JP2004520011A - Rankリガンド介在障害の治療において有用な抗−rankリガンドモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、高アフィニティー中和MAb由来のキメラ、ヒト化および他のRANK−L MAb、それらを含む医薬組成物、治療および診断方法を提供する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、一般に、RANKリガンドにより介在される症状の治療および診断に有用な抗体に、さらに詳細には、MAb、改変、Fab、キメラおよびヒト化抗体に関する。
【0002】
(従来技術)
RANK−Lは腫瘍壊死スーパーファミリーの一の構成員である。
ヒトRANKリガンド(RANK−L)は、免疫系、骨の発育およびホメオスタシスの重要な調節物質であることが知られている腫瘍壊死因子ファミリーの蛋白の一の構成員である(Andersonら、Nature 390:175−179、1997)。このリガンドはまた、腫瘍壊死因子関連の活性化誘発のサイトカイン(TRANCE)(Wongら、J.Exp.Med. 186:2075、1997)、オステオプロテゲリンリガンド(OPGL)(Laceyら、Cell 93:165、1998)および破骨細胞分化因子(ODF)(Yasudaら、Proc.Natl.Acad.Sci. 95:3597、1998)と称される。腫瘍壊死因子ファミリーの構成員は、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化などの多様な、時に正反対の生物学的応答を媒介する。今日まで記載されているTNFファミリーのリガンドのさらなる構成員として、4−1BBL、APRIL、CD40L、CD30L、CD27L、FasL、LIGHT、LT−アルファ、LT−ベータ、OX40L、TNF−アルファ、TRAIL、RANK−LおよびTWEAKが挙げられる(Wongら、J.Leukocyte Biol.:65 715、1999およびKwonら、Curr Opin Immunol 11:340、1999を参照のこと)。これらの他のリガンドのうち、RANKLは、CD40Lと最大の相同性を共有する(細胞外領域にて約28%の同一性を有する)。
【0003】
TNFリガンドファミリーの他の構成員と同様に、RANK−Lは、ショート細胞質テイルと、RANK−L受容体、すなわちRANKのための結合部位を含む、細胞外TNF核ドメインとを有するII型膜蛋白として発現される。その受容体結合ドメインは蛋白分解的に切断され、一定の距離にある受容体の機能を刺激することが可能な、可溶性RANKLを放出することができる。この切断はメタロプロテアーゼの阻害剤により遮断され、精製されたTNFアルファ変換酵素(TACE)が切断を誘発することができる。このことはこのプロセシングがTACEにより、あるいは類似する酵素により媒介されることを示唆する(Lumら、J.Biol.Chem. 274:13613、1999)。RANK−Lは活性化されたT−細胞、活性化された骨芽細胞および骨髄間質細胞上で発現され、免疫系生態学と骨生態学とを関連付ける。生化学的な証拠はRANK−Lがグリコシル化されていることを示している。細胞質テイルはSH3ドメイン含有蛋白のためのドッキング部位として働きうるモチーフを有し、したがって受容体との結合の際に逆シグナル化を媒介する可能性がある。
【0004】
RANK−Lの受容体
RANK−Lについての2つの受容体、RANKおよびOPGが同定された。RANKはCD40と最も関連しているTNF受容体ファミリーの構成員である(Andersonら、Nature 390:175、1997)。RANKは、184個のアミノ酸の細胞外ドメイン、貫膜ドメインおよび383個のアミノ酸のラージ細胞質ドメインを有する616個のアミノ酸のI型膜受容体である。mRNAとして広範囲にわたって発現するが、RANK蛋白の細胞表面での発現は脾臓、リンパ節および骨髄由来の樹状細胞および破骨細胞先祖細胞に限定されるようである(Wongら、J.Exp.Med., 186:2075、1997;Andersonら、Nature 390:175、1997;laceyら、Cell 93:165、1998)。TNF受容体ファミリーの多くの構成員と同様に、RANKの細胞質ドメインはTNF−受容体関連因子(TRAF)として知られているアダプター分子との相互作用を介してシグナル変換を媒介していると考えられる。TRAFは、順次、NF−kBおよびミトゲン−誘発の蛋白キナーゼ(MAPK)、例えば、c−Junアミノ末端蛋白キナーゼ(JNK)および細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)などのいくつかの異なる経路を活性化する。これらの異なるシグナル変換経路は、多方面にわたり、細胞生存シグナル、アポトーシス、分化、サイトカイン分泌および/または細胞活性化を媒介している。したがって、RANK−LとRANKの相互作用は、免疫機能および骨ホメオスタシスの制御において一の重要な役割を果たしている可能性がある。生化学的および遺伝学な遺伝子ノックアウトの研究により、TRAF−6ならびにTRAF−2およびTRAF−5もまた、RANKの細胞質領域と結合するこのファミリーの主たる構成員であることがわかる。
【0005】
第2の同定されたRANK−L受容体がオステロプロテゲリン(OPG)であり、それは貫膜領域を欠き、RANK−Lとその同族細胞表面受容体RANKの間のシグナル化を遮断するように作用する可溶性デコイ受容体RANKとして機能するようである。OPGは骨吸収の強力な阻害剤であることが知られており、インビトロおよびインビボにてRANK−L介在破骨細胞形成を阻害することができる(Laceyら、Cell 93:165、1998;Yasudaら、PNAS 95:3597、1998;Tomoyasuら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 245:382、1998;TsudaおよびHigashio、Nippon Rinsho 56:1435、1998)。OPGはまたTNFリガンドのTRAILと結合する(Emeryら、J.Biol.Chem. 273:14363、1998)。
【0006】
樹状細胞生態学におけるRANK−Lの役割
成熟骨髄樹状細胞および脾臓樹状細胞はその細胞表面上で高レベルのRANKを発現し、このことはRANK−Lが樹状細胞生態学の制御において中心的な役割を果たしていることを示唆する(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。RANK−Lの一の主たる作用は、おそらく、十分に研究されているアポトーシスのサプレッサーである、Bcl−xLをアップレギュレートさせて、成熟樹状細胞の生存率を向上させることである(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。DC生存率の向上は、抗原/MHC複合体および共同刺激性細胞、例えば、B7−1およびB7−2の刺激表示を伸ばすことにより、順次、T細胞増殖応答の強化をもたらすことができる(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。RANK−Lによる樹状細胞の刺激はまた、IL−12、IL−15、IL−1およびIL−6などの数種のサイトカイン遺伝子の転写を誘発することも知られている(Wongら、J.Leukocyte Biol. 65:715、1999)。これらのサイトカインは免疫応答の強度および型を制御する。CD40Lのノックアウト実験において、RANKL−RANK経路が残りのウイルス耐性を媒介する(Bachmanら、J.Exp.Med. 189:1017−1020)。また、RANKLとRANKのノックアウトマウスはリンパ節器官形成の機能を欠いており、BおよびT細胞の初期発生にていくつかの欠損を示す(Kongら、Nature 397:315、1999;Dougallら、Genes and Development 13:2412、1999;Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97:1566、2000)。このように、RANK−Lは、免疫系の発生において、および免疫応答の特性および強度の制御において一の役割を果たしているようである。
【0007】
骨生態学におけるRANK−Lの役割
RANK−Lは破骨細胞の発生および活性化のための重要な分化因子であり、それ自体が骨ホメオスタシスおよびカルシウム代謝を維持するのに主たる役割を果たしている。RANK−Lは骨吸収性破骨細胞の脊髄前駆体からの分化を刺激することができる(Laceyら、Cell 93:165、1998;Yasudaら、PNAS 95:3597、1998)。このように、RANK−LおよびRANKのノックアウトマウスは、破骨細胞の分化機能を完全に欠くため、重度の骨石化症を有すると特徴付けられた(Kongら、Nature 397:315、1999;Dougallら、Genes and Development 13:2412、1999;Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97:1566、2000)。さらには、トランスジェニックマウスにおけるRANK−Lデコイ受容体OPGの組織的過剰発現も、可溶性RANKドメイン外蛋白の組織的投与(Fullerら、J.Exp.Med. 188:997、1998)と同様に、骨石化症を発症することが判明した(Simonetら、Cell 89:309、1997)。RANK−Lはまた破骨細胞を刺激し、成熟破骨細胞の運動性、拡張および生存率の増加をもたらす。この刺激は、破骨細胞の活性化により、順次、より効果的な骨吸収をもたらす。かくして、骨ホメオスタシスは、少なくともいくらかはRANK−LとOPGの発現の均衡に依存しているようである。したがって、骨の疾患は、RANK−Lの作用を亢進または減衰させることにより治療することができる。例えば、T細胞を活性化することでRANKLの発現がアップレギュレートされ(Josienら、J.Immunol 162:2562−2568、1999;Kongら、Nature 402:304−309、1999)、ポリクローナル活性化されたctla4ノックアウトマウスから由来のT細胞はragノックアウトマウスへの養子免疫伝達により骨喪失を誘発するが、それはOPGを投与することで阻害される(Kongら、Nature 402:304−309、1999)。また、ラットにおけるアジュバント誘発の関節炎において、OPG蛋白の投与は、炎症性反応に影響を及ぼすことなく、骨および軟骨喪失を阻害する(Kongら、Nature 402:304−309、1999)。
【0008】
要約すれば、RANKとRANK−Lのライゲーションは、骨髄における破骨細胞の分化、または骨吸収の亢進および免疫応答の強化に至る、リンパ器官における樹状細胞の生存およびサイトカインの産生をもたらす。したがって、RANK−Lは免疫系障害および骨ホメオスタシスの疾患の新規な療法を開発するための望ましい標的である。
中和RANK−L抗体はヒトにおける病理学的な骨喪失および関連する徴候を緩和するのに有用でありうる。中和RANK−L抗体はまたヒトにおける炎症および自己免疫疾患および関連する徴候を緩和するのに有用である可能性がある。かくして、当該分野において、RANK−L介在の破骨細胞の分化および活性化ならびにそのような骨疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトRANK−Lに対する中和モノクローナル抗体を創製することについて一の要求がある。さらに、当該分野において、RANK−Lの介在する免疫応答の強化ならびにそのような免疫系の疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトRANK−Lに対する中和モノクローナル抗体などの高アフィニティーRANK−Lアンタゴニストを創製することについて一の要求がある。アンタゴニストであるRANKLモノクローナル抗体は、TRAILなどの他のTNF関連のリガンドと相互作用する可能性のあるOPG蛋白よりもその作用においてより選択的であると考えられる。
【0009】
(発明の開示)
本発明は、第1の態様において、ヒトRANK−Lに特異的であり、次に記載されているように結合アフィニティーが約10−10M以下の解離定数により特徴付けられる、中和モノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル抗体の具体例がマウスモノクローナル抗体19H22である。本発明のもう一つ別の態様はMAb 19H22を産生するハイブリドーマ細胞である。本発明は、関連する態様において、本発明の齧歯動物の中和モノクローナル抗体のFc領域を欠失させることで産生されるヒトRANK−Lに特異的な中和FabフラグメントまたはそのF(ab’)2フラグメントを提供する。
【0010】
さらに別の関連する態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来の相補性決定領域(CDR)を含む、ヒトRANK−Lに特異的な改変抗体およびその抗体をコードする核酸分子を提供する。改変抗体がヒト化抗体である場合、ヒト以外の生物の免疫グロブリンからの相補性決定領域(CDR)をコードする配列を、第1免疫グロブリンパートナーの少なくとも1つの、好ましくはすべての相補性決定領域(CDR)がヒト以外の生物のモノクローナル抗体から由来のCDRによって置き換えられている、その第1免疫グロブリンパートナーに挿入する。その上、第1免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン定常鎖のすべてまたは一部を含む、第2免疫グロブリンパートナーに作動的に連結していることが好ましい。
【0011】
関連する態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来のCDRおよびかかるCDRをコードする核酸分子を提供する。
もう一つ別の態様において、ヒト重鎖および軽鎖定常領域と、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体から由来の重鎖および軽鎖可変領域とを含有する、キメラ抗体が提供される。
さらにもう一つ別の態様において、本発明は、1(またはそれ以上)の上記した抗体および医薬上許容される担体を含有する、医薬組成物を提供する。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、免疫系または骨の疾患、特に慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症についての、ヒトにおける過剰量のRANK−Lに付随する症状の治療方法であって、ヒトに有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【0013】
さらに別の態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来の改変抗体(例えば、操作された抗体、CDR、FabまたはF(ab)2フラグメントまたはそのアナログ)の組換え体を産生する方法、およびその産生に有用な成分を提供する。これらの成分は、その成分をコードする単離された核酸配列、および組換えプラスミドであって、選択された制御配列の下で、その組換えプラスミドをトランスフェクトした宿主細胞(好ましくは哺乳動物細胞)にてその発現を指令する能力を有する、その核酸配列を含有する組換えプラスミドを包含する。この産生方法は、改変抗体、好ましくはヒト化抗体が該細胞にて発現されるような条件下で本発明のトランスフェクトされた宿主細胞系を培養し、その発現産物をそこから単離することを含む。
【0014】
本発明のさらにもう一つ別の態様は、ヒトにおいて、Th1T細胞の過剰な活性または破骨細胞の発生および活性化に付随する症状、特に慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症を診断する方法であって、患者から由来の生物学的流体の試料を得、RANK−L/抗体(モノクローナルまたは改変抗体)の複合体が形成されるような条件下で本発明の抗体および改変抗体をかかる試料と接触させるようにし、そのRANK−L/抗体の複合体の有無を検出することを含む方法である。
本発明の他の態様および利点を、以下の記載およびその好ましい具体例に詳述する。
【0015】
(発明を実施するための最良の形態)
表Iはマウス抗体19H22に関する軽鎖可変領域のcDNAおよび推定アミノ酸配列(各々、配列番号:1および2)を示す。囲まれている領域(表Iのボックス内)は3つのCDR(配列番号:5、6および7)およびCDRをコードする各々のポリヌクレオチド(配列番号:13、14および15)を示す。太字領域は縮重プライマー配列(配列番号:11)を示す。
【0016】
【表1】
【0017】
表IIはマウス抗体19H22の重鎖可変領域のcDNAおよび推定アミノ酸配列(各々、配列番号:3および4)を示す。囲まれている領域(表IIのボックス内)は3つのCDR(配列番号:8、9および10)およびCDRをコードする各々のポリヌクレオチド(配列番号:16、17および18)を示す。太字領域は縮重プライマー配列(配列番号:12)を示す。
【0018】
【表2】
【0019】
本発明は、その可変軽鎖および重鎖領域を表IおよびIIに示す、マウスモノクローナル抗体19H22に例示されるように、ヒトRANK−L結合特異性、中和活性およびヒトRANK−Lとの高アフィニティーにより特徴付けられる、種々の抗体、改変抗体およびそれらのフラグメントを提供する。モノクローナル抗体、19H22を従来のハイブリドーマ技法により調製し、新規な中和抗体を生成した。本発明の抗体は、RANK−L介在障害、例えば慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患の治療用の治療的組成物および医薬組成物に有用である。また、この生成物は、ヒトにおける内因性RANK−Lレベルまたは活性化細胞からのエクスビボで放出されるRANK−Lを測定すること(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))によるRANK−L介在症状の診断にも有用である。
【0020】
I.定義
「抗体」は、モノクローナル抗体、改変抗体、ヒト化抗体、操作された抗体およびキメラ抗体を包含するが、これらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは、ポリクローナル抗体と反対のものであり、慣用的なハイブリドーマ技法、ファージ表示コンビナトリアルライブラリー、免疫グロブリンチェーンシャフリングおよびヒト化技法により調製することができる、免疫グロブリンをいう。
「改変抗体」とは、改変免疫グロブリンのコード化領域によりコードされた蛋白をいい、かかる蛋白は選択された宿主細胞中で発現させることにより得ることができる。かかる改変抗体は操作された抗体(例えば、キメラまたはヒト化抗体)あるいは免疫グロブリンの定常領域、例えばFv、FabまたはF(ab)2などのすべてまたは一部を欠いている抗体フラグメントである。
「改変免疫グロブリンのコード化領域」とは、本発明の改変抗体をコードする核酸配列をいう。改変抗体がCDR−グラフトまたはヒト化抗体である場合、第1免疫グロブリンパートナーを含むヒト可変フレームワーク配列がヒト以外の生物の免疫グロブリンから由来の相補性決定領域(CDR)をコードする配列と置き換えられている。所望により、第1免疫グロブリンパートナーは第2免疫グロブリンパートナーと作動的に結合していてもよい。
【0021】
「第1免疫グロブリンパートナー」とは、未変性(または天然に存在する)CDR−コード化領域がドナー抗体のCDR−コード化領域により置き換えられているところの、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリンの可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(または両鎖)、そのアナログあるいは機能的フラグメントとすることができる。抗体(免疫グロブリン)の可変領域内にあるかかるCDR領域は、当該分野にて既知の方法により決定することができる。例えば、Kabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest、第4版、U.S.Department of Health and Human Services、National Institutes of Health(1987))は、CDRを位置付けるためのルールを開示している。加えて、CDR領域/構造を同定するのに有用なコンピュータープログラムも知られている。
【0022】
「中和」とは、ヒトRANK−Lとその特異的受容体との結合を妨げることにより、あるいは結合が生じたとしても、RANK−Lのその受容体を介するシグナル化を阻害することにより、RANK−L活性を阻害する抗体をいう。RANK−L中和アッセイにて測定した場合に、RANK−L活性を阻害するのにMAbが90%効果的、好ましくは95%効果的、最も好ましくは100%効果的であるならば、そのMAbは中和抗体である。
「高アフィニティー」なる語は、光バイオセンサー分析法により測定した場合に、ヒトRANK−Lと10−10M以下のKdにより特徴付けられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
「ヒトRANK−Lとの結合特異性」とは、ネズミRANK−Lまたは他のRANK−LよりもヒトRANK−Lとより高いアフィニティーを有することを意味する。
【0023】
「第2免疫グロブリンパートナー」とは、第1免疫グロブリンパートナーがフレームにて融合するか、または任意の従来のリンカー配列により融合している(すなわち、作動的に結合した)蛋白またはペプチドをコードするもう一つ別のヌクレオチド配列をいう。免疫グロブリン遺伝子であることが好ましい。第2免疫グロブリンパートナーは、目的とする同じ抗体(すなわち、相同的抗体−第1および第2改変抗体が同じ供給源から誘導されている)または付加的な抗体(すなわち、異種抗体)のその全体の定常領域をコードする核酸配列を含んでいてもよい。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(あるいは単一ペプチドの一部としての両鎖)であってもよい。第2免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリン種またはイソ型に限定されるものではない。加えて、第2免疫グロブリンパートナーは、FabまたはF(ab)2に見られるような、免疫グロブリン定常領域の一部(すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分)を含んでいてもよい。かかる第2免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、ファージ表示ライブラリーの一部として、宿主細胞の表面で曝される内在性膜蛋白をコードする配列、あるいは分析または診断検出のための蛋白、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードする配列を含んでいてもよい。
【0024】
Fv、Fc、Fd、FabまたはF(ab)2なる語は標準的な意味で用いられる(例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
