WO1998046644A1

WO1998046644A1 - Novel protein and process for producing the same

Info

Publication number: WO1998046644A1
Application number: PCT/JP1998/001728
Authority: WO
Inventors: Kyoji Yamaguchi; Hisataka Yasuda; Nobuaki Nakagawa; Nobuyuki Shima; Masahiko Kinosaki; Eisuke Tsuda; Masaaki Goto; Kazuki Yano; Akihiro Tomoyasu; Fumie Kobayashi; Naohiro Washida; Ken Takahashi; Tomonori Morinaga; Kanji Higashio
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 1998-10-22
Also published as: AU735355B2; CA2781623A1; LU91759I9; KR100496063B1; US20030176647A1; AU735355C; CN1138786C; HU0800628D0; JP3523650B2; US20050003457A1; EP0911342A1; PT911342E; US7192718B2; FR10C0048I2; RU2238949C2; IL127115A; US7449185B2; KR20040004509A; US20120329671A1; NO2010021I1

Description

明細書

新規蛋白質及びその製造方法

技術分野

本発明は、破骨細胞形成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibi tory factor；以下、 0CIFということがある）に結合する新規な蛋白質（0CIF結合分子；以下 0BM ということがある）、及びその製造方法に関する。

また本発明は、該蛋白質をコードする DNA、この DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物に関する。

さらに本発明は、該蛋白質びその DNAを用いた、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリ一ニング方法、これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成物に関する。

またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬に関する。

背景技術

骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の、総合された活性に依存している。骨代謝異常は、骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより発生すると考えられている。骨代謝の異常を伴う疾患としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページエツト病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及び変形性関節炎などが知られている。これらの骨代謝異常疾患の代表として骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわることにより発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムについては未だ完全には解明されていないが、骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の原因となり、この疾患は社会問題にもなつており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は、骨形成の促進、骨吸収の抑制、あるいはこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する骨芽細胞の増殖、分化、機能を促進すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を抑制すること、あるいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制することにより促進されると期待される。このような活性を有するホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質について、現在精力的な探索及び開発研究が進められている。

すでに、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、カルシトニン製剤、活性型ビタミン D₃製剤、エストラジオールを含有するホルモン製剤、イブリフラボン、ビタミン K₂、ビスフォスフォネート系化合物などがあり、さらに、より副作用が少なく、有効性に優れた治療薬の開発を目指して活性型ビ夕ミン D₃誘導体、エストラジオール誘導体、第 2世代または第 3世代のビスフォスフォネート系化合物などの臨床試験が実施されている。

しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも満足出来るものではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が期待されている。また、骨代謝疾患の治療に使用されている薬剤の中には、その副作用により治療可能な疾患が限定されているものもある。更に現在、骨粗鬆症などの骨代謝疾患の治療には、複数の薬剤を同時に使用する多剤併用療法が主流になってきている。このような観点から、従来の医薬品とは異なった作用メカ二ズムを持ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の少ない医薬品の開発が期待されている。

前述したように、骨代謝を担当する細胞は骨芽細胞と破骨細胞である。これらの細胞は互いに密接に相互作用していることが知られており、この現象は力ップリングと呼ばれている。即ち、破骨細胞の分化、成熟には骨芽細胞様ストローマ細胞が分泌するサイト力イン類、インターロイキン 1 (IL- 1)、 3 (IL-3)、 6 (IL- 6)、 11 (IL- 11)、顆粒球マクロファージコロニ一刺激因子（GM- CSF) 、マクロファージコロニー刺激因子（M- CSF)、インタ一フヱロンガンマ一（IFN-7) 、腫瘍壊死因子ひ（TNF- a) 、トランスフォーミング増殖因子 3 (TGF-^) などが促進的又は抑制的に作用することが報告されている（Raisz:Disorders of Bone and M ineral Metabolism, 287-311, 1992; Suda et al.： Princeples of Bone Biolog y, 87-102， 1996; Suda et al.： Endocrine Reviews, 4， 266-270, 1955， Lacey et al. : Endocrinology, 186， 2369-2376, 1995) 。骨芽細胞様ストローマ細胞は、未熟な破骨細胞前駆細胞や破骨細胞との細胞間接着により、それぞれ破骨細胞の分化、成熟や成熟破骨細胞による骨吸収などの機能発現に重要な役割を演じていることが知られている。この細胞間接着による破骨細胞形成に関与する因子として、骨芽細胞様ストローマ細胞の膜上に発現される破骨細胞分化誘導因子（ osteoclast differentiation factor, ODF) (Suda et al.： Endocrine Rev. 13,

66-80, 1992; Suda et al.： Bone 17， 87S-91S, 1995)という分子が仮想されており、この仮説によれば破骨細胞の前駆細胞に 0DFのレセプターが存在している。しかし、 0DF及びこのレセプ夕一とも未だ精製及び同定されておらず、それらの性質、作用機作、及び構造に関する報告もない。このように、破骨細胞の分化、成熟のメカニズムは未だ十分に解明されておらず、このメカニズムの解明は基礎医学領域に多大な貢献をするだけでなく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨代謝異常症治療薬の開発にも貢献することが期待される。本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意探索を進めた結果、ヒト胎児肺線維芽細胞、 IMR-90 (ATCC CCL186)の培養液中に破骨細胞形成抑制因子（osteoclasto genesis inhibi tory factor, OCIF)を見出した（W096/26217号) 。

さらに、本発明者らは、 0CIFの DNAクローニング、動物細胞を用いた遺伝子組み換え型 0CIFの生産、遺伝子組み換え型 0CIFによる in vivo 薬効（骨代謝改善効果）の確認などに成功した。 0CIFは、従来の医薬品よりも有効性が高くかつ副作用が少ない、骨代謝異常に関連する疾患の予防及び治療剤として期待されている。発明の開示

本発明者らは破骨細胞形成抑制因子 0CIFを用い、その結合蛋白質の存在を鋭意探索した結果、 0CIF結合蛋白質が活性型ビタミン D₃や副甲状腺ホルモン（parath yroid hormone, PTH) などの骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現することを見出した。さらに、この 0CIF結合蛋白質の性質及びその生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、本発明を成すに至った。さらに、本発明蛋白質につき研究を重ねた結果、この新規な膜蛋白質は骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞との共培養系において、骨芽細胞様スト口一マ細胞による未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を担う重要な蛋白質であることを明らかにした。本発明における破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての蛋白質の同定及びその単離精製の成功により、本発明蛋白質を利用した、生体の骨代謝機構に基づいた新規な骨代謝異常症治療薬のスクリーニングを可能にした。

従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子 0CIFに結合する新規な蛋白質（0CIF結合分子； 0BM)、及びその製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、該蛋白質をコードする DNA、この DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。また、該蛋白質を含有する骨代謝異常症予防及び Z又は治療剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、該蛋白質を及びその DNAを用いた、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用を伝達するレセプタ一のスクリーニング方法、これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬を提供することを課題とする。

本発明蛋白質は、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。

即ち、

a. 親和性：破骨細胞开成抑制因子 (osteoclastogenesi s inhibi tory factor ； 0CIF) に特異的に結合し、高い親和性（細胞膜上での解離定数、 Kd値が 10— ^aM 以下）を有する。

b. 分子量：非還元条件下における SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量測定で、約 30, 000- 40， 000 の分子量を示し、又、，モノマータイプの 0CIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子尊は、約 90， 000-110, 000を示す。

c 生物活性：活性型ビタミン D₃及び副甲状腺ホルモン（PTH)などの、骨吸収促進因子の存在下でのマウス骨芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する。

破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミン D₃あるいは PTH存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、 ST2 とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明蛋白質の発現細胞は活性型ビ夕ミン D₃ 存在あるいは非存在下でそれぞれ培養したマウス骨芽細胞様ストローマ細胞あるいはマウス脾臓細胞への 0CIFの結合性を試験することにより調べることができる。本発明蛋白質は、活性型ビタミン D₃や PTHのような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。又、活性型ビタミン D₃存在下の上記共培養系に 0CIFを添加することにより 1 から 40 ng/mlの範囲で用量依存的に破骨細胞の形成が阻害されること、活性型ビ夕ミン D₃存在下で ST2細胞上に誘導される本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成の経時変化とがよく相関すること、又、 ST2 細胞に発現される本発明蛋白質の多寡と ST2細胞による破骨細胞形成支持能の強弱が一致し、 ST2細胞上の本発明蛋白質に 0CIFが結合することにより破骨細胞形成が完全に抑制されることから、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する生物活性（作用）を有する蛋白質として特定される。

本発明蛋白質の 0CIFに対する親和性は、 0CIFを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって評価することができる。 0CIFは、放射性同位元素による標識や蛍光標識などのような通常の蛋白質標識法を用いることによって標識することができる。例えば、 0CIFの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の ^{1 2 5} I標識が挙げられ、ョードジヱン法、クロラミン T法、及び酵素法などの標識法を利用することができる。このようにして得た標識 0CIF を用いた、 0CIFの動物細胞膜表面への結合性試験は常法に従い実施でき、又、結合性試験に用いる培地に標識 0CIFの 100倍から 400倍濃度未標識 0CIFを添加することにより、非特異的な結合量を測定することができる。 0CIFの特異的結合量は、標識 0CIFの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。細胞膜上に発現された本発明蛋白質の親和性は標識 0CIFの添加量を変えて試験を行い、特異的結合量を Scatchard plot で解析することによって評価される。このようにして求められた、本発明蛋白質の 0CIFに対する親和力は約 100- 500pMであり、本発明蛋白質はこのように破骨細胞形成抑制因子 0C IFに高い親和性（細胞膜上での解離定数、 Kd値が 10— ⁹M以下）を有する蛋白質として特定される。 0BM の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーや SDS-PAGE等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためには、 SDS- PAGEを用いるのが好ましく、 0BM は、還元条件下で約 40, 000(40， 000± 4, 000)の分子量を有する蛋白質として特定される。本発明蛋白質は、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2、マウス前脂肪細胞株 PA6、その他のヒト骨芽細胞様細胞株、あるいはヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物から採取し濃縮した骨芽細胞様細胞などから得ることができる。又、これらの細胞に本発明蛋白質を発現させるために必要な誘導物質としては、活性型ビタミン D₃ (Calci triol) 、副甲状腺ホルモン（PTH)、インターロイキン（IL) - 1、 IL-6、 IL- 11 、オンコスタチン IV [及び白血病細胞増殖抑制因子 UF)などの骨吸収促進因子が挙げられる。又、これらの誘導物質の添加濃度としては、活性型ビ夕ミン D₃や PTH では、 10_ ⁸M、 IL- 11 やオンコスタチン Mではそれぞれ 10ng/ml及び lng/ml、 IL- 6では 20ng/mlの IL-6と 500ng/mlの IL- 6可溶性レセプ夕一を用いるのが望ましい。好ましくは、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2 を用い、 10一 M活性型ビタミン D₃、 10— ⁷Mデキサメサゾン、及び 10%牛胎児血清を添加したひ -ME 中で一週間以上培養してコンフルェントにした細胞を用いるとよい。このようにして培養した細胞はセルスクレイパーなどを用いて剝離させ、回収するとよい。又、回収した細胞は使用するまでの間— 80°Cで保存しておくことができる。本発明蛋白質は、このようにして回収した細胞の膜画分から精製すると効率良く精製することができる。膜画分の調製は、細胞内器官の分画に利用される通常の方法に従って行うことができる。膜画分の調製に使用する緩衝液には、好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。添加するプロテアーゼ阻害剤としては、例えば PMSF、 APMSF、 EDTA、 0-フヱナント口リン、ロイぺプチン、ぺプス夕チン A、ァプロチニン、大豆トリプシンインヒビ夕一などのセリンプロテア —ゼ阻害剤、チオールプロテア一ゼ阻害剤、及びメタ口プロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。細胞の破砕には、 Daunceホモジナイザー、ポリトロンホモジナイザ一、超音波破砕装置などを用いることが出来る。破砕した細胞は 0. 5 Mシュクロースを加えた緩衝液に懸濁させ、 600 x gで 10分間遠心分離することにより、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離することができる。遠心分離で得た上清を 150， 000 x gで 90分間遠心分離することにより、沈殿画分として膜画分を得ることができる。このようにして得た膜画分を各種の界面活性剤で処理することにより、細胞膜に存在する本発明蛋白質を効率良く可溶化し、抽出することができる。可溶化に用いる界面活性剤としては、細胞膜蛋白質の可溶化に一般的に使用されている各種界面活性剤、例えば CHAPS (3- [ (3- cholaraidopropyl)- dimet hylammonio] -l-propanesulfonate) 、 Tri ton X— 100、 NikkoK n—才クチノレク'、リコシドなどを用いることができる。好ましくは、 0. 5 % CHAPSを添加して 4 °Cで 2 時間攪拌し、本発明蛋白質を可溶化するのが良い。このようにして調製したサンプルを、 150, 000 x gで 60分間遠心分離し、その上清を可溶化膜画分として得ることができる。

このようにして得られた可溶化膜画分からの本発明蛋白質の精製は、 0C IFを固定化したカラム、ゲル、樹脂などを用いて効率よく精製することができる。固定化に使用する 0C IFとしては、 W096/26217号公報記載の方法に従って、ヒト胎児肺線維芽細胞株 [MR- 90の培養液から単離したもの、あるいは遺伝子工学的手法により得られたもの（rOCIF) を使用することができる。これらの rOCIFは、ヒト、ラット、あるいはマウスの cDNAを常法に従って発現ベクターに組み込み、 CH0細胞、 BHK細胞、 Namalwa細胞などの動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製 4

することによって得ることができる。このようにして得られた 0CIFは、分子量約 60kDa (モノマー型）と 120kDa (ダイマー型）の分子量を示すが、固定化に用いる 0C IFとしては、好ましくはダイマー型 0CIFを用いる。 0CIFを固定化するためのゲル、樹脂としては ECH セファロ一ス 4B、 EAH セファロ一ス 4B、チォプロピルセファロース 6B、 CNBr-活性化セファロース 4B、活性化 CHセファロース 4B、エポキシ活性化セファロース 6B、活性化チォ一ルセファロ一ス 4B (以上、フアルマシア社） TSKgel AF-エポキシトヨパール 650 、 TSKgel AF-ァミノトヨパール 650 、 TSKgel AF-フオルミルトヨパール 650 、 TSKgel AF-カルボキシトヨパール 650 、 TSKgel AF -トレシルトヨパール 650 (以上、ト一ソ一社）、ァミノ—セル口ファイン、カルボキシ—セル口ファイン、 FMP 活性化セル口ファイン、フオルミル—セル口ファイン（以上、生化学工業社）、ァフィゲル 10, ァフィゲル 15, ァフイブレツプ 10 (以上、 BioRad社）などを用いることができる。又、 0CIFを固定化するためのカラムとしては HiTrap NHS- act ivated カラム（フアルマシア社）、 TSKgel T resy卜 5PW (トーソー社）などを用いることができる。 HiTrap NHS- act ivated 力ラム（1 ml, フアルマシア社）を用いた 0CIFの固定化法として、具体的には以下の方法を挙げることができる。即ち、 0CIF 13. 0 mgを含む 0. 2 M NaHC0₃/0. 5 M NaCKpH 8. 3)溶液1 mlをカラムに添加し、室温で 30分間カップリング反応させる。次いで、 0. 5 M ェタノールァミン /0. 5 NaCKpH 8. 3) と 0. 1 酢酸 /0. 5 M NaC KpH 4. 0) を流し、再度 0. 5 Mエタノールアミン /0. 5 M NaCKpH 8. 3) に置き換え、室温で 1 時間放置し、過剰な活性基を不活性化する。その後、 0. 5 M エタノ —ルアミン /0. 5 M NaCKpH 8. 3) と 0. 1 M酢酸/ 0. 5 M NaCKpH 4. 0) で 2度洗浄し、 50 mM Tris/1 M N a Cl/0. 1 % C H A P S緩衝液（pH 7. 5)で置換することにより、 0CIF固定化カラムを作製することができる。このようにして作製した 0CIF固定化カラムや 0C IF固定化ゲルあるいは樹脂などを用い、本発明蛋白質を効率よく精製することができる。本発明蛋白質の分解を抑制するために、精製に用いる緩衝液にも上記の各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。本発明蛋白質は、上記の可溶化膜画分を 0CIF固定化カラムに負荷する、あるいは 0CIF固定化ゲル、樹脂などと混ぜて攪拌することによって吸着させ、酸、各種蛋白質変性剤、カコジレートバッファ一などによって 0CIF固定化カラム、ゲル、あるいは樹脂などから溶出することができる。好ましくは、本発明蛋白質の変性を最小限に抑えるため、酸を用いて溶出し直ちに中和するとよい。溶出に用いる酸性緩衝液としては、例えば 0. 1 M グリシン一塩酸緩衝液（pH 3. 0) 、 0. 1 M グリシン—塩酸緩衝液（pH 2. 0) 、及び 0. 1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 2. 0) などを用いることができる。

このようにして精製した本発明蛋白質は、生物試料からの蛋白質の精製に汎用される通常の方法を用いて、本発明蛋白質の物理化学的性質を利用した各種の精製操作により更に精製することができる。本発明蛋白質溶液の濃縮には限外濾過、凍結乾燥及び塩析など、通常、蛋白質の精製過程で用いられる手法が挙げられる。好ましくは、 Centricon-10 (BioRad社）などを用いた遠心による限外濾過を用いるのが良い。又、精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相ク πマトグラフィー、調製用電気泳動などを用いた通常の蛋白質の精製に利用される各種の手法を組み合わせて用いることができる。より具体的には、 Superose 12 カラム（フアルマシア社）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィ一や逆相クロマトグラフィ一を組み合わせて用いることにより、本発明蛋白質を純化することが可能である。又、精製過程中の本発明蛋白質の同定は、固定化 0CIFとの結合活性あるいは 0CIFとの結合物を抗 0CIF抗体による免疫沈降後、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE ) で分析することにより検出できる。このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究 ·診断用試薬として有用である。

また本発明は、破骨細胞形成抑制因子 0CIFに結合する新規な蛋白質（0CIF結合分子； 0BM ) をコ一ドする DNA、その DNAによりコ一ドされるァミノ酸配列を有する蛋白質、それを用いて 0CIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤に関する。さらに本発明は、 0B M の発現を調節する物質のスクリーニング方法、 0BM と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、 0BM と結合し 0BM の作用を伝達するレセプターのスクリ一ニング方法、これらのスクリ一ニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物に関する。

本発明の DNAによりコードされる新規蛋白質 0BM は、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。

即ち、

a.破骨細胞形成抑制因子（0CIF) に特異的に結合する。

b.還元条件下における SDS- PAGEによる分子量測定で、約 40, 000 ( ±4， 000)の分子量を示す。又、モノマータイプの 0CIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約 90， 000-110, 000である。

c.破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する。

ものである。

本発明の 0CIF結合分子、 0BM をコードする DNAを同定し、 0BM の性質を評価するためのプローブとして使用するヒト破骨細胞形成抑制因子（0CIF) は、 W096/2 6217号に従ってヒト胎児性線維芽細胞株 IMR - 90の培養液から単離することができる。 0BM の DNAの単離、同定には、遺伝子組換え型ヒト 0CIF、遺伝子組換え型マ W 44

1 2 ウス 0CIF、遺伝子組換え型ラット 0CIF等を用いることもできる。これらの遺伝子組換え型 0CIFはそれぞれの DNAを常法に従って発現べクタ一に組み込み、 CH0 細胞、 BHK細胞、 Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。

目的の蛋白質をコードする cDNA を分離する（cDNAクローニング）方法としては、その蛋白質の部分ァミノ酸配列を決定しそれに対応する塩基配列をもとにハイブリダィゼ一シヨン法により目的の cDNA を単離する方法の他に、蛋白質のァミノ酸配列が不明であっても発現ベクター中に cDNA ライブラリ一を構築し、それらを細胞中に導入し、目的の蛋白質の発現の有無をスクリ一二ングすることにより、目的の cDNA を単離する方法（発現クロ一ニング法）がある（D' Andrea e t al.： Cel l 57, 277-285, 1989; Fukunaga et al.： Cel l 61， 341-350， 1990)。発現クロ一ニング法では、宿主細胞として細菌、酵母、動物細胞などが目的に応じて使い分けられている。本発明のように動物細胞の膜表面に存在すると考えられる蛋白質をコードする cDNA をクローニングする際には、動物細胞を宿主とする場合が多い。又、 DNA の導入効率が高く、導入された DNAの発現効率の高い宿主が通常使用される。そのような特徴を持つ細胞のひとつが、本発明で用いたサル腎臓細胞 COS- 7細胞である。 C0S-7細胞では SV40 large T ant igenが発現しているため、 SV40の複製開始点を持つプラスミドは細胞中で多コピーのェピソームとして存在するようになり、通常より高発現が期待できる。又、 DNAを導入した時点から数日のうちに最高の発現レベルに到達するので迅速なスクリ一ニングに適している。この宿主細胞に高発現可能なプラスミドを組み合わせることによつて、極めて高レベルの遺伝子発現が可能となる。プラスミド上で最も遺伝子の発現量に影響を与える因子はプロモータ一であり、高発現用のプロモーターとして SRひプロモータ一やサイトメガロウィルス由来プロモーター等がよく使用される。 44

1 3 発現クローニングにより膜蛋白質の c DNAをクローニングしょうとする際のスクリーニング法として、バインディング法（binding 法）、バニング法（panning 法）、フィルムェマルジヨン法などが考案されている。

本発明は、発現クローニング法とバインディング法を組み合わせることによつて得た OC IFに特異的に結合する蛋白質（0BM)をコードする DNA及び発現蛋白質、及び DNA又は発現蛋白質を用いた生理活性物質のスクリーニングに関する。本発明の DNAがコードする 0BM は、 OC IFを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって検出することができる。 OCIFの標識法としては、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。例えば、 OCIFの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の ¹ ^{2 5} I標識が挙げられ、具体的標識法としてョードジェン法、クロラミン T法及び酵素法等がある。 OCIFの動物細胞膜表面への結合性はこのようにして得た標識 0C IFを用い、常法に従った方法で試験できる。又、結合性の試験に用いる培地に標識 OCIFの 100倍から 400倍濃度の未標識 0CIFを添加することにより、非特異的な結合量を測定できる。 0C IFの特異的結合量は、標識 0CIFの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。

本発明者らは、破骨細胞の分化に関与する因子は 0CIFと相互作用するとの仮定のもと、遺伝子組み換え型 0CIFを用い、 0CIFが結合する蛋白質を分離するため、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2 の mRNAから作製した発現ライブラリ一を以下に述べる方法でスクリーニングした。 ST2 mRNAをもとに合成した DNAを動物細胞用発現ベクターに挿入し、それらをサル腎臓細胞 COS- 7細胞に遺伝子導入した。 ^{1 2 5} I標識した 0CIFをプ α—ブとして用いて COS- 7細胞上に発現した目的の蛋白質をスクリーニングした。その結果、 0CIFと特異的に結合する蛋白質をコードする DNAを分離するに至り、この 0CIF結合分子（0CIF結合分子； 0BM)をコードする DNAの塩基配列を決定した。又、この DNAにコードされる 0BM は細胞膜上で 0CIFと強くしかも特異的に結合することを見出した。

本発明でいう比較的温和な条件での DNAハイブリダィゼ一シヨンとは、例えば常法に従いナイロンメンブレンに DNAをトランスファーし固定化した後、ハイブリダイゼ一ション用バッファ一中で放射線標識したプローブの DNAと 40〜70°C、 2時間〜 1晚程度ハイプリダイゼーションさせ、 0. 5 x SSC(0. 075M塩化ナ卜リウ厶及び 0.0075M クェン酸ナトリウム）で 45°C10分洗浄する条件を言う。具体的には、常法に従い、ナイロンメンブレンにハイボンド N (アマシャム社）を用い、 DNAをトランスファ一し固定化した後、 Rapid Hybridizat ion Buffer (アマシャ厶社）中で^{3 2} P標識したプローブの DNAと 65°C 2時間ハイブリダィゼーシヨンさせて、 0.5 x SSC (0. 075M塩化ナトリウム及び 0. 0075Mクェン酸ナトリウム）で 45で10分洗浄する条件を言う。

破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビ夕ミン D₃あるいは PTH の存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、 ST2 とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明の 0BM は活性型ビタミン D₃や PTH のような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。更に、活性型ビタミン D₃あるいは PTH非存在下でもマウス脾臓細胞の培養系に本発明の DNAによりコ一ドされる蛋白質を添加することによって破骨細胞の形成が促進されることから、本発明の DNAによりコードされる 0BM は破骨細胞の分化、成熟に関与していると考えられる。

本発明の DNAを発現べクタ一に挿入して 0BM発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発現させることにより、組み換え型 0BM を製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主として COS- 7、 CH0、 Nama lwa など、又は細菌の宿主として大腸菌などを、用いることができる。その際、 DNAの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させる、あるいは膜結合部位をコ一ドする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型 0BM は、通常用いられる蛋白精製法、例えば 0CIF固定化カラムを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィー、ィォン交換クロマトグラフィー、あるいはゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせることにより、効率よく精製することができる。このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究 ·診断用試薬として有用である。

本発明の DNAにコードされる蛋白質 0BM を利用して、（1)0BMの発現を調節する物質のスクリーニング、（2)0BMに特異的に結合し、 0BM の生物活性を阻害、あるいは修飾する物質のスクリーニング、及び（3) 破骨細胞前駆細胞に存在し、 0BM の生物活性を伝達する蛋白質（0BM レセプター）のスクリーニング、更にはこの 0BM レセプ夕一を利用したアン夕ゴニストやァゴニストの開発が可能である。上述の 0BM あるいは 0BM レセプターを用いたコンビナトリァルケミストリーにおいて、アン夕ゴニストあるいはァゴニス卜の探索に必要なぺプチドライブラリーは具体的に以下の方法で作製することができる。その一つに、スプリット法がある

(Lam et al. ； Nature 354， 82-84， 1991) 。この方法は、合成担体（ビーズ）にそれぞれのアミノ酸（ユニット）を結合させたものを各ユニットごと別々に合成する。この合成された担体を一度すベて混ぜ、次にユニットの数に等分し、次のュニットをまた各々結合させる。この操作を n 回繰り返すことにより、担体に n 個のュニッ卜が結合したライブラリ一が作製される。このように合成を行うと一つの担体群には、 1 種類の配列しか合成されないので、本発明の蛋白質を用いた上記のスクリーニング法で陽性を示した担体群を選びだし、そのアミノ酸配列を決定すれば、特異的に結合するペプチドを同定することができる。又、別の方法としてファージディスプレイ法を用いることもできる。この方法はランダムなぺプチドをコ一ドする合成遺伝子をファージで発現させるもので、上記合成ライブラリ一に比べ、ライブラリ一中の分子数を多くできるという利点があるものの、ファージが嫌う配列はライブラリーに存在し得ないことなどがあり、分子数当たりの多様性が低いという欠点がある。ファージディスプレイ法でも同様に、本発明の蛋白質を用いたスクリ一ニング系を利用し、それに特異的に結合するファ一ジをパ二ングにより濃縮し、得られた特異的結合性を有するファージを大腸菌で増幅し、そのペプチドをコードする塩基配列を決定すればよい。更に、前記 (2) 及び（3) のスクリーニング系を使用し、ペプチドライブラリーから 0BM あるいは 0BM レセプターに特異的でかつ高親和性のぺプチドをスクリーユングしたい場合、スクリーニング時にそれぞれ 0CIFや 0BM を共存させ、それぞれの濃度を上げながら、陽性を示した担体あるいはファージをスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチドを得ることができる。例をあげれば、すでに造血ホルモンであるエリスロポエチン（EP0)のレセプターを用い、多様性に富んだぺプチドライブラリ一からの EP0 様活性を有する低分子べプチドアゴニストのスクリーニング及びその立体構造解析、更にはその立体構造に基づいた有機合成展開による EP0 活性を有する低分子物質（ァゴニス卜）の創製に成功している（Ni c olas et al.： Science, 273, 458-463, 1996) 。

