WO2007132512A1 - 炎症性疾患の検出並びに炎症性疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents

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WO2007132512A1
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inflammatory
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Kenta Maruyama
Koichi Matsuo
Hisataka Yasuda
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Keio University
Oriental Yeast Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for detection of inflammatory diseases and prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention relates to a method for diagnosing or suppressing inflammatory diseases such as sepsis, allergies, and autoimmune diseases by RANKL that suppresses the production of inflammatory site force-in and improves the survival rate in inflammatory model animals.
  • CRP C-reactive protein
  • TNF-a TNF-a
  • IL—1, IL—6, IL—8, IL—10 MIP—1, HMGB—1, MIF, C5a, calcitonin and the like are known (Marshall et al., Crit Care Med 31: 1560, 2003).
  • the inflammatory reaction is a biological reaction that limits and repairs the spread of damage caused to the living body by invasion, and occurs as a nonspecific reaction to all noxious invasion. This is a physiological biological reaction that occurs in close association with neuroendocrine reactions, immune inflammatory reactions, and coagulation-fibrinolytic reactions. It appears locally as redness, swelling, pain, and hot feeling, and when it is invasive, it produces a systemic reaction accompanied by fever, veins, vaginal breathing, and leukocytosis.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • the inflammatory reaction is established by vasodilation, increased vascular permeability, leukocyte / vascular endothelial cell activation, and the like. These reactions are caused by complement, amin, kinin, prostanoid, cytodynamic force, and thrombin, which are produced nonspecifically upon invasion. Local nociceptive stimulation induces a local inflammatory response. However, when the bioinvasion is large, systemic deviation of these inflammatory mediators (especially site force in and thrombin) occurs, resulting in systemic vasodilation and permeation. Increased sex, leukocyte / vascular endothelial cell activation.
  • the inflammatory response takes the process of nociceptive acceptance, response, and repair, but if the systemic inflammatory response persists, the repair process is not reached and the homeostasis of the living body is destroyed. In such cases, it is known to cause multi-organ failure leading to death of the living body.
  • SIRS can also be thought of as a condition caused by high-site force insemia (Riedemann et al., Nat Med 9: 517, 2003).
  • activated protein C is an endogenous protein that activates not only the coagulation inhibitory function but also fibrinolytic function and inhibits thrombus formation and inflammation (DePalo et al., Advances in Sepsis 1: 114, 2001). It is expected that the risk of bleeding will increase due to its nature that is not only a function. In particular, intracranial hemorrhage is a serious adverse event, and it is necessary to exercise caution such as complying with contraindicated conditions. Other attempts have been made below.
  • Anti-endotoxin antibody specific anti-endotoxin antibody therapy, eg, polyclonal human immunoglobulin G against E. coli J5, murine (E5) and humanized (HA1A) monoclonal against endotoxin lipid A Antibodies were studied in patients with severe Gram-negative infections (Llewelyn et al., Sepsis 3: 39, 1999), but no benefit was found in large trials.
  • Anti-TNF therapy refers to neutralization therapy targeting TNF-a, which is one of the inflammatory site forces in by anti-TNF monoclonal antibody and soluble TNF receptor. To tell. Inhibition of TNF-a has been reported to improve survival in many sepsis models (Tracey et al., Nature 330: 662, 1987; Pennington et al., Clin Infect Dis 17 (Suppl 2): S515, 1993 However, despite the fact that several Phase I and Phase III clinical trials were subsequently conducted, suppression of TNF-a action by anti-TNF treatment has improved survival, (Abraham JAMA 273: 934, 1995; Reinhart et al., Crit Care Med 24: 733, 1996; Severansky et al., Seps ss 3: 11, 1999; Reinhart et al., Crit Care Med 29: S121, 2001).
  • IL-lRa IL-1 Receptor Antagonist
  • PAF receptor antagonist PAF receptor antagonist
  • PAF Platelet aggregation factor
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs The antiprostaglandin drug ibuprofen was a force tested in three double-blind trials V, and ibuprofen was useful in the case of deviation (Ber nard et al., N Engl J Med 336: 912 1997; Severansky et al., Sepsis 3: 11, 1999).
  • Bradycun is a bioactive peptide involved in site force-in release and vascular alterations in sepsis, but in two double-blind studies, bradycone antagonists improve mortality (Fein et al., JAMA 277: 482 1997; Severansky et al., Sepsis 3: 11, 1999).
  • sepsis is a disease for which the reduction of the number of deaths cannot be achieved because the incidence is still not suppressed despite the progress of various treatment methods.
  • RANKL a ligand for RANK
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • RANKL is a membrane-bound protein, some of which is present in blood as a soluble form.
  • sRANKL soluble RANKL
  • OPG concentration ratio with OPG
  • Patent Literature 1 Special Table 2004-526748
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-509430
  • Patent Document 3 International Publication No. W098 / 46644 Pamphlet
  • Patent Document 1 Yasuda et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597, 1998
  • Non-Patent Document 2 Lacey et al., Cell 93: 165, 1998
  • Non-Patent Document 3 Rogers et al., J Clin Endoceinol Metab 90: 6323, 2005
  • An object of the present invention is to provide a method for the prevention or treatment of symptoms caused by inflammatory diseases such as infectious diseases, allergies, and autoimmune diseases using RANKL, and a prophylactic or therapeutic thread and composition. In particular, it aims at the prevention and treatment of lethality due to these inflammatory diseases.
  • the present invention uses the concentration of membrane-type and soluble RANKL and OPG present in the body such as in blood and synovial fluid as markers for investigating the degree of inflammation and risk of death in inflammatory diseases. The purpose is to provide a measuring method and a reagent.
  • the present inventors examined the action of soluble RANKL on macrophages, considering the possibility that RANKL is involved in the innate immune system and regulates innate immunity. As a result, it was found that the production of inflammatory site force-in by infection was suppressed by the effect of soluble RAN KL in various macrophages. In addition, the soluble RANKL concentration in blood decreases rapidly within a few hours after infection, while the OPG concentration rises. Therefore, soluble RANKL or OPG alone, or a combination of soluble RANKL and OPG It has been found that it can be a novel marker of sensitive infection. Further, the present inventors have found that the prevention of septic shock by drugs can be achieved by administration of soluble RANKL, and that soluble RANKL can be used as an inflammation preventive agent or anti-inflammatory agent, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [0021] A method for detecting an inflammatory disease using RANKL and Z or OPG in a biological sample as a marker.
  • [0022] A method for detecting inflammatory diseases using RANKL in a biological sample as a marker.
  • [0023] A method for detecting an inflammatory disease using OPG in a biological sample as a marker, wherein the patient is afflicted with an inflammatory disease when the OPG concentration in the biological sample is increased compared to a normal person. [1] The method for detecting an inflammatory disease according to [1].
  • [0024] A method for detecting an inflammatory disease using RANKL and OPG in a biological sample as a marker, and the soluble RANKL / OPG concentration ratio in the biological sample is lower than that in a normal person
  • [0025] [5] A method for detecting an inflammatory disease using RANKL in a biological sample as a marker, comprising measuring membrane-type RANKL present on cells in the biological sample by flow cytometry. [1] A method for detecting an inflammatory disease.
  • [0026] A method for detecting inflammatory diseases using RANKL and OPG in a biological sample as markers, and measuring the membrane type RANKL present on cells in the biological sample by a flow cytometry method.
  • the inflammatory disease is an infectious disease, allergic disease or autoimmune disease [1] to [7]
  • a detection reagent for detecting an inflammatory disease using RANKL and Z or OPG as a marker including an anti-RANKL antibody and an anti-OPG antibody.
  • the inflammatory disease is an infectious disease, an allergic disease or an autoimmune disease [10] or
  • a detection reagent for detecting the inflammatory disease according to [11].
  • composition for preventing or treating inflammatory diseases according to [14], comprising RANKL and M-CSF as active ingredients.
  • composition for preventing or treating inflammatory diseases according to [15], wherein the composition for preventing or treating inflammatory diseases is a combination drug.
  • composition for preventing or treating inflammatory disease is a kit comprising a drug containing RANKL and a drug containing M-CSF.
  • the inflammatory disease is an infectious disease, an allergic disease or an autoimmune disease [15] to [18
  • composition for prevention or treatment of any one of inflammatory diseases The composition for prevention or treatment of any one of inflammatory diseases.
  • composition for prevention or treatment of an inflammatory disease according to [19], wherein the inflammatory disease is sepsis.
  • An immunosuppressant comprising RANKL and sputum or M-CSF as active ingredients.
  • the immunosuppressive agent is a kit comprising a drug containing RANKL and a drug containing M-CSF.
  • RANKL When suffering from an inflammatory disease such as an infectious disease, the expression of RANKL decreases and the expression of OPG increases. Therefore, by detecting the amount of RANKL or OPG, an inflammatory disease can be detected and diagnosed. Especially when the RANKL / OPG amount ratio is used as an index, detection and diagnosis can be performed with high accuracy.
  • RANKL and Z or M-CSF have an action of suppressing the production of inflammatory cytokines against various macrophages.
  • RANKL and Z or M-CSF can also prevent or treat inflammatory diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the lack of induction of cytodynamic in production by soluble RANKL.
  • FIG. 2 is a graph showing RANKL-induced tolerance in macrophages by inflammatory site force-in concentration.
  • FIG. 3 is a diagram showing RANKL-induced tolerance in macrophages by the mRNA level of inflammatory site force-in.
  • FIG. 4 is a graph showing the RANKL-inducible tolerance in macrophages by the produced TNF-a concentration when pre-treated with soluble RANKL for a certain period of time and then stimulated with LPS.
  • FIG. 3 is a graph showing the concentration of produced TNF-a when M-CSF-dependent spleen-derived macrophages (MDSMs) are pretreated with soluble RANKL for a certain period of time and then stimulated with LPS.
  • MDSMs M-CSF-dependent spleen-derived macrophages
  • FIG. 6 shows RANKL-induced tolerance to various stimuli.
  • FIG. 7 shows reversibility of RANKL-induced tolerance.
  • FIG. 8 is a graph showing relaxation of RANKL-induced tolerance by GM-CSF.
  • FIG. 9 shows changes in serum soluble RANKL and OPG concentrations in response to LPS injection.
  • FIG. 10 shows changes in soluble RANKL and OPG concentrations in serum against Salmonella infection.
  • FIG. 11 is a graph showing the concentrations of soluble RANKL and OPG in serum in wild-type mice and RANKL-deficient mice (Tnfsfir / _ ).
  • FIG. 12 is a graph showing serum site force-in concentrations of wild-type mice and RANKL-deficient mice (Tnfsfir / _ ) injected with LPS intraperitoneally.
  • FIG. 13 shows the concentrations of soluble RANKL and OPG in serum in wild type mice and OPG-deficient mice (Tnfrsfl lb—).
  • FIG. 14 is a graph showing serum cytoforce-in concentrations in wild-type mice and OPG-deficient mice (Tnfrsfl lb — / _ ) injected with LPS intraperitoneally.
  • FIG. 16 shows that TLR4 expression is suppressed by treatment with soluble RANKL of macrophages.
  • FIG. 17 shows suppression of antigen presentation by soluble RANKL.
  • FIG. 18 shows that RANKL tolerance is c-Fos independent.
  • FIG. 19 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human RANKL residues 140 to 317 and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 20 shows a restriction enzyme map of a vector containing the RANKL gene.
  • FIG. 21A shows the base sequence of a vector containing the RANKL gene (part 1).
  • FIG. 21B shows the nucleotide sequence of a vector containing the RANKL gene (part 2, continued from FIG. 21A).
  • FIG. 22 shows a method for producing a GST-RANKL vector.
  • FIG. 23 shows the survival rate when LPS is administered to mice administered with GST-RANKL and M-CSF.
  • RANKL Receptor activator of NF- ⁇ B ligand
  • RANK one receptor activator of NF- ⁇
  • This is a type 2 transmembrane protein having a transmembrane domain and an extracellular domain (Special Table 2002-509430, International Publication No. W098 / 46644, pamphlet).
  • the domain having N-terminal force amino acid force after the 152nd position is a TNF ligand family homology domain.
  • OPG osteoprotegerin
  • the method of the present invention is a method for measuring RANKL and Z or OPG in a biological sample collected from a subject and detecting an inflammatory disease using RANKL and Z or OPG as a marker.
  • the RANKL measured in the method of the present invention is a soluble RANKL (sRANKL) secreted in a biological sample, which is a body fluid such as blood, or a membrane RANKL present on cells such as in peripheral blood.
