CN1522264A - 抗cd40单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

对CD40有激动或拮抗的作用的抗体或它的功能片段。

Description

抗CD40单克隆抗体
技术领域
本发明涉及识别人B细胞、树突状细胞(DC)等表面上存在的人CD40抗原的抗体或其功能片段。具体地说，本发明涉及对树突状细胞(DC)表面上的人CD40抗原有充分拮抗作用的抗人CD40抗体或其功能片段，和预期具有比常规抗人CD40抗体有更高治疗效果的激动性(agonistic)抗人CD40抗体或其功能片段。
背景技术
1.CD40
CD40是存在于细胞膜表面的分子量为50kDa的抗原。CD40是在B细胞、树突状细胞(DC)、某些类型的癌症细胞和胸腺上皮细胞上表达的。已知CD40在B细胞和DC的增殖和分化中起了重要作用。CD40已经被鉴定是在人B细胞表面上表达的抗原(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4494，1986，I.Stamenkovic等，EMBO J.8：1403，1989)。根据氨基酸序列的同源性，CD40被认为是TNF受体家族的成员，该家族包括低亲和力的NGF受体、TNF受体、CD27、OX40、CD30等。最近已经克隆了人和小鼠CD40的配体(CD40L)的基因，发现它是II型膜蛋白质，是在激活的CD4+T细胞上表达的。也已经表明，CD40L在人和小鼠B细胞中导入了强的激活信号。
已经证明CD40的表达在树突状细胞上比在B细胞上更频繁，所以显然CD40起了重要作用。CD40和CD40L的结合引起了抗原呈递细胞(APC)的激活。具体地说，它增强了共刺激分子如CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达，或IL-12的产生(Caux，C.等：通过CD40交联的人树突状细胞的激活，J.Exp.Med.，180：1263，1994)，(Shu，U等：激活的T细通过CD40-CD40配体的相互作用诱导单核细胞产生白介素-12，Eur.J.Immunol.25：1125，1995)。树突状细胞显示了强大的抗原呈递能力，并具有强大的激活辅助T(Th)细胞的能力。另外，人们认为，树突状细胞控制了天然的Th细胞分化成Th1或Th2细胞。当树突状细胞(DC1)通过在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养骨髓树突状细胞的外周血液单核细胞并利用CD40L而成熟时，DC1在体外能够产生IL-12，刺激并激活异常的天然(allo-naive)Th细胞，所以诱导了产生IFNγ的T细胞(特别是促进分化成Th1)。由于这一作用是通过抗IL-12抗体抑制的，反应可以由IL-12介导。在其他方面，当通过培养存在于有IL-3和CD40配体的外周血液中的淋巴组织T区域或类浆细胞(plasmacytoid)T细胞来制备淋巴细胞-树突状细胞(DC2)时，DC2不能生产IL-2，刺激和激活异常的天然Th细胞，诱导生产IL-4的T细胞，从而促进分化成Th2。人们认为Th1细胞参与了细胞免疫的激活，Th2细胞参与了体液免疫能力的增强以及细胞免疫能力的抑制。用Th1细胞辅助激活细胞毒性T细胞(CTL)可以除去在细胞质和肿瘤细胞中扩增的病原因子(许多病毒、单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核杆菌(tubercle bacillus)，弓形虫原生动物(toxoplasma protozoa)等)。
已经显示，识别膜表面表达的CD40的抗CD40单克隆抗体在B细胞上发挥了各种生物活性。抗CD40单克隆抗体大部分被分类成影响CD40和CD40L之间相互作用的激动性和拮抗性抗体。
2.激动性抗体
B细胞的激活已知是激动性抗体的作用。例如，已经报道抗CD40的抗体可以诱导细胞的粘附(Barrett等，J.Immumol.146：1722，1991；Gordon等，J.Immunol.140：1425，1988)，增大细胞体积(Gordon等，J.Immunol.140：1425，1988；Valle等，Eur.J.Immunol.19：1463，1989)，诱导只用抗IgM抗体、抗CD20抗体或佛波酯激活的B细胞的分裂(Clark和Ledbetter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4494，1986；Gordon等，LEUCOCYTE TYPING III.A.J.McMicheal ed.Oxford UniverstityPress.Oxford，p.426；Paulie等，J.Immunol.142：590，1989)，在存在IL4时诱导B细胞的分裂(Valle等，Eur.J.Immunol.19：1463，1989；Gordon等，Eur.J.Immunol.17：1535，1987)，诱导IgE的表达(Jabara等，J.Exp.Med.172：1861，1990；Gascan等，J Immunol.147：8，1991)，用IL-4刺激和无T细胞时培养的细胞的IgG和IgM(Gascan等，J.Immunol.147：8，1991)，通过IL-4(Gordon和Guy，Immunol.Today 8：339，1987；Cairns等，Eur.J.Immunol.18：349，1988)增强来自B细胞的可溶CD23/FcεRII的分泌和细胞上的表达(Challa A，Allergy，54：576，1999)，并促进IL-6的产生(Clark和Shu，J.Immunol.145：1400，1990)。另外，已经报道，B细胞克隆是通过在存在CDw32+粘附细胞时加入IL-4和抗CD40抗体从人初级培养B细胞建立的(Bancherau等，Science241：70，1991)，并且抑制生发中心细胞的程序死亡是CD40介导的，尽管有抗原受体的功能(Liu等，Nature 342：929，1989)。如上所述，CD40已经鉴定为人B细胞表面上表达的抗原。已经主要利用诱导人B细胞的增殖和分化的功能和诱导癌症细胞的细胞死亡作为指示物的活性来评估大多数分离的抗体(Katira，A.等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman等，eds.P547.Oxford University Press.Oxford，W.C.Flansow等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman等，eds.P.555.Oxford University Press.Oxford.J.D.Pound等，IntemationalImmunology，11：11，1999)。
抗CD40能导致DC的成熟(Z.H.Zhou等，Hybridoma，18：471，1999)。另外，已经报道在抗原特异性的CD8T细胞引发(priming)中CD4T细胞的作用是通过CD40-CD40L信号来激活DC。已经显示，在树突状细胞(DC)的激活中CD4辅助T细胞的作用可以通过抗CD40的单克隆抗体(mAb)来替代(Shoenberger，S.P.等：T细胞辅助细胞毒性T淋巴细胞是通过CD40-CD40L相互反应来介导的，Nature，480，1998)。另外，在小鼠中，通过施用抗CD40抗体不仅可以保护生物体不受表达CD40的肿瘤细胞的侵害，而且可以不受不表达CD40的肿瘤细胞的侵害(French，R.R.等：CD40抗体引起去除淋巴瘤和免于T细胞辅助的细胞毒性T细胞应答，Nature Medicine，5，1999)。
至今报道的大多数抗体还没有用针对DC的效果作为指示物来分离。然而，在DC功能的修饰方面，用抗体对B细胞的作用来选择的抗体似乎不足以作为治疗药剂。据报道，根据抗体识别的表位，在抗小鼠CD40的单克隆抗体中，有与DC反应而与血管内皮细胞不反应的克隆，和不与DC反应而与血管内皮细胞反应的克隆(Van Den Berg，TK等，Immunology，88：294，1996)。人们也假设人CD40抗体对DC的结合和作用是根据表位而不同的。
已知，抗CD40抗体或CD40配体可以阻遏表达CD40的淋巴瘤细胞系的增殖，所以可以诱导细胞死亡。(Funakoshi S等，Blood，83：2782，1994；Funakoshi S等，Journal of Immunotherapy，19，93，1996；Z.H.Zhou等，Hybridoma，18：471 1999；和Joseph A等，CancerResearch，60：3225，2000)。关于激动性抗体，有趣的是抗体的功能并不总是与CD40L的一致。激活B细胞的作用也不与阻遏B细胞肿瘤生长的作用一致。人们需要的是开发具有DC激活能力和肿瘤细胞增殖阻遏作用的抗体。另外，在激动性抗体中间，抑制和不抑制CD40L与CD40的结合的抗体是存在的(Challa A等，Allergy，54：576，1999)。例如，G28-5(ATCC No.HB-9110)产生的抗体与CD40L竞争，所以没有与CD40L组合应用产生的影响。表达CD40的细胞的激活程度是根据抗体而不同的。甚至当抗体独立地显示弱的激动活性的时候，将抗体与CD40配体结合使用能比单独使用CD配体产生的活性更明显地提高存在抗体时的活性。相反，甚至当抗体独立地显示激动活性时，CD40配体的抑制在存在抗体时可以将活性降低到比单独使用CD40配体产生的活性更低的程度(Pound等，Intemational Immunology，11：11，1999)。已经显示，使用不与CD40配体竞争的抗体，虽然抗体本身阻遏肿瘤细胞增殖的作用是弱的，但在存在CD40配体时可以达到更强的增殖抑制(Joseph A等，Cancer Research，60：3225，2000)。因此，需要的是开发结合CD40以独立地抑制细胞增殖，但不抑制CD40配体与CD40结合的抗体。通过充分利用这些特性的优点，有可能开发出比可溶CD40L更有效的治疗药剂。例如，可溶的CD40L是通过与CD40的结合而激活的，同时，它抑制了体内存在的CD40L的功能。不与CD40L竞争的抗体不会引起这样的抑制，并且通过协同作用可以预期有更好的治疗效果。
3.拮抗性抗体
同时，如上所述，可以预期因为CD40在免疫反应中有重要作用，可以通过抑制CD40和它的配体的结合来开发器官移植的免疫抑制和针对自体免疫疾病的治疗药剂。Sawada-Hase等已经报道，强烈表达CD40的细胞的比例在Crohn疾病的患者的外周血液单核细胞中是增加的。但是，抑制CD40与它的配体的结合的抗体还没有被很好地了解。例如，抑制结合的抗体可以是对CD40的功能性分析和需要CD40的激活的抗疾病治疗是有效的。另外，也已经显示抑制CD40的配体的抗体具有有效地作为抵抗其中涉及CD40和CD40配体的结合的疾病的治疗药剂的潜力。但是，已经报道，CD40L是在激活的血液血小板中表达的(V.Henn等，Nature 391：591，1998)。已经报道，如果抗CD40L抗体用作治疗药剂，存在引起凝血的危险(T.Kawai等，Nat.Medi.6：114，2000)。从这样的一个观点来看，可以预期抗CD40的抗体作为抑制CD40与它的配体结合的治疗药剂，比抗CD40L的抗体更安全。需要抗CD40抗体抑制CD40L与CD40的结合，而不是通过抗体本身激活CD40。
虽然，在过去对于特异性地结合人CD40并抑制CD40L与CD40的结合而不激活CD40的抗体已经进行了大量的研究，但只报道了一个例子，即称为5D12的小鼠抗人CD40抗体(J.Kwekkeboom等，Immunology 79：439，1993)。另外，还不知道是否显示B细胞中和活性的抗体也显示DC中和活性，即是否抗体可以中和CD40配体的作用。另外，已经报道，生物素化抗小鼠CD40抗体的作用可以通过与抗生物素蛋白的交联来增强(Johnson等，Eur J Immunol，24：1835，1994)。我们利用针对标记(FLAG)的抗体(M2)增强了针对B细胞系(Ramos细胞)的可溶CD40配体的作用，并且测量了中和活性，所述抗体在此之前已经通过遗传工程技术提供给可溶配体。因此，我们证明，5D12(ATCC No.HB-11339)只显示轻微的中和活性。
我们最近发现，作为甚至在没有CD40L时交联的结果，5D12(一种拮抗性抗体)对它自身具有激动活性。已经报道，小鼠CD40抗体的作用是通过生物素与抗生物素蛋白的交联而增强的(Johnson等，EurJ Immunol.，24：1835，1994)。另外，已知利用固相化(solid-phased)在平板上的抗免疫球蛋白抗体固相化CD40抗体，可以导致抑制肿瘤细胞增殖的活性的增强。这被认为是固相化产生的效果。但是，还不知道，当在培养溶液中加入抗免疫球蛋白抗体用于抗CD40抗体的交联时，拮抗性抗体可能显示激动活性。如果用于治疗的抗体具有抗原性，可以产生完全相反的效果，制备在人体中结合CD40抗体的抗体，并且CD40抗体与之交联，由此产生了似乎与CD40配体相同的活性。相应地，从治疗药剂的安全性出发，将抗体的抗原性保持在低水平是非常重要的。考虑这样一种情况，其中治疗药剂是根据小鼠抗体的可变区的序列通过人源化技术来开发的。由于人源化抗体具有免疫原性，在施用之后可能产生抗人源化抗CD40的抗体。特别是，存在抗体变成激动性抗体的危险。即使抗原性是低的，抗CD40抗体也可以与抗体受体(FcR)交联。从这些事实出发，优选的拮抗性抗体这样一种人抗体，它特异性地结合CD40，抑制CD40L的结合，甚至通过交联也不激活CD40，具有与FcR的弱结合。
发明内容
如上所述，最近对DC的功能的分析已经日益增加，所以CD40已经开始被识别到是在控制DC的功能中的重要基因。从这一背景出发，本发明的目的是利用一种使用DC的评估系统，提供抗人CD40抗体或其功能片段，它对树突状细胞(DC)表面的人CD40抗原也基本上是拮抗性的；并提供激动性的抗人CD40抗体或其功能片段，可以预期它具有比常规的抗人CD40抗体更高的治疗效果。
作为关于抗人CD40的抗体的制备的深入研究的结果，我们完成了本发明，产生了被认为对疾病具有比常规的已知抗CD40抗体更高的治疗效果的新的激动性抗体和拮抗性抗体来。即本发明如下。
(1)抗人CD40的抗体，或其功能片段，具有选自下列特性(a)至(f)中的至少一个特性：
(a)在存在LPS和IFNγ时作用于树突状细胞，产生IL-12；
(b)具有作用于树突状细胞导致细胞成熟的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(c)具有促进已建立的B细胞系表达CD95的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(d)具有抑制已建立的B细胞系增殖的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(e)诱导已建立的B细胞系的细胞死亡；和
(f)不抑制CD40配体与CD40的结合。
(2)本发明的上述抗体或其功能片段，其中树突状细胞的成熟是在20μg/ml或更低的浓度下进行的。另外，抗体或其功能片段促进已建立的B细胞系在抗体浓度20μg/ml或更低的浓度下表达CD95。已建立的B细胞系的例子包括Ramos、HS-Sulton等。
(3)另外，本发明的上述抗体或其功能片段当将浓度为0.1μg/ml或更多的抗体加入到浓度为1×106细胞/ml的树突状细胞中时产生100pg/ml或更多的IL-12，当加入1μg/ml或更高浓度的抗体时，产生1000pg/ml或更多，优选10000pg/ml或更多的IL-12。
(4)另外，在0.01μg/ml和10μg/ml的抗体浓度范围内，本发明的上述抗体或其功能片段，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的高约2到3倍。例如，抗体浓度为0.01μg/ml时，其表达效力比作为对照的G28-5抗体的表达高约2到6倍或更高。抗体浓度为0.1μg/ml时，其表达效力比作为对照的G28-5抗体的表达高约2到7倍或更高。抗体浓度为1μg/ml时，其表达效力比作为对照的G28-5抗体的表达高约2到7倍或更高。抗体浓度为10μg/ml时，其表达效力比作为对照的G28-5抗体高约2到6倍或更高。
(5)一种抗体或其功能片段，具有杂交瘤KM302-1(保藏号：FERMBP-7578)，KM341-1-19(保藏号：FERM BP-7759)，2105(保藏号：FERMBP-8024)，或F1-102(保藏号：ATCC PTA-3337)产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
名称 保藏号 保藏日期 保藏在
KM302-1  FERM BP-7578 2001年5月9日 国际专利生物保藏机构，国家高级工业科学技术研究所(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)
KM341-1-19  FERM BP-7759 2001年9月27日
2105  FERM BP-8024 2002年4月17日
F1-102  ATCCPTA-3337 2001年4月24日 美国典型培养物保藏中心(10801University Blvd，Manassas，Virginia，20110-2209，US.A)
(6)一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤F2-103产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，它们分别由保藏号ATCC PTA-3302和ATCC PTA-3303的质粒DNA编码；杂交瘤F5-77产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，它们分别由保藏号ATCC PTA-3304和ATCC PTA-3305的质粒DNA编码；或杂交瘤F5-157产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，它们分别由保藏号ATCC PTA-3306和ATCC PTA-3307的质粒DNA编码。
名称 保藏号 保藏日期 保藏在
F2-103重链(F2-103-H) ATCCPTA-3302 2001年4月19日 美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBlvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A)
F2-103轻链(F2-103-L) ATCCPTA-3303 2001年4月19日
F5-77重链(F5-77-H) ATCCPTA-3304 2001年4月19日
F5-77轻链(F5-77-L) ATCCPTA-3305 2001年4月19日
F5-157重链(F5-157-H) ATCCPTA-3306 2001年4月19日
F5-157轻链(F5-157-L) ATCCPTA-3307 2001年4月19日
(7)一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤KM341-1-19产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：28和30表示；杂交瘤2105产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：32和34表示；杂交瘤110产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：36和38表示；杂交瘤115产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：40和42表示；杂交瘤KM643-4-11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：52和54表示；杂交瘤F2-103产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ IDNOS：60和62表示；或者杂交瘤F5-77产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：64和66表示。