また本発明者らは、破骨細胞形成抑制因子 0C IFを用い、その結合蛋白質が活性型ビ夕ミン D₃や副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone, PTH)などの骨吸収因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞株、 ST2 の細胞上に特異的に発現することをすでに見出した。さらに、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、該蛋白質を精製することによりその物理化学的諸性質及びその生物活性を明らかにした。本発明者らは、本発明の DNAにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質 0BM と、すでに前記 0CIF と特異的に結合する精製天然型蛋白質との異同を明らかにすべく、物理化学的性質及び生物活性を比較した。その結果、両蛋白質とも①膜結合蛋白質であり、特異的に 0CIFと結合し、 ② SDS- PAGEでの分子量は約 40, 000、 ③モノマ一タイプの 0C IFとクロスリンキングさせた場合の見かけの分子量は約 90, 000 - 110， 000であり、物理化学的諸性質がよく一致していること、又、生物活性においても、両蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有していることから、両蛋白質は同一である可能性が示唆された。さらに、本発明 DNAを用いて遺伝子工学的に発現させ、精製した蛋白質（遺伝子組み換え型 0BM) で作製したゥサギ抗 0BM ポリクローナル抗体は、前記の方法で得られる精製天然型蛋白質に交差性を有し、 0BM と 0CIFとの特異的結合を阻害するのと同様に、前記の精製天然型蛋白質と 0C IFとの結合を特異的に阻害した。これらの結果から、本発明の DNAにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質 0BMは、前記 0CIFに特異的に結合する天然型蛋白質と同一であることが明らかである。

さらに本発明者らは、 0CIFに特異的に結合し、天然型あるいは遺伝子組み換え型マウス 0BM と同様にマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有するヒト由来 0CIF結合蛋白分子（以下ヒト 0BM と称する）をコードする遺伝子（cDNA) を単離するため、前述のとおりマウス OBM c DNAから作製したプライマ一を用い、ヒトリンパ節由来 cDNA を铸型として polymerase chain r eaction (PCR) を行い、得られたヒト OBM cDNA断片をプローブとして上記 cDNA ライブラリーをスクリーニングした。その結果、 0CIFと特異的に結合するヒト由来蛋白質をコードする cDNA を分離することに成功し、このヒト由来 0CIF結合蛋白分子、即ちヒト 0BM をコードする cDNA の塩基配列を決定した。この cDNA にコードされるヒト OBM は、マウス OBM と同様に細胞膜上で OCIFと強く、しかも特異的に結合する特性を有し、またマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有することを見出した。即ち、本発明は破骨細胞形成抑制因子 OCIFに結合する新規なヒト由来蛋白質であるヒト 0BM をコードする DNA、その DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、その DNAを用いて 0C IFに特異的に結合する性質を有し、マウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤の提供、更にヒト 0BM の発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒト 0BM と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒト 0BM と結合しその作用を伝達するレセプ夕一のスクリー二ング方法及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明は、 OCIFに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する新規なヒト蛋白質であるヒト 0BM をコードする DNA、その DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、その DNAを用いて OCIFに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤に関する。更に、本発明はヒト 0BM の発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒト 0BM と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒト 0BM と結合し 0BM の生物活性を伝達するレセプ夕 —のスクリ一ニング方法、及びこれらのスクリ一ニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来 OCIF結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び又は治療薬に関する。

本発明の DNAによりコードされる新規ヒト由来 OCIF結合蛋白分子、即ちヒト 0B M は、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。

即ち、

a . 破骨細胞形成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibi tory factor, OCIF) ( WO 96/26217号）に特異的に結合する。

b . 還元条件下での SDS- PAGEによる分子量測定で、約 40, 000(±5，000)の分子量を示す。又、モノマータイプの 0CIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約 90, 000 - 110, 000 である。

C 破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する。

ものである。

本発明のヒト 0BM をコードする cDNA を分離同定するための、プローブとして使用するマウス由来 0CIF結合蛋白質であるマウス 0BM cDNAは、前述の方法に従つて、マウス骨芽細胞様スト口一マ細胞株、 ST2 の cDNA ライブラリ一から単離することができる。又、ヒト 0BM cDNAを発現することにより得られる蛋白質の特性及びその生物活性を評価するために必要なヒ卜破骨細胞形成抑制因子 0CIFは、 W0 96/26217号記載の方法に従って、ヒト線維芽細胞株 IMR-90の培養液から単離、あるいはその DNAを用いて遺伝子工学的に製造することができる。ヒト 0BM の特性や生物活性の評価には、遺伝子組み換えヒト 0CIF、遺伝子組み換えマウス 0CIF、遺伝子組み換えラット 0CIF等を用いることもできる。これらの遺伝子組み換え型 0CIFは、それぞれの cDNA を常法に従って発現べクタ一に組み込み、 CH0 細胞、 BHK細胞、 Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。

目的の蛋白質をコードするヒト型の cDNA を単離する（cDNAクロ一ニング）方法としては、 ①その蛋白質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定し、それに対応ずる塩基配列を有する DNAをプローブとして用い、ハイブリダィゼ一シヨン法により目的の cDNA を単離する方法、 ②目的の蛋白質のアミノ酸配列が不明であつても発現べクタ一中に cDNA ライブラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより、目的の c DNAを単離する方法（発現クローニング法）、及び③ヒト由来の目的蛋白質と同じ特性及び生物活性を有するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子、 cDNAがクローニングしょうとするヒト由来の目的蛋白質の cDNA と高いホモロジ一を有すると想定し、前者の c DNAをプローブとし、ヒト細胞あるいは組織から構築した cDNA ライブラリ一からハイブリダィゼ一シヨン法や polymerase chain react ion(PCR)法により目的のヒト蛋白質をコードする cDNA を単離する方法がある。ヒト OBM c DNAは、前記マウス OBM cDNAと高い相同性を有するとの想定のもと、ヒト 0BM 産生細胞あるいは組織は後者の cDNA をプローブとして、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法により調べることができる。ヒト OBM cDNAは、マウス 0BM cDNAから作製したマウス 0BM プライマーを用い、上記のようにして同定したヒト 0BM産生組織、例えばヒトリンパ節等から構築した cDNA を铸型として、 PCR によりヒト OBM c DNA断片を得て、このヒト OBM cDNA断片をプローブとし、上記の様に同定したヒト 0BM産生細胞あるいは組織の cDNA ライブラリ一をスクリ一二ングすることにより得ることができる。本発明は、このようにして得られた 0CIF に特異的に結合する性質を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有するヒト由来蛋白質、即ちヒト 0BM をコードする DNAに関する。本発明の DNAがコードするヒト 0BM は、膜貫通領域を有する膜結合型蛋白質をコードすることから、 0CIFを標識し、本発明の cDNA を発現した動物細胞表面への 0C [F 標識体の結合によって検出することができる。 0CIFの標識法としては、前述と同様、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。本発明のヒト OBM cDNAにより発現される蛋白質の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィ一や SDS- PAGE等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためには、 SDS-PAGEを用いるのが好ましく、ヒト 0BM は、還元条件下で約 40, 000 (4 0, 000 ±5， 000)の分子量を有する蛋白質として特定される。

本発明でいう比較的温和な条件での DNAハイブリダィゼーシヨンとは、例えば常法に従いナイロンメンブランに DNAをトランスファ一し、固定化した後、ハイブリダィゼ一シヨン用バッファ一中で放射線標識したプローブの DNAと 40-70 て、 2 時間から一夜程度ハイブリダィゼーシヨンさせ、 0. 5 X SSC (0. 075 M塩化ナトリウム及び 0. 0075 M クェン酸ナトリウム）で 45°C、 10分間洗浄する条件を言う。より具体的には、常法に従い、ナイロンメンブランにハイボンド N (アマシャム社）を用い、 DNAをトランスファ一し、固定化した後、 Rapid Hybridizatio n Buffer (アマシャム社）中で^{3 2} P標識したプローブの DNAと 65° (、 2 時間ハイブリダィゼ一シヨンさせて、上記の 0. 5 X SSCで 45°C、 10分間洗浄する条件を言。

破骨細胞形成の代表的なィンビト口培養系として、活性型ビ夕ミン D₃あるいは PTH の存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、 ST2 とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。このインビト口培養系での破骨細胞形成には、骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞間の接着による相互作用及び活性型ビ夕ミン D₃や PTH等の骨吸収促進因子の存在が不可欠である。このインビトロ培養系において、骨吸収促進因子非存在下で、しかも破骨細胞形成支持能のないサル腎臓細胞株である COS細胞に本発明の cDNA を発現させた遺伝子組み換え COS細胞株は、骨芽細胞様ストローマ細胞株、 ST2 と同様に脾臓細胞からの破骨細胞形成支持能を獲得した。また本発明の cDNA は膜結合型蛋白質をコードすることから、この膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶型として発現させることもできる。骨吸収促進因子非存在下の上記ィンビト口培養系に、この分泌型ヒト 0BM を添加するだけで破骨細胞の形成が起こることも確認された _c これらの結果から、本発明の cDNA によりコードされるヒト OBM は破骨細胞の分化、成熟に関与する因子として特定される。

本発明の cDNA を発現ベクターに挿入してヒト OBM 発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞または菌株に導入して発現させることにより、組み換え型ヒト 0B を製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主として COS - 7、 CH0 、 Namalwa 細胞などを、また細菌の宿主として大腸菌等を用いることができる。その際、 cDNAの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させることができるし、また膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型ヒト 0BM は、通常用いられる蛋白精製法、例えば 0CIF固定化カラムを用いたァフィ二ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ一やゲル濾過クロマトグラフィ一等を組み合わせることにより効率良く精製できる。このようにして得られた本発明ヒト 0BM は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究 '診断用試薬として有用である。

本発明の cDNA にコードされる蛋白質、ヒト 0BM を利用することにより、 ①ヒト 0BM の発現を調節する物質のスクリーニング、 ②ヒト 0BM に特異的に結合し、その生物活性を阻害あるいは修飾する物質のスクリーニング、及び③ヒト破骨細胞前駆細胞に存在し、ヒト 0BM の生物活性を伝達するヒト蛋白質（ヒト 0BM レセプ夕一）のスクリーニング、さらにはこのヒト 0BM レセプターを利用したアン夕ゴニストやァゴニストの開発が可能である。上述のヒト 0BM あるいはヒト 0BM レセプターを用いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アン夕ゴニストあるいはァゴニストの探索に必要なぺプチドライブラリ一はマウス 0BM を用いたスクリ一ニングの方法と同様の方法で作製することができ、マウス 0BM の代わりにヒト 0BM を用いて、ぺプチドライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のぺプチドを得ることができる。

さらにまた、前述のように 0BM は有用性の高い蛋白質であるが、この蛋白質の測定を行うには 0BM を特異的に認識する抗体とその抗体を用いた酵素免疫測定法の構築が必須である。しかしながら、これまでに 0BM の測定に有用な抗体は得られていない。さらに、 0BM あるいは s OBM の生物活性を中和する抗 OBM/sOBM抗体は、 0BM あるいは s OBM の作用、即ち破骨細胞形成の促進作用を抑制することが想定され、骨代謝異常症の治療薬としての開発が期待されるが、このような抗体も未だ得られていない。

上述の状況に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、破骨細胞形成抑制因子（0CIF) に特異的に結合する膜結合蛋白質（0CIF結合分子 0BM)及び膜結合部位を欠損した可溶性 OBM(sOBM) の両抗原を認識する抗体（抗 OBM/sOBM抗体）を見出すに至つた。従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子 0CIFに特異的に結合する膜結合蛋白質 0BM及び膜結合部位を欠損した可溶性 OBM(sOBM) の両抗原を認識する抗体（抗 OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この抗体を用いた 0BM及び sOBM の測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び Z又は治療剤を提供することを課題とする。

本発明は、破骨細胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesis inhibi tory factor； 0CIF) に特異的に結合する膜結合蛋白質（OCIF binding molecule； OBM)及び膜結合部位を欠損した可溶性 OBM(sOBM) の両抗原を認識する抗体（抗 OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この抗体を用いた 0BM及び s OBM の測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする医薬、特に骨代謝異常症予防及び/又は治療剤に関する。

本発明の抗体は、 0BM及び s OBM の生物活性である破骨細胞形成促進活性を中和する活性を有し、以下の性質を持つ抗体から構成される。

即ち、

a) マウス 0BM 及びマウス s OBM の両抗原を認識するポリクローナル抗体（抗マウス OBM /sOBM ポリクローナル抗体）

b) ヒト 0BM 及びヒト s OBM の両抗原を認識するポリクローナル抗体（抗ヒト 0B M /sOBM ポリクロ一ナル抗体）

c) マウス 0BM 及びマウス s OBM の両抗原を認識するモノクローナル抗体（抗マウス OBM /sOBM モノクローナル抗体）

d) ヒト 0BM 及びヒト s OBM の両抗原を認識するモノクローナル抗体（抗ヒト 0B M /sOBM モノクロ一ナル抗体）

e) マウス OBM 及びマウス s OBM の両抗原に交差性を有する抗ヒト OBM /sOBM モノクローナル抗体、から構成される。

マウス 0BM 及びマウス s OBM の両抗原を認識するポリクローナル抗体（以下抗マウス OBM /sOBM ポリクローナル抗体と称する）及びヒト 0BM 及びヒト s 0BM の両抗原を認識するポリクローナル抗体（以下抗ヒト OBM /sOBM ポリクローナル抗体と称する）は、以下の手段によって得ることができる。免疫用抗原としての精製マウス 0BM は、前述の方法に従って得ることができる。即ち、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 S T— 2を活性ビタミン D₃処理し、その細胞膜上の 0BM を 0C IF固定化カラム及びゲル濾過クロマトグラフィ一により精製することにより、天然型マウス OBM (nativeOBM ) を得ることができる。又、前述のマウス OBM c D NA (配列表配列番号 15) 又はヒト OBM c DNA (配列表配列番号 12) を常法により発現ベクターに組み込み、 CH0 細胞、 BHK 細胞、 Namalwa、 C0S-7 細胞等の動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などで発現させて、上記と同様の方法で精製することにより、遺伝子組み換えマウス 0BM (配列表配列番号 1 ) 又はヒト 0BM (配列表配列番号 11) を得ることができ、これを免疫用抗原として用いても良い。この時、膜結合蛋白質であるマウス 0BM あるいはヒト 0BM を大量かつ高度に精製するには、多大の労力を要する。一方、膜結合型蛋白質である 0BM とその膜結合部位を欠損させて得られる可溶化蛋白質である可溶性 OBM (sOBM)とは、前述のように破骨細胞の分化、成熟促進活性において差異がないことが認められている。従つて、マウス s OBM及びヒト s OBM は発現及びその高度精製が比較的容易であること力、ら、これら可溶化蛋白質である s OBM を免疫用抗原として用いても良い。マウス s OBM (配列表配列番号 16) 及びヒト s OBM (配列表配列番号 17) は、マウス s OBM cDNA (配列表配列番号 18) 又はヒト s OBM cDNA (配列表配列番号 19) の 5'上流側に他の分泌蛋白質由来の既知シグナル配列をコードする塩基配列を付加し、上記と同様に遺伝子工学的手法により発現べクタ一に組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現し、精製することにより、それぞれ得ることができる。このようにして得られた免疫用抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS)に溶解し、必要に応じ同容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、動物に約 1週間間隔で皮下投与し、数回免疫する。抗体価を測定し、最高の抗体価に達した時点でブースター投与し、投与 10日後に全採血を行う。得られた抗血清を硫酸アンモニゥム分画沈澱し、グロブリン分画を陰イオン交換クロマトグラフィ一により精製するか、あるいは抗血清をバインディングバッファー（Biorad社）で 2倍希釈し、その希釈抗血清をプロテイン A又はプロテイン Gセファロ一スカラムクロマトグラフィ一により精製することにより、目的とする抗マウス又は抗ヒト OBM/sOBMポリクローナル型抗体を得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、以下の方法により得ることができる。即ち、モノクローナル抗体の作製に必要な免疫用抗原としては、ポリクロ一ナル抗体の時と同様に天然型マウス OBM (nat iveOBM) 、遺伝子組み換えマウス型又はヒト 0B M、遺伝子組み換えマウス型又はヒト型 s OBM を用いることができる。それぞれの抗原により哺乳動物を免疫するか、あるいはインビトロ法により免疫したリンパ球細胞を骨髄腫細胞株（ミエローマ）などと融合させ、常法によりハイプリド一マを作製する。このハイプリドーマ培養液について、高度に精製されたそれぞれの抗原を用いて、ソリッドフーズ ELISA によりそれぞれの抗原を認識する抗体生産ハイプリドーマを選択する。得られたハイプリドーマをクローニングし、樹立した安定な抗体産生ハイプリドーマをそれぞれ培養することにより、目的とする抗体が得られる。ハイプリドーマの作製に当たっては、哺乳動物を使用する場合、マウスゃラットなどの小動物を使用するのが一般的である。免疫は、抗原を適当な溶媒、例えば生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与し、動物に 1〜2週間間隔で 3〜4回程度投与する方法が一般的である。このようにして免疫された動物を最終免疫後 3日目に解剖し、摘出した脾臓から得られた脾臓細胞を免疫細胞として使用する。免疫細胞と細胞融合するマウス由来のミエローマとしては、例えば p3/x63- Ag8、 p3-Ul 、 NS- 1、 MPC_11、 SP - 2/0、 F0、 P3 x63 Ag8. 653及び S194などが挙げられる。又、ラット由来の細胞としては、 R - 21 0 などの細胞株が挙げられる。ヒト型の抗体を生産する場合には、ヒト Bリンパ球をインビトロで免疫し、ヒトミエ口一マ細胞や EBウィルスにより形質転換した細胞株と細胞融合させることにより、ヒト型の抗体を生産することができる。免疫された細胞とミエローマ細胞株との融合は公知の方法、例えば Koehler と Mi ls teinらの方法 (Koehler et al.： Nature 256, 495-497, 1975) がー股的に使用されるが、電気パルスを利用した電気パルス法などでも良い。免疫リンパ球とミエロ—マ細胞株は、通常行われている細胞数の比率に混合し、一般に使用される牛胎児血清 (FCS) 不含細胞培養用培地にポリエチレングリコ一ルを添加して融合処理を行い、 FCS 添加 HAT選択培地で培養を行い融合細胞（ハイプリドーマ）を選別する。次に、抗体を生産するハイプリドーマを ELISA、プラーク法、ォク夕ロニー法、凝集法など通常用いられる抗体の検出方法により選択し、安定なハイプリドーマを樹立する。このようにして樹立されたハイプリドーマは、通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイプリドーマは常法により培養して、その培養液、または哺乳動物の腹腔内に移植することにより、腹水から抗体を回収することができる。培養液あるいは腹水中の抗体は、塩析法、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー、プロテイン Aまたはプロティン Gァフィ二ティ一クロマトグラフィーなど通常用いられる方法により精製することができる。このような方法により、抗原として s OBM を用いて得られたモノクローナル抗体のほとんど全ては、 s OBM だけでなく 0BM をも特異的に認識できる抗体（抗 OBM /sOBM モノクローナル抗体と称する）である。これらの抗体は、 0BM及び s OBM のそれぞれの測定に利用することができる。これらの抗体は放射性ァイソトープゃ酵素ラベルすることにより、ラジオィ厶ノアッセィ（RIA) ゃェンザィムィムノアッセィ（E[A) として知られている測定系に用いることにより、 0BM量及び s OBM量を測定することができる。これらの測定系を用いることにより、血液、尿などの生体試料中の s OBM量を容易にかつ高感度で測定することができる。また、これらの抗体を用いることにより、組織や細胞表面に結合した 0BM量をバインディングアツセィ等により容易にかつ高感度で測定することができる。

得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒト OBM /sOBM抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒト OBM /sOBM抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、 ①ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球を in vi troで IL- 4存在下、抗原であるヒト OBM あるいはヒト sOBMで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのへテロハイプリドーマである K₆H₆/B₅ (ATCC CRL1823)と細胞融合させることにより、目的の抗体産生ハイプリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノクローナル抗体である _c これらの抗体の中からヒト OBM /sOBM の活性を中和する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球を in vi troで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ヒト 0BM および sOBMに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性ヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノクロ一ナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノクローナル抗体の CDR 領域（特に CDR- 3)にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒト OBM /sOB を固相化したプレートを用いてファージディスプレイ法により、抗原であるヒト OBM /sOB に強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有する CDR のアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノクローナル抗体をコ一ドする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノクロ一ナル抗体が得られる。これらの中から、ヒト OBM /sOBM の生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ヒト OBM /sOBM モノク口一ナル抗体を選別することができる。また、 ② Bal cマウスを用いて、本発明と同じように常法 ( oehler et al.： Nature 256, 495-497， 1975)によりマウス型抗ヒト OBM /sOBM モノクローナル抗体を作製し、ヒト OBM /sOBM の生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒト OBM /sOB モノクロ一ナル抗体の CDR-領域（CDR- 1， 2および 3)をヒ W 9 /46644

2 9

MgG の CDR 領域に移植する CDR-graf t ing (Winter and Mi lstein : Nature 349， 293-299, 1991)の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに③ヒト末梢血リンパ球を Severe combined immune def iciency (SCID)マウスに移植し、この移植された SCIDマウスはヒト型抗体を生産する（Mosier D. E. et al. ： Nature 335, 256 一 259, 1988 ; Duchosal M. A. et al.： Nature 355, 2 58-262, 1992) ので、抗原としてヒト OBM あるいは sOBMを抗原として感作し、スクリ一二ングすることにより、ヒト OBM /sOBM に特異的なヒト型モノクロ一ナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することができる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法①と同様に、マウスとヒトとのへテロハイプリドーマである K₆H₆/B₅ (ATCC CRL1823)と細胞融合させ、得られたハイプリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイプリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製することにより精製品を得ることができる。又、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマから cDNA ライブラリ一を構築し、目的のヒト型モノクローナル抗体をコ一ドする遺伝子（ c DNA) をクロ一二ングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当な発現べクタ一に組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組み換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。

さらに、上述の方法で得られた抗 OBM /sOBM モノクロ一ナル抗体の中から、 0B M /sOBM の生物活性を中和する抗体が得ることができる。これら OBM /sOBM の生物活性を中和する抗体は、生体内での OBM /sOBM の生物作用、即ち破骨細胞形成促進作用をブロックすることから、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び又は治療剤として期待される。抗 OBM /sOBM抗体による 0BM あるいは s OBM の生物活性の中和活性は、 in vi tro での破骨細胞形成系における破骨細胞形成の抑制活性で測定することができる。 in vi troアツセィ系として、以下の 3 つの方法がある。即ち、破骨細胞形成 (osteoclastogenesis) の in vi tro培養系として、 ①活性型ビタミン D₃とデキサメサゾンの存在下、マウス骨芽細胞様ストロ一マ細胞株、 ST2細胞とマウス脾臓細胞との共培養系、 ②サル腎臓細胞株、 COS- 7細胞上に 0BM を発現させ、ホルムアルデヒドにより固定化し、 M- CSF 存在下、その細胞上でマウス脾臓細胞を培養する共培養系、 ③遺伝子組み換え s OBM及び M- CSF 存在下でマゥス脾臓細胞を培養する系などが挙げられる。これら培養系に種々の濃度で抗 OBM /sOBM抗体を添加し、破骨細胞形成に及ぼす影響を調べることにより、抗 OBM /sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。又、 in vivo での実験動物を利用した骨吸収抑制活性により抗 OBM /sOBM抗体の破骨細胞形成抑制活性を評価することができる。即ち、破骨細胞形成が亢進している動物モデルとして、卵巣摘出モデルがある。この種の実験動物に抗 OBM /sOBM抗体を投与し、骨吸収抑制活性（骨密度の増強活性）を測定することにより、抗 0B M /sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。

このようにして得られた OBM /sOBM の生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び/又は治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。本発明抗体は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、 0BM 及びノ又は s OBM を認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば熱、 pHおよび湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、 P H調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としては、グリシン、ァラニン等のアミノ酸類、デキストラン 40およびマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量に対して 0. 01〜 100倍、特に 0. 1 〜10倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファ一、クェン酸バッファ一等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液の pHを調整し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を再溶解した後の水量に対し、 1 〜10mMとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート 20、プル口ニック F- 68、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート 80が挙げられ、またこれらの 2種以上を併用してもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としは、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対し 0. 00 1 〜1. 0 %添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用又は動物薬用注射剤として用いる場合は、浸透圧比として許容される浸透圧比は 1 〜2が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型化抗体の投与量は、抗体のヒト 0B /sOB に対する親和性、即ちヒト OBM /sOBM に対する解離定数（Kd値）に依存し、親和性が高い（Kd値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発現することができる。又、ヒト型抗体はヒト血中での半減期が約 20日間と長いことから、例えばヒトに対して投与する際には、約 0. 1 〜100mg/kgを 1〜30日間に 1回以上投与すれば良い。

図面の簡単な説明

第 1図は、本発明実施例 3のマウス 0BM蛋白質の SDS- PAGEの結果を示す。

〔符号の説明〕

(A) ：レーン 1 ：分子量マーカー

レーン 2 ：活性型ビ夕ミン D₃とデキサメサゾン存在下で培養した ST2 細胞からの部分精製標品（Gly- HCKPH2. 0)溶出画分）

レーン 3 ：活性型ビ夕ミン D₃とデキサメサゾン非存在下で培養した ST 2細胞からの部分精製標品（Gly-HCKpH2. 0)溶出画分）

(B) ：レーン 1 ：分子量マーカー

レーン 2 ：逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した本発明マウス 0BM蛋白質（実施例 3 )

第 2図は、実施例 4の ^{1 2 5} Iで標識した 0C IFの骨芽細胞様ストローマ細胞 ST2 への結合試験の結果を示す。

第 3図は、実施例 5 (1) の継代数の違う骨芽細胞様ストローマ細胞 ST2 による破骨細胞形成支持能を示す。

〔符号の説明〕

1 ：継代数約 10代の ST2細胞の破骨細胞形成支持能 2 ：継代数約 40代の ST2細胞の破骨細胞形成支持能

第 4図は、実施例 5 (2) の活性型ビタミン D₃及びデキサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストローマ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化を示す第 5図は、実施例 5 (2) の共培養系における破骨細胞形成の経時変化を示す。第 6図は、実施例 5 (3) の共培養期間において、種々の培養期間のみ 0CIF処理した場合の破骨細胞形成抑制効果を示す。

第 7図は、実施例 6の ^{1 2 5} I標識 0CIFと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験の結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 ： ^{1 2 5} I標識 OCIF- CDD1

レーン 2 : ^{1 2 5} I標識 OCIF- CDD1 と ST2細胞をクロスリンクさせたものレーン 3 ： 400倍濃度の未標識 0CIFを添加してクロスリンクさせたもの第 8図は、実施例 9における、 SDS- PAGEの結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 ： P0BM291をトランスフヱクトした COS- 7細胞の蛋白質を、 OCIF無添加で免疫沈降させたもの

レーン 2 ： P0BM291をトランスフヱク卜した C0S-7細胞の蛋白質を、 0CIFを添加して免疫沈降させたもの

第 9図は、実施例 10における、 ^{1 2 5} Iで標識した OCIFの、 P0BM291をトランスフエクトした C0S-7細胞への結合試験の結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1及び 2 ： ^{1 2 5} Iで標識した 0CIFの、 P0BM291 をトランスフエクトした COS- 7細胞への結合量

レーン 3及び 4 ： ^{1 2 5} Iで標識した 0CIFの、 P0BM291 をトランスフエクした COS-7細胞への結合量（400 倍濃度の未標識 0CIF添加時）

第 10図は、実施例 11における、 ^{1 2 5} Iで標識した 0CIFを用いたクロスリンク試験の結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 ： ^{1 2 5} I標識 0CIF

レーン 2 ： ^{1 2 5} 1標識 0CIFと、 P0BM291をトランスフヱクトした COS- 7 細胞をクロスリンクさせたもの

レーン 3 : 400倍濃度の未標識 0CIF存在下で、 ^{1 2 5} I標識 0CIFと、 P0BM291 をトランスフエク卜した COS- 7細胞をクロスリンクさせたもの

第 11図は、実施例 12における、ノーザンプロットの結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 ：ビタミン D及びデキサメサゾン無添加で培養した ST2細胞由来 RNA レーン 2 ：ビタミン D及びデキサメサゾンを添加し培養した ST2細胞由来 RNA 第 12図は、実施例 13_ (2) における、 0CIF濃度を変えた時の培養上清中蛋白質の 0CIF結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇： PCEP4