本明細書中で使用される「操作された抗体」とは、一定の型の改変抗体、すなわち、選択された受容体の抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインの一部が選択されたエピトープに対して特異性を有する1またはそれ以上のドナー抗体から由来の類似する部分により置き換えられているところの、全長の合成抗体(例えば、抗体フラグメントとは反対のキメラまたはヒト化抗体)として記載する。例えば、かかる分子は非修飾軽鎖(またはキメラ軽鎖)と関連するヒト化重鎖により特徴付けられる抗体、またはその逆の抗体を包含する。操作された抗体はまた、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列を変更することで特徴付けることもできる。これらの抗体はアクセプター抗体からの1またはそれ以上のCDR(好ましくはすべてのCDR)を本明細書に記載のドナー抗体からのCDRと置き換えたものとすることができる。
【0025】
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体から由来の天然に存在する可変領域(軽鎖および重鎖)を、アクセプター抗体から由来の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含有する一の型の操作された抗体である。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の生物のドナー免疫グロブリンから由来のCDRを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導の部分が1の(またはそれ以上の)ヒト免疫グロブリンから由来している、操作された一の型の抗体をいう。加えて、フレームワーク支持残基を改変し、結合アフィニティーを保存させることもできる(例えば、Queenら、Proc.Natl Acad Sci USA、86:10029−10032(1989);Hodgsonら、Bio/Technology、9:421(1991)を参照のこと)。
【0026】
「ドナー抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンのコード化配列を提供し、ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有する改変抗体の発現が得られるように、その可変領域、CDRまたは他の機能的フラグメントあるいはそのアナログの核酸配列を第1免疫グロブリンパートナーに寄与する、抗体(モノクローナルまたは組換え抗体)をいう。本発明における使用に適する一のドナー抗体は、19H22と称される、ヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体である。抗体19H22はヒトRANK−Lと高アフィニティーを有し、ヒトRANK−L特異的(すなわち、ネズミRANK−Lを認識しない)である、イソ型IgG2b/カッパの中和抗体として定義される。この抗体は、適当なネズミIgG定常領域上に、各々、配列番号:1および2の可変軽鎖DNAおよびアミノ酸配列;および各々、配列番号:3および4の可変重鎖DNAおよびアミノ酸配列を有する。
【0027】
「アクセプター抗体」なる語は、その重鎖および/または軽鎖フレームワーク領域および/またはその重鎖および/または軽鎖定常領域をコードする核酸配列のすべて(またはいずれかの部分であるが、好ましくはすべてである)を第1免疫グロブリンパートナーに寄与する、ドナー抗体に対して異種構造を有する抗体(モノクローナルまたは組換え抗体)をいう。ヒト抗体はアクセプター抗体であることが好ましい。
【0028】
「CDR」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第4版、U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of health(1987)を参照のこと。免疫グロブリンの可変部には3つの重鎖および3つの軽鎖のCDR(またはCDR領域)がある。かくして、本明細書中で用いる「CDR」とは、3つすべての重鎖CDRまたは3つすべての軽鎖CDR(または、適当ならば、すべての重鎖およびすべての軽鎖の両方のCDR)をいう。
【0029】
CDRは抗体の抗原またはエピトープとの結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明で目的とするCDRはドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列から誘導され、そのCDRが誘導されるドナー抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能を共有するかまたは保持する、天然に存在するCDRのアナログを包含する。
抗原結合特異性または中和能を共有するとは、例えば、MAb19H22は特定レベルの抗原アフィニティーにより特徴付けることができるが、適当な構造環境下で19H22の核酸配列によりコードされるCDRはより低いまたはより高いアフィニティーを有するかもしれないことを意味する。にもかかわらず、そのような環境下で、19H22のCDRは19H22と同じエピトープを認識すると考えられる。19H22の代表的な軽鎖CDRは、配列番号:5;配列番号:6;配列番号:7を包含し、19H22の代表的な重鎖CDRとして、配列番号:8;配列番号:9;配列番号:10が挙げられる。
【0030】
「機能的フラグメント」とは、フラグメントを誘導した抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列(例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端で少し欠失した配列)である。
「アナログ」とは、少なくとも1個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列をいい、かかる修飾は化学的であってもよく、あるいは少しの(例えば、好ましくは10個以下の)アミノ酸の置換または再配列とすることができる。かかる修飾はアミノ酸配列が生物学的特性、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高アフィニティーを保持することを可能とする。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がCDR−コード化領域の範囲内であるいはその周辺で形成される場合、置換を介して(サイレント)変異を構築することができる。
【0031】
アナログはまた、対立遺伝子変形として生成することもできる。「対立遺伝子変形または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の変化である。かかる変形または修飾は遺伝的コードの縮重によるものであっても、あるいは所望の特性を得るために意図的に操作したものであってもよい。これらの変形または修飾はコードされたアミノ酸配列に変化を与えても与えなくてもどちらでもよい。
フラグメント、アナログおよび対立遺伝子変形の概念は「同一性」なる語で表すこともできる。例えば、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される配列と少なくとも90%、より好ましくは95%同一である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。
【0032】
「同一性」は、当該分野で公知であり、配列を比較することで決定されるような、2またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは2またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,Von Heinje,G.Academic Press,1987;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux, J.編,M Stockton Press,New York,1991;およびCarillo,HおよびLipman,D.、SIAM J.Applied Math., 48:1073(1988)に記載されている方法(これらに限らない)を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。2つの配列の間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(AltschulF.ら、J.Molec.Biol. 215:403−410(1990))を包含するが、これに限らない。BLAST XプログラムはNCBIおよび他の供給源(BLAST Manual,Altschulら、NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894;Altschulら、J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【0033】
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する:
1)アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48:443−453(1970)
比較マトリックス:HentikoffおよびHentikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89:10915−10919(1992)からのBLOSSUM 62
ギャップペナルティー:12
ギャップ長ペナルティー:4。
これらのパラメーターを用いて有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである(エンドギャップについてペナルティーを伴わない)。
【0034】
ポリヌクレオチドの比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する:
1)アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48:443−453(1970)
比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0
ギャップペナルティー:50
ギャップ長ペナルティー:3。
Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして利用できる。これらは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【0035】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号:1の対照となる配列と同じ、すなわち100%同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(トランジションおよびトランスバージョンを含む)または挿入からなる群より選択され、その変化は対照となるヌクレオチド配列の5’または3’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のヌクレオチドにおいて個々に、あるいは対照となる配列中の1またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。ヌクレオチドの変化した数は、配列番号:1中の全ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて、その積を配列番号:1中の全ヌクレオチド数から差し引くことにより、あるいは
nn≦xn−(xn・y)
式中、nnはヌクレオチドの変化した数であり、xnは配列番号:1中の全ヌクレオチド数であり、yは、例えば、70%ならば0.70であり、80%ならば0.80であり、85%ならば0.85であり、90%ならば0.90であり、95%ならば0.95などであり、xnとyとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをxnから差し引くことにより、決定される。配列番号:2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード化配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それゆえ、かかる変化に伴ってポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変化する。
【0036】
同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号:2の対照となる配列と同じ、すなわち、100%同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい(その場合、同一性%は100%未満である)。かかる変化は、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換(同類または非同類置換を含む)または挿入からなる群より選択され、該変化は対照となるポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のアミノ酸において個々に、あるいは対照となる配列中の1またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。所定の%同一性についてのアミノ酸の変化した数は、配列番号:2中のアミノ酸の総数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて、その積を配列番号:2中のアミノ酸の総数から差し引くことにより、あるいは
na≦xa−(xa・y)
式中、naはアミノ酸の変化した数であり、xaは配列番号:2中のアミノ酸の総数であり、yは、例えば、70%ならば0.70であり、80%ならば0.80であり、85%ならば0.85などであり、xaとyとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをxaから差し引くことにより、決定される。
【0037】
「エフェクター剤」なる語は、改変抗体および/またはドナー抗体の天然または合成軽鎖または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントが常套手段により結合しうる非蛋白キャリア分子をいう。かかる非蛋白キャリアは、診断の分野にて使用される通常のキャリア、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、例えば、BIAコア(ファルマシア)系にて用いられるような多糖類、あるいは医薬の分野にて、さらにはヒトおよび動物に安全に投与するために有用な他の非蛋白物質を包含しうる。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同位元素をキレートするためのマクロサイクリルを包含しうる。かかるエフェクター剤、例えばポリエチレングリコールはまた、改変抗体の半減期を伸ばすのに有用でありうる。
【0038】
II.高アフィニティーRANK−Lモノクローナル抗体
本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントを構築するのに用いるために、ヒト以外の種(例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯動物(例えば、ネズミおよびラット)など)を利用し、未変性ヒトRANK−Lまたはそのペプチドエピトープと一緒に表示して望ましい免疫グロブリンを生成することができる。一般的なハイブリドーマ技法を利用してヒト以外の生物のMAb RANK−Lを分泌するハイブリドーマ細胞系を生成する。ついで、かかるハイブリドーマを、実施例のセクションに記載されるように、96−ウェルプレートにコーティングしたRANK−Lを用いるか、あるいはまた、ストレプタビジンをコーティングしたプレートに結合したビオチニル化RANK−Lを用いて、結合についてスクリーニングする。
【0039】
本発明の一の具体例である高アフィニティー中和抗体が、以下の実施例により詳細に記載されている、キメラまたはヒト化抗体の形成に用いることができる、MAb19H22(その重鎖および軽鎖可変領域を表IおよびIIに示す)、マウス抗体である。19H22MAbは約Kd10−10MのヒトIL−1RANK−Lとの抗原特異性により特徴付けられる。このMAbはイソ型IgG2b/カッパであることで特徴付けられる。
本発明は19H22またはその超可変(すなわち、CDR)配列の使用に限定されるものではない。ヒトRANK−Lおよび対応する抗−RANK−LCDRとの約10−10M以下の解離定数により特徴付けられる他の適当な高アフィニティーRANK−L抗体を代わりに用いることもできる。以下の記載において、ドナー抗体が19H22として同定されている場合にはいつも、この明示は説明のためであって、単に記載を簡単にするためのものである。
【0040】
III.抗体フラグメント
また、ヒトRANK−Lに対するMAb由来のFabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントの使用を含む。これらのフラグメントはRANK−LおよびTh1T細胞介在症状に対してインビボで保護剤として、またはインビボで、特に、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患のRANK−L診断剤の一部として有用である。Fabフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部を含有し;F(ab’)2フラグメントは2個のFabをジスルフィド結合により結合させることにより形成されるフラグメントである。MAb19H22および他の類似する高アフィニティーのRANK−L結合抗体はFabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントの供給源を提供し、それらは、例えば、そのMAbを適当な蛋白分解酵素、パパインおよび/またはペプシンを用いて切断する、常套手段により、あるいは組換え技法により得ることができる。これらのFabおよびF(ab’)2フラグメントは、それ自体が治療薬、予防薬または診断薬として有用であり、また可変領域および本明細書に記載の組換え体またはヒト化抗体の形成に有用なCDR配列を含む配列のドナーとして有用である。
【0041】
FabおよびF(ab’)2フラグメントはコンビナトリアルファージライブラリー(例えば、Winterら、Ann.Rev.Immunol.、12:433−455(1994)を参照のこと)を介して、あるいは免疫グロブリンチェーンシャフリング(例えば、Marksら、Bio/Technology、10:779−783(1992)を参照のこと、この両方を出典明示により本明細書の一部とする)を介して構築することができ、この場合、選択された抗体(例えば、19H22)から由来のFdまたはVH免疫グロブリンが軽鎖免疫グロブリンのレパートリー、VL(またはVK)と結合し、新規なFabが形成される。反対に、選択された抗体から由来の軽鎖免疫グロブリンが重鎖免疫グロブリンのレパートリー、VH(またはFd)と結合し、新しいFabを形成することもできる。
【0042】
IV.目的とする抗−RANK−Lアミノ酸およびヌクレオチド配列
上記したMAb19H22または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴付けられる種々の改変抗体を設計および獲得するのに有用な、可変重鎖および/または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、CDR配列、機能性配列およびそのアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列などの配列を付与することができる。
一例として、本発明は、RANK−LMAb19H22からの可変軽鎖および可変重鎖配列およびそれらから由来の配列を提供する。
【0043】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする、本発明の核酸配列またはそのフラグメントはまた、特定の変化をCDRをコードする核酸配列またはフレームワーク領域内で変異誘発を導入するのに、および得られた修飾または融合核酸配列を発現プラスミドに組み込むのに有用である。
遺伝コードの縮重を鑑みれば、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびCDR配列、ならびにドナー抗体の抗原特性を共有する機能性フラグメントおよびそのアナログをコードする種々のコード化配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはCDRをコードする、本発明の単離された核酸配列またはそのフラグメントを用いて、第2免疫グロブリンパートナーと作動的に組み合わせた場合に、本発明の改変抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは他の操作された抗体を産生することができる。
【0044】
一の具体例において、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される構成員と、少なくとも90%同一の、より好ましくは95%同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。さらにもう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号:2、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも90%同一の、より好ましくは95%同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【0045】
本発明は、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体に関する。配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0046】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
本発明はまた、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【0047】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞もまた含まれる。さらに、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系もまた包含される。さらに、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0048】
本発明はまた、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0049】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0050】
本明細書に記載の改変抗体の一部をコードする単離された核酸配列に加えて、未変性CDRコード化配列に相補的な核酸配列またはCDRコード化領域を囲む修飾ヒトフレームワーク領域に相補的な核酸配列などの、他の核酸配列も本発明に包含される。有用なDNA配列は、そのDNA配列にとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(T.Maniatisら、Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory(1982)、387ないし389頁を参照のこと)下で、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするものを包含する。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例が、65℃で4XSSCとハイブリダイズさせ、つづいて65℃で0.1XSSC中にて1時間洗浄するものである。また、一の代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、42℃で50%ホルムアミド、4XSSCを用いるものである。これらのハイブリダイズに付すDNA配列は長さが少なくとも約18個のヌクレオチド、すなわち、略CDRの大きさであることが好ましい。
