CN1929862A - 拮抗性抗－cd40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的应用 - Google Patents

拮抗性抗－cd40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了治疗对象的慢性淋巴细胞性白血病的方法。所述方法包括将治疗有效量的拮抗性抗－CD40抗体或其抗原结合片段给予需要它的患者。当所述抗体结合人CD40表达细胞上的CD40抗原时，所述拮抗性抗－CD40抗体或其抗原结合片段无明显的激动活性，而显示拮抗活性。抗－CD40抗体或其抗原结合片段的拮抗活性有益地抑制表达人CD40的慢性淋巴细胞性白血病细胞的增殖和/或分化。

Description

拮抗性抗-CD40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的应用
                          发明领域
本发明涉及用拮抗性抗-CD40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的方法。
                          发明背景
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是B细胞恶性肿瘤，其特征为致瘤性细胞增殖和在骨髓、血液、淋巴结和脾脏中的积累。CLL是西半球最常见的成年人白血病类型。CLL在老年人群中发病率上升，诊断到该病的中值年龄是约65岁。当前治疗方案包括(使用)化疗药物，例如氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、环磷酰胺、阿来组单抗(Campath-1H)、阿霉素和泼尼松。氟达拉滨是最有效的化疗药物，应答率为17-74％，但反复使用药物经常会使CLL变得难以控制(Rozman和Montserrat，(1995)，NEJM，2133：1052)。
CLL患者的中值存活率是9年，虽然一些有突变的免疫球蛋白基因的患者具有更有利的预后。参见，例如Rozman和Montserrat，(1995)，NEJM，2133：1052和Keating等，(2003)，Hematol.，2003：153。如果CLL已转化为大细胞淋巴瘤，中值存活降至不到1年；类似地，前淋巴细胞性白血病的预后比典型CLL的预后更差(Rozman和Montserrat，(1995)，NEJM，2133：1052)。迄今为止，还未获得治愈的证据。
CD40是一种55kDa的细胞表面抗原，存在于正常和致瘤性人B细胞、树突状细胞、其它抗原呈递细胞(APC)、内皮细胞、单核细胞和上皮细胞表面。CD40配体与B细胞膜上的CD40抗原结合提供刺激B细胞激活和增殖的阳性共刺激信号，导致B细胞成熟为分泌高水平可溶性免疫球蛋白的浆细胞。患有低级和高级B细胞淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病、CLL、成髓细胞白血病、和何杰金病的患者的转化细胞表达CD40。几种B细胞系肿瘤的恶性B细胞表达高水平的CD40并且其存活和增殖似乎依赖CD40信号传导。这使得CD40抗原成为潜在的抗癌症治疗靶位。
由于慢性淋巴细胞性白血病患者的预后不佳，需要替代治疗方法。
                           发明简述
本发明提供了治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)人对象的方法，该方法包括给予对象抗-CD40抗体或其抗原结合片段，当所述抗体或其抗原结合片段与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性。本发明也提供了抑制表达CD40抗原的CLL细胞生长的方法。
适用于本发明方法的拮抗性抗-CD40抗体对CD40具有强亲和力，其特征为至少10-6M、优选至少约10-7M-10-8M、更优选至少约10-8M-10-12M的解离平衡常数(KD)。这些单克隆抗体和它们的抗原结合片段能特异性结合表达在人细胞表面的人CD40抗原。当它们与人细胞上的CD40抗原结合时，无明显的激动活性而显示拮抗活性。在一个实施方案中，当抗-CD40抗体或其片段结合正常人B细胞上的CD40抗原时显示拮抗活性。在另一个实施方案中，当抗-CD40抗体或其片段结合恶性人B细胞上的CD40抗原时，显示拮抗活性。合适的单克隆抗体具有人恒定区；它们也优选具有完全或部分的人源化框架区；最优选完全的人抗体或它们的抗原结合片段。这种单克隆抗体的例子是重组产生的本文名为5.9和CHIR-12.12的抗体；名为131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(称为细胞系12.12)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体；含有SEQ ID NO：6所示、SEQ ID NO：7所示、SEQ ID NO：8所示、同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示和同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的单克隆抗体；含有SEQ ID NO：2所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ ID NO：5所示、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示和同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的单克隆抗体；具有由含有SEQ ID NO：1所示、SEQ ID NO：3所示、同时含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体；和保留了特异性结合人CD40能力的这些单克隆抗体的抗原结合片段，当它们结合人细胞上的CD40抗原时，无明显的激动活性而显示拮抗活性。这种单克隆抗体的例子也包括结合某表位的单克隆抗体，所述表位能结合杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体；结合某表位的单克隆抗体，所述表位含有SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：12所示氨基酸序列的残基82-87；在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；和为CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体或任一上述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合人CD40抗原的能力。
在本发明的一个实施方案中，治疗方法包括给予患者治疗有效剂量的药物组合物，该组合物含有合适的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量约是0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。应理解该治疗方法包括单次给予治疗有效剂量或多次给予治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
可修饰适用于本发明方法的本文所鉴定的拮抗性抗-CD40抗体。这些拮抗性抗-CD40抗体的修饰物包括，但不限于免疫活性的嵌合性抗-CD40抗体、人源化抗-CD40抗体和免疫活性的鼠抗-CD40抗体。
                          附图简述
图1显示了mAb CHIR-12.12的轻链和重链的氨基酸序列。图1A显示轻链的前导区(SEQ ID NO：2的残基1-20)、可变区(SEQ ID NO：2的残基21-132)和恒定区(SEQ ID NO：2的残基133-239)。图1B显示重链的前导区(SEQID NO：4的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：4的残基20-139)和恒定区(SEQ IDNO：4的残基140-469)。图1B所示mAb CHIR-12.12重链的交替恒定区反映了SEQ ID NO：4的153位用丝氨酸残基替换丙氨酸残基。mAb CHIR-12.12重链的该变体的完整序列示于SEQ ID NO：5。
图2显示mAb CHIR-12.12的轻链(图2A；SEQ ID NO：1)和重链(图2B；SEQ ID NO：3)的编码序列。
图3列出了mAb CHIR-5.9的轻链和重链的氨基酸序列。图3A显示了轻链的前导区(SEQ ID NO：6的残基1-20)、可变区(SEQ ID NO：6的残基21-132)和恒定区(SEQ ID NO：6的残基133-239)。图3B显示了重链的前导区(SEQ IDNO：7的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：7的残基20-144)和恒定区(SEQ IDNO：7的残基145-474)。图3B所示mAb CHIR-5.9重链的交替恒定区反映了SEQ ID NO：7的158位用丝氨酸残基替换丙氨酸残基。mAb CHIR-5.9重链的该变体的完整序列示于SEQ ID NO：8。
图4显示了人CD40的短同种型(氨基酸序列示于图4B；SEQ ID NO：10)的编码序列(图4A；SEQ ID NO：9)和人CD40的长同种型(氨基酸序列示于图4D)的编码序列(图4C；SEQ ID NO：11)。
图5显示了单克隆抗体CHIR-12.12在48小时(图5A)和72小时(图5B)抑制CD40L介导的CLL患者(n＝9)的癌细胞增殖。
图6显示单克隆抗体CHIR-12.12在48小时(图6A)和72小时(图6B)对CLL患者(n＝9)细胞无刺激作用。
图7显示了单克隆抗体CHIR-12.12比单克隆抗体Rituxan更有效地经ADCC-介导裂解CLL细胞系EHEB。
图8显示了通过示差扫描量热法(DSC)测定的CHIR-12.12在不同pH制剂中的热解链温度。
                            发明详述
本文所用的“肿瘤”指所有致瘤性细胞(无论是恶性还是良性的)的生长和增殖，和所有前癌和癌细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性的”表示或描述了以不受调控的细胞增殖为典型特征的哺乳动物的生理状况。癌症的例子包括，但不限于淋巴瘤和白血病。
“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体显示对抗原的结合有特异性，但免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一类型的多肽有例如淋巴系统以低水平产生和骨髓瘤以高水平产生的多肽。
术语“抗体”以最广义用时包括全装配的抗体、能结合抗原的抗体片段(例如，Fab′、F′(ab)2、Fv、单链抗体、双体分子)和包含以上物质的重组肽。
本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变以外，构成该群的每个抗体是相同的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白。每条轻链经共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目视不同免疫球蛋白同种型的重链而不同。每条重链和轻链也具有有规律地隔开的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端为可变区(VL)，在另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。据信，特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成相互作用界面。
术语“可变”表示以下内容：在抗体之间，可变区的某些部分在序列上差别很大，这部分是每种特定抗体用于与其特定抗原特异性结合的部分。然而，可变性不是均匀分布于整个抗体可变区中。它集中于位于轻链或重链可变区的称为互补决定区(CDR)或超变区的3个区段。可变区的较保守部分称为框架(FR)区。天然轻链和重链的可变区包含主要采取β-片层构型并由3个CDR相连的4个FR区，CDR形成(有时形成部分)连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过FR区紧密相聚，并且与另一条链的CDR紧靠在一起形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669页)。
恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应器功能，例如Fc受体(FcR)结合、抗体参与依赖抗体的细胞毒性、调理作用、启动依赖补体的细胞毒性和肥大细胞脱颗粒。
本文使用的术语“超变区”指负责结合抗原的抗体氨基酸残基。超变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of proteins ofImmunological Interest)(第5版，Public Health Service，National Institute ofHealth，Bethesda，MD)和/或“超变环”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。“框架”或“FR”残基是除超变区残基以外的可变区残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体分子；线性抗体(Zapata等，(1995)Protein Eng 8(10)：1057-1062)；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段(每种具有一个抗原结合位点)与一残留的“Fc”片段(其名字反映它易于结晶)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，该片段仍能交联抗原。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv抗体中，该区由紧密的非共价缔合的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。在单链Fv抗体中，一条重链可变区和一条轻链可变区经可弯曲的肽接头共价相连从而使轻链和重链缔合成类似于双链Fv抗体中的“二聚体”结构。每个可变区的3个CDR正是在这种构型中相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予了该抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段也含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端多几个残基(包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸残基)而不同于Fab’片段。本文称为Fab′-SH的是其恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初制备为之间具有绞链半胱氨酸的成对Fab′片段。抗体片段的其它化学偶联反应也是已知的。
任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分为截然不同的两种类型，该两种类型根据它们恒定区的氨基酸序列称为kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它们重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同类型。人免疫球蛋白主要有5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应器功能。例如，人IgG1和IgG3同种型可介导依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的“标记”指直接或间接与抗体偶联而产生“标记”抗体的可检测化合物或组合物。标记本身可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可催化底物化合物或组合物化学转变成可检测化合物。可用作可检测标记的放射性核素包括，例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。标记也可以是不可检测的实体，例如毒素。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括能部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然靶分子的生物活性或其转录或翻译的任何分子。
本文所用的“载体”包括当其以所用剂量和浓度与细胞或哺乳动物接触时没有毒性的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的例子包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。“联合”一种或多种其它治疗性药物给药包括同步(同时)和以任何顺序连续给药。
本文所用的术语“宿主细胞”指以单核实体培养的微生物或真核细胞或细胞系，它们可以是或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的受者，并且包括受转染原始细胞的后代。应理解，由于天然的、偶发的或设计的突变，一个细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补性上无需和原始的亲代完全相同。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。这些细胞优选至少表达FcγRII并行使依赖抗原的细胞介导细胞毒性(ADCC)效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体通常是IgG1或IgG3同种型。应注意，除了分离得到IgG1和IgG3抗体以外，这种ADCC介导性抗体可通过将非ADCC抗体的可变区或可变区片段工程改造为IgG1或IgG3同种型的恒定区来制备。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区域的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体或者交替剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞质结构域不同的FcγIIA(“活化性受体”)和FcγIIB(“抑制性受体”)。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。FcR综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 4：25-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330-341。本文的术语“FcR”包括其它FcR，包括将来鉴定到的FcR。该术语也包括将成熟IgG转移至胎儿的新生受体，FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117：587和Kim等，(1994)J.Immunol.24：249(1994))。
