列表序列号12)插入表达介质中，使其表达于CHO细胞、BHK细胞、Namalwa、COS-7细胞等动物细胞和昆虫细胞或大肠杆菌，用与上述同样的方法进行精制，能够获得基因重组型小鼠OBM(序列表序列号1)或人OBM(序列表序列号11)，也可将其作为免疫用抗原使用。此时，对作为膜结合蛋白的小鼠OBM或人OBM进行大量且高度精制需要花费很大精力。另一方面，如前所述，作为膜结合型蛋白质的OBM与作为使膜结合部位缺损而获得的可溶化蛋白质的可溶性OBM(sOBM)在促进破骨细胞分化和成熟的活性上没有差异。由于小鼠sOBM和人sOBM的表达和高度精制比较容易，所以，这些可溶化蛋白质sOBM也可作为免疫用抗原。在小鼠sOBMcDNA(序列表序列号18)或人sOBMcDNA(序列表序列号19)的5′位上侧附加编码来源于其他分泌蛋白质的已知信号序列的碱基序列，通过与上述同样的遗传工程学方法将其插入表达介质中，以各种动物细胞、昆虫细胞或大肠杆菌等为宿主进行表达，然后精制就可获得小鼠sOBM(序列表序列号16)及人sOBM(序列表序列号17)。将上述所得免疫用抗原溶于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，根据需要混合等体积的福氏完全佐剂，并乳化后，经皮下给动物进行注射，时间间隔约为1周，进行数次免疫。测定抗体效价，当该值达到最高时加强免疫一次。10天后采集全血。所得抗血清用硫酸铵进行盐析沉淀，用阴离子交换层析法对球蛋白部分进行精制，或用结合缓冲液(Biorad公司)使抗血清稀释2倍，再用蛋白质A或蛋白质G琼脂糖柱层析法对经过稀释的抗血清进行精制，这样就能够获得抗小鼠或抗人OBM/sOBM多克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可通过以下方法制得。即，作为制备单克隆抗体所必须的免疫用抗原与制备多克隆抗体时的相同，可使用天然型小鼠OBM(nativeOBM)、基因重组型小鼠或人OBM、基因重组型小鼠或人sOBM。分别利用这些抗原使哺乳动物免疫，或使通过体外法免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞(骨髓瘤细胞)等融合，按照常用方法制得融合细胞。该融合细胞培养液用经过高度精制的各种抗原，经ELISA筛选能分泌识别这些抗原的抗体的融合细胞。克隆筛选得到的融合细胞，分别培养有抗体产生的稳定的融合细胞，就能够获得目的抗体。如果制备融合细胞时使用哺乳动物，则可使用小鼠和大鼠等小动物。免疫一般采用的是用适当的溶剂，如生理盐水等将抗原稀释到适当浓度，然后将该溶液注入静脉或腹腔，根据需要还可并用福氏完全佐剂，注射时间是每1～2周3～4次。在最终免疫后的第3天解剖上述经过免疫的动物，将从摘取的脾脏中获得的脾脏细胞作为免疫细胞使用。作为与免疫细胞进行细胞融合的来源于小鼠的骨髓瘤细胞包括p3/x63-Ag8、p3-U1、NS-1、MPC-1、SP-2/0、F0、P3x63Ag8.653及S194等。此外，作为来源于大鼠的细胞包括R-210等细胞株。制备人源型抗体时，对人体B淋巴细胞进行体外免疫，使人体骨髓瘤细胞和由EB病毒进行过性状转化的细胞株进行细胞融合，就可产生人源型抗体。融合经免疫的细胞和骨髓瘤细胞一般可用众所周知的方法，如Koehler和Milstein等的方法(Koehler et al.：Nature 256，495-497，1975)，但也可用电脉冲法。免疫淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照通常的细胞数比例混合，在常用的不含胎牛血清(FCS)的细胞培养用培养基中加入聚乙二醇进行融合处理，在添加了HAT的FCS的培养基中进行培养，选择融合细胞(融合细胞)。然后，通过ELISA、蚀斑法、浊度法和凝集法等常用抗体检出方法对产生抗体的融合细胞进行选择，确立稳定的融合细胞。上述融合细胞可通过常用的培养方法进行继代培养，根据需要可冷冻保存。用常用方法对融合细胞进行培养，将其转移到培养液中或哺乳动物的腹腔内，能够从腹水中回收抗体。培养液或腹水中的抗体可通过盐析法、离子交换和凝胶过滤法、蛋白质A或蛋白质G柱层析法等常用方法进行精制。以sOBM为抗原，通过上述方法获得的几乎所有的单克隆抗体是不仅能够特异性识别sOBM，还能够识别OBM的抗体(称为抗OBM/sOBM单克隆抗体)。这些抗体可用于OBM和sOBM的测定。用放射性同位素或酶对这些抗体进行标记，然后用于放射免疫测定(RIA)或酶免疫测定(EIA)等测定系统中，就能够定量测定OBM和sOBM。用这些测定系统，能够容易、且高精度地对血液和尿等生物试样中的sOBM量进行测定。而且，通过使用这些抗体，用结合测定法等能够容易、且高精度地测定与组织和细胞表面结合的OBM量。
该抗体用作为患者治疗药时，应考虑其抗原性，最好是制备人源型抗人OBM/sOBM抗体(来作来治疗剂)。按照下述方法能够制得人抗人OBM/sOBM抗体。即(1)在体外IL-4存在下，从脾脏中取出人淋巴细胞，用作为抗原的人OBM或人sOBM使其致敏，使致敏淋巴细胞与小鼠和人体的杂交融合细胞K6H6/B5(ATCC CRL1823)细胞融合，筛选出产生目的抗体的融合细胞。所得产生抗体的融合细胞所产生的抗体为人抗人OBM/sOBM单克隆抗体。从这些抗体中选出具有中和人OBM/sOBM活性的抗体。但是，上述在体外使淋巴细胞致敏的方法一般难以获得对抗原具有高度亲和性的抗体。所以，为了获得对人OBM或sOBM具有高亲和性的单克隆抗体必须使上述获得的低亲和性人抗人OBM/sOBM单克隆抗体高亲和化。为此，可使上述获得的作为中和抗体的低亲和性人抗人OBM/sOBM单克隆抗体的CDR区域(特别是CDR-3)发生随机变异，并使其表达于噬菌体，在固定了人OBM/sOBM的(酶标)板上通过噬菌体显现法，可选出与作为抗原的人OBM/sOBM高度结合的噬菌体，再使该噬菌体在大肠杆菌中增殖，从其碱基序列可决定具有高亲和性的CDR氨基酸序列。将编码上述获得的人抗人OBM/sOBM单克隆抗体的基因插入常用的哺乳动物用表达介质中，使其表达，就可获得人抗人OBM/sOBM单克隆抗体。这样就可从其中选出作为目的产物的具有中和人OBM/sOBM的生物活性的作用，且具有高亲和性的人抗人OBM/sOBM单克隆抗体。此外，(2)使用Balb/c系小鼠，按照与本发明同样的常规方法(Koehler et al.：Nature 256，495-497，1975)制得小鼠抗人OBM/sOBM单克隆抗体，选出具有中和人OBM/sOBM的生物活性的作用，且具有高亲和性的单克隆抗体。通过将该高亲和性小鼠抗人OBM/sOBM单克隆抗体的CDR区域(CDR-1、2和3)移植到人IgG的CDR区域的CDR-移植法(Winter and Milstein：Nature 349，293-299，1991)，能够转变为人源型。除此之外还有(3)将人体外周血液中的淋巴细胞移植到患有重度免疫缺陷综合症(Severe combined immunedeficiency(SCID))的小鼠中，由于被移植的SCID小鼠产生了人源型抗体(Mosier D.E.et al.：Nature 335，256-259，1988；Duchosal M.A.et al.：Nature 355，258-262，1992)，所以，可用人OBM或sOBM作为抗原致敏SCID小鼠，对其进行筛选，就能够从小鼠中筛选出可分泌对人OBM/sOBM具有特异性的人源型单克隆抗体的淋巴细胞。与前述人体型抗体制备方法相同，使所得淋巴细胞与作为小鼠和人体的杂交融合细胞的K6H6/B5(ATCC CRL1823)细胞融合，筛选所得融合细胞，获得产生作为目的产物的人源型单克隆抗体的融合细胞。培养该融合细胞，大量制备作为目的产物的人体型单克隆抗体，与上述方法同样进行精制就可获得精制品。另外，可从产生目的产物的人体型单克隆抗体的融合细胞构筑cDNA文库，克隆编码目的产物的人体型单克隆抗体的基因(cDNA)，利用遗传工程学方法将基因插入适当的表达介质中，以各种动物细胞、昆虫细胞或大肠杆菌等为宿主进行表达，就能够大量制备基因重组型人单克隆抗体。按照与上述同样的方法，从所得培养液进行精制，就能够大量获得经过精制的人单克隆抗体。
此外，从利用上述方法制得的抗OBM/sOBM单克隆抗体中，能够获得可中和OBM/sOBM的生物活性的抗体。由于中和OBM/sOBM的生物活性的抗体可抑制生物体内的OBM/sOBM的生物作用，即抑制促进破骨细胞形成作用，所以可望作为医药品，特别是可作为骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。测定体外破骨细胞形成体系中的破骨细胞形成抑制活性就可测定抗OBM/sOBM抗体的中和OBM或sOBM的生物活性的作用。体外测定体系有以下3种方法。即，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)的体外培养体系包括(1)活性维生素D3和地塞米松存在下的小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2细胞和小鼠脾脏细胞的共培养系；(2)使OBM表达于猴子的肾脏细胞株COS-7细胞，通过甲醛固定化，在M-CSF存在下，在上述细胞上培养小鼠脾脏细胞的共培养系；(3)基因重组sOBM和M-CSF存在下培养小鼠脾脏细胞的体系等。在这些培养系中加入各种浓度的抗OBM/sOBM抗体，检测其对破骨细胞形成的影响，这样就能够测定抗OBM/sOBM抗体对破骨细胞形成的抑制活性。此外，通过利用体内实验动物的骨吸收抑制活性，也可评估抗OBM/sOBM抗体对破骨细胞形成的抑制活性。即，破骨细胞形成亢进的动物模型是摘除了卵巢的模型。使这种实验动物服用抗OBM/sOBM抗体，通过测定其骨吸收抑制活性(骨密度的增强活性)，可测定抗OBM/sOBM抗体对破骨细胞形成的抑制活性。
上述所得的可中和OBM/sOBM的生物活性的抗体可用作为药品，特别是用作为骨代谢异常症的预防/治疗的复合药物，也可用作为诊断这类疾病的免疫学诊断试剂。本发明的抗体可制剂化后经口或非经口给药。含有本发明抗体的制剂作为以能够识别OBM及/或sOBM的抗体为有效成分的医药组合物被人或动物使用时安全性良好。医药组合物有包括静脉输注在内的注射剂、栓剂、经鼻给药剂、舌下给药制剂、经皮吸收剂等。由于单克隆抗体为高分子蛋白质，所以，不仅会吸附在管形瓶等玻璃容器和注射针筒上，而且不稳定，各种物理化学因子，如热、pH和湿度等都容易使其失活。因此，为了获得稳定的制剂，可添加稳定剂、pH调整剂、缓冲液、溶剂和表面活性剂等。稳定剂包括甘氨酸、氨基丙酸等氨基酸，葡聚糖40和甘露糖等糖类，山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等糖醇类。也可2种以上并用。这些稳定剂的添加量一般是抗体重量0.01～100倍，最好是0.1～10倍。通过添加这些稳定剂，能够提高液体制剂或冻干制剂的稳定性。缓冲液包括磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。缓冲液能够调整液体制剂或冻干制剂再溶解后的水溶液的pH值，而且有利于抗体的稳定性和溶解性。缓冲液的添加量，例如对应于液体制剂或冻干制剂再溶解后的溶液量，最好为1～10mM。表面活性剂最好为吐温20、普路罗尼克F-68、聚乙二醇等，特别好的是吐温80，也可2种以上并用。通过添加表面活性剂，能够防止再溶解后的液体制剂或冻干制剂中的抗体对容器的吸附。表面活性剂的添加量对应于液体制剂或冻干制剂再溶解后的溶液量，最好为0.001～1.0％。添加上述稳定剂、缓冲液或防吸附剂能够制得本发明的抗体制剂，特别是作为医疗用或动物药用注射剂使用时，渗透压为1～2较好。制剂化时随着氯化钠的增减可调整渗透压比。制剂中的抗体含量可根据适用疾病、适用给药途径等进行适当调整，对应于人的人源型抗体的给药量依赖于抗体对人OBM/sOBM的亲和性，即对人OBM/sOBM的解离常数(Kd值)，亲和性越高(Kd值越低)，少量给药，就能够发挥药效。此外，由于人体型抗体在人血液中的半衰期约为20天，所以，如果用于人时，以0.1～100mg/kg的量每隔1～30天给药1次以上为佳。
对附图的简单说明
图1表示本发明实施例3的小鼠OBM蛋白质的SDS-PAGE结果。
[对符号的说明]
(A)：1：标准分子量
     2：从活性维生素D3和地塞米松存在下培养的ST2细胞中精制的部分标准品(Gly-HCl(pH2.0)溶出组分)
         3：从活性维生素D3和地塞米松不存在时培养的ST2细胞中精制的部分标准品(Gly-HCl(pH2.0)溶出组分)
(B)：1：标准分子量
     2：用逆相高速液相层析法精制而得的本发明的小鼠OBM蛋白质(实施例3)
图2表示实施例4的125I标记OCIF与成骨细胞样基质细胞ST2的结合试验结果。
图3表示实施例5-(1)的继代数不同的成骨细胞样基质细胞ST2的破骨细胞形成支持能。
[对符号的说明]
1：继代数约为10的ST2细胞的破骨细胞形成支持能
2：继代数约为40的ST2细胞的破骨细胞形成支持能
图4表示实施例5(2)的活性维生素D3和地塞米松存在下进行培养时，成骨细胞样细胞膜上的本发明蛋白质表达的经时变化。
图5表示实施例5(2)的共培养系中的破骨细胞形成的经时变化。
图6表示实施例5(3)的共培养期间，只有用OCIF处理过的培养期间的破骨细胞形成抑制效果。
图7表示实施例6的125I标记OCIF与本发明蛋白质的交联试验结果。
[对符号的说明]
1：125I标记OCIF-CDD1
2：125I标记OCIF-CDD1与ST2细胞进行交联
3：添加了400倍浓度的未标记OCIF后的交联
图8表示实施例9的SDS-PAGE结果。
[对符号的说明]
1：导入了pOBM291的COS-7细胞的蛋白质在没有添加OCIF的情况下的免疫沉淀
2：导入了pOBM291的COS-7细胞的蛋白质在添加了OCIF的情况下的免疫沉淀
图9表示实施例10中125I标记OCIF与导入了pOBM291的COS-7细胞结合的试验结果。
[对符号的说明]
1和2：125I标记OCIF与导入了pOBM291的COS-7细胞的结合量
3和4：125I标记OCIF与导入了pOBM291的COS-7细胞的结合量(添加了400倍浓度的未标记OCIF)
图10表示实施例11中使用了125I标记OCIF的交联试验结果。
[对符号的说明]
1：125I标记OCIF
2：125I标记OCIF与导入了pOBM291的COS-7细胞的交联
3：在400倍浓度的未标记OCIF存在下，125I标记OCIF与导入了pOBM291的COS-7细胞的交联
图11表示实施例12的北方印染法的结果。
[对符号的说明]
1：没有添加维生素D和地塞米松时培养的来源于ST2细胞的RNA
2：添加了维生素D和地塞米松时培养的来源于ST2细胞的RNA
图12表示实施例13-(2)中改变了OCIF浓度后经过培养的上清液中的蛋白质的OCIF结合能。
[对符号的说明]
○：pCEP4
●pCEP4sOBM
图13表示实施例13-(2)中改变了培养上清液的比例后，培养上清液中蛋白质的OCIF结合能。
[对符号的说明]
○：pCEP4
●pCEP4sOBM
图14表示实施例14-(2)中表达于大肠杆菌的硫氧还蛋白和小鼠OBM的融合蛋白质的SDS-PAGE的结果。
[对符号的说明]
1：标准分子量
2：来源于GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质部分
3：来源于GI724/pTrxOBM25的可溶性蛋白质部分
图15表示实施例14-(3)中改变可溶性蛋白质部分的比例后的OCIF结合能。
[对符号的说明]
□：GI724/pTrxFus
○：GI724/pTrxOBM25
图16表示实施例14-(3)中OCIF浓度改变后的可溶性蛋白部分(1％)的OCIF结合能。
[对符号的说明]
□：GI724/pTrxFus
○：GI724/pTrxOBM25
图17表示通过本发明小鼠OBM cDNA表达、并精制的小鼠OBM蛋白质，以及天然型精制OCIF结合蛋白质和能特异性结合OCIF的兔抗小鼠OBM抗体的抑制结果。
[对符号的说明]
1：经过抗体处理的由cDNA表达、经精制而获得的蛋白质OBM+125I-OCIF
2：经过抗体处理的天然型蛋白质+125I-OCIF
3：未用抗体处理过的由cDNA表达、经精制而获得的蛋白质小鼠OBM+125I-OCIF
4：未用抗体处理过的天然型蛋白质+125I-OCIF
5：3+非标记OCIF(125I-OCIF的400倍量)
6：4+非标记OCIF(125I-OCIF的400倍量)
图18表示由本发明cDNA表达的蛋白质人OBM的SDS-PAGE结果。
[对符号的说明]
1：标准分子量
2：导入了包含本发明的cDNA的表达介质phOBM的COS-7细胞的蛋白质在没有添加OCIF的情况下通过兔抗OCIF多克隆抗体进行的免疫沉淀
3：导入了包含本发明的cDNA的表达介质phOBM的COS-7细胞后所表达的蛋白质在添加了OCIF的情况下通过兔抗OCIF多克隆抗体进行的免疫沉淀
图19表示导入了包含本发明的cDNA的表达介质phOBM的COS-7细胞与OCIF的结合试验结果。
[对符号的说明]
1：导入了phOBM的COS-7细胞中添加了125I-OCIF
2：导入了phOBM的COS-7细胞中添加了125I-OCIF，还添加了400倍量的非标记OCIF
图20表示由本发明cDNA编码的蛋白质人OBM和125I-OCIF(单体型)的交联试验结果。
[对符号的说明]
1：125I-OCIF
2：125I-OCIF和导入了phOBM的COS-7细胞上的蛋白质进行交联
3：在400倍浓度的非标记OCIF存在下进行的125I-OCIF和导入了phOBM的COS-7细胞上的蛋白质的交联
图21表示实施例23-(2)中，改变了OCIF浓度后培养上清液中的蛋白质与OCIF的结合能。
[对符号的说明]
○：导入只有不含编码分泌型人OBM cDNA介质pCEP4的293-EBNA细胞的培养液
●：导入含编码分泌型人OBM cDNA的介质pCEP4的293-EBNA细胞的培养液
图22表示实施例23-(2)中，固定OCIF浓度，改变所添加的培养液量后培养上清液中的蛋白质(分泌型人OBM)和OCIF的结合能。
[对符号的说明]
○：导入只有不含编码分泌型人OBM cDNA的介质pCEP4的293-EBNA细胞的培养液
●：导入含编码分泌型人OBM cDNA的介质pCEP4的293-EBNA细胞的培养液
图23表示表达于大肠杆菌的硫氧还蛋白和人OBM的融合蛋白质的SDS-PAGE的结果。
[对符号的说明]
1：标准分子量
2：来源于大肠杆菌GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质部分
3：来源于大肠杆菌GI724/pTrxOBM的可溶性蛋白质部分
图24表示实施例24-(3)中，改变含有硫氧还蛋白和人OBM的融合蛋白质的来源于大肠杆菌的可溶性蛋白质部分的添加比例时的融合蛋白质和OCIF的结合能。
[对符号的说明]
○：来源于大肠杆菌GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质部分
●：来源于大肠杆菌GI724/pTrxOBM的可溶性蛋白质部分
图25表示实施例24-(3)中，改变OCIF浓度时，来源于大肠杆菌的可溶性蛋白质部分中的硫氧还蛋白和人OBM的融合蛋白质与OCIF的结合能。
[对符号的说明]
○：来源于大肠杆菌GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质部分
●：来源于大肠杆菌GI724/pTrxOBM的可溶性蛋白质部分
图26表示通过使用了本发明的兔抗人OBM/sOBM多克隆抗体的组合ELISA对人OBM和sOBM的测定结果。
[对符号的说明]
□：人OBM
■：人sOBM
图27表示通过使用了本发明的兔抗人OBM/sOBM单克隆抗体的组合ELISA对人OBM和sOBM的测定结果。
[对符号的说明]
□：人OBM
■：人sOBM
图28表示通过使用了对本发明的小鼠OBM和sOBM具有交叉作用的抗OBM/sOBM单克隆抗体的双抗体夹心ELISA法对小鼠OBM和sOBM的测定结果。
[对符号的说明]
□：小鼠OBM
■：小鼠sOBM
图29表示硫氧还蛋白和小鼠OBM的融合蛋白对人体破骨细胞株细胞形成的促进活性。
图30表示抗OBM/sOBM抗体对通过维生素D3的刺激而产生的骨吸收活性的抑制。
图31表示抗OBM/sOBM抗体对通过前列腺素E2(PGE2)的刺激而产生的骨吸收活性的抑制。
图32表示抗OBM/sOBM抗体对通过甲状旁腺(PTH)的刺激而产生的骨吸收活性的抑制。
图33表示抗OBM/sOBM抗体对通过白介素1α(IL-1)的刺激而产生的骨吸收活性的抑制。
实施发明的最佳状态
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，这些仅是单例，本发明并不仅限于这些例子中。
实施例1
本发明蛋白质的制备
(1)ST2细胞的大量培养
在含有10％胎牛血清的α-MEM培养基中培养小鼠成骨细胞样基质细胞ST2(RIKEN CELL BANK，RCB0224)，通过附着细胞用225cm2T型瓶中，用胰蛋白酶对培养至融合状态的ST2细胞进行处理，然后从T型瓶中剥离，洗净，接着转移到5个225cm2T型瓶中，分别在其中加入60ml添加了10-8M活性维生素D3(Calcitriol)、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基，在CO2恒温箱中培养7～10天。最后用细胞铲回收经过培养的ST2细胞，在使用前一直保存在-80℃的温度下。
(2)膜部分的调制和膜结合蛋白的可溶化
在使用80个225cm2T型瓶中培养而得的实施例1-(1)所述ST2细胞(容量约为12ml)中添加3倍容量(约36ml)的含有蛋白酶抑制剂(2mM APMSFP、2mMEDTA、2mM o-菲咯啉、1mM亮肽素、1μg/ml胃酶抑素A和100单位/ml抑肽素)的10mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.2)。然后用螺旋搅拌机剧烈搅拌细胞，历时30秒钟，在冰水中放置10分钟。接着用均化机(DOUNCE TISSUE GRINDER，Asyrindge，WHEATON SCIENTIFIC公司制)粉碎细胞。在该细胞粉碎液中，加入等量(48ml)的添加了蛋白酶抑制剂、0.5M蔗糖、0.1M氯化钾、10mM氯化镁和2mM氯化钙的10mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.2)，搅拌后，于4℃以600×g搅拌10分钟。通过离心分离使细胞核和未粉碎细胞作为沉淀部分分离。然后将上清液于4℃以150,000×g，离心90分钟，获得作为沉淀部分的ST2细胞的膜部分。在该膜部分中添加上述含有蛋白酶抑制剂、150mM氯化钠和0.1M蔗糖的10mMTris盐酸缓冲液(pH 7.2)8ml后，再添加200μl 20％的CHAPS(3-[(cholamidopropyl)-diemethylammonio]-1-propanesulfonate，Sigma公司制)，于4℃搅拌2小时。再将此液在4℃以150,000×g离心分离60分钟，获得作为可溶化膜部分的上清液。
实施例2
本发明蛋白质的精制
(1)OCIF固定化亲和层析柱的制备