(8)一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：从杂交瘤KM341-1-19分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：27和29表示；从杂交瘤2105分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：31和33表示；从杂交瘤110分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：35和37表示；从杂交瘤115分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：39和41表示；从杂交瘤KM643-4-11分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：51和53表示；从杂交瘤F2-103分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQID NOS：59和61表示；或从杂交瘤F5-77分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：63和65表示。
(9)一种抗人CD40的抗体或其功能片段，具有选自下列特性(g)至(j)中的至少一个：
(g)中和CD40上配体的作用；
(h)中和或减弱已建立的B细胞系上的CD40的配体在表达CD40的细胞上具有的一种或多种作用，并具有对已建立的B细胞系上的CD40的激动作用，由于抗免疫球蛋白抗体的交联，该激动作用比5D12的更弱；
(i)减弱或中和CD40配体对已建立的B细胞系的作用，增强CD95表达；和
(j)对树突状细胞上表达的CD40具有拮抗作用。
(10)上面(9)的抗体或功能片段，当将浓度0.1μg/ml的抗体加入补充了饱和量的表达CD40L的细胞的1×106细胞/ml的Ramos细胞时，可以抑制Ramos细胞中CD95的表达水平比对照低约10％或更低(to a level approximately 10％or less than that of a control)；当加入抗体的浓度1μg/ml时，可以抑制Ramos细胞中CD95的表达到和阴性对照相同的水平；当加入的抗体浓度为10μg/ml时，可以抑制Ramos细胞中CD95的表达到与阴性对照相同的水平。
(11)上面(9)的抗体或其功能片段，其中当在补充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃体B细胞中加入浓度为0.001μg/ml到10μg/ml之间的抗体时，扁桃体B细胞的增殖在体外受到约80％到约95％或更多的抑制。例如，当加入的抗体的浓度在0.01μg/ml到10μg/ml之间时，扁桃体B细胞的增殖受到约95％或更多的抑制。特别是，当加入的抗体的浓度为0.001μg/ml时，扁桃体B细胞的增殖受到约80％或更多的抑制。
(12)一种抗体或其功能片段，具有杂交瘤KM281-1-10(保藏号：FERM BP-7579)，4D11(保藏号：FERM BP-7758)或F4-465(保藏号：ATCC PTA-3338)产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
名称 保藏号 保藏日期 保藏在
KM281-1-10  FERMBP-7579 2001年5月9日 国际专利生物保藏机构，国家高级工业科学技术研究所(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)
4D11  FERMBP-7758 2001年9月27日
F4-465  ATCCPTA-3338 2001年4月24日 美国类型培养物收藏处(10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209，U.S.A.)
(13)一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤KM281-1-10产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：44和46表示；杂交瘤4D11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：48和50表示；或杂交瘤F4-465产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ IDNOS：56和58表示。
(14)一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：从杂交瘤KM281-1-10分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：43和45表示；杂交瘤4D11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：47和49表示；或从杂交瘤F4-465分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：55和57表示。
(15)上面(1)到(14)的抗体或其功能片段的例子，包括人抗体。
(16)一种药物组合物，含有上面(1)到(15)中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
(17)一种免疫强化剂、抗肿瘤药剂或抗自体免疫疾病药剂，含有上面(1)到(8)中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
(18)一种免疫抑制剂、抗自体免疫疾病药剂、抗过敏的治疗药剂或抗凝血因子VIII抑制综合症的治疗药剂，含有上面(9)到(14)中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
(19)在此，本发明的单克隆抗体识别的人CD40的表位，可以通过已知的方法来测定，例如通过检测与从人CD40的一级氨基酸序列得到的重叠的(overlapping)合成寡肽的结合(例如，Ed Harlow和David Lane(eds.)， 抗体：实验室手册，1988，冷泉港实验室出版；美国专利No.4708871)。具有噬菌体展示过程(process)的肽文库试剂盒(新英格兰生物实验室)也可以用于表位的图谱定位。本发明也包括识别人CD40的新表位的抗体或其功能片段，它被上述各杂交瘤产生的抗体或其功能片段识别。
(20)本发明进一步提供了一种核酸(RNA或cDNA)，它编码至少从上述各杂交瘤分离的抗体的重链和/或轻链的可变区，本发明还提供含有该核酸的载体和携带该核酸的寄主细胞。
以下详细描述本发明。本说明书(specification)包括PCT申请PCT/US01/13672(2001年4月27日递交)、日本专利申请2001-142482(2001年5月11日递交)、日本专利申请2001-310535(2001年10月5日递交)和美国专利申请USSN 10/040,244(2001年10月26日递交)的说明书和/或附图中公开的内容的一部分或全部，这些申请文本是本申请的优先权文本。
如后面所述，我们已经发现，已知的单克隆抗体5D12(ATCC No.HB-11339)是拮抗B细胞上的CD40的，不是拮抗DC上的CD40的。我们进一步发现，作为抗免疫球蛋白抗体交联的结果，即使它们是阻遏CD40L的作用的拮抗性抗体，许多单克隆抗体显示对其自身有激动活性。
1.定义
用于本说明书的术语定义如下。
本发明中的术语“人CD40”指具有Clark等(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4494 1986)或Stamenkovic等(I.Stamenkovic等，EMBO J.8：1403，1989)显示的氨基酸序列的多肽。特别地，人CD40是在B细胞、DC、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞或这些细胞的肿瘤细胞的表面上表达的抗原多肽。
术语“抗CD40单克隆抗体”指抗细胞表达的CD40、全长的CD40或部分长度的CD40的任何单克隆抗体。更优选的抗CD40单克隆抗体结合了CD40的细胞外部分，提供了表达CD40的细胞上的激动或拮抗作用。
另外，本发明中的术语“抗体”来源于编码组成免疫球蛋白的重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的基因(通常称为“抗体基因”)。本发明的抗体包括任何免疫球蛋白类别和具有任何同型(isotype)的抗体。本发明的抗体的术语“功能片段”是如上定义的抗体的一部分(部分片段)，指保留抗体对抗原的一种或多种作用的片段。这样的功能片段的特定的例子包括F(ab’)2，Fab’，Fab，Fv，具有二硫键的FVs，单链FV(scFV)，和其多聚物(D.J.King.，单克隆抗体的应用和工程化，1998 T.J.International Ltd)。
本发明中的术语“人抗体”指这样一种抗体，它是来源于人的抗体基因的表达产物。
术语“激动性”指促进CD40配体与细胞表面上表达的CD40结合的作用，所述细胞例如B细胞、肿瘤细胞或树突状细胞；或提供给表达CD40的细胞一种或多种作用，所述作用是通过CD40配体提供给表达CD40的细胞的。术语“激动性抗体”指具有这样的激动性作用的抗体。
术语“拮抗性”指抑制CD40配体与细胞表面上表达的CD40结合的作用，所述细胞例如B细胞、肿瘤细胞或树突状细胞的；或中和CD40配体提供给表达CD40的细胞的一种或多种作用。术语“拮抗性抗体”指具有这样的作用的抗体。
术语“树突状细胞(DC)”在本发明中指也称为树突状白细胞的具有很强抗原呈递功能的一组细胞。本文利用的树突状细胞是通过培养例如骨髓、脐带血或外周血中含有的CD34阳性前体细胞诱导的。或者，树突状细胞可以通过在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养外周血液中的CD14阳性单核细胞而得到。
术语“不成熟的DC”指DC是CD14阴性、CD1a强阳性、CD83、CD86阳性和MHC II类阳性。
术语“成熟的DC”指DC是CD14阴性、CD1a阳性和已经变成CD83、CD86和MHC II类强阳性。
术语“激活DC”在本发明中指DC通过对CD40刺激的应答诱导的变化。例如，它也指使不成熟的DC成熟，CD80、CD86和HLA-II类的高水平表达，和IL-12的生产的增强。或者，当T细胞共存在时，它也指刺激T细胞以促进它们的增殖。
术语“激活B细胞和B细胞系”在本发明中指细胞通过对CD40刺激的应答诱导的变化。例如，它指引起DNA合成，促进胸腺嘧啶的掺入，由此增加CD95的表达量。
2.抗体的获得
为了得到本发明的抗体，优选地利用作为抗原的用重组体产生和纯化的表达人CD40或可溶的人CD40的基因重组小鼠细胞系的来免疫小鼠。用于免疫的小鼠在生产人抗体时是优选的(Tomizuka等，ProcNatl Acad Sci USA.，2000，97卷：722)。通过选择结合利用重组体已经生产和纯化的可溶人CD40的单克隆抗体，也与B细胞以外的细胞上表达的CD40反应的抗体可以比通过选择特异性地与B细胞反应的克隆的情况更容易地得到。杂交瘤可以通过Kohler和Milstein等的方法生产(Nature，1975，256卷：495)，这一方法通常用于利用免疫小鼠的淋巴结或脾细胞来生产单克隆抗体中。
另外，可溶CD40L与CD40的结合是利用表面胞质团(plasmon)共振系统如BIAcore 2000(Biacore)来分析的，然后选择不竞争CD40L的抗体。另外，选择独立地抑制B淋巴瘤的细胞生长的抑制的抗体。另外，利用是否它们作用于DC作为指示物的条件进行抗体的选择。这能利用生产和选择具有作用于树突状细胞或B细胞而不与CD40L竞争，和抑制表达CD40的癌症细胞的增殖的抗体。
本发明的抗体是通过培养这样得到的杂交瘤得到的。另外，编码人单克隆抗体或其可变区的基因是从生产抗体的细胞如B细胞或杂交瘤克隆的，克隆的基因掺入适当的载体，然后将载体导入寄主(例如，哺乳动物细胞系，大肠杆菌，酵母细胞，昆虫细胞或植物细胞)，由此可以制备基因重组技术产生的重组抗体(P.J.Delves.，ANITBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，单克隆抗体.，2000，牛津大学出版社；J.W.Goding.，单克隆抗体：原理和实践，1993，学术出版社)。另外，生产了靶抗体基因通过转基因动物生产技术掺入内源基因的转基因的小牛，山羊，羊或猪。从这些转基因动物的奶，可以大量得到从抗体基因衍生的单克隆抗体。当在体外培养杂交瘤时，它们是在适于各种条件如待培养的细胞种类的特性，实验和研究的目的和培养的方法的各种方法下生长，维持和存储的。然后，杂交瘤可以利用从已知的用于在培养上清液中生产单克隆抗体的已知的营养培养基或已知的碱性培养基诱导和制备的任何营养培养基来培养的。
3.筛选
利用人B淋巴瘤通过分析进行激动性抗体的筛选，所以可以选择促进CD95表达的抗体。另外在纯化的DC培养溶液中加入抗体，任何选择导致成熟的抗体。或者，选择在利用不成熟的DC的混合淋巴细胞的反应中具有增殖的T细胞的活性的抗体。另外，在成熟的DC中加入抗体，然后，选择具有促进IL-12成熟的作用的抗体。另外，选择具有抑制表达CD40的肿瘤细胞的生长的活性或诱导肿瘤细胞的细胞死亡的活性的抗体。根据抗体是否利用例如表面胞质团共振系统(BIOCore)抑制可溶CD40与可溶CD40配体的结合可以区别与CD40L的竞争。另外，根据抗体是否增强CD40配体在B细胞系上的作用也可以从其他情况中区别。
利用人B淋巴瘤通过分析进行拮抗性抗体的筛选。在存在抗-FLAG抗体时加入具有FLAG作为标记的可溶CD40L能筛选更强烈地抑制人B淋巴瘤细胞上可溶CD40L与CD40的结合的抗体。通过导入编码CD40L而不是CD40L的基因，也可以利用在细胞表面表达许多CD40配体的重组细胞。随后，人抗体与抗人IgG抗体交联，所以除去了激活交联的B淋巴瘤的克隆。另外，选择当在成熟的CD中加入CD配体时在利用纯化和成熟的DC的混合的淋巴细胞反应中具有抑制T细胞增殖的活性的抗体或具有抑制IL-12生产的作用的抗体。
如上所述得到的抗体至少具有下面的任何特性，所述特性被认为是治疗效果。
(1)对于激动性抗体
(a)在存在LPS(脂多糖)和IFNγ时抗体作用于树突状细胞引起IL-12产生。LPS浓度在这一情况中范围为10pg/ml到10ng/ml，IFNγ浓度范围为10-4M到10-2M。在利用G28-5抗体作为对照的实验中，IL-12的生产量比已知的激动性抗CD-40抗体更大。当浓度为0.1μg/ml或更大的抗体加入到浓度为1×106g细胞/毫升的树突状细胞中时，产生了100pg/ml或更多的IL-12，或者当加入浓度为1μg/ml或更多时，产生了1,000pg/ml或更多，优选地10,000pg/ml或更多的IL-12(参见实施例9和13)。
(b)抗体具有结合树突状细胞的作用，能引起树突状细胞的成熟。另外，当抗体浓度为20μg/ml或更低，优选地0.1到15μg/ml；更优选地5到15μg/ml时，与树突状细胞一起培养，引起成熟的活性比G28-5抗体更高(参见实施例9)。
(c)抗体具有比G28-5抗体更大的促进已建立的B细胞系表达CD95的活性。在这一情况中，抗体浓度为10μg/ml或更大，优选地1μg/ml或更大，更优选地0.1μg/ml或更大，更优选地0.01μg/ml或更大，最优选地0.001μg/ml或更大，促进CD95表达的活性比实验中用作对照的G28-5抗体的活性更大。在实验中用作对照的G28-5抗体促进CD95的表达的活性与浓度10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml和0.01μg/ml的抗体的比例如下所示(表1)。
表1
抗体浓度 比例
10μg/ml 约2倍，优选地约3倍，更优选地4.5倍，更优选地6倍
1μg/ml 约2倍，优选地约5倍，更优选地约6倍，更优选地7倍
0.1μg/ml 2倍，优选地6倍，更优选地约7倍
0.01μg/ml 2倍，优选地4倍，更优选地5倍，更优选地约6倍
促进CD95的表达是指，抗体激活已建立的B细胞系。这里，已建立的B细胞系的例子包括Ramos细胞和HS-Sulton细胞。另外，Ramos细胞是Burkitt淋巴瘤，它是人树突状B细胞的模型细胞。HS-Sulton细胞是Burkitt淋巴瘤(参见实施例6和12)。
(d)抗体具有抑制DNA合成，胸腺嘧啶掺入，和已建立的B细胞系(Ramos细胞或HS-Sulton细胞)的增殖的活性，这一活性比G28-5抗体的活性更高。在这一情况中，抗体的浓度至少0.05μg/ml，或者更优选地是0.1到15μg/ml(参见实施例8)。
(e)抗体诱导已建立的B细胞系的细胞死亡(参见实施例16)。
(f)抗体不抑制CD40配体与CD40的结合。术语“不抑制”指CD40L可以结合CD40到与当没有抗体时甚至当抗体已经结合了CD40(即没有抗体)时相同的程度。CD40配体和CD40中的一个或两个可以是在膜上或可溶蛋白质上表达的蛋白质类型(参见实施例11)。
例如，通过杂交瘤KM302-1(FERM BP-7578)和杂交瘤KM341-1-19(FERM BP-7759)可以产生具有上面的特性的抗体。
测定了杂交瘤KM341-1-19产生的单克隆抗体的重链(H链)和轻链(L链)可变区的核苷酸序列和氨基酸序列(实施例17)。本发明提供了至少编码重链可变区或全长重链的DNA，和编码杂交瘤KM341-1-19产生的单克隆抗体的轻链可变区的DNA。DNA也包括其他编码由于密码子间并的相同的氨基酸序列和实施例17中所述的那些。另外，本发明提供了至少重链可变区的氨基酸序列或全长重链的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列特异的单克隆抗体或其功能片段，如实施例17中公开的。
(2)对于拮抗性抗体
(g)抗体中和了CD40的配体的作用。这里，术语“配体的作用”指T细胞上或其他细胞上表达的配体的作用和自由CD40的配体的作用(参见实施例7和14)。
(h)抗体中和已建立的B细胞系上CD40的配体对表达CD40的细胞的一种或多种作用，和在上面的已建立的B细胞系上通过与抗免疫球蛋白抗体的交联对CD40不具有拮抗作用。这一作用比5D12的更弱。“配体对表达CD40的细胞的作用”指表达CD40的细胞的激活。特别是，在B细胞中，该效果指胸腺嘧啶掺入和B细胞增殖的激活，和在建立的B细胞系中CD95增强的表达的激活。另外，在DC中，该效果指DC成熟的激活，CD86和HLA-DR的增强的表达的激活，共存的T细胞的胸腺嘧啶的激活，增殖的促进，IL-12和IL-10的生产的激活等。通过导致在培养溶液中产生0.1μg/ml或更多的抗免疫球蛋白抗体进行抗免疫球蛋白抗体的交联(见实施例7)。
(i)抗体缓解或中和交联的CD40L或细胞表达的CD40L的活性来增强已建立的B细胞系中CD95的表达。抗体也缓解或中和CD40L的活性，其作用是通过与抗体的交联和抗体标记的抗体来增强的。CD40与表达CD40的细胞的配体(包括游离的配体和特异的细胞表达的配体)的结合，最后导致细胞在细胞表面上表达CD95(Fas)。因此，本发明的拮抗性抗体通过与CD40结合抑制上面的信号传导，从而中和CD95的表达。在这一情况中的抗体的浓度是1μg/ml或更多，优选地是0.1μg/ml或更多(参见实施例7和14)。
(j)抗体拮抗DC上的CD40。具体地说，抗体缓解或中和CD40L激活DC的活性。当通过T细胞上的配体与DC共存在来刺激DC时，T细胞被激活，所以促进了胸腺嘧啶的掺入等。在混合的淋巴细胞的反应中，允许来源于不同的个体DC和T细胞共存在，DC与T细胞相互反应，从而导致T细胞激活。本发明的拮抗性抗体通过结合CD40抑制上面的相互反应，导致胸腺嘧啶的掺入受到抑制。在这一情况中抗体的浓度至少是0.001μg/ml，或者更优选地是0.1到10μg/ml(参见
实施例10)。
上面的拮抗性抗体是通过例如杂交瘤KM281-1-10(FERM BP-7579)和KM281-2-10-1-2(FERM BP-7580)(2001年5月9日，国际专利生物保藏(IPOD)，保藏于高级工业科学和技术研究所(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki)和4D11(FERM BP-7758)产生上面的拮抗性抗体。