  • sRANKL soluble RANKL
  • biological samples include biological samples such as blood, plasma, serum, tears, urine, amniotic fluid, synovial fluid, spinal fluid, cell extract, tissue extract, cells, and tissues. Inflammatory diseases are all over the body Often, blood, plasma, and serum are preferred among the biological samples.
  • the inflammatory disease is a general term for diseases exhibiting inflammatory symptoms, and includes infectious diseases, allergic diseases, autoimmune diseases and the like.
  • infectious diseases for example, severe trauma, burns, surgical invasion, acute splenitis, peritonitis, malignant tumor, acute abdomen (a disease that requires abdominal disease with rapid abdominal pain as the main symptom and must be operated immediately), infection (Especially nosocomial infections caused by Gram-negative bacteria such as Serratia, Pseudomonas aeruginosa, Acinetopactor, Cytolobacter, Enterobacter, etc.)
  • allergic diseases such as contact hypersensitivity, allergic rhinitis, food allergy, and asthma are also targeted.
  • atopic dermatitis also includes inflammatory skin diseases such as abraded dermatitis, medicinal dermatitis or psoriasis.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, scleroderma, dermatomyositis, autoimmune vasculitis, mixed connective tissue disease, systemic lupus erythematosus, idiopathic thrombocytopenic purpura, Crohn's disease, human adjuvant disease, etc. It becomes a target.
  • the method of the present invention it is possible to detect and diagnose whether or not a subject has the above-mentioned inflammatory disease.
  • the severity of the above inflammatory diseases can be evaluated.
  • the severity of sepsis can be evaluated and determined.
  • the method for measuring RANKL and Z or OPG is not limited.
  • anti-RA NKL antibody such as Western blotting, EIA, RIA, agglutination, immunochromatography, flow cytometry, etc. and Z or anti-OPG It can be measured by an immunoassay using an antibody.
  • the bound RANKL level (RANKL amount) on the cells may be measured by flow cytometry. Measurement by flow cytometry can be performed using a flow cytometer such as FACS.
  • Anti-RANKL antibody and Z or anti-OPG antibody can be prepared by known methods.
  • the antibody used may be appropriately labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase or a fluorescent dye.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase or a fluorescent dye.
  • anti-RANKL antibody is also soluble RANKL and membrane R Antibodies that recognize and bind to the extracellular domain of ANKL are preferred.
  • soluble RANKL does not contain an intracellular domain
  • the anti-RANKL antibody used in the method of the present invention contains an epitope present in an extracellular domain other than the intracellular domain of RANKL, preferably a TNF ligand family homology domain. Recognizable antibody. Commercially available antibodies can also be used.
  • the expression of RANKL and / or OPG may be detected by detecting RANKL and / or OPG mRNA.
  • mRNA can be detected by Northern blotting, RT-PCR, a method using a DNA chip (DNA microarray), or the like.
  • RANKL and OPG mRNA can be detected by Northern blotting, RT-PCR, a method using a DNA chip (DNA microarray), or the like.
  • a probe or primer having a partial sequence ability complementary to the partial sequence of mRNA encoding RANKL and Z or OPG is used.
  • the base sequences of RANKL and OPG are known, and probes or primers can be designed based on the known base sequence information.
  • the number of bases of the primer or probe is 5 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 15 to 25. These methods can be performed by known methods.
  • Subject strength When the RANKL concentration or amount in the collected sample is significantly lower than the RANKL concentration or amount of a normal person, or when the OPG concentration is significantly higher than the OPG concentration of a normal person, A subject can be diagnosed as having an inflammatory disease.
  • the lower the RAN KL concentration or amount, or the higher the OPG concentration the more the inflammatory disease such as sepsis can be evaluated and judged to be serious.
  • the ratio of the soluble RANKL and OPG concentrations (soluble RAN KL concentration / OPG concentration) in the sample collected from the subject's strength is lower than the normal ratio, the subject is inflammatory. Can be diagnosed as having a disease. In addition, the smaller the ratio of the soluble RANKL and OPG concentration, the more serious the inflammatory disease such as sepsis can be evaluated.
  • the disease can be detected at an early stage of the inflammatory disease. it can.
  • more accurate detection is possible by measuring RANKL and Z or OPG multiple times over time.
  • the present invention includes a reagent or kit for detecting an inflammatory disease using RANKL and Z or OPG as a marker, and the reagent or kit comprises an anti-RANKL antibody and Z or anti-PG.
  • a reagent or kit for detecting an inflammatory disease using RANKL and Z or OPG as a marker and the reagent or kit comprises an anti-RANKL antibody and Z or anti-PG.
  • the antibody should be labeled with enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase.
  • enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase.
  • membrane-bound RANKL When measuring membrane-bound RANKL by flow cytometry, label the antibody against RANKL with a fluorescent dye.
  • the present invention further includes a marker for detecting an inflammatory disease comprising RANKL and Z or OPG, and further includes the use of RANKL and / or OPG as a marker for detecting an inflammatory disease. .
  • the present invention further includes a composition (anti-inflammatory agent) or immunosuppressant for the treatment or prevention of inflammatory diseases comprising RANKL and Z or M-CSF as an active ingredient.
  • a composition anti-inflammatory agent
  • immunosuppressant for the treatment or prevention of inflammatory diseases
  • RANKL and Z or M-CSF as an active ingredient.
  • RANKL and M-CSF can be used alone or in combination for the treatment or prevention of inflammatory diseases, and the immune ability of a subject can be suppressed.
  • RANKL induces macrophage tolerance (RANKL tolerance), which is independent of c-Fos, which is necessary for osteoclast differentiation.
  • the effect of RANKL on macrophages is that macrophages differentiate into osteoclasts. This is different from the “demacrophic phenomenon” in the process.
  • the inflammatory disease targeted by the composition for prevention or treatment of the present invention is a general term for diseases exhibiting inflammatory symptoms, and includes infectious diseases, allergic diseases, autoimmune diseases and the like.
  • infectious diseases for example, severe trauma, burns, surgical invasion, acute splenitis, peritonitis, malignant tumor, acute abdomen (disease that requires rapid surgery for abdominal diseases whose main symptoms are abdominal pain), infectious diseases (In particular, nosocomial infections caused by gram-negative bacteria) and severe acute illness (so-called SIRS) that requires treatment with ICU, such as sepsis.
  • infectious diseases such as contact hypersensitivity, allergic rhinitis, food allergy, and asthma are also targeted.
  • atopic dermatitis contact dermatitis, photosensitivity dermatitis, chronic dermatitis of hands and feet, seborrheic dermatitis, monetary dermatitis, generalized exfoliative dermatitis, congestive dermatitis, local Inflammatory skin diseases such as abraded dermatitis, medicinal dermatitis or psoriasis are also included.
  • rheumatoid arthritis, scleroderma, dermatomyositis, autoimmune vasculitis, mixed connective tissue disease, systemic lupus erythematosus, idiopathic blood Autoimmune diseases such as plaque-reducing purpura, Crohn's disease, and human adjuvant disease are also targeted.
  • RANKL that can be used in the therapeutic composition or immunosuppressant of the present invention
  • RANKL that can be used in the therapeutic composition or immunosuppressant of the present invention
  • the full-length base sequence and amino acid sequence of RANKL derived from human are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the soluble RANKL derivative or soluble RANKL analog includes a protein having a partial sequence of the amino acid sequence of RANKL, such as a truncated form of RANKL, and having a RANKL activity.
  • the soluble RANKL derivative preferably contains a TNF ligand family homology domain starting from amino acid position 152 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a soluble RANKL derivative for example, the protein having the 127th amino acid force, the protein having the 317th amino acid sequence force, the protein having the 140th amino acid force, the protein having the 317th amino acid sequence force, or the 159th amino acid force Examples include a protein having the 317th amino acid sequence ability.
  • the soluble RANKL derivative or the soluble RANKL analog comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and
  • the amino acid sequence of the protein having activity or the partial sequence ability of the amino acid sequence of RANKL described above includes an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and the activity of RANKL Contains the protein.
  • 1 or several is 1 to 9, preferably 1 to 5, and more preferably 1 or 2.
  • the soluble RANKL fusion protein refers to a fusion protein in which another protein is fused to a soluble RANKL protein, a soluble RANKL derivative, or a soluble RANKL analog.
  • SEQ ID NOs: 3 and 4 show the base sequence of DNA encoding the protein in which GST is fused to the protein having the 127th amino acid ability and the 317th amino acid ability in the RANKL amino acid sequence, and the amino acid sequence of the protein.
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 show the base sequence of DNA encoding a protein in which GST is fused to the protein having the amino acid sequence from the 140th amino acid to the 317th amino acid in the RANKL amino acid sequence, and the amino acid sequence of the protein.
  • the 159th amino acid force in the amino acid sequence of RANKL is a protein comprising the 317th amino acid sequence
  • a soluble RANKL mimetic refers to a compound having a structure similar to that of RANKL and having RANKL activity.
  • RANKL, soluble RANKL, soluble RANKL derivatives, soluble RANKL analogs and soluble RANKL fusion proteins can be prepared as recombinant proteins by genetic engineering techniques.
  • M-CSF used in the preventive or therapeutic composition or immunosuppressive agent of the present invention as in RAN KL, M-CSF, M-CSF derivative, M-CSF analog, M-CSF fusion protein, Include M-CSF mimetics.
  • M-CSF, M-CSF derivatives, M-CSF analogs and M-CSF fusion proteins can be produced as recombinant proteins by genetic engineering techniques.
  • Commercially available M-CSF preparations can also be used. Examples of such M-CSF include leucoprole (registered trademark, generic name: Mirimostim).
  • RANKL may be administered alone to a subject, or M-CSF may be administered alone.
  • both RANKL and M-CSF are administered. When both are administered, they can be administered simultaneously as a mixture, ie, a combination.
  • a composition containing RANKL and a composition containing M-CSF can be separately formulated, and both preparations can be mixed and administered at the time of use.
  • each formulation may be administered separately and sequentially.
  • RANKL and M-CSF are administered simultaneously.
  • the preventive or therapeutic composition or immunosuppressive agent of the present invention is also a kit comprising a drug containing RANKL and a drug containing M-CSF for separately administering RANKL and M-CSF.
  • the composition for preventing or treating inflammatory diseases of the present invention may be administered to a patient suffering from an inflammatory disease.
  • when used for prevention it may be administered to a patient who may suffer from an inflammatory disease.
  • the composition of the present invention may be pre-administered before invasive surgery to prevent post-operative infection.
  • the immunosuppressive agent of the present invention containing RANKL and Z or M-CSF as an active ingredient may be administered to a patient when a tissue or organ is transplanted to the patient.
  • the immunosuppressive agent of the present invention suppresses transplant rejection or graft-versus-host disease associated with cell or organ 'tissue transplantation. Can do.
  • composition for preventing or treating inflammatory diseases or the immunosuppressive agent of the present invention can be administered in various forms, and orally administered in tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc.
  • parenteral administration such as injections, drops, suppositories, sprays, eye drops, nasal agents, patches, and the like can be given.
  • the composition for preventing or treating inflammatory diseases or the immunosuppressive agent of the present invention includes a carrier, a diluent, and an excipient that are usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets.
  • lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets.
  • aqueous solutions for injection physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic interfaces You may use together with an activator etc.
  • suitable solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic interfaces You may use together with an activator etc.
  • the oily liquid sesame oil, soybean oil or the like is used, and as a solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl
  • the dosage varies depending on symptoms, age, body weight, etc. In oral administration, it is about O.OOlmg to 1000 mg per day, and may be administered once or divided into several times. For parenteral administration, 0.001 mg to 1000 mg may be administered at one time by intravenous injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, suppository, eye drops, etc.
  • RANKL and M-CSF are used in combination, the same dose without limitation in the dose ratio may be administered, or more soluble RANKL or M-CSF may be administered.
  • the present invention further includes a method for preventing or treating infectious diseases, or a method for immunosuppression, comprising administering soluble RANKL and Z or M-CSF to a patient in need of prevention or treatment. To do.
  • the present invention further includes use of soluble RANKL and Z or M-CSF for the production of a composition for the prevention or treatment of infectious diseases, or for the production of an immunosuppressive agent.
  • the present invention further provides soluble RANKL and Z or M-CSF used for the treatment of infectious diseases, or soluble RANKL and Z or M-CS used for immunosuppression.