制备人抗体的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌细胞无限增殖。然而，EBV-感染的细胞难于克隆并且得到的免疫球蛋白通常产量较低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 100：5-40)。将来，可能通过引入转化基因的有限组合来实现人B细胞的无限增殖。近来的发现增加了这种可能性，即端粒酶催化性亚基连同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表达可导致正常人上皮细胞和成纤维细胞的致癌性转变(Hahn等，(1999)Nature 400：464-468)。现在已可能制备经过免疫后能产生全套人抗体不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)(Jakobovits等，(1993)Nature 362：255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14：845-851；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15：146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727；综述见Little等，(2000)Immunol.Today 21：364-370)。例如，嵌合型和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合子消除可完全抑制内源性抗体的产生已见描述(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555)。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变小鼠可制备转基因小鼠品系(Jakobovits等，(1993)Nature 362：255-258)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics 15：146-156)，当用抗原攻击后可产生高亲和力完全人抗体。这可通过将兆碱基的人重链和轻链基因座通过种系整合入删除了上述内源性JH区段的小鼠来实现。这些小鼠(XenoMouseII technology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重链基因座和800kb的人κ基因座，其中人重链基因座含有约66个VH基因、完全的DH和JH区域，以及3个不同的恒定区，人κ基因座含有32个Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。这些小鼠中产生的抗体在各方面，包括基因重排、装配和所有成分极其类似于在人中观察到的抗体。由于删除了内源性片段从而防止了鼠基因座中基因重排，此种人抗体的表达优先压倒内源性抗体。这种小鼠可用特别感兴趣的抗原免疫。
可筛选这种免疫动物血清对原先(接种)抗原的抗体反应性。可从淋巴节或脾细胞分离淋巴细胞，选择CD138-阴性和CD19-阳性淋巴细胞来选择B细胞。一方面，可将这种B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合以产生上述杂交瘤。
在另一方面，宜进一步筛选这种B细胞培养物对原先(接种)抗原的反应性。这种筛选包括用靶/抗原蛋白质的ELISA、用能与感兴趣抗原结合的已知抗体进行竞争性试验和与瞬时感染的表达该靶抗原的CHO或其它细胞的体外结合试验。
本发明涉及治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人患者的组合物和方法。这些方法包括用本文所述的抗-CD40抗体或其抗原结合片段治疗，其中给予该抗体或其抗原结合片段可在接受该治疗方法的对象内提高阳性治疗应答。适用于本发明方法的抗-CD40抗体能特异性结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，当这些抗体与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合后无明显激动活性而显示拮抗活性，如表达CD40的正常与致瘤性人B细胞(包括CLL细胞)所证实的。这些抗-CD40抗体和其抗原结合片段在本文中称为“拮抗性抗-CD40抗体”。这种抗体包括，但不限于下文所述的完整的人单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12，和具有单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12结合特性的单克隆抗体。这些可重组产生的单克隆抗体描述于下文和分别于2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))所述，各专利申请的内容均全文纳入本文作为参考。
具有单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12结合特性的抗体包括能竞争性干扰CD40结合和/或与CHIR-5.9和CHIR-12.12相同表位结合的抗体。技术人员可采用本领域已知的标准方法确定某抗体是否竞争性干扰CHIR-5.9或CHIR-12.12。
当这些抗体结合展示于人细胞，例如人B细胞表面上的CD40时，无明显的激动活性；在一些实施方案中，抗体与展示于人细胞表面的CD40结合抑制了这些人细胞的增殖与分化。因此，适用于本发明方法的拮抗性抗-CD40抗体包括对表达细胞表面CD40抗原的正常和恶性人细胞可显示拮抗活性的单克隆抗体。
拮抗性抗-CD40抗体
单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12代表了用于本发明方法的合适的拮抗性抗-CD40抗体。CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体是杂交瘤细胞系131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文称为细胞系12.12)产生的IgG1同种型完全人抗-CD40单克隆抗体。采用含有人IgG1重链基因座和人κ链基因座的免疫的异种小鼠(XenoMousetechnology；Abgenix；Fremont，California)脾细胞获得了这些细胞系。使脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(Sierra BioSource)融合。将得到的杂交瘤亚克隆数次得到稳定的单克隆细胞系5.9和12.12。本发明的其它抗体可用含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠或通过本领域已知和/或本文所述的其它方法类似地制备。
CHIR-12.12抗体的可变区的核苷酸和氨基酸序列，CHIR-5.9抗体的可变区的氨基酸序列分别见2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))中所述，各申请的内容全文纳入本文作为参考。mAb CHIR-12.12轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列分别示于图1A和1B。也参见SEQ IDNO：2(mAb CHIR-12.12轻链的完整序列)、SEQ ID NO：4(mAb CHIR-12.12重链的完整序列)和SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：4所示mAb CHIR-12.12的重链变体的完整序列，其变体包含在SEQ ID NO：4所示153位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基)。编码mAb CHIR-12.12轻链和重链的核苷酸序列分别示于图2A和2B。也参见SEQ ID NO：1(mAb CHIR-12.12轻链的编码序列)和SEQ ID NO：3(mAb CHIR-12.12重链的编码序列)。CHIR-5.9mAb轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列分别示于图3A和3B。也参见SEQ ID NO：6(mAb CHIR-5.9轻链的完整序列)、SEQ ID NO：7(mAb CHIR-5.9重链的完整序列)和SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：7所示mAb CHIR-5.9的重链变体的完整序列，其变体包含在SEQ ID NO：7所示158位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基)。此外，表达CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体的杂交瘤分别在ATCC中以专利保藏号PTA-5542和PTA-5543保藏。
除了拮抗活性外，本发明的抗-CD40抗体优选具有另一种抗肿瘤细胞的作用机理。例如，天然CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体具有ADCC活性。或者，CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体的可变区可表达在具有ADCC活性的另一种抗体同种型上。如下文所述，也可将CHIR-5.9或CHIR-12.12的天然形式、重组形式或其抗原结合片段偶联于细胞毒素。
如流式细胞术试验测定的那样，在ELISA型测定中CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体与可溶性CD40结合、阻止了CD40-配体与细胞表面CD40结合并置换了先前结合的CD40-配体。抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12可彼此竞争而不与15B8竞争结合CD40，15B8是2000年10月2日提交的名为“人抗-CD40抗体”的美国临时申请系列号60/237,556和2001年10月2日提交的也名为“人抗-CD40抗体”的PCT国际申请号PCT/US01/30857(代理人审理号PP 16092.003)中所述的抗-CD40单克隆抗体，该两篇申请的内容均全文纳入引为参考。当在体外测试对正常人对象的B细胞增殖的作用时，CHIR-5.9和CHIR-12.12起拮抗性抗-CD40抗体作用。此外，CHIR-5.9和CHIR-12.12不诱导正常人对象的淋巴细胞强增殖。这些抗体能通过依赖抗体的细胞毒性(ADCC)杀死CD40表达靶细胞。如BiacoreTM试验所测定的，CHIR-5.9与人CD40的结合亲和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12的结合亲和力是5×10-10M。
适用于本发明方法的拮抗性抗-CD40抗体对CD40细胞表面抗原显示强的单一位点结合亲和力。采用标准试验，例如BiacoreTM测定本发明的单克隆抗体对CD40的解离平衡常数(KD)显示为至少10-5M、至少3×10-5M、优选至少10-6M-10-7M、更优选至少10-8M-约10-12M。Biacore分析是本领域已知的并详述于《BIA应用手册》(BIAapplications handbook)。WO 01/27160所述的方法用于调节结合亲和力。
“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”指属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的跨膜糖蛋白(参见，例如美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO 8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens 36：33；Barclay等，(1997)《白血球抗原手册》(The LeucocyteAntigen Facts Book)(第二版；Academic Press，San Diego))。已鉴定到该基因交替剪接转录变体编码的人CD40的两种同种型。第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表达为具有由前19个残基代表的信号序列的277个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：12(首次报道为GenBank登录号CAA43045，在GenBank登录号NP_001241中鉴定为同种型1)，由SEQ ID NO：11(参见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码)。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表达为也具有由前19个残基表示的信号序列的203个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：10(首次报道为GenBank登录号NP_690593)，由SEQ ID NO：9(GenBank登录号NM_152854)编码)。人CD40的这两种同种型的前体多肽的前165个残基相同(即，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的残基1-165)。短同种型的前体多肽(SEQ ID NO：10所示)由缺乏编码区段，导致翻译读框移位的转录物变体(SEQ ID NO：9)编码；与CD40长同种型所含有的(SEQ ID NO：12的残基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同种型含有较短且不同的C-末端(SEQ ID NO：10的残基166-203)。对于本发明的目的，术语“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”包括CD40的短和长同种型。本发明的抗-CD40抗体可与下文所述该细胞表面抗原的短同种型或长同种型中相同位置的人CD40表位结合。
如本文别处所述，CD40抗原展示在各种类型细胞的表面。“展示于表面”和“表达于表面”指全部或部分CD40抗原暴露于细胞的外部。展示或表达的CD40抗原可完全或部分糖基化。
“激动活性”指作为激动剂的物质功能。激动剂与细胞受体的结合引起了与该受体的天然配体所引起的相似或相同的反应或活性。例如，CD40激动剂可诱导任何或全部(但不限于)下列应答：B细胞增殖和/或分化；抗体产生；胞内粘附；B细胞记忆产生(memory generaion)；同种型转换；上调II类MHC和CD80/60的细胞表面表达；分泌促炎性细胞因子，例如IL-8、IL-12和TNF等。“拮抗活性”指作为拮抗剂的物质功能。例如，CD40的拮抗剂可防止或降低通过CD40受体与激动性配体，特别是CD40L结合诱导的任何应答。拮抗剂可使激动剂结合所诱导的一种或多种应答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选40％、45％、50％、55％、60％、更优选70％、80％、85％和最优选90％、95％、99％或100％。检测抗-CD40抗体和CD40-配体结合特异性与拮抗活性的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于标准的竞争性结合试验、监测B细胞分泌免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样B细胞增殖试验、抗体产生的T细胞辅助试验、B细胞增殖的共同刺激试验和上调B细胞激活标记的试验。参见，例如分别公开于以下专利或申请中的试验：WO 00/75348；美国专利号6,087,329；和2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))，各申请的内容均全文纳入本文作为参考。
“明显的”激动活性指在B细胞应答试验中所检测的激动活性比天然物质或阴性对照诱导的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。“明显的”激动活性优选在B细胞应答试验中检测到的激动活性比天然物质或阴性对照诱导的高至少2倍或3倍。因此，例如当感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖时，“明显的”B细胞增殖指诱导的B细胞增殖水平比天然物质或阴性对照诱导的B细胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一个实施方案中，不结合CD40的非特异性免疫球蛋白，例如IgG1作为阴性对照。“无明显激动活性”的物质显示在B细胞应答试验中检测到的激动活性不高于天然物质或阴性对照诱导的激动活性约25％，优选不高约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高约0.1％。如上所述，当与人细胞上的CD40抗原结合时，本发明方法所用的拮抗性抗-CD40抗体无明显的激动活性。在本发明的一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体在B细胞应答中无明显的激动活性。在本发明的另一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体在多种细胞应答试验中(例如，增殖和分化，或增殖、分化和抗体产生)无明显的激动活性。
本文所用的“抗-CD40抗体”包括特能异性识别CD40 B细胞表面抗原的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体以及它们的片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了亲代抗-CD40抗体的抗原结合功能的其它片段。对本发明的方法而言，特别感兴趣的是与上述单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同结合特性的拮抗性抗-CD40抗体。
因此，除了单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12之外，可用于实施本文所述的本发明方法的其它抗体包括，但不限于以下抗体：(1)分别以专利保藏号PTA-5542和PTA-5543由ATCC保藏的，命名为131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文称为细胞系12.12)的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体；(2)含有选自SEQ ID NO：2所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ IDNO：5所示氨基酸序列、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，与同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的单克隆抗体；(3)含有选自SEQ ID NO：6所示、SEQ ID NO：7所示、SEQ ID NO：8所示氨基酸序列、同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，与同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的单克隆抗体；(4)具有由选自含有SEQ ID NO：1所示、SEQ ID NO：3所示、同时含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体；(5)能与杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体所结合的表位相结合的单克隆抗体；(6)能结合含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的残基82-87表位的单克隆抗体；(7)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；和(8)作为CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或前项(1)-(7)中所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合人CD40抗原的能力。本领域技术人员知道使用本领域已知和下文所述方法重组产生的本文公开的拮抗性抗体和这些抗体的抗原结合片段包括，例如重组产生的单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12。
制备拮抗性抗-CD40抗体