【0051】
V.改変された免疫イムノグロブリン分子および改変抗体
改変された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの操作された抗体を含む、改変抗体をコードすることができる。望ましい改変された免疫グロブリンコード化領域は、RANK−L抗体、好ましくは本発明により提供されるような第1免疫グロブリンパートナー(ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域)に挿入された高アフィニティー抗体、の抗原特異性を有するポリペプチドをコードするCDRコード化領域を含有する。
第1免疫グロブリンパートナーは第2免疫グロブリンパートナーと作動的に連結していることが好ましい。第2免疫グロブリンパートナーは上記に定義したとおりであり、目的とする第2抗体領域、例えばFc領域をコードする配列を含んでいてもよい。第2免疫グロブリンパートナーはまた、軽鎖または重鎖の定常領域がフレームにてまたはリンカー配列により融合する別の免疫グロブリンをコードする配列を含んでいてもよい。RANK−Lの機能性フラグメントまたはアナログに拮抗するように指令された操作された抗体は同じ抗体との結合の強化を惹起するように設計することができる。
【0052】
第2免疫グロブリンパートナーはまた、その第2免疫グロブリンパートナーが常套手段により作動的に連結することができる、非蛋白キャリア分子を含む、上記したエフェクター剤と結合してもよい。
第2免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間の融合または連結は、適当な手段のよるもの、例えば慣用的な共有またはイオン結合、蛋白融合または異種二機能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技法は当該分野にて知られており、一般的な化学および生化学のテキストに広く記載されている。
【0053】
加えて、第2免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に望ましい大きさの空間を簡単に付与する従来のリンカー配列もまた、改変された免疫グロブリンをコードする領域中に構築させてもよい。かかるリンカーの設計は当該分野にて周知である。
加えて、本発明の分子のシグナル配列を修飾して発現を強化することもできる。
代表的な改変抗体は、MAb19H22の抗原特異性を有する可変重鎖および/または軽鎖のペプチドまたは蛋白配列、例えば、VHおよびVL鎖を含有する。本発明のさらに別の望ましい改変抗体は、アミノ酸配列がマウス抗体分子19H22の重鎖および/または軽鎖の可変領域の少なくとも1個の、好ましくはすべてのCDRを含有し、残りの配列がヒト供給源から由来するか、またはその機能性フラグメントまたはアナログであることにより特徴付けられる。
【0054】
さらなる態様において、本発明の操作された抗体は付加的な物質が結合していてもよい。例えば、組換えDNA技法の操作を用いて、完全な抗体分子のFcフラグメントまたはCH2CH3ドメインが酵素または他の検出可能な分子(すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子)で置き換えられている、本発明の操作された抗体を産生してもよい。
第2免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、マウス19H22の抗原特異性を有するCDR−含有配列と異種構造の非免疫グロブリンのペプチド、蛋白またはそのフラグメントと作動的に連結していてもよい。得られた蛋白は抗−RANJ−L抗原特異性および非免疫グロブリンの発現に関する特性の両方を示すかもしれない。融合パートナーそれ自体が治療蛋白であるか、または付加的な抗原特性を有するならば、その融合パートナー特性は、例えば、別の結合または受容体ドメインまたは治療特性などの機能的特性であってもよい。
【0055】
本発明のもう一つ別の望ましい蛋白は、全長の重鎖および軽鎖、またはFabまたはF(ab’)2フラグメントなどのその別個のフラグメント、重鎖ダイマー、またはFvまたは一本鎖抗体(SCA)などのその最小組換えフラグメントあるいは選択されたドナーMAb、例えばMAb19H22と同じ特異性を有する別の分子を有する、完全な抗体分子を含んでいてもよい。かかる蛋白は改変抗体の形成に用いてもよく、あるいは融合していない形態にて用いてもよい。
第2免疫グロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、イソ型またはイソ種の免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域から誘導される場合は必ず、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、一の供給源、例えば、アクセプター抗体からの免疫グロブリン(Ig)の定常領域と、可変フレームワーク領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書に記載の抗−RANK−L抗体から由来の1またはそれ以上の(好ましくはすべての)CDRを含むことができる。加えて、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために、核酸またはアミノ酸レベルでアクセプターMAb軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域を、またはドナーCDR領域を、改変、例えば、欠失、置換または付加に付すこともできる。
【0056】
かかる操作された抗体は、RANK−LMAb(所望により、上記したように修飾されていてもよい)の1の(または両方の)可変重鎖および/または軽鎖あるいは1またはそれ以上の下記の重鎖または軽鎖CDRを用いて設計される。操作された抗体が中和抗体であると、すわなち、それらは望ましくはRANK−L蛋白の受容体との結合を遮断し、RANK−L依存性細胞の増殖を遮断または防止すると考えられる。
かかる操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域またはサブタイプを含有するヒト化抗体、あるいはRANK−L抗体機能性フラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含有するキメラ抗体を包含する。適当なヒト(または他の動物)アクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、通常のデータベース、例えば、KABAT(登録商標)データーベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性(アミノ酸を基礎として)により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRを挿入するための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖定常または可変フレームワーク領域の付与能を有する適当なアクセプター抗体は同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体を起源とする必要はない。
【0057】
異種構造のフレームワークおよび定常領域は、IgG(サブタイプ1ないし4)、IgM、IgAおよびIgEなどのヒト免疫グロブリン種およびイソ型から選択されることが望ましい。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブリン蛋白配列だけを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするDNA配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子などの免疫グロブリンでないアミノ酸配列に融合されるところの、遺伝子を構築することもできる。
特に望ましい一例としてのヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域に挿入された19H22のCDRを含有するであろう。中和ヒト化抗体の場合、RANK−L抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域からの1、2または好ましくは3個のCDRを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入し、その後者の抗体の未変性CDRと置き換える。
【0058】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインが1またはそれ以上のCDR置換により操作されている。6個すべてのCDRまたは6個よりも少ないCDRを種々組み合わせて用いることが可能である。好ましくは6個すべてのCDRを置き換える。軽鎖としてヒトアクセプター抗体からの非修飾軽鎖を用い、ヒト重鎖におけるCDRだけを置き換えることも可能である。さらに別法として、一般的な抗体データベースに基づいて別のヒト抗体から適合可能な軽鎖を選択することもできる。残りの操作された抗体は適当なアクセプターヒト免疫グロブリンから誘導することができる。
かくして、操作されたヒト化抗体は、天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、有効な治療に用いるのに必要な、例えばヒトにおけるRANK−L介在炎症性疾患の治療にまたは診断薬として使用するのに必要な特性を組み合わせて有することが好ましい。
【0059】
ドナー抗体の特異性および高アフィニティーに必ずしも影響を与えることなく、可変ドメインアミノ酸にて変形することにより改変抗体をさらに修飾できること(すなわち、アナログ)は当業者であれば理解できるであろう。重鎖および軽鎖アミノ酸は可変ドメインフレームワークまたはCDRあるいはその両方で他のアミノ酸で置換することができる。
加えて、定常領域を改変し、本発明の分子の選択特性、例えば、二量化、Fc受容体との結合または補体を結合させ、活性化する能力を亢進または減少させることもできる(例えば、Angalら、Mol.Immunol. 30:105−108(1993);Xuら、J.Biol.Chem. 269:3469−3474(1994);Winterら、EP 307434−Bを参照のこと)。
キメラ抗体である改変抗体は、フレームワーク領域を含め、両鎖のためのヒト免疫グロブリン定常領域と一緒になって、完全なヒト以外の生物のドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を提供することで、上記したヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に関連する付加的なヒト以外の生物の配列を保持するキメラ抗体はヒトにおいて有意な免疫応答を惹起することができると考えられる。
【0060】
かくして、一の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される構成員と、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%同一の、1またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。もう一つ別の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号:2、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%同一の、1またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。
かかる抗体は、上記したような、RANK−L介在障害の予防または知慮に有用とすることができる。
【0061】
VI.改変抗体の産生および改変抗体
好ましくは、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築においては、MAb19H22または他の適当なドナーMAbの可変軽鎖および/または重鎖配列およびCDR、ならびにそのコード化核酸配列を以下の方法にて利用する。また、同じまたは類似する方法を用いて本発明の他の具体例を形成することもできる。
一般には、選択されたドナーMAb、例えばマウス抗体19H22を産生するハイブリドーマをクローン処理に付し、当業者に公知の方法、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory(1989))に記載の方法により重鎖および軽鎖の可変領域のDNAを得る。少なくともCDRコード化領域、およびドナーMAb結合特異性を保持するために必要なアクセプターMAb軽鎖および/または重鎖の可変ドメインフレームワーク領域の部分、ならびにヒト免疫グロブリンから由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分を含有する19H22の可変重鎖および軽鎖領域は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得ることができる。CDRのコード化領域を既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することにより同定する。
【0062】
ついで、マウス/ヒトのキメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイしてもよい。かかるキメラ抗体は、両方の鎖のためのヒトIg定常領域と一緒に、完全なヒト以外の生物のドナー抗体VHおよびVL領域を含有する。
ヒト化抗体はキメラ抗体から誘導してもよく、あるいは重鎖および軽鎖からのドナーMAbCDRコード化領域を選択された重鎖および軽鎖フレームワークに挿入することにより合成して製造することが好ましい。別法として、本発明のヒト化抗体は標準的な変異誘発技法を用いて調製することもできる。かくして、得られたヒト化抗体はヒトフレームワーク領域およびドナーMAbCDR−コード化領域を含有する。その後でフレームワークの残りを操作してもよい。得られたヒト化抗体を組換え宿主細胞、例えば、COS、CHOまたは骨髄腫細胞中で発現させることができる。他の適当なRANK−L特異的であり、中和作用を示す、高アフィニティーのヒト以外の生物の抗体にこの技法を用い、他のヒト化抗体を調製してもよい。
【0063】
通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、改変抗体についてのこれらのコード化配列を、宿主細胞での複製および発現を、および/またはその細胞からの分泌を調節する能力を有する通常の調節制御配列と作動的に共同して置くことにより産生することができる。調節配列はプロモーター配列、例えば、CMVプロモーターおよびシグナル配列を包含し、それらは他の既知の抗体から誘導することができる。同様に、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2発現ベクターを産生することもできる。好ましくは、この第2発現ベクターは、ポリペプチド鎖が、各々、できる限り多く機能的に発現するように、そのコード化配列および選択可能なマーカーが関連付けられる範囲では、第1のものと同じである。また、改変抗体の重鎖および軽鎖のコード化配列が単一のベクター上に存在していてもよい。
【0064】
選択された宿主細胞を慣用的技法により第1および第2の両方のベクターを用いて共同してトランスフェクトし(あるいは単一のベクターで簡単にトランスフェクトし)、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含むトランスフェクトされた本発明の宿主細胞を創製する。ついで、そのトランスフェクトされた細胞を慣用的技法により培養し、本発明の操作された抗体を産生する。組換え重鎖および/または軽鎖の両方を含むヒト化抗体をELISAまたはRIAなどの適当なアッセイにより培養物からのスクリーニングに付す。類似する慣用的な技法を用いて本発明の他の改変抗体または分子を構築することもできる。
本発明の方法および組成物の構築に利用されるクローニングおよびサブクローニング工程に適するベクターは当業者により選択される。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される一のベクターはpUC19であり、そのベクターは、Amersham(Buckinghamshire、英国)またはPharmacia(Uppsala、スウェーデン)などの会社から商業的に入手可能である。加えて、容易に複製することができ、一の存在量のクローニング部位および選択可能な遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、そして操作が簡単なベクターはいずれもクローニングに用いることができる。
【0065】
同様に、本発明に係る操作された抗体の発現のために利用されるベクターは、当業者によって一般的なベクターから選択され得る。ベクターはまた、選択された宿主細胞にて異種DNA配列の複製および発現を指令する選択された調節配列(CMVプロモーターなど)を含有する。これらのベクターは操作された抗体または改変された免疫グロブリンのコード化領域をコードする上記されたDNA配列を含有する。加えて、ベクターは、操作を容易にするために望ましい制限部位を挿入することによって修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込むこともできる。
発現ベクターはまた、異種DNA配列の発現を増幅するのに適する遺伝子、例えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)により特徴付けることもできる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン(BGH)およびベータグロビンプロモーター配列(ベータグロプロ)からなどの、ポリAシグナル配列を包含する。本明細書にて有用な発現ベクターは当業者に周知の技法を用いて合成することができる。
【0066】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等は、市販のまたは天然の供給源から得てもよく、あるいは選択された宿主にて組換えDNAの産物を発現および/または分泌するのに関連して使用される既知の操作により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現について当該分野にて公知である多種の他の適当な発現ベクターをこの目的のために選択することもできる。
本発明はまた、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコード化配列を含有する組換えプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞系を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた一般的なものである。しかしながら、イー・コリの種々の菌株から由来の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の工程に使用するのが最も望ましい。
【0067】
本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適する宿主細胞または細胞系は、CHO、COS、繊維芽細胞(例えば、3T3)および脊髄細胞などの哺乳動物細胞が好ましく、CHOまたは脊髄細胞がより好ましい。ヒト細胞を用いて、その分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することもできる。別法として、他の真核細胞系を利用することもできる。適当な哺乳動物の宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の産生および精製の方法の選択は当該分野にて知られている。例えば、Sambrookら、前掲を参照のこと。
【0068】
細菌細胞が宿主細胞として本発明の組換えFabの発現に適することを証明することができる(例えば、Pluckthum,A.、Immunol.Rev.、130:151−1881992)を参照のこと)。しかしながら、細菌細胞中で発現される蛋白は折りたたまれていないか不当に折りたたまれた形態あるいはグリコシル化されていない形態であるため、細菌細胞中で産生された組換えFabは抗原結合能の保持についてスクリーニングする必要がある。細菌細胞により発現された分子がうまく折りたたまれた形態にて産生されたならば、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現のために使用されるイー・コリの種々の菌株は生物学の分野における宿主細胞として周知である。ビー・サチリス、ストレプトマイセス、他の細菌等の種々の菌株もまた、この方法にて利用することができる。
【0069】
望ましい場合には、当業者に公知の酵母菌の細胞、ならびに昆虫細胞、例えば、ドロソフィラおよびレピドプテラ、およびウイルス発現系を宿主細胞として利用することもできる。例えば、Millerら、Genetic Engineering、8:277−298、Plenum Press(1986)およびその中で引用されている文献を参照のこと。
本発明のベクターを構築する一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション方法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変抗体を産生するのに必要な培養方法は、そのすべてが慣用的な方法である。同様に、一旦産生されれば、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該分野の標準的操作に従って細胞培養基から精製することもできる。かかる技法は当該分野における技術の範囲内にあり、本発明を制限するものではない。
【0070】
ヒト化抗体を発現させるもう一つ別の方法は、米国特許第4873316号に記載されるように、トランスジェニック動物での発現を利用する。この方法は、トランスジェニック操作により哺乳動物に組み込まれた場合に、雌体の乳中に所望の組換え蛋白を産生させる、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
所望の方法により発現されると、次に操作された抗体を適当なアッセイを用いて試験する。現在のところ一般的なELISAアッセイフォーマットを利用して操作された抗体とRANK−Lとの定量的および定性的結合を評価する。加えて、また、通常のクリアランス機構にも拘わらずに体内で残っている操作された抗体を評価するのになされるその後のヒト臨床実験の前に、別のインビトロアッセイを用いて中和効率を検証してもよい。
【0071】
ヒト化抗体の産生について記載されている一般的操作に従って、当業者はまた、本明細書に記載の他のドナーRANK−L抗体、可変領域配列およびCDRペプチドからヒト化抗体を構築することもできる。操作された抗体は、その改変抗体の受容体により「自己」として認識される可能性のある可変領域のフレームワークを有するように産生できる。可変領域のフレームワークを少し修飾して、受容体に対する免疫原性を著しく増大させることなく、抗原結合を大きく増大させることができる。かかる操作された抗体はRANK−L介在状態についてヒトを効果的に治療することができる。かかる抗体は上記した症状の診断においても有用である。