  • soluble RANKL and Z or M-CSF used for the treatment of infectious diseases
  • soluble RANKL and Z or M-CS used for immunosuppression.
  • C57BL / 6J mice 6 to 10 week old C57BL / 6J mice were purchased from Oriental Yeast Co., Ltd.
  • C57BL / 6J background OPG homo-deficient mice and control heterozygous mice were purchased from CLEA Japan.
  • C57BL / 6J background RANKL-deficient mice and TLR4-deficient mice were bred and kept in an environment free of pathogenic microorganisms (SPF). RANKL-deficient mice were fed meal. All experiments were conducted according to the animal experiment guidelines of Keio University School of Medicine or Oriental Yeast Industry.
  • M-CSF-dependent bone marrow-derived macrophages (MDBMs)
  • the femur and tibia were first washed with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% urinary fetal serum (FCS) and antibiotics. Cells were harvested. After being applied to the cell strainer, the bone marrow cells were cultured overnight to recover non-adherent cells. The collected non-adherent cells are cultured for 3-4 days in the presence of lOng / ml M-CSF, and the cells adhering to the well are collected with a cell scraper and placed in a 24-well plate (Falcon) as M-CSF-dependent bone marrow-derived macrophages.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS urinary fetal serum
  • M-CSF-dependent spleen-derived macrophages were prepared from spleen cells in the same manner as described above. All macrophages should be grown in the presence of lOng / ml M-CSF throughout the entire experiment.
  • Peritoneal cells were collected by washing the abdominal cavity with complete medium (DMEM containing 10% FCS and antibiotics). The collected cells were spread in 24-well plates (Falcon) at a density of 1 X 10 5 / well. After 6 hours of culture, PBS was washed to remove non-adherent cells and replaced with fresh medium. The adherent cells thus obtained were used as peritoneal macrophages.
  • Pretreatment of macrophages was performed at different concentrations of soluble RANKL ( ⁇ 0.10 endotoxin units / mg, R & D) or LPS (also called lipopolysaccharide or endotoxin. Minnesota Re595, Sigma).
  • the cultured cells were then washed twice with phosphate buffered saline (PBS), LPS, Salmonella munchen flagellin (Calbiochem), CpG oligonucleotide (5, -TCCATgACgTTCCTgATgCT-3, SEQ ID NO: 12), control mouth GpC oligonucleotide (5, -TCCATgAgCTTCCTgATgCT-3, Proligo; SEQ ID NO: 13) was stimulated as described in the text. In some experiments, 500 U / ml GM-CSF (Pepro Tec) was added 3 hours prior to stimulation with LPS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • LPS Salmonella munchen flagellin
  • CpG oligonucleotide 5, -TCCATgACgTTCCTgATgCT-3, SEQ ID NO: 12
  • control mouth GpC oligonucleotide 5, -TCCATgAgCTTCCTgATgCT
  • LPS (S. Minnesota Re595, Sigma) was administered intraperitoneally.
  • LPS E. coli 055: B5, Sigma
  • the blood was collected after a certain period of time by blood sampling, left for 1 hour for coagulation, and centrifuged at 15000 rpm at 24 ° C for 20 minutes. Serum was stored at -80 ° C until cytodynamic determination.
  • the concentrations of TNF-a, IL-6, and IL-12 ( ⁇ 40) in the macrophage culture supernatant were quantified using an ELISA set (BD PharMingen).
  • the concentrations of soluble RANKL and OPG in mouse serum were quantified using ELIS A kit (R & D).
  • the mRNA was prepared by collecting macrophages and homogenizing in Isogen (Nippon gene). cDNA was synthesized using Enhanced Avian HS RT-PCR kit (Sigma-Aldrich). Quantitative PCR is A BI PRISM 7000 instrument TaqMan Assay-on-demand (Applied Biosystems) IL-6, TNF-a, IL-12 (p40), Gapdh primers were used.
  • LPS significantly induces the production of cytoforce-ins such as TNF-a, IL-6, and IL-12 p40
  • soluble RANKL has a high concentration of lOOng / ml. Even so, it became clear that no site force-in production was detected. Therefore, unlike LPS, soluble RANKL does not induce inflammatory site force-in.
  • FIGS. 2A to C show the protein concentration of each inflammatory site force-in, indicating that RANKL-induced tolerance was induced in macrophages.
  • MDBMs were pretreated with soluble RANKL for 24 hours ( ⁇ ) and then stimulated with lOOng / ml LPS for 6 hours (2 °). As shown in Figures 2A-C, such inducible tolerance was also observed when soluble RANKL was at a low concentration of lng / ml.
  • MDBMs were pretreated with medium alone (white diamond) or 10 ng / ml soluble RANKL (black diamond) for 24 hours, and then stimulated with lOOng / ml LPS for 6 hours.
  • Cells were collected at each time indicated in the figure, and the cytodynamic mRNA level was measured by quantitative PCR. The value was standardized by Gapdh.
  • the pretreatment time for soluble RANKL was shortened to 24 hours, 12 hours, and 6 hours.
  • MDBMs were pretreated with soluble RANKL of lng / ml for the time indicated in Fig. 4 ( ⁇ and then stimulated with LPS (2 °).
  • LPS was significantly reduced even in a short pretreatment time of 6 hours. It was revealed that the induction of TNF-a production by stimulation was suppressed (Fig. 4).
  • MDBMs were pretreated with soluble RANKL for 24 hours and then stimulated with flagellin, CpG oligonucleotide, and Salmonella.
  • the cytodynamic force in the culture supernatant was quantified by ELISA.
  • pretreatment with soluble RANKL suppresses the induction of TNF-a production in response to bacterial bacterial components and salmonella stimulation (Figs. 6A-C).
  • GM-CSF is known to inhibit RANKL / RANK signaling
  • the effect of GM-CSF on RANKL-induced tolerance was next examined.
  • MDSMs were pretreated with soluble RANK L for 24 hours, and then treated with GM-CSF-containing medium without soluble RANKL for 3 hours. Cells were then stimulated with LPS and TNF-o; concentration was quantified.
  • MDBMs were treated with soluble RANKL at 10 ng / ml for 24 hours ( ⁇ ), then stimulated with 500 U / ml GM-CSF for 3 hours (2 °), and then with lOOng / ml LPS. Stimulated for 6 hours (3 °). The results are shown in FIG.
  • the bar in the figure shows the average person standard deviation. *, P is 0.01. Data are representative of 3 experiments.
  • GM-CSF itself does not induce TNF- ⁇ production
  • short-term GM-CSF treatment significantly increases TNF-a production in soluble RANKL-pretreated macrophages. I let you. These results imply that GM-CSF reduces RANKL-induced tolerance ( Figure 8). From the above, it was found that this example restores the responsiveness of macrophages to short-term treatment power SLPS by GM-CSF, similar to the removal of soluble RANKL.
  • the serum soluble RANKL concentration before LPS injection was about 150 pg / ml, and the OPG concentration was about 20 OOpg / ml.
  • the results are shown in FIGS. 9A and B.
  • the bar in the figure shows the average standard deviation . *, P ⁇ 0.05; Comparison with **, P ⁇ 0.01 Oh.
  • the soluble RANKL concentration decreased dramatically after 6 hours after LPS injection, while the OPG concentration increased after 6 hours.
  • C57BL / 6J mice (n 6) were orally infected with 3.3 ⁇ 10 7 CFU / g body weight Salmonella (infection). Control mice received PBS (control).
  • the bar in the figure shows the average standard deviation. *, P ⁇ 0.05; **, P 0.01 Comparison with control.
  • OPG was slightly higher than in wild-type mice.
  • TLR4 Treatment of macrophages with soluble RANKL for 24 hours significantly reduces TLR4 mRNA levels. Even after stimulation with LPS after treatment with soluble RANKL and following the TLR4 mRNA level over time, this trend remained unchanged (Fig. 16A). The bar in the figure shows the average standard deviation. Furthermore, flow cytometry analysis revealed that treatment of macrophages with soluble RANKL for 24 hours suppressed the expression of TLR4-MD2 complex on the cell surface (FIG. 16B). Since TLR4 is a receptor for LPS, it was suggested that such a decrease in TLR4 plays a part in the mechanism of RANKL tolerance.
  • MHCII is a molecule for presenting foreign antigens to lymphocytes. In that case, co-stimulatory molecules such as CD80 and CD86 are considered essential.
  • mice were 7-8 week old C57BL / 6N (female) mice.
  • LPS was used by dissolving Lipopolysacchandes from Escherichia coll 055: B5 (Sigma) with 10 mg ⁇ 3 or 1.0 ml of sterilized water.
  • M-CSF was used by dissolving leucoprol (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) and adding 1.0 ml of PBS per 50 g.
  • FIG. 19 shows the base sequence of the cDNA encoding ANKL residues 140 to 317 and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 20 shows a restriction enzyme map of a vector containing the RANKL gene. Furthermore, the base sequence of the vector is shown in FIGS. 21A and 21B. The base sequence in FIG. 21B is a continuation of the base sequence in FIG. 21A.
  • the cells were washed with a washing buffer (50 mM Tris—HCl′pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (v / v) Triton X-100). Subsequently, elution was performed with a Glutathione solution (20 mM reduced glutathione, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0). The molecular weight and purity of GST-RANKL purified by SDS-PAGE were confirmed and filtered. The molecular weight was 47.0 kDa and the purity was 95% or more. In addition, the endotoxin concentration was measured by the limulus amebocyte lysate assay and confirmed to be less than 1 EU / ⁇ g.
  • a washing buffer 50 mM Tris—HCl′pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (v / v) Triton X-100.
  • elution 20
  • Fig. 22 shows a method for preparing a GST-RANKL expression vector.