用1mM盐酸置换HiTrap NHS-activated柱(1ml，pharmacia公司)内的异丙醇后，使用注入器(5ml，テルモ公司)向柱子中添加1ml按照WO96/26217号记载的方法调制而得的含有13.0mg基因重组型OCIF的0.2M NaHCO3/0.5M NaCl(pH8.3)。于室温使其进行30分钟偶联反应后，为封闭过量的活性基团，用3ml 0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH 8.3)和0.1M乙酸/0.5M NaCl(pH 4.0)交替洗涤3次，然后再用0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH 8.3)置换，于室温放置1小时。接着，用0.5M乙醇胺/0.5M NaCl(pH 8.3)和0.1M乙酸/0.5M NaCl(pH 4.0)洗涤2次，再使用50mMTirs/1M NaCl/0.1％CHAPS缓冲液(pH 7.5)。
(2)用OCIF固定化柱亲和层析法精制本发明的蛋白质
OCIF结合蛋白的精制必须在4℃进行。用实施例2-(1)所述的添加了蛋白酶抑制剂、0.15M氯化钠和0.5％CHAPS的10mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.2)对前述OCIF固定化层析柱进行平衡。该柱上负荷了约8ml实施例1(2)所述的可溶化膜部分，流速为0.01ml/分。以0.5ml/分的流速，使上述添加了蛋白酶抑制剂、0.15M氯化钠和0.5％CHAPS的10mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.2)流过柱子进行洗涤，历时100分钟。然后，以0.1ml/分的流速，使添加了蛋白酶抑制剂、0.2M氯化钠和0.5％CHAPS的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.3)流过柱子，使吸附在柱子上的蛋白质溶出，历时50分钟。同样，以0.1ml/分的流速，使添加了蛋白酶抑制剂、0.2M氯化钠和0.5％CHAPS的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 2.0)流过柱子，使吸附在柱子上的蛋白质溶出，历时50分钟。溶出液以0.5ml/分作部份收集，在收集液中添加2M Tris溶液，立即中和。将从各缓冲液中溶出的收集液(溶出液量为1.0～5.0ml)分别用セントリコン-10(Centricon-10，Amicon，USA)浓缩至50～100μl。分取一部分浓缩的收集液，分别在其中添加OCIF后，用OCIF多克隆抗体使其免疫沉淀。将该沉淀部分SDS化后，SDS-PAGE时出现的能够与OCIF特异性结合的蛋白质区域的组份(Fr.No.3-10)即为本发明蛋白质。
(3)通过凝胶过滤对本发明蛋白质进行精制
将利用实施例2-(2)所述方法精制、浓缩而得的OCIF结合蛋白(0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH 3.3和0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 2.0溶出部分)加入到用10mM Tris-HCl、0.5M NaCl和0.5％ CHAPS(pH 7.0)进行过平衡处理的Superose12 HR10/30柱(pharmacia公司，1.0×30cm)，将平衡化缓冲液作为移动相，使其以0.5ml/min的流速展开，每次收集0.5ml。与上述同样，对本发明的蛋白质部分(Fr.No.27-32)进行鉴定，最后用Centricon-10(Amicon)浓缩各分馏部分。
(4)用逆相高速液体层析法进行精制
将用前述凝胶过滤法精制而得的OCIF结合蛋白加于经过三氟乙酸(TFA)、30％乙腈平衡的C4柱(2.1×250mm，Vydac，USA)上，以0.2ml/min的流速，在最初50分钟内使乙腈浓度从30％转变为50％，在以后的10分钟内转变为80％，进行溶出，溶出的蛋白质的峰可在215nm检出。分取溶出的各峰的蛋白质，对处于峰值段的本发明蛋白质进行鉴定，这样就可获得高度精制的本发明蛋白质。
实施例3
被精制的本发明蛋白质的SDS-PAGE
首先，用上述OCIF固定化柱亲和层析法精制由在活性维生素D3存在下或不存在时培养的ST2细胞调制而得的膜可溶化部分，将该精制标准品加入SDS-PAGE。如图1(A)所示，只有从活性维生素D3存在下培养的ST2细胞获得的精制标准品才能检出分子量约为30,000～40,000Da的主要的蛋白质谱带，通过OCIF固定化柱亲和层析法，可使与OCIF特异性结合的蛋白质，即本发明蛋白质选择性地被浓缩和精制。但是，除了本发明蛋白质之外，还可从另外两种精制试样中检出与OCIF固定化柱的载体和空隙非特异性结合的几种蛋白质的谱带。利用上述凝胶过滤和C4逆相色谱法可除去这些本发明蛋白质之外的蛋白质，所得高度精制的本发明蛋白质的SDS-PAGE如图1(B)所示。高度精制的本发明蛋白质的电泳均一，其分子量约为30,000～40,000Da。
实施例4
OCIF与成骨细胞的结合试验
(1) 125 I标记OCIF的调制
可通过碘原(Iodogen)法对OCIF进行125I标记。即，将20μl 2.5mg/ml Iodogen-氯仿溶液转移到1.5ml爱匹特鲁夫试管中，于40℃使氯仿蒸发，制得被碘包覆的试管。用400μl 0.5M硫酸钠缓冲液(Na-Pi，pH 7.0)洗试管，共3次，然后，添加5μl 0.5M Na-Li(pH 7.0)。在该试管中添加1.3μl(18.5MBq)Na-125I溶液(Amersham公司制，NEZ-033H20)后，立即加入1mg/ml rOCIF溶液(单体型或二聚体型)10μl，再用旋转搅拌机搅拌，在室温下放置30秒钟。将该溶液转移到预先添加过5μl含有10mg/ml碘化钾、0.5M Na-Pi(pH 7.0)溶液80μl和牛血清白蛋白质的磷酸盐缓冲生理盐水的试管中，并搅拌。然后使该溶液加于用0.25％牛血清白蛋白质的磷酸盐缓冲生理盐水进行过平衡化处理的旋转柱(1ml，G-25 fine，pharmacia公司)，以2,000rpm离心5分钟。在柱中溶出部分中添加400μl牛血清白蛋白质的磷酸盐缓冲生理盐水，并搅拌后，取出2μl，用γ-计量器(γ-counter)测定其辐射能。通过测定因10％ TCA而沉淀的部分的辐射能可求出所调制的125I标记OCIF溶液的放射化学纯度。此外，按照WO96/26217号公报记载的方法能够对125I标记OCIF溶液的OCIF生理活性进行测定。又，按照以下的ELISA可测定125I标记OCIF浓度。
(2)通过ELISA测定 125 I标记OCIF浓度
如WO96/26217号公报所述，为使抗OCIF兔子的多克隆抗体浓度为2μg/ml，在其中溶解50mM NaHCO3(pH 9.6)，然后分别在96孔板(MaxiSorpTM，Nonc社)的各孔中添加100μl上述溶液，然后在4℃放置一晚。倒掉该溶液后，分别在各孔中添加300μlブロックエ-ス(雪印乳业)/磷酸盐缓冲生理盐水(25/75)，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用含有0.01％吐温80的磷酸盐缓冲生理盐水(P-PBS)洗涤各孔，共3次，然后在各孔中分别加入添加了125I标记OCIF试样或OCIF标准品的300μlブロックエ-ス/磷酸盐缓冲生理盐水(25/75)，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。接着，在各孔中分别加入添加了100μl含有被过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体的ブロックエ-ス/磷酸盐缓冲生理盐水(25/75)，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。然后，在各孔中分别加入100μl TMB溶液(TMB Soluble Reageng，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置2～3分钟后，在各孔中分别添加100μl反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。接着，通过微量板读数器测定各孔在490nm时的吸光度。利用OCIF标准品制得的检测线求出125I标记OCIF的浓度。
(3)OCIF与成骨细胞或脾细胞的结合试验
分别在小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2或脾细胞中添加10-8M维生素D3(Calcitriol)及10-7M地塞米松或不添加上述物质而是分别将它们悬浮于含有10％胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基中，使它们的浓度分别为4×104cell/ml和2×106cell/ml，将上述培养基接种在24孔微量板上，每孔1ml。使细胞在CO2恒温箱中培养4天，用α-MEM培养基洗涤后，在各孔中加入200μl添加了20ng/ml上述125I标记OCIF(单体型或二聚体型)的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白，20mM Hepes缓冲液，0.2％NaNO3的α-MEM培养基)。再在各孔中加入200μg/ml添加了8μg/ml rOCIF(400倍浓度)的结合试验用培养基，供非特异性吸附量的测定。在CO2恒温箱中培养1小时后，用1ml磷酸盐缓冲生理盐水洗涤3次。此时，由于脾细胞为游离细胞，所以可一边对24孔微量板进行离心分离一边洗涤各孔中的细胞。洗涤后，分别在各孔中加入0.1N的NaOH溶液500μl，于室温放置10分钟，使细胞悬溶，最后用γ-计量器(γ-counter)测定与细胞结合的RI量。
如图2所示，125I标记OCIF不与上述培养的脾细胞结合，而是与维生素D3培养的成骨细胞样基质细胞特异性结合。这就表明本发明蛋白质是通过活性维生素D3和地塞米松被诱导于成骨细胞样基质细胞上的膜结合蛋白。
实施例5
本发明蛋白质的生物活性
(1)能促进成骨细胞样基质细胞的破骨细胞形成
通过测定所形成破骨细胞的耐酒石酸性的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)可对促进成骨细胞的破骨细胞形成的能力进行评估。即，使ddy小鼠(8～12周龄)的脾细胞(2×105cells/100μl/well)和小鼠成骨细胞样基质细胞ST2(5×103cells/100μl/well)悬浮于添加了10-8M活性维生素D3及10-7M地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培养基中，然后接种在96孔板上。在CO2恒温箱中培养1周后，用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤各孔，然后再添加100μl乙醇/丙酮(1∶1)，于室温固定1分钟。固定后，在各孔中添加含有5.5mM磷酸对硝基苯酚和10mM酒石酸钠的50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5，100μl)，于室温反应15分钟。反应后，在各孔中添加0.1N NaOH溶液，用微量板读数器测定405nm的吸光度。从RIKEN CELL BANK购入后继代数约为10代的ST2细胞和继代数约为40代的ST2细胞促进破骨细胞形成的能力的试验结如图3所示。其结果是，继代数较多的ST2细胞促进破骨细胞形成的能力更强。
(2)在活性维生素D3和地塞米松存在下培养的成骨细胞样基质细胞膜上的本发明蛋白质表达的经时变化和共同培养系统中破骨细胞形成的经时变化
与实施例4-(3)同样，在活性维生素D3和地塞米松存在下培养成骨细胞样基质细胞株ST2，历时7天。采用实施例4-(1)所述125I标记OCIF(单体型)进行OCIF结合试验。使400倍浓度的非标记OCIF、125I标记OCIF与ST2细胞竞争性结合，以测定非特异性结合。其结果是，由于存在活性维生素D3和地塞米松，所以随着培养时间的增长，125I标记OCIF的特异性结合量有所上升。即，如图4和图5所示，由于存在活性维生素D3，本发明蛋白质随着培养时间增长而表达于ST2细胞表面，其表达量在开始培养后的第4天达到最大。另一方面，在活性维生素D3存在下对小鼠脾细胞和ST2细胞进行共同培养，使破骨细胞样细胞形成。作为破骨细胞标记酶的TRAP阳性单核前破骨细胞样细胞在开始培养后的第3、4天形成，进一步分化、成熟的TRAP阳性多核细胞在培养后第5、6天形成。这表明本发明蛋白质的表达经时变化和破骨细胞形成的经时变化有关。
(3)共同培养期间，仅在各培养时间用OCIF处理时的破骨细胞形成抑制效果
为了更加明确本发明蛋白质与破骨细胞形成有关，在前述实施例5-(2)所述的6天共同培养期间，用10ng/ml OCIF对各培养阶段(各2天，但第5天只有1天)的细胞进行处理。其结果如图6所示，本发明蛋白质在ST2细胞上表达最明显是培养后第48～96小时之间，此时对细胞进行OCIF处理，能够获得最佳的抑制破骨细胞形成效果。即，OCIF通过本发明蛋白质与ST2细胞结合，抑制了破骨细胞的形成。
从以上结果可看出，在活性维生素D3和地塞米松存在下，本发明蛋白质被诱导在成骨细胞样基质细胞膜上，它具有支持和促进破骨细胞分化、成熟的生物活性(作用)。
实施例6
125 I标记OCIF和本发明蛋白质的偶联试验
为了进一步识别本发明蛋白质的存在，进行了125I标记OCIF和本发明蛋白质的偶联试验。与实施例4-(3)同样，在活性维生素D3和地塞米松存在下或不存在时培养成骨细胞样细胞株ST2，历时4天。用1ml磷酸盐缓冲生理盐水洗涤细胞后，使上述125I标记OCIF(单体型)25ng/ml或记载于WO96/26217号专利的序列表中序列号为76的蛋白质表达于动物细胞，加入200μl添加了40ng/ml利用上述方法标记所得125I标记OCIF-CDD1的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes缓冲液、0.2％NaNO3和100μg/ml肝素的α-MEM培养基)。然后在孔中再加入添加了400倍浓度的OCIF的结合试验用培养基，供非特异性吸附试验用。在CO2恒温箱中培养1小时后，用1ml添加了100μg/ml肝素的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤3次。接着在这些孔中加入溶解了100μg/ml偶合剂和DSS(Disuccinimidyl suberate，Pierce公司)的磷酸盐缓冲生理盐水500μl，于0℃使其反应10分钟。用冷却至0℃的1ml磷酸盐缓冲生理盐水洗涤这些孔中的细胞，共2次，然后在各孔中加入添加1％ Triton X-100、2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、10μM胃酶抑素、10μM亮肽素、10μM抗痛素和2mM EDTA的20mMHepes缓冲液100μl，于室温放置30分钟，使细胞溶解。通过常用方法在非还原条件下，对15μl上述试样进行SDS化后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4～20％聚丙烯酰胺梯度，第一化学公司)使其电泳。电泳后，使凝胶干燥，于-80℃，采用BioMax MS薄膜(Kodak公司)和BioMax MS感光滤膜(Kodak公司)使其感光24小时。再用常用方法使感光后的薄膜显象。使用125I标记OCIF(单体型，60kDa)时，可检出分子量约为90,000～110,000Da的被偶联的蛋白质。又，如图7所示，使用125I标记OCIF-CDD1(31kDa)时，可检出约70～80kDa(平均78kDa)的蛋白质。
实施例7
利用Scatchard标绘对表达于ST2细胞上的本发明蛋白质进行解析
调制上述125I标记OCIF(单体型)浓度为1,000pM的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes缓冲液和0.2％NaNO3的α-MEM培养基)，使用该结合试验用培养基，以1/2的稀释倍率进行阶段性稀释。又，为了求出非特异性结合，调制在上述溶液中又添加了400倍浓度的非标记单体型OCIF的溶液。将200μl调制的溶液加入在10-8M活性维生素D3(Calcitriol)和10-7M地塞米松存在下培养4天的上述ST2细胞(约为第10代)的孔中，用与实施例4-(3)相同的方法进行125I标记OCIF的结合试验。按照常用方法对所得结果进行Scatchard标绘，求出OCIF和OCIF结合蛋白的解离系数以及ST2细胞的OCIF结合蛋白个数(位置数)。其结果是，OCIF与本发明蛋白质的解离系数为280pM，ST2细胞的OCIF结合蛋白的个数约为33,000个/细胞。此外，如实施例5-(1)所述，由于约40继代培养的ST2细胞支持破骨细胞形成的能力比10继代培养的ST2细胞强，所以表达于前者ST2细胞上的本发明蛋白质个数为58,000个/细胞。很明显比10继代培养的ST2细胞多，这说明本发明蛋白质表达量的多少与ST2细胞支持破骨细胞形成的能力强弱有关。这也说明本发明蛋白质是支持或促进破骨细胞分化、成熟的因子。
实施例8
OBMcDNA的克隆
(1)从小鼠ST2细胞中抽出RNA
用含有10％胎牛血清的α-MEM培养基(ギブコBRL公司)培养小鼠成骨细胞样基质细胞株ST2(RIKEN CELL BANK，RCB0224)。通过附着细胞用225cm2T型瓶，用胰蛋白酶对培养至融合状态的ST2细胞进行处理，然后从T型瓶中剥离，洗净，接着转移到5个225cm2T型瓶中，分别在其中加入60ml添加了10-8M活性维生素D3(Calcitriol，和光纯药公司)、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基，在CO2恒温箱中培养5天。采用ISOGEN(和光纯药公司)从经过培养的ST2细胞中抽出全部RNA。用Oligo(dT)-纤维柱(5′-3′Prime公司)，由全部约600μg RNA调制聚A+RNA。获得约8μg聚A+RNA。
(2)表达文库的构筑
用Great Lengths cDNA试剂盒(Clontech公司)，按照其说明书把来源于实施例8-(1)获得的2μg聚A+RNA合成为双链cDNA。即，混合2μg聚A+RNA和Oligo(dT)25(dN)引物，添加蒸馏水至最终容量为6.25μl，于70℃保温3分钟后，在冰水中冷却2分钟。然后在该溶液中添加蒸馏水2.2μl、5X First-strand缓冲液2.5μl、100mM DTT(二硫苏糖醇)0.25μl、PRIME RNase抑制剂(1U/ml)(5′-3′Prime公司)0.5μl、被稀释了5倍的[α-32p]dCTP(アマシャム公司，3000Ci/mmol，2μCi/μl)0.5μl、dNTP(各20mM)0.65μl和MMLV(RNsaseH-)逆转录酶1.25μl(250单位)，于42℃保温90分钟。然后再添加蒸馏水62.25μl、5X second-strand缓冲液20μl、dNTP(各20mM)0.75μl和Second-strand酶混合物5μl，于16℃保温2小时。接着在该反应液中添加T4DNA polymerase 7.5单位，于16℃再保温30分钟后添加0.2M EDTA 5μl使反应停止，用苯酚和氯仿处理后，用乙醇使其沉淀。EcoRI-Sal I-NotI磷酸二氢钾使该双链cDNA的末端发生加成反应(Clontech公司)，使其末端磷酸化。然后用分子筛柱使500bp以上的cDNA分离，再用乙醇使其沉淀。将沉淀的DNA溶于水，然后插入预先经过限制性内切酶EcoRI(宝酒造社制)剪切和CIAP(牛小肠碱性磷酸酯酶，宝酒造社)处理而制得的pcDL-SRα296(Molecular and Cellular Biology，Vol.8，pp466-472，1988)。
(3)以与OCIF结合为指标的表达文库的筛选
用实施例8-(2)制得的DNA，整合进大肠杆菌和XL2 Blue MRF(东洋纺社)，并使其以1个孔中有约100个菌落配置于细胞培养用24孔塑料板上的L-羧苄青霉素琼脂培养基(1％胰化胨、0.5％酵母浸膏、1％ NaCl、60μg/ml羧苄青霉素和1.5％琼脂)上增殖。将各孔中的性状转变株悬浮于3ml Terrific Broth氨苄青霉素培养基(1.2％胰化胨、2.4％酵母浸膏、0.4％甘油、0.017M KH2PO4、0.072MK2HPO4和100μg/ml氨苄青霉素)中，于37％振荡培养1晚。通过离心收集菌落，用QIAwell kit(QIAGEN公司)调制质粒DNA。利用260nm时的吸光度来测定DNA含量，用乙醇使其沉淀而浓缩，然后用蒸馏水溶解使浓度为200ng/ml。这样就将分别来源于约100个菌落的DNA库调制为500库，用于对COS-7细胞(RIKENCELL BANK，RCB0539)的导入。以8×104细胞/孔的标准将COS-7细胞接种在24孔板上，采用含有10％胎牛血清的DEME培养基，将其放置在37℃恒温箱中，培养一晚。第二天，除去培养基后，用不含血清的DMEM培养基洗涤细胞。按照转导用试剂リポフェクトアミン(ギブコBRL社)所附的说明书，使预先经过OPTI-MEM培养基(ギブコBRL社)稀释的前述质粒DNA和リポフェクトアミン(ギブコBRL社)混合，15分钟后将该混合溶液加入各孔的细胞中。所用DNA和リポフェクタミン的量分别为1μg和4μl。5小时后，除去培养基，添加1ml含有1 0％胎牛血清的DMEM培养基(ギブコBRL社)，在37℃的CO2恒温箱中(5％CO2)培养2～3天。用不含血清的DMEM培养基洗涤与上述同样进行转导、培养2～3天的COS-7细胞后，在各孔中加入200μl添加了20ng/ml 125I标记OCIF的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes缓冲液、0.1mg/ml肝素和0.02％NaN3的无血清DMEM培养基)。在37℃的CO2恒温箱中(5％CO2)培养1小时后，用含有0.1mg/ml肝素的磷酸盐缓冲生理盐水500μl洗涤2次。然后，在各孔中加入500μl 0.1N NaOH溶液，于室温放置10分钟，使细胞溶解，用γ-计量器(パッカ-ド公司)测定各孔中的125I量。通过对500库进行筛选，分离出了1个含有编码了与OCIF特异性结合的蛋白质的cDNA的DNA库。而且，对含有本发明的cDNA的DNA库进行细分化，通过重复进行前述转导和筛选操作，可分离出编码与OCIF特异性结合的蛋白质的cDNA。该含有cDNA的质粒被称为pOBM291。含有该质粒的大肠杆菌以pOBM291的名称于平成9年5月23日被保藏于国立生命科学和人体技术研究所。其保藏号为FERM BP-5953。OCIF的125I标记以及通过ELISA进行125I标记OCIF的定量法如下所示。用碘原(Iodogen)法对OCIF进行125I标记。将20μl 2.5mg/ml Iodogen-氯仿溶液转移到1.5ml爱匹特鲁夫试管中，于40℃使氯仿蒸发，制得被碘包覆的试管。用400μl0.5M磷酸钠缓冲液(Na-Pi，pH 7.0)洗试管，共3次，然后，添加5μl 0.5M Na-Pi(pH7.0)。在该试管中添加1.3μl(18.5MBq)Na-125I溶液(Amersham公司制，NEZ-033H20)后，立即加入1mg/ml rOCIF溶液(单体型或二聚体型)10μl，再用旋转搅拌机搅拌，在室温下放置30秒钟。将该溶液转移到预先添加过5μl含有10mg/ml碘化钾、0.5M Na-Pi(pH 7.0)溶液80μl和5μl 5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲生理盐水的试管中，并搅拌。然后使该溶液加到事先用BSA-PBS进行过平衡处理的旋转柱(1ml，G-25 fine，pharmacia公司)，以2,000rpm离心5分钟。在柱中溶出部分中添加BSA-PBS 400μl，并搅拌后，取出2μl，用γ-计量器(γ-counter)测定其辐射能。通过测定因10％ TCA而沉淀的部分的辐射能可求出所调制的125I标记OCIF溶液的放射化学纯度。此外，按照WO96/26217号公报记载的方法能够对125I标记OCIF溶液的OCIF生理活性进行测定。又，按照以下的ELISA法可测定125I标记OCIF浓度。即，如WO96/26217号公报所述，为使兔抗OCIF多克隆抗体浓度为2μg/ml，在其中溶解50mMNaHCO3(pH 9.6)，然后分别在96孔免疫板(Nonc公司，MaxiSorpTM)的各孔中添加100μl上述溶液，然后在4℃放置一晚。倒掉该溶液后，分别在各孔中添加200μlブロックエ-ス(雪印乳业)/磷酸盐缓冲生理盐水的混合溶液(混合比为25/75)(B-PBS)，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用含有0.01％吐温80的磷酸盐缓冲生理盐水(P-PBS)洗涤各孔，共3次，然后在各孔中分别加入添加了125I标记OCIF试样或OCIF标准品的B-PBS 100μl，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。接着，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的被过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。然后，在各孔中分别加入100μl TMB溶液(TMB Soluble Reageng，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置2～3分钟后，在各孔中分别添加反应终止液(StoppingReagent，Scytek公司)。接着，通过微量板读数器测定各孔在490nm时的吸光度。利用OCIF标准品制得的检测线求出125I标记OCIF的浓度。