【0072】
VII.治療的/予防的使用
また、本発明は慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患を患っているヒトを治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の1つまたはそれ以上の改変抗体または変質抗体またはそのフラグメントを含む抗体を投与することを含む方法に関する。
【0073】
本発明の分子の使用により誘発される治療的応答はヒトRANK−Lとの結合により形成され、したがって、続いて破骨細胞および樹状細胞の発達および機能を阻害する。したがって、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、限定するものではないが、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患を含む骨ホメオスタシス、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患の障害を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。また、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解もしくは変形性関節症(OA)、または乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。
【0074】
本発明の抗体およびそのフラグメントはまた、サイトカイン抑制性抗炎症薬(Cytokine Suppressive Anti−Inflammatory Drugs(CSAIDSTM)または他の抗体、特に本発明の抗体と関連する症状の原因である他のマーカー(エピトープ)と反応的なヒトMAbなどのサイトカイン阻害剤と一緒に用いることができる。
本発明の治療薬は、2日ないし6月の、あるいは必要に応じて、骨減少症または自己免疫症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症を治療する場合には、より長期の治療が望ましい。用量および治療期間は、本発明の分子がヒトの循環下にある相対的な期間と関連しており、当業者が患者の治療されるべき状態および一般的な健康に応じて調節することができる。
【0075】
本発明の治療薬の投与方法は、該薬を宿主に送達する任意の適当な経路とすることができる。本発明の抗体およびそのフラグメント、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内投与に特に有用である。
【0076】
本発明の治療薬は、活性成分として有効量の本発明の抗体(例えば、ヒト化抗体)を医薬上許容される担体中に含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の予防薬において、抗体を含有する水性懸濁液または溶液で、好ましくは生理的pHに緩衝され、すぐに注射できる形態のものが好ましい。非経口投与用組成物は、通常、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本発明の抗体またはそのカクテルの溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば、0.4%セイライン、0.3%グリシン等を用いることができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知られた滅菌技術(例えば、濾過)により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要な医薬上許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤等を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃度は広範囲に変えることができ、すなわち、約0.5重量%未満、通常約1重量%または少なくとも約1重量%から15または20重量%まで変化し、主に流体の体積、粘度等に応じて、選択される具体的な投与方法に従って選択される。
【0077】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水、および約1ngないし約100mg、例えば約50ngないし約30mgまたはより好ましくは約5mgないし約25mgの本発明の抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンゲル液、および約1mgないし約30mg、好ましくは5mgないし約25mgの本発明の抗体を含有するように調製することができる。実際の非経口投与可能な組成物の調製法は当業者に周知であるか明らかであり、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Science”、第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。
【0078】
医薬調製物である場合の、本発明の治療薬は、単位投与形であることが好ましい。治療的に有効な適当な用量は当業者が容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における炎症性障害を有効に治療するために、体重70kgあたり0.1mgないし約20mgの一回用量の本発明の蛋白または抗体を非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与する。かかる投与は、必要ならば、その疾患の間、医師により適当に選択される適当な間隔で繰り返すことができる。
本発明の抗体はまた、例えば、RANK−L介在障害を測定するための、またはかかる障害の治療の進行度を追跡するための診断用方法にて用いることもできる。診断薬としてのこれらの抗体は、一般に、ELISAにて、ならびに血清、血漿または他の適当な組織中のRANK−Lレベルを測定するための、もしくは培養基中でのヒト細胞の放出を測定するための他の慣用的アッセイフォーマットにて用いるために標識されていてもよい。抗体を使用するアッセイの特性は標準的なものであり、この開示を限定するものではない。
【0079】
かくして、本発明の一の具体例は、患者における、骨ホメオスタシスの障害または自己免疫疾患および破骨細胞またはT細胞活性の過剰または不足に付随する他の症状(例えば、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症)の診断を補助する方法であって、その患者から得られる試料(血漿または組織)中のヒトRANK−Lの量を測定し、その測定した量と正常な集団のヒトRANK−Lの平均の量とを比較し、それによれば、患者の試料中でRANK−Lが有意に高い量で存在することは骨または自己免疫疾患および破骨細胞またはT細胞の過剰な数または活性に付随する疾患を意味する、方法に関する。同様に、患者の試料中でRANK−Lが有意に低い量で存在することは破骨細胞の数または活性の不足に伴う骨疾患を意味する。
【0080】
本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントは貯蔵のために凍結乾燥させ、使用前に適当なキャリアー中で復元することができる。これらの技法は通常の免疫グロブリンで効果的であることがわかっており、当該分野にて公知の凍結乾燥法および復元法を利用することができる。
かくして、本発明は(a)ヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)モノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体;および(c)モノクローナル抗体19H22に関する。
本発明はまた、(a)ヒトRANK−Lと結合する抗体の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド;(b)モノクローナル抗体19H22の抗体特性の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド;および(c)モノクローナル抗体19H22の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチドに関する。さらに本発明は(a)、(b)および(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0081】
本発明のポリペプチドは、とりわけ、配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドを含む、免疫グロブリン相補性決定領域に関する。本発明のポリヌクレオチドは、とりわけ、配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。本発明は(a)免疫グロブリン相補性決定領域が配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドを含むところのヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)配列番号:2に示されるようなポリペプチドの重鎖可変領域および/または配列番号:4に示されるようなポリペプチドの軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体に関する。
【0082】
本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号:2および配列番号:4からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明はモノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
(a)ヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)モノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体;および(c)モノクローナル抗体19H22を含む医薬組成物も含まれる。
【0083】
本発明は、試料中のヒトRANK−Lの存在を検出する方法であって、
a)該試料をヒトRANK−Lと結合する抗体に曝し;および
b)ヒトRANK−Lと結合する抗体を検出する、ことを含む方法に関する。
抗体に曝露する前に、ヒトRANK−L蛋白が抗体による結合の影響を受けやすいように、試料が処理されている方法が好ましい。ヒトRANK−Lと結合する好ましい抗体はモノクローナル抗体19H22の識別特性を有しており、より好ましいのはモノクローナル抗体19H22そのものである。
【0084】
以下の実施例は、代表的な操作された抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を含む、本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。アミノ酸はすべて慣用的な3文字または1文字コードで同定されている。必要な制限部位、プラスミド、ならびに他の試薬および材料はすべて、特記しない限り、商業的に入手されたものである。一般的なクローニングライゲーションおよび他の組換えDNA方法は、T.Maniatisら(前掲)または同じ出版人(「Sambrook」ら)による、その第二版(1989)、Sambrookら編に記載されるように行った。
【0085】
(実施例)
実施例1−RANK−Lに対するMAbの産生
A.CB6f1マウスに可溶性ヒトRANKL蛋白を複数回投与して免疫処理することでモノクローナル抗体を産生した。免疫処理したマウスから抗血清を採取し、抗−RANKL抗体について力価測定を行った。出血免疫アッセイ試験に基づいて、反応の最も優れたマウスを脾摘出術の3日および1日前にブースター処理に付した。脾臓を摘出し、ポリエチレングリコール方法を用いてその脾臓細胞をX63AG8653骨髄腫細胞と融合させた。ついで、その融合細胞を20x96ウェルの組織培養プレートにて培養した。融合した14日後に、そのハイブリドーマをRANKL蛋白との抗体結合についてアッセイした。RANKLとの抗体結合を有するそれらのハイブリドーマをそのハイブリドーマの成長速度に合わせて段々により大きな組織培養プレートに広げた。そのハイブリドーマからの上澄を免疫アッセイにて使用し、抗体特異性およびRANKL/RANK結合を中和することにおけるその生物学的活性を確認した。活性が確認されたならば、そのハイブリドーマ細胞系を低温保存し、血清不含培地にて抗体を産生するために秤量した。
【0086】
RANKL蛋白に対する抗体を産生する際の大きな問題はハイブリドーマ培養物のアポトーシスにあった。このことは、通常、ハイブリドーマ拡張の初期の段階で起り、細胞系を完全に死滅させるか、あるいは生産体でないハイブリドーマ細胞系を産生し、これにより抗体合成のスイッチはオフとなる。この問題は、我々の行った100種以上の他の抗原を用いる観察との関連で、どちらかと言えばRANKL抗原に独特であった。この作用は、おそらく、RANKL抗体のネズミRANKLとの弱い交差反応性に由来するものである。RANKLがハイブリドーマ細胞上にあるならば、そのハイブリドーマ培養基にある相対的に高い濃度のRANKL抗体はRANKLと結合し、アポトーシスの誘発をもたらしうる。ハイブリドーマ成長因子を添加してその成長を刺激し、アポトーシスの作用をオフセットしようとする試みがなされたが、大部分のハイブリドーマ細胞系で効果がないことが実証された。この問題の結果は、細胞系の死滅か、IgG合成のシャットダウンのいずれかであり、ハイブリドーマの90%より多くがその融合体から失われた。ある融合体では、この方法ですべてのハイブリドーマが喪失した。
この作用を根絶するために、多数のマウスを免疫処理し、その脾臓を連続的に使用し、生物学的アッセイにおける評価のための抗−RANKL抗体を分泌する一連の安定したハイブリドーマを産生した。
【0087】
B.19H22MAbの精製および配列決定
製造業者の指示に従ってProsepA(Bio Processing、Consett、UK)クロマトグラフィーにより19H22MAbを精製した。SDS−PAGEによればそのMAbは>95%純度であった。N−末端配列を分析するために、重鎖および軽鎖のポリペプチドをSDS−PAGEにより分離し、PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)膜に移し、直接配列決定した(P.Matsudaira、J.Biol.Chem. 262:10035−10038、1987)。
C.MAbのイソ型化
ネズミRANKL MAb19H22を市販のキット(Zymed、Amerscham)でイソ型化し、IgG2b/カッパであることが判明した。
【0088】
実施例2−アッセイ
A.競合ELISAを、溶液での検出のため、プラスチック上にコートしたヒトRANK−Fc融合蛋白およびビオチニル化可溶性ヒトRANKL蛋白を用いて確立した。RANK−FcおよびRANKL蛋白を、各々、CHO細胞およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)中で産生し、>90%の均一性に精製した。shRANKL(可溶性、ヒトRANKL)蛋白を、製造業者の説明に従って、NHS−ビオチンと蛋白(Pierce、Rockford、IL)のモル比を20:1でビオチニル化した。96−ウェルELISAプレートを、pH9.6のカルボネート−ビカルボネート緩衝液中、4℃で一晩、50ng/ウェル(0.53nmol)のRANK−Fcでコートした。プレートを0.1%のトウィーン20を含有するpH7.4のトリス−生理食塩水緩衝液で洗浄し、1%のBSA/PBS中で室温で2時間遮断した。競合蛋白(RANK−Fc;死滅受容体5(DR5)−Fc;OPG−Fc;RANKL MAb 19H22)を0.01%のトウィーン20/PBSで希釈し、ビオチニル化shRANKL(0.43nM)を添加する前にウェルに加え、組合わせた試料を室温で2時間インキュベートした。コートしたRANK−Fc(+/−競合物)に結合したビオチニル化shRANKLの量を、アルカリホスファターゼ複合ストレプタビジンを用いて測定した。シグナル検出に関する基質は105PNPP(Pierce Inc., Rockford, IL)であり、Spectra Max 340プレートリーダーを用いて405nmで吸光度を測定した。DR5−Fc蛋白は、RANKLと相互作用しないことを示している種々の他の研究から考えられる阻害を示さなかった。いくらかの並行したアッセイにおいて、OPG−FcはRANK−Fcよりも強力な阻害剤であり、各々、約0.5および6nMのIC50を有している。19H22 MAbは約2nMのIC50を有するOPG−Fcにより類似した効力を示した。
【0089】
B.培養物中のヒト単球由来の樹状細胞の成熟の阻害。勾配単離により精製された新鮮なヒト単球を組換えヒトIL−4(25ng/ml)およびヒトGM−CSF(50ng/ml)と培養物中で6日間処理し、抗原捕獲表現型の樹状細胞(未成熟DC)を産生した。培地を6日目に、TNF−アルファアンタゴニストTNFRII−Fc(30μg/ml)またはRANKL MAb 19H22(30μg/ml)の存在または不存在下、組換えヒトTNF−アルファ(30ng/ml)または可溶性RANKL(30ng/ml)のいずれかを添加することにより培養物を変化させた。TNF−アルファまたはRANKLは、単独で、表現型、形態学および機能的特性により測定されるような、成熟DCの形成を誘発した。したがって、細胞は細胞表面CD83、CD86、CD80およびMHCIIのアップレギュレーションを示し、CD1aのダウンレギュレーションを示した。未成熟細胞は、マクロ飲作用を示す、FITC−デキストランの著しい接取を示すのに対して、成熟細胞は、実質的には、この能力を喪失していた。TNF−アルファは、成熟を誘発することにおいてRANKLよりもより効果的であり、本質的に、成熟DCの同種の集合体を生じる。対照的に、RANKLでの処理は、類似の表現型の細胞の集合体を産生するが、細胞の1つのフラクション(異なるドナーから得られた単球での異なる実験において30ないし80%)だけが、RANKLで処理した細胞においてこの表現型を示した。RANKL MAb 19H22はsRANKLで処理した細胞の成熟を遮断するが、TNF−アルファで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。同様に、TNFRI−FcはTNF−アルファで処理した細胞の成熟を遮断するが、sRANKLで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。したがって、RANKL MAb 19H22はDC成熟のRANKL誘発の機能的活性を特異的に阻害するものである。
【0090】
C.細胞培養物中のヒトsRANKL刺激骨髄ネズミ破骨細胞形成の阻害。骨髄細胞を生後6週のBalb/Cマウスの大腿骨から集め、3回洗浄し、計数し、ついで培地(10%のFCSを捕捉したRPMI、グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび25ng/mlのCSF−1、50ng/mlの可溶性RANKL)に再懸濁させた。これらの細胞を、Nunc24−ウェルマルチウェルプレート(4通り)中、5×105/ウェルでプレートし、7ないし10日間、培養(37℃、5%のCO2)した。試験物質(例えば、抗体、OPG−Fc)を培養の開始時に添加した。培地および試験物質を3ないし4日毎に交換した。培養期間の最後に、細胞を固定し、Sigmaキット386−1を用いて、製造業者の説明に従って、酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)に対して染色した。各々のウェル中の破骨細胞(3個以上の核を有するTRAP陽性細胞として定義する)の数を顕微鏡で数えた。RANKL MAb19H22およびOPG−Fcは両方とも、ウェル当たりに発達した破骨細胞の数により測定する場合、1μg/mlの濃度で完全に破骨細胞形成を阻害し、両方ともこのアッセイにおいて約200ng/mlのIC50を示した。対照的に、RANK−Fc融合蛋白は、10μg/mlで完全に阻害されたが、2μg/mlでは効果なしであった。
【0091】
D.RANKLにより介されるヒト単球破骨細胞形成の阻害。ヒト単球を上記セクションBの樹状細胞成熟に関して記載したように調製した。これらの細胞を6ないし8日間、25ng/mlのヒトM−CSFを捕捉した50ng/mlのヒト可溶性RANKLの存在下で培養し、骨吸収活性を有する破骨細胞を形成させた。阻害実験に関しては、RANKL MAb 19H22またはRANK−Fc蛋白を培養開始時に加え、破骨細胞の形成を多核細胞の形成によりモニターした。一のアッセイにおいて、ネズミ破骨細胞形成アッセイ(上記パートC)における観察とは対照的に、RANK−Fc蛋白は約500ng/mlのIC50でさらに活性であったのに対して、19H22 MAbは約4μg/mlのIC50を与えた。
要約すれば、これらの結果はRANKL MAb 19H22はヒトRANKLとその受容体RANKの間の相互作用の強力な阻害剤である。この阻害はRANKL介在DC成熟ならびに破骨細胞発達および機能の拮抗効果を導く。
【0092】
実施例3−CDR配列
遺伝子クローニングおよび配列分析:
可変重鎖および軽鎖遺伝子を、以下に簡単に記載する標準的な分子生物学的方法を用いてハイブリドーマ細胞からクローニングした。すべてのRNAをTRIzol試薬(Life Technologies Cat. # 15596−026)を用い、製造業者の指示に従って、ハイブリドーマ細胞から単離した。RNAをプライミング用のポリdTオリゴヌクレオチドを用いて、製造業者の説明(Boehringer Mannheim Cat. No. 1483−188)に従って、RT−PCRキットを用いて逆転写した。第1のストランドcDNA合成に続いて、重鎖および軽鎖V領域を3’不変領域特異的プライマーおよび縮重5’プライマーを用いてPCR増幅した。縮重5’プライマー配列は、可変重鎖または軽鎖領域の前もって測定されたN末端アミノ酸配列をコードするように設計された。多数のクローン由来の全長配列を、各々のPCR増幅物から得、一列に並べてコンセンサスを得た。したがって、重鎖および軽鎖両方に関するDNA配列の最初の17個の塩基は、生成されたPCRプライマーであるが、翻訳された蛋白の配列は天然のものである。
(技術分野)
本発明は、一般に、RANKリガンドにより介在される症状の治療および診断に有用な抗体に、さらに詳細には、MAb、改変、Fab、キメラおよびヒト化抗体に関する。
【0002】
(従来技術)
RANK−Lは腫瘍壊死スーパーファミリーの一の構成員である。
ヒトRANKリガンド(RANK−L)は、免疫系、骨の発育およびホメオスタシスの重要な調節物質であることが知られている腫瘍壊死因子ファミリーの蛋白の一の構成員である(Andersonら、Nature 390:175−179、1997)。このリガンドはまた、腫瘍壊死因子関連の活性化誘発のサイトカイン(TRANCE)(Wongら、J.Exp.Med. 186:2075、1997)、オステオプロテゲリンリガンド(OPGL)(Laceyら、Cell 93:165、1998)および破骨細胞分化因子(ODF)(Yasudaら、Proc.Natl.Acad.Sci. 95:3597、1998)と称される。腫瘍壊死因子ファミリーの構成員は、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化などの多様な、時に正反対の生物学的応答を媒介する。今日まで記載されているTNFファミリーのリガンドのさらなる構成員として、4−1BBL、APRIL、CD40L、CD30L、CD27L、FasL、LIGHT、LT−アルファ、LT−ベータ、OX40L、TNF−アルファ、TRAIL、RANK−LおよびTWEAKが挙げられる(Wongら、J.Leukocyte Biol.:65 715、1999およびKwonら、Curr Opin Immunol 11:340、1999を参照のこと)。これらの他のリガンドのうち、RANKLは、CD40Lと最大の相同性を共有する(細胞外領域にて約28%の同一性を有する)。