  • SEQ ID Nos: 3 and 4 GST-RANKL (aal27-317)
  • SEQ ID Nos: 5 and 6 GST-RANKL (aal40-317)
  • SEQ ID Nos: 7 and 8 GST-RANKL (aal59-317)

Abstract

炎症性疾患の新規な検出方法および炎症性疾患の新規な予防又は治療用組成物の提供。生体試料中のRANKL及び／又はOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法、並びにRANKL及び／又はM-CSFを有効成分として含む、炎症性疾患の予防または治療用組成物。

Description

明 細 書
炎症性疾患の検出並びに炎症性疾患の予防又は治療用組成物 技術分野
[0001] 本発明は炎症性サイト力インの産生抑制や炎症モデル動物における生存率の向上 をもたらす RANKLにより敗血症、アレルギー、 自己免疫疾患などの炎症性疾患を診 断し、又は抑制する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、外科領域中でも侵襲の大きな手術での周術期や感染症などの救急疾患の 急性期では、過剰に産生された液性因子が病態形成に重要な役割を果たして！/ヽるこ とが分力つている。これら侵襲下において曰々刻々と変化する病態を早期から把握し 、臨床に応用するには様々な液性因子の測定が大変重要である。敗血症から複数 臓器機能が障害される多臓器不全（multiple organ dysfunction syndrome: MODS)へ 至る過程における各種液性因子に関する研究は、分子生物学的手法の開発と相ま つて飛躍的に進歩した。最近の多臓器不全の研究は細胞レベルの障害機構と微小 環境や液性因子を解析して病態に迫ると V、う研究アプローチに移行してきて V、る。す なわち、敗血症による多臓器不全など、その原因は違っても、発生機序や病態は極 めて類似しているという認識のもとに、最近では多臓器不全に至る前のもっと早期の 段階で力かる病態への移行に関与する因子を制御することが重要視され、現在では 臨床家'研究者の目は多臓器不全そのものの治療よりも、その前段階における敗血 症の病態解明とそれへの有効な対応策の確立に向けられているといえる。
[0003] このような液性因子は炎症マーカーとして有用である力 具体的にはこれまで CRP( C— reactive protein), TNF- a , IL— 1, IL— 6, IL— 8, IL— 10, MIP— 1, HMGB— 1, MIF, C5a , calcitoninなどが知られている（Marshallら、 Crit Care Med 31: 1560， 2003)。 CRPは 血小板数などと組み合わせて重度の敗血症の予後を評価するのに用いた報告 (Asa yamaら、 Keio J Med 47: 19 1998)はあるが、敗血症と外傷との比較で有意差を認め ないという報告 (遠藤ら、感染症誌 73: 197 1999)もあり、評価が定まっていない。 TN F- aや IL-6につ V、ても同様に敗血症と外傷との比較で有意差を認めな V、と！/、う報告 (遠藤ら、感染症誌 73: 197 1999)がある一方で、 IL-6を敗血症の予後マーカーとし て用いている報告（Reinhartら、 Crit Care Med 29: 765, 2001)もあり、評価は一定し ない。また、 IL- 10が有効であるという報告（Onoら、 Am J Surg 188: 150, 2004)はある 力 まだ十分に検証されているとは言えない。急性呼吸窮迫症候群 (ARSD)や気管支 喘息などにおいて MIFの関与が報告（Donnellyら、 Nat Med 3: 320, 1997; Rossiら、 J Clin Invest 101: 2869, 1998)されているが、マーカーとなりうるかどうかは不明である 。以上述べた液性因子も敗血症の原因なの力、その結果として産生されてくるの力も 明らかになっていない。
[0004] 炎症反応は侵襲により生体に生じる損傷の拡大を制限し修復する生体反応であり 、すべての侵害侵襲に対して非特異的反応として発来する。その本態は神経内分泌 反応、免疫炎症反応、凝固線溶反応が密接に関連して生じる生理的生体反応であ る。局所的には発赤、腫脹、疼痛、熱感、として発現し、侵襲が大きい場合には発熱 、瀕脈、瀕呼吸、白血球増加を伴う全身性反応を生じる。これが全身性炎症反応症 候群 (systemic inflammatory response syndrome: SIRS)であり、外 、熱傷、脾炎、 襲の強い術後など感染を伴わない様々な原因によるものと、細菌、真菌、寄生虫、ゥ ィルスなどによる感染を伴うものがある。特に感染に起因する SIRSを敗血症（sepsis)と いう。
[0005] 炎症反応は血管拡張、血管透過性亢進、白血球 ·血管内皮細胞活性化などにより 成立する。これらの反応は侵襲に伴い非特異的に産生される補体、ァミン、キニン、 プロスタノイド、サイト力イン、トロンビンにより引き起こされる。局所的侵害刺激には局 所炎症反応が惹起されるが、生体侵襲が大きい場合には、これらの炎症メディエータ 一（特にサイト力インとトロンビン)の全身逸脱が起こり、全身性の血管拡張、透過性 亢進、白血球 ·血管内皮細胞活性化がみられる。炎症反応は侵害刺激受容、反応、 修復の過程をとるが、全身性炎症反応が持続する場合には修復過程に至らず生体 の恒常性が破綻する。このような場合、多臓器不全を惹起して生体を死に導くことが 知られている。
[0006] 侵襲に対して生体は防御のため神経'内分泌'免疫系の 3系が相互に密接に作用 しながら反応する。侵襲に伴い、神経 ·内分泌系は活性ィヒされ、エネルギー代謝の 亢進、糖新生、心拍出量の増加などをもたらし、全身の炎症反応像を形成するが、一 方でコルチゾールは免疫系を抑制し、またカテコールアミンは免疫細胞である NK細 胞ゃキラー T細胞の活性を抑制することも知られて 、る。細菌感染や組織障害の発 生により補体系や血液凝固系が活性化され、これに伴い血管内皮細胞の活性化や 貪食系の細胞である単球、マクロファージ、好中球が遊走し、障害部位での TNF- o; や IL-1を中心とする炎症性サイト力インが遊離される。これら炎症性サイト力インの遊 離に伴い、プロテアーゼゃ活性酸素、血小板活性ィ匕因子なども遊離され SIRSの病態 を形成していく。したがって、 SIRSは高サイト力イン血症によってもたらされた病態とも 考えることができる (Riedemannら、 Nat Med 9: 517, 2003)。
[0007] 米国において年間約 75万人が敗血症に罹患し、 21万人以上がそのために命を失 つていると報告されている (Wheelerら、 N Engl J Med 340: 207, 1999 ; Severanskyら、 S epsis 3: 11, 1999 ; Hotchkissら、 N Engl J Med 348: 138, 2003)。さらに敗血症の処置 は ICU入院期間の延長や資源使用増加により、重大な経済的影響をもたらす。しか し、この高炎症性サイト力イン血症とも呼べる敗血症に対しての治療法確立が緊急課 題として、世界中で試みられてきたにもかかわらず、敗血症の致死率の改善が得られ る治療法はないのが現状である (Vincentら、 Clin Infect Dis 34: 1084, 2002)。最近に なり、治療法として活性型プロテイン C(activated protein C: APC)投与により、有意に 重症敗血症の予後の改善が得られるという報告がなされた (Bernardら、 N Engl J Med 344: 699, 2001)。米国 Food and Drug Administration (FDA)により重症敗血症に対 する治療薬として初めて認可されることとなった。し力しながら、その有効性はわずか 6 - 7%程度の救命率の上昇と 、つた程度のものであり、 V、まだ敗血症は非常に致 死性の高い、極めて治癒困難な病的状態であると考えられている。また、活性型プロ ティン Cは凝固抑制機能のみならず、線溶機能を活性化し、血栓形成や炎症を阻害 する内因性タンパク質であり (DePaloら、 Advances in Sepsis 1: 114, 2001)、対症療法 的な作用であるだけでなぐその性質から出血リスクの増大が予想されている。特に、 頭蓋内出血は重大な有害事象であり、投与に当たっては禁忌条件を遵守するなどの 十分な注意が必要である。この他に試みられてきたものとして以下に示す。
[0008] (1)大量ステロイド：内毒素血症や菌血症動物における前処理としての適応成功に 基づき、早期臨床試験において敗血症性ショック患者における大量ステロイド投与の 効果を検討したが、大規模二重盲検試験では、敗血症性ショックの発症初期に投与 した場合でも有益性は報告されていない（Meduriら、 Sepsis 3: 21, 1999 ; Bernardら、 N Engl J Med 317: 1565, 1987 ; Boneら、 Chest 92: 1032, 1987)。
[0009] (2)抗内毒素抗体:特異的抗内毒素抗体治療、例えば加熱殺菌 E. coli J5に対する ポリクローナルヒト免疫グロブリン G、内毒素の lipid Aに対するネズミ (E5)およびヒト化（ HA1A)モノクローナル抗体が、重度のグラム陰性菌感染症患者を対象として検討さ れた（Llewelynら、 Sepsis 3: 39, 1999)が、大規模試験では有益性は認められなかつ た。
[0010] (3)抗 TNF治療：抗 TNF治療とは抗 TNFモノクローナル抗体と可溶性 TNF受容体によ る炎症性サイト力インの一つである TNF- aを標的にした中和療法のことを言う。 TNF - aの作用を抑制することで多くの敗血症モデルで生存を改善するとの報告があった (Traceyら、 Nature 330: 662, 1987 ; Penningtonら、 Clin Infect Dis 17(Suppl 2): S515, 1993)が、その後複数の第 Π相、第 III相臨床試験が行われたにも関わらず、抗 TNF治 療で TNF- aの作用を抑制すると生存率が改善すると 、う報告はな 、 (Abrahamら、 J AMA 273: 934, 1995 ; Reinhartら、 Crit Care Med 24: 733, 1996 ; Severanskyら、 Sepsi s 3: 11, 1999 ; Reinhartら、 Crit Care Med 29: S121, 2001)。
[0011] (4) IL-1受容体拮抗薬 (IL-lRa) : IL-lも炎症性サイト力インの一つである力 敗血症 の多くの病態を惹起することが知られている（Ohlssonら、 Nature 348: 550 1990)。こ れらの影響は天然の IL-1受容体拮抗物質である IL-lRaにより抑制することができる 力 重度敗血症患者を対象として施行された試験 3件 (二重盲検試験 2件)では、治 療群とプラセボ群に生存率の差がないことが示された（Fisherら、 JAMA 271: 1836, 1 994 ; Opalら、 Crit Care Med 25: 1115, 1997 ; Severanskyら、 Sepsis 3: 11, 1999)。
[0012] (5) PAF受容体拮抗薬 (PAFra)：血小板凝集因子 (PAF)は敗血症中のサイト力イン放 出に関与するリン脂質である力 2件の二重盲検試験は PAF受容体拮抗薬 (BN52021 )が生存を有意に改善しないことを示した（Dhainautら、 Crit Care Med 22: 1720, 1994 ； Dhainautら、 Crit Care Med 26: 1963, 1998 ; Severanskyら、 Sepsis 3: 11, 1999)。最 近、他の化合物 (BB-882)を用いた第 II相臨床試験において、重度敗血症患者の生 存を有意に改善しないことが再度示された。
[0013] (6)非ステロイド性抗炎症薬：抗プロスタグランジン薬イブプロフェンは二重盲検試験 3件で検討された力 V、ずれの場合もイブプロフェンの有用性は示されな力つた (Ber nardら、 N Engl J Med 336: 912 1997 ;Severanskyら、 Sepsis 3: 11, 1999)。
[0014] (7)ブラジキュン拮抗薬:ブラジキュンは敗血症におけるサイト力イン放出と血管の変 化に関与する生物活性ペプチドであるが、 2件の二重盲検試験ではブラジキュン拮 抗薬による死亡率改善はみられなかった（Feinら、 JAMA 277: 482 1997 ;Severansky ら、 Sepsis 3: 11, 1999)。
[0015] 以上のように敗血症は種々の治療法の進歩にもかかわらず、依然として発症率の 抑制が認められず、死亡者数の減少が得られない疾患である。敗血症に対する予防 法や治療法の新規開発が求められている。
[0016] RANKのリガンドである RANKLは破骨細胞分化誘導因子であり、これまでにマクロフ ァージコロニー刺激因子 (M-CSF)との共存下でマクロファージ系の前駆細胞から破 骨細胞を誘導することが知られている（非特許文献 1および 2を参照)。すなわち、 RA NKLは骨芽細胞により産生され、マクロファージ系前駆細胞上の RANKに結合し破骨 細胞に誘導する。また、この際 RANKと構造が類似している OPG (osteoprotegerin)が デコイ（おとり）レセプターとして RANKLの作用を抑制する。このように、 RANKL及び 0 PGの量のバランスにより骨代謝が制御されて ヽる。 RANKLは膜結合タンパク質であ る力 その一部は可溶型として血液中に存在する。可溶型 RANKL(sRANKL)濃度の 変動が認められる骨代謝疾患もいくつか報告されており、骨代謝マーカーとしての有 用性が指摘され、医療応用が検討されている (非特許文献 3ならびに特許文献 1〜3 を参照)。また、 OPGとの濃度比すなわち可溶型 RANKL/OPGの比によって議論され ることもしばしばである。このように従来 RANKLは、骨代謝系における役割は知られ ていたが、自然免疫系における機能は明らかでなぐ血中に存在する可溶型 RANKL の生物学的な意味もはっきりしていなかった。
特許文献 1：特表 2004-526748号公報
特許文献 2：特表 2002-509430号公報
特許文献 3：国際公開第 W098/46644号パンフレット 非特許文献 1： Yasudaら、 Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597, 1998
非特許文献 2 : Laceyら、 Cell 93: 165, 1998
非特許文献 3 : Rogersら、 J Clin Endoceinol Metab 90： 6323, 2005