(4)决定编码OBM的全部氨基酸序列的cDNA碱基序列
用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キンエルマ社)决定实施例8-(3)所得OBMcDNA的碱基序列。即，以pOBM291为模板，决定直接插入片断的碱基序列。而且，将用限制性内切酶EcoRI剪切pOBM291所得约1.0kb和约0.7kb的片断插入质粒pUC19(宝酒造社)的EcoRI部位，同时决定这些片断的碱基序列。所用引物为决定pcDL-SRα296的插入片断DNA的碱基序列的引物SRR2、决定质粒pUC19的插入片断DNA的碱基序列的引物M13PrimerM3、以M13PrimerRV(同样由宝酒造社制造)和OBMcDNA的碱基序列为基础设计的合成引物OBM#8。这些引物的序列在序列表中的序列号为3～6。
此外，被决定的OBMcDNA的碱基序列的序列号为2，由该序列推定的氨基酸序列的序列号为1。
实施例9
被本发明cDNA编码的蛋白质的表达
在6孔板的各孔中，用リポフェクトアミン将质粒pOBM291导入COS-7细胞，然后在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养2天。接着转移到添加了5％透析胎牛血清的不含半胱氨酸和甲硫氨酸的DMEM(大日本制药公司)培养基中(800μl/well)培养15分钟后，添加14μl Express protein Labeling Mix(NEN公司，10mCi/ml)，培养4小时后，再添加200μl含有10％胎牛血清的DMEM培养基，培养1小时。用PBS洗涤细胞，共2次，接着添加0.5ml含有1％ TritonX-100、1％牛血红蛋白、10μg/ml亮肽素、0.2TIU/ml抑肽素和1mM PMSF的TSA缓冲液(含有0.14M NaCl和0.025％ NaN3的10mM Tris-盐酸(pH8.0))在冰上放置1小时。然后用细胞粉碎器粉碎细胞，于4℃以3000×g进行10分钟离心分离，获得上清液。在100μl该上清液中添加200μl经过稀释的缓冲液(含有0.1％TritonX-100、0.1％牛血红蛋白、10μg/ml亮肽素、0.2TIU/ml抑肽素和1mMPMSF的TSA缓冲液)，还添加A蛋白质琼脂糖(50μl)，于4℃振荡1小时后，于4℃以1500×g离心分离1分钟，回收上清液，除去与A蛋白质琼脂糖非特异性结合的部分。然后，在上清液中添加OCIF(1μg)，于4℃振荡1小时使OBM和OCIF结合后，再添加抗OCIF多克隆抗体(50μg)，于4℃振荡1小时。然后添加A蛋白质琼脂糖(10μl)，于4℃振荡1小时。于4℃以1500×g离心分离1分钟，回收沉淀部分。依次用经过稀释的缓冲液、不含牛血红蛋白的经过稀释的缓冲液、TSA缓冲液、50mM Tris-盐酸(pH6.5)分别洗涤上述沉淀部分2次、2次、1次和1次。洗涤后，在沉淀中添加含有10％β巯基乙醇的SDS缓冲液(0.125MTris-HCl、4％月桂基硫酸钠、20％甘油和0.002％溴酚蓝，pH6.8)，于100℃加热5分钟后进行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝胶，第一化学公司)。按照常用方法固定凝胶后，通过放大(アマシャム公司)增强同位素的信号后，于-80℃用BioMax MR薄膜(KODAK公司)使其感光。其结果如图8所示。被本发明cDNA编码的蛋白质分子量约为40,000Da。
实施例10
被本发明cDNA编码的蛋白质与OCIF的结合
在24孔板的各孔中，用リポフェクトアミン将质粒pOBM291导入COS-7细胞，对该细胞进行2～3天培养后，用不含血清的DMEM培养基洗涤。然后在其中加入200μl添加了20ng/ml 125I标记OCIF的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes缓冲液、0.1mg/ml肝素、0.2％ NaN3的无血清培养基)。再在各孔中加入200μl添加了8ng/ml非标记OCIF的结合试验用培养基，然后进行试验。在37℃的CO2恒温箱中(5％ CO2)培养1小时后，用500μl含有0.1mg/ml肝素的磷酸缓冲生理盐水洗涤细胞，共2次。洗涤后，在各孔中加入500μl0.1N NaOH溶液，于室温放置10分钟，使细胞溶解，然后用γ-计量器(γ-counter)测定孔中的125I量。其结果如图9所示，在导入质粒pOBM291的细胞上只结合了125I标记OCIF。此外，如果添加400倍浓度的OCIF可明显抑制上述结合。从以上结果可看出，被质粒pOBM291上的cDNA编码的蛋白质、OBM在COS-7细胞表面与OCIF特异性结合。
实施例11
125 I标记OCIF与被本发明cDNA编码的蛋白质的偶联试验
为了更为详细地解析被本发明cDNA编码的蛋白质的性质，使125I标记的单体型OCIF和被本发明cDNA编码的蛋白质进行偶联反应。按照实施例8-(3)所述方法，使质粒pOBM291导入COS-7细胞后，加入200μl添加了上述125I标记OCIF(25ng/ml)的结合试验用培养基，然后在孔中再加入添加了400倍浓度的非标记OCIF的结合试验用培养基。在37℃的CO2恒温箱(5％CO2)中培养1小时后，用500μl添加了0.1mg/ml肝素的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤细胞，共2次。接着在细胞中加入溶解了100μg/ml偶合剂和DSS(Disuccinimidyl suberate，Pierce公司)的磷酸盐缓冲生理盐水500μl，于0℃使其反应10分钟。用冷却至0℃的1ml磷酸盐缓冲生理盐水洗涤这些孔中的细胞，共2次，然后在细胞中加入添加了1％Triton X-100(和光纯药公司)、2mM PMSF(苯甲基磺酰氟，Sigma公司)、10μM胃酶抑素(和光纯药公司)、10μM亮肽素(和光纯药公司)、10μM抗痛素(和光纯药公司)和2mMEDTA(和光纯药公司)的20mM Hepes缓冲液100μl，于室温放置30分钟，使细胞溶解。通过常用方法在非还原条件下，对15μl上述试样进行SDS化后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4～20％聚丙烯酰胺梯度，第一化学公司)使其电泳。电泳后，使凝胶干燥，于-80℃，采用BioMax MS薄膜(Kodak公司)和BioMax MS感光滤膜(Kodak公司)使其感光24小时。再用常用方法使感光后的薄膜显象。其结果是，通过使125I标记的单体型OCIF和被本发明cDNA编码的蛋白质进行偶联反应后，检出了如图10所示分子量约为90,000～110,000Da的谱带。
实施例12
利用(北方印染法)核酸印迹法进行解析
用胰蛋白酶对在附着细胞用225cm2T型瓶中培养至融合状态的ST2细胞进行处理，然后将其从T型瓶中剥离，并洗净，接着将其接种在1个225cm2T型瓶中，在其中加入60ml添加了10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基，在恒温箱中培养4天。利用ISOGEN(和光纯药公司)从经过培养的ST2细胞中抽出全部RNA。此外，利用同样的方法，从在活性维生素D3和地塞米松不存在时培养的ST2细胞中抽出全部RNA。在上述两份都为20μg(4.5μl)的全部RNA中添加2.0μl 5X凝胶电泳缓冲液(0.2M吗啉代丙磺酸pH 7.0，5mM乙酸钠和5mM EDTA)、3.5μl甲醛和10.0μl甲酰胺，于55℃保温15分钟后，供电泳使用。电泳用凝胶由1.0琼脂糖、2.2M去离子化甲醛、40mM吗啉代丙磺酸(pH 7.0)、10mM乙酸钠和1mM EDTA配制而成。此外，电泳是在40mM吗啉代丙磺酸(pH 7.0)、10mM乙酸钠和1mM EDTA组成的缓冲液中进行的。电泳后，RNA转移到尼龙薄膜中。用巨引物DNA标记盒(アマシャム)和α-32P-dCTP(アマシャム)对被限制性内切酶EcoRI剪切所得约1.0kb的DNA片断进行标记，并以此标记物为探针进行杂交。其结果如图11所示，在活性维生素D3和地塞米松存在下培养ST2细胞时，使本发明cDNA编码的蛋白质(OBM)的基因表达很明显。
实施例13
本发明cDNA编码的蛋白质促进破骨细胞形成的能力
按照实施例8-(3)所述方法在COS细胞中导入pOBM291.3天后，通过离
心洗涤的方法，用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤トリプシナイズ细胞1次后，一
边使细胞悬浮于含有1％多聚甲醛的PBS中，一边在室温下固定5分钟，然
后用PBS离心洗涤，共6次。接着，在24孔板中分别加入在含有10-8M活
性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中调制而
成的1×106个/ml的小鼠脾细胞700μl及4×104个/ml的ST2细胞350μl，然
后在各孔中设置TC凹陷(Nunc公司)。在TC凹陷中加入在上述培养基中阶
段稀释固定而成的COS细胞(350μl)和OCIF(50μl)，于37℃培养6天。其结
果可证明OCIF所具备的破骨细胞形成抑制活性被本发明cDNA编码的蛋白
质抑制。
实施例14
分泌型OBM的表达
(1)分泌型OBM表达质粒的构筑
以OBM HF(序列表序列号为7)和OBM XR(序列表中序列号为8)作为引物，pOBM291作为模板，进行PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳法精制生成物后，用限制性内切酶HindIII、EcoRI剪切，再用琼脂糖凝胶电泳法精制。然后，采用偶联试剂盒ver.2(宝酒造社)对该精制片断(0.6kb)、pSec TagA(インビトロ-ゲン公司)的HindIII/EcoRV片断(5.2kb)和OBM cDNA的EcoRI/PmaCI片断(0.32kb)进行偶联，用该反应生成物对大肠杆菌DH5α进行性状转换。采用碱性SDS法对来源于耐氨苄青霉素菌株的质粒进行精制，选出通过限制性内切酶剪切而在pSecTagA中插入0.6kb和0.32kb的片断的质粒。然后采用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キン-エルマ-公司)对该质粒进行序列测定，可识别该质粒具有编码分泌型OBM的序列(碱基序列：序列表序列号为2的338～1355号，氨基酸序列：序列表序列号为1的72～316号)。用限制性内切酶NheI、XhoI剪切质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳回收相当于分泌型OBMcDNA的片断(1.0kb)。用偶联试剂盒将该片断插入表达介质pCEP4(InVitrogen公司)的NheI/XhoI片断(10.4kb)中，并将其反应生成物导入大肠杆菌DH5α。采用碱性SDS法对所获得的耐氨苄青霉素菌株的质粒进行精制，并通过限制性内切酶的剪切和解析，选出带有具备目的结构的分泌型OBM表达质粒(pCEP sOBM)的大肠杆菌株。培养带有pCEP sOBM的大肠杆菌株，用キアフィルタ-プラスミドミディ试剂盒(キアゲン公司)精制pCEPsOBM。
(2)分泌型OBM的表达
将293-EBNA细胞悬浮于含有10％ FCS的IMDM(IMDM-10％ FCB)中，以2×105个/2ml/孔的标准，将其接种在包被了胶原蛋白的24孔板上(住友ベ-クライト公司)，培养一晚。用4μlリポフェクトアミン(ギブコ公司)将1μg pCEP sOBM或pCEP4导入该细胞中，然后在0.5ml不含血清的IMDM或IMDM-10％ FCS中培养2天，回收培养后的上清液。通过以下方法可识别分泌型OBM在培养后的上清液中表达。在培养后的上清液中添加碳酸氢钠，使其最终浓度为0.1M后，将培养液加入96孔板中，于4℃放置一晚，使培养后的上清液中的OBM固定在96孔板上。在室温下，将该板放置在用PBS稀释过4倍的ブロックェ-ス(雪印乳业公司)溶液(B-PBS)中进行封闭，历时2小时，然后，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的3-100ng/ml OCIF，于37℃放置2小时。用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗涤板后，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的WO96/26217号记载的过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体，于37℃放置2小时。用PBS-T洗涤各孔，共6次后，在各孔中分别加入100μl TMS溶液(TMSSoluble Reagent，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。然后用微量板读数器对各孔在450nm时的吸光度进行测定，其结果如图12所示。导入pCEP sOBM的细胞的培养后上清液固定化的板中，随着所添加OCIF的浓度增加，其450nm的吸收也有所增加，但导入介质pCEP4的细胞的培养后上清液固定化时却没有发现吸收有所增加。又，用于固定化的培养后上清液的比例在5～90％的范围内变化，添加了一定浓度的OCIF(50ng/ml)时的实验结果如图13所示。导入pCEPsOBM的细胞的培养后上清液固定化的板中，培养后上清液的比例越高，450nm时的吸收就越多，但导入介质pCEP4的细胞的培养后上清液固定化板中，未见吸收有所增加。从以上结果可看出，分泌型OBM表达于导入pCEP sOBM的细胞的培养后上清液中。
实施例15
硫氧还蛋白-OBM融合蛋白质(Trx-OBM)的表达
(1)硫氧还蛋白-OBM融合蛋白质(Trx-OBM)表达介质的构筑
混合10μl 10X ExTaq缓冲液(宝酒造社)、8μl10mM dNTP(宝酒造社)、77.5μl灭菌蒸馏水、2μl pOBM291水溶液(10ng/μl)、1μl引物-OBM3(100pmol/μl，序列表序列号为9)、1μl引物-OBMSalR2(100pmol/μl，序列表序列号为10)和0.5μl ExTaq(5u/μl)(宝酒造社)，在微型离心管中进行PCR反应。在95℃、50℃、55℃、74℃和72℃分别反应5分钟、1秒钟、1分钟、1秒钟和5分钟后，再于96℃、50℃、55℃、74℃、72℃分别反应1分钟、1秒钟、1分钟、1秒钟和3分钟，循环25次。利用1％琼脂糖凝胶电泳法，用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)从全部反应液中精制获得约750bp的DNA片断。用限制性内切酶SaII，EcoRI(宝酒造社)剪切经过精制的全部DNA片断后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，精制约160bp的DNA片断(片断1)，使其溶于20μl灭菌蒸馏水中。同样，分别精制用限制性内切酶BamHI，EcoRI(宝酒造社)剪切4μg pOBM291所得约580bp的DNA片断(片断2)、用限制性内切酶BamHI，SaII(宝酒造社)剪切2μgpTrXFus(In Vitrogen公司)所得约3.6bp的DNA片断(片断3)，然后分别将它们溶于20μl灭菌蒸馏水中。采用DNAligation kit ver.2(宝酒造社)，于16℃保温2小时30分钟，使片断1、片断2和片断3结合在一起。用偶联反应液，按照ThioFusion Expression System(InVitrogen公司)所附的InstructionManual中记载的方法，将上述反应结合物导入大肠杆菌GI724株(InVitrogen公司)。根据对利用限制性内切酶剪切而获得的DNA片断图的解析以及确定的DNA序列，可从所得耐氨苄青霉素的菌株中选出带有OBMcDNA片断(碱基序列：序列表序列号2的350～1111，氨基酸序列：序列表序列号1的76～316)和硫氧还蛋白基因以相同序列部位结合的质粒的菌株。所得菌株被命名为GI724/pTxOBM25。
(2)大肠杆菌中的OBM表达
于30℃，分别使GI724/p TxOBM25菌株和具有pTrxFus的GI724菌株(GI724/pTrxFus)在2mlRMG-Amp培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、1.2％酪蛋白水解物(Difco公司)、1％甘油、1mMMgCl2、100μg/ml氨苄青霉素(Sigma公司)pH7.4)中振荡培养6小时。然后在50mlInduction培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、0.2％酪蛋白水解物、0.5％葡萄糖、1mM MgCl2、100μg/ml氨苄青霉素pH7.4)中添加0.5ml菌液，于30℃振荡培养。当OD600nm值约为0.5时，为使最终浓度为0.1mg/ml，在其中添加L-色氨酸，于30℃继续振荡培养6小时。以3000×g离心菌液，收集菌体，将其悬浮在12.5ml PBS(10mM磷酸缓冲液和0.15M NaCl，pH7.4)中。将悬浮液放入超声波装置(Ultrasonics公司)，粉碎菌体，以7000×g离心30分钟，收集上清液作为可溶性蛋白质部分。在还原条件下使该可溶性蛋白质溶液进行SDS聚丙烯酰胺(10％)电泳，每次10μl。其结果是，在GI724/pTrxOBM25的可溶性蛋白质溶液中检出了在GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液中没有出现的分子量约为40KDa的谱带(图14)。因此，可识别硫氧还蛋白和OBM的融合蛋白质(Trx-OBM)在大肠杆菌中的表达。
(3)Trx-OBM与OCIF的结合能
通过以下实验可识别所表达的Trx-OBM与OBM的结合。即，在96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中分别加入100μl用10mM碳酸氢钠水溶液稀释了5000倍的抗硫氧还蛋白抗体(InVitrogen公司)，于4℃放置一晚。除去各孔中的液体后，在各孔中分别加入200μl用PBS稀释了2倍的ブロックェ-ス(雪印乳业公司)溶液(BA-PBS)，于室温放置1小时。除去液体后，在各孔中分别加入100μl被BA-PBS阶段性稀释的上述来源于GI724/pTrxOBM25和GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液，于室温放置2小时。各孔用PBS-T洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl被BA-PBS稀释过的OCIF(100ng/ml)，于室温放置2小时。各孔用PBS-T洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl被BA-PBS稀释了2000倍的WO96/26217号公报记载的过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体，于室温放置2小时。各孔用PBS-T洗涤6次后，在各孔中加入100μl TMB溶液(TMB Soluble Reagent，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温约放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。最后用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度。其结果如图15所示。比较添加了来源于GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液的试样和未添加的试样，发现它们的吸光度几乎相同，但添加了来源于GI724/pTrxOBM25的可溶性蛋白质溶液的试样，其吸光度随着添加浓度的增加而上升。又，固定所添加的可溶性溶液的稀释比例(1％)，添加被BA-PBS阶段性稀释的OCIF(0～100ng/ml)时的实验结果如图16所示。使用来源于GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液的试样与OCIF浓度没有关系，其吸光度较小，但使用来源于GI724/pTrxOBM25的可溶性蛋白质溶液的试样的吸光度随着所添加的OCIF的浓度增加而增大。从上述结果可看出，来源于GI724/pTrxOBM25的Trx-OBM具有与OCIF结合的能力。
(4)产生Trx-OBM的大肠杆菌的大量培养
用铂接种环将GI724/pTrxOBM25涂在RMG-Amp琼脂培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、2％酪蛋白水解物、1％甘油、1mM MgCl2、100μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂pH7.4)中，于30℃培养一晚。然后将菌体悬浮在10ml诱导培养基中，每次5ml加入盛有500ml诱导培养基的2L三角烧瓶中(共2个)，于30℃振荡培养。为使OD600nm值约为0.5时的最终浓度达到0.1mg/ml，可添加L-色氨酸，并再次在30℃振荡培养6小时。以3000×g离心分离菌液20分钟，收集菌体，将菌体悬浮在160ml PBS中。将悬浮液装入超声波发生器(Ultrasonics公司)粉碎菌体，然后以7000×g离心30分钟，收集上清液作为可溶性蛋白质部分。