【0003】
TNFリガンドファミリーの他の構成員と同様に、RANK−Lは、ショート細胞質テイルと、RANK−L受容体、すなわちRANKのための結合部位を含む、細胞外TNF核ドメインとを有するII型膜蛋白として発現される。その受容体結合ドメインは蛋白分解的に切断され、一定の距離にある受容体の機能を刺激することが可能な、可溶性RANKLを放出することができる。この切断はメタロプロテアーゼの阻害剤により遮断され、精製されたTNFアルファ変換酵素(TACE)が切断を誘発することができる。このことはこのプロセシングがTACEにより、あるいは類似する酵素により媒介されることを示唆する(Lumら、J.Biol.Chem. 274:13613、1999)。RANK−Lは活性化されたT−細胞、活性化された骨芽細胞および骨髄間質細胞上で発現され、免疫系生態学と骨生態学とを関連付ける。生化学的な証拠はRANK−Lがグリコシル化されていることを示している。細胞質テイルはSH3ドメイン含有蛋白のためのドッキング部位として働きうるモチーフを有し、したがって受容体との結合の際に逆シグナル化を媒介する可能性がある。
【0004】
RANK−Lの受容体
RANK−Lについての2つの受容体、RANKおよびOPGが同定された。RANKはCD40と最も関連しているTNF受容体ファミリーの構成員である(Andersonら、Nature 390:175、1997)。RANKは、184個のアミノ酸の細胞外ドメイン、貫膜ドメインおよび383個のアミノ酸のラージ細胞質ドメインを有する616個のアミノ酸のI型膜受容体である。mRNAとして広範囲にわたって発現するが、RANK蛋白の細胞表面での発現は脾臓、リンパ節および骨髄由来の樹状細胞および破骨細胞先祖細胞に限定されるようである(Wongら、J.Exp.Med., 186:2075、1997;Andersonら、Nature 390:175、1997;laceyら、Cell 93:165、1998)。TNF受容体ファミリーの多くの構成員と同様に、RANKの細胞質ドメインはTNF−受容体関連因子(TRAF)として知られているアダプター分子との相互作用を介してシグナル変換を媒介していると考えられる。TRAFは、順次、NF−kBおよびミトゲン−誘発の蛋白キナーゼ(MAPK)、例えば、c−Junアミノ末端蛋白キナーゼ(JNK)および細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)などのいくつかの異なる経路を活性化する。これらの異なるシグナル変換経路は、多方面にわたり、細胞生存シグナル、アポトーシス、分化、サイトカイン分泌および/または細胞活性化を媒介している。したがって、RANK−LとRANKの相互作用は、免疫機能および骨ホメオスタシスの制御において一の重要な役割を果たしている可能性がある。生化学的および遺伝学な遺伝子ノックアウトの研究により、TRAF−6ならびにTRAF−2およびTRAF−5もまた、RANKの細胞質領域と結合するこのファミリーの主たる構成員であることがわかる。
【0005】
第2の同定されたRANK−L受容体がオステロプロテゲリン(OPG)であり、それは貫膜領域を欠き、RANK−Lとその同族細胞表面受容体RANKの間のシグナル化を遮断するように作用する可溶性デコイ受容体RANKとして機能するようである。OPGは骨吸収の強力な阻害剤であることが知られており、インビトロおよびインビボにてRANK−L介在破骨細胞形成を阻害することができる(Laceyら、Cell 93:165、1998;Yasudaら、PNAS 95:3597、1998;Tomoyasuら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 245:382、1998;TsudaおよびHigashio、Nippon Rinsho 56:1435、1998)。OPGはまたTNFリガンドのTRAILと結合する(Emeryら、J.Biol.Chem. 273:14363、1998)。
【0006】
樹状細胞生態学におけるRANK−Lの役割
成熟骨髄樹状細胞および脾臓樹状細胞はその細胞表面上で高レベルのRANKを発現し、このことはRANK−Lが樹状細胞生態学の制御において中心的な役割を果たしていることを示唆する(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。RANK−Lの一の主たる作用は、おそらく、十分に研究されているアポトーシスのサプレッサーである、Bcl−xLをアップレギュレートさせて、成熟樹状細胞の生存率を向上させることである(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。DC生存率の向上は、抗原/MHC複合体および共同刺激性細胞、例えば、B7−1およびB7−2の刺激表示を伸ばすことにより、順次、T細胞増殖応答の強化をもたらすことができる(Wongら、J.Exp.Med.、186:2075、1997)。RANK−Lによる樹状細胞の刺激はまた、IL−12、IL−15、IL−1およびIL−6などの数種のサイトカイン遺伝子の転写を誘発することも知られている(Wongら、J.Leukocyte Biol. 65:715、1999)。これらのサイトカインは免疫応答の強度および型を制御する。CD40Lのノックアウト実験において、RANKL−RANK経路が残りのウイルス耐性を媒介する(Bachmanら、J.Exp.Med. 189:1017−1020)。また、RANKLとRANKのノックアウトマウスはリンパ節器官形成の機能を欠いており、BおよびT細胞の初期発生にていくつかの欠損を示す(Kongら、Nature 397:315、1999;Dougallら、Genes and Development 13:2412、1999;Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97:1566、2000)。このように、RANK−Lは、免疫系の発生において、および免疫応答の特性および強度の制御において一の役割を果たしているようである。
【0007】
骨生態学におけるRANK−Lの役割
RANK−Lは破骨細胞の発生および活性化のための重要な分化因子であり、それ自体が骨ホメオスタシスおよびカルシウム代謝を維持するのに主たる役割を果たしている。RANK−Lは骨吸収性破骨細胞の脊髄前駆体からの分化を刺激することができる(Laceyら、Cell 93:165、1998;Yasudaら、PNAS 95:3597、1998)。このように、RANK−LおよびRANKのノックアウトマウスは、破骨細胞の分化機能を完全に欠くため、重度の骨石化症を有すると特徴付けられた(Kongら、Nature 397:315、1999;Dougallら、Genes and Development 13:2412、1999;Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97:1566、2000)。さらには、トランスジェニックマウスにおけるRANK−Lデコイ受容体OPGの組織的過剰発現も、可溶性RANKドメイン外蛋白の組織的投与(Fullerら、J.Exp.Med. 188:997、1998)と同様に、骨石化症を発症することが判明した(Simonetら、Cell 89:309、1997)。RANK−Lはまた破骨細胞を刺激し、成熟破骨細胞の運動性、拡張および生存率の増加をもたらす。この刺激は、破骨細胞の活性化により、順次、より効果的な骨吸収をもたらす。かくして、骨ホメオスタシスは、少なくともいくらかはRANK−LとOPGの発現の均衡に依存しているようである。したがって、骨の疾患は、RANK−Lの作用を亢進または減衰させることにより治療することができる。例えば、T細胞を活性化することでRANKLの発現がアップレギュレートされ(Josienら、J.Immunol 162:2562−2568、1999;Kongら、Nature 402:304−309、1999)、ポリクローナル活性化されたctla4ノックアウトマウスから由来のT細胞はragノックアウトマウスへの養子免疫伝達により骨喪失を誘発するが、それはOPGを投与することで阻害される(Kongら、Nature 402:304−309、1999)。また、ラットにおけるアジュバント誘発の関節炎において、OPG蛋白の投与は、炎症性反応に影響を及ぼすことなく、骨および軟骨喪失を阻害する(Kongら、Nature 402:304−309、1999)。
【0008】
要約すれば、RANKとRANK−Lのライゲーションは、骨髄における破骨細胞の分化、または骨吸収の亢進および免疫応答の強化に至る、リンパ器官における樹状細胞の生存およびサイトカインの産生をもたらす。したがって、RANK−Lは免疫系障害および骨ホメオスタシスの疾患の新規な療法を開発するための望ましい標的である。
中和RANK−L抗体はヒトにおける病理学的な骨喪失および関連する徴候を緩和するのに有用でありうる。中和RANK−L抗体はまたヒトにおける炎症および自己免疫疾患および関連する徴候を緩和するのに有用である可能性がある。かくして、当該分野において、RANK−L介在の破骨細胞の分化および活性化ならびにそのような骨疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトRANK−Lに対する中和モノクローナル抗体を創製することについて一の要求がある。さらに、当該分野において、RANK−Lの介在する免疫応答の強化ならびにそのような免疫系の疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトRANK−Lに対する中和モノクローナル抗体などの高アフィニティーRANK−Lアンタゴニストを創製することについて一の要求がある。アンタゴニストであるRANKLモノクローナル抗体は、TRAILなどの他のTNF関連のリガンドと相互作用する可能性のあるOPG蛋白よりもその作用においてより選択的であると考えられる。
【0009】
(発明の開示)
本発明は、第1の態様において、ヒトRANK−Lに特異的であり、次に記載されているように結合アフィニティーが約10−10M以下の解離定数により特徴付けられる、中和モノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル抗体の具体例がマウスモノクローナル抗体19H22である。本発明のもう一つ別の態様はMAb 19H22を産生するハイブリドーマ細胞である。本発明は、関連する態様において、本発明の齧歯動物の中和モノクローナル抗体のFc領域を欠失させることで産生されるヒトRANK−Lに特異的な中和FabフラグメントまたはそのF(ab’)2フラグメントを提供する。
【0010】
さらに別の関連する態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来の相補性決定領域(CDR)を含む、ヒトRANK−Lに特異的な改変抗体およびその抗体をコードする核酸分子を提供する。改変抗体がヒト化抗体である場合、ヒト以外の生物の免疫グロブリンからの相補性決定領域(CDR)をコードする配列を、第1免疫グロブリンパートナーの少なくとも1つの、好ましくはすべての相補性決定領域(CDR)がヒト以外の生物のモノクローナル抗体から由来のCDRによって置き換えられている、その第1免疫グロブリンパートナーに挿入する。その上、第1免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン定常鎖のすべてまたは一部を含む、第2免疫グロブリンパートナーに作動的に連結していることが好ましい。
【0011】
関連する態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来のCDRおよびかかるCDRをコードする核酸分子を提供する。
もう一つ別の態様において、ヒト重鎖および軽鎖定常領域と、ヒトRANK−Lでは約10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体から由来の重鎖および軽鎖可変領域とを含有する、キメラ抗体が提供される。
さらにもう一つ別の態様において、本発明は、1(またはそれ以上)の上記した抗体および医薬上許容される担体を含有する、医薬組成物を提供する。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、免疫系または骨の疾患、特に慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症についての、ヒトにおける過剰量のRANK−Lに付随する症状の治療方法であって、ヒトに有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【0013】
さらに別の態様において、本発明は、ヒトRANK−Lでは10−10M以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体(MAb)から由来の改変抗体(例えば、操作された抗体、CDR、FabまたはF(ab)2フラグメントまたはそのアナログ)の組換え体を産生する方法、およびその産生に有用な成分を提供する。これらの成分は、その成分をコードする単離された核酸配列、および組換えプラスミドであって、選択された制御配列の下で、その組換えプラスミドをトランスフェクトした宿主細胞(好ましくは哺乳動物細胞)にてその発現を指令する能力を有する、その核酸配列を含有する組換えプラスミドを包含する。この産生方法は、改変抗体、好ましくはヒト化抗体が該細胞にて発現されるような条件下で本発明のトランスフェクトされた宿主細胞系を培養し、その発現産物をそこから単離することを含む。
【0014】
本発明のさらにもう一つ別の態様は、ヒトにおいて、Th1T細胞の過剰な活性または破骨細胞の発生および活性化に付随する症状、特に慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症を診断する方法であって、患者から由来の生物学的流体の試料を得、RANK−L/抗体(モノクローナルまたは改変抗体)の複合体が形成されるような条件下で本発明の抗体および改変抗体をかかる試料と接触させるようにし、そのRANK−L/抗体の複合体の有無を検出することを含む方法である。
本発明の他の態様および利点を、以下の記載およびその好ましい具体例に詳述する。
【0015】
(発明を実施するための最良の形態)
表Iはマウス抗体19H22に関する軽鎖可変領域のcDNAおよび推定アミノ酸配列(各々、配列番号:1および2)を示す。囲まれている領域(表Iのボックス内)は3つのCDR(配列番号:5、6および7)およびCDRをコードする各々のポリヌクレオチド(配列番号:13、14および15)を示す。太字領域は縮重プライマー配列(配列番号:11)を示す。
【0016】
【表1】
【0017】
表IIはマウス抗体19H22の重鎖可変領域のcDNAおよび推定アミノ酸配列(各々、配列番号:3および4)を示す。囲まれている領域(表IIのボックス内)は3つのCDR(配列番号:8、9および10)およびCDRをコードする各々のポリヌクレオチド(配列番号:16、17および18)を示す。太字領域は縮重プライマー配列(配列番号:12)を示す。
【0018】
【表2】
【0019】
本発明は、その可変軽鎖および重鎖領域を表IおよびIIに示す、マウスモノクローナル抗体19H22に例示されるように、ヒトRANK−L結合特異性、中和活性およびヒトRANK−Lとの高アフィニティーにより特徴付けられる、種々の抗体、改変抗体およびそれらのフラグメントを提供する。モノクローナル抗体、19H22を従来のハイブリドーマ技法により調製し、新規な中和抗体を生成した。本発明の抗体は、RANK−L介在障害、例えば慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患の治療用の治療的組成物および医薬組成物に有用である。また、この生成物は、ヒトにおける内因性RANK−Lレベルまたは活性化細胞からのエクスビボで放出されるRANK−Lを測定すること(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))によるRANK−L介在症状の診断にも有用である。
【0020】
I.定義
「抗体」は、モノクローナル抗体、改変抗体、ヒト化抗体、操作された抗体およびキメラ抗体を包含するが、これらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは、ポリクローナル抗体と反対のものであり、慣用的なハイブリドーマ技法、ファージ表示コンビナトリアルライブラリー、免疫グロブリンチェーンシャフリングおよびヒト化技法により調製することができる、免疫グロブリンをいう。
「改変抗体」とは、改変免疫グロブリンのコード化領域によりコードされた蛋白をいい、かかる蛋白は選択された宿主細胞中で発現させることにより得ることができる。かかる改変抗体は操作された抗体(例えば、キメラまたはヒト化抗体)あるいは免疫グロブリンの定常領域、例えばFv、FabまたはF(ab)2などのすべてまたは一部を欠いている抗体フラグメントである。
「改変免疫グロブリンのコード化領域」とは、本発明の改変抗体をコードする核酸配列をいう。改変抗体がCDR−グラフトまたはヒト化抗体である場合、第1免疫グロブリンパートナーを含むヒト可変フレームワーク配列がヒト以外の生物の免疫グロブリンから由来の相補性決定領域(CDR)をコードする配列と置き換えられている。所望により、第1免疫グロブリンパートナーは第2免疫グロブリンパートナーと作動的に結合していてもよい。
【0021】
「第1免疫グロブリンパートナー」とは、未変性(または天然に存在する)CDR−コード化領域がドナー抗体のCDR−コード化領域により置き換えられているところの、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリンの可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(または両鎖)、そのアナログあるいは機能的フラグメントとすることができる。抗体(免疫グロブリン)の可変領域内にあるかかるCDR領域は、当該分野にて既知の方法により決定することができる。例えば、Kabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest、第4版、U.S.Department of Health and Human Services、National Institutes of Health(1987))は、CDRを位置付けるためのルールを開示している。加えて、CDR領域/構造を同定するのに有用なコンピュータープログラムも知られている。
【0022】
「中和」とは、ヒトRANK−Lとその特異的受容体との結合を妨げることにより、あるいは結合が生じたとしても、RANK−Lのその受容体を介するシグナル化を阻害することにより、RANK−L活性を阻害する抗体をいう。RANK−L中和アッセイにて測定した場合に、RANK−L活性を阻害するのにMAbが90%効果的、好ましくは95%効果的、最も好ましくは100%効果的であるならば、そのMAbは中和抗体である。
「高アフィニティー」なる語は、光バイオセンサー分析法により測定した場合に、ヒトRANK−Lと10−10M以下のKdにより特徴付けられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
「ヒトRANK−Lとの結合特異性」とは、ネズミRANK−Lまたは他のRANK−LよりもヒトRANK−Lとより高いアフィニティーを有することを意味する。
【0023】
「第2免疫グロブリンパートナー」とは、第1免疫グロブリンパートナーがフレームにて融合するか、または任意の従来のリンカー配列により融合している(すなわち、作動的に結合した)蛋白またはペプチドをコードするもう一つ別のヌクレオチド配列をいう。免疫グロブリン遺伝子であることが好ましい。第2免疫グロブリンパートナーは、目的とする同じ抗体(すなわち、相同的抗体−第1および第2改変抗体が同じ供給源から誘導されている)または付加的な抗体(すなわち、異種抗体)のその全体の定常領域をコードする核酸配列を含んでいてもよい。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(あるいは単一ペプチドの一部としての両鎖)であってもよい。第2免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリン種またはイソ型に限定されるものではない。加えて、第2免疫グロブリンパートナーは、FabまたはF(ab)2に見られるような、免疫グロブリン定常領域の一部(すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分)を含んでいてもよい。かかる第2免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、ファージ表示ライブラリーの一部として、宿主細胞の表面で曝される内在性膜蛋白をコードする配列、あるいは分析または診断検出のための蛋白、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードする配列を含んでいてもよい。
【0024】
Fv、Fc、Fd、FabまたはF(ab)2なる語は標準的な意味で用いられる(例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
本明細書中で使用される「操作された抗体」とは、一定の型の改変抗体、すなわち、選択された受容体の抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインの一部が選択されたエピトープに対して特異性を有する1またはそれ以上のドナー抗体から由来の類似する部分により置き換えられているところの、全長の合成抗体(例えば、抗体フラグメントとは反対のキメラまたはヒト化抗体)として記載する。例えば、かかる分子は非修飾軽鎖(またはキメラ軽鎖)と関連するヒト化重鎖により特徴付けられる抗体、またはその逆の抗体を包含する。操作された抗体はまた、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列を変更することで特徴付けることもできる。これらの抗体はアクセプター抗体からの1またはそれ以上のCDR(好ましくはすべてのCDR)を本明細書に記載のドナー抗体からのCDRと置き換えたものとすることができる。
【0025】
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体から由来の天然に存在する可変領域(軽鎖および重鎖)を、アクセプター抗体から由来の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含有する一の型の操作された抗体である。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の生物のドナー免疫グロブリンから由来のCDRを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導の部分が1の(またはそれ以上の)ヒト免疫グロブリンから由来している、操作された一の型の抗体をいう。加えて、フレームワーク支持残基を改変し、結合アフィニティーを保存させることもできる(例えば、Queenら、Proc.Natl Acad Sci USA、86:10029−10032(1989);Hodgsonら、Bio/Technology、9:421(1991)を参照のこと)。