用于本发明的拮抗性抗-CD40抗体可用本领域技术人员已知的任何方法制备。可通过常规方法制备多克隆血清。通常先用含CD40抗原的溶液免疫合适的动物，优选小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可得到的血清体积多和可用已有的抗-家兔和抗-山羊标记抗体，优选用家兔和山羊制备多克隆血清。
可在转基因动物，优选携带人免疫球蛋白基因座的小鼠中制备多克隆血清。在一优选的实施方案中，表达CD40的SF9细胞用作免疫原。也可用盐水，优选用完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合物或乳剂来免疫。每次注射50-200μg的剂量一般足够。通常在2-6周后注射用盐水配制，优选用不完全弗氏佐剂配制的蛋白质加强免疫一次或多次。或者可用本领域已知的方法体外免疫产生抗体，就本发明目的而言体外与体内免疫等效。将免疫动物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育该血液1小时，然后4℃孵育2-18小时获得多克隆抗血清。离心(例如，1,000×g 10分钟)回收血清。每次放血可自家兔获得约20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞的制备方法见纳入本文作为参考的美国专利号6,004,552中所述。简言之，将编码人CD40的序列用转移载体重组入杆状病毒。将质粒与野生型杆状病毒DNA共同转染入Sf9细胞。鉴定重组杆状病毒感染的Sf9细胞并克隆纯化。
抗体优选在性质上是单克隆的。“单克隆抗体”指得自基本上均质抗体群的抗体，即除了存在极少量天然发生的突变以外，组成该群的每个抗体是相同的。该术语不受限于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗体结合功能的其它片段。单克隆抗体是高度特异性的，针对一个的抗原性位点，即在本发明中为CD40细胞表面抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上一个决定簇。修饰词“单克隆的”表示得自基本上均质的抗体群的抗体特性，不可理解为需要通过任何具体方法产生该抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等，(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法或重组DNA方法制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352：624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；和美国专利号5,514,548中所述技术自噬菌体抗体文库分离得到。
“表位”指抗原性分子中能诱导产生抗体并结合该抗体的那一部分。表位可含有线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式一个接一个顺序排列)，非线性氨基酸残基(本文称为“非线性表位”；这些表位非顺序排列)或线性与非线性氨基酸残基。
本文使用的术语“CD40-抗原表位”指除CD40抗原本身以外能与本发明的抗-CD40单克隆抗体起免疫反应的分子。CD40-抗原表位包括蛋白质、蛋白质片段、肽、碳水化合物、脂质和其它分子，但就本发明的目的而言，最常用蛋白质、短的寡肽、寡肽模拟物(即，模拟CD40抗原的抗体结合性能的有机化合物)或它们的组合。PCT申请US 91/04282描述了合适的寡肽模拟物。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256：495-496所述方法或其改进形式制备单克隆抗体。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用盐水，优选用完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外注射混合物或乳剂来免疫。可用本领域已知的任何免疫方法来获得本发明的单克隆抗体。免疫动物后，取出脾脏(任选取出几个大的淋巴结)解离成为单个细胞。使细胞混悬液涂布于包被有感兴趣抗原的板或孔来筛选脾细胞。表达抗原特异性膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合而不被洗掉。然后诱导得到的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，用选择性培养基培养。接种得到的细胞系列稀释液并测定能特异性结合感兴趣抗原的抗体(和不结合无关抗原的抗体)的产生。然后将分泌单克隆抗体(mAb)的选出的杂交瘤在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(作为小鼠的腹水)培养。
作为使用杂交瘤细胞的替代方法，如纳入本文作为参考的美国专利号5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公开的，可在细胞系，例如CHO细胞系中制备抗体。简言之，用能表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。嵌合性抗体可通过转染不同载体上的两种蛋白质来制备。另一优点是该抗体正确糖基化。
CD40的单克隆抗体是本领域已知的。参见，例如以下文献中有关B-细胞抗原的章节，McMichael编，(1987；1989)《白细胞分型III和IV》(LeukocyteTyping III and IV)(牛津大学出版社，纽约)；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；国际公布号WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等，(1988)J.Immunol.140：1425；Valle等，(1989)Eur.J.Immunol.19：1463；Clark等，(1986)PNAS 83：4494；Paulie等，(1989)J.Immunol.142：590；Gordon等，(1987)Eur.J Immunol 17：1535；Jabara等，(1990)J.Exp.Med.172：1861；Zhang等，(1991)J.Immunol.146：1836；Gascan等，(1991)J.Immunol.147：8；Banchereau等，(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 3：8；和Banchereau等，(1991)Science 251：70；所有文献纳入本文作为参考。本发明特别感兴趣的是本文公开的与上述单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同结合特性的拮抗性抗-CD40抗体。
此外，本文使用的术语“抗-CD40抗体”包括嵌合性抗-CD40抗体；用于本发明方法的这种嵌合性抗-CD40抗体具有本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体的结合特性。“嵌合”抗体指最好是用重组脱氧核糖核酸技术衍生的含有人(包括免疫“相关”种类，例如黑猩猩)和非人组分的抗体。Rituxan是具有鼠可变区和人恒定区的嵌合性抗体例子。出于本发明的目的，嵌合性抗体恒定区最好基本上与天然的人抗体恒定区相同；嵌合性抗体可变区最好衍生自非人来源并具有所需CD40细胞表面抗原的抗原性特异性。非人来源是可用来产生针对人CD40细胞表面抗原或含有人CD40细胞表面抗原物质的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括，但不限于啮齿类(例如，家兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，纳入本文作为参考的美国专利号4,816,567)和非人灵长类(例如，古猴(Old World Monkey)，类人猿等；参见例如纳入本文作为参考的美国专利号5,750,105和5,756,096)。当本文所用的短语“免疫活性”指嵌合性抗-CD40抗体时，指能结合人CD40的嵌合性抗体。
人源化抗-CD40抗体表示适用于本发明方法的其它抗-CD40抗体。“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗体形式。就大部分序列而言，人源化抗体指其中受者的超变区残基(也称为互补决定区或CDR)被非人种类(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的超变区残基取代的，具有所需特异性、亲和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗体)。短语“互补决定区”指共同确定了天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等，(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health andHuman Services)，NIH公布号91-3242)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应器功能的那部分。在以前涉及产生用于治疗人疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。所述人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。然而，这些人源化抗体仍能在人中引发有害且可能危险的免疫应答并且丧失了亲和力。用于本发明方法的人源化抗-CD40抗体具有类似于本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体所显示的结合特性。
人源化基本上可根据Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等，(1988)Science239：1534-1536)的方法通过用啮齿类或突变型啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。也参见纳入本文作为参考的美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基所取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供体抗体中没发现的残基。制备这些修饰物可进一步精制抗体的性能(例如，获得所需的亲和力)。总体上，人源化抗体基本上含有所有可变区、至少一个，通常两个可变区，其中所有或基本上所有的超变区是对应的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架区是对应的人免疫球蛋白序列。人源化抗体也任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多的细节见引作参考的Jones等，(1986)Nature 331：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括其中基本上小于完整的人可变区被非人种类的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO01/27160，其中公开了人源化抗体和产生对预定抗原具有改进亲和力的人源化抗体的技术。
术语抗-CD40抗体也包括非人哺乳动物宿主，更具体说是以灭活的内源性免疫球蛋白(Ig)基因座为特征的转基因小鼠产生的异种或修饰的抗-CD40抗体。在这种转基因动物中，使得表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的活性内源性基因无功能，并用同类人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物可产生基本上无宿主免疫球蛋白轻或重链亚基的人抗体。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号5,877,397和5,939,598。
针对CD40的完整人抗体优选通过免疫转基因小鼠获得。这种小鼠可用XenoMouse技术(Abgenix；Fremont，California)获得并公开于纳入本文作为参考的美国专利号6,075,181；6,091,001和6,114,598中。为制备本文公开的抗体，用表达人CD40的Sf9细胞免疫具有人IgG1重链基因座和人K轻链基因座的转基因小鼠。小鼠也可以是其它同种型的转基因动物。本发明所用的完整人抗体的特征在于其结合特性与本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体所显示的特征相似。
只要抗-CD40抗体的片段保留了所需的全长抗体的亲和力，它们就适用于本发明的方法。因此，抗-CD40抗体的片段保留了结合CD40B细胞表面抗原的能力。这种片段的特征在于其性能与相应的全长拮抗性抗-CD40抗体相似，即这种片段能特异性结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，并且当与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显激动活性而显示拮抗活性。本文将这种片段称为“抗原结合”片段。
抗体的合适抗原结合片段含有全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括，但不限于Fab、F(ab′)2、Fv片段和单链抗体分子。“Fab”指由轻链或重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab′)2指含有两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段指含有抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域以一条多肽链的形式存在。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还含有一多肽接头使sFv形成能与抗原结合所需的结构。sFv的综述见Pluckthun(1994)《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，269-315页。如下文所述，本文公开的拮抗性抗-CD40抗体的抗原结合片段也可与细胞毒素偶连以起杀死靶癌细胞的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature 348：552-554(1990)和美国专利号5,514,548中描述的技术从抗体噬菌体文库分离得到抗体或抗体片段。Clackson等，(1991)Nature 352：624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222：581-597分别描述了利用噬菌体文库分离得到鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过构建非常大的噬菌体文库方案的链改组(Marks等，(1992)Bio/Technology10：779-783)以及组合感染和体内重组来产生高亲和力(nM范围)人抗体(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
已开发了各种技术来制备抗体片段。这些片段通过使完整抗体蛋白水解消化而获得(参见，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24：107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 229：81)。然而，现在这些片段可通过重组宿主细胞直接制备。例如，可从上述噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10：163-167)。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离得到F(ab′)2片段。其它制备抗体片段的技术是技术人员熟知的。
本发明方法所用的拮抗性抗-CD40抗体包括本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体以及与该抗体不同但保留了CDR的抗体；具有一个或多个氨基酸添加、删除或取代的抗体，可通过抑制B细胞增殖和/或分化来测定其拮抗活性。本发明也包括脱免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗体，该抗体可按纳入本文作为参考的国际公布号WO 98/52976和WO 0034317所述制备。本发明的拮抗性抗-CD40抗体内的残基以该方式修饰而使得该抗体对人无免疫原性或较低，但却保留了对人CD40表达细胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述试验测定。权利要求的范围也包括本领域已知的含有本发明拮抗性抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或从相应的多核苷酸载体表达。参考下述抗体偶联法所描述的这种融合蛋白。
本发明的抗体可具有用例如纳入本文作为参考的专利公布号EP 0 983303A1、WO00/34317和WO98/52976中所述方法产生的序列变异。例如，CDR中的序列显示可导致抗体与II型MHC结合并引发有害的辅助性T细胞应答。保守取代可使得该抗体保留结合活性而丧失其引发有害T细胞应答的能力。可用本领域已知，例如本文其它部分所述的方法进行任何这种保守或非保守取代，得到的抗体属于本发明的范围。用本文所述方法常规测试变体抗体的拮抗活性、亲和力和特异性。
如果上述任何方法或其它本文未公开的方法制备的抗体在体外和/或体内拥有至少一种以下生物活性，其属于本发明范围：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞增殖；抑制表达CD40L的细胞或可溶性CD40刺激的正常人外周B细胞增殖；和抑制下述人恶性B细胞增殖。这些试验可分别如以下待批临时申请所述进行：2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))，每篇文献的内容全文纳入本文作为参考。也参见纳入本文作为参考的以下文献所述的试验：Schultze等，(1998)，Proc.Natl.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164：688-697；Noelle等，(1998)，AgentsActions Suppl.49：17-22；Lederman等，(1996)，Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等，(1991)，《当代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)13：12；Kwekkeboom等，(1993)，Immunology 79：439-444和美国专利号5,674,492和5,847,082。
检测本文所鉴定的CD40-抗原表位特异性拮抗性抗-CD40抗体的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过抑制标记的已知配体和其特异抗体结合的能力来检测和定量未知物的血清学试验。也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽与样品中的候选抗体，例如与针对本发明单克隆抗体的一种或多种表位而产生的单克隆抗体结合而沉淀。可通过筛选针对CD40蛋白或含有感兴趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制备的一系列抗体来鉴定能与感兴趣某表位特异性反应的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣的表位包括含有以下同种型的线性和/或非线性氨基酸残基的表位：如图4B所示(SEQ ID NO：10)由图4A所示序列(SEQ IDNO：9；也参见GenBank登录号NM_152854)编码的人CD40短同种型(见GenBank登录号NP_690593)，或如图4D所示(SEQ ID NO：12)由图4C所示序列(SEQ ID NO：11；参见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码的人CD40长同种型(参见GenBank登录号CAA43045和NP_001241)。或者，可用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行竞争性结合试验来选择与以前鉴定的抗体相当的单克隆抗体。
