CN1509328A - Opg配体调节免疫应答的作用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用OPG配体，或其它激动剂或拮抗剂刺激或抑制单核细胞的活性的方法。本发明进一步提供用这些OPG配体，激动剂或拮抗剂治疗病理性疾病，特别是免疫相关疾病的方法。本发明所用的激动剂和拮抗剂包括抗RANK受体抗体，抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，RANK受体免疫粘附素，和OPG受体免疫粘附素。

Description

OPG配体调节免疫应答的作用
发明领域
本发明主要涉及用肿瘤坏死因子(TNF)家族相关分子，OPG配体，或其它拮抗剂或激动剂，调节免疫系统活性的方法。
发明背景
各种分子，如肿瘤坏死因子-α(″TNF-α″)，肿瘤坏死因子-β(″TNF-β″或″淋巴毒素-α″)，淋巴毒素-β(″LT-β″)，CD30配体，CD27配体，CD40配体，OX-40配体，4-1BB配体，Apo-1配体(也称为Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称为TRAIL)，Apo-3配体(也称为TWEAK)，APRIL，OPG配体(也称为RANK配体，ODF，或TRANCE)，及TALL-1(也称为BlyS，BAFF或THANK)已被鉴定为细胞因子的肿瘤坏死因子(″TNF″)家族的成员[见例如Gruss andDower，Blood，85：3378-3404(1995)；Pitti等，J.Biol.Chem.，271：12687-12690(1996)；WILey等，Immunity，3：673-682(1995)；Browning等，Cell，72：847-856(1993)；Armitage等Nature，357：80-82(1992)，WO 97/01633公开于January 16，1997；WO 97/25428公开于July 17，1997；Marsters等，Curr.Biol.，8：525-528(1998)；Chicheportiche等，Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Hahne等，J.Exp.Med.，188：1185-1190(1998)；WO98/28426公开于July2，1998；WO98/46751公开于October 22，1998；WO/98/18921公开于May7，1998；Moore等，Science，285：260-263(1999)；Shu等，J.Leukocyte Biol.，65：680(1999)；Schneider等，J.Exp.Med.，189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyay等，J.Biol.Chem.，274：15978-15981(1999)]。在这些分子中，TNF-α，TNF-β，CD30配体，4-1BB配体，Apo-1配体，Apo-2配体(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配体(TWEAK)已被报导参与细胞凋亡。TNF-α和TNF-β已被报导诱导易感肿瘤细胞的细胞凋亡[Schmid等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：1881(1986)；Dealtry等，Eur.J.Immunol.，17：689(1987)]。
TNF家族的各种分子在免疫系统的功能或发育中也起到所声称(purported)的作用[Gruss等，Blood，85：3378(1995)]。Zheng等已报导TNF-α参与CD8阳性T细胞的刺激后细胞凋亡[Zheng等，Nature，377：348-351(1995)]。其它研究人员已报导CD30配体可能与甲状腺内自反应性T细胞的缺失有关[Amakawa等，Cold Spring Harbor Laboratory Symposium onProgrammed Cell Death，Abstr.No.10，(1995)]。CD40配体活化B细胞的很多功能，包括增殖，免疫球蛋白分泌，及存活[Renshaw等，J.Exp.Med.，180：1889(1994)]。另一最近鉴定的TNF家族细胞因子，TALL-1(BlyS)，已被报导，在某些情况下可诱导B细胞增殖及免疫球蛋白分泌。[Moore等，见上文；Schneider等，见上文；Mackay等，J.Exp.Med.，190：1697(1999)]。
小鼠Fas/Apo-1受体或配体基因(分别叫做lpr和gld)的突变与一些自身免疫病相关，表明Apo-1配体可能在调节自反应性淋巴细胞在外周的克隆缺失中起作用[Krammer等，Curr.Op.Immunol.，6：279-289(1994)；Nagata等，Science，267：1449-1456(1995)]。据报导，Apo-1配体也诱导CD4阳性T淋巴细胞和B淋巴细胞的刺激后凋亡，并可能参与活化的淋巴细胞在不再被需要时的去除[Krammer等，见上文；Nagata等，见上文]。据报道，特异性结合到Apo-1受体的激动剂小鼠单克隆抗体表现出的杀细胞活性可与TNF-α的杀细胞活性相当或类似[Yonehara等，J.Exp.Med.，169：1747-1756(1989)]。
在文献中已报导，被称为OPG配体的TNF相关配体(也称为RANK配体，TRANCE，或ODF)参与某些免疫调节活动。WO98/28426(公开于7月2日，1998年)描述此配体(本文指RANK配体)为2型跨膜蛋白，发现该蛋白的可溶形式可诱导树突细胞的成熟，提高CDlα+树突细胞在MLR中的异刺激能力，并在体外TGF-β存在时增加活的人外周血T细胞的数量。[也见，Anderson等，Nature，390：175-179(1997)；WO 99/29865公开于June 17，1999]。参考文献WO98/28426也披露所述配体可提高一种巨噬细胞肿瘤细胞系(叫做RAW264.7；ATCC TIB71)的TNF-α生产，但不刺激那些肿瘤细胞的一氧化氮生产。[也见，Nagai等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，269：532-536(2000)；WO 00/15807公开于March 23，2000]。
文献中已探讨OPG配体/TRANCE/ODF在调控树突细胞活性[见例如Wong等，J.Exp.Med.，186：2075-2080(1997)；Wong等，J.Leukocyte Biol.，65：715-724(1999)；Wong等，J.Biol.Chem.，272：25190-25194(1997)；Josien等，J.Immunol.，162：2562-2568(1999)；Josien等，J.Exp.Med.，191495-501(2000)]及影响T细胞在免疫应答中的活化的公认作用[见例如Bachmann等，J.Exp.Med.，189：1025-1031(1999)；Green等，J.Exp.Med.，189：1017-1020(1999)]。Kong等，Nature，397：315-323(1999)报导了携带已受损的opg基因的小鼠表现出严重的骨质疏松症，破骨细胞缺乏，并表现出T和B淋巴细胞的早期分化的缺陷。Kong等还报导T细胞在体内的系统性活化可造成OPGL介导的破骨细胞生成和骨损失的增加。[Kong等，Nature，402：304-308(1999)]。
称为RANK的TNFR家族成员，已被鉴定为OPG配体的受体(见WO98/28426公开于July 2，1998；WO 99/58674公开于November 18，1999；Anderson等，Nature，390：175-179(1997)；Lacey等，Cell，93：165-176(1998)。另一TNFR相关分子，叫做OPG(FDCR-1或OCIF)，也已被鉴定为OPG配体的受体。[Simonet等，Cell，89：309(1997)；Yasuda等，Endocrinology，139：1329(1998)；Yun等，J.Immunol.，161：6113-6121(1998)]。见上文的Yun等，披露了OPG/FDCR-1/OCIF可以膜结合的形式和分泌的形式表达，并且在免疫系统细胞，包括树突细胞，EBV转化的B细胞系和扁桃体B细胞上具有限制性表达的模式。Yun等也披露在B细胞和树突细胞，OPG/FDCR-1/OCIF的表达可被参与B细胞活化的分子CD40上调。然而，Yun等承认OPG/FDCR-1/OCIF如何在免疫应答的调节中作用仍是未知的。
通过这些TNF家族细胞因子介导来诱导的多种细胞应答，据信是从它们结合到特异性细胞受体开始的。以前鉴定出大约为55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)的两种独特的TNF受体[Hohman等，J.Biol.Chem.，264：14927-14934(1989)；Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：3127-3131(1990)；EP 417，563，公开于March 20，1991；Loetscher等，Cell，61：351(1990)；Schall等，Cell，61：361(1990)；Smith等，Science，248：1019-1023(1990)；Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：2830-2834(1991)；Goodwin等，Mol.Cell.Biol.，11：3020-3026(1991)]。那些TNFRs被发现共享包括胞外，跨膜和胞内区的细胞表面受体的典型结构。自然发现的两个受体的胞外部分都是可溶性TNF结合蛋白[Nophar，Y等，EMBO J.，9：3269(1990)；和Kohno，T.等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，87：8331(1990)；Hale等，J.Cell.Biochem.Supplement 15F，1991，p.113(P424)]。
1型和2型TNFRs的胞外部分(TNFR1和TNFR2)含有从NH2末端开始，命名从1到4的四个半胱氨酸富集结构域(CRDs)的重复性氨基酸序列模式。[Schall等，见上文；Loetscher等，见上文；Smith等，见上文；Nophar等，见上文；Kohno等，见上文；Banner等，Cell，73：431-435(1993)]。类似的CRDs的重复性模式存在于多个其它细胞表面蛋白，包括p75神经生长因子受体(NGFR)[Johnson等，Cell，47：545(1986)；Radeke等，Nature，325：593(1987)]，B细胞抗原CD40[Stamenkovic等，EMBO J.，8：1403(1989)]，T细胞抗原OX40[Mallet等，EMBO J.，9：1063(1990)]以及Fas抗原[Yonehara等，见上文及Itoh等，Cell，66：233-243(1991)]。CRDs也被发现在休普氏和粘液瘤痘病毒的可溶性类TNFR(sTNFR)T2蛋白中[Upton等，Virology，160：2029(1987)；Smith等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，176：335(1991)；Upton等，Virology，184：370(1991)]。这些序列的最佳比对表明所述半胱氨酸残基的位置是高度保守的。这些受体有时共同称为
TNF/NGF受体超家族的成员。
现已鉴定的TNF家族配体，除了淋巴毒素-α，主要为II型跨膜蛋白，它们的C末端位于胞外。相比之下，现在鉴定的TNF受体(TNFR)家族的多数受体主要为I型跨膜蛋白。然而，在TNF配体和受体家族中，发现家族成员之间鉴定出的同一性主要存在于胞外结构域(″ECD″)。若干个TNF家族的细胞因子，包括TNF-α，Apo-1配体和CD40配体，在细胞表面被蛋白酶剪切；每种情况下所得的蛋白通常形成具有可溶性细胞因子作用的同型三聚体分子。TNF受体家族蛋白也经常被蛋白酶剪切以释放能象同源细胞因子的抑制物的可溶性受体ECD。
最近，已鉴定出TNFR家族的其它成员。在Bulow等，Science，278：138-141(1997)中，研究人员描述了称为跨膜活化物和CAML相互作用子或″TACI″的血浆膜受体。据报导，所述TACI受体含有TNF-R家族特征的半胱氨酸富集基序。在体外试验中，TACI在转染的Jurkat细胞表面与TACI特异性抗体的交联导致了NF-KB的活化。[也见，WO 98/39361公开于September 18，1998]。
Laabi等，EMBO J.，11：3897-3904(1992)报导鉴定了一种叫做″BCM″的新基因，据发现其表达与B细胞最终成熟同时。所述BCM正常cDNA的开放阅读框架预测了具有单个跨膜结构域的184个氨基酸长度的多肽。这些研究人员后来命名这个基因为″BCMA″。[Laabi等，Nucleic Acids Res.，22：1147-1154(1994)]。据报导，BCMA mRNA的表达在代表前B淋巴细胞阶段的人恶性B细胞系中缺乏，因而，据信其与淋巴细胞的分化阶段相关[Gras等，Int.Immunology，7：1093-1106(1995)]。Madry等，Int.Immunology，10：1693-1702(1998)中描述了鼠BCMA cDNA的克隆。据报导，所述鼠BCMA cDNA可编码185个氨基酸长度的多肽，该多肽与人BCMA多肽具有62％的同一性。鼠和人BCMA蛋白序列的比对表明，在N末端区有六个半胱氨酸的保守基序，由此推测所述BCMA蛋白属于TNFR超家族[Madry等，见上文]。
在Marsters等，Curr.Biol.，6：750(1996)中，研究人员描述了叫做Apo-3的全长天然序列人多肽，该多肽的胞外半胱氨酸富集型重复表现出与TNFR家族的相近性，并因为它包含了胞浆死亡结构域序列而与NFR1和CD95类似[也见Marsters等，Curr.Biol.，6：1669(1996)]。Apo-3也被其它研究人员称为DR3，wsl-1，TRAMP，和LARD[Chinnaiyan等，Science，274：990(1996)；Kitson等，Nature，384：372(1996)；Bodmer等，Immunity，6：79(1997)；Screaton等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：4615-4619(1997)]。
Pan等已公开另一被称为″DR4″的TNF-受体家族成员[Pan等，Science，276：111-113(1997)；也见WO98/32856公开于July 30，1998]。所述DR4被报导含有能构成(engage)细胞自杀装置的胞浆死亡结构域。Pan等披露DR4据信为配体Apo2L/TRAIL的受体。
在Sheridan等，Science，277：818-821(1997)及Pan等，Science，277；815-818(1997)中，描述了另一据信为Apo2L/TRAIL的受体的分子[也见，WO98/51793公开于November 19，1998；WO98/41629公开于September 24，1998]。那种分子被称为DR5(它也被称为Apo-2；TRAIL-R，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER[Screaton等，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak等，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu等，Nature.Genetics，17：141-143(1997)；WO98/35986公开于August 20,1998；EP870,827公开于October 14,1998；WO98/46643公开于October 22,1998；WO99/02653公开于January 21,1999；WO99/09165公开于February 25,1999；WO99/11791公开于March 11,1999]。据报导，DR5与DR4一样，包含胞浆死亡结构域并能够传导细胞凋亡信号。在Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合体的晶体结构见Hymowitz等，Molecular Cell，4：563-571(1999)所述。
而另一含有死亡结构域的受体DR6，最近才被鉴定出来[Pan等，FEBSLetters，431：351356(1998)]。除去含有四个公认的胞外半胱氨酸富集结构域及一个胞浆死亡结构域，据信DR6包含一个公认与脯氨酸富集基序在胞浆区重叠的亮氨酸拉链序列。该脯氨酸富集基序类似于很多胞内信号传导分子内的与src同源3结构域结合的序列。
还有一组最近鉴定出来被称为″诱骗(decoy)受体″的受体，据信它作为抑制物，而不是信号传导物起作用。该组包括DCR1(也称为TRID，LIT或TRAIL-R3)[Pan等，Science，276：111-113(1997)；Sheridan等，Science，277：818-821(1997)；McFarlane等，J.Biol.Chem.，272：25417-25420(1997)；Schneider等，FEBS Letters，416：329-334(1997)；DegliEsposti等，J.Exp.Med.，186：1165-1170(1997)；及Mongkolsapaya等，J.Immunol.，160：36(1998)]和DCR2(也叫做TRUNDD或TRAIL-R4)[Marsters等，Curr.Biol.，7：1003-1006(1997)；Pan等，FEBS Letters，424：41-45(1998)；Degli Esposti等，Immunity，7：813-820(1997)]这两种细胞表面分子，及OPG[Simonet等，见上文；Emery等，见下文]和DCR3[Pitti等，Nature，396：699-703(1998)]这两种分泌性可溶蛋白。
TNFR家族其它新鉴定的成员包括CAR1，HVEM，GITR，ZTNFR-5，NTR-1，和TNFL1[Broiatsch等，Cell，87：845-855(1996)；Montgomery等，Cell，87：427-436(1996)；Marsters等，J.Biol.Chem.，272：14029-14032(1997)；Nocentini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：6216-6221(1997)；Emery等，J.Biol.Chem.，273：14363-14367(1998)；WO99/04001公开于January 28,1999；WO99/07738公开于February 18,1999；WO99/33980公开于July 8,1999]。
如最近为Tewari等所综述，TNFR1，TNFR2和CD40通过转录因子NF-κB的活化调节前炎性细胞因子和共刺激细胞因子，细胞因子受体，以及细胞粘附分子的表达[Tewari等，Curr.Op.Genet.Develop.，6：39-44(1996)]。NF-κB为二聚化转录因子家族的前体，其亚单位含有保守的Rel区[Verma等，Genes Develop.，9：2723-2735(1996)；Baldwin，Ann.Rev.Immunol.，14：649-681(1996)]。NF-κB的潜伏形式与IκB抑制物家族的成员复合；当作为对某些刺激的应答IκB被灭活时，释放的NF-κB移位到核，在那里它与特异性DNA序列结合并活化基因的转录。如上所述，现已鉴定的TNFR成员包括或者缺乏胞内死亡结构域区域。一些缺乏死亡结构域的TNFR分子，如TNFR2，CD40，HVEM，和GITR，能够调节NF-κB的活性。[见例如Lotz等，J.Leukocyte Biol.，60：1-7(1996)]。
TNF家族细胞因子及它们的受体的综述，见Ashkenazi和Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)；Gruss和Dower，见上文，和Nagata，Cell，88：355-365(1997)。
发明简述
据报导最近鉴定出的，叫做OPGL的TNF家族成员的分子可结合至少两种受体，RANK和OPG。尽管如文献所述，这种配体及其受体的表达模式总体上提示该配体和受体的相互作用可能在抗原呈递细胞(APC)的功能和T细胞活化中起作用，但本领域并不知道OPGL在单核细胞的活化中会起什么作用。申请人发现OPGL可活化人单核细胞，特别是活化这些单核细胞来分泌某些细胞因子如IL-1(包括IL-1β)，IL-6，IL-12，MIP-1α，和TNF-α和趋化因子如IL-8。同样据信OPGL可对共刺激分子，如ICAM-α和VCAM-1，LFA和B7.1，B7.3和B7h的上调起作用。OPGL也可作为促进T细胞活化的抗原呈递分子。
因而本发明提供用OPG配体活化单核细胞，特别是活化单核细胞分泌一或多种细胞因子或趋化因子的方法。可选地，所述方法包括使哺乳动物细胞，如外周血单核细胞，暴露于有效量的OPG配体以刺激该单核细胞分泌一或多种细胞因子或趋化因子。此细胞可以是在细胞培养物或哺乳动物中。
本发明还提供用OPG配体治疗与单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌缺乏或下降相关，或由其造成的哺乳动物病理性疾病的方法。在治疗方法中，OPG配体可给药患有病理性疾病的哺乳动物。用于本发明的OPG配体包括OPG配体的可溶性胞外结构域序列。
本发明还提供了可用于调节免疫活性的如本文所述的激动剂和拮抗剂分子。此种激动剂或拮抗剂分子可包含，例如，抗OPG或RANK受体的抗体。例如，可以按类似于本发明所述OPGL的方式用激动型RANK抗体激活单核细胞，特别是激活单核细胞以便分泌一或多种细胞因子或趋化因子。可选地，此种抗体为可特异性结合OPG配体，OPG受体或RANK受体的单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，抗体片段或单链抗体。在一个实施方案中，此抗体模拟OPG配体多肽的活性(激动型抗体)或反过来该抗体抑制或中和OPG配体多肽的活性(拮抗型抗体)。可选地，此种抗体为优选具有非人互补决定区(CDR)残基及人框架区(FR)残基的单克隆抗体。另一方面，该抗体可为抗体片段，单链抗体，或抗独特型抗体。
本文公开的方法中所用的组合物可包含OPG配体或其它激动剂或拮抗剂及载体，如可药用载体。优选，所述组合物为无菌形式。此组合物可采用冻干的配置物或液态药物配制物的形式，它们在储存中有更长时间的稳定性。
在另一实施方案中，该发明涉及一种制品，其包括：
(a)  包含OPG配体多肽或其它激动剂或拮抗剂的组合物；
(b)  含有所述组合物的容器；和
(c)  粘贴在所述容器上的标签，或所述容器中所包括的包装插页，其指示所述OPG配体多肽或激动剂或拮抗剂在治疗病理性疾病，优选免疫相关疾病中的应用。所述组合物可包含治疗有效量的OPG配体多肽或激动剂或拮抗剂。
在本发明的具体实施方案中，提供了刺激哺乳动物单核细胞的方法，其包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的OPG配体多肽，该OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述OPG配体多肽包括：
a)与全长天然序列OPG配体多肽有至少80％的序列同一性的多肽，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)所述的氨基酸序列；
b)图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列；
c)由图1B(SEQ ID NO：1)所述氨基酸序列组成的多肽；或
d)含有a)，b)或c)的片段的多肽。
在所述方法中，所述哺乳动物单核细胞可在体外或体内暴露于所述OPG配体多肽。可选地，所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。可选地，所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6或IL-12。可选地，所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α或MIP-1α。可选地，所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。可选地，所述OPG配体多肽包含图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列。可选地，所述OPG配体多肽与全长天然序列OPG配体多肽有至少80％的序列同一性，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。可选地，所述OPG配体多肽有至少90％的序列同一性。
在本发明的其他实施方案中，提供了刺激哺乳动物单核细胞的方法，其包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的激动型抗RANK受体抗体，该抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α或IL-8的细胞因子或趋化因子。在所述方法中，所述哺乳动物单核细胞可在体外或体内暴露于所述激动型抗RANK受体抗体。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6或IL-12。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α或MIP-1α。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体为单克隆抗体。可选地，所述激动型抗RANK受体抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