【0026】
「ドナー抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンのコード化配列を提供し、ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有する改変抗体の発現が得られるように、その可変領域、CDRまたは他の機能的フラグメントあるいはそのアナログの核酸配列を第1免疫グロブリンパートナーに寄与する、抗体(モノクローナルまたは組換え抗体)をいう。本発明における使用に適する一のドナー抗体は、19H22と称される、ヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体である。抗体19H22はヒトRANK−Lと高アフィニティーを有し、ヒトRANK−L特異的(すなわち、ネズミRANK−Lを認識しない)である、イソ型IgG2b/カッパの中和抗体として定義される。この抗体は、適当なネズミIgG定常領域上に、各々、配列番号:1および2の可変軽鎖DNAおよびアミノ酸配列;および各々、配列番号:3および4の可変重鎖DNAおよびアミノ酸配列を有する。
【0027】
「アクセプター抗体」なる語は、その重鎖および/または軽鎖フレームワーク領域および/またはその重鎖および/または軽鎖定常領域をコードする核酸配列のすべて(またはいずれかの部分であるが、好ましくはすべてである)を第1免疫グロブリンパートナーに寄与する、ドナー抗体に対して異種構造を有する抗体(モノクローナルまたは組換え抗体)をいう。ヒト抗体はアクセプター抗体であることが好ましい。
【0028】
「CDR」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第4版、U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of health(1987)を参照のこと。免疫グロブリンの可変部には3つの重鎖および3つの軽鎖のCDR(またはCDR領域)がある。かくして、本明細書中で用いる「CDR」とは、3つすべての重鎖CDRまたは3つすべての軽鎖CDR(または、適当ならば、すべての重鎖およびすべての軽鎖の両方のCDR)をいう。
【0029】
CDRは抗体の抗原またはエピトープとの結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明で目的とするCDRはドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列から誘導され、そのCDRが誘導されるドナー抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能を共有するかまたは保持する、天然に存在するCDRのアナログを包含する。
抗原結合特異性または中和能を共有するとは、例えば、MAb19H22は特定レベルの抗原アフィニティーにより特徴付けることができるが、適当な構造環境下で19H22の核酸配列によりコードされるCDRはより低いまたはより高いアフィニティーを有するかもしれないことを意味する。にもかかわらず、そのような環境下で、19H22のCDRは19H22と同じエピトープを認識すると考えられる。19H22の代表的な軽鎖CDRは、配列番号:5;配列番号:6;配列番号:7を包含し、19H22の代表的な重鎖CDRとして、配列番号:8;配列番号:9;配列番号:10が挙げられる。
【0030】
「機能的フラグメント」とは、フラグメントを誘導した抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列(例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端で少し欠失した配列)である。
「アナログ」とは、少なくとも1個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列をいい、かかる修飾は化学的であってもよく、あるいは少しの(例えば、好ましくは10個以下の)アミノ酸の置換または再配列とすることができる。かかる修飾はアミノ酸配列が生物学的特性、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高アフィニティーを保持することを可能とする。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がCDR−コード化領域の範囲内であるいはその周辺で形成される場合、置換を介して(サイレント)変異を構築することができる。
【0031】
アナログはまた、対立遺伝子変形として生成することもできる。「対立遺伝子変形または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の変化である。かかる変形または修飾は遺伝的コードの縮重によるものであっても、あるいは所望の特性を得るために意図的に操作したものであってもよい。これらの変形または修飾はコードされたアミノ酸配列に変化を与えても与えなくてもどちらでもよい。
フラグメント、アナログおよび対立遺伝子変形の概念は「同一性」なる語で表すこともできる。例えば、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される配列と少なくとも90%、より好ましくは95%同一である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。
【0032】
「同一性」は、当該分野で公知であり、配列を比較することで決定されるような、2またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは2またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,Von Heinje,G.Academic Press,1987;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux, J.編,M Stockton Press,New York,1991;およびCarillo,HおよびLipman,D.、SIAM J.Applied Math., 48:1073(1988)に記載されている方法(これらに限らない)を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。2つの配列の間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(AltschulF.ら、J.Molec.Biol. 215:403−410(1990))を包含するが、これに限らない。BLAST XプログラムはNCBIおよび他の供給源(BLAST Manual,Altschulら、NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894;Altschulら、J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【0033】
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する:
1)アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48:443−453(1970)
比較マトリックス:HentikoffおよびHentikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89:10915−10919(1992)からのBLOSSUM 62
ギャップペナルティー:12
ギャップ長ペナルティー:4。
これらのパラメーターを用いて有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである(エンドギャップについてペナルティーを伴わない)。
【0034】
ポリヌクレオチドの比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する:
1)アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48:443−453(1970)
比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0
ギャップペナルティー:50
ギャップ長ペナルティー:3。
Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして利用できる。これらは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【0035】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号:1の対照となる配列と同じ、すなわち100%同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(トランジションおよびトランスバージョンを含む)または挿入からなる群より選択され、その変化は対照となるヌクレオチド配列の5’または3’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のヌクレオチドにおいて個々に、あるいは対照となる配列中の1またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。ヌクレオチドの変化した数は、配列番号:1中の全ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて、その積を配列番号:1中の全ヌクレオチド数から差し引くことにより、あるいは
nn≦xn−(xn・y)
式中、nnはヌクレオチドの変化した数であり、xnは配列番号:1中の全ヌクレオチド数であり、yは、例えば、70%ならば0.70であり、80%ならば0.80であり、85%ならば0.85であり、90%ならば0.90であり、95%ならば0.95などであり、xnとyとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをxnから差し引くことにより、決定される。配列番号:2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード化配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それゆえ、かかる変化に伴ってポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変化する。
【0036】
同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号:2の対照となる配列と同じ、すなわち、100%同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい(その場合、同一性%は100%未満である)。かかる変化は、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換(同類または非同類置換を含む)または挿入からなる群より選択され、該変化は対照となるポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のアミノ酸において個々に、あるいは対照となる配列中の1またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。所定の%同一性についてのアミノ酸の変化した数は、配列番号:2中のアミノ酸の総数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて、その積を配列番号:2中のアミノ酸の総数から差し引くことにより、あるいは
na≦xa−(xa・y)
式中、naはアミノ酸の変化した数であり、xaは配列番号:2中のアミノ酸の総数であり、yは、例えば、70%ならば0.70であり、80%ならば0.80であり、85%ならば0.85などであり、xaとyとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをxaから差し引くことにより、決定される。
【0037】
「エフェクター剤」なる語は、改変抗体および/またはドナー抗体の天然または合成軽鎖または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントが常套手段により結合しうる非蛋白キャリア分子をいう。かかる非蛋白キャリアは、診断の分野にて使用される通常のキャリア、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、例えば、BIAコア(ファルマシア)系にて用いられるような多糖類、あるいは医薬の分野にて、さらにはヒトおよび動物に安全に投与するために有用な他の非蛋白物質を包含しうる。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同位元素をキレートするためのマクロサイクリルを包含しうる。かかるエフェクター剤、例えばポリエチレングリコールはまた、改変抗体の半減期を伸ばすのに有用でありうる。
【0038】
II.高アフィニティーRANK−Lモノクローナル抗体
本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントを構築するのに用いるために、ヒト以外の種(例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯動物(例えば、ネズミおよびラット)など)を利用し、未変性ヒトRANK−Lまたはそのペプチドエピトープと一緒に表示して望ましい免疫グロブリンを生成することができる。一般的なハイブリドーマ技法を利用してヒト以外の生物のMAb RANK−Lを分泌するハイブリドーマ細胞系を生成する。ついで、かかるハイブリドーマを、実施例のセクションに記載されるように、96−ウェルプレートにコーティングしたRANK−Lを用いるか、あるいはまた、ストレプタビジンをコーティングしたプレートに結合したビオチニル化RANK−Lを用いて、結合についてスクリーニングする。
【0039】
本発明の一の具体例である高アフィニティー中和抗体が、以下の実施例により詳細に記載されている、キメラまたはヒト化抗体の形成に用いることができる、MAb19H22(その重鎖および軽鎖可変領域を表IおよびIIに示す)、マウス抗体である。19H22MAbは約Kd10−10MのヒトIL−1RANK−Lとの抗原特異性により特徴付けられる。このMAbはイソ型IgG2b/カッパであることで特徴付けられる。
本発明は19H22またはその超可変(すなわち、CDR)配列の使用に限定されるものではない。ヒトRANK−Lおよび対応する抗−RANK−LCDRとの約10−10M以下の解離定数により特徴付けられる他の適当な高アフィニティーRANK−L抗体を代わりに用いることもできる。以下の記載において、ドナー抗体が19H22として同定されている場合にはいつも、この明示は説明のためであって、単に記載を簡単にするためのものである。
【0040】
III.抗体フラグメント
また、ヒトRANK−Lに対するMAb由来のFabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントの使用を含む。これらのフラグメントはRANK−LおよびTh1T細胞介在症状に対してインビボで保護剤として、またはインビボで、特に、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患のRANK−L診断剤の一部として有用である。Fabフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部を含有し;F(ab’)2フラグメントは2個のFabをジスルフィド結合により結合させることにより形成されるフラグメントである。MAb19H22および他の類似する高アフィニティーのRANK−L結合抗体はFabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントの供給源を提供し、それらは、例えば、そのMAbを適当な蛋白分解酵素、パパインおよび/またはペプシンを用いて切断する、常套手段により、あるいは組換え技法により得ることができる。これらのFabおよびF(ab’)2フラグメントは、それ自体が治療薬、予防薬または診断薬として有用であり、また可変領域および本明細書に記載の組換え体またはヒト化抗体の形成に有用なCDR配列を含む配列のドナーとして有用である。
【0041】
FabおよびF(ab’)2フラグメントはコンビナトリアルファージライブラリー(例えば、Winterら、Ann.Rev.Immunol.、12:433−455(1994)を参照のこと)を介して、あるいは免疫グロブリンチェーンシャフリング(例えば、Marksら、Bio/Technology、10:779−783(1992)を参照のこと、この両方を出典明示により本明細書の一部とする)を介して構築することができ、この場合、選択された抗体(例えば、19H22)から由来のFdまたはVH免疫グロブリンが軽鎖免疫グロブリンのレパートリー、VL(またはVK)と結合し、新規なFabが形成される。反対に、選択された抗体から由来の軽鎖免疫グロブリンが重鎖免疫グロブリンのレパートリー、VH(またはFd)と結合し、新しいFabを形成することもできる。
【0042】
IV.目的とする抗−RANK−Lアミノ酸およびヌクレオチド配列
上記したMAb19H22または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴付けられる種々の改変抗体を設計および獲得するのに有用な、可変重鎖および/または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、CDR配列、機能性配列およびそのアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列などの配列を付与することができる。
一例として、本発明は、RANK−LMAb19H22からの可変軽鎖および可変重鎖配列およびそれらから由来の配列を提供する。
【0043】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする、本発明の核酸配列またはそのフラグメントはまた、特定の変化をCDRをコードする核酸配列またはフレームワーク領域内で変異誘発を導入するのに、および得られた修飾または融合核酸配列を発現プラスミドに組み込むのに有用である。
遺伝コードの縮重を鑑みれば、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびCDR配列、ならびにドナー抗体の抗原特性を共有する機能性フラグメントおよびそのアナログをコードする種々のコード化配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはCDRをコードする、本発明の単離された核酸配列またはそのフラグメントを用いて、第2免疫グロブリンパートナーと作動的に組み合わせた場合に、本発明の改変抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは他の操作された抗体を産生することができる。
【0044】
一の具体例において、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される構成員と、少なくとも90%同一の、より好ましくは95%同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。さらにもう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号:2、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも90%同一の、より好ましくは95%同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【0045】
本発明は、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体に関する。配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0046】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
本発明はまた、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【0047】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞もまた含まれる。さらに、配列番号:5、6および7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系もまた包含される。さらに、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0048】
本発明はまた、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号:8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0049】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【0050】
本明細書に記載の改変抗体の一部をコードする単離された核酸配列に加えて、未変性CDRコード化配列に相補的な核酸配列またはCDRコード化領域を囲む修飾ヒトフレームワーク領域に相補的な核酸配列などの、他の核酸配列も本発明に包含される。有用なDNA配列は、そのDNA配列にとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(T.Maniatisら、Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory(1982)、387ないし389頁を参照のこと)下で、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするものを包含する。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例が、65℃で4XSSCとハイブリダイズさせ、つづいて65℃で0.1XSSC中にて1時間洗浄するものである。また、一の代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、42℃で50%ホルムアミド、4XSSCを用いるものである。これらのハイブリダイズに付すDNA配列は長さが少なくとも約18個のヌクレオチド、すなわち、略CDRの大きさであることが好ましい。
【0051】
V.改変された免疫イムノグロブリン分子および改変抗体
改変された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの操作された抗体を含む、改変抗体をコードすることができる。望ましい改変された免疫グロブリンコード化領域は、RANK−L抗体、好ましくは本発明により提供されるような第1免疫グロブリンパートナー(ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域)に挿入された高アフィニティー抗体、の抗原特異性を有するポリペプチドをコードするCDRコード化領域を含有する。