(5)OCIF固定化亲和层析柱的制备
混合2g TSK凝胶AF-トレシルトヨパ-ル650(东曹公司)和40ml用WO96/26217号公报记载的方法调制的含有35.0mg重组基因型OCIF的1.0M磷酸钾缓冲液(pH7.5)，于4℃慢慢振荡一晚，使其进行偶合反应。为了封闭过量的活性基团，在离心分离除去上清液后，在沉淀的载体中加入40ml 0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)，于室温慢慢振荡1小时。在柱子中流过含有0.01％吐温80和0.2MNaCl的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.3)和含有0.01％吐温80和0.2M NaCl的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)洗涤柱子后，再用含有0.01％吐温80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗涤2次，进行平衡处理。
(6)用OCIF固定化亲和层析法精制Trx-OBM
Trx-OBM的精制必须在4℃时进行。混合上述OCIF固定化亲和性载体(10ml)和上述实施例15-(4)所述可溶性蛋白质溶液(120ml)后，在50ml离心管(4根)中，于4℃用转头慢慢振荡一晚。然后将该混合液中的载体填入エコノ柱中(バイオラッド公司，内径为1.5cm，长为15cm)。依次在柱子中流过含有0.01％吐温80的PBS 300ml、含有0.01％吐温80和2M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)100ml以及含有0.01％吐温80和0.2MNaCl的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.3)100ml洗涤柱子。然后，在柱子中流过含有0.01％吐温80和0.2M NaCl的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)，使吸附在柱子上的蛋白质溶出。以5ml/管收集溶出液，在收集液中加入10％容量的2M Tris溶液(pH8.0)，立即中和。接着用上述实施例15-(3)记载的方法(与OCIF的结合能)检测收集液各管中是否存在Trx-OBM。然后收集含有Trx-OBM部分，进一步精制。
(7)通过凝胶过滤法精制Trx-OBM
利用Centriplus10和Centricon10(amicon公司)使约25ml上述实施例15-(6)的含Trx-OBM的收集液离心浓缩至约0.5ml。将该试样装入事先用含有0.01％吐温80的PBS进行过平衡化处理的Superose 12 HR 10/30柱子(1.0×30cm，pharmacia公司)。分离时将含有0.01％吐温80的PBS作为移动相，以0.25ml/min.的流速展开。以0.25ml/管收集柱子中流出的溶出液，采用实施例15-(3)记载的方法以及用Phast System(pharmacia公司)的SDS-聚丙烯酰胺电泳(10～15％聚丙烯酰胺凝胶，pharmacia公司)，通过银染色可检出收集部分的Trx-OBM。收集被纯化的含有Trx-OBM部分(Fr.20～23)，测定Trx-OBM的蛋白质浓度。然后将牛血清白蛋白作为标准品，用DC-蛋白质分析试剂盒(バイオラッド公司)对蛋白质浓度进行测定。
实施例16
OBM的破骨细胞形成诱导活性
用リポフェクトアミン(ギブコ公司)使pOBM291和pcDL-SRα296各自导入COS-7细胞。用含有10％FCS的DMEM培养上述两种细胞1天后，用胰蛋白酶进行处理，在覆盖了盖玻片(15mm圆形，マツナミ公司)的24孔板的每个孔中接种5×104个细胞，再培养2天。经过培养的板用PBS洗涤1次后，在其中添加含有1％多聚甲醛的PBS，使其温度保持在室温，历时8分钟，使细胞固定。固定了细胞的板用PBS洗涤6次后，在各孔中分别加入700μl以1×106/ml的比例悬浮于含有10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中的小鼠脾细胞。在各孔上设置Millicell PCF(ミリポア公司)，在Millicell PCF中添加700μl以4×104个/ml的比例悬浮于上述培养基的ST2细胞，于37℃培养6天。培养结束后，除去Millicell PCF，板用PBS洗涤1次后，用丙酮-乙醇溶液(50∶50)使细胞固定1分钟后，用LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE试剂盒(Sigma公司)对只表现出破骨细胞特异性标记的耐酒石酸性的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞染色。显微镜观察的结果是，固定了导入pcDL-SRα296的COS-7细胞的孔中没有检出表现TRAP活性的细胞，而固定了导入pOBM291的细胞的孔中观察到45±18个(平均值±标准偏差，n＝3)的TRAP阳性细胞。同时还识别了这些TRAP阳性细胞上结合了降钙素，这样就说明OBM具有诱导破骨细胞形成的活性。
实施例17
Trx-OBM及分泌型OBM的破骨细胞形成诱导活性
以2×106个/ml的比例，将小鼠脾细胞悬浮于含有10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，在24孔板的每个孔中加入350μl上述悬浮液。分别在各孔中加入350μl经上述培养基稀释过的精制Trx-OBM溶液(40ng/ml)，350μl用上述培养基稀释了10倍的在IMDM-10％ FCS中培养的导入了pCEP sOBM或pCEP4的293-EBNA细胞的培养上清液或350μl上述培养基后，在各孔中设置Millicell PCF(ミリポア公司)，在Millicell PCF中添加600μl以4×104个/ml的比例悬浮于上述培养基中的ST2细胞。培养6天后，除去MillicellPCF，板用PBS洗涤1次后，用丙酮-乙醇溶液(50∶50)使细胞固定1分钟，然后用LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE试剂盒(Sigma公司)对只表达出耐酒石酸性的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞染色。显微镜观察的结果是，没有添加Trx-OBM的孔中没有检出表现TRAP活性的细胞，而添加了Trx-OBM的孔中观察到106±21个(平均值±标准偏差，n＝3)的TRAP阳性细胞。同样，添加了导入pCEP4的293-EBNA培养上清液的孔中没有检出表现TRAP活性的细胞，而添加了导入pCEP sOBM的293-EBNA培养上清液的孔中观察到120±3个(平均值±标准偏差，n＝3)的TRAP阳性细胞。同时还识别了这些TRAP阳性细胞上结合了降钙素，这样就说明Trx-OBM和分泌型OBM具有诱导破骨细胞形成的活性。
实施例18
由本发明cDNA表达的蛋白质OBM和本发明的天然OCIF结合蛋白质的一 致性
(1)兔抗OBM多克隆抗体的制备
等量混合由实施例14-(6)和(7)记载的方法制得的200μg/ml精制OBM(硫氧还蛋白-OBM融合蛋白质)与福氏佐剂(DIFCO公司)，制得乳浊液，用该乳浊液对3只雄性日本白兔(体重为2.5～3.0kg，北山ラベス公司)进行皮下免疫，用量为1ml。1周免疫1次共6次，在最后一次免疫后第10天进行采血。按照以下方法对从血清中分离出来的抗体进行精制。即，在用PBS稀释了2倍的抗血清中添加硫酸铵，使最终浓度达到40％(w/v％)，于4℃放置1小时后，以8000×g离心分离20分钟，获得沉淀。用少量PBS溶解沉淀，于4℃在PBS中进行透析，然后使其加于蛋白质G-Sepharose柱(ファルマシア公司)。用PBS洗净后，用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)溶出吸附的免疫球蛋白，立即用1.5M Tris盐酸缓冲液(pH8.7)中和达到中性pH值。使溶出的蛋白质组分在PBS中透析后，测定其在280nm时的吸光度，确定其浓度(E1％13.5)。然后用马来亚酰胺活性过氧化物酶试剂盒(ピアス公司)制备西洋山葵过氧化物酶标记的抗OBM抗体。即，在1mg精制抗体中添加80μg N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸，于室温使其反应30分钟。然后添加5mg羟胺，进行脱乙酰化后，使被修饰的抗体在聚丙烯酰胺脱盐柱上层析分离。接着混合蛋白质部分和1mg马来酰亚胺活性过氧化物酶，于室温反应1小时，获得酶标记的抗体。
(2)兔抗OBM多克隆抗体对由本发明cDNA表达的蛋白质(OBM)或本发明的 天然蛋白质与OCIF的特异性结合能力的抑制
将利用实施例15-(6)和(7)记载的方法获得的精制OBM(硫氧还蛋白-OBM融合蛋白质)及实施例2-(4)的天然精制OCIF结合蛋白溶于0.1M碳酸氢钠中，使其浓度转变为2μg/ml。在96孔免疫板(Nunc公司制)的各孔中分别加入100μl上述溶液，于4℃放置一晚、然后在各孔中分别添加200μl50％浓度的ブロックェ-ス，于室温放置1小时。各孔用含有0.1％吐温20的PBS(P20-PBS)洗涤3次后，在P20-PBS稀释过的25％浓度的ブロックェ-ス中溶解兔抗OBM抗体，使其浓度为200μg/ml，然后在各孔中添加抗体溶液或不含抗体的25％浓度的ブロックェ-ス溶液100μl，将温度保持在37℃，历时1小时。各孔用P20-PBS洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl添加了20ng/ml实施例8-(3)记载的125I标记OCIF的结合试验溶液(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes、0.1mg/ml肝素的P20-PBS)。又，在各孔中再加入含有8μg/ml非标记OCIF的结合试验溶液100μl进行实验。将该免疫板的温度保持在37℃，历时1小时，各孔用P20-PBS洗涤6次。然后用γ-计数器测定各孔中的125I量。其结果如图17所示。如图所示，由本发明cDNA表达并精制的OBM以及与本发明的天然OCIF特异性结合的蛋白质经过兔抗OBM多克隆抗体处理后，完全不与125I标记OCIF结合。另一方面，未经抗体处理的上述两种蛋白质能与125I标记OCIF结合。又，添加400倍浓度的非标记OCIF(8μg/ml)显著地抑制了它们的结合，所以可识别这两种蛋白质与OCIF的结合是特异性结合。从上述结果可看出，兔抗OBM多克隆抗体对由本发明cDNA表达的蛋白质OBM或本发明的天然OCIF结合蛋白质都有作用，能够抑制这两种蛋白质与OCIF的特异性结合。
实施例19
人OBMcDNA的克隆
(1)小鼠OBM引物的制备
使用按照上述实施例的方法调制而得的小鼠OBM引物和OBM#3及OBM#8，对人OBMcDNA进行克隆。它们在序列表中的序列号分别为9和6。
(2)通过PCR获得人OBMcDNA片断
以来源于人体淋巴结的cDNA文库的Human Lymph Node Marathon readycDNA(クロンテック公司)为模板，用上述(1)制备的小鼠OBMcDNA引物，进行PCR反应，获得OBMcDNA片断。
以下为PCR的条件：
10×EX Taq缓冲液(宝酒造社)    2μl
2.5mM dNTP                    1.6μl
cDNA溶液                      1μl
EX Taq(宝酒造社)              0.2μl
蒸馏水                        14.8μl
40μM引物-OBM#3               0.2μl
40μM引物-OBM#8               0.2μl
在微型蜗型试管中混合上述溶液后，在以下条件下进行PCR反应。于95℃进行2分钟前处理，然后分别在95℃、57℃和72℃进行3个阶段反应，时间分别为30秒、30秒和2分20秒，重复40次后，在72℃保温5分钟。将反应液的一部分用于琼脂糖电泳，在上述小鼠OBMcDNA引物中可检出被扩增的约690bp的DNA片断。
(3)利用PCR扩增的人OBMcDNA片断的精制和碱基序列的确定
通过琼脂糖电泳分离实施例19-(2)所得人OBMcDNA片断。然后用QIAEX凝胶抽取试剂盒(キアゲン公司)进行精制。以被精制的人OBMcDNA片断为模板，再次用上述小鼠OBMcDNA引物进行PCR反应，大量制备人OBMcDNA片断，同样，通过QIAEX凝胶抽取试剂盒精制。以OBM#3和OBM#8(序列表9和6)为引物，采用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キンエルマ-公司)确定被精制的人OBMcDNA片断的碱基序列。该人OBMcDNA片断的碱基序列与小鼠OBMcDNA片断的碱基序列相比，有80.7％的一致性。
(4)利用约690bp的人OBMcDNA片断的杂交法对全部人OBMcDNA进行筛 选
用メガプライムDNA试剂盒(アマシャム公司)对实施例19-(3)精制而得的约690bp的人OBMcDNA片断进行[α32P]dCTP标记，对全部的人OBMcDNA进行筛选。筛选对象为Human Lymph Node 5′-STRETCH PLUS cDNA文库(クロンテック公司，USA)。按这家公司的说明书，于37℃使重组噬菌体感染大肠杆菌C600Hfl15分钟后，将该大肠杆菌添加入加温至45℃的LB琼脂培养基(1％胰化胨、0.5％酵母浸膏、1％NaCl和0.7％琼脂)中，接种于含有1.5％琼脂的LB琼脂培养基平板上。于37℃培养一晚后，使ハイボンド N粘合在(アマシャム公司)生成蚀斑的平板上，约3分钟。接着按照常用方法对滤膜进行碱性变性处理，中和，将其浸在2×SSC溶液中后，利用UV交联(ストラタジ-ン公司)将DNA固定在滤膜上。将所得滤膜浸在Rapid-hyb缓冲液(アマシャム公司)中，于65℃进行15分钟前处理，然后将其转移到添加了经过热变性处理的上述人OBMcDNA片断(约690bp，5×105cpm/ml)的上述缓冲液中，于65℃使其彻夜进行杂交反应，反应后，于65℃依次用含有0.1％SDS的2×SSC、1×SSC和0.1×SSC洗涤滤膜，历时15分钟。使所得的几个阳性克隆再进行2次筛选而纯化。其中，选择具有约2.2kb插入片断的克隆用于以下实验。将经过纯化的噬菌体命名为λhOBM。按照QIAGEN Lambda试剂盒(キアゲン公司)的说明书，从纯化的λhOBM中获得约10μg的DNA。用限制性内切酶SaII消化DNA后，用琼脂糖电泳分离出约2.2kb的hOBM插入cDNA。预先用限制性内切酶SaII剪切经过QIAEX凝胶抽取试剂盒(キアゲン公司)精制的DNA片断，然后利用DNA偶联试剂盒ver.2(宝酒造社)将其插入经过脱磷酸化处理的质粒pUC19(MBI公司)中，将含有DNA片断的pUC19导入大肠杆菌DH 5α(ギブコBRL公司)，所得性状有所转变的菌株被称为pUC19hOBM.使其增殖，按照常用方法精制插入了约2.2kb的人OBMcDNA的质粒。
(5)对编码人OBM的全氨基酸序列的cDNA碱基序列的确定
用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キンエルマ-公司)识别实施例19-(4)所得人OBMcDNA的碱基序列。即，以pUC19hOBM为模板，确定插入片断的碱基序列。作为引物使用的是用于确定pUC19的插入片断DNA的碱基序列的引物、M13PrimerM3和M13PrimerRV(生产商均为宝酒造社)及以OBMcDNA片断(约690bp)的碱基序列为基础设计合成的引物人OBM#8。所用引物、M13PrimerM3和M13PrimerRV的序列在序列表中的序列号分别为4和5。由此确定，并从人OBMcDNA碱基序列推测的人OBM的氨基酸序列在序列表中的序列号为1，人OBMcDNA在序列表中的序列号为12。
利用所得含有人OBMcDNA的质粒、导入pUC19hOBM的大肠杆菌于平成9年8月13日被保藏在国立生命科学和人体技术研究所，其保藏编号为FEBMBP-6058。
实施例20
OCIF的 125 I标记及通过ELISA对 125 I标记OCIF进行定量
OCIF通过碘原(Iodogen)法进行125I标记。将2.5mg/ml Iodogen-氯仿溶液20μl移入1.5ml爱匹特鲁夫试管中，于40℃使氯仿蒸发，制得包被了碘的试管。用0.5M磷酸钠缓冲液400μl(Na-Pi，pH7.0)洗涤该试管，共3次，然后在其中添加5μl0.5M Na-Pi(pH7.0)。接着在试管中添加1.3μl(18.5MBq)Na-125I溶液(アマシャム公司，NEZ-033H)后，立即添加10μl1mg/ml OCIF溶液(单体型或二聚体型)，用旋转搅拌机搅拌后，于室温放置30分钟。接着将该溶液转移到预先添加了80μl含有10mg/ml碘化钾的0.5M Na-Pi溶液(pH7.0)和5μl含有5％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水(BSA-PBS)的试管中，并搅拌。然后使该溶液加于经过A-PBS平衡化的旋转柱(1ml，G-25 Sephadex fine，pharmacia公司)上，以2,000rpm离心5分钟。在从柱子溶出的部分中添加400μl BSA-PBS，并搅拌后，取2μl，通过γ-计量器测定其辐射能。通过测定因10％三氯乙酸(TCA)而沉淀的部分的辐射能可求出上述调制而成的125I标记OCIF溶液的放射化学纯度。
按照WO96/26217号记载的方法测定125I标记OCIF的OCIF生物活性。又，通过ELISA可测定125I标记OCIF的浓度。即，如WO96/26217号公报所述，为使兔抗OCIF多克隆抗体浓度为2μg/ml，可将其溶解于50mM NaHCO3(pH 9.6)，然后分别在96孔免疫板(Nonc公司，MaxiSorpTM)的各孔中添加100μl上述溶液，然后在4℃放置一晚.倒掉该溶液后，分别在各孔中添加200μlブロックエ-ス(雪印乳业)/磷酸盐缓冲生理盐水的混合溶液(混合比为25/75)(B-PBS)，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用含有0.01％吐温80的磷酸盐缓冲生理盐水(P-PBS)洗涤各孔，共3次，然后在各孔中分别加入添加了125I标记OCIF试样或OCIF标准品的B-PBS 100μl，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。接着，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的被过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体，于室温放置2小时。倒掉该溶液后，用200μl P-PBS洗涤各孔，共6次。然后，在各孔中分别加入100μl TMB溶液(TMB SolubleReageng，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置2～3分钟后，在各孔中分别添加反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。接着，通过微量板读数器测定各孔在490nm时的吸光度。利用OCIF标准品制得的检测线求出125I标记OCIF的浓度。
实施例21
被本发明cDNA编码的蛋白质的表达
(1)动物细胞用hOBM表达介质的构筑
用限制性内切酶SaII剪切pUChOBM，用1％琼脂糖电泳法精制约2.2kb的DNA片断，通过DNAブランティング试剂盒(宝酒造社)使末端平滑化(平滑化hOBMcDNA片断)。用限制性内切酶EcoRI剪切表达质粒pcDL-SRα296(Molecularand Cellar Biology，Vol 8，pp466-472(1988))，通过DNA偶联试剂盒ver.2使利用ブランティング试剂盒而末端被平滑化的DNA片断和平滑化hOBMcDNA片断结合。使结合物在偶联反应液中导入大肠杆菌DHα。通过对限制性内切酶剪切而获得的DNA片断图的解析和DNA序列的确定，从所得耐氨苄青霉素性性状转变菌株中选出具有hOBMcDNA的转录方向与SRα启动子的转录方向相同的质粒phOBM的菌株。将其命名为DH 5α/phhOBM。
(2)在COS-7细胞表达人OBM
培养大肠杆菌DH 5α/phOBM，用キアフィルタ-プラスミドミディ试剂盒(キアゲン公司)精制质粒phOBM。在6孔板的各孔中，用リポフェクトアミン将phOBM导入COS-7细胞，然后在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养2天。接着转移到添加了5％透析胎牛血清的不含半胱氨酸和甲硫氨酸的DMEM(大日本制药公司)培养基中(88μl/well)培养15分钟后，添加14μl Express proteinLabeling Mix(NEN公司，10mCi/ml)，培养4小时后，再添加200μl含有10％胎牛血清的DMEM培养基，培养1小时。用PBS洗涤细胞，共2次，接着添加0.5ml含有1％ TritonX-100、1％牛血红蛋白、10μg/ml亮肽素(leupeptin)、0.2TIU/ml抑肽素(aprotinin)和1mM PMSF的TSA缓冲液(含有0.14M NaCl和0.025％ NaN3的10mM Tris-盐酸(pH8.0))，在冰上放置1小时。然后用细胞粉碎器粉碎细胞，于4℃以3000×g进行10分钟离心分离，获得上清液。在100μl该上清液中添加200μl经过稀释的缓冲液(含有0.1％ TritonX-100、0.1％牛血红蛋白、10μg/ml亮肽素、0.2TIU/ml抑肽素和1mM PMSF的TSA缓冲液)，与蛋白质A琼脂糖(50μl)一起在4℃振荡1小时后，于4℃以1500×g离心分离1分钟，收集上清液以除去与蛋白质A琼脂糖非特异性结合的蛋白质。然后，在上清液中添加OCIF(1μg)，于4℃振荡1小时使人OBM和OCIF结合后，再添加兔子OCIF多克隆抗体(50μg)，于4℃振荡1小时。在该溶液中添加蛋白质A琼脂糖(10μl)，于4℃再振荡1小时。于4℃以1500×g离心分离1分钟，回收沉淀部分。依次用经过稀释的缓冲液、不含牛血红蛋白的经过稀释的缓冲液、TSA缓冲液、50mM Tris-盐酸(pH6.5)分别洗涤上述沉淀部分2次、2次、1次和1次。洗涤后，在沉淀中添加含有10％β巯基乙醇的SDS缓冲液(0.125M Tris-HCl、4％月桂基硫酸钠、20％甘油和0.002％溴酚蓝，pH6.8)，于100℃加热5分钟后进行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝胶，第一化学公司)。按照常用方法固定凝胶后，通过放大(アマシャム公司)增强同位素的信号后，于-80℃用Bio Max MR薄膜(KODAK公司)使其感光。其结果如图18所示。被本发明cDNA编码的蛋白质分子量约为40,000Da。