•： pCEP sOBM

第 13図は、実施例 13- (2)における、培養上清の割合を変えた時の培養上清中蛋白質の 0CIF結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇： PCEP4

•： pCEP sOBM

第 14図は、実施例 14- (2)における、大腸菌で発現させたチォレドキシンとマウス OBM の融合蛋白質の SDS- PAGEの結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 ：分子量マーカ一

レーン 2 ： GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分

レーン 3 ： GI724/pTrxOB 25 由来可溶性蛋白質画分

第 15図は、実施例 14- (3)における、可溶性蛋白質画分の割合を変えた時の OCIF 結合能を示す。

〔符号の説明〕

□： GI724/pTrxFus

〇： GI724/pTrxOB 25

第 16図は、実施例 14- (3)における、 OCIF濃度を変えた時の可溶性蛋白質画分（ 1 %) の OCIF結合能を示す。

〔符号の説明〕

□： GI724/pTrxFus

〇： GI724/pTrxOBM25

第 17図は、本発明のマウス OBM cDNAにより発現され精製して得られる蛋白質マウス 0BM、及び天然型の精製 OCIF結合蛋白質と OCIFとの特異的結合能の、ゥサギ抗マウス 0BM抗体による阻害結果を示す。

〔符号の説明〕

1: 抗体で処理した cDNAにより発現され精製して得られる蛋白質、 0BM+ ¹²⁵ I- OCIF

2: 抗体で処理した天然型の蛋白質 + ¹²⁵I-0CIF

3: 抗体未処理の cDNAにより発現されて得られる蛋白質、マウス 0BM + ¹²⁵1 -OCIF 4：抗体未処理の天然型の蛋白質 + ¹²⁵I-0CIF 5: 3 +非標識 OCIF (¹²⁵I- OCIFの 400倍量）

6: 4 +非標識 OCIF (¹²⁵I- 0CIFの■ 倍量）

第 18図は、本発明の cDNAにより発現される蛋白質、ヒト 0BMの SDS- PAGEの結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1: 分子量マーカー

レーン 2: 本発明の cDNAを含む発現ベクター、 phOBMをトランスフヱク卜した COS- 7細胞の蛋白質を 0CIF無添加でゥサギ抗 0CIFポリクローナル抗体で免疫沈降させたもの

レーン 3: 本発明 cDNAを含む発現ベクター、 phOBMをトランスフヱク卜した COS- 7細胞の蛋白質を 0CIF添加でゥサギ抗 0C1Fポリクロ一ナル抗体で免疫沈降させたもの

第 19図は、本発明 cDNAを含む発現ベクター、 phOBMをトランスフヱクトした CO S-7細胞への OCIFの結合試験の結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1: phOBMをトランスフエクトした COS- 7細胞に¹²⁵1- 0CIFを添加したもの

レーン 2: phOBMをトランスフヱクトした COS- 7細胞に¹²⁵1- 0CIFを添加し、さらに 400倍量の非標識 0CIFを加えたもの

第 20図は、本発明 cDNAでコードされる蛋白質、ヒト 0BM と¹²⁵I- 0CIF (モノマ —型）とのクロスリンキング試験の結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1: ¹²⁵1- 0CIF

レーン 2: ¹²⁵I- 0CIFと phOBMをトランスフヱクトした COS- 7細胞膜上の蛋白質とをクロスリンクさせたもの

レーン 3 : 400倍濃度の非標識 0CIF存在下で、 ^{1 2 5} I- 0CIFと phOBMをトランスフエクトした COS- 7細胞膜上の蛋白質とをクロスリンクさせたもの

第 21図は、実施例 23 -（2) における、 0CIF濃度を変えた時の培養液上清中蛋白質（分泌型 hOBM)の 0CIF結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇：分泌型ヒト 0BM をコードする cDNAを含まないベクタ一のみの pCEP4をトランスフヱクトした 293- EBNA細胞の培養液

·：分泌型ヒト 0BM をコードする cDNAを含む発現べクタ一の pCEPshOBMをトランスフヱクした 293-EBNA細胞の培養液

第 22図は、実施例 23—（2) における、 0CIF濃度を一定にし、添加する培養液量を変えた時の培養液上清中蛋白質（分泌型ヒト 0 )の 0CIF結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇：分泌型ヒト 0BM をコードする cDNAを含まないベクタ一のみの pCEP4 をトランスフヱクトした 293- EBNA細胞の培養液

·：分泌型ヒト 0BM をコードする cDNAを含む発現ベクターの pCEPshOBM をトランスフヱクトした 293-EBNA細胞の培養液

第 23図は、大腸菌で発現させたチォレドキシンとヒト 0BM の融合蛋白質の SDS - PAGEの結果を示す。

〔符号の説明〕

レーン 1 : 分子量マーカー

レーン 2: 大腸菌 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分

レーン 3: 大腸菌 GI724/pTrxhOBM由来可溶性蛋白質画分

第 24図は、実施例 24- (3)における、チォレドトキシンとヒト 0BM の融合蛋白質を含む大腸菌由来可溶性蛋白質画分の添加割合を変えた時の融合蛋白質と、 0CIF との結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇：大腸菌 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分

·：大腸菌 GI724/pTrxshOBM 由来可溶性蛋白質画分

第 25図は、実施例 24-(3)における、 0CIF濃度を変えた時の大腸菌由来可溶性蛋白質画分中のチォレドトキシンとヒト 0BM の融合蛋白質と、 0CIFとの結合能を示す。

〔符号の説明〕

〇：大腸菌 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分

·：大腸菌 GI724/pTrxshOBM 由来可溶性蛋白質画分

第 26図は、本発明のゥサギ抗ヒト OBM/sOBMポリクローナル抗体を用いたサンドィツチ ELISAによる、ヒト 0BM及び sOBMの測定結果を示す。

〔符号の説明〕

□：ヒト 0BM

秦：ヒト s 0BM

第 27図は、本発明の抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体を用いたサンドィツチ ELISAによる、ヒト 0BM及び sOBMの測定結果を示す。

〔符号の説明〕

□：ヒト 0BM

翁：ヒ h sOBM

第 28図は、本発明のマウス 0BM 及び sOBMにも交差性を有する抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ EUSAによる、マウス 0BM及び sOBMの測定結果を示す。〔符号の説明〕

□：マウス 0BM

•：マウス s 0BM

第 29図は、チォレドトキシンとマウス 0BM の融合蛋白質によるヒト破骨細胞様細胞形成の促進活性を示す。

第 30図は、ビタミン D₃刺激による骨吸収活性の、抗 OBM/sOBM抗体による抑制を示す。

第 31図は、プロスタグランジン E₂ (PGE₂)刺激による骨吸収活性の、抗 OBM/sOBM 抗体による抑制を示す。

第 32図は、副甲状腺ホルモン（PTH) 刺激による骨吸収活性の、抗 OBM/sOBM抗体による抑制を示す。

第 33図は、インターロイキン 1 ひ（1L-1)刺激による骨吸収活性の、抗 OBM/sOBM 抗体による抑制を示す。

発明を実施するための最良の形態

〔実施例〕

以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

〔実施例 1〕

本発明蛋白質の製造

(1) ST2細胞の大量培養

マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2 (RI EN CELL BANK, RCB0224)は、 10% 牛胎児血清を含むひ -MEM培地を用いて培養した。付着細胞用 225cm² Tフラスコでコンフルェン卜になるまで培養した ST2細胞を、トリプシン処理して Tフラスコから剝がし洗浄した後、 5 枚の 225cm² Tフラスコに移し、 10— ⁸M活性型ビタミン D₃ (Calci tri ol)、 10— ⁷Mデキサメサゾン、及び 10%牛胎児血清を添加したひ— ME M培地各々 60mlを加えて C0₂ インキュベータ一中で 7-10日間培養した。培養した ST2細胞はセルスクレイパーを用いて回収し、使用するまで - 80°Cで保存した。

(2) 膜画分の調製と膜結合蛋白質の可溶化

225cm²の Tフラスコ 80枚を用いて培養した実施例 1 -(1)記載の ST2細胞（容量約 12ml) に、プロテアーゼ阻害剤 (2m APMSFP, 2m EDTA, 2mM o-p enanthrol i ne， 1 mM leupept in, 1 〃g/ml pepstat in A及び 100 uni ts/ml aprot inin) を含む 10 mM トリスー塩酸緩衝液（pH 7. 2)を 3 倍容量（36ml) 加えた。ボルテックスミキサーを用いて 30秒間この細胞を激しく攪拌した後、氷中で 10分間放置した。ホモジナイザー (DOUNCE TISSUE GR INDER, A syrindge, WHEATON SCIENTIFIC 社）を用い、細胞を破砕した。この細胞破砕液に、上記のプロテアーゼ阻害剤、 0. 5M シュクロース、 0. 1 塩化カリウム、 10 m 塩化マグネシウム、及び 2 mM塩化力ルシゥムを加えた 10mMトリス—塩酸緩衝液（pH 7. 2) の等量（48ml) を加え、攪拌した後、 4 °C、 600 x gで 10分間遠心した。この遠心分離により、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離した。遠心分離で得た上清を 4 で、 150, 000 X gで 90分間遠心し、沈殿画分として S T 2細胞の膜画分を得た。この膜画分に、上記のプロテアーゼ阻害剤、 150 mM塩化ナトリウム、及び 0. 1 シュクロースを含む 10mMトリス—塩酸緩衝液（pH 7. 2)8 mlを加えた後、 20% CHAPS (3- [ (3-cho lamidopropyD-dimethyla睡 nio]十 propanesulfonate 、 Sigma社) 200 / 1 を加え、 4 でで 2 時間攪拌した。この液を 4 °C、 150, 000 x gで 60分間遠心し、その上清を可溶化膜画分として得た。

〔実施例 2〕

本発明蛋白質の精製

(1) 0CIF固定化ァフィ二ティーカラムの調製 HiTrap NHS- activatedカラム（lml, フアルマシア社）内のイソプロパノールを 1 mM塩酸で置換した後、 W096/26217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型 OCIF 13.0mgを含む 0.2 NaHC0₃/0.5M NaCKpH 8.3)溶液 lmlをシリンジ（5ml，テルモ社）を用いカラムに添加した。室温で 30分間カップリング反応させた後、過剰な活性基を不活性化する為、 0.5Mエタノールァミン /0.5 M NaCKpH 8.3) と 0.1M酢酸 /0,5M NaCKpH 4.0)を 3ml ずつ交互に 3回流し、再度 0.5 M エタノールァミン /0.5M NaCKpH 8.3)に置き換え室温で 1時間放置した。その後、 0.5 M ェ夕ノールアミン /0.5M NaCKpH 8.3)と 0.1M酢酸 /0.5M NaCKpH 4.0)で 2度洗浄し、 50mM Tris/1M Na Cl/0.1% C H A P S緩衝液（pH 7.5)に置換した。

(2) OCIF固定化ァフィニティーカラムによる本発明蛋白質の精製

0CIF結合蛋白質の精製は、特に断らない限り 4°Cで行った。前述の 0CIF固定化ァフィ二ティ一カラムを、実施例 1 -(2)記載のプロテア一ゼ阻害剤、 0.15 M塩化ナトリウム、及び 0.5% CHAPSを加えた 10mMトリスー塩酸緩衝液（pH 7.2)で平衡化した。このカラムに、実施例 1—(2) 項記載の可溶化膜画分約 8 mlを流速 0.01 ml/分で負荷した。このカラムに、上記のプロテア一ゼ阻害剤、 0.15 M塩化ナトリウム、及び 0.5% CHAPSを加えた 10mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.2)を流速 0.5 ml/分で 100 分間流してカラムを洗浄した。次に、プロテアーゼ阻害剤、 0.2M塩化ナトリウム、及び 0.5 % CHAPS を加えた 0.1 M グリシン—塩酸緩衝液（pH 3.3) を流速 0.1ml/分で 50分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。同様に、プ口テアーゼ阻害剤、 0.2 M塩化ナトリウム、及び 0.5 %CHAPSを加えた 0.1Mクェン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0)を流速 0.1ml/分で 50分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は 0.5ml/フラクションにて分取した。分取した画分には、 2Mトリス溶液を加え、直ちに中和した。各緩衝液で溶出したフラクション（溶出液量 1.0- 5.0ml)の各々をセントリコン- 10( Centricon-10， Ami con, USA) を用いて 50 から 100 / 1 に濃縮した。濃縮した各フラクションの一部を分取し、それぞれに 0CIFを添加後、 0CIFポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。その沈殿画分を SDS 化して後、 SDS- PAGEにかけて 0CIFに特異的な結合能を有する蛋白質のバンドが出現するフラクション（Fr. No. 3-10) を本発明蛋白質画分とした。

(3) ゲル濾過による本発明蛋白質の精製

実施例 2— (2) 記載の方法で精製し、濃縮した 0CIF結合蛋白質（0. 1M グリシン一塩酸緩衝液、 pH 3. 3及び 0. 1 Mクェン酸ナトリウム緩衝液、 pH 2. 0溶出画分）を 10 ra Tris-HCl, 0. 5 NaCl, 0. 5%CHAPS(pH7. 0)で平衡化した Superose 12 HR10/30カラム（フアルマシア社、 l. Ox 30cm)にかけ、平衡化緩衝液を移動相として用い流速 0. 5 ml/min で展開させ、 0. 5 mlづつの画分を集めた。上記と同様にして本発明蛋白質画分（Fr. No. 27-32)を同定し、各々のフラクションを Cen tricon-lO(Amicon) で濃縮した。

(4) 逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製

前述のゲル濾過で精製した 0C IF結合蛋白質を 0. 1 % トリフルォロ酢酸 (TFA), 30%ァセトニトリルで平衡化した C₄ カラム（2. Ix250mm、 Vydac, USA) に負荷した。最初の 50分間でァセトニトリル濃度を 30%から 55%に、次の 10分間でァセト二トリル濃度を 80%にする勾配、流速 0. 2 ml/min で溶出を行い、溶出された蛋白質のピークを 215 nm で検出した。溶出された各ピークの蛋白質を分取し本発明蛋白質のピークを同定することにより、高度に精製された本発明蛋白質を得た。〔実施例 3〕

精製された本発明蛋白質の SDS-PAGE

まず、活性型ビタミン D₃存在下あるいは非存在下で培養した ST2細胞から調製した膜可溶化画分を上記のように 0C【F固定化ァフィニティ—力ラムで精製し、その精製標品を SDS- PAGEにかけた。第 1図（A)に示したように、活性型ビタミン D₃ 存在下で培養した ST2細胞からの精製標品のみに、約 30， 000- 40, 000 のメジャーな蛋白質バンドが検出され、 0CIF固定化ァフィ二ティ—カラムにより、 0CIFに特異的に結合する蛋白質、即ち本発明蛋白質が選択的に濃縮、精製されることが明らかになつた。しかしながら、本発明蛋白質以外に 0CIF固定化カラムの担体ゃスぺサ一などに非特異的に結合した数種の蛋白質バンドが両精製サンプル中に共通して検出された。これらの本発明蛋白質以外の蛋白質を上記のようにゲル濾過及び C4逆相クロマトグラフィ一で除去し、得られた高度精製本発明蛋白質の SDS - PA GEを第 1図（B) に示した。高度精製本発明蛋白質は電気泳動的に均一であり、その分子量は約 30,000 - 40, 000であった。

〔実施例 4〕

0CIFの骨芽細胞への結合試験

(1) ¹²⁵ I標識 0CIFの調製

0CIFはョ一ドジヱン（Iodogen) 法により ¹²⁵ I標識した。即ち、 2.5rag/ml Iod ogen—クロ口ホルム溶液 20 zl を 1.5 mlエツペンドルフチューブに移し、 40°Cでクロ口ホルムを蒸発させて、ョ一ドジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを 0.5M リン酸ナトリウム緩衝液（Na- Pi, pH 7.0) 400 /1 で 3 回洗浄した後、 0.5M Na- Pi， pH7.0， 5 1 を加えた。このチューブに Na- ¹²⁵ I溶液（Ame rsham社、 NEZ-033H20) 1.3 〃1(18.5 MBq) を加えた後、直ちに 1 mg/ml rOCIF 溶液（モノマー型あるいはダイマー型） 10〃1 を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で 30秒間放置した。この溶液を、予め 10 mg/ml ヨウ化力リウ厶、 0.5 M Na- Pi, pH 7.0 溶液 80 〃1 と 5% 牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水を添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液を 0.25 %牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液で平衡化しておいたスピン力ラム（1ml, G-25 fine, フアルマシア社）に負荷し、 2,000 rpmで 5分間遠心した。カラムから溶出された画分に 0.25%牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液 400 /1 を加え攪拌した後、 2 \ を取り、その放射能をガンマ一カウン夕一で測定した。このようにして調製した ¹²⁵ I標識 0CIF溶液の放射化学純度は 10% TCAにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。又、 ¹²⁵ I標識 0CIF溶液の 0CIF生物活性は、 W096/26217号公報記載の方法に従い測定した。又、 ¹²⁵ I標識 0CIF濃度は以下のように EUSAにより測定した。

(2) ¹²⁵ I標識 0CIF濃度の ELISAによる測定

W096/26217号公報記載の抗 0CIFゥサギポリクローナル抗体を 2 /g/mlになるように溶解させた 50mM NaHC0₃ (pH 9.6)100〃 1 づっを 96ゥヱルイ厶ノプレート（ axiSorp™. Nunc社）の各ゥヱルに加えて 4 でで一夜放置した。この液を吸い取つた後、ブロックエース（雪印乳業） Zリン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25 75) 300 l づっを各ゥヱルに加え、室温で 2時間放置した。この液を吸い取った後、各ゥルを 0.01%ポリソルベート 80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（P- PBS) で 3 回洗浄し、次いで ¹²⁵ I標識 0CIFサンプルあるいは 0CIF標準品を添加したブロックエース/リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25/75) 300 //1 づっを各ゥルに加え、室温で 2時間放置した。この液を吸い取った後、 P- PBS 200 /1 で各ゥエルを 6 回洗浄した。パーォキシダーゼ標識したゥサギ抗 0CIFポリクローナル抗体を含むブロックエース（雪印乳業）リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25/75)

づつを各ゥルに加え、室温で 2時間放置した。この液を吸い取った後、 P- PBS 200 l で各ゥヱルを 6回洗浄した。 TMB溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensit ivity, Scytek社） 100 pt\ づっを各ゥヱルに加え、室温で 2 -3分放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社） 100 \ づっを各ゥヱルに加えた。各ゥエルの 490 nm における吸光度をマイクロプレートリーダ一で測定した。 0CIF標準品を用いて作製した検量線より、 ¹²⁵ I標識 0CIFの濃度を求めた。 (3) OCIFの骨芽細胞あるいは脾臓細胞への結合試験

マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2あるいは脾臓細胞をそれぞれ 4xl0⁴ce 11/ml 及び 2xl0⁶cel l/ml の濃度になるように、 10一⁸ M活性型ビタミン D₃ (Calci triol)及び 10— ⁷Mデキサメサゾン添加あるいは無添加の 10%牛胎児血清（FBS)を含むひ— MEM培地に懸濁させ、この培地 lmlずつを 24ゥヱルマイクロプレートに播種した。細胞を C0₂ インキュベータ一中で 4日間培養しひ — M E M培地で洗浄した後、上記の ^{1 2 5} 1標識 0CIF (モノマ一型又はダイマー塑） 20ng/ml を加えた結合試験用培地（0. 2%牛血清アルブミン、 20 mM Hepes緩衝液、 0. 2 % NaN₃ を加えたひ- MEM培地） 200 l を各ゥエルに加えた。又、別のゥェルには、 8 g/mlrOCIF (400倍濃度）を更に添加した結合試験用培地を 200 g/ml加え、非特異的吸着量測定に供した。 C0₂ インキュベータ一中で 1時間培養した後、 1 mlのリン酸塩緩衝生理食塩水 1mlで 3 回洗浄した。この際、脾臓細胞は浮遊細胞であるため、 24ゥエルプレートを遠心分離しながら、各ゥエルの細胞を洗浄した。洗浄後、 0. 1 N NaOH溶液 500〃1 を各ゥルに加え、室温に 10分間放置することにより細胞を溶解させ、細胞に結合した RI量をガンマ一カウン夕一で測定した。 1^{2 5} 1標識 0CIFは、培養した脾臓細胞には結合せず、第 2図に示したように、活性型ビ夕ミン D₃で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞にのみ特異的に結合した。このことから、本発明蛋白質は活性型ビ夕ミン D₃とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞上に誘導される膜結合蛋白質であることが明らかになった。

〔実施例 5〕

本発明蛋白質の生物活性

(1) 骨芽細胞様ストローマ細胞の破骨細胞形成支持能

骨芽細胞の破骨細胞形成支持能は、形成される破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性 (TRAP 活性）を測定することによって評価した。即ち、 ddy マウス（8-12 週齢）の脾臓細胞（2xl0⁵ cells/100 /1 /well)とマウス骨芽細胞様ストローマ細胞 ST2(5xl0³ cells/100// 1/well) を 101 活性型ビタミン D₃、 10- ⁷ M デキサメサゾン、及び 10%牛胎仔血清を加えたひ- MEM培地に懸濁させ、 96ゥエルプレートに播種した。 C0₂ インキュベータ一中で 1週間培養した後、各ゥェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、更に 100 /1 のエタノール/ アセトン（1 :1) を加えて、室温で 1分間固定した。固定後、 5.5 m p-nitrophenol phospha teと lOmM酒石酸ナトリウムを含む 50mM クェン酸緩衝液、 pH 4.5、 100 1 を各ゥルに加え、室温で 15分間反応させた。反応後、 0.1 N NaOH溶液を各ゥエルに添加し、 405 MIの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 RIKEN CELL BANK から購入した後の継代数約 10代の ST2細胞と継代数約 40代の ST2細胞の破骨細胞形成支持能を試験した結果を第 3図に示す。この結果から、継代数の多い ST2細胞は破骨細胞形成支持能が高いことが明らかになった。

(2) 活性型ビタミン D₃ 及びデキサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストローマ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化と共培養系における破骨細胞形成の経時変化

実施例 4- (3)と同様に、骨芽細胞様ストローマ細胞株 ST2を活性型ビタミン D₃ 及びデキサメサゾン存在下で 7日間培養した。 0CIF結合試験は、実験例 4-(1)に記載した ¹²⁵1標識 0CIF (モノマータイプ）を用いて行った。非特異的結合は 4 00倍濃度の非標識 0CIFを用いて ¹²⁵ I標識 0CIFの ST2細胞への結合を競合させることにより測定した。その結果、活性型ビタミン D₃とデキサメサゾンにより、培養日数の経過と共に ¹²⁵ I標識 0CIFの特異的結合量が上昇した。即ち、第 4図及び第 5図に示したように本発明蛋白質は活性型ビタミン D₃により ST2細胞の表面に培養日数と共に発現し、その発現は培養 4日目に最大に達した。一方、マウス脾臓細胞と ST2細胞の共培養を活性型ビタミン D₃存在下で行うことにより、破骨細胞様の細胞が形成される。破骨細胞のマーカー酵素である TRAP陽性の単核前破骨細胞様細胞は培養 3、 4日目には形成され、さらに分化、成熟した TRAP陽性の多核細胞は培養 5、 6日目に形成される。本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成のそれとは良く相関していることが明らかになった。

(3) 共培養期間において、種々の培養期間のみ 0CIF処理した場合の破骨細胞形成抑制効果

本発明蛋白質が破骨細胞形成に関与する因子であることを更に明確にするために、前述の実施例 5 - (2)における 6日間の共培養期間において、種々の培養期間

(各 2日間、但し 5日目のみ 1 日間）の細胞を、 100 ng/ml の 0CIFで処理した。その結果、第 6図に示したように、 ST2細胞上に最も本発明蛋白質が発現される培養 48- 96 時間目での 0CIF処理が最も効果的に破骨細胞の形成を抑制した。即ち、 0CIFは本発明蛋白質を介して ST2 細胞に結合することにより、破骨細胞形成を抑制することが明らかになつた。

以上の結果から、本発明蛋白質は活性型ビタミン D₃とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞膜上に誘導され、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性（作用）を有することが明らかになった。

〔実施例 6〕

^{1 2 5} I標識 0CIFと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験

本発明蛋白質の存在をさらに確認するため、 ^{1 2 5} I標識 0CIFと本発明蛋白質とのクロスリンキングを行つた。実施例 4 -(3)と同様にマウス骨芽細胞様細胞株 ST 2 を活性型ビ夕ミン D₃及びデキサメサゾン存在下及び非存在下で 4日間培養した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水 1mlで洗浄した後、上記の ^{1 2 5} I標識 0C IF (モノマ一型） 25 ng/mK 又は W096/26217号公報にある配列表配列番号 76記載の蛋白質を動物細胞で発現させ上記の方法で標識することにより得られた ^{1 2 5} I標識 0CIF - CDD1 40ng/ml を加えた結合試験用培地（0.2%牛血清アルブミン、 20m Hepes 緩衝液、 0.2 % NaN₃ 、及び 100〃g/mlへパリンを加えたひ- MEM培地） 200〃 1 を添加した。又、別のゥエルには、 400 倍濃度の 0CIFを更に添加した結合試験用培地を添加し、非特異的吸着試験に供した。 C0₂ インキュベータ一中で 1時間培養した後、 100 wg/mlへパリンを加えたリン酸塩緩衝生理食塩水 1mlで 3回洗浄した。これらのゥヱルに 100〃g/mlのクロスリンキング剤、 DSS (Disuccinimidyl suberate. Pierce社）を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水 500 1 を加え、 0 でで 10分間反応させた。これらのゥエルの細胞を 0°Cに冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水 1mlで 2回洗った後、 1 % Triton X- 100 、 2m P SF (phenylmethylsu lfonyl fluorideリ、 10 M pepstatin 、 10 zM leupeptin 、 10 M antipain、及び 2πιΜ EDTA を加えた 20 mM Hepes緩衝液 100〃 1 を各ゥヱルに加え室温に 30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル 15//1 を常法により非還元条件下で SDS化した後、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（4- 20 %ポリアクリルアミドグラジェント、第一化学社）を用いて泳動させた。泳動後、ゲルを乾燥させ、 BioMax MS フイルム（Kodak 社）と BioMax MS 増感スクリーン（Kodak社）を用いて- 80 でで 24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。

¹²⁵1標識 0CIF (モノマー型、 60kDa)を用いた場合には分子量約 90， 000-110， 000 のクロスリンクされた蛋白質が検出された。又、 ¹²⁵ I標識 0CIF - CDD1 (31 kDa) を用いた場合、第 7図に示すように約 70-80kDa (平均 78 kDa)のクロスリンクされた蛋白質が検出された。

〔実施例 7〕

ST細胞上に発現する本発明蛋白質の Scatchard Plotによる解析

上記の ¹²⁵1標識 0CIF (モノマー型）を 1,000 pM になるように加えた結合試験用培地（0.2%牛血清アルブミン、 20mM Hepes 緩衝液、 0.2 % NaN₃ を加えたひ - MEM培地）を調製し、結合試験用培地を用い、 1 Z 2希釈倍率で段階的に希釈した。又、非特異的な結合を求めるため、これらの溶液に更に 400倍濃度の未標識モノマー型 0CIFを添加した溶液を調製した。調製したこれらの溶液 200 n \ を 10_ ⁸M活性型ビタミン D₃ (Calci triol)と 10— ⁷Mデキサメサゾン存在下で 4 日間培養した上記の ST2細胞（約 10継代目）のゥルに加え、実施例 4 -(3)と同様の方法で ^{1 2 5} I標識 0C IFの結合を試験した。得られた結果を常法に従って Scatchard Plotし、 OCIFと OC IF結合蛋白質の解離定数と ST2細胞当たりの 0CIF結合蛋白質の個数（サイト数）を求めた。その結果、 0CIFと本発明蛋白質の解離定数は 280pM、 ST2細胞当たりの OCIF結合蛋白質のサイト数は約 33, 000 個/細胞であった。又、実施例 5 - (1)で記載したように、約 40継代培養した ST2細胞は破骨細胞形成支持能が 10継代培養した ST2細胞よりも高かったことから、前者の ST2細胞上に発現した本発明蛋白質のサイト数を測定したところ、サイト数が 58, 000個/細胞であり、明らかに 10継代培養した ST2細胞よりも多く、本発明蛋白質の発現量の多寡が ST2細胞による破骨細胞形成支持能の強弱に繫がっていることが明らかになつた。このことは、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子であることを示す。