(3)本发明的抗体可被改变成不同亚类的抗体(例如，参见EP314161公开)，方法是用本领域已知的遗传工程技术，特别是通过用确定另一亚类的区域取代抗体重链中确定亚类的区域。重链可变区和另一亚类的恒定区可以直接连接。例如，改变本发明的抗体的亚类成IgG2或IgG4能使降低抗体与Fc受体的结合程度。具体地说，根据Kabat等(Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，国家健康研究所，Bethesda，Md.(1991))在人抗体重链，EU指标118(Ala)，119(Ser)位点中导入Nhe I位点(GCTAGC)。利用关到另一亚类的限制酶消化，不改变氨基酸可以关到另一亚类IgG。另外，人工改变恒定区的氨基酸序列，或具有这样的改变的氨基酸序列的恒定区序列与本发明的抗体的可变区的结合可以降低Fc受体的结合程度(Lund J.等，J.Immunol.1991147卷：2657-2662)，或者也可以提高或降低CDC的活性(Tao M.等，J.Exp.Med.19911025-1028卷，Idusogie E E.等，J.Immunol.2001 166卷：2571-5)。另外，为了避免ADCC，CDC等的作用，可以先选择IgG2或IgG4亚类抗体。另外，放射性核素，细菌毒素，化学治疗剂，前药等与本发明的抗体的结合可以进一步增强抗疾病如癌症的治疗效果。
4.药物组合物
含有本发明的纯化抗体的药物制剂的药物组合物也包括在本发明的范围内。这样的药物组合物优选地除了抗体还含有生理可接受的稀释剂或载体，或者可以是与其他抗体或其他药物如抗生素的混合物。适当的载体的例子包括但不限于生理盐溶液，磷酸缓冲盐溶液，磷酸缓冲盐葡萄糖溶液和缓冲生理盐。另外，抗体是冻干的，然后当需要时加入上述的缓冲水溶液来重建。给药的途径的例子包括口服途径和肠胃外途径，包括静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内注射或药物递送。
在这种情况中，与有效剂量的本发明的抗体，适当的稀释剂结合给药的有效剂量的范围是每次给药，每公斤体重0.1mg到100mg。给药进行的间隔是2天到8星期。
当利用含有本发明的抗体的药物组合物时，特别是当利用激动性抗体时，组合物用作免疫强化药物(抗病毒药剂和抗感染药物)，抗肿瘤药剂或抗自体免疫疾病药剂。这些疾病的多个例子可以同时发生。另外，抗体也可以用作与疫苗如癌症特异的肽结合的佐剂。当组合物含有拮抗性抗体，在器官移植是用作器官移植基础上的免疫阻遏药剂(针对免疫注射的预防性或治疗性药剂或在移植胰岛，肾等的基础上的GVHD)，或抗自体免疫疾病药剂(例如，针对风湿病，或作为针对动脉硬化，弥漫性硬化，系统性红斑狼疮，自发性凝血病或Crohn疾病的治疗药剂)，针对过敏如气喘的治疗药剂，或针对血液凝血因子VIII抑制综合症的治疗药剂。这些疾病的多个例子可以同时发生。
当将抗CD40抗体用于针对CD40参与的疾病的治疗方法时，可以期望通过利用DC的功能作为指示物来选择抗体，提供更好的治疗效果。
在激动性抗体的情况中，可以期望具有强免疫强化作用的抗体可以通过选择可以更有效地激活DC的抗体来得到。另外，利用成熟的DC作为指示物促进IL-12的生产，可以得到具有强CTL诱导作用的抗体。通过CTL诱导，可以得到除去用病毒或肿瘤细胞感染细胞内高度有效的抗体。另外，因为可以期望协同效果，优选的抗体结合CD40而不抑制CD40配体与CD40的结合。当考虑癌症治疗时，如果存在直接诱导表达CD40的癌症细胞的细胞死亡或抑制它们的增殖和有效激活DC的抗体，可以从中期望协同效果，这样的抗体可以是用于抵抗不表达CD40的肿瘤的治疗药剂。这些抗体可以认为是可以用作抵抗病毒疾病的治疗药剂或抗肿瘤药剂。
同时，特异性地结合CD40和抑制CD40L的结合而不激活CD40的抗体也可以期望不仅能够抑制B细胞的配体的作用，而且抑制DC上的作用。但是，利用它们在B细胞上的效果作为指示物至今已经得到抗体。所以，得到同样在树突状细胞上有强大的阻遏作用的抗体抱歉开发它们作为药物产物是非常有意义的。另外，关心的是通过如上所述的交联，抗CD40抗体可以具有基本上相反的作用。所以，甚至通过交联也不激活CD40的抗体叔需要的。同样关心的是，迄今作为抗人CD40抗体报道的从非人哺乳动物如小鼠衍生的单克隆抗体，包括小鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体，和CDR移植产生的人源化抗体具有抗原性。所以，人抗体可以如愿作为抗体移植与CD40配体的结合。
附图简述
图1显示KM302-1抗体促进CD95的表达。
图2A显示拮抗性抗体中和Ramos细胞上CD40配体的作用。
图2B显示拮抗性抗体中和Ramos细胞上CD40配体的作用。
图3显示KM281-1-10抗体中和Ramos细胞上CD40配体的作用。
图4显示交联的KM281-1-10抗体不促进CD95的表达。
图5显示交联的5D12抗体促进CD95的表达。
图6显示肿瘤细胞上的KM302-1抗体的增殖阻遏效果。
图7显示KM302-1抗体促进DC的成熟。
图8显示KM302-1抗体促进DC的IL-12的产生。
图9显示KM281-1-10抗体中和DC上CD40配体的作用。
图10显示KM281-1-10抗体中和DC上CD40配体的作用。
图11显示KM302-1抗体激活不成熟的DC-MLR。
图12显示KM341-1-19抗体等促进Romos细胞的CD95的表达。
图13显示KM341-1-19抗体促进成熟的DC的IL-12的产生。
图14显示KM341-1-19抗体促进成熟的DC的IL-10的成熟。
图15显示4D11抗体等中和Ramos细胞上CD40配体的作用。
图16显示KM302-1抗体在人肿瘤细胞移植小鼠模型上抗肿瘤的效果。
图17显示KM341-1-19抗体显示了抵抗肿瘤细胞的增殖阻遏效果。
图18显示F4-465，4D11和KM281-1-10阻遏了特异于抗原的IgG的生产。
图19显示F4-465，4D11和KM281-1-10阻遏了特异于抗原的IgM的产生。
图20显示F4-465阻遏了扁桃体B细胞的增殖。
实施本发明的最佳方式
参考实施例，本发明将被进一步详细叙述。但是，本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
实施例1抗原的制备
(1)细胞
EL-4细胞是来源于小鼠的已建立的T细胞系，可以容易地得到(ATCC：TIB-39)。从ATCC购买了Ramos B细胞(ATCC No.：CRL-1596)和产生小鼠抗CD40抗体的杂交瘤G28-5(HB-9110)和5D12(HB-11339)。
(2)抗原的表达和纯化
利用人CD40 cDNA(Genbank登记号：NM_001250)作为模板，和下面的引物，在条件20个循环的95℃5秒，55℃30秒和72℃30秒，通过PCR扩增细胞外的区域。
引物  1：5’-CCCAGATCTG TCCATCCAGA ACCACCCACTGCATGCAGAG-3’(SEQ ID NO：1)
引物  2：5’-ACAAGATCTG GGCTCTACGT ATCTCAGCCGATCCTGGGGA C-3’(SEQ ID NO：2)
在蜂毒素信号序列之前和pFastBac载体(Gibco BRL)的来源于人IgG1的FC或来源于小鼠的FC区域之前插入扩增的cDNA。为了产生CD40，根据说明制备了重组的杆状病毒。用重组病毒感染Th5细胞，然后培养4天。用0.22nm滤纸处理上清液，在其中加入蛋白质G琼脂糖(Amersham Pharmacia)，然后在4℃温和摇动混合物。过一夜后，将琼脂糖转移到柱上，然后用20个体积的PBS洗涤。用20mM的甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱人CD40 FC蛋白质。从Randolph J.Noelle(Inui，S等，EJI，20，1747-1753，1990)得到细胞表面上表达CD40的载体。用Xba I酶裂解全长的cDNA，然后插入pCDNA3(INVITROGEN)。将载体导入EL-4细胞，然后在存在0.5mg/mlG418(Gibco BRL)时培养细胞，得到温度表达的菌株。利用FITC结合的抗体人CD抗体(Pharmingen)进行FACS分析证实CD40的表达。
实施例2用于免疫的小鼠的产生
用于免疫的小鼠具有一个遗传背景，它们对于内源的Ig重链和κ轻链是纯合的，同时小鼠含有染色体14片段(SC20)，含有人Ig重链基因座位，和人Igκ链转基因(Kco5)。这些小鼠是具有人Ig重链基因的A系小鼠和具有人Igκ链转基因的B系小鼠杂交产生的。A系小鼠对于破坏的内源Ig重链和κ轻链是纯合的，含有染色体14片段(SC20)，可以传递到子代，上述如在Tomizuku等的报告中(Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA.，2000 97卷：722)。免疫A系的小鼠，得到下面的杂交瘤F2-103和F5-77。另外，B系的小鼠(转基因小鼠)对于裂解的内源Ig重链和κ轻链是纯合的，含有人Igκ链转基因(Kco5)，上述如在Fishwild等的报告中所述(Nat Biotechnol.，1996 14卷：845)。
将通过A系的雄性小鼠和B系的雌性小鼠杂交，或A系的雌性小鼠与B系的雄性小鼠杂交得到的具有在血清中同时检测到的人Ig重链和κ轻链的个体用于下面的免疫实验。另外，通过与Kirin BreweryCo.，ltd的合同可以得到上面的产生人抗体的小鼠。通过免疫上面的小鼠，得到下面的杂交瘤KM302-1，KM341-1-19，KM643-4-11，2053，2105，3821，3822，285，110，115，KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24，KM225-2-56，KM341-6-9，4D11，5H10，11E1，5G3，3811，3411和3417。另外，含有Kuroiwa等报道的人抗体的Lambda链的嵌合小鼠也用于下面的免疫实验。从小鼠得到了杂交瘤F4-465。
实施例3制备抗人CD40的人单克隆抗体
根据单克隆抗体的实验方法(Tamie ANDO等，KODANSHA，1991)的引言中所述的一般的方法制备本实施例中的单克隆抗体。本文中用作免疫原的人CD40是实施例1中制备的人CD40人FC和表达CD40的EL-4-细胞。本文中用于免疫的动物是生产实施例2中制备的人免疫球蛋白的产生人抗体的小鼠。
用2到100μg/CD40免疫：hFc每个小鼠免疫产生人抗体的小鼠。除了第一次免疫，将抗原溶液与等体积的Freund不完全佐剂(Sigma)混合，然后皮下注射进几个分开的位点。每10天到3星期进行免疫约3到4次。对于第一次免疫，利用Freund不完全佐剂(Sigma)。从小鼠尾巴收集血液，然后利用ELISA测定抵抗CD40的人抗体γ和κ。在切除脾脏之前3到4天，通过尾静脉注射20μg CD40：溶解于PBS的Fc进行最后的免疫。
用表达人CD40的小鼠EL-4细胞免疫产生人抗体的小鼠。在PBS中悬浮EL-4细胞(108细胞/毫升)，然后与等体积的预先与PBS乳化的RIBI佐剂温和混合。约10天到3星期用细胞进行免疫3到5次。当不利用佐剂时，用X射线，用8000rad辐射细胞。
从免疫的小鼠通过外科得到脾脏。将收集到的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/10(ATCC No.：CRL1581)以比例5到1混合。用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)座位细胞融合的试剂融合细胞，制备大量的杂交瘤。通过在10％的胎牛血清(FCS)，次黄嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)补充的含有HAT的DMEM培养基(Gibco BRL)中培养选择杂交瘤。在96孔的微滴平板(Beckton Dicknson)上进行培养。利用酶联免疫吸附测试(ELISA)和荧光激活的细胞分拣器(FACS)，如实施例4所述测定进行产生抗人CD40的人单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选。
通过如下所述的3种类型ELISA和FACS分析进行ELISA筛选产生人单克隆抗体的杂交瘤。所以，得到大量的产生具有人免疫球蛋白γ链(hIgγ)和人免疫球蛋白轻链κ的人单克隆抗体的杂交瘤。在包括这一实施例的下面的任一实施例中，显示实施例的实验结果的表和图，利用信号给出了本发明的产生人抗人CD40单克隆抗体的杂交瘤克隆。后面注有“抗体”的克隆指各个杂交瘤产生的抗体，或携带从杂交瘤分离的抗体基因(全长或可变区)的寄主细胞产生的重组抗体。另外，在文中明确的范围内，杂交瘤克隆的名称可以表达抗体的名称。
下面的杂交瘤克隆代表单个克隆。
激动性抗体：
KM302-1，KM341-1-19，KM643-4-11，2053，2105，3821，3822，285，110，115，F1-102，F2-103，F5-77和F5-157。
拮抗性抗体：
KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24，KM225-2-56，KM341-6-9，4D11，5H10，11E1，5G3，3811，3411，3417和F4-465
在2001年5月9日保藏了它们中间的3个杂交瘤克隆KM302-1，KM281-1-10和KM281-2-10-1-2，在2001年9月27日保藏了克隆KM341-1-19和4D11，在2001年4月17日保藏了克隆2105，是根据布达佩斯条约保藏在国家高级工业科学和技术研究所国际专利生物保藏处(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的。根据布达佩斯条约，具有F2-103，F5-77和F5-157的重链和轻链可变区的质粒在2001年4月19日，杂交瘤克隆F1-102和F4-465在2001年4月24日保藏在ATCC(美国类型培养物保藏中心，University Blvd.10801，Manassas，Virginia，USA)(表2)。
表2
  名称   保藏号
  KM302-1   FERM BP-7578
  KM281-1-10   FERM BP-75 79
  KM281-2-10-1-2   FERM BP-75 80
  KM341-1-19   FERM BP-7759
  4D11   FERM BP-7758
  2105   FERM BP-8024
  F1-102   ATCC PTA-3337
  F4-465   ATCC PTA-3338
  F2-103重链(F2-103-H)   ATCC PTA-3302
  F2-103轻链(F2-103-L)   ATCC PTA-3303
  F5-77重链(F5-77-H)   ATCC PTA-3304
  F5-77轻链(F5-77-L)   ATCC PTA-3305
  F5-157重链(F5-157-H)   ATCC PTA-3306
  F5-157轻链(F5-157-L)   ATCC PTA-3307
实施例4杂交瘤的筛选
检测具有人免疫球蛋白γ链的单克隆抗体
以50μl/孔在96孔的ELISA的微滴平板(Maxisorp，Nunc)的每个孔中加入实施例1中制备的人CD40小鼠FC(1μg/ml)，在4℃，将吸收到微滴平板上的人CD40小鼠FC温育。然后，丢弃上清液，然后在每个孔中加入封闭试剂(Block Ace，DAINIPPPONPHARMACEUTICAL)，接着在室温下温育封闭。在每个孔中加入每个杂交瘤的上清液(50μl)，反应，然后用0.1％的含有吐温20的磷酸缓冲液(PBS-T)洗涤每个孔。然后，用含有FBS的1％的PBS-T稀释用过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(γ)抗体(Sigma，A0170)5000倍。在每个孔中加入溶液(50μl/ml)，然后进行温育。用PBS-T洗涤微滴平板3次，然后在每个孔中加入色原底物溶液(TMB，50μl/孔，SUMITOMO BAKELITE)，接着在室温下温育30分钟。在每个孔中加入终止溶液(50μl/孔)终止反应。用微滴读数器测定450nm波长处的吸光值。通过FACS分析阳性孔中的培养上清液，然后选择Ramos细胞染色的孔。通过限制稀释方法克隆孔中的细胞，然后在每个孔中得到I个克隆的细胞。利用人CD40小鼠FC，通过ELISA证实hk-阳性状态。作为结果，从20个小鼠得到173个克隆的抗人CD40抗体。表3(激动性抗体)和表4(拮抗性抗体)显示了这些抗体中的一些。在这些激动性抗体中，利用表达CD40L的细胞，表达CD40的细胞和抗体，在竞争实验中至少KM341-1-19和2105不明显地与配体竞争。
表3激动性抗体
杂交瘤  抗原  亚类 DC 肿瘤细胞
KM302-1  CD40小鼠FC  IgG4 激活 阻遏增殖
KM341-1-9  表达人CD40的EL-4  IgG2 激活 阻遏增殖
KM643-4-11  CD40小鼠FC  IgG1 未进行(notimplemented) 未进行
2053  CD40小鼠FC  IgG2 未进行 未进行
2105  CD40小鼠FC  IgG2 未进行 未进行
3821  表达人CD40的EL-4  IgG3 未进行 未进行
3822  表达人CD40的EL-4  IgG3 未进行 未进行
285  CD40小鼠FC  IgG1 未进行 未进行
110  CD40小鼠FC  IgG4 未进行 未进行
115  CD40小鼠FC  IgG4 未进行 未进行
F2-103  CD40小鼠FC  IgG4 未进行 未进行
F5-77  CD小鼠FC  IgG1 未进行 未进行
表4拮抗性抗体
杂交瘤  抗原  亚类 交联的效果 DC-MLR
KM281-1-10  CD40小鼠FC  IgG1 低 阻遏
KM281-2-10-1-2  CD40小鼠FC  IgG1 低 未进行
KM283-5  CD40小鼠FC  IgG4 明显 没有阻遏
KM225-2-56  CD40小鼠FC  IgG4 明显 未进行
KM292-1-24  CD40小鼠FC  IgG2 明显 未进行
KM341-6-9  表达人CD4的EL-4  IgG1 明显 未进行
4D11  CD40小鼠FC  IgG1 低 未进行
5H10  CD40小鼠FC  IgG1 低 未进行
11E1  CD40小鼠FC  IgG1 低 未进行
5G3  CD40小鼠FC  IgG2 明显 未进行
3811  表达人CD40的EL-4  IgG1 明显 未进行
3411  表达人CD40的EL-4  IgG2 明显 未进行
3417  表达人CD40的EL-4  IgG2 明显 未进行
F4-465  表达人CD40的EL-4  IgG1 未进行 未进行
除了利用过氧化物酶标记的山羊抗人Igk抗体(稀释1000倍，50μl/孔，Southern Biotechnology)，对于人免疫球蛋白γ链，以和上面所述的ELISA方法相似的方法检测了含有人免疫球蛋白轻链k(Igk)的单克隆抗体。
除了利用用过氧化物酶标记的羊抗人IgG1抗体，羊抗人IgG2抗体，羊抗人IgG3抗体或羊抗人IgG4抗体(每个稀释2,000倍，50μl/孔，The Binding Site)，对于人免疫球蛋白γ链，以和上面的ELISA方法相同的方法鉴定了各个单克隆抗体亚类。
抵抗表达人CD40的细胞的各个单克隆抗体的反应实验
通过FACS分析研究了有报道表达CD40的抵抗Ramos细胞系的各个单克隆抗体的反应性。
将Ramos细胞系在0.1％NaN3和2％含有FCS的PBS的染色缓冲液(SB)中悬浮，浓度为2×106/ml。细胞悬浮液(100μl/孔)分布到96孔的园底平板(Beckton Dickinson)。加入各个杂交瘤的培养上清液(50μl)，在冰温度进行温育30分钟。将抵抗人血清白蛋白的人IgG1抗体用作阴性对照，用杂交瘤培养基制备成浓度2μg/ml。加入50μl的溶液，然后在冰温度下温育15分钟。在用SB洗涤后，加入稀释250倍的R-PE荧光标记的抗人抗体(Southern Biotechnology)，然后在冰的温度下温育15分钟。在用SB洗涤2次后，将产物悬浮于300到500μl的FACS悬浮液中，然后通过FACS(FACSort and FACScan，BecktonDickinson)测量每个细胞的荧光强度。作为结果，选择具有Ramos细胞系结合活性的抗体。