这种免疫试验采用的抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可用于凝结试验；采用各种各样标记物的标记抗体可用于各种试验。通过使抗体与可检测物质连接有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方式包括使用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等标记。合适的酶的例子包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例子包括：链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可将任何前述的拮抗性抗-CD40抗体或它们的抗体片段偶联然后用于本发明方法。制备偶联抗体的方法是本领域已知的。因此，可用间接标记或间接标记方法来标记抗-CD40抗体。“间接标记”或“间接标记方法”指将螯合剂共价偶联于抗体并且将至少一种放射性核素插入该螯合剂中。例如，参见纳入本文作为参考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18：589-603中所述的螯合剂和放射性核素。合适的标记包括荧光基团、生色团、放射性原子(特别是32P和125I)、电子密集试剂(electron-dense reagent)、酶和具有特异性结合伴侣(partner)的配体。一般通过其活性来检测酶。例如，常通过将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变为可用分光光度计定量的蓝色色素的能力来检测辣根过氧化物酶。“特异性结合伴侣”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原和其特异性单克隆抗体。其它特异性结合伴侣包括生物素和亲和素或链霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本领域已知的许多受体-配体对。因为相同的标记可以几种不同模式使用，以上描述应该理解为不是要将各种标记归为截然不同的种类。例如，125I可用作放射性标记或作为电子密集试剂。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可为所需的作用组合各种标记。例如，mAb与亲和素在实施本发明中也需要标记：因此，可用生物素标记mAb，然后用标记125I的亲和素或用标记HRP的抗-生物素mAb检测其存在。其它预先(制备)的突变与可能性对本领域普通技术人员不难理解，应认为是本发明范围内的等价物。
或者，抗-CD40抗体可使用放射性核素与抗体直接共价相连(一般通过氨基酸残基)的“直接标记”或“直接标记方法”标记。优选的核素见Srivagtava和Mease(1991)，同上。特别优选间接标记方法。也参见，例如国际公布号WO 00/52031和WO 00/52473，其中接头用于连接放射性标记与抗体；抗-CD40抗体的受标记形式描述于纳入本文作为参考的美国专利号6,015,542。
此外，抗体(或其片段)可与治疗性部分，例如细胞毒素、治疗性药物或放射性金属离子或放射性同位素偶联。细胞毒素或细胞毒药物包括对细胞有害的任何药物。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、足叶乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗性药物包括，但不限于抗代谢物(例如，氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，道诺红菌素(曾用名道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(曾用名放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂药物(例如，长春新碱和长春碱)。放射性同位素包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本发明的偶联物可用于修饰给定的生物应答；此类药物部分不应理解为限制于典型的化学治疗剂。例如，此类药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物；或生物应答修饰剂，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
将这种治疗性部分偶联于抗体的技术是熟知的。参见，例如《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体”(Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等编，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256页；Hellstrom等，(1987)，《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)中的“用于药物递送的抗体”(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等编，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653页；《单克隆抗体’84：生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications)中的Thorpe，(1985)，“癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：综述”(Antibodycarriers of Cytoxic Agents in Cancer Therapy：A review)，Pinchera等编，第475-506页，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；《癌症诊断和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)中的“在癌症治疗中治疗性应用放射性标记抗体的分析、结果和前景”(Analysis，Results，andFuture Prospective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherpy)，Baldwin等编，(Academic Press，New York，1985)，第303-316页；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
或者，可将抗体与二抗偶联形成如美国专利号4,676,980所述的抗体杂合偶联物。此外，可在标记和本发明的抗体之间使用接头(参见美国专利号4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可用放射性碘、铟、铱或本领域已知的其它放射性颗粒直接标记(美国专利号5,595,721)。治疗方案可由同时或依次给予偶联和非偶联抗体的组合治疗方案构成(WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗体的变体
拮抗性抗-CD40抗体的合适的生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体保留了亲代拮抗性抗-CD40抗体的所需结合特性。制备抗体变体的方法一般是本领域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗体，如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列变体可通过突变克隆的编码感兴趣抗体的DNA序列来制备。诱变与核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。例如，参见纳入本文作为参考的Walker和Gaastra编，(1983)，《分子生物学技术》(Techniques inMolecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等，(1987)MethodsEnzymol.154：367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和本文引用的参考文献。适当的氨基酸取代而不影响感兴趣多肽的生物活性的指南见纳入本文作为参考的Dayhoff等，(1978)《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protezh Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。优选保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在构建感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体多肽的变体过程中，进行修饰使变体继续具有所需活性，即相似的结合亲和力并能特异性地结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，并且当与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性而显示拮抗活性。编码这种变体多肽的DNA中的任何突变显然无须将其序列置于读框外并且优选不要生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利公布号75,444。
此外，可以许多方式使拮抗性抗-CD40抗体的恒定区突变而改变其效应器功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1所述的优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。
参比的拮抗性抗-CD40抗体的变体的氨基酸序列优选与该参比拮抗性抗-CD40抗体分子，例如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列，或与该参比抗体分子的较短部分具有至少70％或75％序列相同性，优选至少80％或85％序列相同性，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。这些分子更优选具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本发明的目的，可使用Smith-Waterman同源性检索算法以相关空格(affine gap)检索确定序列相同性百分比，所用参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体与参比的抗-CD40抗体有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基的不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有额外的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对与保守残基取代或空格相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
能特异性结合CD40并保留拮抗活性的多肽的精确化学结构，特别是当与恶性B细胞上的CD40抗原结合时取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性盐或碱性盐，或以中性盐形式获得。在合适的环境中可保留它们的生物活性的所有这种制剂包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗体的定义中。此外，可通过使用糖组分衍生(糖基化)或通过其它补充分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等增加该多肽的一级氨基酸序列。也可通过和糖偶联来增加该多肽的一级氨基酸序列。这种增加的某些方面可通过生产宿主的翻译后加工系统来实现；可在体外引入其它这种修饰。在任何情况中，只要抗-CD40抗体的拮抗特性能未遭破坏，这种修饰就包括在本文所用的抗-CD40抗体的定义中。在各种试验中，期望这种修饰可通过提高或降低该多肽的活性来定量或定性地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生方式来修饰链中的各个氨基酸残基，可切割该多肽得到保留活性的片段。这种不破坏拮抗活性的改变未将该多肽序列排除在本文所用感兴趣的抗-CD40抗体的定义之外。
本领域为有关多肽变体的制备和使用提供了基本指南。在制备抗-CD40抗体变体过程中，本领域的技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将导致适合用作本发明方法药物组合物中治疗性活性组分的变体。
采用本发明的拮抗性抗-CD40抗体的治序方法
本发明的方法涉及用拮抗性抗-CD40抗体来治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的对象(即，患者)，其中该癌症的细胞表达CD40抗原。“表达CD40的慢性淋巴细胞性白血病细胞”指表达CD40抗原的CLL细胞。成功地治疗CLL取决于诊断时癌症的发展阶段、对象是否以前或即将联合抗-CD40给药接受其它治疗方法。检测细胞的CD40表达的的方法是本领域熟知的，包括但不限于PCR技术、免疫组织化学方法、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。
许多标准可用于将CLL分为不同的阶段。本发明的方法可用于治疗根据Rai-Binet分类系统分类的CLL。Rai系统将CLL分为5个阶段：0阶段是仅存在淋巴细胞增多；I阶段是存在淋巴结病；II阶段是存在脾肿大、淋巴结病或两种情况均存在；III阶段是存在贫血、器官巨大症或两种情况均存在(根据体重丧失、疲倦、发热、肥大器官巨大症(massive organomegaly)和淋巴细胞数量骤增来定义病情的进展)；和IV阶段是存在贫血、血小板减少、器官肿大或它们的组合。Binet分阶段系统仅有三类：A阶段是存在淋巴细胞增多和少于3个淋巴结增大(该阶段包括了所有Rai 0阶段的患者、一半Rai I阶段的患者和3分之一的Rai II阶段的患者)；B阶段涉及3个或更多个淋巴结；C阶段是存在贫血或血小板减少，或两者都存在。Rai-Binet分类系统可与检测免疫球蛋白基因突变(的方法)组合来更精确地鉴定疾病的状态。存在突变的免疫球蛋白基因与预后的改善相关。
本发明的方法适用于治疗根据上述任何标准分类的CLL。就是因为这些标准可用于鉴定该疾病的发展阶段，可监测这些相同的标准，即贫血、淋巴结病、器官巨大症和免疫球蛋白基因突变评价治疗效果。
本文将“治疗”定义为将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予对象，或将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予对象的分离的组织或细胞系，所述对象患有CLL，CLL相关症状，或CLL的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响CLL、CLL的任何相关症状、或CLL的易感性。“治疗”也指将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予对象，或将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予对象的分离的组织或细胞系，所述对象患有CLL，CLL相关的症状，或CLL的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响CLL、CLL的任何相关症状、或CLL的易感性。
“抗肿瘤活性”指降低恶性的CD40表达细胞增殖或积累的速率从而降低已存在的肿瘤或在治疗期间产生的肿瘤的生长速率，和/或破坏已存在的致瘤性(肿瘤)细胞或新形成的致瘤性细胞从而减小治疗期间肿瘤的总体积。用至少一种抗-CD40抗体(或其抗原结合片段)治疗可导致治疗CLL的有益生理应答，所述疾病包含表达CD40抗原的细胞。应该知道本发明的方法可用于防止CLL细胞在治疗过程中的进一步增殖和过度生长。
根据本发明的方法，至少一种本文它处所定义的拮抗性抗-CD40抗体(或其抗原结合片段)可用于促进对治疗和预防CLL相关的阳性治疗性应答。癌症治疗相关的“阳性治疗性应答”指与这些抗体或其片段的抗肿瘤活性相关疾病的改善，和/或疾病相关症状的改善。即，可观察到抗增殖作用、防止肿瘤进一步过度生长，肿瘤体积减小、癌细胞(即，致瘤性细胞)数量降低、致瘤性细胞死亡增加、抑制致瘤性细胞存活、患者存活率增加和/或CD40表达细胞激活所介导的一种或多种症状的减轻。因此，例如疾病改善的特征可以是完全的应答。“完全的应答”指任何以前异常的放射显影研究、骨髓和脑脊髓液(CSF)正常化的临床上无可检测的疾病。用本发明的方法治疗后这种应答必须维持至少一个月。或者，疾病的改善可归类为部分应答。“部分应答”指在无新的病损时，所有可检测的肿瘤负荷(即，对象中肿瘤细胞的数量)至少降低约50％并至少持续一个月。这种应答仅适用于可检测的肿瘤。
可用以下筛选技术评价肿瘤应答所导致的肿瘤形态(即，总的肿瘤负荷、肿瘤体积等)变化：例如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射显影成像、计算机化断层显像(CT)扫描、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)分析、生物发光成像，如萤光素酶成像、骨扫描成像和包括抽取骨髓(BMA)的肿瘤活体组织取样。除了这些阳性治疗性应答以外，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段治疗的对象可经历疾病相关症状改善的有益作用。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”指给予拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段后，可导致与治疗CLL患者相关的阳性治疗性应答的量。在本发明的一些实施方案中，抗-CD40抗体或其片段的治疗有效量为约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。应知道该治疗方法可包括一次给予或多次给予治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一实施方案是将拮抗性抗-CD40抗体用作临床测试过程的一部分来诊断性监测组织中蛋白质水平，例如用于检测给定治疗方案的有效性。将该抗体与可检测的物质偶联有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗-CD40抗体可与已知的化疗方法联用、单独使用、或与外科或手术方法(例如，脾切除术、肝切除术、淋巴结切除术、白细胞去除术(leukophoresis)、骨髓移植等)，放疗，化疗，其它抗癌症单克隆抗体治疗，类固醇、IL-2治疗和干扰素-α联用，来治疗CLL。以此方式，本文所述拮抗性抗-CD40抗体或它们的抗原结合片段与至少一种其它癌症疗法联用，所述其它疗法包括，但不限于外科、放疗、化疗、其它抗癌症单克隆抗体疗法(例如，靶向恶性B细胞上的CD52细胞表面抗原的阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath)；靶向恶性B细胞上的CD20细胞表面抗原的利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan)；或其它治疗性抗-CD20的抗体，例如完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗(tositumomab)/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(Zevalin)；或靶向恶性B细胞上的CD23抗原的抗-CD23抗体)；干扰素-α疗法，白介素-2(IL-2)疗法、用IL-12、IL-15或IL-21治疗；或类固醇疗法，其中其它癌症疗法在抗-CD40抗体治疗给予之前、期间或之后给予。因此，当该组合疗法包括联合给予抗-CD40抗体或其抗原结合片段和例如化疗、放疗、干扰素-α、IL-2和/或类固醇治疗的另一种治疗性药物时，本发明的方法包括用独立的制剂或单一的药物制剂共同给药，或以两种顺序之一连续给药。当本发明的方法包括组合治疗方案时，这些治疗可同时进行，即在给予其它癌症治疗的同时或同一时间框内给予抗-CD40抗体或其抗原结合片段(即，同时进行治疗，但本发明的抗-CD40抗体或其抗原结合片段不是正好与其它疗法在相同的时间给予)。或者，本发明的抗-CD40抗体或其抗原结合片段也可在其它癌症疗法之前或之后给予。可依次进行不同的癌症疗法而不论受治疗的对象是否对第一疗程有反应，从而降低缓解或复发的可能性。当该组合疗法包括联合给予抗-CD40抗体或其抗原结合片段和细胞毒药物时，抗-CD40抗体或其抗原结合片段优选在给予细胞毒药物之前给予。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与化疗联合给予，并且任选与自体骨髓移植联合，其中抗体和化疗药物可以依次给予，以任一顺序给予或同时给予(即，同时或在相同时间范围内)。合适的化疗药物的例子包括，但不限于氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素和泼尼松。