在另外的实施方案中，提供了抑制哺乳动物单核细胞的方法，其包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的可抑制所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种细胞因子或趋化因子的拮抗剂，其中所述拮抗剂含有抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，抗RANK受体抗体，OPG受体免疫粘附素或RANK受体免疫粘附素，而且所述一或多种细胞因子或趋化因子选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α或IL-8。在所述方法中，所述哺乳动物单核细胞可在体外或体内暴露于所述拮抗剂。可选地，所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。可选地，所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6或IL-12。可选地，所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α或MIP-1α。可选地，所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。
在另外的实施方案中，提供了与哺乳动物单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌下降相关的或由其造成的病理性疾病的治疗方法，该方法包括给药哺乳动物有效量的激动剂以刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述激动剂包括：
a)  与全长天然序列OPG配体多肽有至少80％的序列同一性的多肽，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)所述的氨基酸序列；
b)  图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列；
c)  由图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列组成的多肽；
d)  含有a)，b)或c)的片段的多肽；或
e)  抗RANK受体抗体。
在所述方法中，所述病理性疾病可为免疫相关性疾病。可选地，所述免疫相关性疾病为传染性疾病。可选地，所述抗RANK受体抗体为单克隆抗体。可选地，所述抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
在另外的实施方案中，提供了与哺乳动物单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌增加相关的或由其造成的病理性疾病的治疗方法，该方法包括给药哺乳动物有效量的拮抗剂以抑制所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述拮抗剂包括抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，抗RANK受体抗体，OPG受体免疫粘附素或RANK受体免疫粘附素。在所述方法中，所述病理性疾病可为免疫相关性疾病。可选地，所述免疫相关性疾病为自身免疫病，类风湿性关节炎，胰岛素依赖性糖尿病，骨关节炎，炎性肠疾病，牛皮癣，移植排斥反应或变态反应。可选地，所述抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，或抗RANK受体抗体为单克隆抗体。可选地，所述抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
在本发明另外的实施方案中提供了一种制品，包括：
(a)包含有效量的本文披露的OPG配体多肽，本文披露的激动剂，或本文披露的拮抗剂的组合物；
(b)包含所述组合物的容器；和
(c)粘贴在所述容器上的标签，或所述容器中所包括的包装插页，其指示所述OPG配体多肽或激动剂或拮抗剂在治疗免疫相关疾病中的应用。
附图说明
图1A显示人OPG配体的cDNA序列(SEQ ID NO：2)，图1B显示人OPG配体的公认氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2A显示人OPG受体的cDNA序列(SEQ ID NO：4)，图2B显示人OPG受体的公认氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图3A-1和3A-2显示人RANK受体的cDNA序列(SEQ ID NO：6)，图3B显示人RANK受体的公认氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图4显示体外试验检测可溶性OPGL对于单核细胞增殖的作用的结果。
图5显示ELISA试验确定可溶性OPGL对于IL-8分泌的诱导作用的结果。
图6显示ELISA试验确定可溶性OPGL对于TNF-α分泌的诱导作用的结果。
图7显示ELISA试验确定可溶性OPGL对于IL-6分泌的诱导作用的结果。
图8显示ELISA试验确定可溶性OPGL对于IL-1分泌的诱导作用的结果。
图9A-9E显示ELISA试验确定可溶性OPGL对于IL-12，IL-6，TNF-α，IL-1β，和MIP-1α分泌的诱导作用的结果。
图10A-10H显示确定OPGL对于单核细胞中CD80(10A-10B)，II类(10C-10D)，CD86(10E-10F)和RANK(10G-10H)表达的影响的试验结果。
图11A-11B显示确定OPGL(11A)和OPG受体(11B)在IL-4和/或抗CD40抗体存在时对培养的B细胞的增殖产生影响的试验结果。
图12显示确定OPGL对于缺血清(serum-starved)的培养物中单核细胞的抗细胞凋亡作用的试验结果。
图13A-13B的SDS-PAGE胶显示OPGL对于用OPGL处理了指定时间后的单核细胞内的Bcl-x1(13A)和Bcl-2(13B)表达的作用。
图14A-14B的SDS-PAGE胶显示OPGL对于用OPGL处理了指定时间后的单核细胞内的p38 MAPK(14A)和p42/44 MAPK(14B)表达的作用。
图15A说明了FACS分析单核细胞以检测RANK受体表达的结果。
图15B说明了用TaqmanTM扩增所分析的，在用OPGL处理的单核细胞内RANK mRNA表达的上调。
图15C说明了用TaqmanTM扩增所分析的，在正常的和溃疡性结肠炎(“UC”)的人组织中RANK mRNA表达的上调。
发明详述
概念：
本文所用术语“OPGL”或“OPG配体”或“OPG配体多肽”包括“天然序列OPGL多肽”和“OPGL变体”。“OPGL”是指由包含WO98/28426(公开于July 2，1998)所示多核苷酸序列的核酸分子编码的多肽(也称RANK配体)及其变体，包含WO98/28426所示序列的核酸分子，其变体，及上述物质的具有天然序列OPGL生物活性的片段。可选地，在所述方法中应用的OPG配体包括具有图1B(SEQ ID NO：1)中氨基酸残基70-317或1-317的连续序列的多肽。OPGL的变体优选与WO98/28426所示并且也在本文图1B(SEQ ID NO：1)中提供的天然序列OPGL多肽，具有至少80％，更优选至少90％，再优选至少95％的氨基酸序列同一性。“天然序列”OPGL多肽包含与从天然衍生的相应OPGL多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此种天然序列OPGL多肽可从自然分离或可用重组和/或合成方法生产。术语“天然序列OPGL多肽”具体包括所述多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外结构域序列)，天然变体形式(例如两种不同的剪接形式)以及天然等位变体。术语“OPGL”包括那些在Anderson等，Nature，390：175-179(1997)；Lacey等，Cell，93：165-176(1998)；Wong等，J.Exp.Med.，186：2075-2080(1997)；Yasuda等，PNAS，95：3597-3602(1998)；美国专利6,242,213于June 5，2001授予；WO99/29865公开于June 17,1999(称为TRANCE)中所述的多肽。重组人OPG配体也可从Alexis公司购买。
“OPG配体变体”指与天然序列OPG配体或OPG配体ECD的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性的OPG配体多肽。优选，所述OPG配体变体结合OPG受体或RANK受体，更优选，结合具有图2B(SEQ IDNO：3)的氨基酸序列的OPG受体多肽或具有图3B(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列的RANK受体多肽。可选地，所述OPG配体变体将具有本文鉴定出的天然序列OPG配体多肽或激动剂或拮抗剂分子的至少一种活性。此种OPG配体变体多肽包括，例如，在全长氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多个内部结构域内，添加或缺失一或多个氨基酸残基的OPG配体多肽。一般，OPG配体变体多肽与图1A所示核酸分子或其特定片段所编码的OPG配体多肽具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约81％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约82％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约83％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约84％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约85％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约86％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约87％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约88％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约89％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约90％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约91％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约92％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约93％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约94％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约95％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约96％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约97％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约98％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约99％的氨基酸序列同一性。OPG配体变体多肽不包括天然OPG配体多肽序列。一般，OPG配体变体多肽为至少大约10个氨基酸长度，通常至少大约20个氨基酸长度，更通常至少大约30个氨基酸长度，更通常至少大约40个氨基酸长度，更通常至少大约50个氨基酸长度，更通常至少大约60个氨基酸长度，更通常至少大约70个氨基酸长度，更通常至少大约80个氨基酸长度，更通常至少大约90个氨基酸长度，更通常至少大约100个氨基酸长度，更通常至少大约150个氨基酸长度，更通常至少大约200个氨基酸长度，更通常至少大约250个氨基酸长度，更通常至少大约300个氨基酸长度，或更多。
本文所用术语“OPG”或“osteoprotegerin”或“OPG受体”包括“天然序列OPG多肽”和“OPG变体”(在本文会继续限定)。“OPG”是指由包含Simonet等，cell，89：309(1997)所述多核苷酸序列的核酸分子编码的多肽及其变体，包含Simonet等，出处同上所述序列的核酸分子，其变体，及上述物质的片段。所述cDNA和公认氨基酸序列已在图2A-B中提供。可选地，在所述方法中应用的OPG受体包括具有图2B(SEQ ID NO：3)中氨基酸残基22-401或1-401所示连续序列的多肽。本发明所述OPG多肽可从各种来源，如从人组织类型或从其它来源分离，或用重组和/或合成方法制备。“天然序列”OPG多肽含有与从自然衍生的相应OPG多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此种天然序列OPG多肽可从自然分离或用重组和/或合成途径来制备。术语“天然序列OPG多肽”具体包含所述多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外结构域序列)，天然变体形式(例如两种不同的剪接形式)以及天然等位变体。本发明的OPG多肽包括在Yasuda等，Endocrinology，139：1329(1998)和Yue等，J.Immunol.，161：6113-6121(1998)中所述的多肽“FDCR-1”和“OCIF”。
“OPG变体”指与天然序列OPG或OPG ECD的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的OPG多肽。优选所述OPG变体结合OPGL，更优选，结合具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的全长OPG配体多肽。可选地，所述OPG变体将具有本文鉴定出的天然序列OPG多肽或激动剂或拮抗剂分子的至少一种活性。此种OPG变体多肽包括，例如，在全长氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多个内部结构域内，添加或缺失一或多个氨基酸残基的OPG多肽。一般，OPG变体多肽与Simonet等所示核酸分子或其特定片段所编码的OPG多肽具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约81％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约82％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约83％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约84％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约85％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约86％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约87％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约88％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约89％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约90％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约91％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约92％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约93％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约94％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约95％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约96％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约97％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约98％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约99％的氨基酸序列同一性。OPG变体多肽不包括天然OPG多肽序列。一般，OPG变体多肽为至少大约10个氨基酸长度，通常至少大约20个氨基酸长度，更通常至少大约30个氨基酸长度，更通常至少大约40个氨基酸长度，更通常至少大约50个氨基酸长度，更通常至少大约60个氨基酸长度，更通常至少大约70个氨基酸长度，更通常至少大约80个氨基酸长度，更通常至少大约90个氨基酸长度，更通常至少大约100个氨基酸长度，更通常至少大约150个氨基酸长度，更通常至少大约200个氨基酸长度，更通常至少大约250个氨基酸长度，更通常至少大约300个氨基酸长度，或更多。
本文所用术语“RANK”或“RANK受体”包括“天然序列RANK多肽”和“RANK变体”(在本文会继续限定)。“RANK”是指由包含WO98/28426(于July 2，1998公开)所示多核苷酸序列的核酸分子编码的多肽及其变体，包含WO98/28426所示序列的核酸分子，其变体，以及上述物质的片段。可选地，在所述方法中应用的RANK受体包括具有图3B(SEQ IDNO：5)中氨基酸残基29-212或1-212所示连续序列的多肽。本发明所述RANK多肽可从各种来源，如从人组织类型或从其它来源分离，或用重组和/或合成方法制备。“天然序列”RANK多肽包含与从自然衍生的相应RANK多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此种天然序列RANK多肽可从自然分离或用重组和/或合成途径来制备。术语“天然序列RANK多肽”具体包含所述多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外结构域序列)，天然变体形式(例如两种不同的剪接形式)以及天然等位变体。本发明的RANK多肽包括在Anderson等，Nature，390：175-179(1997)；美国专利6,017,729于January 25，2000授权；Lacey等，Cell，93：165-176(1998)所述的多肽。
“RANK变体”指与天然序列RANK或RANK ECD的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的RANK多肽。优选所述RANK变体结合OPGL，更优选，结合具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的全长OPG配体多肽。可选地，所述RANK变体将具有本文鉴定出的天然序列RANK多肽或激动剂或拮抗剂分子的至少一种活性。此种RANK变体多肽包括，例如，在全长氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多个内部结构域内，添加或缺失一或多个氨基酸残基的RANK多肽。一般，RANK变体多肽与WO98/28426所示核酸分子或其特定片段所编码的RANK多肽具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约81％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约82％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约83％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约84％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约85％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约86％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约87％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约88％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约89％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约90％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约91％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约92％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约93％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约94％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约95％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约96％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约97％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约98％的氨基酸序列同一性，更优选至少大约99％的氨基酸序列同一性。RANK变体多肽不包括天然RANK多肽序列。一般，RANK变体多肽为至少大约10个氨基酸长度，通常至少大约20个氨基酸长度，更通常至少大约30个氨基酸长度，更通常至少大约40个氨基酸长度，更通常至少大约50个氨基酸长度，更通常至少大约60个氨基酸长度，更通常至少大约70个氨基酸长度，更通常至少大约80个氨基酸长度，更通常至少大约90个氨基酸长度，更通常至少大约100个氨基酸长度，更通常至少大约150个氨基酸长度，更通常至少大约200个氨基酸长度，更通常至少大约250个氨基酸长度，更通常至少大约300个氨基酸长度，或更多。
“胞外结构域”或“ECD”指基本上不含跨膜和胞质结构域的一种形式。通常，多肽的ECD形式具有小于约1％的此类跨膜和/或胞质结构域，优选具有小于约0.5％的此类结构域。应当懂得，所鉴定出的本发明多肽的任何跨膜结构域(一个或多个)是依据本领域在鉴定疏水结构域类型中常规使用的标准而确定的。跨膜结构域的精确的边界会有不同，但在最初确定的结构域的两末端之一最多不超过约5个氨基酸。在优选实施方案中，所述ECD由多肽的可溶性胞外结构域序列组成，该多肽不含跨膜和胞浆或胞内结构域(并且不是膜结合的)。
在此鉴定的序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列及必要时引入缺口以获得序列同一性的最大百分比，且不考虑作为序列同一性的部分的任何保守取代时，候选序列中与Apo-2配体序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员所知的能确定用于测定比对所需相应参数的多种途径完成，包括指定能获得对全长比对序列的最大比对所需的算法。为此目的，氨基酸序列同一性百分比可通过使用序列比对的计算机程序ALIGN-2得到，该程序由Genentech，Inc.授权，其源代码已连同用户手册提交美国版权局，华盛顿特区，20559，在美国版权局注册号码TXU510087。该程序可从Genetech，Inc.，South San Francisco，CA公开得到。所有序列比对参数由ALIGN-2程序设定，没有改变。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算：
                   X/Y比值乘以100
其中X是用序列对比程序ALIGN-2比较A和B的氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数，其中Y是B的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非作其它特殊叙述，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2序列比较计算机程序如上述得到的。然而，％氨基酸序列同一性也可能用所述序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：33893402(1997))来确定。该NCBI-BLAST2序列比较程序可从NCBI互联网下载。NCBI-BLAST2使用多个搜索系数，其中所有那些搜索系数被设置为默认值，它们包括例如，不覆盖(unmask)＝是，串(strand)＝所有，期望出现次数(expectedoccurrences)＝10，最低复杂性长度(minimum low complexity length)＝15/5，多通e值(multi-pass e-value)＝0.01，多通常数(constant for multi-pass)＝25，终缺口比对遗落值(dropoff for final gapped alignment)＝25及记数矩阵(scoringmatrix)＝BLOSUM62。
在NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较时，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算：
                         X/Y比值乘以100
其中X是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较A和B的氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数，其中Y是B的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。
杂交反应的″严格度″由本领域技术人员很容易地确定，通常根据经验在考虑探针长度、洗涤温度和盐浓度的基础上计算得出。一般而言，长的探针需要较高的温度以便正确退火，而短的探针需要较低温度。杂交通常取决于变性的DNA在低于解链温度的环境中存在互补序列时的重退火能力。探针和杂交序列之间所需同源程度越高，则可使用的相对温度越高。结果是，相对温度较高将使反应条件趋于更加严格，而较低温度则使反应的严谨度较小。有关杂交反应的严格度的其它细节和解释，见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biologv，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″严格条件″或″高度严格条件″，可以定义为：(1)使用低离子强度和高温洗涤，例如，50℃ 0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中42℃使用变性剂如甲酰胺，譬如，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或者(3)42℃使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和，于55℃在50％甲酰胺中洗涤，接着于55℃用含EDTA的0.1×SSC进行高度严格洗涤。
″中等严格条件″可以按照Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989的定义，包括使用严格度低于前述的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度，离子强度和SDS％)。中等严格条件的一个实例是，于37℃在如下组成的溶液中过夜温育：20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA，接着于37-50℃在1×SSC中洗涤杂交膜。本领域熟练技术人员懂得如何必要地调整温度、离子强度等条件以适应诸如探针长度等因素。
本文使用的术语″表位标签″，是指含有与″标签多肽″融合了的多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够多的残基以提供针对所制备抗体的表位，所述标签多肽也优选十分特殊因而所述抗体基本不与其它表位交叉反应。通常，适宜的标记多肽至少有6个氨基酸残基，一般为约8～50个氨基酸残基(优选为约10～20个氨基酸残基)。
本文中所用术语“免疫粘附素”定义为抗体样分子，其将异源蛋白(一种“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应器功能组合。结构上，免疫粘附素包括具有所需结合特异性之氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列的融合，所述氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即为“异源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是至少包括一个受体或一个配体的结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
术语“拮抗剂”使用其广义含义，包括在体外，原位，或体内，部分或完全阻断，抑制，或中和OPGL的一或多种生物活性的任何分子。OPGL多肽的这类生物活性举例包括OPGL与OPG或RANK的结合，B细胞的增殖，及单核细胞的活化，特别是刺激单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌。拮抗剂可通过直接或间接方式作用。例如，使OPGL与OPG或RANK直接结合导致在体外，原位，或体内，部分或完全阻断，抑制，或中和OPGL的一或多种生物活性。所述拮抗剂也可例如，阻断或抑制另一效应子分子，导致间接在体外，原位，或体内，部分或完全阻断，抑制，或中和OPGL的一或多种生物活性。
术语“激动剂”使用其广义含义，包括模拟OPGL或与OPGL功能类似，并优选，在体外，原位，或体内部分或完全增强，刺激或活化OPG或RANK的一或多种生物活性的任何分子。OPGL的这些生物活性举例包括B细胞的增殖和单核细胞的活化，特别是刺激这些单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌。激动剂可通过直接或间接方式作用。例如，激动剂直接结合OPG或RANK，导致受体活化或信号传导，从而在体外，原位，或体内，部分或完全增强，刺激或活化OPG或RANK的一或多种生物活性。所述激动剂也可例如，刺激另一效应子分子，由该分子导致OPG或RANK受体活化或信号传导，从而通过间接作用，在体外，原位，或体内，部分或完全增强，刺激或活化OPG或RANK的一或多种生物活性。
术语“OPGL拮抗剂”指的部分或完全阻断，抑制，或中和OPGL的生物活性的任何分子包括，但不限于OPG受体或RANK受体的可溶形式，如OPG或RANK的胞外结构域序列，OPG受体免疫粘附素，RANK受体免疫粘附素，OPG受体融合蛋白，RANK受体融合蛋白，OPG受体的共价修饰形式，RANK受体的共价修饰形式，OPG变体，RANK变体，OPG受体抗体，RANK受体抗体，及OPGL抗体。为确定OPGL拮抗剂分子是否部分或完全阻断，抑制或中和OPGL的生物活性，可通过试验来评测所述拮抗剂分子对于，例如，OPGL与OPG或RANK的结合，或者对于OPGL的单核细胞活化作用的影响。可在已知的体外或体内试验形式，例如在表达OPG和/或RANK的细胞内进行这种试验。优选，本文描述的方法所用的OPGL拮抗剂能阻断或中和至少一种类型的OPGL活性，其可选用本文描述(及在实施例中)的试验来确定。可选地，在结合试验中与阴性对照分子相比，拮抗剂能使OPGL与OPG或RANK的结合降低或抑制至少50％，优选，至少90％，更优选至少99％，最优选，100％。实施例中，该拮抗剂包含竞争性抑制OPGL与OPG或RANK结合的抗体。通过竞争性抑制确定抗体特异性和亲和力的方法在本领域已知[见例如Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1998)；Colligan等，Current Protocols in Immunology，Green PublishingAssoc.，NY (1992；1993)；Muller，Meth.Enzym.，92：589601(1983)]。
术语“激动剂”指部分或完全增强，刺激或活化OPG或/和RANK的生物活性的任何分子包括，但不限于抗OPG受体抗体和抗RANK受体抗体。为确定RANK激动剂分子是否部分或完全增强，刺激，或活化RANK的生物活性，可通过试验来评测所述激动剂分子对于，例如单核细胞或OPG或RANK转染的细胞的影响。可在已知的体外或体内试验的模式中进行这种试验。优选，本文描述的方法所用的RANK激动剂能增强或活化至少一种类型的RANK活性，其可选由本文所述的试验来确定。优选，所述OPG激动剂或RANK激动剂可分别刺激或活化OPG或RANK而达到OPG或RANK受体的天然配体(OPGL)所能达到的程度。
本文中术语“抗体”是指最广义上的抗体，具体包括例如，可特异性结合OPGL，RANK或OPG的单克隆抗体，具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗体，及抗体的片段。
本文中术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度的特异性，针对单个抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单个表位。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可被合成并不受其它抗体的污染。修饰词“单克隆”表明该抗体的特点，即其来自基本上同质的抗体群，不解释为需通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等(自然，256：495(1975))首先描述的杂交瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(例如见美国专利4816567)。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson等(自然，352：624-628(1991))和Marks等(分子生物学杂志，222：581-597(1991))所述技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其重链和/或轻链的一部分与源自特殊物种或属于特殊抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但所述链的剩余部分的序列与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性)的相应序列相同或同源(美国专利4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院院刊，81：6851-6855(1984))。生产嵌合抗体的方法在本领域已知。
“人源化”型非人(例如小鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’)或抗体的其它抗原结合序列，它们包含非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)中受者的互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体CDR或框架序列中不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。人源化抗体包括PRIMATIZEDTM抗体，其中抗体的抗原结合区可从通过感兴趣抗原免疫接种猕猴制得的抗体中衍生获得。生产人源化抗体的方法在本领域已知。
也能用多种本领域已知的技术，包括噬菌体展示文库来生产人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。也可用Cole等和Boemer等的技术来制备人单克隆抗体。Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boemer等，J.Immunol.，147(1)：8695(1991)。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，Fc段的名称反应了其易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fy”段是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密地非共价连接的一个重链可变区与一个轻链可变区的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半仅含有三个抗原特异性CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整的结合位点相比其亲和力较低。
Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’与Fab的差别在于Fab’在重链CH1的羧基末端多出几个残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基中至少有一个游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段在最初产生为Fab’片段对，在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列而归为两种完全不同的两类(称为κ和λ)中的一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院院刊，90：6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或“对其特异的”的抗体为那种结合到特定多肽或特定多肽的表位上，而基本不结合到任何其它多肽或多肽表位的抗体。
“分离，”当用于描述本文公开的各种蛋白时，是指从蛋白的天然环境的成分中鉴定，分离和/或回收的蛋白。其天然环境中的杂质成分是通常可以干扰对该蛋白的诊断或治疗的物质，可能包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，蛋白可以(1)纯化至足以通过采用转杯式测序仪得到至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)纯化至在非还原或还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质的程度。分离的蛋白包括重组细胞中的原位蛋白，因为所述蛋白的天然环境中的至少一种成分不存在。但是通常，需要通过至少一步纯化步骤制备分离的蛋白。
术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞群起细胞间介质作用的蛋白。这些细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；缪氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的抗ErbB2抗体，和任选的一种化疗剂)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文限定“小分子”具有约500道尔顿以下的分子量。
术语“免疫相关疾病”指一种疾病，其中哺乳动物的免疫系统的一种组分造成，介导或者促进哺乳动物发病。也包括疾病其中免疫应答的刺激或干扰对疾病进展具有改善作用。这个术语中包括的有免疫-介导的炎症，非-免疫-介导的炎症，传染性疾病，免疫缺陷疾病，及肿瘤形成。
术语“T细胞介导疾病”指T细胞直接或间接介导或者促进哺乳动物发病的疾病。该T细胞介导疾病可与如下作用相关：细胞介导作用，淋巴因子介导作用等，以及如果B细胞被例如，T细胞分泌的淋巴因子所刺激，与B细胞相关的作用。
一些为免疫或T细胞介导，可根据本发明来治疗的免疫相关疾病和炎症举例，包括系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，青年期慢性关节炎，椎关节病，系统性硬化症(硬皮病)，自发性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)，斯耶格伦氏综合症，全身性脉管炎，肉状瘤病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症，阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少症(自发性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯氏病，桥本氏甲状腺炎，青年期淋巴细胞甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎，肾小管间质性肾炎)，中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病如多发性硬化症，自发性脱髓鞘多神经病或归-伯二氏综合症，及慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆管疾病如传染性肝炎(肝炎A，B，C，D，E及其它非-亲肝性病毒)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬变，肉芽肿性肝炎，及硬化性胆管炎，炎性肠疾病(溃疡性结肠炎；克朗氏病)，麸质-敏感性肠病，及惠普耳氏病，自身免疫或免疫-介导的皮肤病包括大疱皮肤疾病，多形红斑和接触性皮炎，牛皮癣，变应性疾病如哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，食物过敏反应和风疹，肺部免疫性疾病如嗜酸性肺炎，自发性肺部纤维化及超敏性局限性肺炎，移植相关性疾病包括移植排斥和移植物抗宿主疾病。传染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)，肝炎A，B，C，D，和E，疱疹等，细菌感染，真菌感染，原虫感染和寄生虫感染。
术语“有效量”为可导致达到特定叙述目的OPGL多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。该OPGL多肽或激动剂或拮抗剂的“有效量”可用经验来确定。而且，“治疗有效量”为有效达到所述治疗作用的OPGL多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。这个量也可用经验来确定。
本文所用术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。
“化疗剂”是在肿瘤治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)；环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin，洋红霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxoid(taxanes)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。
本文中“生长抑制剂”是指在体内或体外抑制细胞生长，尤其抑制表达ErbB的癌症细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期ErbB表达细胞百分比的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除S期以外的某个阶段)进展的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)，taxoid(taxane)和topo II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊甙(etoposide)和博来霉素等。那些使G1期停滞的药物还连带(spill over)使S期停滞，例如DNA烷化剂象他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥(machlorethamine)、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。详见《(癌症的分子基础》Mendelsohn和Israel编，第一章，Murakami等的题为“细胞周期的调节、癌基因和抗肿瘤药”的文章(WB Saunders：Philadephia，1995)，尤其见13页。4D5抗体(和其功能性等同物)也可用于此目的。
术语“单核细胞”指被限定为具有分化为停留(resident)巨噬细胞的单核细胞的潜力的哺乳动物细胞。本文所用术语单核细胞就一般意义可包括但不限于成单核细胞和前单核细胞。单核细胞通常为II类MHC细胞并且通常表达本领域已知的标记物如CD14，CD62，CD32，和CD16。单核细胞通常在体内的血液和骨髓循环。单核细胞可能作用于，例如，噬菌作用，抗原呈递，和分子象金属蛋白酶，氧化氮，和某些趋化因子的分泌。
“治疗”指治愈性治疗以及预防性或防止性措施。
“慢性”给药指以与急性方式相反的连续方式给药所述制剂，从而在更长的时间内维持最初的治疗效果。“间歇”给药是指本质上的循环治疗而不是无间断地连续治疗。
与一种或多种其它治疗药物“联合”给药包括同时(并行)给药和任何顺序的连续给药。
本文中“载体”包括可药用载体，赋形剂或稳定剂，它们所使用的剂量和浓度条件下对暴露于其中的细胞和哺乳动物无毒性作用。通常可药用载体是pH缓冲水溶液。可药用载体的实例包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽(小于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
需要治疗的“哺乳动物”是指哺乳类任何动物，包括人、家禽、农用动物，和动物园、运动项目用的动物或宠物，如犬、马、猫、牛等。优选哺乳动物是人。
II.方法和材料
申请人已经意外地发现OPG配体可以活化单核细胞来分泌各种细胞因子与趋化因子。哺乳动物细胞，如单核细胞暴露于有效量的OPG配体，或模拟OPG配体活性的激动剂分子对各种应用都有用。例如，细胞因子如IL-1，IL-6，IL-8，IL-12，MIP-1α，或TNF-α的分泌增加对炎症前用途，特别是体内治疗感染(如寄生虫感染或微生物感染)是有用的。细胞因子如IL-1，IL-6，IL-8，IL-12，MIP-1α或TNF-α的分泌增加可能也对增强的T细胞活化，天然杀伤(NK)细胞或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的活化有用。这些细胞因子的分泌增加还发现对癌症治疗起辅助抑制或降低肿瘤生长的作用。
OPG配体活性的抑制或中和也可用于本文描述的应用拮抗剂分子的方法。抑制或降低这些细胞因子或趋化因子分泌的拮抗剂分子在治疗如下疾病中是可用的：如自身免疫病，类风湿性关节炎，胰岛素依赖性糖尿病，骨关节炎，炎性肠疾病(如溃疡性结肠炎或科隆氏病)，牛皮癣，移植物排斥或变态反应应答。
A.材料
用于本方法的OPGL多肽包括，但不限于，可溶形式的OPGL，含有OPGL的融合蛋白，共价修饰形式的OPGL，和OPGL变体。也可应用拮抗剂或激动剂分子。可用于生产这些组合物的多种技术见下述。
通常地，本发明的组合物可用本领域已知的重组技术来制备。以下说明书涉及生产这种多肽所用的方法，该法为培养用含有编码核酸的载体转化或转染的宿主细胞并从该细胞培养物回收所述多肽。(见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995))。
编码所需多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)可被插入一复制载体以进一步克隆(DNA复制)或表达。公开可得多种载体。该载体成分通常包括但不限于下述的一或多种：信号序列，复制起始点，一或多种标记基因，增强子元件，启动子，及转录终止序列，其中每个均见下述。可应用的可选信号序列，复制起始点，标记基因，增强子元件，启动子，及转录终止序列在本领域已知并进一步在WO97/25428中具体描述。
表达和克隆载体经常包含被宿主生物识别并被可操纵连接到编码核酸序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码(5′)上游(通常在约100-1000碱基)的不翻译序列，它们控制着与其操纵性相连的特定核酸序列的转录和翻译。这些启动子通常分为两类，可诱导的和组成的(constitutive)。可诱导启动子为在它们自身控制下引起DNA转录水平升高的启动子，其控制是对应于一些培养条件的改变，例如营养物的存在或缺乏或温度的改变。众所周知此时大量启动子被各种潜在的宿主细胞识别。通过用限制性酶切将启动子从来源DNA去除并将分离的启动子序列插入到载体中，这些启动子被可操纵性连接到编码DNA。
适宜用于原核生物和真核生物宿主的启动子在本领域已知，并在WO97/25428中详述。
包含一或多种上述成分的适宜载体的构建应用了标准连接技术。对分离的质粒或DNA片段剪接，续尾(tailored)，并以需要的形式重连接以形成所需的载体。为分析以确定所构建质粒的正确序列，该连接混合物可用于转化E.coli K12菌株294(ATCC 31,446)，并用适宜的氨苄青霉素和四环素抗性选择成功的转化子。从转化子制备质粒，用限制性内切酶消化来分析，和/或用本领域已知的标准技术测序。[见例如Messing等，Nucleic Acids Res.，9：309(1981)；Maxam等，Methods in Enzymology，65：499(1980)]。
可用在哺乳动物细胞内提供编码DNA的瞬时表达的表达载体。通常，瞬时表达包括应用能在宿主细胞有效复制的表达载体，从而该宿主细胞可积累很多所述表达载体的拷贝并且顺序合成为表达载体所编码的高水平的所需多肽[Sambrook等，见上文]。包含适宜表达载体及宿主细胞的瞬时表达系统，可方便地阳性鉴定被克隆DNAs编码的多肽，并迅速筛选具有所需生物或生理特性的多肽。
适宜在重组脊椎动物细胞培养物中合成所需多肽的其它方法，载体，及宿主细胞在Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058被描述。
在本文载体中克隆或表达DNA的适宜宿主细胞包括原核生物细胞，酵母细胞，或更高等真核生物细胞。适宜这个目的的原核生物细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠细菌如大肠杆菌，例如E.coli，肠杆菌，欧氏杆菌，克雷伯氏杆菌，变形杆菌，沙门氏菌，例如伤寒沙门氏杆菌，沙雷氏菌，例如粘质沙雷氏菌，及志贺氏菌，以及杆菌如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如公布于DD 266,710公开于12 April1989的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌。优选，所述宿主细胞应分泌基本量的蛋白水解酶。