实施例5制备各个抗体
通过下面的方法制备含有单克隆抗体的培养上清液。
从ATCC(ATCC No.HB-9110)得到生产G28-5抗体的杂交瘤。在含有小牛胰岛素(5μg/ml，Gibco BRL)，人转移素(5μg/ml，Gibco BRL)，乙醇胺(0.01mM，Sigma)和亚硒酸钠(2.5×10-5nM，Sigma)的eRDF培养基(Kyokutoseiyaku)中驯化生产抗CD40抗体的杂交瘤。在旋转烧瓶中培养杂交瘤。当杂交瘤的变化的细胞速度达到90％，收集培养上清液。将收集的上清液应用到10μm和0.2μm的滤纸(German Science)上，使消除碎片如杂交瘤。
通过下面的方法从上面的培养上清液纯化抗CD40抗体。利用Hyper D蛋白质A柱(NGK INSULATORS，LTD)或蛋白质G柱(为了纯化小鼠IgG1，Amersham Pharmacia Biotech)，根据附带的说明利用PBS(-)作为吸收缓冲液和0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液将含有抗CD40抗体的培养上清液进行亲和纯化。加入1MTris-HCl(pH8.0)或Na2HPO4溶液调整洗脱部分使具有约7.2的pH。利用洗脱膜(10000cut，Spectrum Laboratories)或SP柱(Amersham PharmaciaBiotech)，用PBS(-)取代制备的抗体溶液，然后利用膜滤纸MILLEX-GV(MILLIPORE)，孔大小0.22μm进行过滤灭菌。测量280nm处的吸光值发现纯化的抗体的浓度，然后以1.45OD处1mg/ml计算。
实施例6通过抗CD40激动性抗体促进Ramos细胞中的CD95的表达
在96孔平板中以100μl/孔(每孔5×104细胞)接种5.0×105细胞/孔的Ramos细胞悬浮液。用培养基将杂交瘤培养上清液或纯化的抗体稀释到20μg/ml，然后以100μl/孔的浓度在96孔的平板中加入溶液。在过夜培养后，收集细胞，然后通过FACSCan或FACSort(Beckton Dickinson)，利用R-PE标记的抗体CD95抗体(Pharmingen NJ)分析。图1显示了结果。在图1中的水平轴表明了CD95的表达强度。用厚线表示抗体的加入，用薄线表示没有抗体加入。显示KM302-1抗体促进CD95的表达比是已知抗体的G28-5抗体更好。即，KM302-1抗体显示有更有效的激动性。
实施例7通过抗CD40拮抗性抗体在Ramos细胞中阻遏CD95的表达
以50μl/孔，将1.0×106细胞/ml的Ramos细胞悬浮液接种到96孔平板中。用培养基将杂交瘤培养上清液或纯化的抗体调整到2μg/ml，然后以100μl/孔加入到96孔的平板中。在培养基中加入可溶的CD40配体(4μg/ml，ALEXIS CORPORATION)和抗FLAG抗体(4μg/ml，M2，Sigma)。在过夜培养后，收集细胞，然后利用R-PE标记的抗CD95的抗体(Pharmingen NJ)通过FACS分析。图2A和2B和3显示了结果。在图中的水平轴表示了CD95的表达强度。通过下面的杂交瘤的每一个：KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24和KM225-2-56产生的抗体将CD95的表达阻遏到与阴性对照相同的程度。
在图3中，KM281-1-10抗体(下面的组)阻遏CD95的表达比5D12抗体(中间的组)更有效，该已知的抗体仅仅轻微地阻遏CD95的表达。特别是，KM281-1-10抗体显示更有效的拮抗性。所以，人单克隆抗体显示是拮抗性抗体。
抗免疫球蛋白抗体交联的效果
以50μl/孔在96孔的平板中接种1.0×106细胞/ml的Ramos细胞悬浮液。用培养基将杂交瘤培养上清液或纯化的抗体调整到2μg/ml，然后以100μl/孔加入到96/孔的平板中。以4μg/ml将抗人IgG抗体(Sigma，I3382)或抗小鼠IgG抗体(Biosource，AMI3401)加入到培养基中，然后以50μl/孔将培养基加入到96孔的平板中。在过夜培养后，收集细胞，然后利用R-PE标记的抗CD95抗体(Pharmingen NJ)通过FACS分析。图4和5显示了结果。在图中的水平轴表示了CD95的表达强度。通过各个杂交瘤KM281-1-10和KM281-2-10-1-2产生的抗体阻遏了CD95的表达。相反，下面各个杂交瘤，5D12，KM283-5，KM292-1-24和KM225-2-56产生的抗体增强了CD95的表达。
实施例8抗CD40的激动性抗体阻遏Ramos细胞中的增殖
以100μl/孔在96孔的平板中接种1.0×105细胞/ml的Ramos细胞和HS-Sulton细胞悬浮液。等量的纯化抗体或可溶的CD40配体的混合物，和抗FLAG抗体(M2)加入到培养基中。在培养2天后，加入10μl的100uCi/ml 3H-胸腺嘧啶(Amersham Pharmacia)。在18小时后，利用Macro 96收集器(SKATRON)在Printer Filtermat A(Wallac)中收集培养产物，干燥，然后在Betap；Scint(Wallac)中浸没孔。在包装后，利用1205BETAPLATE液体闪烁计数器测量活性。图6显示了结果。在图中，纵轴表示了细胞掺入的3H胸腺嘧啶的量，水平轴表示了培养溶液中抗体或CD40L的浓度。当在Ramos细胞和HS-Sulton细胞中加入KM302-1抗体时，掺入的胸腺嘧啶的量比常规的G28-5抗体和CD40L的更低。所以，显示KM302-1抗体是可以有效阻遏肿瘤细胞的增殖的激动性抗体。
实施例9 CD40激动性抗体活化树突状细胞
(1)材料和方法
从Genzyme techne购买重组人IL-4。从Miltenyi Biotech GmbH购买抗人CD24MACS小珠。从Nycomed Pharma AS购买Lymphoprep。用于培养的培养基是用10％热失活的FCS(Cell CultureTechnologies)，10mM HEPES(Sigma)，55μM 2-巯基乙醇(Gibco BRL)和硫酸链霉素(MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.)，可以诱导DC。用2％FCS(Cell Culture Technologies)和0.02％Azaid补充的PBS(Sigma)洗涤染色过程中的细胞。当将细胞冷冻时，利用了Cell banker(NipponZenyaku Kogyo)。
(2)诱导单核细胞衍生的DC
通过Lymphoprep密度梯度离心从外周血液制备单核细胞(PBMC)。利用抗人CD14 MACS小珠将细胞进行阳性选择，分离细胞成CD14阳性部分和阴性部分。在阳性部分加入重组的人GM-CSF(50ng/ml)和重组人IL-4(100ng/ml)，接着在用10％FCS补充的RPMI1640培养基中在6孔的平板中培养。在开始培养时，细胞培养的浓度是1×106细胞/ml(3ml每孔)。在培养过程中，每2天交换培养基一次。在离心管中取10％的培养溶液进行培养基交换，离心溶液，除去上清液，用比取样培养溶液体积大2倍的新的培养溶液(含有上面浓度的细胞激动素等)悬浮，然后将悬浮液回到每个孔中。在培养6天后，收集细胞，计算细胞数，然后在上面的培养基中以1×106/ml的浓度悬浮细胞。然后在24孔的平板中再培养4天。在这一时期中，没有进行培养交换(每孔的细胞数1×106细胞，细胞浓度为1×106细胞)。
(3)细胞染色和流动细胞计分析
为了染色，利用了抗HLA-DR抗体(同型对照：大鼠IgG2a)，抗-CD86抗体(同型对照：大鼠IgG1)和抗-CD83抗体(同型对照：大鼠IgG2b)。首先加入抗体，然后在4℃进行温育30分钟。在洗涤3次后，利用FACS Calibur(Beckton Dickinson)进行分析。
(4)增强成熟DC的IL-12分泌能力
在如上所述得到不成熟的DC后，加入LPS(400pg/ml)和IFNγ(10-3M)，然后进行培养2天，得到成熟的DC。在成熟的DC中，加入10μg/ml的抗CD40抗体或同型对照。在24小时后的上清液中，利用ELISA测量IL-12的产生(Pharmingen)。
(5)结果和讨论
图7显示了M302-1抗体，激动性抗体对DC成熟的效果，图8显示KM302-1抗体对成熟的DC的IL-12生产的抗体的效果。成熟的程度是可以与作为对照的G28-5抗体相比较。当检测了CD86的表达和HLA-DR的表达时，进一步提高了表达，即在KM302-1抗体的情况与G28-5抗体比较时成熟的程度提高了。同时显示，用KM302-1抗体处理成熟的DC提高了IL-12的分泌。因此，显示KM302-1抗体可以作为DC上的激动性抗体。
实施例10 DC-MLR
在2000rpm离心正常人收集的血液(外周血)10分钟，然后吸收血清。用PBS再悬浮血液细胞部分，然后在Ficoll(AmershamPharmacia)上温和放置。在2000rpm进行离心30分钟，所以收集在中间层中的PBMC部分，用PBS洗涤2次，然后利用MACS用于一些细胞分离过程。
利用MACS(Miltenyi Biotec GmbH)附带的说明进行培养DC的单核分离。这可以简单地解释如下。在PBMC(1×108)加入800μl MACS缓冲液和200μl的MACS CD14(Miltenyi Biotec GmbH，502-01)，然后在4℃处理15分钟。将细胞吸收到MACS LS柱，然后洗涤。将吸收到柱上的细胞作为单核细胞收集。在不吸收到柱上的细胞中加入MACS HLA-DR(Miltenyi Biotec GmbH，461-01)。用BS柱除去HLR-DR阳性细胞，从而制备T细胞部分。通过FACS测量CD3阳性细胞的比例，然后从T细胞部分的总细胞数计算T细胞的基本数。在6孔培养平板中，在含有100ng/ml的IL-4(R&D系统)，50ng/mlG-CSF(KIRIN)和10％的FCS(SIGMA)的R0培养基(补充了β-巯基乙醇(Gibco)和含有HEPES(SIGMA))中培养得到的单核细胞，浓度是1×106细胞/ml。在培养后的第5天，在细胞中加入10ng/ml的LPS(DIFCO)分化成熟的DC。
通过混合已经从不同的人中分离的T细胞和成熟的DC进行MLR。测定T细胞与DC的细胞比例为1∶80，确定T细胞的数目是2×105细胞/孔。首先，在DC中加入抗体反应，进行了30分钟。随后，加入T细胞，进行培养4天，然后加入10μl的100uCi ml3H-胸腺嘧啶(Amersham Pharmacia)。14小时后，在Printed Filtermat A(Wallac)中利用Macro 96收集器(SKATRON)收集细胞，干燥，然后在Betap；Scint(Wallac)中浸没孔。在包装后，利用1205BETAPLATE液体闪烁计数器测定活性。通过混合已经从不同的人分离的T细胞和成熟的DC进行利用不成熟的DC的MLR。在细胞的比例为T细胞比DC1：40的情况中，相同地进行MLR。图9和10显示了结果。显示加入KM281-1-10抗体降低了胸腺嘧啶的掺入，所以MLR被阻遏。另外，在图10中显示，KM283-5和5D12抗体没有阻遏DC-MLR。即，只有KM281-1-10抗体是中和DC上的CD40配体的作用的拮抗性抗体。另外，图11显示了利用不成熟的DC，在MLR上检测拮抗性抗体KM302-1抗体的效果的结果。DC的激活促进了与T细胞的相互反应，引起了胸腺嘧啶的掺入的增强。这些结果表明，KM302-1是作用于不成熟的DC的激动性抗体。
实施例11 CD40抗体对CD40L与CD40结合的作用
利用BIAcore 2000(Biacore)引起抗CD40抗体结合固定的CD40人FC，然后检测可溶的CD40L与CD40的结合数中的变化。根据系统附带的说明，在CM芯片(CM5，Biacore)上固定可溶的CD40人FC。然后，加入25μg/ml抗CD40的抗体，结合CD40。另外，加入10μg/ml的可溶CD40L用于结合。测定在加入CD40L之前和之后的结合数之间的差异。当加入对照IgG时，CD40L的结合数是100RU。在加入KM302-1抗体后，CD40L的结合数是110RU，在加入KM283-5抗体后，CD40L的结合数是18RU。所以，显示KM302-1抗体不抑制CD40L与CD40的结合。
实施例12通过抗CD40激动性抗体促进Ramos细胞中的CD95的表达
根据实施例6的方法分析实施例4中得到的杂交瘤的纯化的抗体，然后选择产生激动性抗体的克隆(每个孔的细胞数目：5×104；细胞浓度：2.5×105/ml)。图12显示了结果。在图中，水平轴表示了，在培养溶液中的抗体浓度，纵轴表示了平均荧光强度，即CD95的表达强度。在浓度0.01μg/ml或更大，KM341-1-19和2105抗体显示比已知的小鼠抗体G28-5抗体更有效地促进Ramos细胞的CD95的表达。特别是，KM341-1-19和2105抗体显示是更有效的激动性抗体。另外，KM341-1-19和2105抗体(0.01μg/ml)的激动活性(增强Ramos细胞的CD95的表达)是比G28-5抗体的更高(10μg/ml)(图12)。表5概括了在各个抗体的浓度下，CD95的表达水平比加入G28-5抗体表达的水平高或低多少倍。
表5
抗体浓度(μg/ml)  KM341-1-19  2105  F5-77  F2-103
 0.01  5.7  3.9
 0.1  7.0  7.1  1.2  1.2
 1  5.7  5.1  1.7  1.8
 10  4.5  3.3  2.0  1.7
实施例13 CD40激动性抗体激活树突状细胞
根据实施例9的方法，测定了CD40激动性抗体对成熟的DC产生IL-12和IL-10的影响。通过ELISA(Pharmingen)方法测定了IL-10。图13和14显示了结果。显示用KM341-1-19抗体处理增强IL-12的分泌。相反，甚至当允许已经用X射线(5000rad)辐射的表达CD40配体的重组L细胞(2×105细胞/ml)共存时，IL-12和IL-10在培养溶液中的浓度是254和51pg/ml。它们比加入1μg/ml KM341-1-19抗体时更低。
如上所述，显示KM341-1-19抗体作为有效的激动性抗体作用于DC。引起成熟的DC分泌IL-12的KM341-1-19抗体(0.1μg/ml)的激动活性比G28-5抗体(100μg/ml)更高。引起成熟的DC分泌IL-12的KM341-1-19抗体(1μg/ml)的激动性活性是比G28-5抗体高100倍或更大(图13)。另外，引起成熟的DC分泌IL-10的KM341-1-9抗体(1μg/ml)的激动活性是比G28-5抗体(100μg/ml)高10倍或更高(图4)。另外，因为KM341-1-19抗体的亚类是IgG2，抗体对Fc受体比IgG1或IgG3具有更低的结合活性。它使NK细胞的杀死活性的能力和激活补充系统的能力也是弱的。因此，由于抗体的关系，表达CD40的细胞的功能或细胞本身的数目降低的危险可能是低的。另外，抗体不容易通过Fc受体交联，所以可以期望药物效果是容易控制的，不会造成由于交联引起的体内激动活性的任何大的波动。
实施例14抗CD40拮抗性抗体阻遏Ramos细胞中的CD95表达
在平底的96孔平板(每个孔细胞数：5×104)中以50μl/孔接种1.0×106细胞/ml的Ramos细胞悬浮液。在96孔平板中以100μl/孔加入用培养基稀释的纯化的抗体。以1.0×105细胞/ml制备表达CD40配体的重组小鼠L细胞(参见Sproggs，M.K.等，J.Exp.Med.，176：1543，1992；Garrone，P.等，J.Exp.Med.，182：1265，1995等)。以50μl/ml加入制备的细胞(每孔的Ramos细胞的数目：5×104；Ramos细胞浓度：2.5×104细胞/ml；每孔的小鼠L细胞的数目：5×103；小鼠细胞浓度：2.5×104细胞/ml)。在过夜培养后，收集细胞，然后利用R-PE标记的抗CD95抗体，通过FACS分析。图15显示了结果。在图中，纵轴表示了平均荧光强度，即CD95的表达强度。当已知的5D12抗体轻微阻遏表达时，甚至在0.1μg/ml浓度时4D11抗体阻遏CD95的表达到和其中没有加入表达CD40L的细胞的阴性相同的程度。另外，在1μg/ml的浓度下，4D11，F4-465和KM281-1-10阻遏CD95的表达到和其中没有加入表达CD40L的细胞的阴性对照的情况相同的程度。这些结果显示，4D11，F4-465和KM281-1-10抗体是更有效的拮抗性抗体。表6显示了当没有加入拮抗性抗体的对照的值定为100时，相对于各个抗体浓度的平均荧光强度的相对值。
表6
抗体浓度(μg/ml)  5D12  4D11  F4-465  KM281-1-10
 0.1  77.6  11.8  49.6  60.1
 1  72.3  0.01  2.5  7.3
 10  69.5  0  1.1  2.6
实施例15抗CD40激动性抗体在Ramos细胞移植中的抗肿瘤效果
在5星期大的C.B.17/Icr-scidJc1小鼠(CLEA JAPAN)中静脉内注射抗-asialo GM1抗体。1天后，作为肿瘤细胞在每个小鼠中静脉内注射5×106个Ramos细胞。1天后，静脉内注射作为阴性对照的KM302-1抗体或抗人白蛋白人IgG抗体。每个小鼠的KM302-1抗体的剂量是1、10、100μg，阴性对照抗体是100μg。对5个小鼠一次给药这些抗体。图16显示了结果。在移植后34天，所有的阴性对照给药小鼠组死亡，而所有5个给药10μg和100μg KM302-1抗体的小鼠组都生存。所以，证实了KM302-1抗体的抗肿瘤效果。KM302-1抗体是IgG4亚类，所以依赖Fc受体介导的抗体的细胞毒性(ADCC)和整个系统的激活是弱的。尽管有这些特征，也观察到单个给药10μgKM302-1抗体延长了有肿瘤的小鼠的生存时间。
实施例16通过抗CD40激动性抗体阻遏Ramos细胞的增殖
在补充了10％FBS的RPMI1640的培养基中以1×104细胞/ml的Ramos细胞悬浮液，然后在96孔的平板中各分配100μl的悬浮液。将与配体相同浓度的抗体FLAG抗体(M2)与可溶配体(反应溶液浓度10μg/ml)共存，从而增强活性。在培养5天后，在每个孔中加入20μl的MTS试剂，然后允许反应2到3小时。在无细胞和无抗体的孔和含有细胞和抗体的孔之间的差异在490nm波长处测定，从而测定可变的细胞数。另外，利用96孔的U底平板相似地将阻遏增殖的作用与G28-5抗体比较。加入利用培养基制备成2μg/ml的KM341-1-19抗体或G28-5抗体。图17显示了结果。在已经加入KM341-1-19抗体的孔中，观察死亡细胞，细胞数明显比已经加入G28-5抗体或配体的孔的更低，吸光值也低。这些结果表明，肿瘤细胞的增殖被阻遏了，诱导了细胞的死亡。
实施例17抗体基因的cDNA克隆
培养生产KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F4-465，F2-103和F5-77抗体的杂交瘤，然后通过离心收集细胞。在细胞中加入TRIZOL(Gibco BRL)，然后根据附带的说明萃取总RNA。利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)根据附带的说明进行抗体cDNA的可变区的克隆。利用5μg总RNA作为模板，构建第一链cDNA。为了扩增KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F2-103和F5-77的重链(H链)，利用了Z-Taq(Takara)和UMP和hh6引物，重复98℃1秒和68℃30秒的循环30次。另外，利用1μl的反应溶液作为模板和MUMP和hh3引物，重复98℃1秒和68℃30秒的循环20次。为了扩增F4-465重链，利用了UMP和hh2引物和Advantage 2PCR试剂盒(Clonthech，cat#1910)，进行5个循环的94℃5秒，72℃3分钟，5个循环的94℃5秒，70℃0秒和72℃3分钟，和25个循环的94℃5秒，68℃10秒和72℃3分钟。
Hh6引物：5’-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3’(SEQ ID NO：3)