因此，例如，在一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段与氟达拉滨联合给予。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予氟达拉滨之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用氟达拉滨治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，氟达拉滨与拮抗性抗-CD40抗体同时给予。
在本发明的其它实施方案中，瘤可宁，一种烷化药物与本文所述拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段联合给予。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予瘤可宁之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用瘤可宁治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，瘤可宁与拮抗性抗-CD40抗体同时给予。
在还有其它的实施方案中，含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松加阿霉素)与本文所述拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段联合给予。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予含有蒽环类的方案之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用含有蒽环类的方案治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，含有蒽环类的方案与拮抗性抗-CD40抗体同时给予。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段与阿来组单抗(Campath；BerlexLaboratories，Richmond，California经销)联合给予。阿来组单抗是靶向表达于恶性B细胞上CD52抗原的重组人源化单克隆抗体(Campath-1H)。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予阿来组单抗之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用阿来组单抗治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，阿来组单抗与拮抗性抗-CD40抗体同时给予。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段可与具有抗血管生成性能的另一种药物，例如酞咪哌啶酮或干扰素-α联用。当对象对一线治疗耐受时，后面的这些药物可起作用。或者，拮抗性抗-CD40抗体可与高剂量的化疗联合给予、单独给予或与自体骨髓移植联合给予对象。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段可与其它免疫治疗药物，特别是IL2联合给予。IL2是已知的一种可扩增受治疗患者的天然杀伤(NK)效应细胞数量的药物，可在给予本发明拮抗性抗-CD40抗体之前或同时给予。NK效应细胞的数量增加可提高给予的拮抗性抗-CD40抗体的ADCC活性。
此外，两种或多种治疗性药物和本文所述的拮抗性抗-CD40抗体的组合治疗也可用于治疗CLL。非限制性例子包括三重联合治疗，其中两种化疗药物与本文所述拮抗性抗-CD40抗体联合给予，其中一种化疗药物和另一种抗癌症单克隆抗体(例如，阿来组单抗、利妥昔单抗或其它抗-CD20抗体，例如完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)；或抗-CD23抗体)与本文所述拮抗性抗-CD40抗体联合给予。这种组合的例子包括，但不限于氟达拉滨、环磷酰胺和拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段的组合；氟达拉滨、抗-CD20抗体，例如利妥昔单抗(Rituxan；IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)和拮抗性抗-CD40抗体，例如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段的组合。
药物制剂和给药方式
本发明的拮抗性抗-CD40抗体的给药浓度可以治疗有效地预防或治疗慢性淋巴细胞性白血病的浓度给药。为实现此目的，可用本领域已知的各种可接受的赋形剂配制此抗体。此抗体一般通过静脉内、腹膜内或皮下注射给药。实现此种给药的方法是本领域普通技术人员已知的。也可能获得可局部或口服给药，或能透过粘膜输送的组合物。
取决于所给予的抗-CD40抗体，静脉内给药优选通过输液在约1-10小时期间进行，更优选约1-8小时，甚至更优选约2-7小时、还要优选约4-6小时。该药物组合物的最初输液可在约4-6小时期间进行，后续输液可较快递送。后续输液可在约1-6小时期间，例如约1-4小时、约1-3小时或约1-2小时给予。
可将本发明的药物组合物配制成与其要采用的给药途径相容。可能的给药途径的例子包括胃肠外(例如，静脉内(IV)、肌肉内(IM)、真皮内、皮下(SC)或输液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠外、真皮内或皮下应用的溶液或悬液可含有以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不易挥发的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌试剂，例如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如维生素C或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整张力的试剂，例如氯化钠和葡萄糖。可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可包装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
抗-CD40抗体通常用标准技术以药学上可接受的缓冲剂提供，例如无菌盐水、无菌缓冲水、丙二醇、上述物质的组合等。纳入本文作为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack PublishingCompany，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制备可胃肠外给予药物的方法。也参见，例如描述了适用于本发明方法的稳定的抗体药物制剂的WO98/56418。
本领域的普通技术人员不难确定待给予的至少一种抗-CD40抗体或其片段的量而无需过多实验。影响给药方式和至少一种拮抗性抗-CD40抗体(或其片段)的各自用量的因素包括，但不限于：所治疗的具体疾病、疾病的严重性、病史、所治疗个体的年龄、身高、体重、健康和身体状况。类似地，待给予的拮抗性抗-CD40抗体或其片段的用量取决于给药方式和对象是接受单剂量还是多剂量的该抗肿瘤药物。随着所治疗患者体重的增加，一般优选较高剂量的抗-CD40抗体或其片段。待给予的抗-CD40抗体或其片段的剂量为约0.003mg/kg-50mg/kg、优选0.01mg/kg-约40mg/kg。因此，例如剂量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括给予多剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其片段。该方法可包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效剂量的含拮抗性抗-CD40抗体或其片段的药物组合物。本领域技术人员不难确定多剂量的含拮抗性抗-CD40抗体或其片段的药物组合物的给药频率和持续时间而无需过多的实验。此外，用治疗有效量的抗体治疗对象包括单次治疗，或优选可包括一系列治疗。在一优选的实施例中，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段以约0.1-20mg/kg体重，每周一次治疗约1-10周，优选约2-8周、更优选约3-7周、甚至更优选约4、5或6周。每年进行治疗以防复发或根据复发迹象进行治疗。也应理解，用于治疗的抗体或其抗原结合片段的有效剂量在具体治疗期间可增加或降低。根据本文所述诊断试验的结果决定剂量的变化。因此，在一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间的第1、7、14和21天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段。在另一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间每周的第1、2、3、4、5、6和7天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段。其它实施方案包括在治疗期间每周的第1、3、5和7天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的给药方案；包括在治疗期间每周的第1和3天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的给药方案；和在治疗期间每周的第1天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的优选给药方案。治疗时期可包括1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或1年。治疗时期可连续或相互隔开1天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量是约0.003mg/kg-50mg/kg、约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约0.5mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一种拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，如抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或它们的抗原结合片段的剂量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在约0.003mg/kg-50mg/kg范围内的其它这种剂量。在整个抗体给药的每周可给予相同治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。或者，可在治疗期间采用不同的治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文它处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量可在较低的剂量范围(即，约0.003mg/kg-20mg/kg)内，后续的剂量可在较高的剂量范围(即，约20mg/kg-50mg/kg)内。
在其它实施方案中，本文它处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量可在较高的剂量范围(即，约20mg/kg-50mg/kg)内，后续剂量可在较低的剂量范围(即，约0.003mg/kg-20mg/kg)内。因此，在一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量是约20mg/kg-35mg/kg，包括约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg和约35mg/kg，随后的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为约5mg/kg-15mg/kg，包括约5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和约15mg/kg。
在本发明的一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体治疗先是给予需要拮抗性抗-CD40抗体治疗的对象以“负荷剂量”的抗体或其抗原结合片段。“负荷剂量”指给予对象的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的初始剂量，其中给予的抗体或其抗原结合片段的剂量在较高的剂量范围内(即，约20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“负荷剂量”在约24小时期间给予，该“负荷剂量”可以一次给药，例如该抗体或其抗原结合片段经静脉内一次输液；或可以多次给药，例如该抗体或其抗原结合片段经静脉内多次输液。给予“负荷剂量”后，可给予对象一次或多次额外治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。随后可按，例如每周给药时间表、或每两周一次、每三周一次或每四周一次给予治疗有效剂量。在这种实施方案中，后续的治疗有效剂量在较低的剂量范围内(即，0.003mg/kg-约20mg/kg)。
或者，在一些实施方案中，给予“负荷剂量”后，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段按照“维持时间表”给予，其中治疗有效剂量的抗体或其抗原结合片段按每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次、每三个月一次、每十四周一次、每四个月一次、每十八周一次、每五个月一次、每二十二周一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次给药。在这种实施方案中，特别是当随后的剂量以更高频率的间隔给药，例如每两个月一次到每月一次时，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量在较低剂量范围内(即，0.003mg/kg-约20mg/kg)；或者特别是当随后的剂量以更低频率的间隔给药，例如约间隔一个月到约十二个月时，治疗有效剂量在较高剂量范围内(即，约20mg/kg-50mg/kg)。
用于本发明方法的本文所述药物组合物中的拮抗性抗-CD40抗体可以是天然的或通过重组技术获得，可以是任何来源的，包括哺乳动物来源，例如小鼠、大鼠、家兔、灵长类、猪和人。这种多肽优选得自人来源，更优选得自杂交瘤细胞系的重组人蛋白。
本发明方法所用的药物组合物包含本发明的拮抗性抗-CD40抗体的生物活性变体。这种变体应该保留天然多肽的生物活性，从而使得当将包含变体多肽的药物组合物给予对象时具有与包含天然多肽的药物组合物相同的治疗作用。即，该变体抗-CD40抗体可以类似于天然拮抗性抗体，例如分别由杂交瘤细胞系5.9或12.12表达的CHIR-5.9或CHIR-12.12观察到的作用方式作为药物组合物中的治疗活性组分。本领域已建立了可用于确定变体抗-CD40抗体是否保留了所需生物活性从而可用作药物组合物中治疗活性组分的方法。可采用为检测天然拮抗性抗体活性而特别设计的试验，包括本发明所述的试验来测定抗体变体的生物活性。
任何包含具有本文所述结合特性的拮抗性抗-CD40抗体作为活性组分的药物组合物可用于本发明的方法。因此，包含一种或多种本发明的拮抗性抗-CD40抗体的液体、冻干或喷雾干燥的组合物可根据本发明的方法制备用作随后给予对象的水性或非水性溶液或悬液。这些组合物中的每种包含至少一种本发明的拮抗性抗-CD40抗体作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指特别引入该组合物中的抗-CD40抗体，当将该药物组合物给予对象时，可产生治疗、预防或诊断对象疾病或病症的所需治疗性或预防性应答。该药物组合物优选包含合适的稳定剂、填充剂，或同时包含二者以最大程度降低制备和储存期间与蛋白质稳定性和生物活性丧失相关的问题。
可在包含本发明的拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物中加入一些制剂(formulant)。这些制剂包括，但不限于油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或填充剂。碳水化合物优选包括糖或糖醇，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。“糖醇”定义为具有羟基的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。这些糖或糖醇可单独或组合使用。糖或糖醇的浓度在1.0％和7％w/v之间，更优选在2.0％和6.0％w/v之间。优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；然而，也可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000和3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量为3,000和5,000之间的聚乙二醇(PEG)。可加入该制剂的表面活性剂见欧洲专利号270,799和268,110。