除了原核生物细胞，真核微生物如丝状真菌或酵母是载体的适宜克隆或表达宿主。表达糖基化多肽的适宜宿主细胞源自多细胞生物。所有这些宿主细胞举例又见WO97/25428所述。
用上述表达或克隆载体转染，优选转化宿主细胞并在适当改良的营养培养基中培养以诱导启动子，选择转化子，或扩增编码所需序列的基因。
转染指表达载体被宿主细胞吸收，无论事实上是否表达了任何编码序列。本领域一般技术人员已知多种转染的方法，例如，磷酸钙和电穿孔。通常，成功的转染在操作该载体的任何指征出现在该宿主细胞内时可予以识别。
转化指将DNA引入生物从而该DNA作为染色体外元件或染色体整合体复制。基于所用宿主细胞，可用对这些细胞适宜的标准技术来转化。应用了氯化钙的钙处理(如Sambrook等，见上文所述)，或电穿孔通常被用于包含坚固细胞壁屏障的原核生物细胞或其它细胞。如Shaw等，Gene，23：315(1983)和公开于29 June 1989的WO 89/05859所述，用根瘤土壤杆菌来感染可用于某些植物细胞的转化。而且，如公开于10 January 1991的WO91/00358所述，可用超声处理来转染植物。
对无细胞壁的哺乳动物细胞，可用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的大体方面已被U.S.Pat.No.4,399,216描述。通常进行酵母的转化是基于Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法。然而也可用其它将DNA引入细胞的方法，如核微注射，电穿孔，细菌原生质体与完整细胞融合，或聚阳离子，例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)，polyomithine。对于多种转化哺乳动物细胞的技术，见Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
如(Sambrook等，见上文)一般所述，原核生物细胞可在适宜培养基中培养。商品化培养基举例包括Ham′s F10(Sigma)，基本必需培养基(″MEM″，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，及Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(″DMEM″，Sigma)。任何此培养基都可根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GentamycinTM-drug)，微量元素(限定为通常终浓度在微摩尔范围的无机化合物)，及葡萄糖或同等能量来源。也可包括适宜浓度的任何本领域技术人员已知的其它必需的补充物。所述培养情况，如温度，pH，等等，是以前选择表达的宿主细胞所用的，而且对于本领域技术人员是显而易见的。
一般而言，最大化哺乳动物细胞培养物的生产力的原理，方案和实用技术可见Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)。
所述表达多肽可从培养基中作为分泌多肽回收，尽管当其无分泌信号直接生成时，也可从宿主细胞裂解物中回收。如果该多肽是膜结合的，可用适宜的去污剂溶液(例如Triton-X 100)使它从膜上释放或可用酶剪切来释放其胞外区。
当所述多肽在重组细胞而不是人类来源的细胞中生成时，其不具有人源的蛋白或多肽。然而，通常必须从重组细胞蛋白或多肽回收或纯化多肽以得到基本均质的制品。第一步，离心所述培养基或裂解物以去除粒状细胞沉淀。之后是适宜纯化步骤的步骤举例：在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸胺沉淀；胶过滤，例如用Sephadex G-75；和蛋白A琼脂糖凝胶柱来回收污染物如IgG。
本发明还考虑应用OPGL变体(或OPG变体或RANK变体)。可用任何本领域适宜技术来制备这些变体。可通过将适宜核苷酸变化引入配体的(或受体的)DNA，和/或通过合成所需多肽来制备所述变体。本领域技术人员会发现氨基酸改变可改变所述配体或受体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特性。
本文所述的天然序列或所述配体(或受体)的多个结构域的变异，可用例如，在美国专利5,364,934所指出的任何保守和非保守突变的技术和指导来制备。变异可为一或多种编码配体或受体的密码子的替代，缺失或插入，与各自的天然序列(见本文各自的图)比较，此种变异会导致配体或受体的氨基酸序变化。可选此变异是通过在所述配体或受体的一或多个结构域中的至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。确定可插入，替代或缺失何种氨基酸残基而不逆向影响所需活性，此指导见于将所述配体或受体与同源的已知蛋白分子的序列比较并最小化在高度同源区的氨基酸序列改变的数量。氨基酸替代可为用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸替换一个氨基酸，如用丝氨酸替换亮氨酸，即保守氨基酸替换。插入或缺失可选在大约1-5氨基酸的范围。确定允许的变异可通过序列中系统产生的氨基酸的插入，缺失或替代并检测所得变体的为全长或成熟天然序列所显示的活性。
本文提供OPGL多肽或受体片段。此片段可在N-末端或C-末端被截短，或例如，当与全长天然蛋白比较时会缺少内在残基。某些片段缺少对所述配体或受体多肽所需生物活性并非必需的氨基酸残基。
OPGL或受体片段可用多种常用技术中的任何一种来制备。所需多肽片段可用化学合成。替代途径包括用酶消化来生产片段，例如，用已知在特定的氨基酸残基所限定的位点剪切蛋白的酶处理蛋白，或用适宜限制性酶消化所述DNA并分离所需片段。而另一适宜技术包括分离并用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。在PCR中的5’和3’引物应用限定DNA片段所需末端的寡核苷酸。
在具体实施方案中，所需保守替换见在优选替换的标题下的表1。如果所述替换造成生物活性的变化，那么可引入更多的基本变化，表1中所命名的举例替换，或如下所述参照氨基酸分类，并筛选产物。
表1
原残基         举例替代                                优选替代
丙氨酸(A)      缬氨酸；亮氨酸；异亮氨酸                缬氨酸
精氨酸(R)      赖氨酸；谷氨酰胺；天冬酰胺              赖氨酸
天冬酰胺(N)    谷氨酰胺；组氨酸；赖氨酸；精氨酸        谷氨酰胺
天冬氨酸(D)    谷氨酸                                  谷氨酸
半胱氨酸(C)    丝氨酸；                                丝氨酸
谷氨酰胺(Q)    天冬酰胺                                天冬酰胺
甘氨酸(E)      脯氨酸；丙氨酸                          丙氨酸
组氨酸(H)      天冬酰胺；谷氨酰胺；赖氨酸；精氨酸      精氨酸
异亮氨酸(I)    亮氨酸；缬氨酸；甲硫氨酸；丙氨酸；苯    亮氨酸
               丙氨酸；正亮氨酸
亮氨酸(L)      正亮氨酸；异亮氨酸；缬氨酸；甲硫氨酸；异亮氨酸
               丙氨酸；苯丙氨酸
赖氨酸(K)      精氨酸；谷氨酰胺；天冬酰胺              精氨酸
甲硫氨酸(M)    亮氨酸；苯丙氨酸；异亮氨酸              亮氨酸
苯丙氨酸(F)    亮氨酸；缬氨酸；异亮氨酸；丙氨酸；酪    亮氨酸
               氨酸
脯氨酸(P)      丙氨酸                                  丙氨酸
丝氨酸(S)      苏氨酸                                  苏氨酸
苏氨酸(T)      丝氨酸                                  丝氨酸
色氨酸(W)      酪氨酸；苯丙氨酸                        酪氨酸
酪氨酸(Y)      色氨酸；苯丙氨酸；苏氨酸；丝氨酸        苯丙氨酸
缬氨酸(V)      异亮氨酸；亮氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；  亮氨酸
               丙氨酸；正亮氨酸
所述配体或受体多肽功能或免疫同一性的基本修饰可通过选择它们在保持如下效应上显著不同的替换来实现，所述效应为(a)在替代区域的多肽骨架的结构，例如，为片状或螺旋状构型，(b)分子在靶位点的电荷或亲疏水性，或(c)侧链的体积。自然生成的残基基于共同侧链性质分为以下组：
(1)  疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；
(2)  中性亲水性：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；
(3)  酸性：天冬氨酸，谷氨酸；
(4)  碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；
(5)  影响侧链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸；和
(6)  芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守性替换必需将这些组之一的一成员交换为另一组的成员。此种替换残基也可被引入保守替换位点或，更优选，引入剩余的(非保守)位点。
可用本领域已知的方法产生所述变异，如寡核苷酸-介导的(定点的)诱变，丙氨酸扫描，和PCR诱变。可在克隆的DNA上进行定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]，盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]，限制性选择诱变[Well etal.，Philos.Treans.R.Soc.London serA，317：415(1986)]或其他已知技术来生产变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用于鉴定在邻接序列上的一或多种氨基酸。在优选的扫描氨基酸中是相当小的中性氨基酸。此种氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸为这组中典型的优选扫描氨基酸，因为它去掉了β-碳以上(beyond)的侧链并且较不可能改变变体的主链构型[Cunningham and Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。丙氨酸也被典型优选因为它是最常见的氨基酸。而且，它经常被发现于包埋和暴露位置[Creighton，The Proteins，(W H.Freeman & Co.，N.Y)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸替换不产生足够量的变体，可用一种电子等排的氨基酸。
OPGL或受体的可溶形式也可被用于本发明的方法。此种OPGL或受体的可溶形式可包含或由各自配体或受体的胞外结构域组成(而且缺乏跨膜和胞内结构域)。所述胞外结构域序列自身可被应用，或可如下被进一步修饰(如通过融合于免疫球蛋白，表位标签或亮氨酸拉链)。某些OPGL，OPG和RANK的胞外结构域区已在文献中被描述，并可用本领域技术人员已知技术进一步被描绘出来。可选地，本法所用OPG配体包括具有表1B(SEQ IDNO：1)氨基酸残基70-317或75-316的邻接序列的多肽。可选地，本法所用OPG受体包括具有表2B(SEQ ID NO：3)氨基酸残基22-401的邻接序列的多肽。可选地，本法所用RANK受体包括具有表3B(SEQ ID NO：5)氨基酸残基29-212的邻接序列的多肽。那些本领域技术人员将能够不需不当实验法来选择应用所需的胞外结构域。具有所需生物活性的OPGL的胞外结构域序列举例见下面实施例部分所述。
在另一实施方案中，可通过将所述多肽与多种非蛋白质性多聚体之一，例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧化烯，以U.S.Patent Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337提出的方式相连来共价修饰所述OPG或受体。所述多肽的pegylated形式可用本领域已知技术来制备。可选地，可通过将所述多肽与一或多种多聚谷氨酸分子相连来对所述OPGL或受体进行共价修饰。
这些分子的亮氨酸拉链形式也在本发明中被考虑。“亮氨酸拉链”为本领域所用术语，它指增强，提高或使得其融合配偶体二聚化或三聚化的亮氨酸富集序列(例如，所述亮氨酸拉链融合或连接的序列或分子)。多个亮氨酸拉链多肽在本领域已述。见例如，Landschulz等，Science，240：1759(1988)；US Patent 5,716,805；WO 94/10308；Hoppe等，FEBS Letters，344：1991(1994)；Maniatis等，Nature，341：24(1989)。那些本领域技术人员会认识到亮氨酸拉链序列可融合到多肽分子的3’或5’末端。
本发明OPGL或受体多肽也可用通过将该多肽与另一异源多肽或氨基酸序列融合形成嵌合分子的方式被修饰。优选，所述异源多肽或氨基酸序列为起寡聚化所述嵌合分子的作用的多肽或氨基酸序列。在实施方案中，此嵌合分子包含了OPGL多肽与提供了抗-标签抗体选择性结合的表位的标签多肽的融合物。所述表位标签一般被置于受体多肽的氨基-或羧基-末端。可用抗标签多肽的抗体来检测该受体的表位-标签形式的存在。除此之外，提供表位标签使得受体可容易地用亲和纯化法来纯化，所述亲和纯化法使用的是抗-标签抗体或其它种类的结合表位标签的亲和基质。多种标签多肽和它们各自的抗体在本领域已知。举例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；flu HA标签多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.细胞.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标签及其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10[Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它标签多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。
本文方法还可用免疫粘附素分子。受体免疫粘附素可包含多种OPG受体或RANK受体的形式，如全长多肽以及包含所述胞外结构域(ECD)序列或ECD序列的片段的受体的可溶形式。在实施方案中，所述分子可包括OPG受体或RANK受体与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物，对于免疫粘附素的二价形式，该融合物可针对IgG分子的Fc区。Ig融合物优选包括用受体多肽的可溶形式(缺失或灭活的跨膜结构域)来替代Ig分子的至少一个可变区。在特别优选的实施方案中，所述免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链，CH2和CH3区，或铰链，CH1，CH2和CH3区。免疫球蛋白融合物的生产也见US Patent No.5,428,130发表于June 27,1995和Chamow等，TIBTECH，14：52-60(1996)。
可选地，免疫粘附素将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的Fc区结合。通常，当制备本发明免疫粘附素时，编码粘附素结合结构域的核酸可被C-末端融合到编码免疫球蛋白恒定区序列的N-末端的核酸上。然而，N-末端融合也是可能的。
通常，在所述融合中，所编码的嵌合多肽会保留至少具有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区的铰链，CH2和CH3区。也可产生与恒定区Fc部分的C-末端，或重链CH1的临近N-末端或轻链的对应区域的融合物。融合所在的精确位置是不严格的；特别的位点是众所周知的并可选以最优化免疫粘附素的生物活性，分泌或结合特性。
在优选方案中，将粘附素序列融合到免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的N-末端。可将整个重链恒定区融合到粘附素序列。然而，更优选的是，在融合物中应用开始于铰链区，刚好位于化学限定IgG Fc的木瓜蛋白酶剪切位点上游的序列(例如，将重链恒定区的第一个残基作为114的残基216)或其它免疫球蛋白的类似位点。在特别优选实施方案中，将所述粘附素氨基酸序列融合到IgG重链的(a)铰链，CH2和CH3区，或(b)铰链，CH1，CH2和CH3区。
对于双特异性免疫粘附素，该免疫粘附素作为多聚体，特别作为异源二聚体或异源四聚体组装。一般，这些组装的免疫球蛋白会具有已知的单位结构。基本的四链结构单位是IgG，IgD和IgE存在的形式。在较高分子量的免疫球蛋白中重复一种四链单位；IgM通常以四个基本单位通过二硫键抱团的五聚体存在。IgA球蛋白，偶尔是IgG球蛋白，也会以血清中的多聚体形式存在。在多聚体情况下，每个四单位可相同或不同。
本文范围内多个举例组装的免疫粘附素见如下图表示意：
(a)ACL-ACL；
(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；
(c)ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH，或VLCL-VHCH)；
(d)ACL-VHCH-(ACH，或ACL-VHCH，VLCL-ACH)；
(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；和
(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，
其中每个A代表同一或不同的粘附素氨基酸序列；
VL为免疫球蛋白轻链可变区；
VH为免疫球蛋白重链可变区；
CL为免疫球蛋白轻链恒定区；
CH为免疫球蛋白重链恒定区；
N为大于1的整数；
Y命名的是共价交联剂的残基。
为简短起见，前述结构只表现出主要性质；它们不表示免疫球蛋白的连接区(J)或其它结构域，也不显示二硫键。然而，所述结构域将被构建在结合功能所需要的位置，以出现在免疫球蛋白分子上它们所占据的一般位置。
可选地，该粘附素序列可被插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，因而可获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在此实施方案中，所述粘附素序列被融合到免疫球蛋白每条臂上的免疫球蛋白重链的3’末端，或者在铰链和CH2结构域之间，或者在CH2和CH3结构域中间。相似构型已被Hoogenboom等，Mol.Immunol.，28：1027-1037(1991)报道。
尽管本发明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白轻链的存在，免疫球蛋白轻链可以共价连接到粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽，或直接融合到粘附素的方式存在。在前者的情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。一旦分泌，杂交重链和轻链可共价连接以提供包含两个双硫-连接的免疫球蛋白重链-轻链对的类免疫球蛋白结构。适合制备此种结构的方法，在例如美国专利4,816,567(发表于28 March 1989)中公开。
通过将编码框内粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列融合来非常方便地构建免疫粘附素。然而，也可用与基因组免疫球蛋白片段的融合(见例如，Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等，Cell，66：1133-1144(1991))。融合物的后一种类型需要Ig表达调控序列的存在。基于源自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的公布序列，用杂交或聚合酶链式反应(PCR)技术，分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”的cDNA和免疫粘附素的免疫球蛋白部分随机插入在所选宿主细胞指导有效表达的质粒载体。
所述可溶ECD序列举例包括，包含表2B所示OPG受体序列的氨基酸22到401的多肽。可基于任何本领域所述方法生产所述OPG受体受体免疫粘附素。
可类似构建RANK受体免疫粘附素。构建RANK受体免疫粘附素所用的可溶ECD序列举例可包括，包含表3B所示RANK序列氨基酸29到212的多肽。
抗OPGL抗体，抗OPG受体抗体，或抗RANK受体抗体，也可用于现在公开的方法。这些分子举例包括中和或阻遏优选抑制OPGL与OPG或RANK受体结合的抗体。该抗OPGL抗体，抗OPG，或抗RANK抗体可为单克隆抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术，如那些为Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)所述的技术来制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫大鼠，仓鼠，或其它宿主动物来引出(elicit)生产或能生产特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。
免疫剂通常包括OPG或RANK多肽，或OPGL多肽，或其融合蛋白。一般，如果需要人源细胞就用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物的来源就用脾细胞或淋巴结细胞。然后用适宜的融合剂，如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖的细胞系融合，以形成杂交瘤细胞[Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103]。无限增殖细胞系通常转化哺乳动物细胞，特别是啮齿类，牛和人源的骨髓瘤细胞。通常应用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适宜培养基，优选包含一或多种抑制未融合，无限增殖细胞的生长或存活的物质，中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲代细胞缺乏酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选无限增殖细胞系为那些有效融合，支持选择性抗体生成细胞的稳定高水平抗体表达，并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞系。更优选的无限增殖细胞系为鼠骨髓瘤细胞系，它可从例如，Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California和the American Type CultureCollection，Manassas，Virginia获得。用于人单克隆抗体生产的人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Moneclonal Antibody Production Techniques and Applications，MarcelDekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63]描述。
可检测杂交瘤细胞所培养的培养基，抗OPGL，OPG或RANK单克隆抗体的存在。优选，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。此技术和试验在本领域已知。所述单克隆抗体的结合亲和力可，例如用Munson和Poilard，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析。可选地，如在结合试验中所确定，抗OPGL，抗OPG，或抗RANK抗体将对各自的受体或配体有结合至少10nM，优选，至少5nM，更优选，至少1nM的亲和力。
在所需杂交瘤细胞被鉴定出来后，所述克隆可用限制性稀释方法被亚克隆并用标准方法[Goding，见上文]使其生长。为此目的的适宜培养基包括，例如，Dulbecco′s改良Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。可选地，所述杂交瘤细胞可作为哺乳动物腹水在体内生长。
亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典免疫球蛋白纯化方法如，例如，蛋白A-Sepharose凝胶，羟化磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析从培养基或腹水分离或纯化。