〔実施例 8〕

QBMcDNA のクロ一ニング

(1) マウス ST2細胞からの RNAの抽出

マウス骨芽細胞様スト口—マ細胞株 ST2(RIKEN CELし BANK, RCB0224) は、 10% 牛胎児血清を含むひ- MEM培地（ギブコ BRL社）を用いて培養した。付着細胞用 2 25cm²T- フラスコでコンフルェントになるまで培養した ST2細胞を、トリプシン処理して T-フラスコから剝がし洗浄した後、 5枚の 225cm² T-フラスコに移し、 10一⁸ M活性化ビタミ D₃ (Calci trioK 和光純薬社）、 10— ⁷M デキサメサゾン、及び 10%牛胎児血清を添加したひ- MEM培地を各々 60mlづっ加えて C0₂ インキュべ一夕一中で 5日間培養した。培養した ST2細胞から IS0GEN (和光純薬社）を用いて総 RNAを抽出した。総 RNA約 600 g から Oligo(dT)- cellulose カラム（5' -3' Prime 社）を用いてポリ A+ RNA を調製した。約 8 g のポリ A+ RNA を得た。

(2) 発現ライブラリ一の構築

実施例 8 -(1)で得られたポリ A+ RNA 2 gから Great Lengths cDNA Synthesis kit (Clontech社）を用い、その説明書に従い二本鎖 cDNAを合成した。即ち、ポリ ⁺ RNA 2 g と 01igo(dT)₂₅(dN) プライマ一を混合し蒸留水を加え最終容量を 6.25 /1 とし、 70°Cで 3分保温後、氷中で 2分冷却した。この溶液に蒸留水 2 .2 /1 、 5X First-strand buffer 2.5^1 、 lOOmM DTT (ジチオスレィトール） 0· 25 /1 、 PRIME RNase Inhibitor(lU/ml)(5' -3' Prime社） 0.5 1 、 5倍希釈した [ ひ-³² P]dCTP (アマシャム社、 3000 Ci/匪 ol、 2 Ci/ l) 0.5 1 、 dNTP (各 20mM) 0.65 /1、 MMLV (RNaseH—) 逆転写酵素 1.25 1(250 ュニット）を加え、 42°Cで 90分保温した。さらに、蒸留水を 62.25 1 、 5X second-strand buffer 20 / 1、 dNTP (各 20mM) 0.75^1、 Second-strand enzyme cocktail 5// 1 を添加し、 16°Cで 2 時間保温した。この反応液に T4DNA polymerase 7.5 ュニットを加え、 16°Cでさらに 30分保温後 0.2 M EDTA 5^1 添加して反応を停止し、フエノール ' クロロフオルム処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖 cDNAの末端に EcoRI- Sall-Notl リンカ一（Clontech社）を付加し末端をリン酸化した。サィズフラクシヨネ一ション用カラムにより 500bp 以上の cDNAを分離し、ェタノ一ル沈殿を行った。沈殿した DNAを水に溶解し、あらかじめ制限酵素 EcoRI (宝酒造社）切断及び CIAP (ゥシ小腸アルカリフォスファターゼ、宝酒造社）処理して調製した pcDL-SR ひ 296 (Molecular and Cellular Biology, Vol. 8， pp466-47 2, 1988 ) に挿入した。

(3) OC I Fとの結合を指標とした発現ライブラリーのスクリーニング

実施例 8 - (2)で得られた D N Aを用い大腸菌、 XL2 Blue MRF' (東洋紡社）を形質転換し、 1ゥヱルあたり約 100 コロニーとなるように細胞培養用 24ゥヱルブラスティックプレ一卜に調製した L カーべニシリン寒天培地（トリプトン、 0. 5% イーストエキス、 l%NaCl、 60〃g/ml力一ペニシリン、 1. 5 寒天）上に増殖させた _c 各ゥヱル中の形質転換株を 3ml の Terri f i c Brothアンピシリン培地（1. 2% トリプトン、 2. 4%イーストエキス、 0. 4%グリセロール、 0. 017M KH₂P0₄、 0. 072M K₂HP0₄, 100 g/mlアンピシリン）に懸濁し、 37°Cで一晩振盪培養した。遠心により集菌し Q IAwel l ki KQ IAGEN社）を用いてプラスミド DNAを調製した。 260nm における吸光度により DNA含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮し、 200ng/ 1 となるように蒸留水に溶解した。この様にしてそれぞれ約 100 個のコロニーから由来する DNAプールを 500 プール調製し、 C0S-7細胞（R IKEN CELL BANK, RCB0539) へのトランスフエクシヨンに用いた。 C0S-7細胞を 24ゥエルプレートに 8X10⁴ 細胞/ ゥエルとなるように播種し、 10%牛胎児血清を含む DMEM培地を用いて、 C0₂ インキュベータ一中で 37°Cにてー晚培養した。翌日、培地を除いた後、無血清 DM EM培地で細胞を洗浄した。トランスフクシヨン用試薬リボフクトアミン（ギブコ BRL社）添付のプロトコールに従い、予め 0PTI- MEM培地（ギブコ BRL 社）を用いて希釈しておいた前記プラスミド DNAとリボフヱクトァミン（ギブコ BRL 社 ) を混合し、 15分後この混合液を各ゥエルの細胞に加えた。用いた D N A及びリポフクタミンの量はそれぞれ 1 a g 及び 4 \ とした。 5 時間後、培地を除去し、 1ml の 10% 牛胎児血清を含む DMEM培地（ギブコ BRL 社）を添加し、 C0₂ インキュベ—夕—中（5%C0₂)、 37°Cで 2- 3 日培養した。上記の様にトランスフヱクトし 2- 3 日培養した C0S-7細胞を無血清 DMEM培地で洗浄した後、 ^{1 2 5} I標識した 0C IF 20ng/mlを加えた結合試験用培地（0.2%牛血清アルブミン、 20mM Hepes緩衝液、 0. lmg/ml heparin及び 0.02% NaN₃を加えた無血清 DMEM培地) 200^1 を各ゥェルに加えた。 C0₂ インキュベータ一中（5 C0₂)で 37°C 1時間培養した後、細胞を 0. lmg/ml heparinを含むリン酸塩緩衝生理食塩水 500 μΛ で 2 回洗浄した。洗浄後、 0.1 N NaOH溶液 500 zl を各ゥエルに加え、室温に 10分間放置することにより細胞を溶解させ、各ゥヱル中の ¹²⁵ Iの量をガンマ一カウンター（パッカード社）で測定した。計 500 プールをスクリーニングすることにより、 0CIFと特異的に結合する蛋白質をコードする cDNAを含む DNAプール 1 つを分離した。さらに本発明の cDNAを含む DNAプールを細分化し、前記と同様のトランスフエクシヨンとスクリーニング操作を繰り返すことにより、 0CIFと結合する蛋白質をコードする cDNAを単離した。この cDNAを含むプラスミドを P0BM291 と名付けた。このプラスミドを含む大腸菌は、 P0BM291 として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP-5953 として平成 9年 5月 23日に寄託されている。 0CIF の ¹²⁵ I標識ならびに ELISA による ¹²⁵ I標識 0CIFの定量法を以下に示す。 0CIF はョ一ドジヱン（Iodogen)法により ¹²⁵ I標識した。 2.5 mg/ml Iodogen 一クロ口ホルム溶液 20〃1 を 1.5 mlエツペンドルフチューブに移し、 40°Cでクロ口ホルムを蒸発させて、ョードジヱンコートしたチューブを調製した。このチューブを 0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液（Na - Pi, pH 7.0)400 1で 3 回洗浄した後、 0.5 M Na-Pi, pH 7.0， 5〃1 を加えた。このチューブに Na- ¹²⁵ I溶液（Amersham社、 NEZ-033H20)1.3 1(18.5 MBq) を加えた後、直ちに 1 mg/ml 0CIF溶液 (モノマー型あるいはダイマー型） 10/ 1 を加え、ボルテクスミキサーで攪拌した後、室温で 30秒間放置した。この溶液を、予め lOmg/ml沃化カリウム、 0.5 M Na- Pi， pH 7.0溶液 80 / 1と 5%牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（BSA-PBS) 5〃1 を添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液を BSA- PBS で平衡化しておいたスピンカラム（lml， G-25 fine, フアルマシア社）に負荷し、 2,000 rpmで 5分間遠心した。カラムから溶出された画分に BSA- PBS を 400 \ 加え攪拌した後、 2 ιι\ を取り、その放射能をガンマ一カウンタ一で測定した。このようにして調製した ¹²⁵ I標識 0CIF溶液の放射化学純度は 10% TCAにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。また、 ¹²⁵ I標識 0CIF溶液の 0CIF生物活性は、 W096/26217号公報記載の方法に従い測定した。また、 ¹²⁵1標識 0CIF 濃度は、以下のように ELISAにより測定した。即ち、 W096/26217号公報記載のゥサギ抗 0CIFポリクローナル抗体を 2 〃g/mlになるように溶解させた 50 mM NaHC0₃, pH 9.6 を 100 ιι\ ずつ 96ゥエルィ厶ノプレート（Nunc, MaxiSorp™) の各ゥェルに加えて 4 でで一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳業）とリン酸塩緩衝生理食塩の混合水溶液（混合比 25:75)(B-PBS) を 200 /1 ずつ各ゥルに加え、室温で 2時間放置した。この液を吸い取った後、各ゥエルを 0.01% Polysorbate 80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（P- PBS)で 3 回洗浄し、次いで ¹²⁵ I標識 0CIFサンプルあるいは 0CIF標準品を添加した B-PBSを 100 /1 ずつ各ゥエルに加え、室温で 2時間放置した。この液を吸い取った後、 P-PBS 200 li\ で各ゥエルを 6回洗浄した。パーォキシダーゼ標識したゥサギ抗 0CIFポリク π—ナル抗体を B- PBS で希釈した溶液を 100^1 ずつ各ゥュルに加え、室温で 2 時間放置した。この液を吸い取った後、 P-PBS 200 \ で各ゥルを 6回洗浄した。 Τ Β 溶液 (TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scytek社）を 100 1 ずつ各ゥヱルに加え、室温で 2- 3分放置した後、停止液（Stopping Reagent, Sc ytek社）を 100〃 1 ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥヱルの 450 nm における吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 0CIF標準品を用いて作製した検量線より ¹²⁵ I標識 0CIFの濃度を求めた。

(4) 0BMの全ァミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列の決定実施例 8 - (3)で得られた OBMcDNAの塩基配列を、夕ックダイデォキシターミネ —ターサイクルシークェンシングキット（パーキンエルマ一社）を用いて決定した。即ち、 P0BM291 を铸型とし、直接挿入断片の塩基配列を決定した。また、 Ρθ BM291 を制限酵素 EcoRI で切断し得られた約 1. Okb ならびに約 0. 7kb の断片をプラスミド pUC19(宝酒造社）の EcoRI 部位に挿入し、それらの断片の塩基配列も決定した。用いたプライマーは、 pcDL- SR 296 の挿入断片 DNAの塩基配列を決定するためのプライマー SRR2、プラスミド PUC19 の挿入断片 DNAの塩基配列を決定するためのプライマー M13PrimerM3、 M13PrimerRV (ともに宝酒造社）及び OBMcDN Aの塩基配列に基づいて設計された合成プライマー 0BM#8 である。これらプライマーの配列を配列表配列番号 3〜 6に示す。

また、決定された OBMcDNAの塩基配列を配列番号 2に、その配列から推定されるァミノ酸配列を配列番号 1にそれぞれ示す。

〔実施例 9〕

本発明 c D N Aにコ一ドされる蛋白質の発現

プラスミド P0BM291 を 6ゥヱルプレートの各ゥヱル中で C0S-7細胞にリポフエクトァミンを用いトランスフヱクシヨンし、 10% 牛胎児血清を含む DMEM培地中で 2日間培養した。 5 % 透析牛胎児血清を添加した、システィン · メチォニン不含 DMEM (大日本製薬社）に培地交換し（800 z l/wel l) 15分培養した後、 Express Pr otein Label ing Mix (NEN社、 lOmCi/ml) を 14 1 添加した。 4時間培養後、 10 %牛胎児血清を含む DMEM培地を 200 1 加え 1時間培養した。細胞を PBS で 2回洗浄後、 1 % Tri tonX-100、 1 % bovine hemoglobin、 10 g /ml leupept in、 0. 2 TlU/ml aprot inin、 ImM PMSFを含む TSAバッファ— (0. 14M NaCl、 0. 025% N aN₃ を含む lOmM Tri s- HCKpH 8. 0)) を 0. 5 ml加え、氷上 1時間静置した。ピぺッティングにより細胞を破砕した後、 4 °Cで 3000X g 10分間遠心分離し上清を得た。この上清 100 ιι\ に 200 1 の希釈バッファ— （0.1 % TritonX-100 、 0.1% bovine hemoglobin、 10〃g/ml leupeptin、 0.2 TlU/ml aprotinin、 ImM PMSFを含む TSA バッファ—）を加え、 protein A Sepharose(50/ 1)とともに 4 °Cで 1 時間振とうさせた後、 4°Cで 1500X g にて 1分間遠心分離し上清を回収することにより、 protein A Sepharose に非特異的に吸着する分画を除いた。この上清に 0CIF(l g)を加え、 4°Cで 1時間振とうさせながら 0BMと 0CIFを結合させた後、抗 0CIFポリクロ一ナル抗体（50 g)を加えて 4 °Cで 1時間振とうした。これに pr otein A Sepharose(10〃 1)を加えさらに 4 °Cで 1時間振とうした。 4 °Cで 1500 X g にて 1分間遠心分離し沈澱画分を回収した。 4で、 1500 X gで 1分間の遠心分離による沈澱の洗浄を、希釈バッファ—で 2回、 bovine hemoglobin を含まない希釈バッファ—で 2回、 TSA バッファ—で 1回、 50mM Tris- HCKPH 6.5) で 1回行った。洗浄後、沈澱に 10 % メルカプトエタノールを含む SDS バッファ一（0. 125 M Tris-HCl, 4¾ ドデシル硫酸ナトリウム、 20 グリセロール、 0.002%プロモフヱノールブル一、 pH 6.8) を加え、 100 でで 5 分加熱後 SDS- PAGE(12.5 ポリアクリルアミドゲル、第一化学社）を行った。常法によりゲルを固定した後、 Amplify (アマシャム社）により、アイソトープのシグナルを増強した後、 Bio Ma x MRフイルム（KODAK社）を用いて- 80 °Cで感光させた。結果を第 8図に示す。本発明 cDNAにコ一ドされる蛋白質の分子量は約 40， 000であることが示された。〔実施例 10〕

本発明 c DNAにコードされる蛋白質と 0CIFとの結合

プラスミド P0BM291 を 24ゥヱルプレートの各ゥヱル中で COS 細胞にリボフェクトァミンを用いてトランスフヱタトし、その細胞を 2- 3 日培養したのち無血清 DM EM培地で洗浄し、これに ¹²⁵ I標識した 0CIF 20ng/nilを加えた結合試験用培地（ 0.2%牛血清アルブミン、 20mM Hepes緩衝液、 0. lmg/ml heparin. 0.2%眺を加えた無血清 DMEM培地） 200 β\ を加えた。また別のゥヱルには、 ¹²⁵ I標識した OCIF 20ng/mlに加えて 8 /g/mlの非標識 0CIFを更に添加した結合試験用培地を 200 H\ 加えて実験を行った。 C0₂ インキュベーター中（5% C0₂) で 37°Cにて 1 時間培養した後、細胞を 0. ltng/mlの heparin を含むリン酸緩衝生理食塩水 500 pt\ で 2回洗浄した。洗浄後、 0.1 N NaOH溶液 500〃1 を各ゥヱルに加え、室温に 10分間放置することにより細胞を溶解させ、ゥヱル中の ¹²⁵ Iの量をガンマ一カウンターで測定した。その結果、第 9図に示したようにプラスミド P0BM291 をトランスフェクトした細胞にのみ ¹²⁵ I標識した 0CIFが結合することが確認された。また、その結合は、 400倍濃度の 0CIFを添加することで著しく阻害されることが確認された。以上の結果から、プラスミド P0BM291 上の cDNAにコードされる蛋白質、 0BMは、 COS- 7細胞表面で 0CIFと特異的に結合することが明らかとなった。

〔実施例 11〕

¹²⁵ I標識した 0CIFと本発明 cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキング試験

本発明 cDNAにコ一ドされる蛋白質の性質をさらに詳しく解析するため、 ¹²⁵ I 標識したモノマー型 0CIFと本発明 cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。実施例 8- (3)に記載の方法に従ってプラスミド P0BM291 を COS- 7細胞にトランスフヱク卜した後、上記の ¹²⁵ I標識した 0CIF (25 ng/ml) を加えた結合試験用培地 200 1 を添加した。また、別のゥヱルには、 ¹²⁵ I標識した 0C IFに加え 400倍濃度の非標識 0CIFをさらに添加した結合試験用培地を加えた。 C0₂ インキュベータ一中（5% C0₂) で 37°C 1時間培養した後、細胞を 0. lmg/ml hepar inを含むリン酸塩緩衝生理食塩水 500 ιι\ で 2回洗浄した。この細胞に 100 pig/ mlのクロスリンキング剤、 DSS (Disuccinimidyl suberate, Pierce社）を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水 500 //1 を加え、 0 でで 10分間反応させた。これらのゥエルの細胞を 0 °Cに冷却したリン酸緩衝生理食塩水 1 ml で 2回洗った後、この細胞に 1% Triton X-100(和光純薬社) 、 2m PMSF (phenylmethylsulfon yl fluoride 、シグマ社）、 10 /M pepstatin (和光純薬社）、 10〃M leupepti n (和光純薬社）、 10 M antipain (和光純薬社）、及び 2 mM EDTA (和光純薬社 ) を含む 20 mM Hepes緩衝液 100 1 を加え、室温に 30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル 15 1 を常法により還元条件下で SDS化した後、 SDS - 電気泳動用ゲル（4-20% ポリアクリルアミドグラジェント、第一化学社）を用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、 BioMax MS フィルム（Kodak社）と BioMax

MS 増感スクリーン（Kodak 社）を用いて- 80 °Cで 24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、 ¹²⁵ I標識モノマー型 0CIFと本発明 cDNAによりコ一ドされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、第 10図に示すように分子量約 90, 000-110， 000のバンドが検出された。

〔実施例 12〕

ノ一ザンブロットによる解析

付着細胞用 25cm² T フラスコでコンフルェントになるまで培養した ST2細胞を、トリプシン処理して T フラスコから剝がし洗浄した後、 1 枚の 225cm²T フラスコに播種し、 10— ⁸M活性化ビタミン D₃、 10"⁷ デキサメサゾン、及び 10%牛胎児血清を添加したひ- MBM培地各々 60mlを加えて C0₂ インキュベータ一中で 4 日間培養した。培養した ST2細胞から IS0GEN (和光純薬社）を用いて総 RNAを抽出した。また、活性化ビタミン D₃とデキサメサゾン非存在下で培養した ST 2細胞からも上記の方法で総 RNAを抽出した。各総 RNA 20 n (4.5 1)にそれぞれ 2.0^1 の 5X ゲル泳動緩衝液（0.2M モルホリノプロパンスルホン酸、 pH 7.0、 50mM 酢酸ナトリウム、 5mM EDTA) 、 3.5 n\ のホルムアルデヒド及び 10.0 1 のホルムアミドを加え 55 でで 15分保温後、電気泳動に供した。電気泳動用のゲルは 1. 0%ァガロース、 2.2 M脱イオン化ホルムアルデヒド、 40 mM モルホリノプ口パンスルホン酸 pH 7. 0、 lOmM 酢酸ナトリウム、 lmM EDTAの組成で調製した _c また、電気泳動は 40 mM モルホリノプロパンスルホン酸、 pH 7. 0、 10mM 酢酸ナトリウム、 ImM EDTAの緩衝液中で行った。電気泳動後、 R N Aをナイロンメンブレンにトランスファーした。 pOBM291 を制限酵素 EcoRI で切断して得られた、約 l. Okb の DNA断片を、メガプライム DNAラベリングキット（アマシャム社）及びひ -^{3 2} P- dCTP (アマシャム社）を用いて標識したものをプローブとしてハイプリダィゼ一シヨンを行った。その結果、第 11図に示すように、 ST2細胞では活性化ビ夕ミン D₃とデキサメサゾンの存在下で培養した場合に、本発明 cDNAにコ一ドされる蛋白質（0BM)の遺伝子発現が強く誘導されていることが明らかとなった。

〔実施例 13〕

本発明 cDNAにコードされる蛋白質の破骨細胞形成支持能

実施例 8 -(3)に記載の方法で COS 細胞に P0BM291 をトランスフヱクトした。 3 日後トリプシナイズした細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で一回遠心洗浄したのち、 1 % パラフオルムアルデヒドを含む PBS に細胞をサスペンドしながら室温で 5分間固定し、 PBS にて 6回遠心洗浄した。 10_⁸M活性化ビ夕ミン D₃、 10"⁷M デキサメサゾン、 10%牛胎児血清を含む - MEM培地にて調製した 1 X10⁶個/ ml のマウス脾臓紬胞及び 4 xlO⁴個/ ml の ST2細胞を 24ゥエルプレートにそれぞれ 700〃 1 、 350 / 1 添加したのち TCインサ—ト（Nunc社）を各ゥヱルにセットした。上記培地にて段階希釈した固定化 COS 細胞 (350 1)及び OCiF (50 1)をィンサート中に添加して 37°Cで 6日間培養した。この結果、 0CIFによる破骨細胞形成阻害活性が、本発明 cDNAにコードされる蛋白質により抑制されることが明らかとなった。〔実施例 14〕

分泌型 0BM の発現 (1) 分泌型 OBM 発現プラスミドの構築

OBM HF (配列表配列番号 7 ) と OBM XR (配列表配列番号 8 ) をプライマー、 p 0BM291を铸型とし P C R反応を行った。この生成物を、ァガロースゲル電気泳動で精製した後、制限酵素 Hindl l l 、 EcoR I で切断し、さらにァガロースゲル電気泳動で精製した。この精製断片（0. 6kb)を、 pSec TagA (インビトロ一ゲン社）の Hindi I I/EcoRV 断片 (5. 2kb)と、 OBM cDNAの EcoRI/PmaC I 断片 (0. 32kb) とともにライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造社）を用いてライゲーシヨンを行い、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5ひを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより pSec TagA に 0. 6Kb と 0. 32kbの断片が揷入されたプラスミドを選び出した。さらにこのプラスミドにっきダイターミネーターサイクルシークェンシング FSキット（パーキン—エルマ一社）を用いてシークェンスを行い、このプラスミドが分泌型 0BM をコードする配列（塩基配列：配列表配列番号 2の 338 〜1355番、ァミノ酸配列：配列表配列番号 1の 72〜316 番）を持っていることを確認した。このプラスミドを制限酵素 Nhe l、 Xholで切断した後、分泌型 OBM cDNAに相当する断片（l. Okb) をァガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲ一シヨンキットを用いて発現ベクター pCEP4(インビトロ一ゲン社）の NheI/Xho〖断片（10. 4 kb) に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5 ひを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型 0BM 発現プラスミド (pCEP sOBM)を持つ大腸菌株を選び出した。 PCEP sOBM を持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタ一プラスミドミディキット（キアゲン社）を用いて pCEP sOB を精製した。

(2) 分泌型 O B Mの発現 293- EBNA細胞を 109 FCS を含む IMDM ( IMDM-10 %FCS)に懸濁し、コラーゲンコ一卜した 24 ゥエルプレート（住友べ一クライト社）に 2xl0⁵ 個 /2ml/ ゥエルになるように播種し、一晩培養した。この細胞に 1 a の pCEP sOB 又は pCEP4 をリポフクトァミン（ギブコ社） 4 \ を用いて形質導入し、 0. 5ml の無血清 IM DM又は IMDM- 10 %FCS 中でさらに 2日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型 0BM の培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。培養上清に最終濃度 0. 1Mになるよう炭酸水素ナトリウムを加えた後、培養液を 96ゥエルプレートに添加し、 4 °Cで一晚放置し、培養上清中の 0BM を 96ゥヱルプレートに固相化した。このプレートを PBS で 4倍希釈したブロックエース（雪印乳業社）溶液（B- PB S)で室温に 2時間放置しブロッキングした後、 B-PBS で希釈した 3- 100ng/mlの 0C IFを各ゥヱルに 100〃 1ずつ加え 37°Cで 2時間放置した。 0. 05% Tween 20 を含む PBS(PBS- T)でプレートを洗浄した後、 B- PBS で希釈した W096/26217号記載のパ一ォキシダーゼ標識ゥサギ抗 0C IFポリクローナル抗体を各ゥヱルに 100 \ ずつ添加し、 37°Cで 2時間放置した。 PBS- T で各ゥルを 6回洗浄した後、 TMB 溶液 (TMB Sol uble Reagent, Hi gh Sens i t i vi ty' Scytek社) を 100 1ずつ各ゥヱルに加え、室温で約 10分放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を 100 li \ ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥエルの 450nmにおける吸光度をマイクロプレートリ一ダ一で測定した。結果を第 12図に示す。 pCEP sOB を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加した 0C IFの濃度に依存して 450mn の吸収が増加したが、ベクター PCEP4 を形質導入した細胞の培養上清を固定化した場合は吸収の増加はみられなかった。又、固定化に用いる培養上清の割合を 5-90% の範囲で種々に変化させ、一定濃度の OC IF (50ng/ml)を添加した際の実験の結果を第 13図に示す。 pCEP sOB を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレ一トでは、培養上清の割合が高くなるほど 450nm の吸収が増加したが、ベクター pC EP4 を形質導入した細胞の培養上清を固定化したプレートでは、吸収の増加は見られなかった。以上の結果より、分泌型 0BMが、 pCEP sOBM を形質導入した細胞の培養上清中に生産されていることが確認された。

〔実施例 15〕

チォレドキシン一 0BM融合蛋白質（Trx- 0BM)の発現

(1) チォレドキシン- 0BM融合蛋白質（Trx-OBM)発現べクタ一の構築

10 /1 の 10X ExTaq バッファー（宝酒造社）、 8 \ の lOmMdNTP (宝酒造社）、 77.5〃 1 の滅菌蒸留水、 2 a 1 の P0BM291 水溶液（10ng/〃 1)、 1 \ のプライマ -0ΒΜ3 (100pmol/ /l 、配列表配列番号 9 ) 、 1 \ のプライマ— 0BMSalR2 (10 0pmol/ /l 、配列表配列番号 1 0) 、 0.5 //1 の ExTaq (5u/ /l) (宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中で PCR 反応を行った。 95°C5分、 50°C 1秒、 55°C 1分、 74°C 1秒、 72°C 5分の反応後、 96°C 1分、 50°C 1秒、 55°C 1分、 74°C 1秒、 72°C 3分の反応を 25サイクル行った。 1 %ァガロースゲル電気泳動により、反応液全量から約 750bp の DNA 断片を QIAEX II gel extraction kit(QIAGEN社) を用いて精製した。精製した DNA 断片全量を制限酵素 SalI，EcoRI (宝酒造社）で切断した後、 1.5 %ァガロースゲル電気泳動を行い約 160bp の DNA 断片（断片 1 ) を精製し 20 1 の滅菌蒸留水に溶解した。同様に、 4 //g の P0BM291 を制限酵素 BamHI， EcoRK宝酒造社）で切断し得られた約 580bp の DNA 断片（断片 2) 、及び 2 zg の pTrXFus (InVitrogen社）を制限酵素 BamHI, Sal I (宝酒造社）で切断し得られた約 3.6kbの DNA断片（断片 3 ) をそれぞれ精製し、それぞれを 20 1 の滅菌蒸留水に溶解した。 DNA 断片の精製には QIAEX II gel extraction kit を用いた。断片し断片 2、断片 3を DNAligation kit ver.2 (宝酒造社）を用い、 16°Cで 2時間 30分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用レ、大腸菌 GI724 株（インビトロ一ゲン社）を ThioFusion Expression System (インビトロ —ゲン社）添付の Instruction Manualに記載の方法で形質転換した。得られたァンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られる DNA 断片地図の解析並びに DNA配列の決定により、 OBMcDNA断片（塩基配列：配列表配列番号 2の 350〜1111、ァミノ酸配列：配列表配列番号 1の 76〜316)がチォレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選び出した。得られた菌株を GI724/pTrxOBM25 と名付けた。