此外，可通过例如与聚合物共价偶联来化学修饰抗体以增加它们的循环半衰期。优选的聚合物和连接肽的方法见全文纳入本文作为参考的美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。优选的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温可溶于水并如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氢或保护性基团，如烷基或烷醇基团。保护性基团优选具有1-8个碳原子，更优选是甲基。符号n是优选1-1,000之间，更优选2-500之间的正整数。PEG优选具有平均分子量1,000-40,000、更优选2,000-20,000、最优选3,000-12,000。PEG优选具有至少一个羟基、更优选是末端羟基。优选激活该羟基以和抑制剂上的游离氨基反应。然而，应理解可改变反应基团的类型和数量以获得共价偶联的PEG/本发明的抗体。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。优选POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架与例如动物和人的单、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，该分支在体内不会被视作外来物质。POG的优选分子量与PEG的相同。POG的结构见Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.263：15064-15070，美国专利号4,766,106描述了POG/IL-2偶联物，两篇文献均全文纳入本文作为参考。
另一种增加循环半衰期的药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法见Gabizon等，(1982)，Cancer Research 42：4734；Cafiso(1981)，BiochemBiophys Acta 649：129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9：467所述。本领域已知的其它药物递送系统描述见，例如Poznansky等，(1980)，《药物递送系统》(Drug Delivery Systems)，(R.L.Juliano编，Oxford，N.Y.)，第253-315页；Poznansky，(1984)，Pharm Revs 36：277。
引入药物组合物中的制剂应使得拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。即，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应保留其物理和/或化学稳定性并具有所需生物活性，即，一种或多种本文以上定义的拮抗活性，包括但不限于抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制CD40L表达细胞或可溶CD40配体(sCD40L)刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固态CD40L刺激的任何细胞中“存活性”抗-凋亡胞内信号；抑制结合sCD40L或固态CD40L后任何细胞中的CD40信号转导；和抑制本文它处所述人恶性B细胞的增殖。
监测蛋白质稳定性的方法是本领域熟知的。参见，例如Jones，(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90；Lee编，(1991)，《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，纽约，纽约)和本文公开的稳定性试验。通常在所选择的温度下，测定蛋白质在一段特定时期内的稳定性。在优选的实施方案中，当在室温(约25℃)储存至少1个月、至少3个月、或至少6个月，和/或在约2-8℃储存至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月时，稳定的抗体药物制剂将使得拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。
当将某种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物时，如果在该药物组合物中未出现沉淀、凝聚和/或变性的可见迹象(即，变色或澄清度丧失)或可测迹象(例如，采用体积排阻层析(SEC)或紫外光散射法)时，则可认为该蛋白质在给定时间点保留了其物理稳定性。就化学稳定性而言，当将某种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物时，如果化学稳定性的测定显示该蛋白质(即，抗体)在该药物组合物中保留了其感兴趣的生物活性，则可认为该蛋白质保留了其化学稳定性。测定化学稳定性变化的方法是本领域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或衬质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱检测因剪切所致蛋白质的化学改变形式的方法；和用例如离子交换色谱检测与分子荷电改变相关(例如，与脱氨基相关)的降解的方法。参见，例如下文所述的方法。
当将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段配制入药物组合物时，如果在给定时间的所需生物活性处于该药物组合物制备之时用所需生物活性的合适试验检测到的所需生物活性的约30％以内，优选约20％以内，则可认为所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在该时间点保留了所需生物活性。检测本文公开的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的所需生物活性的试验可如本文的实施例所述进行。也参见纳入本文作为参考的以下文献所述的试验：Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr Transplant.2：6-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164：688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等，(1996)，Curr Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等，(1991)，Current Protocolsin Immunology 13：12；Kwekkeboom等，(1993)Immunology 79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082。
在本发明的一些实施方案中，将拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段配制入液体药物制剂中。拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段可用本领域已知的任何方法，包括上文公开的方法制备。在一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段在CHO细胞系中重组产生。
拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段制备和纯化后可以本文所述方式配制为液体药物制剂。当拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在配制前要保存时，可在，例如≤-20℃冷冻，然后于室温融化作进一步配制。该液体药物制剂含有治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。该制剂中的抗体或其抗原结合片段的用量要考虑给药途径和所需剂量体积。
在此方式中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段：约0.1mg/ml-50.0mg/ml、约0.5mg/ml-40.0mg/ml、约1.0mg/ml-30.0mg/ml、约5.0mg/ml-25.0mg/ml、约5.0mg/ml-20.0mg/ml或约15.0mg/ml-25.0mg/ml。在一些实施方案中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段：约0.1mg/ml-5.0mg/ml、约5.0mg/ml-10.0mg/ml、约10.0mg/ml-15.0mg/ml、约15.0mg/ml-20.0mg/ml、约20.0mg/ml-25.0mg/ml、约25.0mg/ml-30.0mg/ml、约30.0mg/ml-35.0mg/ml、约35.0mg/ml-40.0mg/ml、约40.0mg/ml-45.0mg/ml或约45.0mg/ml-50.0mg/ml。在其它实施方案中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段：约15.0mg/ml、约16.0mg/ml、约17.0mg/ml、约18.0mg/ml、约19.0mg/ml、约20.0mg/ml、约21.0mg/ml、约22.0mg/ml、约23.0mg/ml、约24.0mg/ml或约25.0mg/ml。该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段和维持该制剂的pH于约pH5.0-pH 7.0的缓冲剂，所述pH包括约pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和约pH 5.0-pH 7.0范围内的其它这种数值。在一些实施方案中，缓冲剂可维持制剂的pH于约pH 5.0-pH 6.5、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH 5.5-7.0、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0的范围。
可在该制剂中采用维持液体抗-CD40抗体制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0范围的任何合适缓冲剂，只要所述抗体保留上述理化稳定性和所需生物活性。合成的缓冲剂包括，但不限于常规的酸及它们的盐，其中反荷离子可以是，例如钠、钾、铵、钙或镁。用于缓冲该液体药物制剂的常规酸及它们的盐的例子包括，但不限于琥珀酸或琥珀酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、乙酸或乙酸盐、酒石酸或酒石酸盐、磷酸或磷酸盐、葡糖酸或葡糖酸盐、谷氨酸或谷氨酸盐、天冬氨酸或天冬氨酸盐、马来酸或马来酸盐和苹果酸或苹果酸盐。该制剂中缓冲剂的浓度可以是约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在约1mM-50mM范围内的其它这种数值。在一些实施方案中，该制剂中缓冲剂的浓度可以是约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM或在约5mM-15mM范围内的其它这种数值。
在本发明的一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，所述缓冲剂的浓度可维持该制剂的pH于约pH 5.0-pH 7.0、优选约pH 5.0-pH 6.5。“琥珀酸盐缓冲剂”或“柠檬酸盐缓冲剂”指分别含有琥珀酸盐或柠檬酸盐的缓冲剂。在一优选的实施方案中，琥珀酸盐或柠檬酸盐反荷离子分别是钠阳离子，因此该缓冲剂分别是琥珀酸钠或柠檬酸钠。然而，预计任何阳离子均有效。其它可能的琥珀酸盐或柠檬酸盐阳离子包括，但不限于钾、铵、钙和镁。如上所述，该制剂中琥珀酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的浓度可以是约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在约1mM-50mM范围内的其它这种数值。在一些实施方案中，该制剂中缓冲剂的浓度可以是约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或约15mM。在其它实施方案中，液体药物组合物包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；和浓度为约1mM-20mM、约5mM-15mM，优选约10mM的琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，例如琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂。
该液体药物制剂接近等渗是理想的，该液体药物制剂除了包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH于约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂外，还可包含其量足以使得该制剂接近等渗的等渗剂。“接近等渗”指水性制剂具有以下重量克分子的渗透浓度：约240mmol/kg-360mmol/kg、优选约240-340mmol/kg、更优选约250-330mmol/kg、再要优选约260-320mmol/kg、还要优选约270-310mmol/kg。确定溶液等渗性的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如Setnikar等，(1959)，J.Am.Pharm.Assoc.48：628。
本领域的技术人员熟悉用于提供药物组合物等渗性的各种药学上可接受的溶质。等渗剂可以是能将本发明液体药物制剂的渗透压调节至与体液的渗透压接近等值的任何试剂。使用生理上可接受的等渗剂是理想的。因此，该液体药物制剂除了包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH于约pH 5.0-pH7.0内的缓冲剂外，还可包含用于提供等渗性的组分，例如氯化钠；氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)包括，但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；乙酸，其它有机酸或它们的盐，和用量相对较少的柠檬酸盐或磷酸盐。普通技术人员知道适合提供该液体制剂最佳等渗性的其它试剂。
在一些优选的实施方案中，该液体药物制剂除了包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH于约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂外，还可包含作为等渗剂的氯化钠。制剂中氯化钠的浓度取决于其它组分对张力的作用。在一些实施方案中，氯化钠的浓度是约50mM-300mM、约50mM-250mM、约50mM-200mM、约50mM-175mM、约50mM-150mM、约75mM-175mM、约75mM-150mM、约100mM-175mM、约100mM-200mM、约100mM-150mM、约125mM-175mM、约125mM-150mM、约130mM-170mM、约130mM-160mM、约135mM-155mM、约140mM-155mM或约145mM-155mM。在一个这样的实施方案中，氯化钠的浓度是约150mM。在其它这样的实施方案中，氯化钠的浓度是约150mM，缓冲剂是浓度为约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，该制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，约150mM的氯化钠和约10mM的琥珀酸或柠檬酸钠，pH为约pH 5.5。
可在制剂中加入表面活性剂以降低溶液-空气界面的表面张力而抑制本发明液体药物制剂在加工过程中由于冻融或机械剪切力所导致的蛋白质降解。因此，在一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，维持制剂的pH于约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂，还包含表面活性剂。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，维持制剂的pH于约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂，等渗剂，例如浓度为约50mM-300mM的氯化钠，还包含表面活性剂。
采用的典型表面活性剂是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐温80)和聚山梨酸酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij 35；二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂酰胆碱；和聚氧乙烯-对-叔-辛酚，例如TritonX-100。表面活性剂或乳化剂经典药物稳定作用的描述见，例如纳入本文作为参考的Levine等，(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165。用于实施本发明的优选表面活性剂是聚山梨酸酯80。当制剂中包含表面活性剂时，一般按以下量加入：约0.001％-1.0％(w/v)、约0.001％-0.5％、0.001％-0.4％、约0.001％-0.3％、约0.001％-0.2％、约0.005％-0.5％、约0.005％-0.2％、约0.01％-0.5％、约0.01％-0.2％、约0.03％-0.5％、约0.03％-0.3％、约0.05％-0.5％或约0.05％-0.2％。
因此，在一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；缓冲剂是浓度为约1mM-50mM、约5mM-25mM或约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂；制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5；该制剂还包含用量为约0.001％-1.0％或约0.001％-0.5％的表面活性剂，例如聚山梨酸酯80。这种制剂任选可包含等渗剂，例如浓度为约50mM-300mM、约50mM-200mM或约50mM-150mM的氯化钠。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括约20.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；约50mM-200mM的氯化钠；约5mM-20mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠，包括约10mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠；浓度为约50mM-200mM的氯化钠；和任选的用量为约0.001％-1.0％，包括约0.001％-0.5％的表面活性剂，例如聚山梨酸酯80；其中液体药物制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0、约pH5.0-pH 5.5、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0。
该液体药物制剂可基本上不含任何防腐剂和其它载体、赋形剂或本文上述的稳定剂。或者，该制剂可包含一种或多种防腐剂，例如抗细菌剂，药学上可接受的载体、赋形剂或本文上述的稳定剂，前提是它们对拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的理化稳定性无不利影响。可接受的载体、赋形剂和稳定剂的例子包括，但不限于：加入的缓冲试剂，助溶剂，表面活性剂，抗氧化剂，包括维生素C和甲硫氨酸，螯合剂，例如EDTA、金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。关于制剂和选择药学上可接受的载体、稳定剂和等渗剂(isomolytes)的详尽讨论见纳入本文作为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)。
本文所述的液体药物制剂或其它药物组合物制备后可冻干以防降解。冻干液体组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。使用前，组合物可用可含有其它成分的无菌稀释剂(例如林格溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建。重建后，组合物优选用本领域的技术人员已知的方法给药。