所述单克隆抗体也可用重组DNA方法，如在美国专利4,816,567所述的那些方法来生产。编码本发明单克隆抗体的DNA可容易地用常用方法(例如，用能特异结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)被分离并测序。本发明杂交瘤细胞作为此DNA的优选来源。一旦分离，该DNA可被置入转染到宿主细胞的表达载体中从而在重组宿主细胞中得到单克隆抗体的合成。所述宿主细胞为例如猿猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成免疫球蛋白蛋白的骨髓瘤细胞。所述DNA也可被如下修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列来替换同源鼠序列的编码序列[美国专利4,816,567；Morrison等，见上文]，或通过将全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列。这些非免疫球蛋白多肽可用于替换本发明抗体恒定区，或可用于替换本发明抗体的抗原-结合位点可变区，从而产生嵌合的二价抗体。
所述抗体可为单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域众所周知。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达的方法。一般在Fc区的任何点截短该重链以避免重链交联。可选地，相关的半胱氨酸残基被另外的氨基酸残基替换或缺失以避免交联。
体外方法也适宜制备单价抗体。可用本领域已知的常规技术来完成抗体消化以生成其片段，特别是，Fab片段。
另一实施方案中，抗体或抗体片段可用在McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术从抗体噬菌体文库分离来制备。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。后来的公开文献描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))的高亲和力(nM范围)人抗体的生产，以及作为构建很大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))机制的结合感染和体内重组。因而，这些技术成为分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代。
所述DNA也可被如下修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列来替换同源鼠序列的编码序列(美国专利4,816,567；Morrison，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将全部或部分编码非免疫球蛋白多肽的序列共价连接到免疫球蛋白编码序列。
通常这些非免疫球蛋白多肽被用于替换抗体的恒定区，或它们被用于替换抗体的抗原结合位点可变区，从而生产嵌合二价抗体，该二价抗体包括一个对抗原具有特异性的抗原-结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
人源化抗体具有一或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它通常来自一个“输入”可变区。人源化基本可用Winter及其合作者的方法(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDRs或CDR序列替换人抗体的对应序列来进行。相应地，此种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上并不完整的人可变区已被非人种类的对应序列替换。实施中，人源化抗体通常为其中的一些CDR残基及一些可能的FR残基被啮齿动物抗体的类似位点的残基所替换的人抗体。
选择生产人源化抗体的人轻链和重链可变区对降低抗原性是非常重要的。根据所谓“最适”方法，用啮齿动物抗体的可变区序列筛选已知人可变区序列的完整文库。之后与啮齿动物最近的人序列就被接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一方法是用特定的框架，该框架源自一特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列。相同框架可被用于多个不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.，151：2623(1993))。
更重要的是对抗体人源化可保持对抗原的高亲和性和其它有利的生物性质。为达到此目的，根据优选方法，人源化抗体是用使用亲代和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和多种概念化人源化产物的方法来制备的。三维免疫球蛋白模型普遍可得而且对于那些本领域技术人员是熟悉的。说明并显示了选择性待选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。检查这些显示可分析残基在待选免疫球蛋白序列功能中可能的作用，即，分析残基对待选免疫球蛋白结合到其抗原的能力的影响。从这个方面讲，来自受者和插入序列的FR残基可被选择并结合从而得到所需抗体性质，如对靶抗原提高的亲和性。一般，所述CDR残基可直接而且基本参与影响抗原的结合。
可选地，现在在内源性免疫球蛋白生产缺乏时，生成转基因动物(例如小鼠)是可能的，该动物经免疫可生产全部人抗体的组成成分。例如，已述在嵌合和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)的纯合缺失会造成内源抗体生成的完全抑制。在此种系突变小鼠体内转移人种系免疫球蛋白基因排列的会造成对应于抗原攻击的人抗体的产生。见例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等，Nature，355：258(1992)。人抗体也可源自噬菌体-展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech，14：309(1996))。
B.配制剂
本文描述的OPGL多肽(或激动剂或拮抗剂)优选在载体中应用。适宜载体和它们的制剂在Osol等编辑的，Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thed.，1980，Mack Publishing Co.，中描述。通常，在载体中用适量的可药用盐以使制剂等渗。这些载体举例包括盐水，林格溶液和右旋葡萄糖溶液。所述溶液的pH优选从大约5到大约8，更优选从大约7.4到大约7.8。对本领域专业人员显而易见的是某些载体可能会更优选基于，例如，给药途径和所给药的制剂的浓度。所述载体可以冻干制剂或水溶液的形式。
可接受的载体，赋形剂或稳定剂优选以所应用剂量和浓度对细胞和/或受体无毒，并包括缓冲液如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸，抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸，防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化乙烷双铵；苯扎氯铵，苯索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白，凝胶，或免疫球蛋白；亲水性多聚体如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖，和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述OPGL(或激动剂或拮抗剂)也可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，分别在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳状液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
本文配制剂也可根据具体情况需要而包含一种以上化合物，优选活性互补但相互无副作用的那些。因而，本发明预计将OPGL(或激动剂或拮抗剂)与一或多种其它治疗剂结合，该治疗剂是基于治疗的特定指征。当该制剂可为内分泌剂如GH，GHRP，GHRH，GH促分泌素，IGFBP，ALS，与GHBP络合的GH，它可选为细胞毒性剂。例如，所述OPGL(或激动剂或拮抗剂)可与另一肽(或多价抗体)共同给药，单价或二价抗体(或抗体)，化疗剂(包括化疗剂混合液)，其它细胞毒性剂，抗血管生成剂，细胞因子，和/或生长抑制剂。其中所述制剂诱导细胞凋亡，它可能特别需要将肽与一或多种其它也诱导细胞凋亡的治疗剂结合。例如，它可与抗B胞表面抗原(例如RITUXAN，ZEVALIN或BEXXAR抗CD20抗体)的前-凋亡抗体(例如二价或多价抗体)和/或与(1)凋亡前抗体(例如，针对TNF受体超家族的受体的二价或多价抗体，如抗DR4或抗DR5抗体)或(2)细胞因子TNF家族的细胞因子(例如Apo2L)结合。同样，它可能与单独的抗ErbB抗体(例如HERCEPTIN抗HER2抗体)一起给药或/和(1)和/或(2)结合给药。可选地，或另外，病人可接受结合的放射治疗(例如用放射性标记剂，如抗体，的外来光线辐射或治疗)，卵巢切除，化学或手术，或高剂量化疗与骨髓移植或外周血干细胞拯救或移植。上述结合治疗包括结合给药(其中两剂或多剂被包括在相同或分别的制剂中)，和分别给药，其中OPGL(或激动剂或拮抗剂)给药可出现在给药附属治疗或治疗之前和/或之后。此种其它制剂的有效量取决于配制剂中OPGL(或激动剂或拮抗剂)的量，疾病或治疗类型，以及其它上述因素。一般以相同剂量和如上所用的给药途径或迄今所用剂量的大约1-99％来应用。
用于体内给药的制剂应为无菌的。这可以通过滤除菌滤膜而轻易实现。
可制备持续释放的配制剂。持续-释放配制剂适宜举例包括固体疏水性多聚体的半渗透性基质，该基质是以成型颗粒的形式，例如薄膜，或微胶囊。持续释放基质举例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(异丁烯酸-2-羟基乙酯)，或聚乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚体，非降解的乙烯乙酸乙酯(ethylene-vinyl acetate)，降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(可注射的微球，由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成)，及聚-D(-)-3-羟丁酸。多聚体如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸使得分子释放超过100天，而某些水凝胶则释放蛋白较短的时间段。
C.治疗模式
本文描述的OPGL(或激动剂或拮抗剂)分子可用于治疗各种病理情况，如免疫相关疾病。这些情况中的某些可通过给药本文描述的OPGL或激动剂分子来刺激哺乳动物单核细胞分泌一或多种细胞因子或趋化因子来治疗。其它类型的免疫相关情况可用本文所述的拮抗剂分子来治疗以抑制或中和单核细胞分泌这些细胞因子或趋化因子。
熟练操作者可做处于本文所述各种病理情况的哺乳动物的诊断。本领域已存在，例如可在哺乳动物诊断或检测免疫相关疾病的诊断技术。对于系统性红斑狼疮，疾病的中心介质为针对自身蛋白/组织的自体-反应性抗体的产生和后来免疫-介导的炎症的发生。多个器官和系统受到临床影响包括肾，肺，肌骨骼(musculoskeletal)系统，粘膜与皮肤，眼，中枢神经系统，心血管系统，胃肠道骨髓和血液。
类风湿性关节炎(RA)为主要涉及多关节滑膜，并伴有其结果为关节软骨损伤的慢性系统性自身免疫炎症。其发病机理为T淋巴细胞依赖性而且与类风湿因子，针对自体IgG的自身抗体的生产相关，结果形成了在关节液和血液中达到高水平的免疫复合物。这些关节内复合物可诱导淋巴细胞和单核细胞向滑膜的明显浸润及其后的明显滑膜改变；如果被类似细胞浸润，关节间隔/液会进入大量中性粒细胞。受影响组织主要为关节，通常是以对称方式。然而，关节外疾病也会以两种主要形式出现。一种形式为伴有进行性关节疾病及肺部纤维化的典型损害，脉管炎，及皮肤溃疡的关节外损害的发展。关节外疾病的第二种形式为所谓的费尔提氏综合症，该病在RA病程中出现得晚，有时在关节病静止后，还涉及嗜中性白血球减少症，血小板减少症和脾肿大的存在。这可伴随有多器官的脉管炎及梗塞，皮肤溃疡和坏疽的形成。病人通常也在病变关节其上的皮下组织发育(develop)类风湿结节；结节的后期具有为浸润的混合炎症细胞包绕的坏死中心。其它在RA出现的现象包括：心包炎，胸膜炎，冠状动脉炎，有肺部纤维化的间质性肺炎，干性角膜结膜炎，和类风湿结节。
青年期慢性关节炎为通常开始于小于16岁的慢性自发性炎症。它的表型与RA有一些类似；一些类风湿因子阳性的病人被分类为青年期类风湿关节炎。该疾病被亚分类为三个主要种类：少关节型，多关节型，及全身型。此种关节炎可为严重的并通常为破坏性的还造成关节强硬并延缓生长。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变性病。
椎关节病为具有一些共同临床特征并与HLA-B27基因产物的表达共同相关的一组病症。所述病症包括：关节强直性脊椎炎，赖特尔氏综合症(反应性关节炎)，关节炎相关性炎性肠疾病，脊椎炎相关性牛皮癣，青年期起始椎关节病和未分化椎关节病。区别特征包括伴有或无脊椎炎的骶骨关节病；炎性非对称关节炎；与HLA-B27(I类MHC的HLA-B基因座的血清限定的等位基因)相关；眼部炎症，及其它类风湿疾病相关的自身抗体缺乏。常被暗示为诱导该疾病的关键的细胞是CD8+T淋巴细胞，一种靶向通过I类MHC分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可与I类MHC等位基因HLA-B27反应，如同它是I类MHC分子所表达的外源肽。现已假设HLA-B27的表位可模拟细菌或其它微生物抗原表位从而诱导CD8+T细胞应答。
系统性硬化症(硬皮病)的病因学未知。该疾病的特点是皮肤的硬化；可能这是通过活动性炎症过程来诱导的。硬化症可为局限的或全身的；血管损伤是常见的而且微脉管系统的内皮细胞损伤是系统性硬化症发展中早期并且重要的事件；血管损伤可能是免疫介导的。通过在很多病人存在的单核细胞在皮肤损伤浸润及存在的抗核抗体暗示了免疫学基础。ICAM-1通常在位于皮肤损伤的成纤维细胞的细胞表面被上调，这表明T细胞与这些细胞的相互作用可能在发病机制中起作用。其它参与的器官包括：胃肠道：导致异常蠕动/运动的平滑肌萎缩和纤维化；肾：影响弓状和小叶间小(smallarcuate and interlobular)动脉结果降低了肾皮质血流的同心内皮下血管内膜组织(concentric subendothelial intimal)增生，可造成蛋白尿，氮质血症及高血压；骨骼肌：萎缩，间质性纤维化；炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；及心脏：收缩带坏疽，瘢痕/纤维化。
自发性炎症肌病包括皮肌炎，多肌炎和其它为未知病因学导致肌肉虚弱的慢性肌肉炎症的病症。肌肉损伤/炎症通常是对称和进行性的。自身抗体与多数形式相关。这些肌炎特异性自身抗体是针对并抑制参与蛋白合成的成分，蛋白和RNA的功能。
斯耶格伦氏综合症是起因于免疫介导的炎症及后来的泪腺和唾液腺功能性破坏。该疾病可与炎性结缔组织疾病相关或伴发。此疾病和抗Ro和La抗原(此二者均为小RNA-蛋白复合物)的自身抗体的产生相关。损害可导致干性角膜结膜炎，口腔干燥，及其它包括胆汁性肝硬变，外周或感觉神经的神经病变，和可触压的紫癜的表现或相关症状。
全身性脉管炎为其中原发性损害为炎症，之后是对血管的损害，其会导致病变血管提供的组织缺血/坏疽/恶化，最后在一些病例中终末器官功能紊乱的疾病。脉管炎也可作为其它免疫炎症介导疾病，如类风湿关节炎，系统性硬化症等，特别是也与免疫复合物形成相关的疾病，的继发损害或后遗症出现。原发性全身性脉管炎的疾病包括：全身性坏死性脉管炎：结节性多动脉炎，变应性血管炎和肉芽肿病，多血管炎；多发性肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞动脉炎。混合型(Miscellaneous)脉管炎包括：粘膜与皮肤的淋巴结综合症(MLNS或川崎症)，隔离的(isolated)CNS脉管炎，贝切特氏病，闭塞性血栓性脉管炎(伯格氏病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列的大多种类的脉管炎的病理机制据信是由于免疫球蛋白复合物在血管壁的沉积首发，之后诱导了通过ADCC或/和补体活化的炎症应答。
肉状瘤病为病因学未知的情况，其特点为上皮样的肉芽肿在身体的几乎任何组织存在；肺受累(involvement)是最常见的。病因机制包括活化的巨噬细胞和淋巴细胞在病灶的持久(persistence)，以及后来由于为这些细胞类型所释放的局部或全身活性产物的释放所造成的慢性后遗症。
自身免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血，免疫全血细胞减少症，和阵发性夜间血红蛋白尿)，是产生与在红细胞(并且在一些病例中，也包括血小板的其它血细胞)表面表达的抗原反应的抗体的结果。它是那些抗体包被细胞，通过补体介导的溶血和/或ADCC/Fc-受体-介导的机制被去除的反映。
在包括血小板生成性紫癜，和其它临床类型(settings)中的免疫介导的血小板减少症的自身免疫性血小板减少症中，血小板破坏/去除是作为抗体或补体附着于血小板后来通过补体溶血，ADCC或FC-受体介导机制而被去除的结果而出现。
甲状腺炎包括格雷夫斯氏疾病，桥本氏甲状腺炎，青年期淋巴细胞性甲状腺炎，和萎缩性甲状腺炎，它们是抗甲状腺抗原的自身免疫应答的结果，该免疫应答产生与蛋白反应的抗体，此种蛋白存在于甲状腺并对其特异。存在的试验模型包括自然产生的模型：鼠(BUF和BB鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；诱导模型：用甲状腺球蛋白或甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素-依赖性糖尿病为胰岛β细胞的自身免疫破坏；此种破坏是通过自身抗体和自体反应性T细胞介导的。抗胰岛素的抗体或胰岛素受体也可形成胰岛素-非-反应性的表型。
免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的伤害的结果，它或者直接作为抗肾抗原的自身反应性抗体或T细胞的产生的结果或者间接作为与其它非肾抗原反应的抗体和/或免疫复合物在肾沉积结果。因而其它造成免疫复合物形成的免疫介导疾病也会诱导作为间接后遗症的免疫介导的肾病。直接和间接的免疫机制会导致炎症应答，它在肾组织产生/诱导损害发展，结果造成器官功能损害，而且在一些病例中会进行为肾衰。体液和细胞免疫机制可参与损害的发病机理。
中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病包括多发性硬化；自发性脱髓鞘多神经病或归-伯二氏综合症；以及慢性炎性脱髓鞘多神经病，据信具有自身免疫的基础并导致神经脱髓鞘作用，它是对少突神经胶质细胞或直接对髓鞘质损害的结果。在MS有证据建议疾病诱发和进行是依赖T淋巴细胞的。多发性硬化为T淋巴细胞-依赖的并具有复发-缓解病程或慢性进行性病程的脱髓鞘疾病。其病因学未知的；然而，病毒感染，遗传性诱因，环境，和自身免疫都会起促进作用。损害包括主要为T淋巴细胞介导的，小胶质细胞和浸润性巨噬细胞的浸润；CD4+T淋巴细胞为损害中的主要细胞类型。少突胶质细胞凋亡和其后的脱髓鞘作用机制是未知的但可能受T淋巴细胞驱策。
炎性和纤维化肺疾病，包括嗜酸性肺炎；自发性肺部纤维化，和超敏性肺炎可能包括非调节性(disregulated)的免疫炎性应答。那种应答的抑制将会有治疗效果。
自身免疫或免疫介导的皮肤疾病包括通过自身抗体介导的大疱皮肤疾病，多形红斑，及接触性皮炎。该自身抗体的生成是T淋巴细胞依赖性的
牛皮癣为T淋巴细胞-介导的炎症。损害包含T淋巴细胞，巨噬细胞和抗原呈递细胞，以及一些中性粒细胞的浸润。
过敏性疾病，包括哮喘；过敏性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏反应和风疹是T淋巴细胞依赖性的。这些疾病主要通过T淋巴细胞诱导的炎症，IgE介导的炎症或二者的结合来介导。
移植相关性疾病，包括移植物排斥反应和移植物-抗-宿主-疾病(GVHD)是T淋巴细胞依赖性的；T淋巴细胞功能的抑制是改善的。
其它干预了免疫和/或炎性应答会有好处的疾病为传染性疾病，其包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS，肝炎A，B，C，D，E)，细菌感染，真菌感染，和原虫和寄生虫感染(激动MLR的分子(或衍生物/激动剂)可被用于治疗以增强对传染性因子的免疫应答)，免疫缺陷病(激动MLR的分子(或衍生物/激动剂)可在先天的，后天获得的，传染性诱导的(如在HIV感染中)，或因医生的治疗(即，如从化疗)而引起的情况下被用于治疗以增强免疫应答)，和肿瘤形成。
所述OPGL(或激动剂或拮抗剂)可根据已知方法给药，如作为集合药团静脉内给药或通过在一时间段内，通过肌内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，胸内，口服，局部，或吸入途径持续注入。可选地，可用使用多种商品化装置的微型-泵注入来给药。该OPGL(或激动剂或拮抗剂)也可用本领域已描述的基因治疗技术来应用。
给药OPGL(或激动剂或拮抗剂)的有效量和程序表可根据经验来确定，而且做决定的应是本领域技术人员。可应用单或多剂量。现认为OPGL的有效量或量，例如，单独应用可能在从每天大约1pg/kg到大约100mg/kg体重或更多的范围。种属间剂量的标度可用本领域已知的方式进行，例如见Mordenti等，Pharmaceut.Res.，8：1351(1991)所公开。当应用OPGL体内给药，正常剂量可能从每天大约10ng/kg到最多100mg/kg哺乳动物体重或更多变化，优选基于给药途径从大约1μg/kg/天到10mg/kg/天。关于特定剂量和输送方法的指导在在文献中被提供；见例如，U.S.Pat.Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。预期不同制剂将对不同的治疗化合物和不同病症是有效的，所以向器官或组织靶向给药，例如，可能需要用与对另一器官或组织不同的方式来给予。那些本领域技术人员知道OPGL(或激动剂或拮抗剂分子)的必须给药剂量将基于，例如，接受治疗的哺乳动物，给药途径，和其它给药哺乳动物的药物或治疗而变化。据理解任一或多种本文公开的激动剂或拮抗物的结合也可用于本发明所述方法。
预计此方法中可用附加治疗。此一或多种其它治疗可包括但不限于，给药本领域已知的放射治疗，细胞因子，生长抑制剂，化疗剂，细胞毒性剂，酪氨酸激酶拮抗剂，ras法尼基转移酶拮抗剂，血管生成拮抗剂，和依赖于细胞周期蛋白的激酶拮抗剂并进一步如上I部分来特别限定。进一步治疗包括但不限于阻断抗体或中和各种TNF家族分子的活性的免疫粘附素分子，如TNF-α的中和抗体(即RemicadeTM)，CD40配体/CD40受体，或OX40配体/OX40受体，或受体-免疫球蛋白构型如EmbrelTM。
OPGL(或激动剂或拮抗剂)和一或多种其它治疗可被同时或顺序给药。在给药这些治疗后，可分析体外处理后的细胞。在体内处理后，处理后哺乳动物可用多种熟练操作人员所众所周知的方式来被监测。
D.制品
在另一本发明实施方案中，提供了含有对治疗上述病症有用的物质的制品。该制品包含容器和标签。适宜容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器，和试管。该容器可用各种物质如玻璃或塑料形成。该容器保存有一种组合物，它对治疗此情况有效并可能有无菌通道入口(例如该容器可能是具有用皮下注射针可穿透的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶)。组合物中的活性剂如本文所述，可包含OPGL或激动剂或拮抗物。在容器上的或与容器相关的标签表明该组合物可用来治疗可选情况。该制品可能还包含第二个含有可药用载体，如磷酸盐缓冲液，林格溶液，和右旋糖溶液的容器。它还可包括从商业和用户角度所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释液，过滤器，针，注射器和带有应用说明书的包装插页。
提供下述例子是为阐述而不是为限定。所有说明书中公开的参考都引入本文作为参考。
实施例1
OPG配体体外增生PBMC
进行体外试验来检测OPG配体对人外周血单核细胞(PBMC)的效果。
用LSM(ICN Pharmaceutical，Inc.)纯化人血，用PBS洗涤2次，在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中重悬并在37℃以5×107细胞/150mm组织培养平板铺板(plate)30分钟。未贴壁的细胞在相同条件下再铺板另外30分钟。用细胞刮取器轻柔地收获贴壁细胞并调整浓度到3×106/ml或5×106/ml。富集的单核细胞以3×106/孔或5×105/孔在96孔平底组织培养平板上铺板(plated-out)。
在96孔平底平板中，在有连续稀释的重组可溶性人OPGL的Flag-标记型分子的条件下，以培养基和美洲商陆有丝分裂原(PWM)(5μg/ml)(Sigma)和/或LPS(100ng/ml)(Sigma)分别作为阴性和阳性对照，在37℃，5％CO2中培养单核细胞。所述OPG配体为自Alexis Corporation购得的重组可溶，Flag-标记型OPG配体(包括人OPGL的胞外结构域的氨基酸75-316，见图1，SEQ ID NO：1)。人PBMC的增殖是通过在培养的最后16个小时用3H-胸腺嘧啶脉冲培养物来测量的。4天后，短暂离心平板并收集上清。胸腺嘧啶的掺入情况用闪烁记数来测量。
结果见图4所示，细胞增殖用CPM×10-4来报导。
实施例2
用OPG配体诱导IL-8
进行体外试验来检测OPG配体在人单核细胞中诱导IL-8的效果。除了短暂离心平板并在24小时孵育后收集上清，本试验基本如实施例1所述来进行。如图5所示向培养物中加入不同浓度的可溶性OPGL。不向培养平板中加入放射同位素。然后依照厂家说明书，用ELISA(Endogen)测量上清的IL-8水平。