Hh3引物：5’-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3’(SEQ ID NO：4)
Hh2引物：5’-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3’(SEQID NO：5)
随后，利用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的PCR产物，然后利用hh4作为引物确定核苷酸序列。或者，将产物亚克隆进PCR-Script(Stratagene，Lajolla，CA)或  PCR-Blunt(Invitrogene，Carlsbad，CA)，然后进行测序。根据序列的信息，合成特异于抗体重链的引物。在KM341-1-19的情况中合成341H引物，在2105的情况中合成2105Hsal引物，在110的情况中合成110Hsal引物，在KM281-1-10的情况中合成281Hsal引物，在4D11的情况中合成4D11Sal引物，在KM643-4-11的情况中合成643Hsal引物，在F4-465的情况中合成H11-9 5’引物，在F2-103的情况中合成F2-103H引物，在F5-77的情况中合成F5-77H引物。利用抗体重链特异引物和hh4，从第一链cDNA扩增cDNA，然后利用扩增的产物作为模板和特异于抗体的引物确定相反方向的序列。
Hh4引物：5’-GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3’(SEQ IDNO：6)
341H引物：5’-atatgtcgacGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAG-3’(SEQ ID NO：7)
2105Hsal：atatgtcgacTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAG(SEQ ID NO：8)
110Hsal：atatgtcgacTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACAC(SEQ ID NO：9)
281Hsal：atatgtcgacTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTG(SEQ IDNO：10)
4D11Sal：atatgtcgacGAGTCATGGATCTCATGTGCAAG(SEQ IDNO：11)
643Hsal：atatgtcgacCCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGAC(SEQID NO：12)
H11-95’：-ACC GTG TCG ACT ACG CGG GAG TGA CT(SEQ IDNO：13)
F2-103H：accgtgtcga cgctgatcag gactgcaca(SEQ ID NO：14)
F5-77H： accgtgtcga cggtgatcag gactgaacag(SEQ ID NO：15)
利用UMP和hk2引物和通过重复循环98℃1秒和68℃30秒30次扩增KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F2-103和F5-77的轻链(L链)。利用UMP和hL2引物通过重复循环98℃1秒和68℃30秒30次扩增轻链F4-465。利用PCR纯化试剂盒纯化扩增的PCR产物，然后利用hk6或hL2引物确定核苷酸序列。根据序列，合成轻链特异的引物。在KM341-1-19的情况中合成341K引物，在2105的情况中合成2053KBg1引物，在110和115的情况中合成110KBg1引物，在KM281-1-10的情况中合成281KBg1引物，在4D11的情况中合成4D11KBg1，在KM643-4-11的情况中合成643KBg1引物，在F4-465的情况中合成Lamda 5’引物，在F-103和F5-77的情况中合成F2-103K引物。
在341-1-19，110，115，KM643-4-11，KM281-1-10，4D11和2105的情况中，利用轻链特异引物和hk6引物从第一链cDN扩增cDNA。然后，从两个方向利用扩增的产物作为模板确定序列。对于F4-465，F2-103和F5-77，亚克隆进PCR-Script(Stratagene，Lajolla，CA)或PCR-Blunt(Invitrogene，Carlsbad，CA)确定序列。
hk2引物：5’-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3’(SEQ ID NO：16)
hL2引物：5’-TCT TCT CCA CGG TGC TCC CTT CAT-3’(SEQ IDNO：17)
341K引物：atatagatctGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：18)
2053KBg1：atatagatctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT(SEQID NO：19)
110KBg1：atatagatctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC(SEQID NO：20)
281KBg1：atatagatctGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG(SEQ ID NO：21)
4D11KBg1：atatagatctTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTAC(SEQ ID NO：22)
643KBg1：atatagatctGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG(SEQ ID NO：23)
Lamda 5’：-AACTCCAGATCTGCCTCAGGAAGCAGCATC(SEQID NO：24)
F2-103K：aactccagat ctagggcaag cagtggtaac(SEQ ID NO：25)
hk6引物：5’-TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG-3’(SEQID NO：26)
编码全长H链和L链可变区的341-1-19的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别显示如下。
H链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：27的第50位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子，终止密码子是第1472位胸腺嘧啶(T)开始的TGA。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第493位腺嘌呤(A)和第494位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区的范围是N末端到SEQ ID NO：28的第148位丝氨酸(S)残基，恒定区是第149位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signa1 P第2版)推测，H链信号序列范围是N末端到SEQ ID NO：28的第20位丝氨酸(S)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：28的第21位谷氨酸(Q)。
L链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：29的5’末端的第29位A开始的，可变区范围是5’末端到第400位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：30的N末端到第124位赖氨酸(K)。纯化的L链蛋白质的N末端的分析发现，L链信号序列范围是SEQ ID NO：30的N末端到第20位甘氨酸(G)，成熟的蛋白质的N末端是SEQ ID NO：30的第21位谷氨酸(E)。
341-1-19 H链(SEQ ID NO：27)
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAA
TGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGT
CCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCT
CGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCA
ACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGT
GGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGAT
CTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCT
CCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTAC
AAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGT
CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCC
CATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAG
CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG
TCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGT
CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTC
CAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC
CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTG
CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT
ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGA
GCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCA
GGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC
CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCG
AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCG
CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
ACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC
CGGGTAAATGAGGATCC
341-1-19 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：28)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSA
TWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQL
NSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVF
PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
341-1-19 L链(SEQ ID NO：29)
ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTC
TCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGAC
ACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTC
CTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGA
AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA
CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT
CTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGC
AGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
341-1-19 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：30)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSL8PGERATLSCRASQSVSSYLA
WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEpEDFAVYYC
QQRSNTFGPGTKVDIKRT
编码H链可变区和L链可变区的2105的DNA和H链和L链的氨基酸序列如下。
H链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：31的5’末端的第70位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第495位腺嘌呤(A)和第496位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区范围是SEQ ID NO：32的N末端到第142位丝氨酸(S)残基，恒定区是第149位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：32的N末端到第19位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：32的第20位谷氨酸(E)。
L链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：33的5’末端到第28位A，可变区是从5’末端到第405位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：34的N末端到第126位赖氨酸(K)。据基因推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ ID NO：34的N末端到第20位甘氨酸(G)。据认为成熟蛋白质的N末端是SEQ IDNO：34的第21位谷氨酸(E)。
2105 H链(SEQ ID NO：31)
CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACT
GAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTG
GCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG
AGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG
ATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAA
GGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCA
TGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGA
ACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGT
ATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGA
CGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
2105 H链氨基酸序列(SEQ ID No：32)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA
MHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN
SLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK
2105 L链(SEQ ID NO：33)
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCT
CTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGAC
ACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTC
CTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGA
AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA
CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT
CTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGC
AGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
CGTACGGTG
2105 L链氨基酸序列(SEQ IDNO：34)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA
WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
QQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV
编码H链可变区和L链可变区的110的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：35的5’末端的第60位腺嘌呤(A)开始的ATG。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第479位腺嘌呤(A)和第480位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区范围是SEQ ID NO：36的N末端到第140位丝氨酸(S)残基，恒定区是第141位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：36的N末端到第19位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：36的第20位谷氨酸(Q)。
L链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：37的第35位A开始的ATG密码子，可变区范围是SEQ ID NO：37的5’末端的第35位A开始，可变区范围是5’末端到第421位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列，可变区范围是SEQ ID NO：38的N末端到第129位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ IDNO：38的N末端到第22位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：38第23位缬氨酸(V)。