拮抗性抗-CD40抗体在生产药物中的应用
本发明也提供拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗CLL对象的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它癌症疗法合作起作用。“合作”指所述药物在用至少一种其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。其它癌症疗法的例子包括，但不限于手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植组合，其中合适的化疗药物包括，但不限于：氟达拉滨或盐酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素、泼尼松和它们的组合，例如含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松加阿霉素)、VAD(长春新碱、阿霉素加地塞米松)、MP(美法仑加泼尼松)，和用于化疗的其它细胞毒性和/或治疗性药物，如米托蒽醌、道诺红菌素、依达比星、天冬酰胺酶和抗代谢物，包括但不限于：阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨；其它抗癌症单克隆抗体疗法(例如，阿来组单抗(Campath)或其它靶向恶性B细胞上CD52细胞表面糖蛋白的抗-CD52抗体；利妥昔单抗(Rituxan)、完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)或任何其它靶向恶性B细胞上CD20抗原的治疗性抗-CD20抗体；抗-CD19抗体(例如，MT103，双特异性抗体)；抗-CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体埃坡组单抗(epratuzumab))；贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin)或其它靶向人血管内皮细胞生长因子的抗癌症抗体；靶向恶性B细胞上CD22抗原的抗-CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子的α-M-CSF抗体；靶向核因子-κB(RANK)及其配体(RANKL)的受体激活剂的抗体；靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向恶性B细胞上CD38抗原的抗-CD38抗体；靶向表达于恶性B细胞上主要组织相容性复合体II类受体的抗体(抗-MHC抗体)；其它靶向恶性B细胞上CD40抗原的抗-CD40抗体(例如，SGN-40)；和靶向表达于许多实体肿瘤和造血来源的肿瘤上肿瘤坏死因子相关促凋亡配体受体1(TRAIL-R1)的抗体(例如，激动性人单克隆抗体HGS-ETR1))；基于小分子的癌症疗法，所述小分子包括但不限于：微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝分裂抑制剂多拉斯他汀(dolastatin)和其类似物；微管蛋白结合药物T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白质激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白质Bcl-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森和Genasense)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极性细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡药物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬钆)；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于：疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVaxPersonalized Immunothcrapy，以前命名为GTOP-99)、Promues(CpG 7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素-α疗法、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其它癌症疗法；其中用其它一种或多种癌症疗法治疗可在用包含上述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗对象之前、期间或之后给予。在一个这种实施方案中，本发明提供单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9在生产治疗CLL患者的药物中的应用，所述药物与上述至少一种其它癌症疗法的治疗合作起作用。
因此，例如在一些实施方案中，本发明提供了单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产治疗对象的CLL的药物中的应用，所述药物与化疗治疗合作起作用，所述化疗药物选自氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素和泼尼松，和含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松加阿霉素)；和它们的任何组合；所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。
在其它实施方案中，本发明提供了单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产治疗对象的多发性骨髓瘤的药物中的应用，所述药物与用至少一种选自以下的其它抗癌症抗体的治疗合作起作用：阿来组单抗(Campath)或其它靶向恶性B细胞上CD52细胞表面糖蛋白的抗-CD52抗体；利妥昔单抗(Rituxan)、完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)或任何其它靶向恶性B细胞上CD20抗原的治疗性抗-CD20抗体；靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向恶性B细胞上CD22抗原的抗-CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；和它们的任何组合；所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。
在还有其它实施方案中，本发明提供了单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产治疗对象的CLL的药物中的应用，所述药物与用选自以下的至少一种其它基于小分子的癌症疗法的治疗合作起作用：SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白质Bcl-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森和Genasense)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极性细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(SAHA)、和FR-901228)，和它们的任何组合；或者可与其它疗法，例如CD154基因免疫(如ISF154)；所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用；或者就多重组合治疗而言，可在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。
在一些实施方案中，含有拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段与两种其它癌症疗法合作起作用。例子包括(不限于)所述药物与用两种化疗药物的治疗合作起作用，例如与用氟达拉滨和环磷酰胺的治疗合作起作用；与用化疗药物，如氟达拉滨和另一种抗癌症单克隆抗体，如阿来组单抗、利妥昔单抗或其它抗-CD20抗体，包括完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)和替伊莫单抗(Zevalin)或抗-CD23抗体的治疗合作起作用。当包含拮抗性抗-CD40抗体的所述药物与两种其它癌症疗法合作起作用时，所述药物可在用任一种或两种所述的其它癌症疗法治疗之前、期间或之后使用。
本发明也提供拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产治疗对象的CLL的药物中的应用，所述药物可用于已预先采用至少一种其它癌症疗法治疗过的对象。“预先治疗过”或“预先治疗”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物之前，对象已接受一种或多种其它癌症疗法。“预先治疗过”或“预先治疗”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段的药物治疗开始前的以下时间内曾采用至少一种其它癌症疗法治疗过的对象：2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。对象无需对先前一种或多种癌症疗法产生反应。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物的对象可以对先前癌症疗法或一种或多种先前癌症疗法(当预先治疗由多种疗法组成时)，例如手术和化疗；手术和其它抗癌症抗体疗法；化疗与其它抗癌症抗体疗法；或手术、化疗和其它抗癌症抗体疗法产生反应或不产生反应。
因此，在一些实施方案中，本发明提供拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产用于需要治疗CLL的对象的药物中的应用，所述对象先前用一种或多种以下其它癌症疗法治疗过：手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植组合，其中合适的化疗药物包括，但不限于：氟达拉滨、瘤可宁、cladribine、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷、环磷酰胺、阿霉素、泼尼松和它们的组合，例如含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松加阿霉素)；其它抗癌症单克隆抗体疗法(例如，阿来组单抗(Campath)；利妥昔单抗(Rituxan)或任何其它治疗性抗-CD20抗体；或靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体)；干扰素-α疗法；白介素-2(IL-2)疗法；用IL-12、IL-15或IL-21的疗法；或类固醇疗法。
本文将合作使用本文所述药物和一种或多种本文定义的其它癌症疗法的“治疗”定义为将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予对象，或将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予对象的分离的组织或细胞系，所述对象患有慢性淋巴细胞性白血病、具有这种癌症相关的症状，或患这种癌症的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该癌症、任何癌症相关症状、或发生癌症的易感性。
提供以下实施例是为了说明，绝非限制。
                             实验
导言
用于以下实施例的拮抗性抗-CD40抗体是CHIR-5.9和CHIR-12.12。CHIR-5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗体是通过免疫携带人IgG1重链基因座和人κ链基因座的转基因小鼠(XenoMousetechnology(Abgenix；Fremont，California))产生的人IgG1亚型抗-人CD40单克隆抗体(mAb)。表达CD40胞外结构域的SF9昆虫细胞用作免疫原。
简言之，如先前de Boer等，(1988)，J.Immunol.Meth.113：143所述，用50％聚乙二醇使免疫小鼠的脾细胞与SP2/0或P 3×63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞以10∶1的比例融合。将融合细胞重悬于添加了次黄嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全IMDM培养基中。然后将融合细胞分置于96-孔组织培养板孔中，平均每孔含有一个生长中的杂交瘤(细胞)。
10-14天后，筛选杂交瘤细胞群上清液有无特异性抗体产生。为筛选杂交瘤克隆产生的特异性抗体，合并各孔上清液并先用ELISA检测抗-CD40特异性活性。然后将阳性(杂交瘤细胞)用标准FACS试验作EBV-转化B细胞的荧光细胞染色。通过用含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS作有限稀释克隆阳性杂交瘤细胞两次。
总共31个小鼠脾(细胞)与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合得到895个在ELISA中能识别重组CD40的抗体。使用Abgenix XenoMouse技术(Abgenix；Fremont，California))产生的杂交瘤细胞平均约10％含有小鼠λ轻链替代了人κ链。选出含有小鼠轻λ链的抗体。选出同样显示能与细胞表面CD40结合的260个抗体亚组用于进一步分析。将在一系列亚克隆过程中选出的稳定杂交瘤细胞用于结合和功能试验作进一步鉴定。该选择方法的进一步细节，可分别参见2003年11月4日和2003年11月26日提交的二者均名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的用法”的待批临时申请，和转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))和60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))，它们的内容均纳入本文作为参考。
7个其它杂交瘤的克隆经鉴定具有拮抗活性。根据它们相对的拮抗能力和ADCC活性，选出两个杂交瘤细胞克隆作进一步评价(下表1)。它们命名为131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。
表1.抗-CD40 IgG1抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12的最初一组数据小结
  母体杂交瘤   杂交瘤克隆   细胞表面结合   拮抗   ADCC   CDC   CMCC#   V-区的DNA序列
  131.2F5   131.2F5.8.5.9   +++   +++   ++   -   12047   有
  153.8E2   153.8E2.D10.D6.12.12   +++   +++   ++++ -   12056   有
小鼠杂交瘤细胞系131.2F8.5.9(CMCC#12047)和杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)由美国模式培养物保藏所(ATCC；10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209(USA))分别以专利保藏号PTA-5542和PTA-5543保藏。
将编码该候选抗体可变区的cDNA经PCR扩增、克隆和测序。CHIR-12.12抗体轻链和重链的氨基酸序列分别示于图1A和1B。也参见SEQ ID NO：2(mAb CHIR-12.12的轻链)和SEQ ID NO：4(mAb CHIR-12.12的重链)。mAb CHIR-12.12重链的变体示于图1B(也参见SEQ ID NO：5)，其与SEQ ID NO：4的区别在于SEQ ID NO：4的153位用丝氨酸残基取代了丙氨酸残基。编码CHIR-12.12抗体的轻链和重链的核苷酸序列分别示于图2A和2B。也参见SEQ ID NO：1(mAb CHIR-12.12轻链的编码序列)和SEQID NO：3(mAb CHIR-12.12重链的编码序列)。CHIR-5.9抗体轻链和重链的氨基酸序列分别示于图3A和3B。也参见SEQ ID NO：6(mAb CHIR-5.9的轻链)和SEQ ID NO：7(mAb CHIR-5.9的重链)。mAb CHIR-5.9重链的变体示于图3B(也参见SEQ ID NO：8)，其与SEQ ID NO：7的区别在于在SEQ IDNO：7的158位用丝氨酸残基取代了丙氨酸残基。
得自独立杂交瘤的抗体如预计的那样在互补决定区(CDR)的核苷酸序列中有本质上改变。据信，VH的CDR3区中的多样性对决定抗体特异性最重要。
如FACS分析所示，CHIR-5.9和CHIR-12.12能特异性结合人CD40并阻止CD40-配体结合。这两种mAb均能竞争去除预先和细胞表面CD40结合的CD40-配体。CHIR-5.9与人CD40的结合亲和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12与人CD40的结合亲和力是5×10-10M。
CHIR-12.12和CHIR-5.9单克隆抗体是强拮抗剂，在体外能抑制CD40配体-介导的正常B细胞增殖以及在体外抑制CD40配体-介导的NHL和CLL患者的癌细胞增殖。在体外，两种抗体通过ADCC杀伤NHL患者的初级(primary)癌细胞。在异种移植人淋巴瘤模型中观察到剂量依赖的抗肿瘤活性。对这些结果和获得这些结果所用试验的更详细描述可分别参见2003年11月4日和2003年11月26日提交的二者均名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的用法”的待批临时申请，和转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))和60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))，它们的内容均全文纳入本文作为参考。
B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的特征在于长寿(long-lived)CD5+B细胞的体内积累。然而，当CLL细胞在体外培养时，它们很快因凋亡而死亡。据信，提供来自微环境的存活信号导致体内对凋亡的保护。CD40配体对CLL细胞的CD40刺激鉴定为一种这样的存活信号。
进行了以下研究来确定拮抗性抗-CD40 mAb CHIR-5.9和CHIR-12.12是否显示以下性能：(1)与慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者细胞结合；(2)通过阻断CD40-配体诱导的存活信号促进CLL患者细胞的细胞死亡；(3)自身对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞具有刺激/抑制活性；和/或(4)介导ADCC作为一种作用方式。
实施例1：CHIR-5.9和CHIR-12.12能阻断CD40介导的CLL患者的癌细胞存活和增殖
候选抗体能阻断CD40介导的CLL患者的癌细胞存活和增殖。患者的CLL细胞在以下两种条件下培养在过度表达CD40L的甲醛固定的CHO细胞悬液中：加入人同种型抗体IgG(对照)；加入CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体。所有抗原在不存在IL-4时以浓度1、10和100μg/ml加入。24和48小时通过MTS试验进行细胞计数。与对照组相比，从CHIR-5.9-(n＝6)和CHIR-12.12-(n＝2)处理的培养物中回收的细胞数量减少。在48小时观察到抗-CD40 mAb处理的和对照抗体处理的培养物之间细胞数量差异较大。这些数据总结于表2。