结果如图5所示，将IL-8的水平用Pg/ml表示。
实施例3
用OPG配体诱导TNF-α
进行体外试验来检测OPG配体在人单核细胞中诱导TNF-α的效果。本试验基本如实施例2所述来进行。然后依照厂家说明书，用ELISA(Endogen)测量上清的TNF-α水平。
结果如图6所示，将TNF-α的水平用Pg/ml表示。
实施例4
用OPG配体诱导IL-6
进行体外试验来检测OPG配体在人单核细胞中诱导IL-6的效果。本试验基本如实施例2所述来进行。然后依照厂家说明书，用ELISA(Endogen)测量上清的IL-6水平。
结果如图7所示，将IL-6的水平用Pg/ml表示。
实施例5
用OPG配体诱导IL-1
进行体外试验来检测OPG配体在人单核细胞中诱导IL-1的效果。本试验基本如实施例2所述来进行。然后依照厂家说明书，，用ELISA(Endogen)测量上清的IL-1水平。
结果如图8所示，将IL-1的水平用Pg/ml表示。
实施例6
用OPG配体诱导细胞因子的分泌
进行体外试验来检测OPG配体对人单核细胞分泌各种细胞因子的效果。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat# 553-01)自人外周血分离单核细胞。然后在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中重悬所述细胞，并与指定浓度的OPG配体(Alexis Corp.)在37℃保温24小时。用ELISA来检测所述细胞培养中的细胞因子(图9A-9E)。用Pharmingen的ELISA试剂盒检测IL-12和IL-6水平，用R & D Systems的ELISA试剂盒检测TNF-α，MIP-1α和IL-1β水平。
结果见图9A-9E所示，将IL-12，IL-6，TNF-α，MIP-1α和IL-1的分泌水平用Pg/ml表示。在OPGL最大所用浓度为5μg/ml时，IL-12(213pg/ml)，IL-6(7704pg/ml)，TNF-α(13.4pg/ml)，MIP-1α(8740pg/ml)和IL-1β(803.8pg/ml)的水平清楚显示，OPGL以剂量-依赖方式活化单核细胞。
实施例7
OPG配体诱导单核细胞中共刺激分子表达的上调
进行体外试验来检测OPG配体对单核细胞表达共刺激分子的效果。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。然后在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中重悬所述细胞，并在含或无5μg/ml OPG配体(购自Alexis Corp.)时在37℃保温24小时。用细胞刮取器轻柔收获分别在0和24小时的培养物中的细胞，用含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液洗涤，并在相同缓冲液中调整到3×106细胞/ml。然后用下述任一种抗体在4℃孵育细胞15分钟：藻红蛋白偶联-α-人CD80(Pharmingen)，FITC偶联-α-人CD86(Pharmingen)，藻红蛋白偶联-α-人II类(Pharmingen)或α-人RANK(Alexis Corp.，cat#804-212-C100)。用含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液洗涤已被α-人RANK染色的细胞，然后与FITC偶联-α-小鼠IgG1抗体在4℃孵育15分钟。与各自的抗体孵育后，用含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液洗涤细胞并用FACS来分析共刺激分子CD80，CD86，和II类以及RANK的表达。
结果见图10所示，其中在0和24小时的单核细胞各自用灰线和粗线说明。被OPGL(5μg/ml)活化24小时的单核细胞的FACS分析表明了活化标记物如CD80，CD86，和II类，以及RANK的上调。
实施例8
OPG配体诱导B细胞增殖
进行体外试验来检测OPG配体对人B细胞的效果。
依照厂家说明书，用CD19微珠(Milteny Biotec，cat# 522-01)从人外周血分离B细胞。在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中重悬富集的B细胞并以1×106细胞/孔在96孔平底组织培养平板上铺板。然后所述细胞与100ng/ml rhuman IL-4(R & DSystems，cat#204-IL-025)和指定浓度(见图11)的OPG配体(Alexis Corp.)在37℃保温96小时。通过用甲基3H-胸腺嘧啶(1pCi/well)脉冲培养物另外16个小时来测量B细胞增殖。用闪烁记数来测量胸腺嘧啶的掺入。
结果见图11A所示，细胞增殖用CPM×10-3来报导。OPGL(结合IL-4(100ng/ml))可以剂量-依赖方式诱导B细胞增殖。
另外，检测OPG减弱α-CD40抗体诱导B细胞增殖的效果。除了用100ng/ml rhuman IL-4(R & D Systems，cat#204-IL-025)，10μg/mlα-人CD40抗体(Pharmingen，cat#33070D)，和指定浓度(见图11B)的OPG(Alexis Corp.)孵育细胞外，基本如上述进行此试验。
所述结果见图11B所示，细胞增殖用CPM×10-3来报导。OPG可以与IL-4联合以剂量-依赖方式阻断α-人CD40抗体介导的B细胞增殖。
实施例9
OPG配体保护单核细胞不受缺(Starvation)血清诱导而凋亡
进行体外试验来检测OPG配体对缺血清的培养物中的人单核细胞的效果。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。在无血清培养基(含有50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中以5×105细胞/ml重悬所述细胞，并且在0.5mg/mlLPS(Sigma，Cat#L-4391)，1μg/ml CD40配体(Alexis Corp.)，或1μg/ml OPG配体(Alexis Corp.)存在时，在37℃保温图12指定的时间段。在指定时间点(见图12)，各自培养物中的细胞用膜连蛋白V-FITC(Clontech Laboratories，cat#K2025-2)染色并根据厂家说明书用FACS分析。
结果见图12所示。它们可清楚表明OPGL保护单核细胞不被血清-损失(withdrawal)诱导而凋亡的能力，而且OPGL的这种抗-凋亡能力与已知存活刺激物如LPS和CD40L的能力相当。
实施例10
OPG配体诱导的单核细胞的Bcl-x1和Bcl-2表达
进行体外试验来检测OPG配体对人单核细胞表达某些存活蛋白的效果。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中以5×105细胞/ml重悬所述细胞并与1μg/ml OPG配体(Alexis Corp.)在37℃保温。在指定时间点(见图13)，收获细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤一次，再溶解于缓冲液(1％SDS，0.5％NonidetP-40，0.15M NaCl，10mM Tris(pH 7.4)，及1片完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals))中。溶解物以10,000×g在4℃离心15分钟。收集上清并用作溶解产物。在SDS电泳缓冲液(25mM TRIS，0.2M甘氨酸和3.5mM SDS)中用4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex Electrophoresis)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离溶解产物(30或50μg)，然后在转移缓冲液(48mM Tris-Base，39mM甘氨酸，0.0375％(w/v)SDS，20％甲醇)中转移到聚偏二氟乙烯膜(Invitrogen Corp.)上。将膜在由TBST(20mM Tris(pH 7.4)，137mM NaCl，0.5％Tween 20)中5％脱脂奶组成的封闭缓冲液中保温，之后用针对Bcl-2(Pharmingen cat#554202)或Bcl-xL((Pharmingen cat#556499)的
第一抗体孵育该膜。用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体和ECL系统(Amersham Pharmacia Biotech)检测抗体-抗原复合物。
所述结果见图13所示。因而OPGL阻断血清-损失所诱导的单核细胞凋亡的能力(见图12)可通过诱导前体-存活蛋白如Bcl-xL和Bcl-2的表达来介导。
实施例11
OPG配体诱导单核细胞内MAPK p38和p42/44途径的活化
进行体外试验以检测OPG配体对人单核细胞表达某些存活蛋白的效果。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。在无血清培养基(含有50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中在37℃血清-饥饿6小时。然后用细胞刮取器轻柔收获细胞，在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中以1×106细胞/ml重悬，并用1μg/ml OPG配体(AlexisCorp.)来刺激。在指定时间点(见图14)，收获细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤一次，再溶解于缓冲液(20mM Hepes，pH 7.4，2mM EGTA，50mM磷酸甘油，0.1％ Triton X-100，10％甘油，1mM二硫苏糖醇，1片完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals))中。所述溶解产物以10,000×g在4℃离心15分钟。收集上清并用作完全细胞溶解产物。在SDS电泳缓冲液(25mMTRIS，0.2M甘氨酸和3.5mM SDS)中用4-20％ Tris-甘氨酸凝胶(NovexElectrophoresis)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离溶解产物(30或50μg)，然后在转移缓冲液(48mM Tris-Base，39mM甘氨酸，0.0375％(w/v)SDS，20％甲醇)中转移到聚偏二氟乙烯膜(Invitrogen Corp.)上。在由TBST(20mMTris(pH 7.4)，137mM NaCl，0.5％Tween 20)中5％脱脂奶组成的封闭缓冲液中，之后在针对p38 MAPK(Cell Signaling Technology)，phospho-p38 MAPK(Cell Signaling Technology)，p42/44 MAPK(Cell Signaling Technology)或phosphop42/44 MAPK(Cell Signaling Technology)的第一抗体中孵育该膜。用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体和ECL系统(Amersham Pharmacia Biotech)检测抗体-抗原复合物。
结果见图14所示，并且表明OPGL活化单核细胞中的p38和p42/44MAPK途径。
实施例12
OPG配体和RANK在正常和患病细胞或组织中的表达
进行试验来检测OPG配体和RANK在多种细胞和组织中的表达。
依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。在含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液中重悬所述细胞，并调整到1×106细胞/ml。之后将细胞与α-人RANK(Alexis Corp.，cat#804-212-C100)或同种对照抗体(Pharmingen)在4℃孵育15分钟。用含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液洗涤来自各自孵育物的细胞，并与FITC偶联-α-小鼠IgG1抗体在4℃孵育15分钟。在此孵育后，用含有2％的热灭活FBS的磷酸盐缓冲液洗涤细胞并用FACS分析RANK的表达。
所述结果见图15A所示，其中被RANK-染色的细胞用粗线来说明而同种-对照-染色细胞用灰线说明。因而，RANK作为OPGL的膜结合受体，在静止态(resting)单核细胞中表达。
据发现RANK的mRNA表达在用OPG配体处理的单核细胞中上调。依照厂家说明书，用单核细胞分离试剂盒(Milteny Biotec，cat#553-01)自人外周血分离单核细胞。在完全培养基(含有10％的热灭活FBS和50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI-1640)中以1×106细胞/ml重悬所述细胞，并在有(或无)指定浓度的OPG配体(Alexis Corporation)的条件下在37℃保温24小时(见图15B)。然后用TRIzolTM试剂(Life Technologies)，依照厂家说明书，从OPGL-处理细胞和对照细胞中分离总RNA。Taqman扩增反应(50μl)由25ng RNA样本和40μl反应混合液(cocktail)组成。所述反应混合液包含10×缓冲液A，10单位RNase抑制剂，200μM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，4mMMgCl2，1.25单位Taq GoldTM聚合酶和25单位MULV逆转录酶(TaqmanCore试剂盒(Perkin Elmer，cat#N8080228)。每孔含有10μl引物/探针混合物，其中有200nM基因-特异性杂交探针和300nM基因-特异性扩增引物。
热循环条件：48℃30分钟，之后50℃2分钟和95℃10分钟。再以95℃15秒和60℃1分钟，循环40次。用ABI Prism 7700测序仪进行反应和序列检测。GAPDH水平用于使上样量标准化。
所用RANK/GAPDH Taqman引物/探针组(set)的序列如下：
RANK正向引物：5′-AGTGGTGCGATTA标签CCCG-3′(SEQ ID NO：7)
RANK反向引物：
5′-GAAGGTTGAGGTGGGAGGATC-3′(SEQ ID NO：8)
RANK探针：
5′-AGCCTCTAACTCCTGGGCTCAAGCAATC-3′(SEQ ID NO：9)
GAPDH正向引物：
5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′(SEQ ID NO：10)
GAPDH反向引物：
5′-CAGCGTCAAAGGTGGAGGAG-3′(SEQ ID NO：11)
GAPDH探针：
5′-TGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′(SEQ ID NO：12)
经OPGL-处理的细胞与未刺激的细胞相比，RANK转录物的表达成倍增加，可参见图15B。OPGL因此能以剂量-依赖方式刺激RANK mRNA在单核细胞中的表达。
据发现在溃疡性结肠炎病人的结肠组织中OPG配体mRNA的表达被上调。从正常，健康供体及从溃疡性结肠炎病人获得结肠组织。用氯化铯梯度离心从所述组织分离总RNA。扩增反应(50μl)由25ng RNA样本和40μl反应混合液组成。所述反应混合液包含10×缓冲液A，10单位RNase抑制剂，200μM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，4mM MgCl2，1.25单位Taq GoldTM聚合酶和25单位MULV逆转录酶(Taqman Core试剂盒(Perkin Elmer，cat#N8080228))。每孔含有10μl的引物/探针混合物，其中有200nM基因-特异性杂交探针和300nM基因-特异性扩增引物。
热循环条件：48℃30分钟，之后50℃2分钟和95℃10分钟。再以95℃15秒和60℃1分钟循环40次。用ABI Prism 7700测序仪进行反应和序列检测。
所用OPGL/GAPDH Taqman引物/探针组序列如下：
OPGL正向引物：
5′-CAAGTATTGGTCAGGGAATTCTG-3′(SEQ ID NO：13)
OPGL反向引物：
5′-GGGCTCAATCTATATCTCGAACTT-3′(SEQ ID NO：14)
OPGL探针：
5′-FAM-TTTAAGTTACGGTCTGGAGAGGAAATCAGCA-TAMARA-3′(SEQ ID NO：15)
GAPDH正向引物：
5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID NO：16)
GAPDH反向引物：
5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′(SEQ ID NO：17)
GAPDH探针：
5′-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMARA-3′(SEQ ID NO：18)
OPGL mRNA在正常和溃疡性结肠炎组织中表达的Taqman Ct值见图15C所示。结果表明，溃疡性结肠炎组织与正常组织相比，其OPGL mRNA水平被上调至少8倍，提示OPGL可能在该疾病的发病机理中起作用。
我们认为上述描述足以使本领域技术人员实现本发明。本发明在范围上不限于本文提供的实施例。事实上，除了本文所示和所述之外，对本发明进行的各种修饰都是本领域技术人员从前述说明书很容易得到的，并且都落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110>杰南技术公司(Genentech，Inc.)
伊奎巴尔.格雷瓦尔(GREWAL，Iqba1)
<120>OPG配体调节免疫应答的作用
<130>P1830R1PCT
<140>PCT/US02/01238
<141>2002-02-06
<150>US 60/278,215
<151>2001-03-23
<160>18
<210>1
<211>317
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>1
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser
  1               5                  10                  15
Glu Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro Hi s Glu Gly Pro Leu
                 20                  25                   30
His Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser
                 35                  40                  45
Arg Ser Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val
                 50                  55                  60
Val Cys Ser Val Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp
                 65                  70                  75
Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile
                 80                  85                  90
Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu
                 95                 100                 105
Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys
                110                 115                 120
Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val
                125                 130                 135
Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser
                140                 145                 150
Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe
                155                 160                 165
Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His
                170                 175                 180
Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys
                185                 190                 195
Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val Asn Gln
                200                 205                 210
Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His
                215                 220                 225
Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
                230                 235                 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu
                245                 250                 255
Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe
                260                 265                 270
His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser
                275                 280                 285
Gly Glu Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp
                290                 295                 300
Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp
                305                 310                 315
Ile Asp
<210>2
<211>2271
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>2
aagcttggta ccgagctcgg atccactact cgacccacgc gtccgcgcgc 50
cccaggagcc aaagccgggc tccaagtcgg cgccccacgt cgaggctccg 100
ccgcagcctc cggagttggc cgcagacaag aaggggaggg agcgggagag 150
ggaggagagc tccgaagcga gagggccgag cgccatgcgc cgcgccagca 200
gagactacac caagtacctg cgtggctcgg aggagatggg cggcggcccc 250
ggagccccgc acgagggccc cctgcacgcc ccgccgccgc ctgcgccgca 300
ccagcccccc gccgcctccc gctccatgtt cgtggccctc ctggggctgg 350
ggctgggcca ggttgtctgc agcgtcgccc tgttcttcta tttcagagcg 400
cagatggatc ctaatagaat atcagaagat ggcactcact gcatttatag 450
aattttgaga ctccatgaaa atgcagattt tcaagacaca actctggaga 500
gtcaagatac aaaattaata cctgattcat gtaggagaat taaacaggcc 550
tttcaaggag ctgtgcaaaa ggaattacaa catatcgttg gatcacagca 600
catcagagca gagaaagcga tggtggatgg ctcatggtta gatctggcca 650