实施例22
被本发明cDNA编码的蛋白质与OCIF的结合
在24孔板的各孔中，用リポフェクトアミン将与实施例21-(2)同样精制而得的phOBM导入COS-7细胞，对该细胞进行2～3天培养后，用不含血清的DMEM培养基洗涤。然后在其中加入200μl添加了20ng/ml 125I标记OCIF的结合试验用培养基(添加了0.2％牛血清白蛋白、20mM Hepes缓冲液、0.1mg/ml肝素、0.2％NaN3的无血清培养基)。再在各孔中加入200μl添加了8ng/ml非标记OCIF的结合试验用培养基，然后进行试验。在37℃的CO2恒温箱中(5％ CO2)培养1小时后，用500μl含有0.1mg/ml肝素的磷酸缓冲生理盐水洗涤细胞，共2次。洗涤后，在各孔中加入500μl 0.1N NaOH溶液，于室温放置10分钟，使细胞溶解，然后用γ-计量器(γ-counter)测定孔中的125I量。其结果如图19所示，在导入质粒pOBM291的细胞上只结合了125I标记OCIF。此外，如果添加400倍浓度的OCIF(8ng/ml)可明显抑制上述结合。从以上结果可看出，被phOBM上的cDNA编码的蛋白质人OBM在COS-7细胞表面与OCIF特异性结合。
实施例23
125 I标记OCIF与被本发明cDNA编码的蛋白质的偶联试验
为了更为详细地解析被本发明cDNA编码的蛋白质的性质，使125I标记单体型OCIF和被本发明cDNA编码的蛋白质进行偶联反应。即，按照实施例21-(1)和(2)所述方法，分别构筑介质，使phOBM导入COS-7细胞后，在各孔中加入200μl添加了上述125I标记OCIF(25ng/ml)的结合试验用培养基，然后在孔中再加入添加了400倍浓度的非标记OCIF的结合试验用培养基，在37℃的CO2恒温箱(5％CO2)中培养1小时后，用500μl添加了0.1mg/ml肝素的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤细胞，共2次。接着在细胞中加入溶解了100μg/ml偶合剂和DSS(Disuccinimidylsuberate，Pierce公司)的磷酸盐缓冲生理盐水500μl，于0℃使其反应10分钟。用冷却至0℃的1ml磷酸盐缓冲生理盐水洗涤这些孔中的细胞，共2次，然后在细胞中加入添加了1％ Triton X-100(和光纯药公司)、2mM PMSF(苯甲基磺酰氟，Sigma公司)、10μM胃酶抑素(和光纯药公司)、10μM亮肽素(和光纯药公司)、10μM抗痛素(antipan，和光纯药公司)和2mM EDTA(和光纯药公司)的20mMHepes缓冲液100μl，于室温放置30分钟，使细胞溶解。通过常用方法在非还原条件下，对15μl上述试样进行SDS化后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4～20％聚丙烯酰胺梯度，第一化学公司)使其电泳。电泳后，使凝胶干燥，于-80℃，采用BioMax MS薄膜(Kodak公司)和BioMax MS感光滤膜(Kodak公司)使其感光24小时。再用常用方法使感光后的薄膜显象。其结果是，通过使125I标记单体型OCIF和被本发明cDNA编码的蛋白质进行偶联反应，检出了如图20所示分子量约为90,000～110,000Da的谱带。
实施例24
分泌型人OBM的表达
(1)分泌型人OBM表达质粒的构筑
以OBM SF(序列表序列号为13)和小鼠OBM#8(序列表中序列号为6)作为引物，以pUC19hOBM为模板，进行PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳法精制生成物后，用限制性内切酶SPII、HindIII剪切，再用琼脂糖凝胶电泳法精制，获得0.27kb的片断。然后，通过限制性内切酶DraI部分消化人OBMcDNA，用琼脂糖电泳法精制一处被剪切的片断，再用限制性内切酶HindIII剪切精制过的片断。通过琼脂糖电泳法精制0.53kb的DraI/HindIII片断，采用偶联试剂盒ver.2(宝酒造社)对该精制片断，上述PCR生成物的SPII、HindIII剪切片断(0.27kb)和pSecTagA(インビトロ-ゲン公司)的SPII/EcoRV片断(5.2kb)进行偶联，把该反应生成物导入大肠杆菌DH5α。采用碱性SDS法对来源于耐氨苄青霉素菌株的质粒进行精制，选出通过限制性内切酶剪切而在pSec TagA中插入0.27kb和0.53kb的片断的质粒。然后采用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キン-エルマ-公司)分析该质粒的碱基序列，可识别该质粒具有编码分泌型人OBM的序列，用限制性内切酶NheI、XhoI剪切该质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳回收相当于分泌型OBMcDNA的片断(8.0kb)。然后用偶联剂将该片断插入表达介质pCEP4(InVitrogen公司)的NheI/XhoI片断(10.4kb)中，将反应生成物导入大肠杆菌DH5α。采用碱性SDS法对来源于耐氨苄青霉素菌株的质粒进行精制，通过限制性内切酶的剪切和解析，选出带有目的结构的分泌型人OBM表达质粒(pCEP shOBM)的大肠杆菌株。培养带有pCEP sOBM的大肠杆菌株，用キアフィルタ-プラスミドミディ试剂盒(キアゲン公司)精制pCEP shOBM。
(2)分泌型OBM的表达
将293-EBNA细胞悬浮于含有10％ FCB的IMDM(IMDM-10％ FCB)中，以2×105个/2ml/孔的标准，将其接种在包覆了胶原蛋白的24孔板上(住友ベ-クライト公司)，培养一晚。用4μlリポフェクトアミン(ギブコ公司)在细胞中导入1μgpCEP shOBM和pCEP4，然后在0.5ml不含血清的IMDM或IMDM-10％ FCS中培养2天，回收培养后的上清液。通过以下方法可识别分泌型人OBM表达于培养后的上清液中。即，在培养后的上清液中添加碳酸氢钠，使其最终浓度为0.1M，于4℃放置一晚，将培养后上清液中的人OBM固定在96孔板上，在室温下，将该板放置在用PBS稀释过4倍的ブロックエ-ス(雪印乳业公司)溶液(B-PBS)中进行封闭，历时2小时，然后，在各孔中分别加入经过B-PBS稀释的3-100ng/ml OCIF，于37℃放置2小时。用含有0.05％吐温20的PBS(P-PBS)洗涤板后，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的WO96/26217号公报记载的过氧化物酶标记兔抗OCIF多克隆抗体，于37℃放置2小时。用P-PBS洗涤各孔，共6次后，在各孔中分别加入100μl TMS溶液(TMS Soluble Reagent，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。然后用微量板读数器对各孔在450nm时的吸光度进行测定，其结果如图21所示。导入了pCEP shOBM的细胞的培养后上清液固定化的板中，随着所添加OCIF的浓度的增高，450nm的吸光度有所增加，但导入了介质pCEP4的细胞的培养后上清液固定化时却没有发现吸光度有所增加。又，用于固定化的培养后上清液的比例在5～90％的范围内变化，添加了一定浓度的OCIF(50ng/ml)时的实验结果如图22所示。导入了pCEP shOBM的细胞的培养后上清液固定化的板中，450nm的吸光度随着培养后上清液添加比例的增高而增加，但导入了介质pCEP4的细胞的培养后上清液固定化板中，未见吸光度有所增加。从以上结果可看出，分泌型人OBM表达于导入了pCEP shOBM的细胞的培养后上清液中。
实施例25
硫氧还蛋白-hOBM融合蛋白质(Trx-hOBM)的表达
(1)硫氧还蛋白-hOBM融合蛋白质(Trx-hOBM)表达介质的构筑
混合10μl 10X ExTaq缓冲液(宝酒造社)、8μl 10mM dNTP(宝酒造社)、77.5μl灭菌蒸馏水、2μl pUC19hOBM水溶液(10ng/μl)、1μl引物小鼠OBM#8(100pmol/μl，序列表序列号为9)、1μl引物-hOBM SalR2(100pmol/μl，序列表序列号为14)和0.5μl ExTaq(5u/μl)(宝酒造社)，在微型离心管中进行PCR反应。在95℃、50℃、55℃、74℃和72℃分别反应5分钟、1秒钟、1分钟、1秒钟和5分钟后，再于96℃、50℃、55℃、74℃、72℃分别反应1分钟、1秒钟、1分钟、1秒钟和3分钟，循环25次。由全部反应液精制获得约750bp的DNA片断。用限制性内切酶SalI(宝酒造社)和BspHI(ニュ-イングランドバイラブズ公司)剪切精制后的DNA片断(全部)，进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后精制得约320bp的DNA片断(片断1)，将其溶于20μl灭菌蒸馏水中。同样，分别精制用限制性内切酶BamHI，BspHI(宝酒造社)剪切4μg实施例19-(3)记载的pUC19OBM所得约450bp的DNA片断(片断2)、用限制性内切酶BamHI，SalI(宝酒造社)剪切2μgpTrXFus(InVitrogen公司)所得约3.6bp的DNA片断(片断3)，然后分别将它们溶于20μl灭菌蒸馏水中。用DNA凝胶提取试剂盒对DNA片断进行精制。采用DNA偶联试剂盒ver.2(宝酒造社)，于16℃保温2小时30分钟，使片断1、片断2和片断3结合在一起。在偶联反应液中，按照所附的ThioFusionExpression System(InVitrogen公司)的Instruction Manual中记载的方法，将偶联结合物导入大肠杆菌GI724株(InVitrogen公司)。根据对用限制性内切酶剪切而获得的DNA片断图的解析和确定的DNA序列，可从所得耐氨苄青霉素的性状转导株中选出具有hOBMcDNA片断与硫氧还蛋白基因以相同碱基序列部位结合的质粒的菌株。所得菌株被命名为GI724/p TxhOBM。
(2)大肠杆菌中的Trx-hOBM表达
于37℃，分别使GI724/p TrxhOBM菌株和具有pTrxFus的GI724菌株(GI724/pTrxFus)在2ml RMG-Amp培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、2％酪蛋白水解物、1％甘油、1mM MgCl2、100μg/ml氨苄青霉素pH7.4)中振荡培养6小时。然后在50ml Induction培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、0.2％酪蛋白水解物、0.5％葡萄糖、1mM MgCl2、100μg/ml氨苄青霉素pH7.4)中添加0.5ml菌液，于30℃振荡培养。在其中添加L-色氨酸，可使OD600nm值约为0.5时，其最终浓度达到0.1mg/ml，进而于30℃继续振荡培养6小时。以3000×g离心菌液，收集菌体，将其悬浮在12.5ml PBS中。将悬浮液放入超声波发生器(Ultrasonics公司)，粉碎菌体，以7000×g离心30分钟，收集上清液作为可溶性蛋白质部分。在还原条件下使该可溶性蛋白质溶液进行SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺)电泳，每次10μl。其结果如图23所示，在GI724/pTrxhOBM的可溶性蛋白质溶液中检出了在GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液中没有出现的分子量约为40,000Da的蛋白质谱带。因此，从以上结果可识别硫氧还蛋白和人OBM的融合蛋白质(Trx-hOBM)在大肠杆菌中的表达。
(3)Trx-OBM与OCIF的结合能
通过以下实验可识别所表达的Trx-hOBM与OBM的结合。即，在96孔免疫酶标板(Nunc公司)的各孔中分别加入100μl用10mM碳酸氢钠水溶液稀释了5000倍的抗硫氧还蛋白抗体(InVitrogen公司)，于4℃放置一晚。除去各孔中的液体后，在各孔中分别加入200μl用PBS稀释了2倍的ブロックエ-ス(雪印乳业公司)溶液(BA-PBS)，于室温放置1小时。除去液体后，各孔用P-PBS洗涤3次。然后在各孔中分别加入100μl被BA-PBS阶段性稀释的上述来源于GI724/pTrxhOBM和GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液，于室温放置2小时。各孔用P-PBS洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl被BA-PBS稀释过的OCIF(100ng/ml)，于室温放置2小时。各孔用P-PBS洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl被BA-PBS稀释了2000倍的WO96/26217号公报记载的过氧化物酶标记的兔抗OCIF多克隆抗体，于室温放置2小时。各孔用P-PBS洗涤6次后，在各孔中加入100μl TMB溶液，于室温约放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(StoppingReagent)。最后用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度。其结果如图24所示。比较添加了来源于GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液的试样和未添加的试样，发现它们的吸光度几乎相同，但添加了来源于GI724/pTrxhOBM的可溶性蛋白质溶液的试样，其吸光度随着添加浓度的增加而上升。又，固定所添加的可溶性溶液的稀释比例(1％浓度)，添加被BA-PBS阶段性稀释的OCIF(0～100ng/ml)时的实验结果如图25所示。使用来源于GI724/pTrxFus的可溶性蛋白质溶液的试样与OCIF浓度没有关系，其吸光度较小，但使用来源于GI724/pTrxhOBM的可溶性蛋白质溶液的试样的吸光度随着所添加OCIF的浓度增加而增大。从上述结果可看出，来源于GI724/pTrxhOBM的Trx-hOBM具有与OCIF结合的能力。
(4)产生Trx-hOBM的大肠杆菌的大量培养
用铂接种环将GI724/pTrxhOBM涂在RMG-Amp琼脂培养基(0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、2％酪蛋白水解物、1.5％琼脂pH7.4)中，于30℃培养一晚。然后将菌体悬浮在10ml诱导培养基中，每次5ml加入盛有500ml诱导培养基的2L三角烧瓶中(共2个)，于30℃振荡培养。添加L-色氨酸，可使OD600nm值约为0.5时的最终浓度达到0.1mg/ml，再次在30℃振荡培养6小时。以3000×g离心分离菌液20分钟，收集菌体，将菌体悬浮在160ml PBS中。将悬浮液装入超声波发生器(Ultrasonics公司)粉碎菌体，然后以7000×g离心30分钟，收集上清液作为可溶性蛋白质部分。
(5)OCIF固定化层析柱的制备
混合2g TSK凝胶AF-トレシルトヨパ-ル650(东ソ公司)和40ml含有用WO96/26217号公报记载的方法制备的35.0mg重组基因型OCIF的1.0M磷酸钾缓冲液(pH7.5)，于4℃慢慢振荡一晚，使其进行偶合反应。为了封闭过量的活性基团，在离心分离除去上清液后，在沉淀的载体中加入40ml 0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)，于室温慢慢振荡1小时。在柱子中依次流过含有0.01％吐温80和0.2MNaCl的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.3)和含有0.01％吐温80和0.2M NaCl的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)洗涤柱子后，再用含有0.01％吐温80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗涤2次，进行平衡处理。
(6)用OCIF固定化亲和柱精制Trx-hOBM
Trx-hOBM的精制必须在4℃时进行。混合上述OCIF固定化亲和性载体(10ml)和上述实施例25-(4)所述可溶性蛋白质溶液(120ml)后，在50ml离心管(4根)中，于4℃用转头慢慢振荡一晚。然后将该混合液中的载体填入エコノ柱中(内径1.5cm×长15cm，バイオラッド公司)。依次在柱子中流过含有0.01％吐温80的PBS300ml、含有0.01％吐温80和2M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)100ml以及含有0.01％吐温80和0.2M NaCl的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.3)100ml洗涤柱子。然后，在柱子中流过含有0.01％吐温80和0.2M NaCl的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)，使吸附在柱子上的蛋白质溶出。5ml/管收集溶出液，在收集液中添加10％容量的2M Tris溶液(pH8.0)，立即中和。接着用上述实施例25-(3)记载的方法(与OCIF的结合能)检测收集液各部分中是否存在Trx-hOBM。然后收集含有Trx-hOBM部分，进一步精制。
(7)用凝胶过滤法精制Trx-hOBM
利用Centriplus10和Centricon10(Amicon公司)使约25ml上述实施例25-(6)的Trx-hOBM部分离心浓缩至约0.5ml。将该试样加入事先用含有0.01％吐温80的PBS进行过平衡化处理的Superose 12 HR 10/30柱子(1.0×30cm，pharmacia公司)。将含有0.01％吐温80的PBS作为移动相，以0.25ml/min.的流速展开。以0.25ml/管收集柱子中流出的溶出液，采用实施例25-(3)记载的方法以及SDS-PAGE检出收集液中的Trx-hOBM，收集含有被纯化的Trx-hOBM部分，测定Trx-hOBM的蛋白质浓度。然后将牛血清白蛋白作为标准品，用DC-蛋白质分析试剂盒(バイオラッド公司)对蛋白质浓度进行测定。
实施例26
hOBM的诱导破骨细胞形成活性
用リポフェクトアミン(ギブコ公司)分别使phOBM和pcDL-SR α296导入COS-7细胞。用含有10％FCS的DMEM培养上述两种细胞1天后，用胰蛋白酶进行处理，在覆盖了盖玻片(15mm圆形，マツナミ公司)的24孔板的每个孔中接种5×104个细胞，再培养2天。经过培养的板用PBS洗涤1次后，在其中添加含有1％多聚甲醛的PBS，使其温度保持在室温，历时8分钟，使细胞固定。固定了细胞的板用PBS洗涤6次后，在各孔中分别加入700μl以1×106/ml的比例悬浮了小鼠脾细胞的含有10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基。在各孔上设置Millicell PCF(ミリポア公司)，在Millicell PCF中添加700μl以4×104个/ml的比例悬浮于上述培养基的ST2细胞，于37℃培养6天。培养结束后，除去Millicell PCF，板用PBS洗涤1次后，用丙酮-乙醇溶液(50∶50)使细胞固定1分钟后，用LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE试剂盒(Sigma公司)对只表现作为破骨细胞特异性标记的耐酒石酸性的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞染色。显微镜观察的结果是，固定了导入不含人OBMcDNA的介质pcDL-SRα296的COS-7细胞的孔中没有检出表达TRAP活性的细胞，而固定了导入phOBM的细胞的孔中观察到65±18个(n＝3，平均值±标准偏差，)的TRAP阳性细胞。又，这些TRAP阳性细胞还与125I标记降钙素特异性结合，这样就可确定表达了降钙素受体。从上述结果可看出，被本发明cDNA编码的蛋白质人OBM具有诱导破骨细胞形成的活性。
实施例27
Trx-hOBM及分泌型hOBM的诱导破骨细胞形成活性
以2×106个/ml的比例，将小鼠脾细胞悬浮于含有10-8M活性维生素D3、10-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，在24孔板的每个孔中加入350μl上述悬浮液。分别在各孔中加入350μl上述用培养基稀释过的精制Trx-hOBM溶液(40ng/ml)，350μl在IMDM-10％ FCS中培养的导入了pCEP shOBM或pCEP4的293-EBNA细胞的上清液用上述培养基稀释了10倍的溶液或350μl上述培养基后，在各孔中设置Millicell PCF(ミリポア公司)，在Millicell PCF中添加600μl以4×104个/ml的比例悬浮于上述培养基中的ST2细胞。培养6天后，除去Millicell PCF，细胞培养板用PBS洗涤1次后，用丙酮-乙醇溶液(50∶50)使细胞固定1分钟，然后用LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE试剂盒(Sigma公司)对只表现耐酒石酸性的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞染色。显微镜观察的结果是，没有添加Trx-hOBM的孔中没有检出表现TRAP活性的细胞，而添加了Trx-hOBM的孔中观察到115±19个(n＝3，平均值±标准偏差)的TRAP阳性细胞。同样，添加了导入了pCEP4的293-EBNA培养上清液的孔中没有检出表达TRAP活性的细胞，而添加了性状转导入pCEP shOBM的293-EBNA培养上清液的孔中观察到125±23个(n＝3，平均值±标准偏差)的TRAP阳性细胞。又，这些TRAP阳性细胞还与125I标记降钙素特异性结合，这样就可确定表达了降钙素受体。从上述结果可看出，Trx-hOBM和分泌型OBM具有诱导破骨细胞形成的活性。
实施例28
多克隆抗体的制备