(2) 大腸菌での 0BM の発現

GI724/pTrxOBM25 株及び pTrxFus を持つ GI724 株（GI724/pTrxFus)それぞれを 2ml の RMG-Amp 培地 (0.6 %Na₂HP0₄, 0.3 %KH₂P0₄， 0.05%NaCl, 0.1 %NH₄C1 1.2 %カザミノ酸（Difco 社）、 1 %グリセロール、 ImM MgCl₂ 、 100 tg/mlァンピシリン（Sigma社） PH7.4)で 30でで 6 時間振とう培養した。菌液 0.5ml を 50 mlの Induction 培地（0.6% Na₂HP0" 0.3 %KH₂P0" 0.05%NaCK 0. \% NH₄C1、 0.2%カザミノ酸、 0.5 %グルコース、 lmM MgCl₂、 lOO^g/ral アンピシリン、 pH 7.4) に添加し、 30°Cで振とう培養した。 0D₆。。_nm での値が約 0.5 になった時点で最終濃度が 0. lmg/mlになるようにいトリプトファンを添加し、さらに 30°Cでの振とう培養を 6時間継続した。菌液を 3000Xg で遠心し菌体を集め、 12.5mlの PBS (lOmM リン酸バッファー、 0.15M NaCK pH7,4)に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ultrasonics 社）にかけ菌体を破砕し、 7000xg で 30分遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。この可溶性蛋白質画分液 10 1 ずつを還元条件下での SDS ポリアクリルアミド（10%) 電気泳動に供した。この結果、 GI724/pT rxOBM25 の可溶性蛋白質画分液には GI724/pTrxFus の可溶性蛋白質画分液には見られない分子量約 40kDa のバンドが検出された（第 14図）。よって、チォレドキシンと 0BM の融合蛋白質（Trx- 0BM ) が大腸菌中で発現していることが確認された。 (3)Trx- OBMの OC IFとの結合能

発現させた Trx-OBM が OC IFと結合することを以下の実験により確認した。即ち、 96ゥヱルイムノプレート（Nunc社）の各ゥルに 10 炭酸水素ナトリウム水溶液で 5000倍に希釈した抗チォレドキシン抗体（インビトロ一ゲン社）を 100〃1 ずつ添加し 4 °Cで一晩放置した。各ゥエル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）を PBS で 2倍希釈した溶液（BA-PBS) を各ゥニルに 200 / 1 ずつ添加し室温で 1 時間放置した。液を捨てた後、各ゥエルに BA-PBSで段階希釈した上記 GI724/pTrxOBM25 由来及び GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋 0質画分液を 100 /z l ずつ添加し室温で 2時間放置した。 PBS-T で各ゥエルを 3回洗浄した後、 BA-PBSで希釈した OC IF ( 100ng/ml ) を各ゥルに 100 n ずつ添加し室温で 2時間放置した。 PBS-T で各ゥヱルを 3回洗浄した後、 BA- PBSで 2000倍希釈した W096/26217 号記載のパ一ォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗 0C IFポリクロ一ナル抗体を各ゥヱルに 100 1 1 ずつ添加し、 2時間室温で放置した。 PBS- T で各ゥエルを 6回洗浄した後、 TMB溶液（TMB Soluble Reagent, High Sens i t ivi ty, Scytek社）を 100〃 1 ずつ各ゥヱルに加え、室温で約 10分放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek 社）を 100〃 1 ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥヱルの 450 nm における吸光度をマイク口プレートリーダ一で測定した。結果を第 15図に示す。 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは添加しなかつたものと比べて吸光度に差は認められなかったが、 GI724/pTrx0BM25 由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは、その添加濃度の増加に依存して吸光度が上昇した。又、添加する可溶性画分液の希釈割合を一定（1 % ) にし、 BA- PBSで段階希釈した OC IF (0-100ng/ml ) を添加した場合の実験結果を第 16図に示す。 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分液を用いたものでは 0C IF濃度に係わりなく吸光度は低いままであつたが、 GI 724/pTrxOBM25 由来可溶性蛋白質画分液を用いたものでは添加した OC IF濃度に依存して吸光度が上昇した。この結果より、 GI724/pTrxOBM25 で生産される Trx-OBM は、 0CIFと結合する能力があることが確認された。

(4) Trx- 0BMを生産する大腸菌の大量培養

GI724/pTrxOBM25 を RMG- Amp 寒天培地 (0.6 %Na₂HP0₄ 、 0.3 %KH₂P0₄、 0.05 %NaCU 0.1 %NH₄C1 、 2%カザミノ酸、 1 %グリセロール、 lmM MgCl₂、 100 zg/mlアンピシリン、 1.5%寒天、 PH7.4) に白金耳で塗まっし、 30°Cでー晚培養した。菌を 10mlの Induction 培地に懸濁し、 5 mlずつを 500ml の Induction 培地のはいった 2 L用三角フラスコ計 2本に添加し、 30°Cで振とう培養した。 OD₆₀ o n_m での値が約 0.5 になった時点で最終濃度が 0. lmg/mlになるように L-トリブトファンを添加し、さらに 30°Cで振とう培養を 6時間継続した。菌液を 3000 xg で 20分間遠心分離して菌体を集め、菌体を 160ml の PBS に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ultrasonics 社）にかけ菌体を破砕し、 7000xg で 30分間遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。

(5) 0CIF固定化ァフィ二ティーカラムの調製

TSKgel AF-トレシルトヨパール 650(東ソ一社） 2g と W096/26217号に記載の方法で調製した遺伝子組み換え型 0CIF 35.0 mgを含む 1.0 Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 40ndとを混合し 4 °Cでー晚ゆつくり振とうしカツプリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化する為、遠心分離により上清を除去した後、 40mlの 0.1 トリス塩酸緩衝液（pH 7.5) を沈殿した担体に加え、室温で 1 時間おだやかに振とうした。 0.01% Polysorbate 80 と 0.2M NaCl を含む 0.1 M グリシン—塩酸緩衝液（pH 3.3) 及び 0.01% Polysorbate 80 と 0.2M NaCl を含む 0.1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0) を通液しカラムを洗浄した後、 0.01% Polysorba te 80 を含む 10mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4) で 2度洗浄し、平衡化した。 (6) OCIF固定化ァフィニティ一カラムによる Trx- 0BMの精製

Trx-OBM の精製は、特に断らない限り 4 °Cで行った。上記の 0CIF固定化ァフィ二ティー担体（10ml) と上記実施例 15-(4)記載の可溶性蛋白質画分液（120ml)とを混合後、 50ml遠心管（4 本）中で、ローターを用いて 4 °Cでー晚おだやかに振とうした。この混合液中の担体をェコノカラム（バイオラッド社、内径 1.5cm長さ 15cm) に充塡した。 0.01% Polysorbate 80 を含む PBS 300ml 、 0.01% Polys orbate 80 と 2M NaClを含む lOmMリン酸ナトリウ厶緩衝液（pH 7.0) 100ml 、及び 0.01% Polysorbate 80 と 0.2M NaCl を含む 0.1 M グリシン—塩酸緩衝液（pH 3.3) 100ml を順次通液してカラムを洗浄した。次に、 0.01% Polysorbate 80 と 0.2M NaCl を含む 0.1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0) を通液し、カラ厶に吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は 5 mlずつ分取した。分取した画分には、 10 容量の 2Mトリス溶液（pH 8.0) を加え、直ちに中和した。溶出液各画分中の Trx-OBMの有無を上記実施例 15-(3)記載の方法（0CIFとの結合能）により調べた。 Trx- 0BMを含む画分を集めさらに精製した。

(7) ゲル濾過による Trx- 0BMの精製

上記実施例 15-(6)の Trx- 0BMフラクション約 25mlを、 Centriplus 10 及び Cen tricon 10 (amicon社）を用いて、約 0.5 ml に遠心濃縮した。このサンプルを、予め 0.01 ^Polysorbate 80を含む PBSで平衡化した Superose 12 HR 10/30 力ラム（1.0 X 30 cm、フアルマシア社）にかけた。分離には、 0.01% Polysorb ate 80を含む PBSを移動相として用い、流速 0.25 ml/minで展開した。カラムからの溶出液は 0.25 mlずつ分取した。分取した画分の Trx-OBMは、実施例 15-(3) 記載の方法及び Phast System (フアルマシア社）を用いた SDS- ポリアクリルァミド電気泳動（10- 15%ポリアクリルアミドゲル、フアルマシア社）と銀染色で検出した。純化された Trx-OBMを含むフラクション（Fr.20-23) を集め、 Trx- 0BM の蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ゥシ血清アルブミンを標準品として用い DC-protein assay ki t (バイオラッド社）で行った。

〔実施例 16〕

QBM の破骨細胞形成誘導活性

P0BM291 及び pcDL- SR 296 をリボフェクトアミン（ギブコ社）を用いて COS- 7細胞にそれぞれトランスフヱクトした。それぞれの細胞を 10%FCS を含む DM EMで 1 日培養後トリプシン処理し、カバ—グラス（ ran丸形、マツナミ社）を敷いた 24ゥヱルプレ—卜に 1ゥヱルあたり 5X10⁴ 個の細胞を播種し、さらに 2日間培養した。培養プレ—トを PBS で 1回洗浄したのち、 1 %パラフオル厶アルデヒドを含む PBS を加えて室温で 8 分間インキュベートし細胞を固定した。細胞を固定したプレートを PBS にて 6回洗浄したのち、 10— ⁸M活性型ビタミン D₃、 10— ⁷M デキサメサゾン、 10%牛胎児血清を含むひ- MEMにて 1 X10⁶個/ ml に懸濁したマウス脾臓細胞を 1ゥヱルあたり 700 n \ 添加した。各ゥエル上に Mi l l i cel l PCF (ミリポア社）をセットし、上記培地にて 4 xlO⁴個/ ml に懸濁した ST2細胞を Mi l l icel l PCF 中に 700 / 1 添加し 37°C、 6日間培養した。培養終了後、 Mi l l i cel l PCF を取り除き、プレートを PBS で 1回洗浄後、ァセトン- エタノール溶液（50 : 50)で 1 分間細胞を固定した後、 LEUKOCYTE AC ID PHOSPHATASEキット（シグマ社）を用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、 pcDL- SR 296 をトランスフエクトした COS- 7細胞を固定したゥル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、 P0BM291 をトランスフクトした細胞を固定したゥル中には 45± 18個（平均土標準偏差、 n=3)の TRAP陽性細胞が観察された。又、これらの TRAP陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、 0BM には破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。〔実施例 17〕

Trx- OBM及び分泌型 OBM による破骨細胞形成誘導活性

マウス脾臓細胞を 10— ⁸M 活性型ビタミン D₃、 10"⁷M デキサメサゾン、 10%牛胎児血清を含むひ- MEMに 2 X10⁶個/ ml になるように懸濁し、この懸濁液を 24ゥエルプレートに 1 ゥエルあたり 350 il l 添加した。精製した Trx-OBMを上記培地で希釈した溶液（40ng/ml)、 pCEP sOBM又は pCEP4 を形質導入した 293- EBNA細胞を IM DM- 10 %FCS で培養した培養上清を上記培地にて 10倍希釈した溶液、又は上記培地のみをそれぞれ 350 PL \ 上記のゥヱルに添加した後、 Mi l l i cel l PCF (ミリポア社）を各ゥヱルにセットし、上記培地にて懸濁した 4 xlO⁴個/ ml の ST2 細胞を Mi l l icel l PCF に 600〃1 添加した。 6日間培養した後、 Mi l l i cel l PCF を取り除き、プレ—トを PBS で一回洗浄後、アセトン- エタノール溶液（50 : 50)で 1分間細胞を固定したのち、 LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）を用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、 Trx- 0BMを添加しなかったゥル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、 Trx-OBMを添加したゥヱルには 106 ± 21 個

(平均土標準偏差、 n=3)の TRAP陽性細胞が観察された。同様に pCEP4 で形質導入された 293-EBNAの培養上清を添加したゥェル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、 pCEP sOBM で形質導入された 293- EBNAの培養上清を添加したゥルには 120 ± 31個（平均土標準偏差、 n=3)の TRAP陽性細胞が観察されすこ。又、これらの TRAP陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、 Trx-OBM及び分泌型 0BM には、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。

〔実施例 18〕

本発明の cDNAにより発現される蛋白質 0BM と本発明の天然型の 0CIF結合蛋白質との同一性

(1) ゥサギ抗 0BM ポリクローナル抗体の作製

雄性日本白色ゥサギ（体重 2. 5 - 3. 0 kg, 北山ラベス社より入手） 3羽に、実施例 14- (6)及び (7) 記載の方法により得られた精製 0BM (チォレドキシン- 0BM融合蛋白質） 200 〃g/mlをフロイント完全アジュバント（D IFC0 社）と等量混合してェマルジヨンとしたものを、 1回 l mlずつ皮下免疫した。免疫は 1週間間隔で合計 6 回行い、最終免疫後 10日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。即ち、 PBS で 2倍希釈した抗血清に最終濃度が 40% (w/v %) となるように硫酸アンモニゥムを添加して 4でで 1時間放置後、 8000 X gで 20分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量の PBS に溶解し、 PBS に対して 4 でで透析した後、 Protein G- Sepharose カラム（フアルマシア社製）に負荷した。 PB S で洗浄後、 0. 1 M グリシン- 塩酸緩衝液（pH 3. 0) で吸着した免疫グロプリン Gを溶出し、直ちに 1. 5Mトリス- 塩酸緩衝液（pH 8. 7) で中性 pHとした。溶出蛋白質画分を PBS に対して透析後、 280 nmにおける吸光度を測定し、その濃度を決定した（E ¹ 13. 5) 。西洋ヮサビパーォキシダーゼ標識した抗 0BM抗体は、マレイミド活性化バーオキシダ一ゼキット（ピアス社）を用いて作製した。即ち、 1 mgの精製抗体に 80 g の N-スクシンイミド -S- ァセチルチオ酢酸を添加し、室温で 30分間反応させた。これに 5 mgのヒドロキシルアミンを添加して脱ァセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を l mgのマレイミド活性化パーォキシダーゼと混合し、室温で 1時間反応させ酵素標識抗体を得た。

(2) ゥサギ抗 0BM ポリクローナル抗体による本発明の cDNAにより発現される蛋白質（0BM)あるいは本発明の天然型の蛋白質と 0C IFとの特異的結合能の阻害

実施例 15- (6)及び（7) 記載の方法で得られた精製 0BM (チォレドキシン一 0BM 融合蛋白質）及び実施例 2 - (4)の天然型精製 OCIF結合蛋白質をそれぞれ 0. 1 炭酸水素ナトリウムに 2 g/mlとなるように溶解し、それぞれの溶液 100 〃1 ずつを 96ゥエルィ厶ノプレート（Nunc 社製）の各ゥヱルに加え、 4 °Cで一夜放置した。各ゥヱルに 50% 濃度のブロックエースを 200 ^ 1 ずつ加え、室温で 1時間放置した。各ゥヱルを 0. 1 %ポリソルベート 20を含む PBS(P20- PBS)で 3回洗浄した後、 P20-PBS で希釈した 25% 濃度のブロックエースにゥサギ抗 0BM抗体を 200 〃g/ mlとなるように溶解し、その抗体溶液あるいは抗体を含まない 25%濃度のブロックエース溶液を 100 \ ずつ各ゥヱルに添加し、 37° (、 1時間インキュベートした。各ゥエルを Ρ20- PBSで 3回洗浄した後、実施例 8 -(3)記載の^{1 2 5}1標識した00 IF20 ng/mlを加えた結合試験溶液（0. 2 %牛血清アルブミン、 20 mM Hepes、 0. 1 mg/ml へパリンを加えた P20- PBS)を 100〃1 ずつ各ゥヱルに添加した。又、別のゥヱルには、 ^{1 2 5}1標識した OCIF 20ng/mlに加えて 8〃 g/mlの非標識 OCIFを含む結合試験溶液を 100 \ 加えて実験を行った。そのィムノプレートを 37で、 1 時間インキュベートした後、各ゥヱルを Ρ20- PBS で 6回洗浄した。各ゥヱル中の^{1 2} ⁵1の量をガンマ一カウン夕一で測定した。結果を第 17図に示す。図に示したように、本発明 cDNAにより発現され、精製して得られる 0BM及び本発明の天然型の 0C IFに特異的に結合する蛋白質は、ゥサギ抗 0BMポリクローナル抗体で処理することによって、 ^{1 2 5}1標識した 0CIFとの結合は全く起こらなかった。一方、抗体処理しなかった両蛋白質には、 ^{1 2 5}1標識 0CIFが結合することが確認された。又、それらの結合は 400倍濃度の非標識 0CIF(8 g/ml) を添加することにより顕著に阻害されることから、両蛋白質の 0CIFへの結合は特異的結合であることが明らかになつた。以上の結果から、ゥサギ抗 0BMポリクローナル抗体は、本発明 cDNAにより発現される蛋白質である 0BM及び本発明の天然型の 0CIF結合蛋白質を共に認識し、両蛋白質と 0CIFとの特異的結合を阻害することが明らかになった。〔実施例 19〕

ヒト OBMcDNAのクローニング

(1) マウス 0BM プライマーの調製

ヒト OBMcDNAのスクリーニングには、上記の実施例の方法に従い調製したマウス 0BMプライマ一、 0BM#3 及び 0BM#8 を用いた。それぞれの配列を配列表配列番号 9及び 6に示す。

(2) PCR によるヒト OBMcDNA断片の取得

ヒトリンパ節由来 cDNAライブラリーとして Human Lymph Node Marathon ready cDNA (クロンテック社）を铸型として、上記（1) で調製したマウス OBMcDNA ブライマ一を用いて、 PCR を行いヒト OBMcDNA 断片を取得した。

以下に用いた PCR の条件を示す。

10 X EX Taq ノッファー (宝酒造社） 2 u \ 2. 5 mM dNTP 1. 6 n \ cDNA溶液 1 (i l

EX Taq (宝酒造社） 0. 2 \ 蒸留水 14. 8 μΛ

40 M プライマ一 0BM#3 0. 2 n 1 40 M プライマー 0BM#8 0. 2 fi l 上記溶液をマイクロフユ一ジチューブ中で混合後、以下の条件で PCR を行った c 95°Cで 2分間前処理し、 95°C30秒、 57°C30秒及び 72で 2分 30秒間の 3段階の反応を 40回繰り返した後、 72°Cで 5分間保温した。反応液の一部をァガロース電気泳動に供したところ、上記マウス OBMcDNA プライマーで増幅される約 690bpの DNA 断片が検出された。

(3) PCR により増幅されたヒト OBMcDNA断片の精製と塩基配列の決定実施例 19- (2)で得られたヒト OBMcDNA断片をァガロース電気泳動により分離し、さらに QIAEXゲルェクストラクシヨンキット（キアゲン社）を用いて精製した。この精製されたヒト OBMcDNA 断片を铸型として、再度上記マウス OBMcDNA プライマ一を用いて PCR を行い、このヒト OBMcDNA 断片を大量に調製し、同様に QIAEX ゲルェクストラクシヨンキットにより精製した。精製されたヒト OBMcDNA 断片の塩基配列を、 0BM#3及び 0BM#8 (配列表 9及び 6 ) をプライマ一として、タックダイデォキシ夕一ミネー夕一サイクルシークェンシング FSキット（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing FS ki t ;パーキンエルマ一社）を用いて決定した。このヒト OBMcDNA 断片の塩基配列は、マウス OBMcDNA の相当する領域と比較した結果、 80. 7%の相同性を示した。

(4) 約 690 bpのヒト OBMcDNA 断片をプローブとしたハイブリダィゼーシヨン法による全長ヒト OBMcDNA のスクリーニング

実施例 19 -（3)で精製された約 690 bpのヒト OBMcDNA 断片をメガプライム DNAラベリングキット（アマシャム社）を用いて [ひ^{3 2} P] dCTP で標識し、全長のヒト OBMcDNA をスクリーニングした。スクリーニングの対象としては、 Human Lymph Node 5' -STRETCH PLUS cDNA ライブラリ一（クロンテック社、 USA)を用いた。同社のプロトコールに従い、組み換えファージを 37°Cで 15分間大腸菌 C600 Hf lに感染させた後、その大腸菌を 45°Cに加温した LB寒天培地（ 1 %トリプトン、 0. 5 % イーストエキス、 l % NaCl 、 0. 7 %寒天）に添加し、 1. 5 %寒天を含む LB寒天培地プレート上に流し込んだ。 37°Cで一夜培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンド N (アマシャム社）を約 3分間密着させた。このフィルタ一を常法に従いアルカリ変性処理した後、中和し、 2 X SSC溶液に浸した後、 UVクロスリンク（ストラタジーン社）により DNAをフィルタ一に固定した。得られたフィル夕一を Rapid-hyb バッファ一（アマシャム社）に浸潰し、 65°Cで 15分間前処理した後、熱変性した上記ヒト OBMcDNA 断片（約 690 bp、 5 x lO⁵ cpm/ml) を添加した上記バッファーに移し替え、 65°Cで一夜ハイブリダィゼーシヨンさせた。反応後、フィルタ一をそれぞれ 0. 1 % SDSを含む 2 X SSC、 1 X SSC及び 0. 1 x SSC で順次 1回ずつ 65 でで 15分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンをさらに 2回スクリーニングを繰り返すことにより純化した。それらの中から、約 2. 2 kbのインサートを持つクローンを選択し、以下の実験に用いた。この純化したファ一ジを； I hOBMと名付けた。純化した； I hOBMから QIAGEN Lambda キット（キアゲン社）のプロトコールに従い、約 10〃g の DNA を得た。この DNA を制限酵素 Sai l で消化した後、ァガロース電気泳動により約 2. 2 kbの hOBMインサート cDNAを分離した。 Q IAEX ゲルェクストラクシヨンキット（キアゲン社）を用いて精製したこの DNA断片を、あらかじめ制限酵素 Sai lで切断し、脱リン酸化しておいたプラスミド pUC19 (MBI社）に DNA ライゲ一シヨンキット ver. 2 (宝酒造社）を用いて揷入した。得られた DNA断片を含む pUC19 で大腸菌 DH 5ひ（ギブコ BRL 社）を形質転換させた。得られた形質転換株は _PUC19hOBM と名付け、これを増殖させ、約 2. 2 kbのヒト OBMcDNA が挿入されたプラスミドを常法により精製した。

(5)ヒト 0BM の全ァミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列の決定

実施例 19-(4)で得られたヒト OBMcDNA の塩基配列を、タックダイデォキシ夕一ミネ一ターサイクルシークェンシング FSキット（パーキンエルマ一社）を用いて決定した。即ち、 _PUC19hOBM を铸型とし、挿入断片の塩基配列を決定した。ブライマ一として、 PUC19 の挿入断片 DNAの塩基配列を決定するためのプライマ一、 M13PrimerM3 及び M13 PrimerRV (ともに宝酒造社）、及びヒト OBMcDNA断片（約 690bp)の塩基配列に基づいて設計した合成プライマーヒト 0BM#8を用いた。用いたプライマ—、 M13PrimerM3及び M13PrimerRV の配列を、それぞれ配列表配列番号 4及び 5に示す。これにより決定された、ヒト OBMcDNA の塩基配列から推定されるヒト OBM のアミノ酸配列を配列表配列番号 11、又、ヒト OBMcDNA の塩基配列を配列表配列番号 12に、それぞれ示す。

得られたヒト OBMcDNA を含むプラスミド、 pUC19hOBM で形質転換した大腸菌は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP-6058 として平成 9年 8月 13日に寄託されている。

〔実施例 20〕

0CIFの¹²⁵1標識ならびに ELISA による¹²⁵1標識 0CIFの定量

0CIFはョードジヱン（Iodogen) 法により¹²⁵1標識した。 2.5 mg/nd Iodogen- クロ口ホルム溶液 20 /1 を 1.5 mlエツペンドルフチューブに移し、 40°Cでクロ口ホルムを蒸発させて、ョードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液（Na-Pi， pH 7.0) 400 /1 で 3回洗浄した後、 5 l の 0.5 M Na-Pi, pH 7.0 を加えた。このチューブに Na-¹²⁵1 溶液（アマシャム社、 NEZ- 033H) 1.3 l (18.5 MBq)を加えた後、直ちに lmg/ml 0CIF溶液（モノマー型あるいはダイマー型） 10 1 を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で 30秒間放置した。この溶液を、予め 10 mg/ml沃化カリウムを含む 0. 5 M Na-Pi (pH 7.0)溶液80 /1 と 5 %牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（BSA-PBS) 5 ul を添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液を BS A-PBS で平衡化したスピンカラム（ lml， G-25 Sephadex fine, フアルマシア社）に負荷し、 2,000 rpmで 5分間遠心した。カラムから溶出された画分に BSA-PBS を 400〃 1加え攪拌した後、 2 1を取り、その放射能をガンマ一カウンターで測定した。このようにして調製した¹² 標識 0CIF溶液の放射化学純度は 10%トリクロロ酢酸（TCA) により沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。

¹²⁵1標識 0CIFの 0CIF生物活性は、 W096/26217号記載の方法に従い測定した。又、 ¹²⁵1標識 0CIF濃度は、以下のように ELISA により測定した。即ち、 W096/26217号公報記載のゥサギ抗 OCIFポリクローナル抗体を 2 /zg/mlになるように溶解した 50 mM NaHC0₃, pH 9.6を 100 \ ずつ 96ゥエルィムノプレート（Nunc 社、 MaxiSorp ™) の各ゥヱルに加えて、 4 °C一夜放置した。この溶液を捨てた後、ブロックェース（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩水との混合水溶液（混合比 25:75) (B-PBS) を 200 PL\ ずつ各ゥヱルに加え、室温で 2時間放置した。この液を捨てた後、各ゥエルを 0.01% Polysorbate 80 を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（P-PBS) で 3回洗浄し、次いで ¹²⁵1標識 0CIFサンプルあるいは 0CIF標準品を添加した B- PBS をずつ各ゥヱルに加え、室温で 2時間放置した。この液を捨てた後、 P - PBS 200 ιι\ で各ゥヱルを 6回洗浄した。パーォキシダーゼ標識したゥサギ抗 0C IFポリクロ一ナル抗体を B- PBS で希釈した溶液を 100 /1ずつ各ゥエルに加え、室温で 2時間放置した。この溶液を捨てた後、 P- PBS 200 1で各ゥルを 6回洗浄した。 TMB溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scytek社) を 100〃 1 ずつ各ゥルに加え、室温で 2〜 3分間放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を 100 1 ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥヱルの 450 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 0CIF標準品を用いて作成した検量線より¹²⁵1標識 0CIFの濃度を求めた。

〔実施例 21〕

本発明 cDNAにコ一ドされる蛋白質の発現

(1) 動物細胞用 hOBM発現ベクターの構築

pUChOBM を制限酵素 Sailで切断し、約 2.2 kbの DNA断片を 1 %ァガロース電気泳動により精製し、 DNA ブランティングキット（宝酒造社）により末端を平滑化した（平滑化 hOBMcDNA断片）。発現プラスミド pcDL- SRひ 296 (Molecular and Cellar Biology, Vol 8， pp466- 472 (1988)) を制限酵素 EcoRI で切断し、ブランティングキットにより末端を平滑化したものと、平滑化した hOBMcDNA 断片とを DNA ライゲーシヨンキット ver.2 により結合させた。ライゲ一シヨン反応液を用い大腸菌 DHひを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株から、制限酵素切断により得られる DNA断片地図の解析並びに DNA配列の決定により、 SR ひプロモーターによる転写方向に対して h OBMcDNA の転写方向が順向きに挿入されているプラスミド、 phOBM を持つ菌株を選びだし、 DH5 ひ/ phOBMと名付けた。