第1免疫グロブリンパートナーは第2免疫グロブリンパートナーと作動的に連結していることが好ましい。第2免疫グロブリンパートナーは上記に定義したとおりであり、目的とする第2抗体領域、例えばFc領域をコードする配列を含んでいてもよい。第2免疫グロブリンパートナーはまた、軽鎖または重鎖の定常領域がフレームにてまたはリンカー配列により融合する別の免疫グロブリンをコードする配列を含んでいてもよい。RANK−Lの機能性フラグメントまたはアナログに拮抗するように指令された操作された抗体は同じ抗体との結合の強化を惹起するように設計することができる。
【0052】
第2免疫グロブリンパートナーはまた、その第2免疫グロブリンパートナーが常套手段により作動的に連結することができる、非蛋白キャリア分子を含む、上記したエフェクター剤と結合してもよい。
第2免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間の融合または連結は、適当な手段のよるもの、例えば慣用的な共有またはイオン結合、蛋白融合または異種二機能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技法は当該分野にて知られており、一般的な化学および生化学のテキストに広く記載されている。
【0053】
加えて、第2免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に望ましい大きさの空間を簡単に付与する従来のリンカー配列もまた、改変された免疫グロブリンをコードする領域中に構築させてもよい。かかるリンカーの設計は当該分野にて周知である。
加えて、本発明の分子のシグナル配列を修飾して発現を強化することもできる。
代表的な改変抗体は、MAb19H22の抗原特異性を有する可変重鎖および/または軽鎖のペプチドまたは蛋白配列、例えば、VHおよびVL鎖を含有する。本発明のさらに別の望ましい改変抗体は、アミノ酸配列がマウス抗体分子19H22の重鎖および/または軽鎖の可変領域の少なくとも1個の、好ましくはすべてのCDRを含有し、残りの配列がヒト供給源から由来するか、またはその機能性フラグメントまたはアナログであることにより特徴付けられる。
【0054】
さらなる態様において、本発明の操作された抗体は付加的な物質が結合していてもよい。例えば、組換えDNA技法の操作を用いて、完全な抗体分子のFcフラグメントまたはCH2CH3ドメインが酵素または他の検出可能な分子(すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子)で置き換えられている、本発明の操作された抗体を産生してもよい。
第2免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、マウス19H22の抗原特異性を有するCDR−含有配列と異種構造の非免疫グロブリンのペプチド、蛋白またはそのフラグメントと作動的に連結していてもよい。得られた蛋白は抗−RANJ−L抗原特異性および非免疫グロブリンの発現に関する特性の両方を示すかもしれない。融合パートナーそれ自体が治療蛋白であるか、または付加的な抗原特性を有するならば、その融合パートナー特性は、例えば、別の結合または受容体ドメインまたは治療特性などの機能的特性であってもよい。
【0055】
本発明のもう一つ別の望ましい蛋白は、全長の重鎖および軽鎖、またはFabまたはF(ab’)2フラグメントなどのその別個のフラグメント、重鎖ダイマー、またはFvまたは一本鎖抗体(SCA)などのその最小組換えフラグメントあるいは選択されたドナーMAb、例えばMAb19H22と同じ特異性を有する別の分子を有する、完全な抗体分子を含んでいてもよい。かかる蛋白は改変抗体の形成に用いてもよく、あるいは融合していない形態にて用いてもよい。
第2免疫グロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、イソ型またはイソ種の免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域から誘導される場合は必ず、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、一の供給源、例えば、アクセプター抗体からの免疫グロブリン(Ig)の定常領域と、可変フレームワーク領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書に記載の抗−RANK−L抗体から由来の1またはそれ以上の(好ましくはすべての)CDRを含むことができる。加えて、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために、核酸またはアミノ酸レベルでアクセプターMAb軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域を、またはドナーCDR領域を、改変、例えば、欠失、置換または付加に付すこともできる。
【0056】
かかる操作された抗体は、RANK−LMAb(所望により、上記したように修飾されていてもよい)の1の(または両方の)可変重鎖および/または軽鎖あるいは1またはそれ以上の下記の重鎖または軽鎖CDRを用いて設計される。操作された抗体が中和抗体であると、すわなち、それらは望ましくはRANK−L蛋白の受容体との結合を遮断し、RANK−L依存性細胞の増殖を遮断または防止すると考えられる。
かかる操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域またはサブタイプを含有するヒト化抗体、あるいはRANK−L抗体機能性フラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含有するキメラ抗体を包含する。適当なヒト(または他の動物)アクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、通常のデータベース、例えば、KABAT(登録商標)データーベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性(アミノ酸を基礎として)により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRを挿入するための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖定常または可変フレームワーク領域の付与能を有する適当なアクセプター抗体は同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体を起源とする必要はない。
【0057】
異種構造のフレームワークおよび定常領域は、IgG(サブタイプ1ないし4)、IgM、IgAおよびIgEなどのヒト免疫グロブリン種およびイソ型から選択されることが望ましい。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブリン蛋白配列だけを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするDNA配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子などの免疫グロブリンでないアミノ酸配列に融合されるところの、遺伝子を構築することもできる。
特に望ましい一例としてのヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域に挿入された19H22のCDRを含有するであろう。中和ヒト化抗体の場合、RANK−L抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域からの1、2または好ましくは3個のCDRを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入し、その後者の抗体の未変性CDRと置き換える。
【0058】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインが1またはそれ以上のCDR置換により操作されている。6個すべてのCDRまたは6個よりも少ないCDRを種々組み合わせて用いることが可能である。好ましくは6個すべてのCDRを置き換える。軽鎖としてヒトアクセプター抗体からの非修飾軽鎖を用い、ヒト重鎖におけるCDRだけを置き換えることも可能である。さらに別法として、一般的な抗体データベースに基づいて別のヒト抗体から適合可能な軽鎖を選択することもできる。残りの操作された抗体は適当なアクセプターヒト免疫グロブリンから誘導することができる。
かくして、操作されたヒト化抗体は、天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、有効な治療に用いるのに必要な、例えばヒトにおけるRANK−L介在炎症性疾患の治療にまたは診断薬として使用するのに必要な特性を組み合わせて有することが好ましい。
【0059】
ドナー抗体の特異性および高アフィニティーに必ずしも影響を与えることなく、可変ドメインアミノ酸にて変形することにより改変抗体をさらに修飾できること(すなわち、アナログ)は当業者であれば理解できるであろう。重鎖および軽鎖アミノ酸は可変ドメインフレームワークまたはCDRあるいはその両方で他のアミノ酸で置換することができる。
加えて、定常領域を改変し、本発明の分子の選択特性、例えば、二量化、Fc受容体との結合または補体を結合させ、活性化する能力を亢進または減少させることもできる(例えば、Angalら、Mol.Immunol. 30:105−108(1993);Xuら、J.Biol.Chem. 269:3469−3474(1994);Winterら、EP 307434−Bを参照のこと)。
キメラ抗体である改変抗体は、フレームワーク領域を含め、両鎖のためのヒト免疫グロブリン定常領域と一緒になって、完全なヒト以外の生物のドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を提供することで、上記したヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に関連する付加的なヒト以外の生物の配列を保持するキメラ抗体はヒトにおいて有意な免疫応答を惹起することができると考えられる。
【0060】
かくして、一の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17および18からなる群より選択される構成員と、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%同一の、1またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。もう一つ別の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号:2、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%同一の、1またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。
かかる抗体は、上記したような、RANK−L介在障害の予防または知慮に有用とすることができる。
【0061】
VI.改変抗体の産生および改変抗体
好ましくは、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築においては、MAb19H22または他の適当なドナーMAbの可変軽鎖および/または重鎖配列およびCDR、ならびにそのコード化核酸配列を以下の方法にて利用する。また、同じまたは類似する方法を用いて本発明の他の具体例を形成することもできる。
一般には、選択されたドナーMAb、例えばマウス抗体19H22を産生するハイブリドーマをクローン処理に付し、当業者に公知の方法、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory(1989))に記載の方法により重鎖および軽鎖の可変領域のDNAを得る。少なくともCDRコード化領域、およびドナーMAb結合特異性を保持するために必要なアクセプターMAb軽鎖および/または重鎖の可変ドメインフレームワーク領域の部分、ならびにヒト免疫グロブリンから由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分を含有する19H22の可変重鎖および軽鎖領域は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得ることができる。CDRのコード化領域を既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することにより同定する。
【0062】
ついで、マウス/ヒトのキメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイしてもよい。かかるキメラ抗体は、両方の鎖のためのヒトIg定常領域と一緒に、完全なヒト以外の生物のドナー抗体VHおよびVL領域を含有する。
ヒト化抗体はキメラ抗体から誘導してもよく、あるいは重鎖および軽鎖からのドナーMAbCDRコード化領域を選択された重鎖および軽鎖フレームワークに挿入することにより合成して製造することが好ましい。別法として、本発明のヒト化抗体は標準的な変異誘発技法を用いて調製することもできる。かくして、得られたヒト化抗体はヒトフレームワーク領域およびドナーMAbCDR−コード化領域を含有する。その後でフレームワークの残りを操作してもよい。得られたヒト化抗体を組換え宿主細胞、例えば、COS、CHOまたは骨髄腫細胞中で発現させることができる。他の適当なRANK−L特異的であり、中和作用を示す、高アフィニティーのヒト以外の生物の抗体にこの技法を用い、他のヒト化抗体を調製してもよい。
【0063】
通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、改変抗体についてのこれらのコード化配列を、宿主細胞での複製および発現を、および/またはその細胞からの分泌を調節する能力を有する通常の調節制御配列と作動的に共同して置くことにより産生することができる。調節配列はプロモーター配列、例えば、CMVプロモーターおよびシグナル配列を包含し、それらは他の既知の抗体から誘導することができる。同様に、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2発現ベクターを産生することもできる。好ましくは、この第2発現ベクターは、ポリペプチド鎖が、各々、できる限り多く機能的に発現するように、そのコード化配列および選択可能なマーカーが関連付けられる範囲では、第1のものと同じである。また、改変抗体の重鎖および軽鎖のコード化配列が単一のベクター上に存在していてもよい。
【0064】
選択された宿主細胞を慣用的技法により第1および第2の両方のベクターを用いて共同してトランスフェクトし(あるいは単一のベクターで簡単にトランスフェクトし)、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含むトランスフェクトされた本発明の宿主細胞を創製する。ついで、そのトランスフェクトされた細胞を慣用的技法により培養し、本発明の操作された抗体を産生する。組換え重鎖および/または軽鎖の両方を含むヒト化抗体をELISAまたはRIAなどの適当なアッセイにより培養物からのスクリーニングに付す。類似する慣用的な技法を用いて本発明の他の改変抗体または分子を構築することもできる。
本発明の方法および組成物の構築に利用されるクローニングおよびサブクローニング工程に適するベクターは当業者により選択される。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される一のベクターはpUC19であり、そのベクターは、Amersham(Buckinghamshire、英国)またはPharmacia(Uppsala、スウェーデン)などの会社から商業的に入手可能である。加えて、容易に複製することができ、一の存在量のクローニング部位および選択可能な遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、そして操作が簡単なベクターはいずれもクローニングに用いることができる。
【0065】
同様に、本発明に係る操作された抗体の発現のために利用されるベクターは、当業者によって一般的なベクターから選択され得る。ベクターはまた、選択された宿主細胞にて異種DNA配列の複製および発現を指令する選択された調節配列(CMVプロモーターなど)を含有する。これらのベクターは操作された抗体または改変された免疫グロブリンのコード化領域をコードする上記されたDNA配列を含有する。加えて、ベクターは、操作を容易にするために望ましい制限部位を挿入することによって修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込むこともできる。
発現ベクターはまた、異種DNA配列の発現を増幅するのに適する遺伝子、例えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)により特徴付けることもできる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン(BGH)およびベータグロビンプロモーター配列(ベータグロプロ)からなどの、ポリAシグナル配列を包含する。本明細書にて有用な発現ベクターは当業者に周知の技法を用いて合成することができる。
【0066】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等は、市販のまたは天然の供給源から得てもよく、あるいは選択された宿主にて組換えDNAの産物を発現および/または分泌するのに関連して使用される既知の操作により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現について当該分野にて公知である多種の他の適当な発現ベクターをこの目的のために選択することもできる。
本発明はまた、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコード化配列を含有する組換えプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞系を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた一般的なものである。しかしながら、イー・コリの種々の菌株から由来の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の工程に使用するのが最も望ましい。
【0067】
本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適する宿主細胞または細胞系は、CHO、COS、繊維芽細胞(例えば、3T3)および脊髄細胞などの哺乳動物細胞が好ましく、CHOまたは脊髄細胞がより好ましい。ヒト細胞を用いて、その分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することもできる。別法として、他の真核細胞系を利用することもできる。適当な哺乳動物の宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の産生および精製の方法の選択は当該分野にて知られている。例えば、Sambrookら、前掲を参照のこと。
【0068】
細菌細胞が宿主細胞として本発明の組換えFabの発現に適することを証明することができる(例えば、Pluckthum,A.、Immunol.Rev.、130:151−1881992)を参照のこと)。しかしながら、細菌細胞中で発現される蛋白は折りたたまれていないか不当に折りたたまれた形態あるいはグリコシル化されていない形態であるため、細菌細胞中で産生された組換えFabは抗原結合能の保持についてスクリーニングする必要がある。細菌細胞により発現された分子がうまく折りたたまれた形態にて産生されたならば、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現のために使用されるイー・コリの種々の菌株は生物学の分野における宿主細胞として周知である。ビー・サチリス、ストレプトマイセス、他の細菌等の種々の菌株もまた、この方法にて利用することができる。
【0069】
望ましい場合には、当業者に公知の酵母菌の細胞、ならびに昆虫細胞、例えば、ドロソフィラおよびレピドプテラ、およびウイルス発現系を宿主細胞として利用することもできる。例えば、Millerら、Genetic Engineering、8:277−298、Plenum Press(1986)およびその中で引用されている文献を参照のこと。
本発明のベクターを構築する一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション方法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変抗体を産生するのに必要な培養方法は、そのすべてが慣用的な方法である。同様に、一旦産生されれば、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該分野の標準的操作に従って細胞培養基から精製することもできる。かかる技法は当該分野における技術の範囲内にあり、本発明を制限するものではない。
【0070】
ヒト化抗体を発現させるもう一つ別の方法は、米国特許第4873316号に記載されるように、トランスジェニック動物での発現を利用する。この方法は、トランスジェニック操作により哺乳動物に組み込まれた場合に、雌体の乳中に所望の組換え蛋白を産生させる、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
所望の方法により発現されると、次に操作された抗体を適当なアッセイを用いて試験する。現在のところ一般的なELISAアッセイフォーマットを利用して操作された抗体とRANK−Lとの定量的および定性的結合を評価する。加えて、また、通常のクリアランス機構にも拘わらずに体内で残っている操作された抗体を評価するのになされるその後のヒト臨床実験の前に、別のインビトロアッセイを用いて中和効率を検証してもよい。
【0071】
ヒト化抗体の産生について記載されている一般的操作に従って、当業者はまた、本明細書に記載の他のドナーRANK−L抗体、可変領域配列およびCDRペプチドからヒト化抗体を構築することもできる。操作された抗体は、その改変抗体の受容体により「自己」として認識される可能性のある可変領域のフレームワークを有するように産生できる。可変領域のフレームワークを少し修飾して、受容体に対する免疫原性を著しく増大させることなく、抗原結合を大きく増大させることができる。かかる操作された抗体はRANK−L介在状態についてヒトを効果的に治療することができる。かかる抗体は上記した症状の診断においても有用である。
【0072】
VII.治療的/予防的使用
また、本発明は慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患を患っているヒトを治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の1つまたはそれ以上の改変抗体または変質抗体またはそのフラグメントを含む抗体を投与することを含む方法に関する。
【0073】
本発明の分子の使用により誘発される治療的応答はヒトRANK−Lとの結合により形成され、したがって、続いて破骨細胞および樹状細胞の発達および機能を阻害する。したがって、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、限定するものではないが、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患を含む骨ホメオスタシス、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患の障害を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。また、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解もしくは変形性関節症(OA)、または乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。