按照前述方法可获得作为免疫抗原的小鼠sOBM或人sOBM。即，同时用含有编码免疫球蛋白的κ-链的信号肽的碱基序列的表达介质pSec TagA(Invitrogen公司)的Hind III/EcoR V片断(5.2kb)和偶联试剂合ver.2(宝酒造社)使小鼠sOBMcDNA(编码不具有使小鼠OBM的N末端到72号的氨基酸受损的膜结合部的小鼠sOBM(序列表序列号为16)的cDNA，序列表序列号为18)或人OBMcDNA(编码不具有使人OBM的N末端到71号的氨基酸受损的膜结合部的人sOBM(序列表序列号为17)的cDNA，序列表序列号为19)进行偶联，将反应生成物导入大肠杆菌DH 5α。利用碱性SDS法精制来源于所得耐氨苄青霉素性菌株的质粒，选出通过限制性内切酶的剪切而在pSec TagA中插入0.6kb和0.32kb的片断的质粒。从采用多循环序列(检测)FS试剂盒(パ-キン-エルマ-公司)确定碱基序列的结果可知，该质粒具有编码小鼠或人sOBM的碱基序列。用限制性内切酶NheI、XhoI剪切质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳回收相当于分泌型OBMcDNA的片断(1.0kb)。用偶联剂将该片断插入表达介质pCEP4(InVitrogen公司)的NheI/XhoI片断(10.4kb)中，将反应生成物导入大肠杆菌DH5α。采用碱性SDS法对来源于耐氨苄青霉素菌株的质粒进行精制，通过限制性内切酶的剪切和解析，选出具有目的结构的分泌型OBM表达质粒(pCEP sOBM)的大肠杆菌株。培养带有pCEP sOBM的大肠杆菌株，用キアフィルタ-プラスミドミディ试剂盒(キアゲン公司)精制pCEPsOBM。然后将293-EBNA细胞悬浮于含有10％ FCS的IMDM(IMDM-10％ FCB)中，以2×105个/2ml/孔的标准，将其接种在包覆了胶原蛋白的24孔板上(住友ベ-クライト公司)，培养一晚。用4μlリポフェクトアミン(ギブコ公司)在细胞中导入1μg pCEP sOBM或pCEP4，然后在0.5ml不含血清的IMDM或IMDM-10％FCS中培养2天，回收培养后的上清液。通过以下方法可筛选出重组基因型小鼠可溶性OBM(msOBM)或人可溶性OBM(hsOBM)的高产细胞。在含有msOBM或hsOBM的培养后的上清液中添加碳酸氢钠，使其最终浓度为0.1M后，分别在96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中加入100μl上述培养后上清液，于4℃放置一晚，使培养后的上清液中的msOBM或hsOBM固定在各孔中。在板的各孔中加入200μl用PBS稀释过4倍的ブロックエ-ス(雪印乳业公司)溶液(B-PBS)，于室温放置2小时，用含有0.1％吐温20的PBS(P-PBS)洗涤3次后，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS阶段性稀释的基因重组型OCIF(rOCIF)溶液(3-100ng/ml)，于37℃放置2小时。然后用PBS洗板，共3次，在各孔中分别加入100μl经过B-PBS稀释的过氧化物酶标记抗OCIF多克隆抗体(WO96/26217号)，于37℃放置2小时。用P-PBS洗涤各孔，共6次后，在各孔中分别加入100μl TMS溶液(TMS SolubleReagent，High Sensitivity，Scytek公司)，于室温放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(Stopping Reagent，Scytek公司)。然后用微量板读数器对各孔在450nm时的吸光度进行测定。固定了表达msOBM或hsOBM的细胞株的培养后上清液的板的吸光度随着OCIF添加浓度的增加而显著增大。从表达msOBM或hsOBM的细胞株中选出吸光度增大比例较高的细胞株作为高产株。在25个T型瓶中(T-225)以含有5％FCS的IMDM为培养基大量培养选出的能高表达msOBM或hsOBM的293-EBNA细胞。当细胞数达到饱和状态后，在每个T型瓶中再加入100ml新鲜的培养基，培养3～4天，回收培养后的上清液。重复上述操作4次，分别获得10升含有msOBM或hsOBM的培养后上清液。然后按照实施例25-(6)和(7)记载的方法，通过使用了rOCIF固定化柱的亲和层析法和凝胶过滤法进行精制，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳可从上述培养后上清液中分别获得约10mg和12mg的精制msOBM或hsOBM。将所得精制标准品分别作为免疫抗原使用。将所得各抗原溶于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，使其浓度为200μg/ml，与等体积的福氏完全佐剂混合乳化后，分别对3只日本白兔皮下注射1ml进行免疫，1周1次左右。测定抗体效价，当抗体效价达到最高时，加强免疫1次，10天后采集全血。抗血清用蛋白质A琼脂糖层析法用的结合缓冲液(BioRad)稀释2倍，然后加于用相同的缓冲液进行过平衡处理的蛋白质A柱上。用同样的缓冲液充分洗涤柱子后，通过溶出缓冲液(BioRad)或0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.9～3.0)使吸附在柱子上的抗sOBM抗体溶出。为了达到立即中和抗体溶出液的目的，用盛有少量1.0M Tris-HCl(pH 8.0)的试管对溶出液进行分管收集。将抗体溶出液放入PBS中，于4℃彻夜进行透析。采用Lowry法以牛IgG为基准，测定抗体溶液中的蛋白量。其结果是，从1ml兔抗血清中可获得约10mg含有本发明的多克隆抗体的精制免疫球蛋白(IgG)。
实施例29
用多克隆抗体的ELISA对OBM和sOBM进行测定
构筑以实施例28所得兔抗人sOBM多克隆抗体为固相抗体和酶标记抗体的双抗体夹心ELISA法。酶标记是按照石川等的方法(Ishikawa et al.：J.Immunoassay，Vol.4，209-327，1983)进行过氧化物酶标记。将实施例28所得抗人sOBM多克隆抗体溶于0.1M NaHCO3中，使其浓度为2μg，然后在96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中分别加入100μl，于室温放置一晚。然后，在各孔中分别加入200μl 50％ブロックエ-ス(雪印乳业公司)，于室温放置1小时，各孔用含有0.1％吐温20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤3次。分别用反应用缓冲液(含有40％ブロックエ-ス、0.1％吐温20的0.2M Tris-HCl缓冲液，pH7.2)阶段性稀释用与实施例26相同方法表达的人OBM并通过实施例2的方法精制而得的精制人OBM，以及实施例28所得精制人sOBM，然后在各孔中分别加入100μl上述溶液，于室温放置2小时后，各孔用上述洗涤缓冲液洗3次。分别用一次反应用缓冲液(含有40％ブロックエ-ス、0.1％吐温20的0.2M Tris-HCl缓冲液，pH7.2)阶段性稀释用与实施例26相同方法表达的人OBM并通过实施例2的方法精制而得的精制人OBM，以及实施例28所得精制人sOBM，然后在各孔中分别加入100μl上述溶液，于室温放置2小时后，各孔用上述洗涤缓冲液洗3次。接着在各孔中分别加入100μl经过二级反应用缓冲液(含有25％ブロックエ-ス、0.1％吐温20的0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.2)稀释了1000倍的POD标记抗人sOBM多克隆抗体，于室温放置2小时后，各孔用洗涤缓冲液洗3次。然后在各孔中分别加入100μl酶基质溶液(TMB，ScyTek公司)，于室温放置10分钟后，在各孔中分别加入100μl反应终止液(Stoppingreagent，ScyTek公司)，使酶反应停止。最后用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度。其结果如图26所示。用兔抗人sOBM多克隆抗体双抗体夹心ELISA法能大致同等识别人sOBM(分子量约为32kDa)和人OBM(分子量约为40kDa)，它们各自的测定灵敏度约为12.5×10-3pmol/ml(人OBM约为500pg/ml，人sOBM约为400pg/ml)。实施例28所得兔抗小鼠sOBM多克隆抗体的ELISA对小鼠sOBM和小鼠OBM进行的测定与上述相同，各自的测定灵敏度也相同，能够测定极微量的小鼠sOBM或小鼠OBM。
如上所述，由于从实施例28所得本发明的人sOBM多克隆抗体可同样识别人sOBM和人OBM这两种抗原，所以被称为抗人OBM/sOBM多克隆抗体。又，同样由于从实施例28所得本发明的小鼠sOBM多克隆抗体可同样识别小鼠sOBM和小鼠OBM这两种抗原，所以被称为抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体。
实施例30
单克隆抗体的制备
使用实施例28所得精制人sOBM作为免疫用抗原。将该精制人sOBM溶于生理盐水中，使其浓度为10μg/ml。在制得的人sOBM溶液中加入等体积的福氏完全佐剂充分乳化后，在每只Balb/c小鼠的腹腔内注入抗原，1周3次，每次200μl，免疫小鼠。然后，在含有5μg/ml人sOBM的生理盐水中加入等体积的福氏不完全佐剂充分乳化，将乳化后溶液注入上述小鼠的腹腔内，1周4次，每次200μl，对小鼠进行追加免疫。第4次追加免疫的1周后，从每只Balb/c小鼠的静脉注入100μ含有10μg/ml人sOBM的生理盐水作加强免疫。最后一次免疫后的第3天摘取脾脏，分离出脾脏细胞，按照公知的方法(Koehler，G.and Milstein，C.，Nature，256，495(1975))使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3x63-AG8.653融合。融合结束后，将细胞悬浮液放置在含有次黄嘌呤、喋啶胺和脱氧胸腺嘧啶核酐的HAT培养基中培养10天，将骨髓瘤细胞杀灭，使杂交瘤细胞(融合细胞)出现后，将细胞悬浮液从HAT培养基转移到除去了喋啶胺的HT培养基中继续培养。
实施例31
杂交瘤细胞(融合细胞)的选择和克隆
在实施例30的细胞融合和培养开始10天后因可出现杂交瘤细胞，所以通过以下所述经过改进的固相ELISA，可对能识别人sOBM的有高亲和性的抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞进行选择。又，为了选择可同时识别人sOBM和小鼠sOBM的抗OBM单克隆抗体，作为固相ELISA用抗原，也可使用除人sOBM以外的实施例27所得的小鼠sOBM。将人sOBM和小鼠sOBM分别溶于0.1M碳酸氢钠溶液中，使它们的浓度为5μg/ml，然后在96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中分别加入50μl上述两种抗原溶液，于4℃静置一晚，使抗原固化。除去各孔中的抗原溶液，在各孔中分别加入200μl 50％ブロックエ-ス(雪印乳业公司)，于室温放置1小时，进行封闭。接着，各孔用含有0.1％吐温20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-P)洗净，在各孔中加入40μl牛血清(ハイクロ-ン公司)。然后，在各孔中加入10μl杂交瘤细胞培养上清液，在80％血清浓度下，于室温反应2小时。在80％血清存在下进行固相ELISA的目的是为了选择即使在高浓度蛋白质及来源于血清的对免疫反应有不良影响的物质等存在下也可与微量的人sOBM或小鼠sOBM结合的抗体，即选择可产生对人sOBM或小鼠sOBM有高亲和性的抗体的杂交瘤细胞。于室温反应2小时后，板用PBS-P洗净，在各孔中分别加入50μl用含有25％ブロックエ-ス的生理盐水稀释了5000倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG(KPL公司)，于室温反应2小时。板用PBS-P洗涤3次后，在各孔中分别加入50μl酶基质溶液(TMB，ScyTek公司)，于室温反应5分钟。然后，加入反应终止液(stoppingreagent，ScyTek公司)使酶反应停止。最后用微量板读数器(イムノリ-ダ-NJ2000，日本インタ-メッド公司)测定各孔在450nm时的吸光度，选出产生可识别人sOBM或小鼠sOBM的抗体的杂交瘤细胞。特别是选出产生显示高吸光度(OD450nm)的抗体的杂交瘤细胞，通过临界稀释法进行3～5次克隆，获得可稳定产生抗体的杂交瘤细胞(融合细胞)。从所得产生抗体的杂交瘤细胞株中进一步选出抗体产生性较高的杂交瘤细胞株。
实施例32
单克隆抗体的生产及精制
分别培养能分泌实施例31所得抗体，即产生对人sOBM具有高亲和性的抗体的杂交瘤细胞以及产生对小鼠sOBM也具有交叉亲和性的抗体的杂交瘤细胞，按1×106细胞/每只小鼠的量，将杂交瘤细胞移植到约1周前腹腔给注了异十八烷(アルドリッチケミカル公司)的Balb/c系小鼠的腹腔内。约2～3周后，取出蓄积的腹水，获得含有可识别本发明的人sOBM或小鼠sOBM的单克隆抗体的腹水。然后按照实施例28记载的用蛋白质A柱精制抗OBM/sOBM多克隆抗体的方法，通过蛋白质A柱(pharmacia公司)层析法从腹水中获得精制单克隆抗体。
实施例33
单克隆抗体的抗原特异性
对特异性识别人sOBM的单克隆抗体以及对人sOBM和小鼠sOBM具有交叉性作用的单克隆抗体，对以具有人sOBM、膜结合部位的完整人OBM和具有小鼠sOBM、膜结合部位的完整小鼠OBM为抗原时的抗原特异性进行测试。虽然获得了30余种单克隆抗体，但对其中具有代表性的单克隆抗体的测试结果如表1所示。其结果是，几乎全部可特异性识别人sOBM的抗sOBM单克隆抗体可识别具有膜结合部位的完整人OBM，但不能够识别小鼠sOBM和具有膜结合部位的完整小鼠OBM。
另一方面，虽然获得了既可识别人sOBM又可识别小鼠sOBM的单克隆抗体，但数量极少，这些抗体对人OBM和小鼠OBM具有交叉作用。其结果显示，存在人OBM和小鼠OBM共同的抗原识别部位，即表位抗原决定蔟。由于以人sOBM为免疫抗原制得的抗人sOBM单克隆抗体同样可识别膜结合型完整蛋白质人OBM，所以，将抗人sOBM单克隆抗体命名为抗人OBM/sOBM单克隆抗体。
                    表1
抗体名     抗原
hsOBM  hOBM    msOBM   mOBM
H-OBM1     +     +    -   -
H-OBM2     +     +    -   -
H-OBM3     +     +    -   -
H-OBM4     +     +    -   -
H-OBM5     +     +    -   -
H-OBM6     +     +    -   -
H-OBM7     +     +    -   -
H-OBM8     +     +    -   -
H-OBM9     +     +    +   +
H-OBM10     +     +    -   -
H-OBM11     +     +    -   -
H-OBM12     +     +    -   -
H-OBM13     +     +    +   +
H-OBM14     +     +    -   -
(hsOBM：人体可溶性OBM，hOBM：人体膜结合型OBM，msOBM：小鼠可溶性OBM，mOBM：小鼠膜结合型OBM)
实施例34
测定单克隆抗体的型和亚型
用免疫球蛋白型和亚型分析试剂盒(アマシャム公司)对本发明的单克隆抗体型和亚型进行测定。该测定按照试剂盒说明书所示方法进行。对具有代表性的单克隆抗体的测定结果如表2所示。大多数抗人OBM/sOBM单克隆抗体为IgG1，其他还存在IgG2a和IgG2b。又，任何一种抗体的轻链都是κ链。
                             表2
抗体名     IgG1    IgG2a  IgG2b   IgG3   IgA     κ
H-OBM8     -    +  -   -   -     +
H-OBM9     +    -  -   -   -     +
H-OBM10     +    -  -   -   -     +
H-OBM11     +    -  -   -   -     +
H-OBM12     -    -  +   -   -     +
H-OBM13     +    -  -   -   -     +
H-OBM14     +    -  -   -   -     +
实施例35
单克隆抗体的解离常数(KD值)的测定
按照公知的方法(Betrand Friguet et al.：Journal of Immunological Methods，77，305-319，1986)测定单克隆抗体的解离常数。即，用含有40％ブロックエ-ス和0.1％吐温20的0.4M Tris-HCl(pH7.4)将实施例32所得精制抗体稀释至5ng/ml，并在该抗体稀释液中等量加入经一次稀释过的实施例28所得精制的可溶性人OBM(hsOBM)，并使混合液中人OBM(hsOBM)的浓度转变为6.25ng/ml～10μg/ml，混合液于4℃静置15小时，使hsOBM与单克隆抗体结合。15小时后，用固相化了hsOBM(10μg/ml，100μl/孔)的固相化ELISA测定未与hsOBM结合的抗体，据其测定结果计算出单克隆抗体对hsOBM的解离常数。又，以上所述虽然是对应于hsOBM的单克隆抗体，但对与小鼠可溶性OBM(msOBM)也具有交叉作用的抗体的msOBM亲和性来说，在上述测定中也可用msOBM来代替hsOBM，同样进行测定。对各抗原显示出高亲和性、对酶免疫测定法和其他结合分析法有用的抗体的测定结果如表3所示。
                              表3
 抗体名  亚型   抗原     解离常数Kd(M)
 H-OBM1  IgG1(κ)   hsOBM   1×10-11＜Kd＜1×10-10
 H-OBM4  IgG1(κ)   hsOBM   1×10-11＜Kd＜1×10-10
 H-OBM9  IgG1(κ)   hsOBM   1×10-9＜Kd＜1×10-8
 H-OBM9  IgG1(κ)   msOBM   1×10-8＜Kd＜1×10-7
其结果是，人可溶性OBM(hsOBM)的特异性抗体H-OBM1和H-OBM4的解离常数(Kd)为10-11M，这表明它们与hsOBM具有极高的亲和性。另一方面，既可识别hsOBM又可识别小鼠可溶性OBM(msOBM)的抗体H-OBM9的Kd值，对应于msOBM为10-8M，对应于hsOBM为10-9M。又，可识别表1中记载的两种抗原的另一抗体H-OBM13对应于这两种抗原的解离常数与H-OBM9没有差别，这两种抗体的亚型也一致，所以，它们可能是识别同一表位抗原决定簇的同一抗体。
实施例36
使用抗人OBM/sOBM单克隆抗体的双抗体夹心ELISA对人OBM和sOBM 进行测定的方法
分别以实施例35所得2种高亲和性单克隆抗体H-OBM1和H-OBM4为固相抗体和酶标记抗体构筑双抗体夹心ELISA。使用马来酰胺活化过氧化物酶(ピアス公司)进行抗体标记。将H-OBM1抗体溶于0.1M碳酸氢钠溶液中，使它们的浓度为10μg/ml，然后在96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中分别加入100μl，于4℃静置一晚，使其固化。除去各孔中的溶液，在各孔中分别加入300μl 50％ブロックエ-ス，于室温放置2小时，进行封闭。接着，各孔用含有0.1％吐温20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-P)洗净，将人体可溶性sOBM和人OBM分别溶于含有40％ブロックエ-ス(雪印乳业公司)和0.1％吐温20(和光纯药公司)的0.4M Tris-HCl(pH 7.4)(一次反应缓冲液)中，稀释，调制成各种浓度的受验溶液。在各孔中分别加入100μl调制成各种浓度的受验溶液，于室温反应2小时。2小时后，板用PBS-P洗净，在各孔中加入100μl经过含有25％ブロックエ-ス和0.1％吐温的0.2M Tris-HCl(pH 7.4)(二次反应缓冲液)稀释的POD标记H-OBM4抗体，于室温反应2小时。板用PBS-P洗净后，在各孔中分别加入100μl酶基质溶液(TMB，ScyTek公司)，使其显色，然后，在各孔中加入100μl反应终止液(stopping reagent，ScyTek公司)使酶反应停止。最后用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度，其结果如图27所示。
从上述结果可看出，使用实施例35所得的2种高亲和性抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM1和H-OBM4构筑而成的双抗体夹心ELISA可同时识别人OBM和人sOBM，它们能够以1.25～2.5×10-3pmol/ml的测定灵敏度(分子量约40KDa的人OBM约为50～100pg/ml，分子量约32KDa的人sOBM约为40～80pg/ml)测定极为微量的人OBM和人sOBM。而且，产生这两种抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM1和H-OBM4的杂交瘤细胞被命名为H-OBM1和H-OBM4，产生可识别小鼠OBM和小鼠sOBM，又具有破骨细胞形成抑制活性的抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM9的杂交瘤细胞被命名为H-OBM9。这些杂交瘤细胞于平成9年11月5日被保藏在国立生命科学和人体技术研究所，它们的保藏编号分别为FERM BP-6264(H-OBM1)、FERM BP-6265(H-OBM4)和FERMBP-6266(H-OBM9)。
实施例37
使用抗人OBM/sOBM单克隆抗体识别小鼠OBM和小鼠sOBM
以可识别实施例33和35所得小鼠OBM及小鼠sOBM的抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM9为固相抗体，实施例28所得抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体为酶标记抗体构筑双抗体夹心ELISA。与实施例35同样，用一次反应用缓冲液分别阶段性稀释小鼠OBM和小鼠sOBM，利用与实施例36同样的方法对小鼠OBM及小鼠sOBM进行测定。其结果如图28所示。从上述结果可看出，通过使用可识别本发明小鼠OBM和小鼠sOBM的本发明抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM9，能够同样测定小鼠OBM和小鼠sOBM。如实施例35的结果所示，抗人OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM9对小鼠sOBM的解离常数较高，即对于小鼠sOBM的亲和性较弱，所以，该ELISA的小鼠OBM(分子量约40KDa)及小鼠sOBM(分子量约32KDa)的测定灵敏度约为25×10-3pmol/ml(小鼠OBM约1ng/ml，小鼠sOBM约0.8ng/ml)。
实施例38
抗OBM/sOBM抗体的破骨细胞形成抑制活性试验
众所周知，通过共同培养小鼠脾细胞和ST2细胞(来源于小鼠骨髓的间质细胞)，可诱导破骨细胞样细胞(OCL)(Endocrinology，125，1805-1813(1989))。所以，在上述共培养体系中添加OBM/sOBM抗体时，可研究该抗体是否会抑制对OCL的诱导。由于小鼠OBM表达于该共培养体系，所以，实施例所用的抗体为识别小鼠OBM的兔抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体，以及可同时识别人OBM和小鼠OBM这两种抗原的人源型抗OBM/sOBM单克隆抗体H-OBM9。将经过含有10％FCS的α-MEM阶段性稀释的各种抗OBM抗体以700μl/孔的标准加入24孔板中(ヌンク公司)，然后以350μl/孔的标准加入悬浮于上述培养基的雄性小鼠脾细胞(2×106/ml)。接着，将经过胰蛋白酶处理的ST2细胞悬浮于含有4×10-8M维生素D3和4×10-7M地塞米松的上述培养基(8×104％ells/ml)中，然后以350μl/孔的标准加入各孔，于37℃培养6天。培养后的板用PBS洗涤1次后，于室温在50％乙醇和50％丙酮的混合液中固定1分钟。使板风干后，按照LEUKOCYTEACID PHOSPHATASE试剂盒(Sigma公司)的说明书所述，以500μl/孔的标准添加基质溶液，于37℃反应55分钟。该反应对只显现作为破骨细胞特异性标记的耐酒石酸的酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞染色。板用蒸馏水洗涤1次后，风干，获得TRAP阳性的细胞数。其结果如表4所示。从上述结果可看出，兔抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体及识别小鼠OBM的抗人OBM/sOBM单克隆抗体随着抗体浓度的变化对OCL诱导有抑制作用。这些抗体与破骨细胞形成因子、OCIF/OPG具有同样的破骨细胞形成抑制活性，作为骨代谢异常症的治疗剂将很有用。