(2) COS- 7細胞でのヒト 0BM の発現

大腸菌、 DH5 ひ/ phOBMを培養し、キアフィルタ一プラスミドミディキット（キァゲン社）を用い、プラスミド phOBMを精製した。 phOBMを 6ゥヱルプレートの各ゥヱル中で COS- 7細胞にリポフヱクトアミンを用いてトランスフエクシヨンし、 10%牛胎児血清を含む DMEM中で 2日間培養した。 5 %透析牛胎児血清を添加した、システィン · メチォニン不含 DMEM (大日本製薬社）に培地交換し（88 1/well) 15分間培養した後、 Express Protein Labeling Mix (NEN 社、 10 mCi/ml)を 14〃1 添加した。 4時間培養後、 10%牛胎児血清を含む DMEMを 200 / 1 加え 1時間培養した。細胞を PBS で 2回洗浄後、 1 % Triton X-100 、 1 %牛へモグ□ビン、 10 〃g/mlロイぺプチン（leupeptin) 、 0.2 nu/mlァプロチニン（aprotinin) 及び 1 m PMSF を含む TSA バッファ一（0.14M NaCl 、 0.025 % NaN₃ を含む 10mMトリス - 塩酸、 pH 8.0) を 0.5 ml加え、氷上で 1時間静置した。ピベッティングにより細胞を破砕した後、 4°C、 3, 000xg, 10分間遠心し上清を得た。この上清 100 111 に 200 ιι\ の希釈バッファー（0.1% Triton X- 100 、 0.1 %牛ヘモグロビン、 10〃g/mlロイぺプチン、 0.2 TIU/mlァプロチニン及び 1 mM PMSF を含む TSA バッファー）を加え、 Protein A Sepharose (50 1)とともに 4 °Cで 1時間振盪させた後、 4°C、 1,500 xgで 1分間遠心分離し上清を回収することにより： Protein A Sepharose に非特異的に吸着する蛋白質を除去した。この上清に 0CIF (l g) を加え、 4°Cで 1時間振盪させながらヒト 0BM と 0CIFを結合させた後、ゥサギ抗 OCIFポリクローナル抗体（50 zg)を加えて 4°Cで 1時間振盪した。この溶液に Pr otein A Sepharose (10 〃1)を加え、更に 4 °Cで 1時間振盪した。 4 °C、 L 500 x gで 1分間遠心分離し沈殿画分を回収した。 4°C、 1,500 x gで 1分間遠心分離して得られた沈殿を希釈バッファーで 2回、牛へモグロビンを含まない希釈バッファ一で 2回、 TSA ノくッファーで 1回、 50 mM トリス- 塩酸（pH 6.5) で 1回、それぞれ洗浄後、沈殿に 10%^メルカプトエタノールを含む SDS バッファー（0.1 25 トリス- 塩酸、 4 %ドデシル硫酸ナトリウム、 20%グリセロール、 0.002 % ブロモフエノールブルー、 pH 6.8) を加え、 100 °Cで 5分間加熱後、 SDS-PAGE ( 12.5%ポリアクリルアミドゲル、第一化学社）にかけた。常法によりゲルを固定、乾燥させ、 Amplify (アマシャム社）により、アイソトープのシグナルを増強した後、 Bio Max MRフィルム（コダック社）を用いて- 80°Cで感光させた。結果を第 18図に示す。この結果、本発明の cDNAにコードされる蛋白質の分子量は、約 40,0 00であることが明らかとなった。

〔実施例 22〕

本発明 cDNAにコードされる蛋白質と 0CIFとの結合

実施例 21-(2)と同様に精製された phOBM を 24ゥヱルプレートの各ゥヱル中で C0 S-7細胞にリボフヱクトァミンを用いてトランスフエクトし、その細胞を 2〜 3 日間培養した後、無血清 DMEMで洗浄し、これに¹²⁵1標識した 0CIF 20 ng/ml を加えた結合試験培地（0.2 %牛血清アルブミン、 20mM Hepes緩衝液、 0. lmg/mlへパリン、 0.2 % NaN₃ を加えた無血清 DMEM) 200 /1 を加えた。また別のゥエルには、 ¹²⁵1標識した 0CIF 20 ng/ml に加えて更に 8 / g/mlの非標識 0CIFを添加した結合試験培地を 200 ml加えて実験を行った。 C0₂ インキュベーター中（5 % C0₂) 、 37°Cで 1時間培養した後、細胞を 0. lmg/mlのへパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水 500 1 で 2回洗浄した。洗浄後、 0. IN NaOH溶液 500 1 を各ゥルに加え、室温に 10分間放置することにより細胞を溶解させ、ゥエル中の¹²⁵1の量をガンマ一カウンタ一で測定した。この結果、第 19図に示したように、 phOBMをトランスフェクトした細胞にのみ¹²⁵1標識した 0CIFが結合することが確認された。又、その結合は 400 倍濃度の非標識 OCIF (8/zg/ml) を添加することにより、顕著に阻害されることが確認された。以上の結果から、 phOBM上の cDNAにコードされる蛋白質ヒト 0BM は、 C0S-7細胞表面で 0CIFに特異的に結合することが明らかとなつた。

〔実施例 23〕

¹²⁵1標識した 0CIFと本発明 cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキング試本発明 cDNAにコードされる蛋白質の性質を更に詳しく解析するため、 ¹²⁵1標識したモノマー型 0CIFと本発明 cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。即ち、実施例 21-(1)及び (2) に記載した方法に従って、それぞれ発現べクタ一を PhOBM を構築し、 COS - 7細胞にトランスフヱクトした後、上記の¹²⁵1標識した 0CIF (25 ng/ml) を加えた結合試験用培地を 200 1 ずつ各ゥエルに添加した。又、別のゥヱルには、 ¹²⁵1標識した 0CIFに加え 400 倍濃度の非標識 0CIFを更に添加した結合試験用培地を加えた。 C0₂ インキュベータ一中（5 % C0₂) 、 37°Cで 1時間培養した後、細胞を 0.1 mg/ml のへパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水 500〃 1 で 2回洗浄した。この細胞に 100 g/mlのクロスリンキング剤、 DSS (Disuccinimidyl suberate, Pierce社）を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水 500 1 を加え、 0°Cで 10分間反応させた。これらのゥヱルの細胞を 0°Cに冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水 lmlで 2回洗浄した後、この細胞に 1 % Triton X-100 (和光純薬社）、 2IIIM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, シグマ社 ) 、 10 zM ぺプスタチン（和光純薬社）、 10 M ロイぺプチン（和光純薬社）、アンチパイン（antipain, 和光純薬社）及び 2mM EDTA (和光純薬社）を含む 20 mM Hepes 緩衝液 100 /1 を加え、室温に 30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル 15 \ を常法により還元条件下で SDS 化した後、 SDS-電気泳動用ゲル（4— 20%ポリアクリルアミドグラジェント、第一化学社）を用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、 BioMAX MS フイルム（コダック社）と oMax MS 増感スクリーン（コダック社）を用いて- 80 てで 24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、 ¹²⁵1標識モノマー型 0CIFと本発明 cDNAによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、第 20図に示すように、分子量約 90,000 - 110,000 の蛋白質バンドが検出された。

〔実施例 24〕

分泌型ヒト 0BM の発現

(1) 分泌型ヒト 0BM 発現プラスミドの構築

ヒト OBM SF (配列表配列番号 13) とマウス 0BM #8 (配列表配列番号 6 ) をブライマ一、 pUC19hOBM を铸型として PCR 反応を行った。この生成物をァガ口一スゲル電気泳動で精製した後、制限酵素 SP1I、 Hindlll で切断し、さらにァガロースゲル電気泳動で精製して、 0.27 kb の断片を得た。ヒト OBM cDNAを制限酵素 Dral で部分消化し、一ヶ所切断された断片をァガロース電気泳動で精製し、その精製断片をさらに制限酵素 Hindi IIで切断した。 0.53 kb の Dral/Hindll I断片をァガロース電気泳動で精製し、この精製断片と上記の PCR 生成物の Spli, Hindlll 断片（0.27 kb) を pSec Tag A (インビトロ一ゲン社）の SP11/EcoRV断片（5.2 kb)と共にライゲーシヨンキット ver.2(宝酒造社）を用いてライゲ一シヨンを行い、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5 を形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによって、 pSec Tag Aに 0.27 kb と 0.53 k の断片が挿入されたプラスミドを選び出した。さらに、このプラスミドをタックダイデォキシターミネータ一サイクルシークェンシング FSキット（パーキンエルマ一社）を用いてシークェンスを行い、このプラスミドが分泌型ヒト 0BM をコードする配列を持っていることを確認した _c このプラスミドを制限酵素 Nhel 、 Xholで切断した後、分泌型ヒト OBM cDNAに相当する断片（0. 8 kb) をァガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲ —シヨンキットを用いて発現ベクター pCEP4 (インビトローゲン社）の Nh /Xho I 断片（10. 4 kb)に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5ひを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより、目的の構造を持った分泌型ヒト 0BM発現プラスミド（pCEPshOBM)を持つ大腸菌株を選択した。 pCEPshOBM を持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタ一プラスミドミディキット（キアゲン社）を用いて pCEPsh OBM を精製した。

(2) 分泌型 0BM の発現

293- EBNA細胞を 10% FCSを含む IMDM (IMDM-10 % FCS) に懸濁し、コラーゲンコートした 24ゥヱルプレート（住友べ一クライト社）に 2 X 10⁵ 細胞 Z Z ralZゥエルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に 1 g の pCEPshOBM及び pC EP4 のそれぞれをリポフエクトァミン（ギブコ社）を用いて形質導入し、 0. 5 mlの無血清 IMDMまたは IMDM-10 % FCS中で更に 2日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型ヒト 0BM の培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。即ち、培養上清に最終濃度が 0. 1 M になるように炭酸水素ナトリウムを加えて 4 °Cで一夜放置し、培養上清中のヒト 0BM を 96ゥエルプレートに固相化した。このプレートを PBS で 4倍希釈したブロックエース（雪印乳業社）溶液 (B- PBS) で室温に 2時間放置しブロッキングした後、 B-PBS で希釈した 3-100 ng/ml の 0C IFを加えて 37°Cで 2時間放置した。 0. 05% Polysorbate 20 を含む PBS (P-PBS) でプレートを洗浄した後、 B- PBS で希釈した W096/26217号記載のバーオキシダ一ゼ標識抗 0C IF抗体を各ゥエルに 100 μΛ ずつ添加し、 37°Cで 2時間放置した。 P- PBS で各ゥヱルを 6回洗浄した後、 TMB溶液（TMB Soluble Reagent, High Sens i t i vi ty, Scytek社）を 100 μ. \ ずつ各ゥヱルに加え、室温で約 10分間放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を 100 1 ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥヱルの 450 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を第 21図に示す。 pCEPshOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加した 0C IFの濃度に依存して 450 rnnの吸光度が増加した。一方、べクターのみの PCEP4 を形質導入した細胞の培養上清を固相化した場合には、その吸光度の増加は見られなかった。又、固相化に用いる培養上清量の割合を 5〜90% の範囲で種々変化させ、一定濃度の 0CIF (50 ng/ral) を添加した際の結果を第 22 図に示す。 pCEPshOBM を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加する培養上清量の増加につれて 450 nmにおける吸光度が増加したが、ベクタ - PCEP4 を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、吸光度の増加は見られなかった。これらの結果により、分泌型ヒト 0BMが pCEPshOBM を形質導入した細胞の培養上清中に発現していることが確認された。

〔実施例 25〕

チォレドキシンーヒ小 0BM融合蛋白質（Trx-hOBM) の発現

(1) チォレドキシン- ヒト 0BM融合蛋白質（Trx-hOBM) 発現ベクターの構築 10 /z l の 10 X ExTaqバッファ一（宝酒造社）、 8 1 の 10mM dNTP (宝酒造社）、 77. 5 l の滅菌蒸留水、 2 1 の pUC19hOBM水溶液（10 ng/〃l)、 1 1 のブライマ一マウス 0BM #3 (配列表配列番号 9 ) (100pmol/〃l)、 1 UL \ のプライマー hO BM SalR2 (配列表配列番号 14) (100praol/ 1)、 0. 5 / 1 の ExTaq (5u 1) (宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中で PCR 反応を行った。 95°C 5分、 50°C 1秒、 55 °C 1分、 74°C 1秒、 72°C 5分の反応後、 96°C 1分、 50°C 1秒、 55°C 1分、 74°C 1 秒、 72°C 3分の反応を 25サイクル行った。反応液全量から約 750 bpの DNA断片を精製した。精製した DNA断片（全量）を制限酵素 Sail (宝酒造社）及び BspHI (二ユーイングランドバイラブズ社）で切断した後、 1 %ァガロース電気泳動を行い、約 320 bpの DNA断片（断片 1 ) を精製し 20 1 の滅菌蒸留水に溶解した。同様に、実施例 19-(3)記載の pUC19hOBM 4 iig を制限酵素 BamHI, BspHI (宝酒造社）で切断して得られた約 450 bpの DNA断片（断片 2 ) 、及びの pTrxFus (インビトロジン社）を制限酵素 BamHI, Sail (宝酒造社）で切断して得られた約 3.6 kbの

DNA断片（断片 3) をそれぞれ精製し、それぞれを 20/ 1 の滅菌蒸留水に溶解した。 DNA断片の精製には QIAEX II gel extraction kit を用いた。断片し断片

2、及び断片 3を DNA ligation kit ver.2 (宝酒造社）を用い、 16°Cで 2時間 30 分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用レ、大腸菌 GI724株

(インビトロジェン社）を ThioFusion Expression System (インビトロジェン社）添付の Instruction Manualに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られる DNA断片地図の解析並びに DNA配列の決定により、 hOBM cDNA断片がチォレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選択した。得られた菌株を GI724/pTrxh0 BMと名付けた。

(2) 大腸菌での Trx-hOBMの発現

GI724/pTrxhOBM株及び PTrxFus を持つ GI724株 (GI724/pTrxFus) をそれぞれ 2 mlの RMG- Amp培地（0.6 % Na₂HP0₄、 0.3 % KH₂P0₄ 、 0.05% NaCl 、 0.1 % N H₄CK 2%カザミノ酸、 1 %グリセロール、 IraM MgCl₂、 100 g/mlアンピシリン、 pH 7.4) 中、 37°Cで 6時間振盪培養した。菌液 0.5 ml を 50 ml の Induct io n培地（0.6 % Na₂HP0₄、 0.3 % KH₂P0₄ 、 0.05% NaCl . 0.1 % NH₄C1、 0.2 % カザミノ酸、 0. 5 %グルコース、 l m MgCl ₂、 100 g/mlアンピシリン、 pH 7. 4) に添加し、 30でで振盪培養した。 0D_e。。 _{n m} における値が約 0. 5 になった時点で、最終濃度が 0. 1 mg/ml になるようにいトリブトファンを添加し、更に 30 で 6時間振盪培養した。菌液を 3. 000 x gで遠心し菌体を集め、 12. 5 ml の PB S に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ul trasonics 社）にかけ菌体を破砕し、 7, 000 X gで 30分間遠心して上清を集めて可溶性蛋白質画分とした。これらの画分溶液 10 1 ずつを還元条件下での SDS-PAGE (10%ポリアクリルアミド）に供した。この結果、第 23図に示すように、 G i724/pTrxOBMの可溶性蛋白質画分には、 GI724/pTrxFus の可溶性蛋白質画分には見られない分子量約 40， 000の蛋白質のバンドが検出された。以上の結果から、チォレドキシンとヒト 0BM の融合蛋白質（ Trx-hOBM) が大腸菌中で発現していることが確認された。

(3)Trx- OB の 0C IFとの結合能

発現させた Trx - hOBMが 0C IFと結合することを、以下の実験により確認した。即ち、 96ゥヱルイムノプレート（Nunc社）の各ゥエルに 10 mM炭酸水素ナトリウム水溶液で 5000倍に希釈した抗チォレドキシン抗体（インビトロジン社）を 100 li \ ずつ添加し 4 °Cで一夜放置した。各ゥヱル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）を PBS で 2倍希釈した溶液（BA-PBS) を各ゥルに 200 ずつ添加し室温で 1時間放置した。液を捨てた後、各ゥルを P-PBS で 3回洗浄した。各ゥヱルに BA-PBSで段階希釈した上記 GI724/pTrxhOBM 由来及び GI724/pTr xFus由来可溶性蛋白質画分溶液をずつ添加し室温で 2時間放置した。 P - PBS で各ゥエルを 3回洗浄した後、 BA-PBSで希釈した 0CIF(100ng/ml)を各ゥエルに 100 ずつ添加し室温に 2時間放置した。 P- PBS で各ゥルを 3回洗浄した後、 BA- PBSで 2000倍に希釈した W096/26217号記載のパーォキシダーゼ標識した抗 0C IF 抗体を各ゥヱルに 100 fi l ずつ添加し、室温で 2時間放置した。 P-PBS で各ゥェルを 6回洗浄した後、 TMB 溶液を 100 1 ずつ各ゥエルに加え、室温で約 10分間放置した後、停止液（Stopping Reagent)を 100 1 ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥエルの 450 MIにおける吸光度をマイクロプレートリーダ一で測定した。結果を第 24図に示す。 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したもの、添加しなかったものの間で吸光度には差異は見られなかったが、 G 1724/pTrxhOBM由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、その添加濃度が増加するにつれて吸光度が上昇した。又、添加する可溶性蛋白質画分溶液の希釈割合を一定（1 %濃度）にし、 BA- PBSで段階希釈した OCIF (0-lOOng/ml) を添加した場合の実験結果を第 25図に示す。 GI724/pTrxFus 由来可溶性蛋白質画分溶液を用いたものでは、 0CIF の濃度に係わりなく吸光度は低値であつたが、 GI724/pTrxhOBMに由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、 0CIF濃度が増加するにつれて吸光度が増加した。これらの結果から、 GI724/pTrxhOBMで生産される Trx-hOBMには、 0CIFと結合する能力があることが確認された。

(4) Trx-hOBMを生産する大腸菌の大量培養

GI724/pTrxhOBMを RMG- Amp 寒天培地 (0. 6 % Na₂HP0₄、 0. 3 % H₂P0₄ 、 0. 05 % NaCl 、 0. 1 % NH₄CK 2 %カザミノ酸、 1. 5 %寒天、 pH 7, 4) に白金耳で塗抹し、 30°Cで一夜培養した。菌体を 10 ml の Induction 培地に懸濁し、 5 mlずつを 500 mlの Induction培地の入った 2 1用三角フラスコ計 2本に添加し、 30°Cで振盪培養した。 0Ds。。 _{n m} での吸光度が約 0. 5 になった時点で最終濃度が 0. 1 mg /ml となるようにいトリブトファンを添加し、更に 30°Cで 6 時間振盪培養した。菌液を 3， 000 X gで 20分間遠心分離して菌体を集め、菌体を 160 nilの PBS に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ul trasonics 社）にかけ菌体を破砕し、 7, 000 X gで 30分間遠心分離して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。

(5) 0CIF固定化ァフィ二ティーカラムの調製 TSKgel AF-トレシルトヨパール 650 (東ソ一社） 2g と、 W096/26217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型 0CIF 35.0 mgを含む 1.0Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5) 40mlとを混合し、 4 °Cで一夜緩やかに振盪することによりカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化するため、遠心分離により上清を除去した後、 40mlの 0.1M トリス- 塩酸緩衝液（pH7.5)を沈殿した担体に加え、室温で 1時間穏やかに振盪した。 0.01 Polysorbate 80 と 0.2M NaCl を含む 0. 1 M グリシン—塩酸緩衝液（pH 3.3) 及び 0.01% Polysorbate 80 と 0.2 M NaCl を含む 0.1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（PH 2.0) を通液しカラムを洗浄した後、 0.01% Polysorbate 80 を含む 10 raM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4) で 2回洗浄し、カラムを平衡化した。

(6) 0CIF固定化ァフィ二ティ一力ラムによる Trx-hOBMの精製

Trx- hOBMの精製は、特に断らない限り 4でで行った。上記の 0CIF固定化ァフィ二ティー担体（10ml) と上記実施例 25-(4)記載の可溶性蛋白質画分溶液（120ml) とを混合後、 50ml遠心管（4本）中で、ローテ一夕一を用いて 4 °Cで一夜穏やかに振盪した。この混合液中の担体をェコノカラム（内径 1.5 cmx長さ 15cm、バイオラッド社）に充填した。 0.01% Polysorbate 80 を含む PBS 300 mU 0.01% P olysorbate 80 及び 2.0 M NaClを含む 10 m リン酸緩衝液（pH 7.0) 100 mU 0. 01% Polysorbate 80 及び 0.2 M NaClを含む 0.1 グリシン一塩酸緩衝液（pH 3 .3) 100 mlを順次通液してカラムを洗浄した。次に、 0.01% Polysorbate 80 及び 0.2M NaCl を含む 0.1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0) を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は 5mlずつ分取した。分取した画分には、 10%容量の 2M トリス溶液（PH 8.0) を加えて直ちに中和した。溶出液各画分中の Trx-hOBMの有無を、実施例 25-(3)記載の方法により調べた。又、 Trx-hOBM を含む画分を集め、更に精製を進めた。 (7) ゲル濾過による Trx- hOBMの精製

上記実施例 25-(6)記載の Trx-hOBMフラクション約 25 mlを Centriplus 10及び Centricon 10 (Ami con社）を用いて、約 0.5mlに遠心濃縮した。この濃縮サンプルを予め 0.01% Polysorbate 80 を含む PBSで平衡化した Superose 12 HR 10/30 カラム（1.0x30cm、フアルマシア社）に負荷した。移動相として 0.01% Polysor bate 80 を含む PBS を用い、流速 0.25 ml/minでカラムを展開した。カラムからの溶出液は 0.25mlずつ分取した。分取した画分の Trx-hOBMは、実施例 25-(3)記載の方法及び SDS-PAGEにより検出した。純化された Trx-hOBMを含むフラクションを集め、 Trx- hOBMの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準品として用い、 DC- protein assay kit (バイオラッド社）で測定した。

〔実施例 26〕

hOBMの破骨細胞形成誘導活性

phOBM及び pcDL-SRひ 296をリボフヱクトァミン（ギブコ社）を用いて C0S-7 細胞にそれぞれトランスフヱクトした。それぞれの細胞を 10% FCSを含む DMEMで 1 日間培養後トリプシン処理し、カバ一グラス（15 ram丸形、マツナミ社）を敷いた 24ゥエルプレートに 1ゥエル当たり 5 X10⁴ 個の細胞を播種し、さらに 2日間培養した。培養プレートを PBSで 1回洗浄した後、 1 %バラフオルムアルデヒドを含む PBS を加えて室温で 8分間ィンキュベ一トし細胞をカバーグラス上に固定化した。細胞を固定化したプレートを PBSで 6回洗浄した後、 10— ⁸ M 活性化ビ夕ミン D₃、 10— ⁷ デキサメサゾン、 10%牛胎児血清を含む - MEMにて 1 X10^S 個/ ml になるように懸濁したマウス脾臓細胞を 1ゥエル当たり 700 ずつ添加した。各ゥエル上に Millicell PCF (ミリポア社）をセッ卜し、上記培地にて 4 x 10⁴ 個/ ml に懸濁した ST2細胞を Millicell PCF中に 700^1 ずつ添加し、 37°C で 6日間培養した。培養終了後、 Millicell PCFを取り除き、プレートを PBSで 1回洗浄後、アセトン- エタノール溶液（50 ： 50)で 1分間細胞を固定した後、 LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）を用いて破骨細胞特異的マーカ一である酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、ヒト OBM cDNAを含まないベクタ一のみの pcDL- SR a 296をトランスフエクトした C0S-7 細胞を固定化したゥヱル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、 phOBM をトランスフエクトした細胞を固定化したゥル中には 65± 18個（n=3、平均値土標準偏差）の TRAP陽性細胞が観察された。又、これらの TRAP陽性細胞は¹²⁵1- 標識サケカルシトニン（アマシャム社）と特異的結合を示したことから、カルシトニンレセプ夕一を発現していることが確認された。これらの結果から、本発明 cDNAによりコードされる蛋白質であるヒト 0BM は破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。

〔実施例 27〕

Trx-hOBM及び分泌型ヒト 0BM による破骨細胞形成誘導活性

マウス脾臓細胞を 10_⁸M活性型ビタミン D₃、 10"⁷M デキサメサゾン、 10%牛胎児血清を含む - MEMに 2 X10⁶ 個/ ml になるように懸濁し、 24ゥヱルプレートに 1ゥヱルあたり 350 u\添加した。精製した Trx- hOBMを上記培地で希釈した溶液 (40 ng/ml) 、 pCEPshOBM または pCEP4 を形質導入した 293-EBNA細胞を IMDM - 10 %FBS で培養した培養上清を上記培地にて 10倍希釈した溶液または上記培地のみをそれぞれ 350 n\添加した後、 Millicell PCF (ミリポア社）を各ゥヱルにセットし、上記培地にて懸濁した 4 X10 個/ ml の ST2細胞を Millicell PCF に 60 0 n\添加した。 6日間培養した後、 Millicell PCF を取り除き、プレートを PB S で 1回洗浄後、アセトン一エタノール溶液（50 ： 50)で 1分間細胞を固定した後、 LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE キット（シグマ社）を用いて酒石酸耐性酸性フォスファタ一ゼ活性（TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、 Trx- hOBMを添加しなかったゥエル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、 Trx- hOBMを添加したゥエルには 115 ± 19個（n=3 、平均値土標準偏差）の TRAP陽性細胞が観察された。同様に、 PCEP4 で形質導入された 293 - EBNAの培養上清を添加したゥル中には TRAP活性を示す細胞は全く検出されなかつたのに対し、 pCEPshOBM で形質導入された 293-EBNAの培養上清を添加したゥェルには 125 ±23個（π=3、平均値土標準偏差）の TRAP陽性細胞が観察された。又、これら TRAP陽性細胞は^{1 2 5}1標識したサケカルシトニン（アマシャム社）と特異的結合を示しことから、カルシトニンレセプターを発現していることが確認された。これらの結果から、 Trx- hOBM及び分泌型 0BM には、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。