110 H链(SEQ ID NO：35)
CTGAACACAGACCCGTCGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGA
GGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTA
AGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT
CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTT
CAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGG
AGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGACTC
CGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGC
GAGAGAGGGCTACAATATTTTGACTGGTTATTTTGGCTACTGGGGCCAGGG
AACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGG
110 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：36)
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG
MHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN
SLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK
110 L链(SEQ ID NO：37)
TCACAGATCTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCC
CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTG
TCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAG
AGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTG
GTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTGCATC
CACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTA
TTACTGTCAACAGTATTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA
GGTGGAAATCAAACGTACG
110 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：38)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISS
DLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFAT
YYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT
编码H链可变区和L链可变区的115的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：39的5’末端的第60位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体的可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第479位腺嘌呤(A)和第480位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链的可变区范围是SEQ ID NO：40的N末端到第140位丝氨酸(S)残基，恒定区是第141位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：40的N末端到第19位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：40的第20位谷氨酸(Q)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：41的5’末端的第35位A开始的ATG，可变区范围是5’末端到第421位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：42的N末端到第129位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ ID NO：42的N末端到第22位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：42的第23位缬氨酸(V)。
115 H链(SEQ ID NO：39)
CTGAACACAGACCCGTCGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGA
GGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTA
AGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT
CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTT
CAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGG
AGTGGGTGGCAGTTATATGGAATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGACTC
CGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGC
GAGAGAGGGCTACAATATTTTGACTGGTTATTTTGGCTACTGGGGCCAGGG
AACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
115H链氨基酸序列(SEQ ID NO：40)
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG
MHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN
SLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK
115 L链(SEQ ID NO：41)
TCACAGATCTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCC
CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTG
TCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAG
AGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTG
GTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTGCATC
CACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTA
TTACTGTCAACAGTATTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA
GGTGGAAATCAAACGFACG
115L链氨基酸序列(SEQ ID NO：42)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISS
DLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFAT
YYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT
编码H链可变区和L链可变区的281-1-10的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：43的5’末端的第52位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第468位腺嘌呤(A)和第469位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链的可变区范围是SEQ ID NO：44的N末端和第139位丝氨酸(S)残基，恒定区是第140位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列的范围是SEQ IDNO：44的N末端到第19位丝氨酸(S)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：44的第20位谷氨酸(Q)。
L链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：45的5’末端的第41开始的ATG密码子，可变区的范围是从5’末端到第424位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：46的N末端到第128位赖氨酸(K)。据基因序列推测的软件(Signal P第二版)推测，L链的信号序列范围是从SEQ ID NO：46的N末端到第20位甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被认为是SEQ ID NO：46的第21位谷氨酸(E)。
281-1-10 H链(SEQ ID NO：43)
CTGAACACAGACCCGTCGACTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTGCAAGAA
CATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGT
CCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTT
CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTGGTT
ACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT
GGGTATATC了ATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTC
GAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA
ATTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCCCCT
TGCACGGTGACTACAAATGGTTCCACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC
ACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
281-1-10 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：44)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGYY
WSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVT
AADTAVYYCARAPLHGDYKWFHPWGQGTIVTVSSASTK
281-1-10 L链(SEQ ID NO：45)
TCACAGATCTGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCC
CAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAG
AAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA
GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAG
CCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTG
CATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA
GTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGG
ACACGACTGGAGATCAAACGTACG
281-1-10 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：46)
METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSpGERATLSCRASQSVSSSYL
AWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY
CQQYGSSPITFGQGTRLEIKRT
编码H链可变区和L链可变区的4D11的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是从SEQ ID NO：47的5’末端的第16位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第456位腺嘌呤(A)和第457位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区范围是SEQ ID NO：48的N末端到第147位丝氨酸(S)残基。恒定区是第148位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：48的N末端到第26位丝氨酸(S)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQID NO：48的第27位谷氨酰胺(Q)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：49的5’末端的第59位A开始的ATG密码子，可变区的范围是5’末端到第442位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是SEQ ID NO：50的N末端到第128位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ ID NO：50的N末端到第22位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：50的第21位丙氨酸(A)。
4D11 H链(SEQ ID NO：47)
ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGG
TTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAG
CTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT
CACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGG
CTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTA
TAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCA
TATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGA
CCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTT
TGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
CTAGC
4D11 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：48)
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSG
GSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQF
SLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTV8SAS
4D11 L链(SEQ ID NO：49)
AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAG
GACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGC
TCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCT
CCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTC
AGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCT
CCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAA
GGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC
TGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCC
GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
4D11 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：50)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS
ALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT
YYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
编码H链可变区和L链可变区的KM643-4-11的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：51的5’末端的第1位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界是定位于5’末端的第447位腺嘌呤(A)和第448位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区范围是SEQ ID NO：52的N末端到第149位丝氨酸(S)残基，恒定区是第150位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：52的N末端到第20位丝氨酸(S)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ IDNO：52的第21位谷氨酰胺(Q)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：53的5’末端的第38位A开始的ATG密码子，可变区范围是5’末端到第409位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：54的N末端到第124位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ ID NO：34的N末端到第20位甘氨酸(G)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：54的第21位谷氨酸(E)。