agaggagcaa gcttgaagct cagccttttg ctcatctcac tattaatgcc 700
accgacatcc catctggttc ccataaagtg agtctgtcct cttggtacca 750
tgatcggggt tgggccaaga tctccaacat gacttttagc aatggaaaac 800
taatagttaa tcaggatggc ttttattacc tgtatgccaa catttgcttt 850
cgacatcatg aaacttcagg agacctagct acagagtatc ttcaactaat 900
ggtgtacgtc actaaaacca gcatcaaaat cccaagttct cataccctga 950
tgaaaggagg aagcaccaag tattggtcag ggaattctga attccatttt 1000
tattccataa acgttggtgg attttttaag ttacggtctg gagaggaaat 1050
cagcatcgag gtctccaacc cctccttact ggatccggat caggatgcaa 1100
catactttgg ggcttttaaa gttcgagata tagattgagc cccagttttt 1150
ggagtgttat gtatttcctg gatgtttgga aacatttttt aaaacaagcc 1200
aagaaagatg tatataggtg tgtgagacta ctaagaggca tggccccaac 1250
ggtacacgac tcagtatcca tgctcttgac cttgtagaga acacgcgtat 1300
ttacagccag tgggagatgt tagactcatg gtgtgttaca caatggtttt 1350
taaattttgt aatgaattcc tagaattaaa ccagattgga gcaattacgg 1400
gttgacctta tgagaaactg catgtgggct atgggagggg ttggtccctg 1450
gtcatgtgcc ccttcgcagc tgaagtggag agggtgtcat ctagcgcaat 1500
tgaaggatca tctgaagggg caaattcttt tgaattgtta catcatgctg 1550
gaacctgcaa aaaatacttt ttctaatgag gagagaaaat atatgtattt 1600
ttatataata tctaaagtta tatttcagat gtaatgtttt ctttgcaaag 1650
tattgtaaat tatatttgtg ctatagtatt tgattcaaaa tatttaaaaa 1700
tgtcttgctg ttgacatatt taatgtttta aatgtacaga catatttaac 1750
tggtgcactt tgtaaattcc ctggggaaaa cttgcagcta aggaggggaa 1800
aaaaatgttg tttcctaata tcaaatgcag tatatttctt cgttcttttt 1850
aagttaatag attttttcag acttgtcaag cctgtgcaaa aaaattaaaa 1900
tggatgcctt gaataataag caggatgttg gccaccaggt gcctttcaaa 1950
tttagaaact aattgacttt agaaagctga cattgccaaa aaggatacat 2000
aatgggccac tgaaatctgt caagagtagt tatataattg ttgaacaggt 2050
gtttttccac aagtgccgca aattgtacct tttttttttt ttcaaaatag 2100
aaaagttatt agtggtttat cagcaaaaaa gtccaatttt aatttagtaa 2150
atgttatctt atactgtaca ataaaaacat tgcctttgaa tgttaatttt 2200
ttggtacaaa aataaattta tatgaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgct 2250
ctagagggcc ctattctata g                                2271
<210>3
<211>401
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>3
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
  1               5                  10                  15
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
                 20                  25                  30
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
                 35                  40                  45
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
                 50                  55                  60
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
                 65                  70                  75
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
                 80                  85                  90
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
                 95                 100                 105
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
                110                 115                 120
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
                125                 130                 135
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
                140                 145                 150
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
                155                 160                 165
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
                170                 175                 180
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
                185                 190                 195
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
                200                 205                 210
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
                215                 220                 225
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
                230                 235                 240
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
                245                 250                 255
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
                260                 265                 270
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
                275                 280                 285
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
                290                 295                 300
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
                305                 310                 315
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
                320                 325                 330
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
                335                 340                 345
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
                350                 355                 360
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
                365                 370                 375
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
                380                 385                 390
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
                395                 400
<210>4
<211>1356
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>4
gtatatataa cgtgatgagc gtacgggtgc ggagacgcac cggagcgctc 50
gcccagccgc cgyctccaag cccctgaggt ttccggggac cacaatgaac 100
aagttgctgt gctgcgcgct cgtgtttctg gacatctcca ttaagtggac 150
cacccaggaa acgtttcctc caaagtacct tcattatgac gaagaaacct 200
ctcatcagct gttgtgtgac aaatgtcctc ctggtaccta cctaaaacaa 250
cactgtacag caaagtggaa gaccgtgtgc gccccttgcc ctgaccacta 300
ctacacagac agctggcaca ccagtgacga gtgtctatac tgcagccccg 350
tgtgcaagga gctgcagtac gtcaagcagg agtgcaatcg cacccacaac 400
cgcgtgtgcg aatgcaagga agggcgctac cttgagatag agttctgctt 450
gaaacatagg agctgccctc ctggatttgg agtggtgcaa gctggaaccc 500
cagagcgaaa tacagtttgc aaaagatgtc cagatgggtt cttctcaaat 550
gagacgtcat ctaaagcacc ctgtagaaaa cacacaaatt gcagtgtctt 600
tggtctcctg ctaactcaga aaggaaatgc aacacacgac aacatatgtt 650
ccggaaacag tgaatcaact caaaaatgtg gaatagatgt taccctgtgt 700
gaggaggcat tcttcaggtt tgctgttcct acaaagttta cgcctaactg 750
gcttagtgtc ttggtagaca atttgcctgg caccaaagta aacgcagaga 800
gtgtagagag gataaaacgg caacacagct cacaagaaca gactttccag 850
ctgctgaagt tatggaaaca tcaaaacaaa gcccaagata tagtcaagaa 900
gatcatccaa gatattgacc tctgtgaaaa cagcgtgcag cggcacattg 950
gacatgctaa cctcaccttc gagcagcttc gtagcttgat ggaaagctta 1000
ccgggaaaga aagtgggagc agaagacatt gaaaaaacaa taaaggcatg 1050
caaacccagt gaccagatcc tgaagctgct cagtttgtgg cgaataaaaa 1100
atggcgacca agacaccttg aagggcctaa tgcacgcact aaagcactca 1150
aagacgtacc actttcccaa aactgtcact cagagtctaa agaagaccat 1200
caggttcctt cacagcttca caatgtacaa attgtatcag aagttatttt 1250
tagaaatgat aggtaaccag gtccaatcag taaaaataag ctgcttataa 1300
ctggaaatgg ccattgagct gtttcctcac aattggcgag atcccatgga 1350
tgataa 1356
<210>5
<211>616
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>5
Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu
  1               5                  10                  15
Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile
                 20                  25                  30
Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg
                 35                  40                  45
Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys
                 50                  55                  60
Thr Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu
                 65                  70                  75
Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys
                 80                  85                  90
Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn
                 95                 100                 105
Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp
                110                 115                 120
Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro
                125                 130                 135
Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val
                140                 145                 150
Cys Lys Pro Cys Leu Ala Cly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser
                155                 160                 165
Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys
                170                 175                 180
Arg Val Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Val Tyr
                200                 205                 210
Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala Leu
                215                 220                 225
Val Ala Ala Ile Ile Phe Cly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys
                230                 235                 240
Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly
                245                 250                 255
Arg Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser
                260                 265                 270
Thr His Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala Cys Glu Gly Val
                275                 280                 285
Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys
                290                 295                 300
Tyr Pro Asp Gln Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys Val Gly Gly
                305                 310                 315
Gly Pro Tyr Ala Gln Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Val
                320                 325                 330
Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser Phe Arg Gln Met Pro Thr
                335                 340                 345
Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu
                350                 355                 360
Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser
                365                 370                 375
Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln Cys Phe
                380                 385                 390
Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr
                395                 400                 405
Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn
                410                 415                 420
Tyr Leu Gln Lys Glu Val Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala
                425                 430                 435
Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly Cys Arg
                440                 445                 450
Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys Clu Pro Leu Val Gly Ser Pro Lys
                455                 460                 465
Arg Gly Pro Leu Pro Gln Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro
                470                 475                 480
Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gln Pro Glu Asp
                485                 490                 495
Gly Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly
                500                 505                 510
Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly Gln Ser Pro Ala Ser Gly Asn Val
                515                 520                 525
Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met
                530                 535                 540
Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser
                545                 550                 555
Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro Val
                560                 565                 570