【0074】
本発明の抗体およびそのフラグメントはまた、サイトカイン抑制性抗炎症薬(Cytokine Suppressive Anti−Inflammatory Drugs(CSAIDSTM)または他の抗体、特に本発明の抗体と関連する症状の原因である他のマーカー(エピトープ)と反応的なヒトMAbなどのサイトカイン阻害剤と一緒に用いることができる。
本発明の治療薬は、2日ないし6月の、あるいは必要に応じて、骨減少症または自己免疫症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症を治療する場合には、より長期の治療が望ましい。用量および治療期間は、本発明の分子がヒトの循環下にある相対的な期間と関連しており、当業者が患者の治療されるべき状態および一般的な健康に応じて調節することができる。
【0075】
本発明の治療薬の投与方法は、該薬を宿主に送達する任意の適当な経路とすることができる。本発明の抗体およびそのフラグメント、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内投与に特に有用である。
【0076】
本発明の治療薬は、活性成分として有効量の本発明の抗体(例えば、ヒト化抗体)を医薬上許容される担体中に含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の予防薬において、抗体を含有する水性懸濁液または溶液で、好ましくは生理的pHに緩衝され、すぐに注射できる形態のものが好ましい。非経口投与用組成物は、通常、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本発明の抗体またはそのカクテルの溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば、0.4%セイライン、0.3%グリシン等を用いることができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知られた滅菌技術(例えば、濾過)により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要な医薬上許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤等を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃度は広範囲に変えることができ、すなわち、約0.5重量%未満、通常約1重量%または少なくとも約1重量%から15または20重量%まで変化し、主に流体の体積、粘度等に応じて、選択される具体的な投与方法に従って選択される。
【0077】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水、および約1ngないし約100mg、例えば約50ngないし約30mgまたはより好ましくは約5mgないし約25mgの本発明の抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンゲル液、および約1mgないし約30mg、好ましくは5mgないし約25mgの本発明の抗体を含有するように調製することができる。実際の非経口投与可能な組成物の調製法は当業者に周知であるか明らかであり、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Science”、第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。
【0078】
医薬調製物である場合の、本発明の治療薬は、単位投与形であることが好ましい。治療的に有効な適当な用量は当業者が容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における炎症性障害を有効に治療するために、体重70kgあたり0.1mgないし約20mgの一回用量の本発明の蛋白または抗体を非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与する。かかる投与は、必要ならば、その疾患の間、医師により適当に選択される適当な間隔で繰り返すことができる。
本発明の抗体はまた、例えば、RANK−L介在障害を測定するための、またはかかる障害の治療の進行度を追跡するための診断用方法にて用いることもできる。診断薬としてのこれらの抗体は、一般に、ELISAにて、ならびに血清、血漿または他の適当な組織中のRANK−Lレベルを測定するための、もしくは培養基中でのヒト細胞の放出を測定するための他の慣用的アッセイフォーマットにて用いるために標識されていてもよい。抗体を使用するアッセイの特性は標準的なものであり、この開示を限定するものではない。
【0079】
かくして、本発明の一の具体例は、患者における、骨ホメオスタシスの障害または自己免疫疾患および破骨細胞またはT細胞活性の過剰または不足に付随する他の症状(例えば、慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎(OA)、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む、骨減少症)の診断を補助する方法であって、その患者から得られる試料(血漿または組織)中のヒトRANK−Lの量を測定し、その測定した量と正常な集団のヒトRANK−Lの平均の量とを比較し、それによれば、患者の試料中でRANK−Lが有意に高い量で存在することは骨または自己免疫疾患および破骨細胞またはT細胞の過剰な数または活性に付随する疾患を意味する、方法に関する。同様に、患者の試料中でRANK−Lが有意に低い量で存在することは破骨細胞の数または活性の不足に伴う骨疾患を意味する。
【0080】
本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントは貯蔵のために凍結乾燥させ、使用前に適当なキャリアー中で復元することができる。これらの技法は通常の免疫グロブリンで効果的であることがわかっており、当該分野にて公知の凍結乾燥法および復元法を利用することができる。
かくして、本発明は(a)ヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)モノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体;および(c)モノクローナル抗体19H22に関する。
本発明はまた、(a)ヒトRANK−Lと結合する抗体の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド;(b)モノクローナル抗体19H22の抗体特性の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド;および(c)モノクローナル抗体19H22の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチドに関する。さらに本発明は(a)、(b)および(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0081】
本発明のポリペプチドは、とりわけ、配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドを含む、免疫グロブリン相補性決定領域に関する。本発明のポリヌクレオチドは、とりわけ、配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。本発明は(a)免疫グロブリン相補性決定領域が配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群より選択されるポリペプチドを含むところのヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)配列番号:2に示されるようなポリペプチドの重鎖可変領域および/または配列番号:4に示されるようなポリペプチドの軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体に関する。
【0082】
本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号:2および配列番号:4からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明はモノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
(a)ヒトRANK−Lと結合するモノクローナル抗体;(b)モノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体;および(c)モノクローナル抗体19H22を含む医薬組成物も含まれる。
【0083】
本発明は、試料中のヒトRANK−Lの存在を検出する方法であって、
a)該試料をヒトRANK−Lと結合する抗体に曝し;および
b)ヒトRANK−Lと結合する抗体を検出する、ことを含む方法に関する。
抗体に曝露する前に、ヒトRANK−L蛋白が抗体による結合の影響を受けやすいように、試料が処理されている方法が好ましい。ヒトRANK−Lと結合する好ましい抗体はモノクローナル抗体19H22の識別特性を有しており、より好ましいのはモノクローナル抗体19H22そのものである。
【0084】
以下の実施例は、代表的な操作された抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を含む、本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。アミノ酸はすべて慣用的な3文字または1文字コードで同定されている。必要な制限部位、プラスミド、ならびに他の試薬および材料はすべて、特記しない限り、商業的に入手されたものである。一般的なクローニングライゲーションおよび他の組換えDNA方法は、T.Maniatisら(前掲)または同じ出版人(「Sambrook」ら)による、その第二版(1989)、Sambrookら編に記載されるように行った。
【0085】
(実施例)
実施例1−RANK−Lに対するMAbの産生
A.CB6f1マウスに可溶性ヒトRANKL蛋白を複数回投与して免疫処理することでモノクローナル抗体を産生した。免疫処理したマウスから抗血清を採取し、抗−RANKL抗体について力価測定を行った。出血免疫アッセイ試験に基づいて、反応の最も優れたマウスを脾摘出術の3日および1日前にブースター処理に付した。脾臓を摘出し、ポリエチレングリコール方法を用いてその脾臓細胞をX63AG8653骨髄腫細胞と融合させた。ついで、その融合細胞を20x96ウェルの組織培養プレートにて培養した。融合した14日後に、そのハイブリドーマをRANKL蛋白との抗体結合についてアッセイした。RANKLとの抗体結合を有するそれらのハイブリドーマをそのハイブリドーマの成長速度に合わせて段々により大きな組織培養プレートに広げた。そのハイブリドーマからの上澄を免疫アッセイにて使用し、抗体特異性およびRANKL/RANK結合を中和することにおけるその生物学的活性を確認した。活性が確認されたならば、そのハイブリドーマ細胞系を低温保存し、血清不含培地にて抗体を産生するために秤量した。
【0086】
RANKL蛋白に対する抗体を産生する際の大きな問題はハイブリドーマ培養物のアポトーシスにあった。このことは、通常、ハイブリドーマ拡張の初期の段階で起り、細胞系を完全に死滅させるか、あるいは生産体でないハイブリドーマ細胞系を産生し、これにより抗体合成のスイッチはオフとなる。この問題は、我々の行った100種以上の他の抗原を用いる観察との関連で、どちらかと言えばRANKL抗原に独特であった。この作用は、おそらく、RANKL抗体のネズミRANKLとの弱い交差反応性に由来するものである。RANKLがハイブリドーマ細胞上にあるならば、そのハイブリドーマ培養基にある相対的に高い濃度のRANKL抗体はRANKLと結合し、アポトーシスの誘発をもたらしうる。ハイブリドーマ成長因子を添加してその成長を刺激し、アポトーシスの作用をオフセットしようとする試みがなされたが、大部分のハイブリドーマ細胞系で効果がないことが実証された。この問題の結果は、細胞系の死滅か、IgG合成のシャットダウンのいずれかであり、ハイブリドーマの90%より多くがその融合体から失われた。ある融合体では、この方法ですべてのハイブリドーマが喪失した。
この作用を根絶するために、多数のマウスを免疫処理し、その脾臓を連続的に使用し、生物学的アッセイにおける評価のための抗−RANKL抗体を分泌する一連の安定したハイブリドーマを産生した。
【0087】
B.19H22MAbの精製および配列決定
製造業者の指示に従ってProsepA(Bio Processing、Consett、UK)クロマトグラフィーにより19H22MAbを精製した。SDS−PAGEによればそのMAbは>95%純度であった。N−末端配列を分析するために、重鎖および軽鎖のポリペプチドをSDS−PAGEにより分離し、PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)膜に移し、直接配列決定した(P.Matsudaira、J.Biol.Chem. 262:10035−10038、1987)。
C.MAbのイソ型化
ネズミRANKL MAb19H22を市販のキット(Zymed、Amerscham)でイソ型化し、IgG2b/カッパであることが判明した。
【0088】
実施例2−アッセイ
A.競合ELISAを、溶液での検出のため、プラスチック上にコートしたヒトRANK−Fc融合蛋白およびビオチニル化可溶性ヒトRANKL蛋白を用いて確立した。RANK−FcおよびRANKL蛋白を、各々、CHO細胞およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)中で産生し、>90%の均一性に精製した。shRANKL(可溶性、ヒトRANKL)蛋白を、製造業者の説明に従って、NHS−ビオチンと蛋白(Pierce、Rockford、IL)のモル比を20:1でビオチニル化した。96−ウェルELISAプレートを、pH9.6のカルボネート−ビカルボネート緩衝液中、4℃で一晩、50ng/ウェル(0.53nmol)のRANK−Fcでコートした。プレートを0.1%のトウィーン20を含有するpH7.4のトリス−生理食塩水緩衝液で洗浄し、1%のBSA/PBS中で室温で2時間遮断した。競合蛋白(RANK−Fc;死滅受容体5(DR5)−Fc;OPG−Fc;RANKL MAb 19H22)を0.01%のトウィーン20/PBSで希釈し、ビオチニル化shRANKL(0.43nM)を添加する前にウェルに加え、組合わせた試料を室温で2時間インキュベートした。コートしたRANK−Fc(+/−競合物)に結合したビオチニル化shRANKLの量を、アルカリホスファターゼ複合ストレプタビジンを用いて測定した。シグナル検出に関する基質は105PNPP(Pierce Inc., Rockford, IL)であり、Spectra Max 340プレートリーダーを用いて405nmで吸光度を測定した。DR5−Fc蛋白は、RANKLと相互作用しないことを示している種々の他の研究から考えられる阻害を示さなかった。いくらかの並行したアッセイにおいて、OPG−FcはRANK−Fcよりも強力な阻害剤であり、各々、約0.5および6nMのIC50を有している。19H22 MAbは約2nMのIC50を有するOPG−Fcにより類似した効力を示した。
【0089】
B.培養物中のヒト単球由来の樹状細胞の成熟の阻害。勾配単離により精製された新鮮なヒト単球を組換えヒトIL−4(25ng/ml)およびヒトGM−CSF(50ng/ml)と培養物中で6日間処理し、抗原捕獲表現型の樹状細胞(未成熟DC)を産生した。培地を6日目に、TNF−アルファアンタゴニストTNFRII−Fc(30μg/ml)またはRANKL MAb 19H22(30μg/ml)の存在または不存在下、組換えヒトTNF−アルファ(30ng/ml)または可溶性RANKL(30ng/ml)のいずれかを添加することにより培養物を変化させた。TNF−アルファまたはRANKLは、単独で、表現型、形態学および機能的特性により測定されるような、成熟DCの形成を誘発した。したがって、細胞は細胞表面CD83、CD86、CD80およびMHCIIのアップレギュレーションを示し、CD1aのダウンレギュレーションを示した。未成熟細胞は、マクロ飲作用を示す、FITC−デキストランの著しい接取を示すのに対して、成熟細胞は、実質的には、この能力を喪失していた。TNF−アルファは、成熟を誘発することにおいてRANKLよりもより効果的であり、本質的に、成熟DCの同種の集合体を生じる。対照的に、RANKLでの処理は、類似の表現型の細胞の集合体を産生するが、細胞の1つのフラクション(異なるドナーから得られた単球での異なる実験において30ないし80%)だけが、RANKLで処理した細胞においてこの表現型を示した。RANKL MAb 19H22はsRANKLで処理した細胞の成熟を遮断するが、TNF−アルファで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。同様に、TNFRI−FcはTNF−アルファで処理した細胞の成熟を遮断するが、sRANKLで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。したがって、RANKL MAb 19H22はDC成熟のRANKL誘発の機能的活性を特異的に阻害するものである。
【0090】
C.細胞培養物中のヒトsRANKL刺激骨髄ネズミ破骨細胞形成の阻害。骨髄細胞を生後6週のBalb/Cマウスの大腿骨から集め、3回洗浄し、計数し、ついで培地(10%のFCSを捕捉したRPMI、グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび25ng/mlのCSF−1、50ng/mlの可溶性RANKL)に再懸濁させた。これらの細胞を、Nunc24−ウェルマルチウェルプレート(4通り)中、5×105/ウェルでプレートし、7ないし10日間、培養(37℃、5%のCO2)した。試験物質(例えば、抗体、OPG−Fc)を培養の開始時に添加した。培地および試験物質を3ないし4日毎に交換した。培養期間の最後に、細胞を固定し、Sigmaキット386−1を用いて、製造業者の説明に従って、酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)に対して染色した。各々のウェル中の破骨細胞(3個以上の核を有するTRAP陽性細胞として定義する)の数を顕微鏡で数えた。RANKL MAb19H22およびOPG−Fcは両方とも、ウェル当たりに発達した破骨細胞の数により測定する場合、1μg/mlの濃度で完全に破骨細胞形成を阻害し、両方ともこのアッセイにおいて約200ng/mlのIC50を示した。対照的に、RANK−Fc融合蛋白は、10μg/mlで完全に阻害されたが、2μg/mlでは効果なしであった。
【0091】
D.RANKLにより介されるヒト単球破骨細胞形成の阻害。ヒト単球を上記セクションBの樹状細胞成熟に関して記載したように調製した。これらの細胞を6ないし8日間、25ng/mlのヒトM−CSFを捕捉した50ng/mlのヒト可溶性RANKLの存在下で培養し、骨吸収活性を有する破骨細胞を形成させた。阻害実験に関しては、RANKL MAb 19H22またはRANK−Fc蛋白を培養開始時に加え、破骨細胞の形成を多核細胞の形成によりモニターした。一のアッセイにおいて、ネズミ破骨細胞形成アッセイ(上記パートC)における観察とは対照的に、RANK−Fc蛋白は約500ng/mlのIC50でさらに活性であったのに対して、19H22 MAbは約4μg/mlのIC50を与えた。
要約すれば、これらの結果はRANKL MAb 19H22はヒトRANKLとその受容体RANKの間の相互作用の強力な阻害剤である。この阻害はRANKL介在DC成熟ならびに破骨細胞発達および機能の拮抗効果を導く。
【0092】
実施例3−CDR配列
遺伝子クローニングおよび配列分析:
可変重鎖および軽鎖遺伝子を、以下に簡単に記載する標準的な分子生物学的方法を用いてハイブリドーマ細胞からクローニングした。すべてのRNAをTRIzol試薬(Life Technologies Cat. # 15596−026)を用い、製造業者の指示に従って、ハイブリドーマ細胞から単離した。RNAをプライミング用のポリdTオリゴヌクレオチドを用いて、製造業者の説明(Boehringer Mannheim Cat. No. 1483−188)に従って、RT−PCRキットを用いて逆転写した。第1のストランドcDNA合成に続いて、重鎖および軽鎖V領域を3’不変領域特異的プライマーおよび縮重5’プライマーを用いてPCR増幅した。縮重5’プライマー配列は、可変重鎖または軽鎖領域の前もって測定されたN末端アミノ酸配列をコードするように設計された。多数のクローン由来の全長配列を、各々のPCR増幅物から得、一列に並べてコンセンサスを得た。したがって、重鎖および軽鎖両方に関するDNA配列の最初の17個の塩基は、生成されたPCRプライマーであるが、翻訳された蛋白の配列は天然のものである。
Claims (13)
- モノクローナル抗体19H22の識別特性を有するモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体19H22である、請求項1記載のモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体19H22の免疫グロブリン相補性決定領域を含む抗体。
- 請求項3に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
- 配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
- 配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
- 発現ベクターが適合宿主細胞中に存在する場合、抗体を産生することのできる、配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、該発現ベクターを含む組換え宿主細胞とから成る発現系。
- 配列番号:5、6、7、8、9および10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培地から該抗体を回収する工程を含む方法。
- 発現ベクターが適合宿主細胞中に存在する場合、抗体を産生することのできる配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、該発現ベクターを含む組換え宿主細胞とから成る発現系。
- 配列番号:2および4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培地から該抗体を回収する工程を含む方法。
- 慢性関節リウマチ(RA)、骨粗鬆症(OP)、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症(OA)を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)または多発性硬化症(MS)を含む免疫疾患を治療または予防する方法であって、該治療または予防を必要とする患者に、有効量の請求項1、2、3、5または6記載の抗体またはポリペプチドを投与することによる方法。
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