                        表4
  抗体添加量(ng/ml)   TRAP阳性多核细胞数
  兔抗小鼠OBM/sOBM多克隆抗体     小鼠抗人OBM/sOBM单克隆抗体(H-OBM9)
  0   1155±53     1059±45
  10   510±24     650±25
  100   10±3     15±4
                    (平均值±标准偏差，n＝3)
实施例39
Trx-OBM的诱导人体破骨细胞形成活性
从健康成人的静脉采得全血，用Histapaque试剂盒(sigma公司)，按照所附说明书用密度梯度法制备单核细胞。将该单核细胞悬浮于含有10-7M地塞米松、20ng/ml巨嗜细胞集落刺激因子(绿十字公司)、10％胎牛血清和实施例15所得精制Trx-OBM(0～100ng/ml)的α-MEM中，使其浓度为1.3×106/ml，将该悬浮液以300μl/孔的标准加入48孔板的各孔中，于37℃培养3天。再用上述培养基更换后，再于37℃培养4天。然后按照实施例5所示方法从经培养的细胞中选出表现为耐酒石酸酸性磷酸酯酶活性(TRAP活性)的细胞，对其进行染色，接着用显微镜观察被染色的多核细胞数量。其结果如图29所示。从上述结果可看出，在没有加入Trx-OBM的孔中几乎没有检出显现TRAP活性的细胞，而添加了Trx-OBM的孔，随着浓度的增加检出了TRAP阳性多核细胞。又，这些TRAP阳性多核细胞的作为破骨细胞的标记Vn受体也是阳性。此外，如果上述培养过程是在静置于48孔板上的象牙切片上进行的，则只有在Trx-OBM存在下才可在象牙切片上形成吸收点。这样就可说明Trx-OBM具有诱导破骨细胞形成的活性。
实施例40
抗OBM/sOBM抗体的骨吸收抑制活性
在每只妊娠15天的ddY小鼠(日本SLC公司)的皮下注射25μCi[45Ca]-CaCl2溶液(Amersham公司)，胎骨用45Ca标记。第二天，处死小鼠，打开腹腔，从子宫中取出胎鼠。摘取胎鼠的前肢，然后剥开皮肤和肌肉摘取长骨，接着除去软管，只留下长骨的骨干部分。将每根骨干分别悬浮在含有加入到24孔板中的0.5ml培养液(0.2％牛血清白蛋白(sigma公司))的BGJb培养基(GIBCO BRL公司)中，于37℃在5％ CO2存在下培养24小时。前培养结束后，将长骨转移到含有各种骨吸收因子(维生素D3、前列腺素E2、甲状旁腺激素、白介素1α)以及正常兔子IgG(100μg/ml，作为对照)或实施例28所得含有兔抗OBM/sOBM多克隆抗体的新培养液(0.5ml)中，再培养72小时。培养结束后，将长骨放入0.5ml 5％三氯乙酸水溶液(和光纯药公司)中，于室温进行处理，使其脱钙，历时3小时以上。然后在培养液和三氯乙酸萃取液(共0.5ml)中加入5ml闪烁剂(AQUASOL-2，PACKARD公司)，测定45Ca的放射活性，由骨吸收算出游离于培养液的45Ca的比例。其结果如图30～图33所示。从上述结果可看出，维生素D3(10-8M)可使骨吸收活性有所提高，但加入了兔抗OBM/sOBM多克隆抗体后，随着浓度的增加会抑制维生素D3的骨吸收，当浓度达到100μg/ml时，完全抑制(图30)。又，前列腺素E2(10-6M)或甲状旁腺激素(100ng/ml)虽然也可使骨吸收活性提高，但加入了兔抗OBM/sOBM多克隆抗体(100μg/ml)后，也几乎全部抑制前列腺素E2或甲状旁腺激素的骨吸收(图31和32)。另一方面，作为阳性对照而使用的正常兔子IgG(100μg/ml)对前列腺素E2或甲状旁腺激素的骨吸收没有影响。又，白介素1α也能够引起骨吸收，但兔抗OBM/sOBM多克隆抗体也可抑制其作用(图23)。从上述结果可看出，本发明抗体作为骨吸收抑制物很有效。对小鼠抗人OBM/sOBM抗体H-OBM9进行同样试验的结果是，它与兔抗OBM/sOBM多克隆抗体具有几乎同等的骨吸收抑制活性。
产业上利用的可能性
本发明提供了与破骨细胞形成抑制因子(Osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)结合的新型蛋白质，其制备方法，使用该蛋白质、筛选可调节蛋白质表达的物质的方法，筛选抑制或改变该蛋白质作用的物质的方法，与该蛋白质结合、传递其作用的受体的筛选方法，以及包含由上述筛选方法获得的物质的医药组合物，该蛋白质的抗体，以及使用了该抗体的骨代谢异常症的治疗剂。
本发明还提供了编码与破骨细胞形成抑制因子结合的新型蛋白质(OCIF结合分子)的DNA，由该DNA编码的氨基酸序列的蛋白质，使用该DNA通过遗传工程方法制备与OCIF特异性结合的蛋白质的方法，以及含有该蛋白质的骨代谢治疗剂。而且，还通过了调节OCIF结合分子表达的筛选方法，与OCIF结合分子结合、抑制或改变其作用的物质的筛选方法，与OCIF结合分子结合、传递其作用的受体的筛选方法，以及包含通过上述筛选方法而获得的物质的医药组合物。
本发明进一步提供了编码与破骨细胞形成抑制因子OCIF结合的新型蛋白质(来源于人的OCIF结合分子，人OBM)的DNA，由该DNA编码的氨基酸序列的蛋白质，使用该DNA通过遗传工程方法制备具有与OCIF特异性结合的性质、具有支持、促进破骨细胞分化和成熟的生物活性的蛋白质的方法，以及含有该蛋白质的骨代谢治疗剂。而且，还通过了调节OCIF结合分子表达的筛选方法，与OCIF结合分子结合、抑制或改变其作用的物质的筛选方法，与OCIF结合分子结合、传递其作用的受体的筛选方法，以及包含通过上述筛选方法而获得的物质的医药组合物。还提供了来源于人体的OCIF结合蛋白质的抗体及使用了该抗体的骨代谢异常症的预防及/或治疗剂。
本发明更进一步提供了识别与OCIF特异性结合的膜结合分子(OCIF bindingmolecule；OBM)蛋白质及缺损了膜结合部位的可溶性OBM(sOBM)这两种抗原的抗体(抗OBM/sOBM抗体)，其制备方法，使用了该抗体的OBM及sOBM的测定方法，以该抗体为有效成分的骨代谢异常症的预防/或治疗剂。
本发明的蛋白质或抗体作为医药品或研究、试验用试剂有用。
关于被保藏的微生物
(1)保藏微生物的保藏机构名称及其地址：
国立生命科学和人体技术研究所
日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮政编码305)
保藏日：平成9年5月23日
保藏号：FERM BP-5953
(2)保藏微生物的保藏机构名称及其地址：
国立生命科学和人体技术研究所
日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮政编码305)
保藏日：平成9年8月13日
保藏号：FERM BP-6058
(3)保藏微生物的保藏机构名称及其地址：
国立生命科学和人体技术研究所
日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮政编码305)
保藏日(原保藏日)：平成9年11月5日
保藏号：FERM BP-6264
(4)保藏微生物的保藏机构名称及其地址：
国立生命科学和人体技术研究所
日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮政编码305)
保藏日(原保藏日)：平成9年11月5日
保藏号：FERM BP-6265
(5)保藏微生物的保藏机构名称及其地址：
国立生命科学和人体技术研究所
日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮政编码305)
保藏日(原保藏日)：平成9年11月5日
保藏号：FERM BP-6266序列号1序列长度：316序列类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：蛋白质序列：Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser1               5                  10                  15Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu
            20                  25                  30His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala
            35                  40                  45Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln
            50                  55                  60Val Val Cys Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met
            65                  70                  75Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg
            80                  85                  90Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu
            95                  100                 105Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln
            110                 115                 120Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly
            125                 130                 135Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser Trp
            140                 145                 150Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala
            155                 160                 165His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys
            170                 175                 180Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile
            185                 190                 195Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln Asp
            200                 205                 210Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu
            215                 220                 225Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr
            230                 235                 240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met
            245                 250                 255Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His
            260                 265                 270Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly
            275                 280                 285Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro
            290                 295                 300Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile
            305                 310                 315Asp316序列号2序列长度：1538序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：由mRNA逆转录得到cDNA序列：GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG    60TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG    120CGCCATGCGC CGGGCCAGCC GAGACTACGG CAAGTACCTG CGCAGCTCGG AGGAGATGGG    180CAGCGGCCCC GGCGTCCCAC ACGAGGGTCC GCTGCACCCC GCGCCTTCTG CACCGGCTCC    240GGCGCCGCCA CCCGCCGCCT CCCGCTCCAT GTTCCTGGCC CTCCTGGGGC TGGGACTGGG    300CCAGGTGGTC TGCAGCATCG CTCTGTTCCT GTACTTTCGA GCGCAGATGG ATCCTAACAG    360AATATCAGAA GACAGCACTC ACTGCTTTTA TAGAATCCTG AGACTCCATG AAAACGCAGG    420TTTGCAGGAC TCGACTCTGG AGAGTGAAGA CACACTACCT GACTCCTGCA GGAGGATGAA    480ACAAGCCTTT CAGGGGGCCG TGCAGAAGGA ACTGCAACAC ATTGTGGGGC CACAGCGCTT    540CTCAGGAGCT CCAGCTATGA TGGAAGGCTC ATGGTTGGAT GTGGCCCAGC GAGGCAAGCC    600TGAGGCCCAG CCATTTGCAC ACCTCACCAT CAATGCTGCC AGCATCCCAT CGGGTTCCCA   660TAAAGTCACT CTGTCCTCTT GGTACCACGA TCGAGGCTGG GCCAAGATCT CTAACATGAC   720GTTAAGCAAC GGAAAACTAA GGGTTAACCA AGATGGCTTC TATTACCTGT ACGCCAACAT   780TTGCTTTCGG CATCATGAAA CATCGGGAAG CGTACCTACA GACTATCTTC AGCTGATGGT   840GTATGTCGTT AAAACCAGCA TCAAAATCCC AAGTTCTCAT AACCTGATGA AAGGAGGGAG   900CACGAAAAAC TGGTCGGGCA ATTCTGAATT CCACTTTTAT TCCATAAATG TTGGGGGATT   960TTTCAAGCTC CGAGCTGGTG AAGAAATTAG CATTCAGGTG TCCAACCCTT CCCTGCTGGA   1020TCCGGATCAA GATGCGACGT ACTTTGGGGC TTTCAAAGTT CAGGACATAG ACTGAGACTC   1080ATTTCGTGGA ACATTAGCAT GGATGTCCTA GATGTTTGGA AACTTCTTAA AAAATGGATG   1140ATGTCTATAC ATGTGTAAGA CTACTAAGAG ACATGGCCCA CGGTGTATGA AACTCACAGC   1200CCTCTCTCTT GAGCCTGTAC AGGTTGTGTA TATGTAAAGT CCATAGGTGA TGTTAGATTC   1260ATGGTGATTA CACAACGGTT TTACAATTTT GTAATGATTT CCTAGAATTG AACCAGATTG   1320GGAGAGGTAT TCCGATGCTT ATGAAAAACT TACACGTGAG CTATGGAAGG GGGTCACAGT   1380CTCTGGGTCT AACCCCTGGA CATGTGCCAC TGAGAACCTT GAAATTAAGA GGATGCCATG   1440TCATTGCAAA GAAATGATAG TGTGAAGGGT TAAGTTCTTT TGAATTGTTA CATTGCGCTG   1500GGACCTGCAA ATAAGTTCTT TTTTTCTAAT GAGGAGAG                           1538序列号3序列长度：21序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：AAACGCAAAA AACCAGAAAG G                   21序列号4序列长度：17序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：GTAAAACGAC GGCCAGT            17序列号5序列长度：17序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：CAGGAAACAG CTATGAC            17序列号6序列长度：22序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：AAGCCCAAA GTACGTCGCA TC       22序列号7序列长度：26序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：CGAAGCTTTC GAGCGCAGAT GGATCC       26序列号8序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：CCTCTAGAGT CTATGTCCTG AAGTTTG      27序列号9序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：ATCAGAAGAC AGCACTCACT              20序列号10序列长度：33序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：GGGGTCGACC TAGGACATCC ATGCTAATGT TCC    33序列号11序列长度：317序列类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：蛋白质序列：Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
             5                  10                  15Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
        20                  25                  30Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
    35                  40                  45Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50                  55                  60Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser65                  70                  75                  80Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
            85                  90                  95Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
        100                 105                 110Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
    115                 120                 125Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130                 135                 140Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu145                 150                 155                 160Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
            165                 170                 175Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
        180                 185                 190Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