Gln Glu Glu Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly
                575                 580                 585
Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu
                590                 595                 600
Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln Gly Gly Ala Lys
                605                 610                 615
Ala
<210>6
<211>3136
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>6
ccgctgaggc cgcggcgccc gccagcctgt cccgcgccat ggccccgcgc 50
gcccggcggc gccgcccgct gttcgcgctg ctgctgctct gcgcgctgct 100
cgcccggctg caggtggctt tgcagatcgc tcctccatgt accagtgaga 150
agcattatga gcatctggga cggtgctgta acaaatgtga accaggaaag 200
tacatgtctt ctaaatgcac tactacctct gacagtgtat gtctgccctg 250
tggcccggat gaatacttgg atagctggaa tgaagaagat aaatgcttgc 300
tgcataaagt ttgtgataca ggcaaggccc tggtggccgt ggtcgccggc 350
aacagcacga ccccccggcg ctgcgcgtgc acggctgggt accactggag 400
ccaggactgc gagtgctgcc gccgcaacac cgagtgcgcg ccgggcctgg 450
gcgcccagca cccgttgcag ctcaacaagg acacagtgtg caaaccttgc 500
cttgcaggct acttctctga tgccttttcc tccacggaca aatgcagacc 550
ctggaccaac tgtaccttcc ttggaaagag agtagaacat catgggacag 600
agaaatccga tgcggtttgc agttcttctc tgccagctag aaaaccacca 650
aatgaacccc atgtttactt gcccggttta ataattctgc ttctcttcgc 700
gtctgtggcc ctggtggctg ccatcatctt tggcgtttgc tataggaaaa 750
aagggaaagc actcacagct aatttgtggc actggatcaa tgaggcttgt 800
ggccgcctaa gtggagataa ggagtcctca ggtgacagtt gtgtcagtac 850
acacacggca aactttggtc agcagggagc atgtgaaggt gtcttactgc 900
tgactctgga ggagaagaca tttccagaag atatgtgcta cccagatcaa 950
ggtggtgtct gtcagggcac gtgtgtagga ggtggtccct acgcacaagg 1000
cgaagatgcc aggatgctct cattggtcag caagaccgag atagaggaag 1050
acagcttcag acagatgccc acagaagatg aatacatgga caggccctcc 1100
cagcccacag accagttact gttcctcact gagcctggaa gcaaatccac 1150
acctcctttc tctgaacccc tggaggtggg ggagaatgac agtttaagcc 1200
agtgcttcac ggggacacag agcacagtgg gttcagaaag ctgcaactgc 1250
actgagcccc tgtgcaggac tgattggact cccatgtcct ctgaaaacta 1300
cttgcaaaaa gaggtggaca gtggccattg cccgcactgg gcagccagcc 1350
ccagccccaa ctgggcagat gtctgcacag gctgccggaa ccctcctggg 1400
gaggactgtg aacccctcgt gggttcccca aaacgtggac ccttgcccca 1450
gtgcgcctat ggcatgggcc ttccccctga agaagaagcc agcaggacgg 1500
aggccagaga ccagcccgag gatggggctg atgggaggct cccaagctca 1550
gcgagggcag gtgccgggtc tggaagctcc cctggtggcc agtcccctgc 1600
atctggaaat gtgactggaa acagtaactc cacgttcatc tccagcgggc 1650
aggtgatgaa cttcaagggc gacatcatcg tggtctacgt cagccagacc 1700
tcgcaggagg gcgcggcggc ggctgcggag cccatgggcc gcccggtgca 1750
ggaggagacc ctggcgcgcc gagactcctt cgcggggaac ggcccgcgct 1800
tcccggaccc gtgcggcggc cccgaggggc tgcgggagcc ggagaaggcc 1850
tcgaggccgg tgcaggagca aggcggggcc aaggcttgag cgccccccat 1900
ggctgggagc ccgaagctcg gagccagggc tcgcgagggc agcaccgcag 1950
cctctgcccc agccccggcc acccagggat cgatcggtac agtcgaggaa 2000
gaccacccgg cattctctgc ccactttgcc ttccaggaaa tgggcttttc 2050
aggaagtgaa ttgatgagga ctgtccccat gcccacggat gctcagcagc 2100
ccgccgcact ggggcagatg tctcccctgc cactcctcaa actcgcagca 2150
gtaatttgtg gcactatgac agctattttt atgactatcc tgttctgtgg 2200
ggggggggtc tatgttttcc ccccatattt gtattccttt tcataacttt 2250
tcttgatatc tttcctccct cttttttaat gtaaaggttt tctcaaaaat 2300
tctcctaaag gtgagggtct ctttcttttc tcttttcctt ttttttttct 2350
ttttttggca acctggctct ggcccaggct agagtgcagt ggtgcgatta 2400
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cccacctcaa ccttcggagt agctgggatc acagctgcag gccacgccca 2500
gcttcctccc cccgactccc cccccccaga gacacggtcc caccatgtta 2550
cccagcctgg tctcaaactc cccagctaaa gcagtcctcc agcctcggcc 2600
tcccaaagta ctgggattac aggcgtgagc ccccacgctg gcctgcttta 2650
cgtattttct tttgtgcccc tgctcacagt gttttagaga tggctttccc 2700
agtgtgtgtt cattgtaaac acttttggga aagggctaaa catgtgaggc 2750
ctggagatag ttgctaagtt gctaggaaca tgtggtggga ctttcatatt 2800
ctgaaaaatg ttctatattc tcatttttct aaaagaaaga aaaaaggaaa 2850
cccgatttat ttctcctgaa tctttttaag tttgtgtcgt tccttaagca 2900
gaactaagct cagtatgtga ccttacccgc taggtggtta atttatccat 2950
gctggcagag gcactcaggt acttggtaag caaatttcta aaactccaag 3000
ttgctgcagc ttggcattct tcttattcta gaggtctctc tggaaaagat 3050
ggagaaaatg aacaggacat ggggctcctg gaaagaaagg gcccgggaag 3100
ttcaaggaag aataaagttg aaattttaaa aaaaaa 3136
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<213>人工序列
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<223>合成序列
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<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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gaaggttgag gtgggaggat c 21
<210>9
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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agcctctaac tcctgggctc aagcaatc 28
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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tgggctacac tgagcaccag 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>11
cagcgtcaaa ggtggaggag 20
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>12
tggtctcctc tgacttcaac agcgacac 28
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>2人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>13
caagtattgg tcagggaatt ctg 23
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>14
gggctcaatc tatatctcga actt 24
<210>15
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>15
tttaagttac ggtctggaga ggaaatcagc a 31
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>17
gaagatggtg atgggatttc 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>18
caagcttccc gttctcagcc 20

Claims (65)

1.刺激哺乳动物单核细胞的方法，包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的OPG配体多肽，所述OPG配体多肽可刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，TNF-α，或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述OPG配体多肽包含：
a)与全长天然序列OPG配体多肽具有至少80％序列同一性的多肽，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；
b)图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列；
c)由图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列组成的多肽；或
d)含有a)，b)或c)的片段的多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体外暴露于所述OPG配体多肽。
3.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体内暴露于所述OPG配体多肽。
4.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。
5.权利要求4的方法，其中所述IL-1为IL-1β。
6.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6。
7.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α。
8.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。
9.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽包含图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列。
10.权利要求9的方法，其中所述OPG配体多肽胞外结构域包含图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸70到317。
11.权利要求1的方法，其中所述OPG配体多肽与全长天然序列OPG配体多肽具有至少80％的序列同一性，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述OPG配体多肽具有至少90％的序列同一性。
13.刺激哺乳动物单核细胞的方法，包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的OPG配体多肽，该OPG配体多肽可刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-12或MIP-1α的细胞因子或趋化因子，其中所述OPG配体多肽包含：
a)与全长天然序列OPG配体多肽具有至少80％的序列同一性的多肽，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；
b)图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列；
c)由图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列组成的多肽；或
d)含有a)，b)或c)的片段的多肽。
14.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体外暴露于所述OPG配体多肽。
15.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体内暴露于所述OPG配体多肽。
16.权利要求13的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-12。
17.权利要求13的方法，其中所述OPG配体多肽刺激所述哺乳动物单核细胞分泌MIP-1α。
18.权利要求13的方法，其中所述OPG配体多肽包含图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列。
19.权利要求13的方法，其中所述OPG配体多肽与全长天然序列OPG配体多肽具有至少80％的序列同一性，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。
20.权利要求19的方法，其中所述OPG配体多肽具有至少90％的序列同一性。
21.刺激哺乳动物单核细胞的方法，包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的激动型抗RANK受体抗体，该抗体可刺激所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α，MIP-1α，或IL-8的细胞因子或趋化因子。
22.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体外暴露于所述激动型抗RANK受体抗体。
23.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体内暴露于所述激动型抗RANK受体抗体。
24.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。
25.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6。
26.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-12。
27.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌MIP-1α。
28.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α。
29.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体刺激所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。
30.权利要求21的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体为单克隆抗体。
31.权利要求30的方法，其中所述激动型抗RANK受体抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
32.抑制哺乳动物单核细胞的方法，包括使所述哺乳动物单核细胞暴露于有效量的，可抑制所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种细胞因子或趋化因子的拮抗剂，其中所述拮抗剂包含抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，抗RANK受体抗体，OPG受体免疫粘附素或RANK受体免疫粘附素，且一或多种所述细胞因子或趋化因子选自IL-1，IL-6，IL-12，MIP-1α，TNF-α，或IL-8。
33.权利要求32的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体外暴露于所述拮抗剂。
34.权利要求32的方法，其中所述哺乳动物单核细胞体内暴露于所述拮抗剂。
35.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-1。
36.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-6。
37.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-12。
38.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌MIP-1α。
39.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌TNF-α。
40.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂抑制所述哺乳动物单核细胞分泌IL-8。
41.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂为抗RANK受体抗体。
42.权利要求41的方法，其中所述抗RANK受体抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
43.权利要求32的方法，其中所述拮抗剂为RANK受体免疫粘附素。
44.权利要求43的方法，其中所述RANK受体免疫粘附素包含所述RANK受体的胞外结构域及免疫球蛋白恒定区。
45.权利要求44的方法，其中所述RANK受体的胞外结构域包含图3B(SEQ ID NO：5)的氨基酸29到212或其片段。
46.治疗与哺乳动物单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌下降相关的或由其造成的病理性疾病的方法，包括对哺乳动物给药有效量的激动剂来刺激该哺乳动物的单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，MIP-1α，TNF-α，或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述激动剂包含：
a)与全长天然序列OPG配体多肽具有至少80％的序列同一性的多肽，该全长天然序列OPG配体多肽具有图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；
b)图1B(SEQ ID NO：1)的多肽的可溶性胞外结构域序列；
c)由图1B(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列组成的多肽；
d)含有a)，b)或c)的片段的多肽；或
e)抗RANK受体抗体。
47.权利要求46的方法，其中所述病理性疾病为免疫相关疾病。
48.权利要求47的方法，其中所述免疫相关疾病为传染性疾病。
49.权利要求46的方法，其中所述抗RANK受体抗体为单克隆抗体。
50.权利要求49的方法，其中所述抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
51.治疗与哺乳动物单核细胞的细胞因子或趋化因子分泌增多相关的或由其造成的病理性疾病的方法，包括给药哺乳动物有效量的拮抗剂来抑制所述哺乳动物单核细胞分泌一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，MIP-1α，TNF-α，或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述拮抗剂包含抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，抗RANK受体抗体，OPG受体免疫粘附素或RANK受体免疫粘附素。
52.权利要求51的方法，其中所述病理性疾病为免疫相关疾病。
53.权利要求52的方法，其中所述免疫相关疾病为自身免疫病，类风湿性关节炎，胰岛素依赖性糖尿病，骨关节炎，炎性肠疾病，牛皮癣，移植排斥反应或变态反应。
54.权利要求53的方法，其中所述免疫相关疾病为类风湿性关节炎。
55.权利要求53的方法，其中所述炎性肠疾病为溃疡性结肠炎或克朗氏病。
56.权利要求5 1的方法，其中所述抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，或抗RANK受体抗体为单克隆抗体。
57.权利要求56的方法，其中所述单克隆抗体为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
58.权利要求51的方法，其中所述拮抗剂为RANK受体免疫粘附素或OPG受体免疫粘附素。
59.权利要求58的方法，其中所述RANK受体免疫粘附素包含所述RANK受体的胞外结构域及免疫球蛋白恒定区。
60.权利要求59的方法，其中所述RANK受体的胞外结构域包含图3B(SEQ ID NO：5)的氨基酸29到212或其片段。
61.治疗哺乳动物的类风湿性关节炎或炎性肠疾病的方法，包括给药所述哺乳动物有效量的拮抗剂来抑制一或多种选自IL-1，IL-6，IL-12，MIP-1α，TNF-α，或IL-8的细胞因子或趋化因子，其中所述拮抗剂包含抗OPG配体抗体，抗OPG受体抗体，抗RANK受体抗体，OPG受体免疫粘附素或RANK受体免疫粘附素。
62.权利要求61的方法，其中所述拮抗剂为RANK受体免疫粘附素或OPG受体免疫粘附素。
63.权利要求62的方法，其中所述RANK受体免疫粘附素包含所述RANK受体的胞外结构域及免疫球蛋白恒定区。
64.权利要求63的方法，其中所述RANK受体的胞外结构域包含图3B(SEQ ID NO：5)的氨基酸29到212或其片段。
65.一种制品，其包含：
(a)一种组合物，其含有有效量的权利要求1或13的OPG配体多肽，权利要求21的激动剂，或权利要求32或46的拮抗剂；
(b)含有所述组合物的容器；和
(c)粘贴在所述容器上的标签，或包括在所述容器中的包装插页，其指示所述OPG配体多肽或激动剂或拮抗剂在治疗免疫相关疾病中的应用。
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