KM643-4-11 H链(SEQ ID NO：51)
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTG
TCCTGTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCC
TCGCAGACCCTCTCATTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGC
AACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGA
GTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAAAGATTATGCAGT
ATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTT
CTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTG
TGCAAGAGGGTATTACTATGGTTCGGGGAGCTATCCCTACTACTACCAAATG
GACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
KM643-4-11 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：52)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSFTCAISGDSVSSNSA
AWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYKDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQL
NSVTPEDTAVYYCARGYYYGSGSYPYYYQMDVWGQGTTVTVSSAS
KM643-4-11 L链(SEQ ID NO：53)
AATTGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAG
CTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAAT
TGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGTGC
CACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTA
CCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAA
CAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG
ACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA
CTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCA
AACGAAC
KM643-4-11 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：54)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGESATLSCRASQSVSSYLA
WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
QQRSNTFGGGTKVEIKR
编码H链可变区和L链可变区的F4-465的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：55的5’末端的第47位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第484位腺嘌呤(A)和第445位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区的范围是SEQ ID NO：56的N末端到第146位丝氨酸(S)残基，恒定区是第147位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：56的N末端到第19位丝氨酸(S)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQID NO：56的第20位谷氨酰胺(Q)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：57的5’末端的第81位A开始的ATG密码子，可变区范围是5’末端到第440位(C)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：58的N末端到第120位苏氨酸(T)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQ ID NO：58的N末端到第19位丙氨酸(G)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：58的第20位丝氨酸(S)。
F4-465 H链(SEQ ID NO：55)
CTGAACACAGACCCGTCGACTACGCGGGAGACCACAGCTCCACACCATGG
ACTGGACCTGGAGGATCCTATTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCC
TCAGTGAAGGTCCCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCTA
TGAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG
ATCAACACCAACACTGGGAACCCAACGTATGCCCAGGGCTTCACAGGACG
GTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGC
AGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGTAGTA
CCAGTTGCTATGAGGGTAACTCACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC
CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAA
F4-465 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：56)
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVPCKASGYTFTSYA
MNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQIS
SLKAEDTAVYYCAREVVPVAMRVTHYYYGMDVWGQGTTVTVSSAST
F4-465 L链(SEQ ID NO：57)
CTGGGTACGGTAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCACAGATCTGCCT
CAGGAAGCAGCATCGGAGGTGCCTCAGCCATGGCATGGATCCCTCTCTTCC
TCGGCGTCCTTGTTTACTGCACAGGATCCGTGGCCTCCTATGAGCTGACTC
AGCCACCCTCAGTGTCCGTGGCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGT
TCTGGAGATAAATTGGGGGATAATTTTACTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCA
GGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTTTCAGGATTGGAAGCGGCGCCCAGGG
ATCCCTGCGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACAGCCACTCTGACC
ATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGG
GACATCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
CAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG
CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG
GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGG
AGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCC
AGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTA
CAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCC
CTACAGAATGTTCATGAATTCAGATCCGTTAACGGTTACCAACTACCTAGAC
TGGATTCGTGACCAACATA
F4-465 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：58)
MAWIPLFLGVLVYCTGSVASYELTQPPSVSVAPGQTASITCSGDKLGDNFTCW
YQQKPGQSPVLVIFQDWKRRPGIPARFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
QAWDISTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP
GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSC
QVTHEGSTVEKTVAPTECS
编码H链可变区和L链可变区的F2-103的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：59的第32位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第463位腺嘌呤(A)到第464位鸟嘌呤之间。在氨基酸序列中，H链可变区的范围是SEQ ID NO：60的N末端到第144位丝氨酸(S)残基，恒定区是第145位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：60的N末端到第19位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ IDNO：60的第20位谷氨酸(E)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：61的5’末端的第29位A开始的，可变区范围是5’末端到第415位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：62的N末端到第129位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQID NO：62的N末端到第22位半胱氨酸。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：62的第23位Asp(D)。
F2-103 H链(SEQ ID NO：59)
GCTGATCAGGACTGCACACAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCT
GGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGG
TGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTACTGGATGCACTGGGTCCGC
CAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTG GGTCTCACGTATTAATAGTGATGGG
AGTAGCACAACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGA
GACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGA
GGACACGGCTGTG TATTACTGTGCAAGAGATAGAGTACTATGGATCGGGGA
GTTATCCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT
CTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC
CAAGAGCACCTCT
F2-103 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：60)
MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSTYW
MHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN
SLRAEDTAVYYCARDRVLWIGELSYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTS
F2-103 L链(SEQ ID NO：61)
GGGGAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC
AGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAAATGTGACATCC
AGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA
CCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAACTGGTTGGCCTGGTATC
AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATAAGGCATCTGGTT
TAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAA
TTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACT
GCCAACAGTCTAATAGTTATTCGTGGACGTTCGGCCACGGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGA
TGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT
CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATC
GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT
ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA
F2-103 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：62)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISN
WLAWYQQKPGKAPKLLLYKASGLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPDDFA
TYYCQQSNSYSWTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGL
编码H链可变区和L链可变区的F5-77的DNA和H链和L链的氨基酸序列分别如下。
H链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：63的5’末端的第100位腺嘌呤(A)开始的ATG密码子。抗体可变区和恒定区的边界定位于5’末端的第528位腺嘌呤(A)和第529位鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，H链可变区范围是SEQ ID NO：64的N末端到第143位丝氨酸(S)残基，恒定区是第144位丙氨酸(A)和后面的残基。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，H链信号序列范围是SEQ ID NO：64的N末端到第19位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQID NO：64的第20位谷氨酸(E)。
L链DNA的翻译起始点是SEQ ID NO：65的5’末端的第59位A开始的，可变区范围是5’末端到第445位腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区范围是SEQ ID NO：66的N末端到第129位赖氨酸(K)。据基因序列推测软件(Signal P第二版)推测，L链信号序列范围是SEQID NO：66的N末端到第22位半胱氨酸(C)。据认为，成熟蛋白质的N末端是SEQ ID NO：66的第23位Asp(D)。
F5-77 H链(SEQ ID NO：63)
GGTCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCCTCACATTCAGTGATCAGCACTG
AACACAGACCCGTCGACGGTGATCAGGACTGAACAGAGAGAACTCACCAT
GGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCA
GTGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGC
CATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAG
CTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCC
GGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGA
ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGG
GGGTACTATGGTTCGGGGAGTTATGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGA
ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC
CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG
CCTGGTCAAGGACTACTTCCCC
F5-77 H链氨基酸序列(SEQ ID NO：64)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM
SWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKDGGYYGSGSYGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
SSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
F5-77 L链(SEQ ID NO：65)
CAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGGGGGAGTCAGACCCAGTCA
GGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCT
GCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATC
TTCCGTGTCTGGATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAG
TCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAG
CCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGGATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC
AAGGTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAG
CCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAGCAGTTT
CCCTCGGACATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGG
CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG
AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA
AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGA
GTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC
CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA
AGTCACCCATCAGGGCCTGA
F5-77 L链氨基酸序列(SEQ ID NO：66)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSGSVGDRVTITCRASQGISS
WLAWYQQKPGKAPKLLIYAGSSLQSGVPSRFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFAT
YYCQQASSFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK
VYACEVTHQGL
实施例18抗体蛋白质在动物细胞中的表达
在适当的载体中如N5KG1(IDEC Pharmaceuticals，美国专利6001358)掺入上面得到的含有抗体可变区的DNA片段，由此制得抗体表达载体。利用表达寄主细胞例如CHO-Ras(Katakura Y.等，Cytotechnology，31：103-109，1999)是适当的。可以在寄主细胞中通过电穿孔导入载体。利用限制酶将约2μg的抗体表达载体线性化。在350V和500μF条件下，利用Bio-Rad电穿孔仪，在4×107CHO-Ras细胞中导入基因，然后在96孔培养平板上接种。加入对应于表达载体的选择标记的药物，继续培养。当观察菌落时，通过实施例4所述的方法选择表达抗体的系。根据实施例5，从选择的细胞纯化抗体。
实施例19 CD40拮抗性抗体对抗原特异性抗体生产的阻遏作用
通过腹膜内注射100μg(NP-CGG的量)的4-羟基-3-硝基苯乙酰基-鸡γ球蛋白结合物(NP-CGG：Osaka大学微生物疾病研究所HitoshiKIKUTANI教授提供)和ARAM(ARAM：抗原识别激活基序)的复合物，使小鼠敏化，所述小鼠具有遗传背景，使得它们是小鼠内源破坏的CD40纯合的并锚定人CD40基因的转基因。在抗原敏化之前立即通过尾静脉给药30或100μg的各单克隆抗体。将100μg的抗人白蛋白人IgG4抗体作为阴性对照给药。在敏化后7天，从眶静脉结丛收集血液，然后通过ELISA方法测定血清中的NP特异IgG1和IgM抗体的量。在ELISA(Maxisorp，Nunc)的96孔微平板的每个孔中通过加入NP结合的小牛血清白蛋白(NP-BSA：2.5μg/ml)(50μl/孔)进行ELISA方法，在4℃温育，然后吸收NP-BSA。然后，丢弃上清液，在每个孔中加入封闭试剂(Super Block，Pierce)，在室温下进行温育封闭。然后用0.1％的含有吐温20的磷酸缓冲液(PBS-T)将每个孔洗涤3次。随后，在每个孔中加入用10％含有BlockAce的PBS-T吸收的各个血清(50μl/孔)，接着在37℃温育2小时反应。用PBS-T洗涤微滴平板3次。在每个孔(50/孔)中加入用10％的BlockAce的PBS-T稀释碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG或IgM抗体(COSMO BIO，1070-04或1020-04)1000倍制备的溶液，接着在37℃温育2小时。然后，用PBS-T洗涤微滴平板3次，在每个孔中加入色原底物溶液(50μl/孔，Sigma104，磷酸底物)，然后用微滴平板读数器测量405nm波长处的吸光值。图18和19显示了结果。在图中，纵轴表示了在IgG1抗体的情况中，一个单位的稀释10000倍的血清和在IgM抗体的情况中用稀释100倍的血清的一个单位转化得到的值。这里，血清是将NP-CGG 2次注射进C57BL/6小鼠中，从小鼠收集血液，合并血清制备的。施用各100μg的F4-465、4D11和KM281-1-10抗体强力地阻遏了NP特异性IgG1和IgM抗体的生产。
实施例20通过CD40拮抗性抗体阻遏扁桃体B细胞的增殖
从儿童医院(San Diego，Califomia，U.S.A)得到人扁桃体。将扁桃体切成小片，研碎，然后通过60微米的尼龙网细胞滤网，制备细胞悬浮液。用PBS洗涤细胞悬浮液几次，计算细胞数，然后用90％人血清(ICN)和10％的DMSO深低温保存悬浮液。冻融后，在用10％的人血清和2.5μg/ml的两性霉素(fangizon，Gibco/BRL)补充的标准RPMI中再悬浮细胞，然后使用。
在96孔的平板中加入1×105细胞，然后加入抗人CD40抗体，浓度为0.01、0.1、1.0和10μg/ml。在每个浓度以三份进行实验。在每个孔中加入1μg/ml flag标记的CD40L(Alexis)和1μg/ml的CD40L增强抗体(Alexis)，接着培养3天。然后，在每个孔中加入1μCi[3H]胸腺嘧啶。12到15小时后，收集细胞，然后利用液体闪烁计数器测定扁桃体B细胞的增殖。将由于CD40L的刺激B细胞已经增殖而且没有加入抗体时得到的计数确定为100，将没有加入CD40L，B细胞也没有刺激时得到的计数确定为0。例如，当相对计数测定为30，则可以表达为这一实验中有70％的增殖抑制。
甚至当抗体浓度为100μg/ml时，5D12(已知的拮抗性抗体)也没有显示超过50％的增殖抑制。F4-465显示甚至当抗体浓度低至0.01μg/ml时也有约80％的增殖抑制，当抗体浓度为0-1到10μg/ml时，显示有约95％的增殖抑制(图20)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请以全文形式引入本文作为参考。
工业应用性
本发明提供了抗CD40的抗体。本发明的这一抗体包括对CD40有激动性的抗体和对CD40有拮抗性的抗体。所以，这些抗体可以分别用作例如免疫增强药剂和免疫抑制药剂。
序列表独立文本
SEQ ID NO：1：合成的DNA
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SEQ ID NO：25：合成的DNA
SEQ ID NO：26：合成的DNA

Claims (30)

1.一种抗人CD40的抗体或其功能片段，具有选自下列特性(a)至(f)中的至少一个特性：
(a)在存在LPS和IFNγ时作用于树突状细胞，产生IL-12；
(b)具有作用于树突状细胞导致细胞成熟的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(c)具有促进已建立的B细胞系表达CD95的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(d)具有抑制已建立的B细胞系增殖的活性，该活性比G28-5抗体的更高；
(e)诱导已建立的B细胞系的细胞死亡；和
(f)不抑制CD40配体与CD40的结合。
2.权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中树突状细胞的成熟是在抗体浓度为20μg/ml或更低时进行的。
3.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度为20μg/ml或更低时能促进已建立的B细胞系表达CD95。
4.权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中已建立的B细胞系是Ramos或HS-Sulton。
5.权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中当在浓度为1×106细胞/ml的树突状细胞中加入浓度为0.1μg/ml或更高的抗体时，产生了100pg/ml或更多的IL-12。
6.权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中当在浓度为1×106细胞/ml的树突状细胞中加入浓度为1μg/ml或更高的抗体时，产生了1000pg/ml或更多的IL-12。
7.权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中当在浓度为1×106细胞/ml的树突状细胞中加入浓度为1μg/ml或更高的抗体时，产生了10000pg/ml或更多的IL-2。
8.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度范围为0.01μg/ml到10μg/ml内，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的约高2到3倍或更高。
9.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度为0.01μg/ml时，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的约高2到6倍或更高。
10.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度为0.1μg/ml时，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的约高2到7倍或更高。
11.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度为1μg/ml时，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的约高2到7倍或更高。
12.权利要求1所述的抗体或其功能片段，在抗体浓度为10μg/ml时，促进已建立的B细胞系(Ramos细胞)表达CD95，效力比作为对照的G28-5抗体表达的约高2到6倍或更高。
13.一种抗体或其功能片段，具有杂交瘤KM302-1(保藏号：FERM BP-7578)、KM341-1-19(保藏号：FERM BP-7759)、2105(保藏号：FERM BP-8024)或F1-102(保藏号：ATCC PTA-3337)产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
14.一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤F2-103产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由保藏号ATCC PTA-3302和ATCC PTA-3303的质粒DNA编码；杂交瘤F5-77产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由保藏号ATCC PTA-3304和ATCC PTA-3305的质粒DNA编码；或杂交瘤F5-157产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由保藏号ATCCPTA-3306和ATCC PTA-3307的质粒DNA编码。
15.一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤KM341-1-19产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：28和30表示；杂交瘤2105产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：32和34表示；杂交瘤110产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：36和38表示；杂交瘤115产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：40和42表示；杂交瘤KM643-4-11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：52和54表示；杂交瘤F2-103产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ IDNOS：60和62表示；或者杂交瘤F5-77产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：64和66表示。
16.一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：从杂交瘤KM341-1-19分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：27和29表示；从杂交瘤2105分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：31和33表示；从杂交瘤110分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：35和37表示；从杂交瘤115分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：39和41表示；从杂交瘤KM643-4-11分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：51和53表示；从杂交瘤F2-103分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQID NOS：59和61表示；或从杂交瘤F5-77分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：63和65表示。
17.一种抗人CD40的抗体，或其功能片段，具有选自下列特性(g)到(j)中的至少一个：
(g)中和CD40配体的作用；
(h)中和或减弱已建立的B细胞系上的CD40的配体在表达CD40的细胞上具有的一种或多种作用，并具有对已建立的B细胞系上的CD40的激动作用，由于抗免疫球蛋白抗体的交联，该激动作用比5D12的更弱；
(i)减弱或中和CD40配体对已建立的B细胞系的作用，增强CD95表达；和
(j)对树突状细胞上表达的CD40具有拮抗作用。
18.权利要求17的抗体或其功能片段，当在用饱和量的表达CD40L的细胞补充浓度1×106细胞/m1的Ramos细胞中加入0.1μg/ml的抗体时，可以抑制Ramos细胞的表达水平比对照低约10％或更低。
19.权利要求17所述的抗体或其功能片段，当将浓度为1μg/ml的抗体加入补充了饱和量的表达CD40L的细胞的浓度为1×106细胞/ml的Ramos细胞中时，可以将Ramos细胞中CD95的表达抑制到与阴性对照相同的水平。
20.权利要求17所述的抗体或其功能片段，当将浓度为10μg/ml的抗体加入补充了饱和量的表达CD40L的细胞的浓度为1×106细胞/ml的Ramos细胞中时，可以将Ramos细胞中CD95的表达抑制到与阴性对照相同的水平。
21.权利要求17所述的抗体或其功能片段，当在补充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃体B细胞中加入浓度为0.001μg/ml和10μg/ml之间的抗体时，扁桃体B细胞的增殖在体外被抑制了约80％到95％或更多。
22.权利要求17所述的抗体或其功能片段，当在补充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃体B细胞中加入浓度为0.01μg/ml和10μg/ml之间的抗体时，扁桃体B细胞的增殖在体外被抑制了约95％或更多。
23.仅利要求17所述的抗体或其功能片段，当在补充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃体B细胞中加入浓度为0.00μg/ml的抗体时，扁桃体B细胞的增殖在体外被抑制了约80％或更多。
24.一种抗体或其功能片段，具有杂交瘤KM281-1-10(保藏号：FERM BP-7579)、4D11(保藏号：FERM BP-7758)或F4-465(保藏号：ATCC PTA-3338)产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
25.一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：杂交瘤KM281-1-10产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：44和46表示；杂交瘤4D11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：48和50表示；或杂交瘤F4-465产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ IDNOS：56和58表示。
26.一种抗体或其功能片段，具有以下区域的成熟部分的氨基酸序列：从杂交瘤KM281-1-10分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：43和45表示；杂交瘤4D11产生的抗体的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：47和49表示；或从杂交瘤F4-465分离的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，分别由SEQ ID NOS：55和57表示。
27.权利要求1到26中任一项所述的抗体或其功能片段，它是人抗体。
28.一种药物组合物，含有权利要求1到26中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
29.一种免疫强化剂、抗肿瘤药剂或抗自体免疫疾病药剂，含有权利要求1到16中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
30.一种免疫抑制剂、抗自体免疫疾病药剂、抗过敏的治疗药剂或抗凝血因子VIII抑制综合症的治疗药剂，含有权利要求17到26中任一项的抗体或其功能片段作为活性成分。
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