〔実施例 28〕

ポリクロ一ナル抗体の作製

免疫抗原として用いるマウス sOBM又はヒト sOBMは、前記の方法に従って得た。即ち、マウス sOBM cDNA (マウス OBM の N末端から 72番目までのアミノ酸を欠損させた膜結合部位を持たないマウス s OBM (配列表配列番号 16) をコードする cDNA、配列表配列番号 18) 又はヒト OBM cDNA (ヒト OBM の N末端から 71番目までのアミノ酸を欠損させた膜結合部位を持たないヒト s 0BM (配列表配列番号 17) をコードする cDNA、配列表配列番号 19) を、ィムノグロブリンの/!;—チェーンのシグナルペプチドをコードする塩基配列を含む発現べクター pSec TagA (ィンビトローゲン社）の Hind I I I/EcoR V断片 (5. 2kb)と、 OBM cDNAの EcoRI/PmaCI 断片（0. 32kb) とともにライゲ一シヨンキット ver.2(宝酒造社）を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5 αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより pSec TagA に 0. 6Kb と 0. 32kbの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。このプラスミドをダイタ一ミネ一夕一サイクルシークェンシング FSキット（パーキン一エルマ一社）を用いてシークェンスを確認した結果、このプラスミドがマウス又はヒト s OBM をコードする配列を有することを確認した。このプラスミドを制限酵素 Nhel、 Xho【で切断した後、分泌型 OBM cDNAに相当する断片（l. Okb)をァガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲ一ションキットを用いて発現ベクター pCEP4(インビトロ一ゲン社）の Nhel/Xhol 断片（10. 4kb) に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌 DH5 ひを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリ SDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型 0BM発現プラスミド（pCEP sOBM)を持つ大腸菌株を選び出した。 PCEP sOBM を持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いて pCEP sOBM を精製した。次に、 293-EBNA細胞を 10%FCS を含む IMDM ( IMDM-10 %FCS)に懸濁し、コラーゲンコ一トした 24 ゥヱルプレート（住友べ一クライト社）に 2xl0⁵ 個 /2ml/ ゥエルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に 1 g の pCEP sOBM又は pCEP4 をリポフヱタミン（ギブコ社） 4〃1 を用いて形質導入し、 0. 5ml の無血清 IMDM又は IMDM-10 %FCS 中でさらに 2日間培養し、その培養上清を回収した。遺伝子組み換えマウス可溶性 OBMOnsOBM) あるいはヒト可溶性 OBM(hsOBM)の高生産紬胞株を以下のようにスクリーニングした。 rasOBM あるいは hsOBM を含むと見られる培養上清に最終濃度が 0. 1Mになるように炭酸水素ナトリウムを添加後、それぞれの培養上清を 100 fi l づっ 96ゥエルィムノプレート（Nunc社）の各ゥヱルに添加し、 4 °Cで一夜放置して培養上清中の msOBM あるいは hsOBM を各ゥエルに固相化した。このプレートの各ゥルに PBSで 4倍希釈したブロックエース（雪印乳業社）溶液 (B- PBS)を 200 1 加え、室温で 2時間放置した。 0. 1 %polysprbate 20を含む PBS(P-PBS)で 3回洗浄後、 B- PBSで段階的に希釈した遺伝子組み換え 0CIF ( rOCIF)溶液（3〜100ng/ml) を 100 z l ずつ各ゥヱルに添加し、 37°Cで 2時間放置した。そのプレートを P B Sで 3回洗浄した後、 B- PBS で希釈したバーオキシダ —ゼ標識抗 0C IFポリクローナル抗体（W096/26217号）を 100 1 ずつ各ゥヱルにに添加し、 37°Cで 2時間放置した。 P-PBSで各ゥルを 6回洗浄後、 TMB溶液（TMB Soluble Agent, High sensi t ivi ty, Scytek社）を 100 z 1ずつ各ゥヱルに加え、室温で約 10分間放置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を 100 /z l ずつ各ゥヱルに加えた。各ゥエルの 450nm における吸光度をマイクロプレートリーダ一で測定した。 msOBM あるいは hsOBM の生産細胞株の培養上清を固相化したプレートでは、 0C IFの添加濃度に比例して、吸光度が顕著に増加した。 msOBM あるいは hsOBM の生産細胞株について、その吸光度の増加の割合の高い生産株を、それぞれ高生産株として選択した。このように選択された msOBM あるいは hsOBM高生産 293- EBNA細胞をそれぞれ 5 % F C Sを含有する IMDMを培地として用い、 T一フラスコ（T-225) を 25枚用いて大量培養した。コンフルェントに達した後、新鮮な培地を T-225 フラスコ 1枚当たり 100ml ずつ加え、 3〜4日間培養して、培養上清を回収した。この操作を 4回繰り返して、 msOBM あるいは hsOBraを含む培養上清をそれぞれ 10リットル得た。実施例 25- (6)及び (7) 記載の方法に従い rOCIF 固定化カラムを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィ一により精製することにより、これら培養上清から SDS-ポリアクリルアミド電気泳動的に均一（分子量 32kDa)な精製 msOBM及び hsOBM をそれぞれ約 10 mg及び 12mg得た。このようにして得られた精製標品を、それぞれ免疫抗原として用いた。得られた各抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS)に 200 g/mlになるように溶解し、等容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、日本白色ゥサギ各 3羽に約 1週間間隔で l mlを皮下投与し免疫した。抗体価を測定し、抗体価が最高に到達した時点で、ブースター投与し、投与 10日後に全採血した。抗血清をプロティン Aセファロースクロマトグラフィ一用バインディングバッファ一（BioRad社）で 2倍希釈し、同バッファーで平衡化したプロテイン Aカラムに負荷した。同バッファ一でカラムを充分洗浄後、カラムに吸着した抗 s OBM抗体をェルーシヨンバッファ一（Bi oRad社）あるいは 0. 1 M グリシン- HC1バッファ一、 pH 2. 9-3. 0 で溶出した。抗体溶出液を直ちに中和する目的で、 1. 0 Tris-H Cl， pH 8. 0を少量含む試験管を用いて溶出溶液を分画した。抗体溶出液を PBS に対して 4 °C、一夜透析した。抗体溶液の蛋白量をゥシ IgG をスタンダードとして Lowry 法により測定した。このようにして、本発明のポリクロ一ナル抗体を含む精製ィムノグロブリン（IgG) が、ゥサギ抗血清 l ml当たり約 10mg得られた。

〔実施例 29〕

ポリクローナル抗体を用いた ELISA による 0BM及び s OBM の測定

実施例 28で得られたゥサギ抗ヒト sOBMポリクローナル抗体を、固相抗体及び酵素標識抗体としたサンドイッチ ELISA を構築した。酵素標識は、石川らの方法（I shikawa et al.： J. Immunoassay, Vol. 4， 209-327, 1983)に従いパーォキシダ —ゼ（P0D)標識した。実施例 28で得られた抗ヒト sOBMポリクローナル抗体を 2 g/mlとなるように 0. 1 M NaHC0₃溶液に溶解し、 96—ゥヱルイムノプレート（Nunc 社）の各ゥヱルに 100 1 ずつ添加、室温で一夜放置した。次いで、各ゥヱルに 200 Jil l ずつ 50%ブロックエース（雪印乳業社）を加え、室温で 1時間放置し、各ゥヱルを 0. 1 % polysorbate 20 を含む PBS (洗浄バッファー）で 3 回洗浄した。実施例 26の方法と同様にヒト 0BM を発現し実施例 2の方法で精製することにより得られた精製ヒト 0BM、及び実施例 28で得られた精製ヒト s OBM をそれぞれ一次反応用バッファ一（40%ブロックエース、 0. 1 % polysorbate 20 を含む 0. 2 M Tris-HClバッファー、 pH 7. 2) で段階希釈した溶液を、 100 μ. \ ずつ各ゥヱルに加えた。室温で 2時間放置後、各ゥエルを上記洗浄バッファーで 3回洗浄した。実施例 26の方法と同様にヒト 0BM を発現し実施例 2の方法で精製することにより得られた精製ヒト 0BM、及び実施例 28で得られた精製ヒト s OBM をそれぞれ一次反応用バッファ一（40%ブロックエース、 0. 1 % polysorbate 20 を含む 0. 2 M Tri s-HClバッファー、 pH 7. 2) で段階希釈した溶液を、 100 n ずつ各ゥヱルに加えた。室温で 2時間放置後、各ゥエルを上記洗浄バッファーで 3回洗浄した。二次反応用バッファー（25%ブロックエース、 0. 1 % polysorbate 20 を含む 0. 1 M Tri s-HClバッファー、 PH 7. 2)で 1000倍希釈した POD 標識抗ヒト s 0BM ポリクローナル抗体を 100 z lずつ各ゥルに加え、室温で 2時間放置した後、各ゥェルを 3回洗浄バッファーで洗浄した。各ゥヱルに酵素基質溶液（TMB， ScyTek社 ) を 100 z l ずつ添加し、室温で 10分間放置後、反応停止液（Stopping reagent ， ScyTek社）を 100 n ずつ各ゥルに加えて酵素反応を停止させた。各ゥエルの 450 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダ一を用いて測定した。結果を第 26図に示す。ゥサギ抗ヒト sOBMポリクローナル抗体を用いたサンドィツチ ELIS A は、ヒト sOBM (分子量約 32kDa)及びヒト 0BM (分子量約 40kDa)をほぼ等しく認識し、それぞれの測定感度は約 12. 5 x i0—³pmol/ml (ヒト 0BMで約 500pg/ml、ヒト s0 BMで約 400pg/ral) であった。実施例 28で得られたゥサギ抗マウス sOBMポリクロ一ナル抗体を用いた ELISA によるマウス sOBM及びマウス 0BM の測定は上記と同様に実施でき、それぞれの測定感度も同程度で極めて微量のマウス s OBM あるいはマウス 0BM を測定できることが明らかとなった。

以上のように、実施例 28で得られた本発明抗ヒト sOBMポリクローナル抗体は、ヒト sOBM及びヒト 0BM の両抗原を等しく認識することから、抗ヒト OBM/sOBMポリクローナル抗体と名付けた。又、実施例 28で得られた抗マウス sOBMポリクローナル抗体は、同様にマウス sOBM及びマウス 0BM の両抗原を等しく認識することから、抗マウス OBM/sOBMポリクローナル抗体と名付けた。〔実施例 30〕

モノクローナル抗体の作製

免疫用抗原には、実施例 28で得られた精製ヒト S0BMを用いた。精製ヒト sOBMを 10 g/mlになるように生理食塩水に溶解した。このようにして調製したヒト sOBM 溶液に、同容量のフロイント完全アジュバントを加え良く乳化した後、それぞれの抗原を Balb/cマウス一匹当たり腹腔内に 200 μ. 1 ずつ 1週間間隔で 3回投与し、マウスを免疫した。次に、ヒト sOBMを 5 /z g/ml含む生理食塩水に同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し、充分乳化したものを上記 Balb/cマウス一匹あたり 200 \ ずつ、 1週間間隔で 4回追加免疫した。 4回目の追加免疫の 1週間後、ブースタ一としてヒト sOBMを 10 / g/ml含む生理食塩水を Balb/cマウス 1匹当たり 100 / 1 ずつ静脈内に投与した。最終免疫後 3日目に脾臓を摘出、脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞 P3X63-AG8. 653とを公知の方法（Koehler, G. and Mi lstein, C.， Nature, 256, 495(1975))に従い細胞融合した。融合終了後、細胞懸濁液をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミヂンを含む HAT培地中で 10日間培養した。ミエローマ細胞が死滅し、ハイプリドーマが出現した後、 HA T培地からァミノブテリンを除いた HT培地に培地交換し、培養を継続した。

〔実施例 31〕

ハイブリドーマの選択及びクローニング

実施例 30の細胞融合及び培養を開始して 10日後にハイプリドーマの出現を認めたので、下記に記載した改良ソリッドフヱーズ ELISA により、ヒト sOBMを認識する高親和性抗体及びその抗体を産生するハイプリドーマの選択を行った。又、ヒト sOBMとマウス sOBMの両方を認識する抗 0BM モノクローナル抗体を選択するために、ソリッドフヱーズ ELISA 用抗原として、ヒト sOBM以外に実施例 27で得られたマウス sOBMも使用した。ヒト sOBM及びマウス sOBMをそれぞれ 5 /z g/inlになるように 0. 1M 炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、それぞれの抗原溶液をずつ 96 —ゥヱルイムノプレート（Nunc 社）の各ゥヱルに加え、 4 °Cで一夜静置しそれぞれの抗原を固相化した。各ゥエル中の抗原溶液を捨て、各ゥルに 50%ブロックエース（雪印乳業社）を 200 ιι \ ずつ加え、室温で 1時間放置してブロッキングした。各ゥエルを 0. 1 % polysorbate 20 を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS-P ) で洗浄し、各ゥヱルに 40〃 1 の牛血清（ハイクローン社）を加えた。次いで、各ゥヱルに 10 z l のハイプリドーマ培養上清を加え、 80%血清濃度下、室温で 2 時間反応させた。 80%血清存在下でのソリッドフヱーズ EUSA の目的は、高濃度の蛋白質及び血清由来の免疫反応妨害物質等の存在中でも微量のヒト sOBMあるいはマウス sOBMと結合できる抗体、即ちヒト sOBMあるいはマウス sOBMに対して高親和性の抗体生産ハイプリドーマを選択するためである。室温で 2時間反応後、プレートを PBS-P で洗浄し、 25%ブロックエースを含む生理食塩水で 5000分の 1 に希釈したパーォキシダーゼ標識抗マウス IgG (KPL社）を各ゥヱルに 50 1 加え、室温で 2時間反応させた。プレートを PBS-Pで 3 回洗浄した後、各ゥヱルに 50〃 1 の酵素基質溶液（TMB, ScyTek社）を加え、室温で 5分間反応させた。次いで、反応停止液（stopping reagent, ScyTek社） 50 z l を加えて酵素反応を停止させた。各ゥエルの 450nm における吸光度をマイクロプレートリーダー（ィムノリーダー NJ2000, 日本インターメッド社）を用いて測定し、ヒト sOBMあるいはマウス sOBM を認識する抗体生産ハイプリドーマを選択した。特に高い吸光度（0D_{4 5}。_{n m})を示すそれぞれの抗体生産ハイプリドーマを選択し、それらを限界希釈法により 3〜 5回クローニングを繰り返すことにより、安定な抗体生産ハイプリドーマを樹立した。得られた抗体生産株の中から、さらに抗体の生産性が高いハイプリドーマ株を選別した。

〔実施例 32〕モノクローナル抗体の生産及び精製

実施例 31で得られた抗体、即ち高親和性でヒト sOBMを認識する抗体生産ハイブリドーマ及びマウス sOBMにも交差性を有する抗体を産生するハイプリドーマをそれぞれ培養し、マウス一匹当たりそれぞれのハイプリドーマを 1 X 10⁶ 細胞ずつ、約 1週間前にプリスタン（アルドリッチケミカル社）を投与しておいた Balb/c系マウスの腹腔内に移植した。約 2〜3週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のヒト sOBMあるいはヒト sOBM及びマウス sOBMを認識するモノクローナル抗体を含む腹水を得た。実施例 28に記載したプロティン Aカラムによる抗 OBM/sOBMポリクロ —ナル抗体の精製法に準じて、プロテイン Aカラム（フアルマシア社）クロマトグラフィ一により腹水から精製モノクローナル抗体を得た。

〔実施例 33〕

モノクロ一ナル抗体の抗原特異性

ヒト sOBMを特異的に認識するモノクローナル抗体並びにヒト sOBM及びマウス sO BMにも交差性を有するモノクローナル抗体について、ヒト sOBM、膜結合部位を有する intactなヒト 0BM 、マウス sOBM、及び膜結合部位を有する intactなマウス OB M を抗原とした時の抗原特異性について調べた。 30数種類のモノクローナル抗体を得たが、それらのうち代表的なモノクローナル抗体についての結果を第 1表に示す。この結果、ヒト sOBMを特異的に認識する抗ヒト sOBMモノクローナル抗体のほとんど全ては膜結合部位を有する intactなヒト 0BM も認識するが、マウス sOBM 及び膜結合部位を有する intactなマウス 0BM は認識しないことが明らかとなつた。一方、ヒト sOBM及びマウス sOBMも認識するモノクローナル抗体も得られたが、その数は極めて少なく、これらの抗体はヒト 0BM並びにマウス 0BM にも交差性を有していることがわかった。これらの結果は、ヒト 0BM とマウス 0BM には共通した抗原認識部位、即ちェピトープが存在していることを示すものである。ヒト sO BMを免疫抗原として作製した抗ヒト sOBMモノクローナル抗体は、膜結合型の inta ctな蛋白質であるヒト 0BM も等しく認識することから、抗ヒト sOBMモノクローナル抗体を抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体と名付けた。第 1表抗原

抗体名 ++++++++++ ++++

sOB hOBM msOBM mOBM

H-0BM 1

H-0BM 2 +++++++++++++ +

H-0BM 3

H-0BM 4

H-0BM 5

H-0B 6

H-0BM 7

H-0BM 8

H-0BM 9 + +

H-0BM 10

H-0BM 11

H-0B 12

H-0BM 13 + +

H-0BM 14

(hsOBM: ヒト可溶性 OBM、 hOBM: ヒト膜結合型 0BM、

msOBM: マウス可溶性 OBM、 mOBM: マウス膜結合型 0BM)

〔実施例 34〕

モノク π—ナル抗体のクラス及びサブクラスの検定本発明のモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、ィムノグロプリンクラス及びサブクラス分析キット（アマシャム社）を用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従い実施した。代表的なモノクローナル抗体についての結果を第 2表に示す。抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体の大多数は 6₁であり、その他 IgG_{2 a} 及び IgG_{2 ¾} も存在していた。又、いずれの抗体もラィトチヱーンは/ c鎖であった。第 2 3¾ 抗体名 IgG, IgG_{2 a} IgG_{2 b} IgG₃ IgA K

H-OBM 8 +

H-OBM 9

H-OBM 10

H-OBM 11

H-OBM 12 +

H-OBM 13 + + + + +

H-OBM 14

〔実施例 35〕

モノクローナル抗体の解離定数（K_D 値）の測定

公知の方法 (Betrand Friguet et al.： Journal of Immunological Methods, 7 7, 305- 319, 1986 )に従い、モノクローナル抗体の解離定数を測定した。即ち、実施例 32で得られた精製抗体を 5ng/mlに 40%ブロックエース、 0. 1 % polysorbate 20を含む 0. 4M Tris-HCl pH7. 4( 1次バッファー）で希釈し、これに実施例 28で得られた精製ヒト可溶性 OBM(hsOBM)を 6. 25ng/ml〜10 z g/ralになるように 1次バッ

+ + + + + + +

ファーで希釈したものを等容量混ぜ、 4 °Cで 15時間静置することにより hsOBM とモノクローナル抗体を結合させた。 15時間後、 hsOBM と未結合の抗体を hs0BM(10 ^ g/mK 100 1/ゥヱル）を固相化したソリツドフヱ一ズ ELISA にて測定することにより、モノクローナル抗体の hsOBM に対する解離定数を算定した。又、 hsOB M に対するモノクローナル抗体でありながら、マウス可溶性 0BM (msOBM) にも交差する抗体の msOBM に対する親和性についても、上記の hsOBM の代わりに msOBM を使用することにより同様に測定した。特に、各抗原に高い親和性を示し、酵素免疫測定法やその他バインディングアツセィ等に有用な抗体についての結果を第 3表に示す。

第 3表抗体名サブクラス抗原解離定数 Kd (M)

H-OBM 1 IgGiC c) hsOBM 1X10一^{1 1} く Kdく 1X10"¹⁰ H-OBM 4 IgGi( ) hsOBM 1X10—¹¹ <Kd< 1X10— ¹⁰ H-OBM 9 IgG,( ) hsOBM lxlO <Kd< lxio-⁸ H-OBM 9 IgGi( ) msOB 1X10—³ く Kdく 1X10— ⁷ この結果、ヒト可溶性 OBM (hsOBM )に特異的な抗体である H-OBM 1 及び H-0BM 4 は解離定数（Kd) が 10— ¹グォーダーで、 hsOBM に極めて高い親和性を有していることが明らかになった。一方、 hsOBM及びマウス可溶性 OBM (msOBM) の両方を認識する抗体、 H-0BM 9 の Kd値は、 msOBM に対しては 1(Γ⁸Μ オーダーであり、 hs 0BM に対しては 10 M オーダーであった。又、第 1表に記載の両抗原を認識する他の抗体、 H-0BM 13の両抗原に対する解離定数は、 H-0BM 9 と差異はなく、両抗体はサブクラスも一致していることから、同じェピトープを認識する同一抗体である可能性が示唆された。

〔実施例 36〕

抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体を用いたサンドィツチ ELISA によるヒト 0BM 及び sOBMの測定方法

実施例 35で得られた 2種類の高親和性モノクローナル抗体、 H-OBM 1 及び H- 0BM 4 をそれぞれ固相抗体と酵素標識抗体として、サンドイッチ ELISA を構築した。抗体の標識は、マレイミド活性化パ一ォキシダ一ゼキット（ピアス社）を用いて行った。 H- OBM 1 抗体を 10〃g /ml になるよう 0.1M炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、 100 μΛ ずつ 96—ゥェルイムノプレート（Nunc社）の各ゥヱルに加え、 4 °Cで一夜静置し固相化した。各ゥヱルの溶液を捨て、 50%濃度のブロックエース 300 jn \ を加え、室温で 2時間静置しブロッキングした。ブロッキング後、プレートを 0. 1 % polysorbate 20 を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS-P) で洗浄した。ヒト可溶性 sOBM及びヒト 0BM をそれぞれ 40%プロックエース（雪印乳業社）及び 0. 1 % polysorbate 20(和光純薬社) を含む 0. 4M Tris-HC (pH 7. 4) ( 1次反応バッファー）に溶解、希釈し、種々の濃度の被験溶液を調製した。種々の濃度に調製したそれぞれの被験溶液を 100 / l ずつ各ゥエルに加え、室温で 2 時間反応させた。 2時間後、プレートを PBS-P で洗浄し、 25%ブロックエース及び 0. 1 % polysorbate 20 を含む 0.2M Tris-HCK pH7. 4) ( 2次反応バッファー）で希釈した P0D 標識 H-0BM 4抗体を各ゥエルに 100 1 加え、室温で 2時間反応させた。プレートを PBS-P で洗浄した後、各ゥヱルに 100 / 1 の酵素基質溶液（TMB， ScyT ek社）を加えて発色させた後、反応停止液（stopping reagent, ScyTek社）を 100 U l ずつ各ゥエルに加えて酵素反応を停止した。各ゥエルの 450ηηι における吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を第 27図に示す。

この結果、実施例 35で得られた 2種類の高親和性抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体、 H- 0BM 1 及び H- 0BM 4 を用いて構築したサンドイッチ ELISA は、ヒト 0B M及びヒト sOBMを等しく認識し、その測定感度は約 1.25-2. 5x iO—³pmol/mK分子量約 40kDa のヒト 0BMでは約 50- lOOpg/ml 、分子量約 32kDa のヒ卜 sOBMでは約 40 -80pg/ml) で極めて微量のヒト 0BM及びヒト sOBMを測定できることが明らかとなつた。尚、これら 2種類の抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体、 H-0BM 1 及び H- 0BM 4 を生産するハイプリドーマを H-0BM1及び H- 0BM4と命名し、またマウス 0BM 及びマゥス sOBMも認識し、破骨細胞形成抑制活性を発揮する抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体、 H- 0BM 9 を生産するハイプリドーマを H-0BM9と命名した。これらのハイプリドーマは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP- 6264(H- 0BM1)、 FERM BP - 6265(H- 0BM4)、及び FERM BP- 6266(H-0BM9)として、平成 9年 11月 5日にそれぞれ寄託されている。

〔実施例 37〕

マウス 0BM及びマウス sOBMを認識する抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体を用いたマウス 0BM及びマウス sOBMの測定

実施例 33及び 35で得られたマウス 0BM及びマウス sOBMも認識する抗ヒト OBM/sO BMモノクローナル抗体、 H- 0BM9を固相抗体とし、実施例 28で得られた抗マウス 0B M/sOBMポリクローナル抗体を酵素標識抗体とするサンドィツチ ELISA を構築した。マゥス 0BM及びマウス sOBMをそれぞれ実施例 35と同様に一次反応用バッファーで段階的に希釈し、実施例 36と同様の方法によりマウス 0BM及びマウス sOBMを測定した。結果を第 28図に示す。この結果、本発明のマウス 0BM及びマウス sOBMも認識する本発明の抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体、 H-0BM 9 を使用することにより、マウス 0BM及びマウス sOBMを同様に測定できることが確認された。実施例 35の結果に示すように、この抗ヒト OBM/sOBMモノクローナル抗体、 H- 0BM 9 はマゥス sOBMに対する解離定数が高い、即ちマウス sOBMに対する親和性が比較的低レ、ことから、本 EUSA によるマウス 0BM (分子量約 40kDa)及びマウス sOBM (分子量約 32kDa)の測定感度は、約 25 X 10— ³pmol/ml (マウス 0BM では約 1 ng/ml 、マウス s0 BMでは約 0. 8ng/ml) 程度であった。

〔実施例 38〕

抗 OBM/sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性試験

マウス脾細胞と ST2細胞（マウス骨髄由来間質細胞）との co-cultureで osteoc last-l ike cel l(OCL) が誘導されることが知られている (Endocrinology, 125, 1 805-1813(1989)) 。そこで、 OBM/sOBM抗体をこの co-cultureに添加した時、 0CL 誘導を抑制するか否かを検討した。この co-cul ture系においてはマウス 0BMが発現しているので、実施例に使用する抗体はマウス 0BM を認識するゥサギ抗マウス OBM/sOBMポリクローナル抗体、及びヒト 0BM 及びマウス 0BM の両抗原を認識するヒト抗 OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体、 H- 0BM 9 を用いた。 10% FCSを含むひ MEM にて段階希釈したそれぞれの OBM 抗体を 24 wel l plate (ヌンク社）に 700 1/we 11、上記培地にて懸濁した雄マウス脾細胞（2 x l0⁶/ml) を 350 /z l/wel l添加した。次いでトリプシナイズした ST2細胞を 4 X 10— ⁸ M Vi tamin D₃ 及び 4Χ1(Γ⁷Μ Dexaraethazone を含む上記培地に懸濁し (8 x lO⁴ cel ls/ml) 350 l/wel l添加し、 37°Cで 6日間培養した。培養プレートを PBS にて 1回洗浄したのち、 50%ェタノ—ル、 50%ァセトンの混合液にて室温で 1分間固定した。プレ—トを風乾した後、 LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）のプロトコ—ルに従い基質液を 500/U/wel l添加し、 37°Cで 5 5 分間反応させた。この反応により破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP 活性）を示：

す細胞のみが染色される。プレートを蒸留水で 1回洗浄した後風乾して TRAP陽性細胞数をカウントした。結果を第 4表に示す。この結果、ゥサギ抗マウス OBM /s 0BM ポリクロ一ナル抗体及びマウス 0BM を認識する抗ヒト OBM/sOBMモノクロ一ナル抗体、 H- 0BM 9 とも抗体濃度に依存して 0CL 誘導を阻害することがわかった。これらの抗体は、破骨細胞形成因子、 0CIF/0PGと同様に破骨細胞形成抑制活性を有し、骨代謝異常症治療薬として有望であることが明らかになった。

第 4表

TRAP 陽性多核細胞数

抗体添加量

ゥサギ抗マウス OBM/sOBM 7ウス抗ヒ卜 OBM/sOBM

(ng/ml) ポリク π-ナル抗体モ /ク n -ナル抗体 (H-0BM 9)

(平均土標準偏差、 n= 3 ) 〔実施例 39〕

Trx-QBM のヒト破骨細胞形成誘導活性

成人健常者より静脈採取した全血から、 Hi stopaque (sigma社）を用い、添付のプロトコールに従い densi ty gradient法によって単核細胞を調製した。この単核細胞を 1(Γ⁷Μ デキサメサゾン、 200ng/mlマクロファージコロニー刺激因子（ミドリ十字社）、 10%牛胎児血清及び実施例 15で得られた精製された Trx-OBM (0-1 00ng/ml)を含むひ- MEMに 1. 3X10^e/mlになるように懸濁し、この懸濁液を 48ゥヱルプレートに 1ゥヱルあたり 300 \ 添加し 3日間 37°Cで培養した。培養液を上記培地で交換後、さらに 4日間 37°Cで培養した。培養した細胞を実施例 5に示した方法で酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性 (TRAP 活性）を示す細胞を選択的に染色し、染色された多核細胞の数を顕微鏡観察により測定した。結果を第 29図に示す。この結果、 Trx-OBM を添加しなかったゥェル中には TRAP活性を示す細胞はほとんど検出されなかったのに対し、 Trx- 0BM を添加すると濃度依存的に TRAP陽性多核細胞が出現した。又、これらの TRAP陽性多核細胞は破骨細胞のマーカーであるビトロネクチンレセプターも陽性であった。さらに、同様の培養を 48ゥエルプレートに静置した象牙質切片上で行うと、 Trx-OBM存在下でのみ象牙質切片上に吸収窩が形成された。これより、 Trx- 0BM にはヒト破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。

〔実施例 40〕

抗 OBM/sOBM抗体による骨吸収抑制活性

妊娠 15日目の ddY マウス（日本 S L C社）に [ ^{4 5}Ca] - CaCl ₂溶液（Amersham社）を 1匹あたり 25〃Ci皮下注射し、胎仔の骨を^{4 5} Caでラベルした。翌日、マウスを屠殺し開腹して、子宮から胎仔を取り出した。胎仔より前肢を摘出して、皮膚及ぴ筋肉を剝がし長管骨を摘出し、さらに軟骨を除去して長管骨の骨幹部のみにした。骨幹部は 24穴プレートに入れた 0. 5ml の培養液（0. 2 %牛血清アルブミン（s igma社）を含む BGJb mediumCGIBCO BRL社））に 1本ずつ浮かべ、 37°C， 5 %C0₂ 存在下で 24時間培養した。前培養終了後、各種骨吸収因子（ビタミン D₃、プロスタグランジン E ₂ 、副甲状腺ホルモン、インターロイキン 1 ひ）、及び正常ゥサギ IgG (100 g/ml；対照として）又は実施例 28で得られたゥサギ抗 OBM/sOBMポリクローナル抗体を含む新しい培養液 (0. 5ml) に長管骨を移し、さらに 72時間培養した。培養終了後、長管骨は 0. 5 mlの 5 %トリクロ口酢酸水溶液（和光純薬社）に入れ、室温で 3時間以上処理して脱灰した。培養液及びトリクロ口酢酸抽出液