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0017] 本発明は RANKLを用いた感染症、アレルギー、自己免疫疾患などの炎症性疾患 による症状の予防又は治療の方法及び予防又は治療用糸且成物の提供を目的とする 。特に、これらの炎症性疾患による致死の予防及び治療を目的とする。また、本発明 は炎症性疾患における炎症の度合いや致死などのリスクの予測を調べるマーカーと して血液中、滑液中など体内に存在する膜型及び可溶型 RANKL及び OPGの濃度な どを測定する方法並びに試薬の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0018] 上記のように、骨代謝における RANKLの役割は知られていたが、自然免疫系にお ける機能は明らかになっておらず、血中に存在する RANKLの生物学的な意味もはつ きりしていな力つた。
[0019] 本発明者らは、 RANKLが自然免疫系に関与し、自然免疫を制御している可能性を 考え、可溶型 RANKLのマクロファージに対する作用について検討を行った。その結 果、感染による炎症性サイト力イン産生が種々のマクロファージにお 、て可溶型 RAN KLの効果で抑制されていることを見出した。また、血中可溶型 RANKL濃度は感染後 数時間の間に速やかに低下し、一方、 OPG濃度は上昇することから、可溶型 RANKL 若しくは OPG単独で、又は可溶型 RANKLと OPGを組合せることにより鋭敏な感染の 新規マーカーとなり得ることを見出した。また、薬剤による敗血症ショックの予防が可 溶型 RANKLの投与により可能になること、可溶型 RANKLを炎症予防剤、又は抗炎症 剤として用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0020] すなわち、本発明は以下の通りである。
[0021] [1] 生体試料中の RANKL及び Z又は OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出 する方法。
[0022] [2] 生体試料中の RANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であつ て、生体試料中の可溶型 RANKL濃度が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾 患に罹患して 、ると判定する、 [1]の炎症性疾患を検出する方法。
[0023] [3] 生体試料中の OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、 生体試料中の OPG濃度が正常人に比べて上昇した場合に、炎症性疾患に罹患して いると判定する、 [1]の炎症性疾患を検出する方法。
[0024] [4] 生体試料中の RANKL及び OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方 法であって、生体試料中の可溶型 RANKL/OPG濃度比が正常人に比べて低下した 場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、 [1]の炎症性疾患を検出する方法。
[0025] [5] 生体試料中の RANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であつ て、生体試料中の細胞上に存在する膜型 RANKLをフローサイトメトリー法により測定 することを含む、 [1]の炎症性疾患を検出する方法。
[0026] [6] 生体試料中の RANKL及び OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方 法であって、生体試料中の細胞上に存在する膜型 RANKLをフローサイトメトリー法に より測定し、膜型 RANKL測定量/ OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合に、炎 症性疾患に罹患して 、ると判定する、 [1]の炎症性疾患を検出する方法。
[0027] [7] 生体試料中の細胞が末梢血細胞である [5]又は [6]の炎症性疾患を検出する方 法。
[0028] [8] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である [1]〜[7]の
V、ずれかの炎症性疾患を検出する方法。
[0029] [9] 炎症性疾患が、敗血症である [8]の炎症性疾患を検出する方法。
[0030] [10] 抗 RANKL抗体及び Z又は抗 OPG抗体を含む、 RANKL及び Z又は OPGをマ 一力一として用い炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[0031] [11] 抗 RANKL抗体及び抗 OPG抗体を含む、 RANKL及び Z又は OPGをマーカーと して用 、炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[0032] [12] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である [10]又は
[11]に記載の炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[0033] [13] 炎症性疾患が、敗血症である [12]の炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[0034] [14] RANKL及び Z又は M-CSFを有効成分として含む、炎症性疾患の予防または 治療用組成物。
[0035] [15] RANKL及び M-CSFを有効成分として含む、 [14]の炎症性疾患の予防又は治 療用組成物。
[0036] [16] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物が配合剤である、 [15]の炎症性疾患の 予防又は治療用組成物。
[0037] [17] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物が RANKLを含む薬剤と M-CSFを含む 薬剤とからなるキットである、 [15]の炎症性疾患の予防または治療用組成物。
[0038] [18] RANKL及び Z又は M-CSFが手術の前に投与されることを特徴とし、手術後の 炎症性疾患を予防する、 [15]〜[17]のいずれかの炎症性疾患の予防又は治療用組 成物。
[0039] [19] 炎症性疾患が感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である [15]〜[18
]のいずれかの炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[0040] [20] 炎症性疾患が、敗血症である [19]の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[0041] [21] RANKL及び Ζ又は M-CSFを有効成分として含む、免疫抑制剤。
[0042] [22] RANKL及び M-CSFを有効成分として含む、 [21]の免疫抑制剤。
[0043] [23] 免疫抑制剤が配合剤である、 [22]の免疫抑制剤。
[0044] [24] 免疫抑制剤が RANKLを含む薬剤と M-CSFを含む薬剤とからなるキットである、
[23]の免疫抑制剤。
発明の効果
[0045] 感染症等の炎症性疾患に罹患した場合、 RANKLの発現が低下し、かつ OPGの発 現が亢進する。従って、 RANKL又は OPGの量を測定することにより炎症性疾患の検 出'診断を行うことができる。特に RANKL/OPG量比を指標にした場合に、高精度で 検出 ·診断を行うことができる。
[0046] さらに、 RANKL及び Z又は M-CSFは種々のマクロファージに対して炎症性サイト力 インの産生を抑制する作用を有する。また、 RANKL及び Z又は M-CSFは炎症性疾 患を予防又は治療することができる。
図面の簡単な説明
[0047] [図 1]可溶型 RANKLによるサイト力イン産生誘導の欠如を示す図である。 [図 2]マクロファージにおける RANKL誘導性トレランスを炎症性サイト力イン濃度により 示す図である。
[図 3]マクロファージにおける RANKL誘導性トレランスを炎症性サイト力インの mRNAレ ベルにより示す図である。
[図 4]マクロファージにおける RANKL誘導性トレランスを可溶型 RANKLで一定時間前 処理した後、 LPSで刺激した場合の産生 TNF- a濃度により示す図である。
[図 5]マクロファージにおける RANKL誘導性トレランスを、腹腔マクロファージ (PMs)と
M-CSF依存性脾臓由来マクロファージ (MDSMs)を可溶型 RANKLで一定時間前処理 した後、 LPSで刺激した場合の産生 TNF- a濃度により示す図である。
[図 6]様々な刺激に対する RANKL誘導性トレランスを示す図である。
[図 7]RANKL誘導性トレランスの可逆性を示す図である。
[図 8]GM-CSFによる RANKL誘導性トレランスの緩和を示す図である。
[図 9]LPS注入に対する血清中の可溶型 RANKLと OPGの濃度の変化を示す図である
[図 10]サルモネラ感染に対する血清中の可溶型 RANKLと OPGの濃度の変化を示す 図である。
[図 11]野生型マウスと RANKL欠損マウス (Tnfsfir/_)における血清中の可溶型 RANKL 及び OPGの濃度を示す図である。
[図 12]腹腔内に LPSを注入した野生型マウスと RANKL欠損マウス (Tnfsfir/_)の血清 中サイト力イン濃度を示す図である。
[図 13]野生型マウスと OPG欠損マウス (Tnfrsfl lb— における血清中の可溶型 RANKL 及び OPGの濃度を示す図である。
[図 14]腹腔内に LPSを注入した野生型マウスと OPG欠損マウス (Tnfrsfl lb— /_ )の血清 中サイト力イン濃度を示す図である。
[図 15]高濃度の LPSを野生型マウス (n=10)と Tnfsfir/_マウス (n=5)に腹腔内注入した 後の生存曲線を示す図である。
[図 16]マクロファージの可溶型 RANKL処理により TLR4の発現が抑制されることを示 す図である。 [図 17]可溶型 RANKLによる抗原提示の抑制を示す図である。
[図 18]RANKLトレランスが c-Fos非依存性であることを示す図である。
[図 19]ヒト型 RANKL残基 140〜317をコードする cDNAの塩基配列及び対応するァミノ 酸配列を示す図である。
[図 20]RANKL遺伝子を含むベクターの制限酵素地図を示す図である。
[図 21A]RANKL遺伝子を含むベクターの塩基配列を示す図である（その 1)。
[図 21B]RANKL遺伝子を含むベクターの塩基配列を示す図である（その 2、図 21Aの 続き)。
[図 22]GST- RANKLベクターの作製方法を示す図である。
[図 23]GST- RANKLと M- CSFを投与したマウスに LPSを投与した場合の生存率を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0048] RANKL (Receptor activator of NF- κ B ligand)は、 TNFスーパーファミリーのメンバ 一である RANK (NF- κ Βの受容体ァクティベータ一）のリガンドであり、細胞内ドメイン (RANKの Ν末端力 第 1番目から 48番目のアミノ酸力 なるドメイン)、膜貫通ドメイン 及び細胞外ドメインを有する 2型貫通タンパク質である（特表 2002-509430号公報、国 際公開第 W098/46644号パンフレット)。細胞外ドメイン中、 N末端力 第 152番目以 降のアミノ酸力もなるドメインは、 TNFリガンドファミリー相同性ドメインである。
[0049] OPG(osteoprotegerin)は、 RANKと類似した構造を有し、 RANKLに結合し得る。
[0050] 被験体が炎症性疾患に罹患すると、 RANKLの発現が低下し、 OPGの発現が亢進し 、血液中の可溶型 RANKL濃度が低下し、 OPG濃度が上昇する。
[0051] 本発明の方法は、被験体力 採取した生体試料中の RANKL及び Z又は OPGを測 定し、 RANKL及び Z又は OPGをマーカーとして用いて炎症性疾患を検出する方法 である。本発明の方法において測定する RANKLは、血液等の体液である生体試料 中に分泌される可溶型 RANKL(sRANKL)及び末梢血中などの細胞上に存在する膜 型 RANKLである。
[0052] 生体試料としては、血液、血漿、血清、涙、尿、羊水、滑膜液、髄液、細胞抽出液、 組織抽出液、細胞、組織などの生体試料が挙げられる。炎症性疾患は全身にその影 響が発現する場合が多いので、上記生体試料のなかでも血液、血漿、血清が好まし い。
[0053] 本発明の方法において、炎症性疾患とは、炎症症状を呈する疾患の総称であり、 感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患等が含まれる。例えば、重症の外傷、熱傷 、手術侵襲、急性脾炎、腹膜炎、悪性腫瘍、急性腹症 (急激な腹痛を主症状とする 腹部疾患にして、早急に手術を行う必要がある疾患）、感染症 (特に、セラチア、緑膿 菌、ァシネトパクター、サイトロバクタ一、ェンテロバクタ一等のグラム陰性菌による院 内感染症）、敗血症などの ICUでの治療を必要とする重症急性疾患 (いわゆる SIRS) などが挙げられる。また、接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息等 のアレルギー疾患も対象となる。また、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性 皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚 炎、うつ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎又は乾癬等の炎症性皮膚 疾患も含む。さらに、関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、自己免疫性血管炎、混合性 結合組織病、全身性エリトマト一デス、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、ヒト アジュバント病などの自己免疫疾患も対象となる。
[0054] 本発明の方法により、被験体が上記の炎症性疾患に罹患している力否かを検出- 診断することができる。また、上記の炎症性疾患の重症度を評価'判定することがで きる。特に、敗血症の重症度を評価 ·判定することができる。