    195                 200                 205Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210                 215                 220His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val225                 230                 235                 240Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
            245                 250                 255Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
        260                 265                 270Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
    275                 280                 285Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp
290                 295                 300Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp305                 310                 315序列号12序列长度：954序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：由mRNA逆转录获得cDNA序列：ATGCGCCGCG CCAGCAGAGA CTACACCAAG TACCTGCGTG GCTCGGAGGA GATGGGCGGC   60GGCCCCGGAG CCCCGCACGA GGGCCCCCTG CACGCCCCGC CGCCGCCTGC GCCGCACCAG   120CCCCCTGCCG CCTCCCGCTC CATGTTCGTG GCCCTCCTGG GGCTGGGGCT GGGCCAGGTT   180GTCTGCAGCG TCGCCCTGTT CTTCTATTTC AGAGCGCAGA TGGATCCTAA TAGAATATCA   240GAAGATGGCA CTCACTGCAT TTATAGAATT TTGAGACTCC ATGAAAATGC AGATTTTCAA   300GACACAACTC TGGAGAGTCA AGATACAAAA TTAATACCTG ATTCATGTAG GAGAATTAAA   360CAGGCCTTTC AAGGAGCTGT GCAAAAGGAA TTACAACATA TCGTTGGATC ACAGCACATC   420AGAGCAGAGA AAGCGATGGT GGATGGCTCA TGGTTAGATC TGGCCAAGAG GAGCAAGCTT   480GAAGCTCAGC CTTTTGCTCA TCTCACTATT AATGCCACCG ACATCCCATC TGGTTCCCAT   540AAAGTGAGTC TGTCCTCTTG GTACCATGAT CGGGGTTGGG CCAAGATCTC CAACATGACT   600TTTAGCAATG GAAAACTAAT AGTTAATCAG GATGGCTTTT ATTACCTGTA TGCCAACATT   660TGCTTTCGAC ATCATGAAAC TTCAGGAGAC CTAGCTACAG AGTATCTTCA ACTAATGGTG   720TACGTCACTA AAACCAGCAT CAAAATCCCA AGTTCTCATA CCCTGATGAA AGGAGGAAGC   780ACCAAGTATT GGTCAGGGAA TTCTGAATTC CATTTTTATT CCATAAACGT TGGTGGATTT   840TTTAAGTTAC GGTCTGGAGA GGAAATCAGC ATCGAGGTCT CCAACCCCTC CTTACTGGAT   900CCGGATCAGG ATGCAACATA CTTTGGGGCT TTTAAAGTTC GAGATATAGA TTGA         954序列号13序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：GGCGTACGCA GAGCGAGAT GGATCCT      27序列号14序列长度：34序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成DNA)序列：GGGGTCGACC ATCCAGGAAA TATCATAACA CTCC    34序列号15序列长度：951序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：由mRNA逆转录获得cDNA序列：ATGCGCCGGG CCAGCCGAGA CTACGGCAAG TACCTGCGCA GCTCGGAGGA GATGGGCAGC   60GGCCCCGGCG TCCCACACGA GGGTCCGCTG CACCCCGCGC CTTCTGCACC GGCTCCGGCG   120CCGCCACCCG CCGCCTCCCG CTCCATGTTC CTGGCCCTCC TGGGGCTGGG ACTGGGCCAG   180GTGGTCTGCA GCATCGCTCT GTTCCTGTAC TTTCGAGCGC AGATGGATCC TAACAGAATA   240TCAGAAGACA GCACTCACTG CTTTTATAGA ATCCTGAGAC TCCATGAAAA CGCAGGTTTG   300CAGGACTCGA CTCTGGAGAG TGAAGACACA CTACCTGACT CCTGCAGGAG GATGAAACAA   360GCCTTTCAGG GGGCCGTGCA GAAGGAACTG CAACACATTG TGGGGCCACA GCGCTTCTCA   420GGAGCTCCAG CTATGATGGA AGGCTCATGG TTGGATGTGG CCCAGCGAGG CAAGCCTGAG   480GCCCAGCCAT TTGCACACCT CACCATCAAT GCTGCCAGCA TCCCATCGGG TTCCCATAAA   540GTCACTCTGT CCTCTTGGTA CCACGATCGA GGCTGGGCCA AGATCTCTAA CATGACGTTA   600AGCAACGGAA AACTAAGGGT TAACCAAGAT GGCTTCTATT ACCTGTACGC CAACATTTGC   660TTTCGGCATC ATGAAACATC GGGAAGCGTA CCTACAGACT ATCTTCAGCT GATGGTGTAT   720GTCGTTAAAA CCAGCATCAA AATCCCAAGT TCTCATAACC TGATGAAAGG AGGGAGCACG   780AAAAACTGGT CGGGCAATTC TGAATTCCAC TTTTATTCCA TAAATGTTGG GGGATTTTTC   840AAGCTCCGAG CTGGTGAAGA AATTAGCATT CAGGTGTCCA ACCCTTCCCT GCTGGATCCG   900GATCAAGATG CGACGTACTT TGGGGCTTTC AAAGTTCAGG ACATAGACTG A            951序列号16序列长度：244序列类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：蛋白质序列：Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe1               5                  10                  15Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr
        20                  25                  30Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln
    35                  40                  45Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro
50                  55                  60Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp65                  70                  75                  80Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr
            85                  90                  95Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser
        100                 105                 110Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu
    115                 120                 125Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr
130                 135                 140Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr145                 150                 155                 160Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile
            165                 170                 175Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser
        180                 185                 190Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe
    195                 200                 205Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser
210                 215                 220Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val225                 230                 235                 240Gln Asp Ile Asp序列号17序列长度：246序列类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：蛋白质序列：Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Gly Thr His Cys Ile1               5                  10                  15Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr
        20                  25                  30Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile
    35                  40                  45Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val
50                  55                  60Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp65                  70                  75                  80Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His
            85                  90                  95Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser
        100                 105                 110Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met
    115                 120                 125Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr
130                 135                 140Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu145                 150                 155                 160Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile
            165                 170                 175Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr
        180                 185                 190Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly
    195                 200                 205Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn
210                 215                 220Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe225                 230                 235                 240Lys Val Arg Asp Ile Asp
            245序列号18序列长度：735序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：由mRNA逆转录获得cDNA序列：GCGCAGATGG ATCCTAACAG AATATCAGAA GACAGCACTC ACTGCTTTTA TAGAATCCTG   60AGACTCCATG AAAACGCAGG TTTGCAGGAC TCGACTCTGG AGAGTGAAGA CACACTACCT   120GACTCCTGCA GGAGGATGAA ACAAGCCTTT CAGGGGGCCG TGCAGAAGGA ACTGCAACAC   180ATTGTGGGGC CACAGCGCTT CTCAGGAGCT CCAGCTATGA TGGAAGGCTC ATGGTTGGAT   240GTGGCCCAGC GAGGCAAGCC TGAGGCCCAG CCATTTGCAC ACCTCACCAT CAATGCTGCC   300AGCATCCCAT CGGGTTCCCA TAAAGTCACT CTGTCCTCTT GGTACCACGA TCGAGGCTGG   360GCCAAGATCT CTAACATGAC GTTAAGCAAC GGAAAACTAA GGGTTAACCA AGATGGCTTC   420TATTACCTGT ACGCCAACAT TTGCTTTCGG CATCATGAAA CATCGGGAAG CGTACCTACA   480GACTATCTTC AGCTGATGGT GTATGTCGTT AAAACCAGCA TCAAAATCCC AAGTTCTCAT   540AACCTGATGA AAGGAGGGAG CACGAAAAAC TGGTCGGGCA ATTCTGAATT CCACTTTTAT   600TCCATAAATG TTGGGGGATT TTTCAAGCTC CGAGCTGGTG AAGAAATTAG CATTCAGGTG   660TCCAACCCTT CCCTGCTGGA TCCGGATCAA GATGCGACGT ACTTTGGGGC TTTCAAAGTT   720CAGGACATAG ACTGA                                                    735序列号19序列长度：741序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：由mRNA逆转录获得cDNA序列：GCGCAGATGG ATCCTAATAG AATATCAGAA GATGGCACTC ACTGCATTTA TAGAATTTTG    60AGACTCCATG AAAATGCAGA TTTTCAAGAC ACAACTCTGG AGAGTCAAGA TACAAAATTA    120ATACCTGATT CATGTAGGAG AATTAAAGAG GCCTTTCAAG GAGCTGTGCA AAAGGAATTA   180CAACATATCG TTGGATCAGA GCACATCAGA GCAGAGAAAG CGATGGTGGA TGGCTCATGG   240TTAGATCTGG CCAAGAGGAG CAAGCTTGAA GCTCAGCCTT TTGCTCATCT CACTATTAAT   300GCCACCGACA TCCCATCTGG TTCCCATAAA GTGAGTCTGT CCTCTTGGTA CCATGATCGG   360GGTTGGGCCA AGATCTCCAA CATGACTTTT AGCAATGGAA AACTAATAGT TAATCAGGAT   420GGCTTTTATT ACCTGTATGC CAACATTTGC TTTCGACATC ATGAAACTTC AGGAGACCTA   480GCTACAGAGT ATCTTCAACT AATGGTGTAC GTCACTAAAA CCAGCATCAA AATCCCAAGT   540TCTCATACCC TGATGAAAGG AGGAAGCACC AAGTATTGGT CAGGGAATTC TGAATTCCAT   600TTTTATTCCA TAAACGTTGG TGGATTTTTT AAGTTACGGT CTGGAGAGGA AATCAGCATC   660GAGGTCTCCA ACCCCTCCTT ACTGGATCCG GATCAGGATG CAACATACTT TGGGGCTTTT   720AAAGTTCGAG ATATAGATTG A                                             741

Claims (18)

1.一种抗体，其特征在于，可识别与破骨细胞形成抑制因子OCIF特异性结合的膜结合蛋白质分子，即OBM，及/或缺损了该膜结合部位的可溶性OBM，即sOBM，所述OBM或sOBM具有选自SEQID NO：1，11，16或17所示的氨基酸序列，所述抗体具有以下性质：
a.分子量：约150,000Da；
b.亚型：IgG1或IgG2；
c.轻链：κ链，
该抗体具有的解离常数为10-7或以下。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征还在于，可识别小鼠OBM及/或小鼠sOBM。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征还在于，可识别人OBM及/或人sOBM。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征还在于，为多克隆抗体。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征还在于，为单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征还在于，对人OBM及/或人sOBM及/或小鼠OBM及/或小鼠sOBM具有交叉作用。
7.根据权利要求1-6所述的抗体，它具有中和OBM或sOBM的生物活性的活性。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述OBM或sOBM的生物活性是诱导破骨细胞形成或骨吸收的活性。
9.根据权利要求1-6所述的抗体，其中所述抗体是人型抗体。
10.一种多克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用小鼠或人OBM或sOBM对动物进行免疫，然后精制动物血液，所述小鼠或人OBM或sOBM具有选自SEQ IDNO：1，11，16或17所示的氨基酸序列。
11.杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为FERM BP-6264、FERM BP-6265、FERM BP-6266。
12.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，培养权利要求11所述杂交瘤细胞，使单克隆抗体产生于培养液，然后从上述培养液精制并回收所述单克隆抗体。
13.权利要求1所述抗体在测定OBM或sOBM中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，以权利要求1所述抗体为固相抗体及酶标记抗体。
15.一种骨代谢异常症的预防及/或治疗剂，其特征在于，以权利要求1所述抗体为有效成分。
16.根据权利要求15所述的预防及/或治疗剂，其中所述骨代谢疾病选自骨质疏松症、高钙血症、佩吉特骨疾病、肾性骨发育不全、慢性风湿病及变形性关节炎。
17.权利要求1所述的抗体在制备治疗/预防骨代谢疾病的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述骨代谢疾病选自骨质疏松症、高钙血症、佩吉特骨疾病、肾性骨发育不全、慢性风湿病及变形性关节炎。
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