(共に 0. 5ml)にシンチレ—タ— （AQUAS0L- 2、 PACKARD 社） 5 mlを加え、 ^{4 5}Caの放射活性を測定し、骨吸収により培養液中に遊離した^{4 5} Caの割合を算出した。結果を第 30図〜第 33図にそれぞれ示す。この結果、ビタミン D ₃ (10 — ⁸M) は骨吸収活性を上昇させたが、ゥサギ抗 OBM/sOBMポリクローナル抗体を加えることにより、濃度依存的にビタミン D₃による骨吸収を抑制し、 100// g/mlの濃度において完全に抑制した（第 30図）。又、プロスタグランジン E ₂ (10 -⁶M) あるいは副甲状腺ホルモン（100 ng/ral) は骨吸収活性を上昇させたが、ゥサギ抗 OBM/sOBMポリクローナル抗体の添加（100 z g/ml) により、プロスタグランジン E ₂ 及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収をほぼ完全に抑制した（第 31図及び第 32図）。一方、陽性対照として用いた正常ゥサギ IgG (100 ^ g/ml) は、プロスタグランジン E ₂ 及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収に対して影響しなかった。又、インタ一ロイキン 1 ひ（10 ng/ml)によっても骨吸収が引き起こされたが、ゥサギ抗 OBM/sOBMポリクローナル抗体（100 g/ml) により有意に抑制された（第 23図）。これらの結果より、本発明抗体は骨吸収抑制物質として優れていることが明らかとなった。マウス抗ヒト OBM/sOBM抗体である H-0BM 9 についても同様の実験を行った結果、ゥサギ抗 OBM/sOBMポリクローナル抗体とほぼ同等の骨吸収抑制活性があることが確認された。

産業上の利用可能性

本発明により、破骨細胞形成抑制因子（Osteoclastogenesis inhibi tory facto r ;0CIF) に結合する新規な蛋白質、その製造方法、この蛋白質を用いて該蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法、該蛋白質の作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と結合してその作用を伝達するレセプタ一のスクリ一二ング方法、及びこれらのスクリ一ニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物、該蛋白質に対する抗体、及びその抗体を用いた骨代謝異常治療剤が提供される。

また、本発明により、破骨細胞形成抑制因子 0CIFに結合する新規な蛋白質 (0CIF 結合分子）をコードする DNA、その DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、その DNAを用いて 0CIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤が提供される。更に、 0CIF結合分子の発現を調節するスクリーニング方法、 0CIF結合分子と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、 OC I F結合分子と結合しその作用を伝達するレセプ夕一のスクリ一二ング方法、これらのスクリ一二ングの結果得られた物質を含有する医薬組成物が提供される。

さらに、破骨細胞形成抑制因子 0CIFに結合する新規なヒト蛋白質（ヒト由来 0C IF結合分子、ヒト 0BM)をコードする DNA、その DNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、その DNAを用いて 0CIFに特異的に結合する性質を有し、破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤が提供される。 0CIF 結合分子の発現を調節する物質のスクリーニング方法、 0CIF結合分子と結合し、その作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、 0CIF結合分子と結合し、その生物作用を伝達するレセプ夕一のスクリーニング方法、及びこれらのスクリ一二ングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来 0CIF結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び Z又は治療薬が提供される。

またさらに、本発明により、 0CIFに特異的に結合する膜結合分子 (OCIF bindin g molecule ; 0BM)蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性 OBM(sOBM) の両抗原を認識する抗体（抗 OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この抗体を用いた 0BM及び sO BMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び Z又は治療剤が提供される。

本発明により得られた蛋白質あるいは抗体は、医薬あるいは研究又は試験用試薬として有用である。寄託された微生物への言及

(1) 微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名；

通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所

日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305)

寄託機関に寄託した日付

平成 9年 5月 23日

寄託機関に寄託について付した受託番号

FERM BP-5953

(2) 微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名；

通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所

日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305)

寄託機関に寄託した日付平成 9年 8月 13日

寄託機関に寄託について付した受託番号

FERM BP- 6058

(3) 微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名；

通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所日本国茨城県つくぱ市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) 寄託機関に寄託した日付（原寄託日）

平成 9年 11月 5日

寄託機関に寄託について付した受託番号

FERM BP-6264

(4) 微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名；

通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所

日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) 寄託機関に寄託した日付（原寄託日）

平成 9年 11月 5日

寄託機関に寄託について付した受託番号

FERM BP-6265

(5) 微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名；

通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所

日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) 寄託機関に寄託した日付（原寄託曰）

平成 9年 11月 5日

寄託機関に寄託について付した受託番号

FERM BP-6266 配列表配列番号： 1

配列の長さ： 3 1 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：蛋白質

配列：

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser 1 5 10 15

Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu

20 25 30

His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala

35 40 45

Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gin

50 55 60

Val Val Cys Ser He Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gin Met

65 70 75

Asp Pro Asn Arg l ie Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg

80 85 90 l ie Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gin Asp Ser Thr Leu

95 100 105 982 082 3

I3 ¾IV V ΠΘΙ sxq aqj aqj AJ ]Q ΐ¾Λ usv 9Π S

OLZ 992 093

SiH ^Md nio J9S usy Aio S usv sAq JIU J9S IO ^IO S人 Ί

992 092 ^ Z

} "91 usv S]H S s ojd an s an J9S JMl sAq 八 Ι¾Λ

0 982 0 Z

J ΐ¾Λ Π91 uio na J dsv J 1 QJd 八 J8S io s Jqi

02Z 912

nio SIH SIH S^V 9Md s 9U usv ¾IV "1 n^l J 1 ^Md ^IO

0\Z 902 002

dsy uio usy Ι¾Λ 3jy na つ usv ^ndl J¾ l^W usv J^S

96 ΐ 06 ϊ 981

ΘΙΙ sxq ¾iv dj Aio S-iV dsy SIH JXl djj, s s no J¾ 八

08ΐ 9 I ΟΖΐ

sAi SIH J9S i as OJJ an J9S BIV BIV usy 9Π J¾ naq SIH

991 091 991

9Md QJd ui BIV nio 。· sXq

S V uio ¾ιν Ι¾Λ dsv

09ΐ OH

dJl S 1 "ID QJd BIV 人 I S 9i SJV uio 0Jd

981 081 52 ΐ

ΐ^Λ θΐΐ SIH UIO ⁿ nio sA uio ¾IV UIO 9Md

031 9Π 0Π

UIO sAq J9j¾ BJV SJV S Q J9S dsy OJJ naq J¾ dsy Jas ni

L 0 ΐ

^^99^86 OZ.lO/86df/13d Glu Glu He Ser He Gin Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro

290 295 300

Asp Gin Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gin Asp l ie

305 310 315

Asp

316 配列番号 ·. 2

配列の長さ： 1 5 3 8

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to raRNA

配列：

GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG 60 TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG 120 CGCCATGCGC CGGGCCAGCC GAGACTACGG CAAGTACCTG CGCAGCTCGG AGGAGATGGG 180

CAGCGGCCCC GGCGTCCCAC ACGAGGGTCC GCTGCACCCC GCGCCTTCTG CACCGGCTCC 240

GGCGCCGCCA CCCGCCGCCT CCCGCTCCAT GTTCCTGGCC CTCCTGGGGC TGGGACTGGG 300

CCAGGTGGTC TGCAGCATCG CTCTGTTCCT GTACTTTCGA GCGCAGATGG ATCCTAACAG 360

AATATCAGAA GACAGCACTC ACTGCTTTTA TAGAATCCTG AGACTCCATG AAAACGCAGG 420

TTTGCAGGAC TCGACTCTGG AGAGTGAAGA CACACTACCT GACTCCTGCA GGAGGATGAA 480

ACAAGCCTTT CAGGGGGCCG TGCAGAAGGA ACTGCAACAC ATTGTGGGGC CACAGCGCTT 540

CTCAGGAGCT CCAGCTATGA TGGAAGGCTC ATGGTTGGAT GTGGCCCAGC GAGGCAAGCC 600 8 O,6、 333 11V33V33330v333ga33303VVJLV 3VLVvl3II3U

333vos133j,,vvvvv

3vj 001VVV3130V33VVVVvvvV V

33 j¾ m fiVMi j,IEv3iwJIgg謹vvvV3LV3j, V

V,31i3vUV31VVVVvu

0V3V3.LVV 13v}vvv1VViW31

ooglvvv

v33fvg VSOVViiVVV glioSv vliviu-Jv

AAACGCAAAA AACCAGAAAG G 21 配列番号： 4

配列の長さ： 1 7

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA) 配列：

GTAAAACGAC GGCCAGT 17 配列番号： 5

配列の長さ： 1 7

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA) 配列：

CAGGAAACAG CTATGAC 17 配列番号： 6

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数： 1 トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A) 配列：

AAGCCCCAAA GTACGTCGCA TC 22 配列番号： 7

配列の長さ： 2 6

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A) 配列：

CGAAGCTTTC GAGCGCAGAT GGATCC 26 配列番号： 8

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA) 配列：

CCTCTAGAGT CTATGTCCTG AAGTTTG 27 配列番号： 9 配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

ATCAGAAGAC AGCACTCACT 20 配列番号： 1 0

配列の長さ： 3 3

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

GGGGTCGACC TAGGACATCC ATGCTAATGT TCC 33 配列番号： 1 1

配列の長さ： 3 1 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：蛋白質

配列： 06ΐ 98ΐ 081

IO V dsy STH J人： L dJ丄 J9S s naq s ]¾Λ sAq STH Aio JGS

9 i OZI S9I

OJd 9Π dsy BIV usv 9U ^J naq SIH ¾iV 。· ui9 ^IV nio 09 ΐ 991 09 ΐ 9^ΐ naq S/iq J9S V sA BJV naq dsy naq dj JOS ΑΐΟ dsy i¾ ¾IV

O 9ST 08 ΐ sAq nio ¾iv SJV m uiO S 3 \ 9Π SIH UIO naq sAq

92 Ϊ 021 9Π u 八 Biv io uio Biv "ΐθ sAq an SJV 3JV SAQ dsy o

0Π 90Ϊ 001 ail naq sXq jqi dsy UIQ J9S nio ^Η9Ί ^J¾L JMI dsy uio 9qj dsy ¾IV

96 06 98

usv nio SIH na 3jy naq 9Π V 1 STH jqi Χΐθ dsy nio 08 9Z OZ 39

J9S 9Π 3Jy usv OJJ dsy UIO ¾IV V 9Md 叫 d 9qj na ¾iv

09 93 09 S s ΐΒΛ ujo Aj na naq Xio naq na BJV Ι¾Λ 9Md

^ 0 9S

WW Jas 2Jy J9S ¾IV ¾IV OJJ ojj uio STH OJ^ ¾IV OJd oj OJJ OJJ

08 92 02

BIV SIH ηθ OJd Χΐθ nio SIH OJJ ¾IV AIO 。 ^10 ^ΐΰ nio

91 01 9

nio s i SJV na J s J¾ αΑχ dsy S V ¾I V S^V ε ΐ ΐ

ZZ.lO/86<ir/X3d Trp Ala Lys l ie Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu l ie Val

195 200 205

Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn He Cys Phe Arg His

210 215 220

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gin Leu Met Val 225 230 235 240

Tyr Val Thr Lys Thr Ser l ie Lys l ie Pro Ser Ser His Thr Leu Met

245 250 255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe Hi s Phe

260 265 270

Tyr Ser l ie Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu

275 280 285

He Ser He Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp

290 295 300

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp l ie Asp

305 310 315 配列番号： 1 2

配列の長さ： 9 5 4

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列： ATGCGCCGCG CCAGCAGAGA CTACACCAAG TACCTGCGTG GCTCGGAGGA GATGGGCGGC 60 GGCCCCGGAG CCCCGCACGA GGGCCCCCTG CACGCCCCGC CGCCGCCTGC GCCGCACCAG 120 CCCCCTGCCG CCTCCCGCTC CATGTTCGTG GCCCTCCTGG GGCTGGGGCT GGGCCAGGTT 180

GTCTGCAGCG TCGCCCTGTT CTTCTATTTC AGAGCGCAGA TGGATCCTAA TAGAATATCA 240

GAAGATGGCA CTCACTGCAT TTATAGAATT TTGAGACTCC ATGAAAATGC AGATTTTCAA 300

GACACAACTC TGGAGAGTCA AGATACAAAA TTAATACCTG ATTCATGTAG GAGAATTAAA 360

CAGGCCTTTC AAGGAGCTGT GCAAAAGGAA TTACAACATA TCGTTGGATC ACAGCACATC 420

AGAGCAGAGA AAGCGATGGT GGATGGCTCA TGGTTAGATC TGGCCAAGAG GAGCAAGCTT 480

GAAGCTCAGC CTTTTGCTCA TCTCACTATT AATGCCACCG ACATCCCATC TGGTTCCCAT 540

AAAGTGAGTC TGTCCTCTTG GTACCATGAT CGGGGTTGGG CCAAGATCTC CAACATGACT 600

TTTAGCAATG GAAAACTAAT AGTTAATCAG GATGGCTTTT ATTACCTGTA TGCCAACATT 660

TGCTTTCGAC ATCATGAAAC TTCAGGAGAC CTAGCTACAG AGTATCTTCA ACTAATGGTG 720

TACGTCACTA AAACCAGCAT CAAAATCCCA AGTTCTCATA CCCTGATGAA AGGAGGAAGC 780

ACCAAGTATT GGTCAGGGAA TTCTGAATTC CATTTTTATT CCATAAACGT TGGTGGATTT 840

TTTAAGTTAC GGTCTGGAGA GGAAATCAGC ATCGAGGTCT CCAACCCCTC CTTACTGGAT 900

CCGGATCAGG ATGCAACATA CTTTGGGGCT TTTAAAGTTC GAGATATAGA TTGA 954 配列番号： 1 3

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列： GGCGTACGCA GAGCGCAGAT GGATCCT 27 配列番号： 1 4

配列の長さ： 3 4

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

GGGGTCGACC ATCCAGGAAA TATCATAACA CTCC 34

配列番号： 1 5

配列の長さ： 9 5 1

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

ATGCGCCGGG CCAGCCGAGA CTACGGCAAG TACCTGCGCA GCTCGGAGGA GATGGGCAGC 60 GGCCCCGGCG TCCCACACGA GGGTCCGCTG CACCCCGCGC CTTCTGCACC GGCTCCGGCG 120 CCGCCACCCG CCGCCTCCCG CTCCATGTTC CTGGCCCTCC TGGGGCTGGG ACTGGGCCAG 180

GTGGTCTGCA GCATCGCTCT GTTCCTGTAC TTTCGAGCGC AGATGGATCC TAACAGAATA 240

TCAGAAGACA GCACTCACTG CTTTTATAGA ATCCTGAGAC TCCATGAAAA CGCAGGTTTG 300

CAGGACTCGA CTCTGGAGAG TGAAGACACA CTACCTGACT CCTGCAGGAG GATGAAACAA 360

GCCTTTCAGG GGGCCGTGCA GAAGGAACTG CAACACATTG TGGGGCCACA GCGCTTCTCA 420 of^ 98 uio sX 8j¾ SJV SJV sAo s dsv ^0Jd ^η9Ί ^{J d s}V "10 ^J9S ^ηΐΟ naq

OS 02

J¾ J9S dsv uio na Aio ¾iv usy nio SIH naq 3jy na an §jy -ΐ

SI 01 9 I

QMd sAo S IH JM1 dsy nio s sn Sjy usv 0Jd dsy uiO ¾IV

^篛軍： - π ₀ψ ϊ ：凝 ω耱邈： ourn 9 ΐ ： ¼S ai

196 V OIOVOVIVOV OOVOXIOVVV 0111300001 113V103V03 OIVOVVOIVO

006 OOOIVOOIOO 13001X003V V33J,0100V3 UVDOVXIVV V0VV010013 OVOOOIOOVV 0^8 OimiVOOO OOllOIVVVJ, V3311V11I1 OVOOllVVOX 311VV30000 10013VVVVV 08 O0V00VOO3V OOVVVOIVOI DDVV1V3101 lOVVOOOlVV VV31V30V33 VVVV110313 QZL IVIOIOOIVO 130V01101V 10VOV3V100 VIOOOVVOOO 01V3VVV01V D1VD900111 099 30111V3VV3 003V10103V IXV1311D00 1VDVV33VV1 I000VV13VV VV003VV30V 009 V1100VOXV3 VVIOIDIVOV V33OOOI300 VO3IVO0V30 V100113X03 101313V310 Oi^g VVV1V00311 OOO31V0031 V00V333X00 1VV3XV03V3 I30VOV0011 1V00OV303O 08^ 0VO130OVV3 OOVO0OV030 00101V0011 001V01300V V00XV01V13 0V0313OVOO i ΐ ΐ

8ZZ.lO/86df/13d 9t 86 O 982 02Z ^ZZ in s d ^IO 9Md 1 ¾IV dsv ^dW。· dsv nai naq

ZZ OIZ

J3S ojj usy s uio θΐΐ s 9Π nio n Aio ¾iv V na sAq

902 002 96 Ϊ

3Md 8 d ^ΐθ ^IO usv 911 S ^J 9 d STH ^ d ηΐθ S usv ^ΐθ

061 98 ϊ 08ΐ

J9S dj usy sXq J¾ Jas ^13 ^IO sAq ^N9つ us STH S J9S oJd

S I ΟΖΐ 99 ΐ

911 sA an J3S ·ΐ¾ 八 ]ΒΛ J 1 ΐ¾Λ ⁿ⁹l ^UI0 "31 J dsy 091 99ΐ 09T ^ΐ QJd Ι¾Λ J9S ^IO J3S ^J nio STH S H SJV aqd sAQ 9H usy ¾IV

( 9SI OS! j naq J 丄 9i dsy ui usy ΐ¾Λ V naq sAq ΧΪΟ usy S

92ΐ 02ΐ 9Π n J¾ usy ^J9S an sAq ¾iv dJi iio 2JV dsy STH JAI dj J9S

0Π 901 00 Ϊ

J9S Π9 J¾ I¾ sAq STH s λΐθ S o^d ^J9S ¾IV ¾1V usv 311

96 06 98

J na STH B V aqd oJd ui ¾IV nio oJd sAq SJV u ¾iv 八

08 9Ζ 0丄 99 dsv Π8ΐ djj, J9S λιο nio ¾IV OJd ¾iv人 13 S ^Md V uio

09 99 09

OJd io ΐ^Λ 9U siH uio naq nio sXq uio ΐ^Λ ¾IV uio 9i BIV

8 ΐ I

ZZ,lO/86df/X3d W99t 86 OM Gin Asp lie Asp 配列番号： 1 7

配列の長さ： 246

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：蛋白質

配列：

Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg lie Ser Glu Asp Gly Thr His Cys He

1 5 10 15

Tyr Arg lie Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Asp Phe Gin Asp Thr Thr

20 25 30

Leu Glu Ser Gin Asp Thr Lys Leu lie Pro Asp Ser Cys Arg Arg lie

35 40 45

Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Val Gin Lys Glu Leu Gin His lie Val

50 55 60

Gly Ser Gin His lie Arg Ala Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp 65 70 75 80

Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gin Pro Phe Ala His

85 90 95

Leu Thr lie Asn Ala Thr Asp lie Pro Ser Giy Ser His Lys Val Ser

100 105 110

Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys lie Ser Asn Met 115 120 125

Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu He Val Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr

130 135 140

Leu Tyr Ala Asn lie Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu 145 150 155 160

Ala Thr Glu Tyr Leu Gin Leu Met Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser l ie

165 170 175

Lys He Pro Ser Ser His Thr Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr

180 185 190

Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser l ie Asn Val Gly Gly

195 200 205

Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu l ie Ser 〖le Glu Val Ser Asn

210 215 220

Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe 225 230 235 240

Lys Val Arg Asp l ie Asp

245 配列番号： 1 8

配列の長さ： 7 3 5

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to raRNA o o o o o o to

eg co o CO <M CO

— — CM CO CO

3J} 33gJ3vJ3v30L3vv3JV v 3VCVVI

目 3

謹 33

30 jL1i33j,.L

§

V3333 VViUViV001V JWV

0333VVVVV31 VVV 3331VV

MOSSal3aloILV VE3V3 IIVV 1VI 3

333313gJ.vf31VVJ3V1lv1vv VVV3113， U vVVΰ39V OVIVDOIV 3ΰ1νν 0V JS13S33vi0V30VVVV 333 Vjiwvv VVVVVVIE3鐘 {33VVSiUV31 O divlリ d -

CO

(XI CO

393S00030 ΰJ3g V1VVVE33νοινν iwgUQM3V1V vlivvvvvνννιviV 11V

JS0333033J3J,300 ViglvVVVV03 V3VJ333V3SLI Jsv33 ¾V1V-VV V1Vivivv

Sl33ji Ιι339 VV0;3 ogoov1ν31USVVvvovvoioivvj

33i 3J3330 ViViVVV31V1V3VS3IULU3V33O33U3VVIV101V J-1V1I30

313S3VV3331V VVVS3 VVVV133 j,VVV O

fs )v〕ovv M3WJvVVVJVJ 333V1V. luogjsj.113V1V333iJ3 {G3i¾3133S00 lVVvvvv JI33333 V3313V1V β OS VJiOiV 003VVV卜VVlVV1 ^

O

Claims

請求の範囲 . 次の物理化学的性質及び生物活性を有する新規蛋白質。

a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子 (osteoclastogenesi s inhibi tory factor

； 0C IF) に特異的に結合し、高い親和性（細胞膜上での解離定数、 Kd値が 10一³ M以下）を有する。

b. 分子量：非還元条件下における SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量測定で、約 30， 000-40, 000 又は約 40, 000±4，000 の分子量を示し、モノマ一タイプの 0CIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は、約 90, 0 00 - 110, 000を示す。

c 生物活性：活性型ビタミン D₃及び副甲状腺ホルモン（PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽細胞様スト口一マ細胞とマウス脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する。

. 骨吸収促進因子存在下で培養した骨芽様細胞株あるいは骨髄由来のストローマ細胞から細胞の膜画分を調製し、界面活性剤で膜蛋白質を可溶化し、 0CIF固定化ァフィニティカラムを用いて精製することを特徴とする、請求の範囲 1記載の蛋白質の製造方法。

. 請求の範囲 1記載の蛋白質を用い、この蛋白質に特異的に結合し、その蛋白質の生物活性を阻害あるいは修飾する物質をスクリ一二ングする方法。

. 請求の範囲 1記載の蛋白質を用い、この蛋白質に特異的に結合し、その蛋白質の生物活性を伝達する物質をスクリーニングする方法。

. 請求の範囲 3又は 4記載のスクリ一二ング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。

. 請求の範囲 1記載の蛋白質に対する抗体。

7 . 請求の範囲 6記載の抗体を有効成分とする骨代謝異常症治療剤。

8 . 配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列をコードする DNA。

9 . 配列表配列番号 2記載の塩基配列からなる DNA。

10. 配列表配列番号 2記載の塩基配列の 1又はそれ以上の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されており、且つ破骨細胞抑制因子に特異的に結合し、その活性を抑制する性質を有する蛋白質をコードする DNA。

11. 請求の範囲 8又は 10のいずれかに記載の DNAと比較的温和な条件下でハイブリダィズする DNA。

12. 請求の範囲 8〜11のいずれかに記載の DNAと 70%以上の相同性を有する DNA。

13. 請求の範囲 8〜12のいずれかに記載の DNAを遺伝子工学的に発現することにより得られる蛋白質。

14. 破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する請求の範囲 13記載の蛋白質。

15. 配列表配列番号 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。

16. 請求の範囲 8〜12記載の DNAを用いて遺伝子工学的に産生させることを特徴とする蛋白質の製造法。

17. 請求の範囲 8〜12のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法。

18. 請求の範囲 8〜12のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。

19. 請求の範囲 8〜12のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリーニング方法。

20. 請求の範囲 17〜19のいずれかに記載のスクリ一二ング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。

21. 配列表配列番号 1記載のアミノ酸配列の 76〜316 番目のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする DNA。

22. 配列表配列番号 1記載のアミノ酸配列の 72〜316 番目のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする DNA。

23. 配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする DNA。

24. 破骨細胞形成抑制因子 OC IFに特異的に結合し、その生物活性を抑制する作用を有する蛋白質をコードする、請求の範囲 21〜23のいずれかに記載の DNA。

25. 配列表配列番号 2の塩基配列を有する、請求の範囲 21〜24のいずれかに記載の DNA。

26. 請求の範囲 21〜25のいずれかに記載の DNAと比較的温和な条件下でハイプリダイズする DNA。

27. 請求の範囲 21〜26のいずれかに記載の DNAと 70%以上の相同性を有する DNA_C

28. 請求の範囲 21〜27のいずれかに記載の DNAを遺伝子工学的に発現することにより得られるポリべプチドを含む蛋白質。

29. 破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有することを特徴とする、請求の範囲 28記載の蛋白質。

30. 配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体である、請求の範囲 28又は 29に記載の蛋白質。

31. 請求の範囲 21〜27のいずれかに記載の DNAを用いて遺伝子工学的に生産させることを特徴とする蛋白質の製造方法。

32. 請求の範囲 21〜27のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法。

33. 請求の範囲 21〜27のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。

34. 請求の範囲 21〜27のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリー二ング方法。

35. 請求の範囲 32〜34のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。

36. 配列表配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする DNA。

37. 破骨細胞形成抑制因子 OC IFに特異的に結合し、その活性を抑制する活性を有する蛋白質をコードする、請求の範囲 36に記載の DNA。

38. 配列表配列番号 12記載の塩基配列を有する、請求の範囲 36又は 37記載の DNA。

39. 請求の範囲 36〜38のいずれかに記載の DNAと比較的温和な条件下でハイプリダイズする DNA。

40. 請求の範囲 36〜39のいずれかに記載の DNAと 70%以上の相同性を有する DNA。

41. 請求の範囲 36〜40のいずれかに記載の DNAを遺伝子工学的に発現することにより得られるポリべプチドを含む蛋白質。

42. 破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する請求の範囲 41記載の蛋白質。

43. 配列表配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体である、請求の範囲 41又は 42に記載の蛋白質。

44. 請求の範囲 36〜40のいずれかに記載の DNAを用いて遺伝子工学的に生産させることを特徵とする蛋白質の製造方法。

45. 請求の範囲 36〜40のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリ一二ング方法。

46. 請求の範囲 36〜40のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。

47. 請求の範囲 36〜40のいずれかに記載の DNAによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリー二ング方法。

48. 請求の範囲 45〜47のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。

49. 破骨細胞形成抑制因子（0CIF) に特異的に結合する膜結合蛋白質分子（0BM) 及び/又はその膜結合部位を欠損した可溶性 OBM(sOBM) を認識する抗体。

50. マウス 0BM及び又はマウス sOBMを認識することを特徴とする、請求の範囲 49記載の抗体。

51. ヒト 0BM及び Z又はヒト sOBMを認識することを特徵とする、請求の範囲 49記載の抗体。

52. ポリクローナル抗体である、請求の範囲 49記載の抗体。

53. モノクローナル抗体である、請求の範囲 49記載の抗体。

54. ヒト 0BM及び Z又はヒト sOBM及び Z又はマウス 0BM及び Z又はマウス sOBMに交差性を有する請求の範囲 53のモノクローナル抗体。

55. 次の性質を有する、請求の範囲 53記載のモノクローナル抗体。

a) 分子量：約 150， 000

b) サブクラス： IgGi又は IgG₂

c) ライトチェイン：鎖

56. マウス又はヒトの 0BM又は sOBMで動物を免疫し、その動物の血液を精製することを特徴とする、ポリクロ一ナル抗体の製造方法。

57. 請求の範囲 54又は 53〜55記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ o

58. 受託番号 FERM BP - 6264， FERM BP-6265 又は FERM BP-6266である、ハイプリドーマ。

59. 請求の範囲 57又は 58記載のハイプリドーマを培養し、培養液中にモノクロ一ナル抗体を産生させ、これをその培養液から精製、回収することを特徴とする、モノクローナル抗体の製造方法。

60. 請求の範囲 49〜55のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする、 0BM の測定方法。

61. 請求の範囲 49〜55のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする、 sOBM の測定方法。

62. 請求の範囲 49〜55のいずれかに記載の抗体を固相抗体及び酵素標識抗体として用いることを特徴とする、 0BM又は sOBMの測定方法。

63. 請求の範囲 49〜55のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬。

64. 請求の範囲 49〜57のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、骨代謝異常症予防及び Z又は治療剤。