[0055] RANKL及び Z又は OPGを測定する方法は限定されず、例えばウェスタンブロッテ イング、 EIA、 RIA、凝集法、ィムノクロマトグラフィー、フローサイトメトリー法等の抗 RA NKL抗体及び Z又は抗 OPG抗体を用いた免疫測定法により測定することができる。 末梢血等の細胞上の膜結合型 RANKLを測定する場合は、フローサイトメトリー法によ り、細胞上の結合 RANKLレベル（RANKL量）を測定すればよい。フローサイトメトリー による測定は、巿販の FACS等のフローサイトメーターを用いて行うことができる。抗 R ANKL抗体及び Z又は抗 OPG抗体は公知の方法で作製することができる。抗体を用 いて測定を行う場合は、用いる抗体を適宜アルカリフォスファターゼ等の酵素や蛍光 色素で標識すればよい。なお、本発明においては可溶型 RANKL及び膜型 RANKL の細胞外ドメインが測定対象となるので、抗 RANKL抗体も可溶型 RANKL及び膜型 R ANKLの細胞外ドメインを認識し、結合する抗体が好ましい。可溶型 RANKLは、細胞 内ドメインを含まないので、本発明の方法で用いる抗 RANKL抗体は、 RANKLの細胞 内ドメイン以外の細胞外ドメイン、好ましくは TNFリガンドファミリー相同性ドメインに存 在するェピトープを認識し得る抗体である。また、市販の抗体を用いることもできる。 また、 RANKL及び/又は OPGの mRNAを検出して、 RANKL及び/又は OPGの発現 を検出してもよい。 mRNAは、ノーザンブロッテイング、 RT- PCR法、 DNAチップ（DNA マイクロアレイ）を利用した方法等により検出することができる。この際、 RANKL及び
Z又は OPGをコードする mRNAを特異的に測定するために、 RANKL及び Z又は OP Gをコードする mRNAの部分配列に相補的な部分配列力 なるプローブ又はプライマ 一を用いる。 RANKL及び OPGの塩基配列は公知であり、公知の塩基配列情報に基 づいて、プローブ又はプライマーを設計することができる。該プライマー又はプローブ の塩基の数は 5〜50、好ましくは 10〜30、さらに好ましくは 15〜25である。これらの方 法は公知の方法で行うことができる。
[0056] 被験体力 採取した試料中の RANKL濃度又は量が正常人の RANKL濃度又は量 に比べ有意に低 、場合に、又は OPG濃度が正常人の OPG濃度に比べ有意に高 、 場合に、該被験体は炎症性疾患に罹患していると診断することができる。また、 RAN KL濃度又は量が低いほど、又は OPG濃度が高いほど、敗血症等の炎症性疾患が重 症であると評価判定することができる。
[0057] また、被験体力ゝら採取した試料中の可溶型 RANKLと OPGの濃度の比（可溶型 RAN KL濃度/ OPG濃度）が正常人の比より低い場合、該被験体は炎症性疾患に罹患して いると診断することができる。また、可溶型 RANKLと OPGの濃度の比が小さいほど、 敗血症等の炎症性疾患が重症であると評価判定することができる。
[0058] RANKL及び Z又は OPGは炎症性疾患に罹患後、数時間内に発現が変化し得るの で、本発明の方法によれば、炎症性疾患の初期段階で疾患の検出を行うことができ る。また、時間をおいて複数回 RANKL及び Z又は OPGを測定することにより、より正 確に検出することが可能になる。
[0059] 本発明は、 RANKL及び Z又は OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する ための試薬又はキットを包含し、該試薬又はキットは、抗 RANKL抗体及び Z又は抗 OPG抗体を含む。 ELISA等で可溶型 RANKLおよび OPGを測定する場合、抗体はァ ルカリフォスファターゼ、西洋わさびペルォキシダーゼ等の酵素で標識すればょ 、。 また、フローサイトメトリー法で膜結合型 RANKLを測定する場合、 RANKLに対する抗 体は蛍光色素で標識すればょ 、。
[0060] 本発明は、さらに RANKL及び Z又は OPGからなる炎症性疾患検出のためのマーカ 一を包含し、さらに炎症性疾患検出のための RANKL及び/又は OPGのマーカーとし ての使用を包含する。
[0061] 本発明は、さらに RANKL及び Z又は M-CSFを有効成分として含む炎症性疾患の 治療又は予防用組成物 (抗炎症剤)又は免疫抑制剤を包含する。 RANKLを単独で、 又は RANKL及び M-CSFを組合せて被験体に投与した場合、被験体にお!ヽてマクロ ファージによる炎症性サイト力インの産生が抑制され、 TLR4レベルが抑制され、また 被験体の抗原提示細胞における抗原提示能が抑制される。このことより、 RANKL及 び M-CSFは、単独で又は組合せて、炎症性疾患の治療又は予防に用いることができ 、また被験体の免疫能を抑制することができる。なお、 RANKLによるマクロファージの トレランスの惹起（RANKLトレランス）は破骨細胞分ィ匕に必要な c-Fos非依存的である こと力ら、 RANKLのマクロファージに対する効果は、マクロファージが破骨細胞に分 化する過程における「脱マクロファージィ匕現象」とは異なる。
[0062] 本発明の予防又は治療用組成物が対象とする炎症性疾患とは、炎症症状を呈す る疾患の総称であり、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患等が含まれる。例えば 、重症の外傷、熱傷、手術侵襲、急性脾炎、腹膜炎、悪性腫瘍、急性腹症 (急激な 腹痛を主症状とする腹部疾患にして、早急に手術を行う必要がある疾患)、感染症（ 特に、グラム陰性菌による院内感染症）、敗血症などの ICUでの治療を必要とする重 症急性疾患 (いわゆる SIRS)などが挙げられる。また、接触過敏症、アレルギー性鼻 炎、食物アレルギー、喘息等のアレルギー疾患も対象となる。また、アトピー性皮膚 炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣 状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うつ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮 膚炎又は乾癬等の炎症性皮膚疾患も含む。さらに、関節リウマチ、強皮症、皮膚筋 炎、自己免疫性血管炎、混合性結合組織病、全身性エリトマト一デス、特発性血小 板減少性紫斑病、クローン病、ヒトアジュバント病などの自己免疫疾患も対象となる。 本発明の治療用組成物又は免疫抑制剤に用い得る RANKLとして、 RANKL,可溶 型 RANKL、可溶型 RANKL誘導体、可溶型 RANKLアナログ、可溶型 RANKL融合タン パク質、又は可溶型 RANKL模倣物が挙げられる。ヒト由来の RANKLの全長塩基配 列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 1及び 2に示す。可溶型 RANKL誘導体又 は可溶型 RANKLアナログは、 RANKLのトランケート体等、 RANKLのアミノ酸配列の 一部配列からなるタンパク質であって、 RANKLの活性を有するタンパク質を含む。可 溶型 RANKL誘導体は、好ましくは配列番号 2のアミノ酸配列において、第 152番目の アミノ酸カゝら始まる TNFリガンドファミリー相同ドメインを含む。可溶型 RANKL誘導体と して、例えば、第 127番目のアミノ酸力 第 317番目のアミノ酸配列力 なるタンパク質 、第 140番目のアミノ酸力 第 317番目のアミノ酸配列力 なるタンパク質、又は第 159 番目のアミノ酸力 第 317番目のアミノ酸配列力 なるタンパク質等が挙げられる。さら に、可溶型 RANKL誘導体又は可溶型 RANKLアナログは、配列番号 2で表わされる アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列を含み、かつ RANKLの活性を有するタンパク質、あるいは上記の RANKLの アミノ酸配列の部分配列力 なるタンパク質のアミノ酸配列にぉ 、て 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ RANKLの活性を 有するタンパク質を含む。ここで、 1又は数個とは 1〜9個、好ましくは 1〜5個、さらに 好ましくは 1若しくは 2個である。可溶型 RANKL融合タンパク質とは、可溶型 RANKL タンパク質、可溶型 RANKL誘導体又は可溶型 RANKLアナログに他のタンパク質が 融合した融合タンパク質をいう。他のタンパク質としては例えば、ダルタチオン S-トラ ンスフ ラーゼ（GST)が挙げられる。配列番号 3及び 4に、 RANKLのアミノ酸配列中 第 127番目のアミノ酸力 第 317番目のアミノ酸配列力もなるタンパク質に GSTが融合 したタンパク質をコードする DNAの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す 。配列番号 5及び 6に、 RANKLのアミノ酸配列中第 140番目のアミノ酸から第 317番目 のアミノ酸配列力もなるタンパク質に GSTが融合したタンパク質をコードする DNAの塩 基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号 7及び 8に、 RANKL のアミノ酸配列中第 159番目のアミノ酸力も第 317番目のアミノ酸配列からなるタンパク 質に GSTが融合したタンパク質をコードする DNAの塩基配列及び該タンパク質のアミ ノ酸配列を示す。可溶型 RANKL模倣物は、 RANKLの立体構造に類似した構造を有 する化合物であって、 RANKLの活性を有する化合物をいう。 RANKL,可溶型 RANKL 、可溶型 RANKL誘導体、可溶型 RANKLアナログ及び可溶型 RANKL融合タンパク質 は遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として作製することができる。
[0064] 本発明の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤に用いる M-CSFとして、 RAN KLと同様に、 M- CSF、 M- CSF誘導体、 M- CSFアナログ、 M- CSF融合タンパク質、又 は M- CSF模倣物が挙げられる。 M- CSF、 M- CSF誘導体、 M- CSFアナログ及び M- CS F融合タンパク質は、遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として作製することが できる。また、巿販の M-CSF製剤を用いることもできる。このような M-CSFとして、例え ばロイコプロール (登録商標、一般名：ミリモスチム)等が挙げられる。
[0065] 炎症性疾患の予防若しくは治療又は免疫抑制のためには、 RANKLを単独で被験 体に投与してもよいし、 M- CSFを単独で投与してもよい。好ましくは、 RANKLと M- CS Fの両方を投与する。両方を投与する場合、両者を混合物、すなわち配合剤として同 時に投与することができる。また、 RANKLを含む組成物と M-CSFを含む組成物を別 々に製剤化し、用時に両方の製剤を混合して投与することもできる。さらに、それぞ れの製剤を別々に順に投与してもよい。好ましくは、 RANKL及び M-CSFを同時に投 与する。本発明の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤は RANKL及び M-CS Fを別々に投与するための、 RANKLを含む薬剤と M-CSFを含む薬剤とからなるキット でもある。
[0066] また、本発明の炎症性疾患の予防又は治療用組成物は、治療用として用いる場合 には、炎症性疾患に罹患している患者に投与すればよい。また、予防用として用いる 場合には、炎症性疾患に罹患するおそれのある患者に投与すればよい。例えば、重 症感染症に罹患し、敗血症や SIRSのおそれのある患者に投与すればよい。また、手 術後の感染を予防するために、侵襲的な手術前に本発明の組成物を前投与してもよ い。本発明の、 RANKL及び Z又は M-CSFを有効成分として含む免疫抑制剤は、組 織や臓器を患者に移植する際に、患者に投与すればよい。本発明の免疫抑制剤は 、細胞あるいは臓器'組織移植に伴う移植片拒絶、移植片対宿主病を抑制すること ができる。
[0067] 本発明の炎症性疾患の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤は、種々の形 態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口 投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤な どによる非経口投与を挙げることができる。
[0068] 本発明の炎症性疾患の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤は、製剤分野 において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦 形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液と しては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適 当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、 非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが 使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用し てもよい。
[0069] 投与量は、症状、年齢、体重などによって異なる力 経口投与では、 1日約 O.OOlmg 〜1000mgであり、 1回又は数回に分けて投与すればよい。また、非経口投与では、 1 回あたり、 0.001mg〜1000mgを静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、座薬、 点眼などによって投与すればよい。 RANKLと M-CSFを併用する場合、その投与量の 比に限定はなぐ同量を投与してもよいし、可溶型 RANKL又は M-CSFを多く投与し てもよい。
[0070] 本発明はさらに、可溶型 RANKL及び Z又は M-CSFを予防又は治療を必要とする 患者に投与することを含む、感染症疾患の予防若しくは治療方法、又は免疫抑制方 法を包含する。
[0071] 本発明はさらに、可溶型 RANKL及び Z又は M-CSFの感染症疾患の予防若しくは 治療用組成物の製造への使用、又は免疫抑制剤の製造への使用をも包含する。
[0072] 本発明はさらに、感染症疾患の治療のために用いられる可溶型 RANKL及び Z若し くは M-CSF、又は免疫抑制のために用いられる可溶型 RANKL及び Z若しくは M-CS Fを包含する。
実施例 [0073] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
[0074] 本実施例にお!、て以下の材料と方法を用いた。
[0075] マウス
6〜10週齢の C57BL/6Jマウスはオリエンタル酵母工業より購入した。 C57BL/6Jバッ クグラウンドの OPGホモ欠損マウスとコントロールのヘテロマウスは日本クレアより購入 した。 C57BL/6Jバックグラウンドの RANKL欠損マウス、 TLR4欠損マウスは病原性微 生物を除去した (SPF)環境下で繁殖'飼育した。 RANKL欠損マウスには粉エサを与え た。全ての実験は慶應義塾大学医学部若しくはオリエンタル酵母工業の動物実験ガ イドラインに従って行った。
[0076] M- CSF依存性マクロファージ
M- CSF依存性骨髄由来マクロファージ (MDBMs)を作るために、まず大腿骨と脛骨 を 10%ゥシ胎児血清 (FCS)と抗生物質の入ったダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で洗浄し、骨髄細胞を採取した。セルストレーナ一にかけた後、骨髄細胞を一晩培養 して力も非接着細胞を回収した。回収した非接着細胞は lOng/ml M-CSF存在下で 3 〜4日培養し、ゥエルに接着した細胞をセルスクレーパーで採集、 M- CSF依存性骨 髄由来マクロファージとして 24穴プレート (ファルコン)に 1 X 105/ゥエルの密度でまい た。 M-CSF依存性脾臓由来マクロファージ (MDSMs)は脾臓細胞より上記と同様の方 法で作った。全てのマクロファージは全実験中を通して lOng/ml M- CSF存在下で培 し 7こ。
[0077] 腹腔マクロファージ
腹腔細胞は完全培地 (10%FCSと抗生物質の入った DMEM)で腹腔を洗浄すること で採取した。採集された細胞は 24穴プレート (ファルコン)に 1 X 105/ゥエルの密度でま いた。 6時間の培養の後、非接着細胞を除くために PBS洗浄を行い、新しい培地に交 換した。こうして得られた接着細胞を腹腔マクロファージとして使用した。
[0078] in vitroトレランス実験
マクロファージの前処理は異なる濃度の可溶型 RANKL(〈0.10エンドトキシン単位/ m g, R&D)又は LPS (リポ多糖やエンドトキシンとも呼ばれる、本実施例で使用したのは S. Minnesota Re595, Sigma)で所定の時間行った。培養細胞はその後リン酸緩衝生理 食塩水（PBS)で二度洗浄し、 LPS、 Salmonella munchen由来の flagellin(Calbiochem)、 CpGオリゴヌクレオチド (5，- TCCATgACgTTCCTgATgCT- 3，；配列番号 12)、コント口 ール GpCオリゴヌクレオチド (5， - TCCATgAgCTTCCTgATgCT- 3，、 Proligo；配列番 号 13)で本文中に記載されているように刺激した。いくつかの実験においては、 500U/ ml GM-CSF(Pepro Tec)を LPSで刺激する 3時間前に加えた。
[0079] マウスへの LPS投与
LPS(S. Minnesota Re595, Sigma)は腹腔へ投与した。図 23の実施例では LPS(E. coli 055:B5, Sigma)を用いた。血液は心臓採血によって一定時間後採集し、凝固のため 一時間放置後 15000rpm、 24°Cで 20分遠心した。血清はサイト力イン定量まで- 80°C で保管した。
[0080] 使用細菌の系統と感染実験
感染 験のため【こ、 salmonella enterica serovar Typhimurium % 330b株 Fサノレ モネラ)をー晚 Luria-Bartani培地 (LB培地)で静置培養したものを希釈して振とうした 後、対数増殖期にある菌を遠心することで回収した。サルモネラは PBSで洗浄した後 Hanks塩類液で希釈し、多重感染度 (MOI)IOでマクロファージに感染させた。 37°Cで 1時間培養して力もマクロファージを PBSで洗浄し、細胞外のサルモネラを除去した後 、 25 g/mlのゲンタマイシンを含む完全培地で培養した。 3時間後、培養上清をサイ トカイン定量のために回収した。サルモネラの経口感染の際には、感染 12時間前から マウスにエサと水は与えず、その後 3.3 X 107 CFU/g体重のサルモネラを経口投与し た。血液は 4日後に心臓採血にて回収した。
[0081] 酵素免疫測定法 (ELISA法）
TNF- a、 IL- 6、 IL- 12 (ρ40)のマクロファージ培養上清中濃度は ELISAセット (BD Ph arMingen)を用いて定量した。マウス血清中の可溶型 RANKL及び OPGの濃度は ELIS Aキット (R&D)を用いて定量した。
[0082] PT-PCRによる解析
mRNAはマクロファージを回収し Isogen(Nippon gene)中で均質化し調製した。 cDNA は Enhanced Avian HS RT-PCR kit(Sigma- Aldrich)を用いて合成した。定量 PCRは A BI PRISM 7000装置 TaqMan Assay- on- demand(Applied Biosystems)の IL- 6、 TNF- a、 IL- 12 (p40)、 Gapdhプライマーを使って行った。
[0083] 統計処理
データは平均士標準偏差で表現した。図 23に結果を示す実施例を除く全てのデ ータは Student' s t-testを用いて有意差検定を行った。図 23に結果を示す実施例の み generalized Wilcoxon testを用 ヽて^! 差恢定を行つ 7こ。
[0084] 以下の結果が得られた。
[0085] (1)菌体構成成分によるマクロファージ刺激に対する RANKLによるトレランスの惹起 まず可溶型 RANKLある!/、は LPSで M- CSF依存性骨髄由来マクロファージ (MDBMs) を刺激して炎症性サイト力イン産生を定量した (図 1A〜C)。図 1A〜Cは、可溶型 RAN KLによるサイト力イン産生誘導の欠如を示す。 MDBMsを図中に示した濃度の LPS又 は可溶型 RANKLで 24時間刺激した。培養上清中の炎症性サイト力インのタンパク濃 度は ELISA法によって定量した。図中のバーは平均士標準偏差を示す (n=3、培養ゥ エル)。図 1A〜Cに示すように、 LPSが有意に TNF- a、 IL- 6、 IL- 12 p40といったサイト 力インの産生を誘導するのに対し、可溶型 RANKLは lOOng/mlという高濃度であって もサイト力イン産生は検出されないことが明ら力となった。それゆえ、 LPSとは異なり可 溶型 RANKLは炎症性サイト力インを誘導しな 、。
[0086] 次に MDBMsを段階的に濃度を上昇させた可溶型 RANKLで 24時間前処理し、その 後 LPSで 6時間刺激した。上清中の TNF- a、 IL-6及び IL-12 (p40)の濃度は ELISA法 によって定量した。その結果、可溶型 RANKLの前処理は、続く LPS刺激によるこれら サイト力インの産生を可溶型 RANKL濃度依存的に抑制することが明ら力となった (図 2A〜C)。図 2A〜Cは、各炎症性サイト力インのタンパク濃度を示し、マクロファージに おける RANKL誘導性トレランスが惹起されたことを示す。 MDBMsは可溶型 RANKLで 24時間前処理し (Γ )、その後 lOOng/mlの LPSで 6時間刺激した (2° )。図 2A〜Cに示す ように、こうした誘導性トレランスは可溶型 RANKLが lng/mlという低濃度の時にも観 察された。
[0087] また LPS刺激後力 6時間までの TNF- a、 IL-6及び IL-12 (p40)の mRNAレベルも経 時的に定量した。可溶型 RANKL前処理をしないマクロファージと比較して、可溶型 R ANKL前処理をしたマクロファージでは、 LPS刺激に対するこれらサイト力イン mRNAの 誘導は有意に抑制されていた (図 3A〜C)。図 3A〜Cは、各炎症性サイト力インの mR NAレベルを示し、マクロファージにおける RANKL誘導性トレランスが惹起されたこと を示す。 MDBMsは培地単独（白ダイヤモンド)又は 10ng/mlの可溶型 RANKL (黒ダイ ャモンド)で 24時間前処理し、その後 lOOng/mlの LPSで 6時間刺激した。細胞は図中 に記載の各時間に回収し、サイト力イン mRNAレベルを定量 PCRによって測定した。 値は Gapdhで標準化した。
[0088] 次に、可溶型 RANKL前処理の時間を 24時間、 12時間、 6時間と短縮した。 MDBMs を lng/mlの可溶型 RANKLで図 4中に記載の時間だけ前処理し (Γ その後 LPSで刺 激した (2° )。その結果、前処理が 6時間という短時間でも有意に LPS刺激による TNF- a産生誘導が抑制されることが明らかとなつた (図 4)。
[0089] RANKL誘導性トレランスが MDBMs以外のマクロファージでも生じるかどうかを検討 するために、次に腹腔マクロファージ (PMs)、 M- CSF依存性脾臓由来マクロファージ（ MDSMs)を利用して実験を行った。腹腔マクロファージ (PMs)と M- CSF依存性脾臓由 来マクロファージ (MDSMs)を 50ng/mlの可溶型 RANKLで 24時間前処理し (Γ ),その 後 LPSで刺激した (2° )。その結果、これらのマクロファージにおいても LPS刺激に対す る TNF- aの産生誘導は可溶型 RANKLの前処理によって抑制された (図 5)。
[0090] 最後に、 MDBMsを可溶型 RANKLで 24時間前処理後に flagellin、 CpGオリゴヌクレオ チド、サルモネラで刺激した。 MDBMsを 10ng/mlの可溶型 RANKLで 24時間前処理し( Γ )、その後 1 X 10— U Mの flagellinか 3ηΜの CpG DNAで 6時間、あるいはサルモネラで 3時間刺激した (2° )。培養上清中のサイト力インは ELISA法で定量した。その結果可 溶型 RANKLの前処理はこうした細菌菌体成分やサルモネラ刺激に対する TNF- aの 産生誘導を抑制することが明らかとなった（図 6A〜C)。図中のバーは平均士標準偏 差を示す (n=3、培養ゥエル)。 *, P〈0.05; **, P〈0.01白柱との比較を示す。これらの結 果は可溶型 RANKLが LPSや他の細菌菌体成分に対するマクロファージの応答性を 低下させることを意味して 、る。
[0091] (2)可溶型 RANKL除去及び GM-CSF処理による RANKL誘導性トレランスの緩和
RANKL誘導性トレランスが可逆的かどうかを調べるために、 MDBMsを可溶型 RANK Lで 24時間処理した後に可溶型 RANKLの入って ヽな 、培地でさらに 24時間培養した 。 MDBMsを培地単独 (Med)又は 10ng/mlの可溶型 RANKLで 24時間処理し (Day 1)、 続!、て培地単独 (Med)又は lOng/mlの可溶型 RANKLでさらに 24時間処理 (Day 2)した 後、 lOOng/mlの LPSで 6時間刺激した。培養上清 (n=3)は ELISA法によるサイト力イン 濃度測定のために回収した。対照群と比較して、 TNF-ひ、 IL-6及び IL-12 (p40)の産 生は十分に、或いは少なくとも部分的に回復しており、 RANKL誘導性トレランスは可 逆的であることが示された (図 7A〜C)。図中のバーは平均士標準偏差を示す。 *, Pく 0.01黒柱との比較を示す。
[0092] GM- CSFは RANKL/RANKのシグナリングを阻害することが知られているため、次に GM-CSFの RANKL誘導性トレランスに与える影響を調べた。 MDSMsを可溶型 RANK Lで 24時間前処理したあと、可溶型 RANKLを含まな!/、GM- CSF入り培地で 3時間処 理した。その後細胞を LPSで刺激し、 TNF- o;濃度を定量した。具体的には、 MDBMs を 10ng/mlの可溶型 RANKLで 24時間処理し (Γ ),その後 500U/mlの GM- CSFで 3時 間刺激 (2° )した後、 lOOng/mlの LPSで 6時間刺激した (3° )。結果を図 8に示す。培養 上清中の TNF- a濃度 (n=3)は ELISA法で定量した。図中のバーは平均士標準偏差 を示す。 *, Pく 0.01。データは 3回の実験のうち代表的なものを示した。図 8に示すよう に、 GM- CSF自体は TNF- αの産生を誘導しないにもかかわらず、短時間の GM- CSF の処理は可溶型 RANKL前処理マクロファージの TNF- a産生を顕著に上昇させた。 こうした結果は、 GM-CSFが RANKL誘導性トレランスを緩和させることを意味して 、る ( 図 8)。以上より、本実施例は可溶型 RANKL除去と同様、 GM-CSFによる短時間処理 力 SLPSに対するマクロファージの応答性を回復させることが判明した。
[0093] (3)血清中可溶型 RANKL及び OPGレベルの LPS投与や細菌感染による動的変動 血清中の生理的及び病理的可溶型 RANKL濃度を比較するために、 LPSをマウス 腹腔内に注入して血清中の可溶型 RANKLと OPG濃度を定量した。 C57BL/6J mice ( n=24)の腹腔に LPSを注入した (1 μ g/g体重)。血液は図 9に記載した時間の後に回収 した (n=3 マウス/各点)。血清中の可溶型 RANKLと OPGの濃度は ELISA法によって 定量した。 LPS注入前の血清中可溶型 RANKL濃度は約 150pg/ml、 OPG濃度は約 20 OOpg/mlであった。結果を図 9A及び Bに示す。図中のバーは平均士標準偏差を示す 。 *, P〈0.05; **, P〈0.01 Ohとの比較を示す。驚くべきことに、可溶型 RANKL濃度は L PS注入後 6時間以降で劇的に低下し、一方 OPGの濃度は 6時間以降で上昇した。さ らに、 C57BL/6Jマウス (n=6)に 3.3 X 107 CFU/g体重のサルモネラを経口感染させた（ 感染)。対照マウスには PBSを飲ませた (コントロール)。 4日後、血液を採集して血清中 の可溶型 RANKL及び OPGの濃度を ELISA法で測定した。結果を図 10A及び Bに示 す。図に示すように、血清中可溶型 RANKLの低下と OPGの上昇はサルモネラ経口 感染後 4日目にも観察された。図中のバーは平均士標準偏差を示す (n=3)。 *, Pく 0.0 5; **, P〈0.01。これらの結果は、血清中の可溶型 RANKL及び OPGレベル力 PSや細 菌感染に対して動的に制御されて 、ることを示して 、る。
[0094] (4) RANKL欠損マウスと OPG欠損マウスにおける異常なサイト力イン産生
生理的な血清中における可溶型 RANKLの、 LPS誘導性サイト力イン産生に対する 影響をみるために、 RANKLを欠損した Tnfsfir/_マウスを解析した。図 11A及び Bに、 野生型マウスと RANKL欠損マウス (Tnfsflr/_)における血清中の可溶型 RANKL及び OPGの濃度を ELISA法で測定した結果を示す (n=4、各遺伝子型)。図中のバーは平 均士標準偏差を示す。 *, P〈0.05; **, Pく 0.01対照との比較を示す。予想された通り、 血清中の可溶型 RANKLはこのマウスでは検出できなかった力 OPGは野生型マウス と比べてやや高かった。
[0095] さらに、腹腔内に LPS(2 μ g/g体重)を注入し、 90分後の野生型マウスと Tnfrsfirマ ウスの血液を採取した。血清中サイト力インは ELISA法で定量した。 LPS注入後、 TNF - aと IL-6の産生が Tnfsfl ΓΛマウスにお!/、て有意に亢進して 、ることが判明した (図 1 2A〜C)。図中のバーは平均士標準偏差を示す。 *, P〈0.05; **, P〈0.01対照との比 較を示す。これらの結果は、 Tnfsfl Γマウスにおいては RANKL誘導性トレランスが欠 如しており、それゆえ炎症性サイト力イン産生が亢進するであろうという予想と一致し ている。
[0096] さらに RANKL誘導性トレランスのマウスにおける役割を調べるために、 OPGを欠損 した Tnfrsfl lb— マウスを解析した。図 13A及び Bに、野生型マウスと OPG欠損マウス（ Tnfrsfl lb— /_ )における血清中の可溶型 RANKL及び OPGの濃度を ELISAで測定した 結果を示す (n=5、各遺伝子型)。図中のバーは平均士標準偏差を示す。 *, Pく 0.05; * *, Pく 0.01対照との比較を示す。対照の OPGヘテロ欠損マウスと比較して、生理的な 血清中可溶型 RANKL濃度は約 10倍 Tnfrsfllb— Λマウスにおいて高かった。それゆえ 、 OPGを欠損したマウスは常に高濃度の可溶型 RANKLにさらされて ヽると 、える。
[0097] さらに、腹腔内に LPS(2 μ g/g体重)を注入し、 90分後の野生型マウスと Tnfrsfllb_/_ マウスの血液を採取し、血清中サイト力インを ELISA法で定量した。結果を図 14A〜C に示す。図中のバーは平均士標準偏差を示す。 *, Pく 0.05; **, Pく 0.01対照との比較 を示す。 LPS注入後 IL-6の産生が Tnfrsfllbチマウスにおいて有意に低下することが 判明した。こうしたことから、慢性的に高い濃度の可溶型 RANKLに暴露されることによ り OPG欠損マウスでは炎症性サイト力イン産生が抑制されていることがわ力つた。
[0098] (5) RANKL欠損マウスの LPSに対する高!、感受性
RANKL欠損マウスにおける異常な炎症性サイト力イン産生の影響を解析するため に、我々は高い濃度の LPSを野生型マウスと Tnfsfir/_マウスに腹腔内注入して生存 率を比較した。高濃度の υ¾(130 /ζ g/g体重)を生後 6週間の野生型マウス (n=10)と Tn 1ΓΛマウス (η=5)に腹腔内注入した後、生存曲線を描いた。その結果、注入後 24時 間後には 90%の野生型マウス (η=10、白四角)が生存していたのに対して、全ての Tnf sfllチマウス (n=5、黒四角)は 24時間以内に死亡した (図 15)。 Tnfsfllチマウスは LPS に対して高感受性であった。こうした結果は、生理的な血清中の可溶型 RANKLがマ ウスをエンドトキシンショック力も保護する働きがあることを示唆している。
[0099] (6)可溶型 RANKLによる TLR4の低下
可溶型 RANKLで 24時間マクロファージを処理すると、 TLR4の mRNAレベルは有意 に抑制される。可溶型 RANKL処理後 LPSで刺激し、その際の TLR4 mRNAレベルを 経時的に追っても、この傾向は変わらな力つた (図 16A)。図中のバーは平均士標準 偏差を示す。また、可溶型 RANKLで 24時間マクロファージを処理すると細胞表面の T LR4-MD2複合体の発現が抑制されることがフローサイトメトリー解析によって明らかと なった (図 16B)。 TLR4は LPSの受容体であるため、こうした TLR4の低下が RANKLトレ ランスのメカニズムの一端を担っていることが示唆された。
[0100] (7)可溶型 RANKLによる抗原提示の抑制
マクロファージを可溶型 RANKLで 24時間処理すると、その表面の MHCII, CD80, C D86の発現が有意に低下することがフローサイトメトリー解析によって明ら力となった（ 図 17、実線が可溶型 RANKL処理群、破線グレーがコントロール群)。 MHCIIは外来 抗原をリンパ球に対して提示するための分子であり、その際に CD80、 CD86などの co -stimulatory moleculesか不可欠であるとされる。
[0101] 従って、これらの分子の発現が低下することは、可溶型 RANKLにマクロファージの 抗原提示を抑制する能力があることを示唆して 、る。
[0102] (8) RANKLトレランスの c-Fos非依存性
破骨細胞分化における RANKL/RANKのシグナルが伝わるためには転写因子 c-Fo sが必要であり、これを欠損するマウスでは破骨細胞ができない。 RANKLトレランス力 S 生じるために c-Fosが必要であるのか否かを調べるため c-Fos欠損マウス由来マクロ ファージを解析した。 c-Fos欠損マウス由来マクロファージを lng/mlの LPSで 24時間 前処理した後 lOOng/mlの LPSで刺激して LPSトレランスを見たところ、野生型と同様に 生じることが明ら力となった (図 18A及び B)。また、 lOng/mlの可溶型 RANKLで 24時間 前処理した後に lOOng/mlの LPSで刺激して RANKLトレランスを見たところ、やはり野 生型と同様に生じることが明ら力となった (図 18C及び D)。図中のバーは平均士標準 偏差を示す。こうしたことから、 LPSトレランスや RANKLトレランスは c-Fos非依存的で あると結論できる。すなわち、 RANKLトレランスはマクロファージが多核の破骨細胞に 分ィ匕する過程における、単なる「脱マクロファージィ匕現象」としてとらえるべきではな ヽ
[0103] (9)マウス急性毒性試験
マウスは、 7〜8週齢 C57BL/6N (雌)マウスを用いた。
[0104] LPSは、 Lipopolysacchandes from Escherichia coll 055:B5 (Sigma) 用い、 10mg^3 たり滅菌水 1.0mlをカ卩えて溶解し用いた。 M-CSFは、ロイコプロール (協和発酵工業） を用い、 50 g当たり PBS 1.0mlをカ卩えて溶解して用いた。
[0105] GST- RANKLの作製
ヒト型 RANKL残基 140〜317をコードする cDNAに PCRにて Sal I,Not Iサイトを付カロし 、これらのエンドヌクレアーゼを用いて、 pGEX- 4T- 2 (GE healthcare;Genbank Access ion Number U 13854)の Glutathione S- transferaseの下流にクローユングした。ヒト型 R ANKL残基 140〜317をコードする cDNAの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図 1 9に示す。また、 RANKL遺伝子を含むベクターの制限酵素地図を図 20に示す。さら に、当該ベクターの塩基配列を図 21A及び 21Bに示す。図 21Bの塩基配列は図 21 Aの塩基配列の続きである。 BL21 (DE3) Escherichia coli(invitrogen)における IPTG ( 終濃度： 0.5mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出用緩衝液 (50m M Tris-HCl,pH8.0,100mM NaCl.lmM EDTA.lmM DTT, l%(v/v)TritonX— 100)にて 懸濁し、 4°Cで超音波破砕機を用いて破砕した。 18000 X g, 15minで遠心後、上清を 回収し Glutathione Sepharose (登録商標）カラムにかけた。続いて洗浄用緩衝液（50 mM Tris— HCl'pH 8.0,100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1%(v/v)TritonX— 100)にて洗浄し た。その後、 Glutathione溶液（20mM還元型グルタチオン， 50mM Tris- HCl,pH8.0)で 溶出した。 SDS-PAGEにて精製した GST- RANKLの分子量及び純度を確認し、フィル ターろ過した。分子量 47.0kDa、純度 95%以上であった。また,リムルス変形細胞溶解 物試験（limulus amebocyte lysate assay)によりエンドトキシン濃度を測定し、 1EU/ μ g 未満であることを確認した。
[0106] GST-RANKL発現ベクターの作製方法を図 22に示す。
[0107] LPS, RANKL及び M- CSF投与試験
10 g GST- RANKL、 2 ^ g M- CSF、 2 ^ g M- CSF+ 10 μ g GST- RANKL、コント口 ールとして PBSをそれぞれ C57BL/6Nマウス（各群 9〜10匹）に腹腔内投与し、 24時間 後に LPS (2.5mg/匹)を腹腔内投与した。その後の生存を 144時間後まで観察した。
[0108] 結果を図 23に示す。図 23に示すように、 RANKLと M- CSFを投与した場合に、生存 率が有意 (Pく 0.03)に高力つた。
[0109] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明 細書にとり入れるものとする。
配列表フリーテキスト
[0110] 配列番号 3および 4： GST-RANKL (aal27-317)
配列番号 5および 6： GST-RANKL (aal40-317)
配列番号 7および 8： GST-RANKL (aal59-317)
配列番号 9〜13：合成

Claims

請求の範囲
[I] 生体試料中の RANKL及び Z又は OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する 方法。
[2] 生体試料中の RANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、 生体試料中の可溶型 RANKL濃度が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患 に罹患して 、ると判定する、請求項 1記載の炎症性疾患を検出する方法。
[3] 生体試料中の OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体 試料中の OPG濃度が正常人に比べて上昇した場合に、炎症性疾患に罹患して!/、る と判定する、請求項 1記載の炎症性疾患を検出する方法。
[4] 生体試料中の RANKL及び OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法で あって、生体試料中の可溶型 RANKL/OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合 に、炎症性疾患に罹患していると判定する、請求項 1記載の炎症性疾患を検出する 方法。
[5] 生体試料中の RANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、 生体試料中の細胞上に存在する膜型 RANKLをフローサイトメトリー法により測定する ことを含む、請求項 1記載の炎症性疾患を検出する方法。
[6] 生体試料中の RANKL及び OPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法で あって、生体試料中の細胞上に存在する膜型 RANKLをフローサイトメトリー法により 測定し、膜型 RANKL測定量/ OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合に、炎症 性疾患に罹患して 、ると判定する、請求項 1記載の炎症性疾患を検出する方法。
[7] 生体試料中の細胞が末梢血細胞である請求項 5又は 6に記載の炎症性疾患を検出 する方法。
[8] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である請求項 1〜7の いずれか 1項に記載の炎症性疾患を検出する方法。
[9] 炎症性疾患が、敗血症である請求項 8記載の炎症性疾患を検出する方法。
[10] 抗 RANKL抗体及び Z又は抗 OPG抗体を含む、 RANKL及び Z又は OPGをマーカー として用い炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[II] 抗 RANKL抗体及び抗 OPG抗体を含む、 RANKL及び Z又は OPGをマーカーとして 用い炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[12] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である請求項 10又は
11に記載の炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[13] 炎症性疾患が、敗血症である請求項 12記載の炎症性疾患を検出するための検出試 薬。
[14] RANKL及び Z又は M-CSFを有効成分として含む、炎症性疾患の予防または治療用 組成物。
[15] RANKL及び M-CSFを有効成分として含む、請求項 14記載の炎症性疾患の予防又 は治療用組成物。
[16] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物が配合剤である、請求項 15記載の炎症性疾 患の予防又は治療用糸且成物。
[17] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物が RANKLを含む薬剤と M-CSFを含む薬剤と 力 なるキットである、請求項 15記載の炎症性疾患の予防または治療用組成物。
[18] RANKL及び Z又は M-CSFが手術の前に投与されることを特徴とし、手術後の炎症 性疾患を予防する、請求項 15〜17のいずれ力 1項に記載の炎症性疾患の予防又 は治療用組成物。
[19] 炎症性疾患が感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である請求項 15〜18 のいずれか 1項に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[20] 炎症性疾患が、敗血症である請求項 19記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成 物。
[21] RANKL及び Z又は M-CSFを有効成分として含む、免疫抑制剤。
[22] RANKL及び M-CSFを有効成分として含む、請求項 21記載の免疫抑制剤。
[23] 免疫抑制剤が配合剤である、請求項 22記載の免疫抑制剤。
[24] 免疫抑制剤が RANKLを含む薬剤と M-CSFを含む薬剤とからなるキットである、請求 項 23記載の免疫抑制剤。
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