表2.培养开始后48小时，候选抗体对CD40诱导的CLL患者的癌细胞存活和增殖的作用
  患者#   Ab浓度(μg/ml)                    相对细胞数量           细胞数量减少％*
  IgG1   CHIR-5.9/5.11   CHIR-12.12   CHIR-5.9/5.11   CHIR-12.12
  1   110100   269.31101.58130.71   25.2733.0740.16   NDNDND   90.6267.4469.28   NDNDND
  2   110100   265.55227.57265.99   75.8128.56.4   NDNDND   71.4643.5397.59   NDNDND
  3   110100   85.970.4477.65   35.3939.5120.95   NDNDND   58.8043.9173.02   NDNDND
  4   110100   80.4863.0155.69   15.0319.513.65   NDNDND   81.3269.0493.45   NDNDND
  5   110100   90.6378.1363.53   91.6682.2886.47   89.5960.4139.59   -1.14-5.31-36.11   1.1522.6837.68
  6   110100   130.21131.77127.08   77.678.1376.56   71.8873.9682.29   40.4040.7139.75   44.8043.8735.25
*与对照Abs相比的减少％＝100-(测试Abs/对照Abs)×100
第二项研究显示了类似的结果。在该项研究中，9位患者的初级CLL细胞在存在或不存在1、10或100μg/ml抗-CD40mAb CHIR-12.12时，以上述方式培养在表达CD40L的甲醛固定的CHO细胞悬液中，使用非特异性IgG作为对照。48和72小时后如上所述测定培养物的增殖情况。在无抗-CD40 mAbCHIR-12.12时，初级CLL细胞耐受细胞自发死亡或者增殖。在存在mAbCHIR-12.12时，该作用收到抑制，此mAb恢复了CLL细胞死亡。因此，这些结果证实抗-CD40 mAb CHIR-12.12在48和72小时都抑制CD40-诱导的CLL细胞增殖。参见图5A和5B。
在只有mAb CHIR-12.12时对未刺激的CLL细胞进行了类似实验。与对照IgG(10μg/ml)相比，单独的mAb CHIR-12.12(10μg/ml)在48和72小时处未诱导CLL增殖，因此对CLL细胞不具有刺激作用。参见图6A和6B。
实施例2：抗-CD40 mAb CHIR-12.12通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)裂解慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞系的能力
CLL细胞系EHEB与拮抗性抗-CD40 mAb CHIR-12.12或抗-CD20抗体Rituxan(IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)一起培养，正常志愿献血者的新鲜分离的人NK细胞作为效应细胞。根据从靶细胞释放的标记测定特异性裂解百分比。
抗-CD40 mAb CHIR-12.12显示剂量依赖方式的裂解活性，在0.1μg/ml达到最高裂解水平(图7)。如图7所示，mAb CHIR-12.12诱导的ADCC介导的细胞裂解比Rituxan(mAb CHIR-12.12的最大特异性裂解＝27.2％；Rituxan的最大特异性裂解＝16.2％；p＝0.007)高。根据这些结果，靶细胞上存在的抗-CD20抗体的结合位点比抗-CD40抗体的约多10倍(见表3)，这表明与CD20表达情况相比，表达于CLL细胞系EHEB上的CD40分子较少。事实上，CLL靶细胞系表达509,053±13,560个CD20分子，而表达的CD40分子为48,416±584个。因此，mAb CHIR-12.12介导的较高的ADCC不是因为在该CLL细胞系上CD40分子的密度高于CD20分子。
表3.EHEB细胞系靶结合位点比例
  细胞系              最大裂解％   最高结合位点之比
  mAb CHIR12.12   Rituxan   CD20/CD40
  EHEB   27.19   16.21   10.51
实施例3：与15B8相比，CHIR-5.9和CHIR-12.12与CD40上的不同表位结合
候选单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12能互相竞争与CD40结合，但不与15B8，一种IgG2抗-CD40 mAb(参见国际公布号WO 02/28904)竞争。利用CM5生物传感器芯片设计了使用Biacore的抗体竞争结合试验，所述芯片含有经氨基偶联而固定的蛋白质A用于捕捉抗-CD40、CHIR-12.12或15B8。用不同浓度的CD40-his观察到正常的缔合/解离结合曲线(数据未显示)。就竞争研究而言，CHIR-12.12或15B8均被捕捉于蛋白质A表面。然后使不同浓度的CD40-his/CHIR-5.9Fab复合物(100nM CD40：1μMCHIR-5.9Fab)流过该修饰的表面。就CHIR-12.12而言，未观察到复合物的缔合，表明CHIR-5.9阻断了CHIR-12.12与CD40-his的结合。就15B8而言，观察到Fab CHIR-5.9复合物的缔合，表明CHIR-5.9不阻断15B8与CD40的结合位点结合。然而，该复合物的解离速率(off rate)显著增加(数据未显示)。
也证明了15B8和CHIR-12.12不竞争与CD40-his结合。该实验步骤如下：用蛋白质A生物传感器芯片捕捉CHIR-12.12、用对照IgG1封闭残留的蛋白质A位点、结合CD40-his然后使15B8流过该修饰的表面。15B8在这些条件下确实有结合，表明CHIR-12.12不阻断15B8与CD40的结合。
实施例4：CHIR-12.12和5.9mAb的结合性能
将蛋白质A经氨基偶联而固定于CM5生物传感器芯片上。将1.5μg/ml的人抗-CD40单克隆抗体在1.5分钟内以10μl/分钟(流过)被捕捉在此修饰的生物传感器表面上。使不同浓度的重组可溶性CD40-his流过该生物传感器表面。用0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20(HBS-EP)稀释抗体和抗原。用Biaevaluation软件以1∶1相互作用模型/球形拟合(global fit)测定动力学和亲和力常数。
如下表4所示，CHIR-5.9和CHIR-12.12的解离速率有121倍差异，这导致CHIR-12.12的亲和力高24倍。
表4.CHIR-5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗体的结合特性小结
  抗体   Ka(M-1秒-1)   Kd(秒-1)   KD(nM)
  抗-CD40，CHIR-5.9   (12.35±0.64)×105   (15.0±1.3)×105   12.15±0.35
  抗-CD40，CHIR-12.12   (2.41±0.13)×105   (1.24±0.06)×104   0.51±0.02
为确定单克隆抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9识别的CD40表位的位置，进行了SDS-PAGE和Western印迹分析。在还原和非还原条件下在4-12％NUPAGE凝胶上分离纯化的CD40(0.5μg)，转移至PVDF膜上用10μg/ml浓度的单克隆抗体检测。印迹以碱性磷酸酶偶联的抗-人IgG检测并用碱性磷酸酶的Western BlueR稳定底物(Promega)显色。
结果表明抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12同时识别非还原和还原形式CD40上的表位，与非还原形式的CD40结合的强度显著高于还原形式的CD40(表5；印迹未显示)。两种形式的CD40的识别均是阳性表明该抗体能与部分是线性序列的构象表位相互作用。单克隆抗体CHIR-5.9主要识别非还原形式的CD40，提示该抗体主要与构象表位相互作用(表5；印迹未显示)。
表5.结构域鉴定
 结构域1  结构域2  结构域3  结构域4
  mAb CHIR-12.12  -  +  -  -
  mAb CHIR-5.9  -  +  -  -
  mAb 15B8  +  -  -  -
为勘察CD40上的抗原性区域，克隆了CD40的4个胞外结构域并在昆虫细胞中表达为GST融合蛋白。GP67分泌信号肽保证了这四个结构域的分泌。昆虫细胞上清液经SDS-PAGE和Western印迹分析来鉴定到含有表位的结构域。
单克隆抗体CHIR-12.12能在还原和非还原条件下识别结构域2上的一个表位(表6；印迹未显示)。相反，单克隆抗体CHIR-5.9显示对结构域2的识别非常微弱(表6；印迹未显示)。在该项分析中，这些抗体均不识别结构域1、3或4。
表6.结构域2分析
  还原性   非还原性
  mAb CHIR-12.12   ++   +++
  mAb CHIR-5.9   +   +
为精确地确定mAb CHIR-12.12所识别的表位，合成了对应于以下序列的CD40的胞外结构域2的肽：PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基61-104)。制备了含有35个10mer肽和1-氨基酸旁支(offset)的SPOT膜(Sigma)。用mAb CHIR-12.12和抗-人IgGβ-半乳糖苷酶作为二抗进行Western印迹分析。剥下印迹用mAb CHIR-5.9再检测来确定该抗体识别的区域。
用10μg/ml的抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12检测作SPOT分析，点18-22得到阳性反应。这些肽覆盖区域的序列示于表7。
表7.用抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12检测作SPOT分析的结果
  点号   序列区域
  18   HQHKYCDPNL(SEQ ID NO：10或12的残基78-87)
  19   QHKYCDPNLG(SEQ ID NO：10或12的残基79-88)
  20   HKYCDPNLGL(SEQ ID NO：10或12的残基80-89)
  21   KYCDPNLGLR(SEQ ID NO：10或12的残基81-90)
  22   YCDPNLGLRV(SEQ ID NO：10或12的残基82-91)
这些结果对应于线性表位：YCDPNL(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基82-87)。该表位含有预计参与CD40-CD40配体相互作用的Y82、D84和N86。
用mAb CHIR-5.9作SPOT分析显示，其对表8所示点20-22代表的肽识别弱，提示区域YCDPNLGL(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基82-89)参与了其与CD40的结合。应注意的是，在BIACORE分析中mAbs CHIR-12.12和CHIR-5.9可相互竞争与CD40结合。
表8.用抗-CD40单克隆抗体5.9检测的SPOT的结果
  点号   序列区域
  20   HKYCDPNLGL(SEQ ID NO：10或12的残基80-89)
  21   KYCDPNLGLR(SEQ ID NO：10或12的残基81-90)
  22   YCDPNLGLRV(SEQ ID NO：10或12的残基82-91)
SPOT分析鉴定到的线性表位位于CD40B1模块中。CD40 B1模块的该序列是：HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC(SEQ ID NO：10或12的残基80-103)。
在此线性表位中CHIR-12.12鉴定的是C83。已知该半胱氨酸残基与C103形成二硫键。CHIR-12.12mAb识别的构象表位可能含有该二硫键(C83-C103)和/或构象上接近C103的环绕氨基酸。
实施例6：CHIR-12.12阻断正常人B细胞中CD40L-介导的CD40存活和信号转导途径
可溶性CD40配体(CD40L)能激活B细胞诱导各种功能性应答，包括提高存活和增殖，激活NFκB、ERK/MAPK、PI3K/Akt，和p38信号转导途径。此外，CD40L-介导的CD40刺激通过减少正常B细胞中切割的PARP和诱导抗凋亡蛋白、XIAP和Mcl-1提供存活信号。CD40L-介导的CD40刺激也募集TRAF2和TRAF3结合CD40胞质结构域。
以下研究证明CHIR-12.12能直接抑制对正常B细胞的所有这些作用。例如，CHIR-12.12处理以时间和剂量依赖方式导致胱冬酶-9、胱冬酶-3和PARP切割增加以及XIAP和Mcl-1减少，恢复B细胞凋亡。用CHIR-12.12处理在对CD40L-介导的CD40刺激的反应中也抑制IκB激酶(IKK)α和β(NFκB途径)、ERK、Akt和p38的磷酸化。此外，发现没有最初的CD40L-介导的CD40刺激时，CHIR-12.12不激发这些凋亡作用。
CHIR-12.12通过诱导PARP切割抑制CD40配体介导的存活
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0、20分钟、2小时、6小时、18小时和26小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中切割的胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3、切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，观察到CD40L-介导的CD40激活提供了存活信号，因为未导致胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3或切割的PARP随时间而增加，表明细胞未经历凋亡。然而，用CHIR-12.12处理导致这些切割产物增加，表明CHIR-12.12处理消除了CD40L结合对sCD40L-刺激的正常B细胞中存活信号的转导，恢复了B细胞凋亡(数据未显示)。
CHIR-12.12抑制“存活”性抗凋亡蛋白的表达
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0、20分钟、2小时、6小时、18小时和26小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中Mcl-1、XIAP、CD40和β肌动蛋白对照。简言之，sCD40L刺激导致Mcl-1和XIAP随时间而持续表达。然而，用CHIR-12.12处理sCD40L-刺激的细胞导致这些蛋白质随时间表达减少(数据未显示)。由于Mcl-1和XIAP是能阻断凋亡途径的“存活”信号，这些结果证明CHIR-12.12处理消除了sCD40L-刺激的正常B细胞中凋亡的阻断。
CHIR-12.12处理抑制了正常B细胞中IKKα(ser180)和IKKβ(Ser 181)的磷酸化
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激1.0×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中磷酸化的IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)与总的IKKβ对照。
简言之，sCD40L刺激导致IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)随时间而磷酸化；然而，用CHIR-12.12处理消除了正常B细胞中对sCD40L-刺激的此应答(数据未显示)。
CHIR-12.12处理以剂量依赖方式抑制CD40配体介导的存活
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/ml)和对照IgG。24小时后收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，CHIR-12.12处理以剂量依赖方式导致sCD40L-刺激的细胞中PARP切割增加，因此消除了sCD40L-刺激的正常B细胞中的存活信号途径(数据未显示)。
CHIR-12.12以剂量依赖方式抑制“存活”性抗-凋亡蛋白的表达
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.5、2和10μg/ml)和对照IgG。22小时后收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中Mcl-1、XIAP、切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，CHIR-12.12处理以剂量依赖方式减少了sCD40L-刺激细胞中的Mcl-1和XIAP表达并增加了切割的PARP表达，因此消除了对sCD40L-刺激的正常B细胞中凋亡途径的阻断(数据未显示)。
在不存在可溶性CD40L信号时，CHIR-12.12不影响抗-凋亡蛋白、切割的PARP和XIAP表达
在这些实验中，仅用CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG(即，在加入抗体之前，细胞未用sCD40L预刺激)处理1.0×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。于0、4、14和16小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中XIAP、切割的PARP和β-肌动蛋白对照。
简言之，这些结果显示无sCD40L刺激时，IgG处理的对照细胞和CHIR-12.12处理的细胞中，细胞表达的切割的PARP浓度增加，而XIAP表达维持恒定(数据未显示)。这些数据表明，没有CD40L刺激时，CHIR-12.12不激发正常人B细胞凋亡。
CHIR-12.12抑制正常B细胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)、Akt、ERK和p38的磷酸化
在这些实验中，1.0×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中血清饥饿(serum starve)并用1μg/mlsCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。细胞用CHIR-12.12(1和10μg/ml)和对照IgG处理培养物。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中磷酸-IKKα、磷酸-IKKβ、总的IKKβ、磷酸-ERK、总的ERK、磷酸-Akt、总的Akt、磷酸-p38和总的p38。
简言之，sCD40L刺激导致IKKα/β磷酸化、ERK磷酸化、Akt磷酸化和p38磷酸化增加，导致细胞的存活和增殖。用CHIR-12.12处理细胞消除了正常B细胞中sCD40L-刺激对这些信号转导途径的作用(数据未显示)。
CHIR-12.12抑制多种信号转导途径，例如CD40信号级联反应中的PI3K和MEK/ERK
在这些实验中，1.0×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中血清饥饿并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。培养物也用CHIR-12.12(1和10μg/ml)、Wortmanin(一种PI3K/Akt抑制剂；1和10μM)、LY 294002(一种PI3K/Akt抑制剂；10和30μM)和PD 98095(一种MEK抑制剂；10和30μg/ml)处理。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中磷酸-ERK、磷酸-Akt、总的Akt、磷酸-IKKα/β和各自总含量。
简言之，这些结果显示CHIR-12.12消除了所有这些信号转导分子的磷酸化，而信号转导抑制剂显示只特异性消除信号转导，表明CHIR-12.12可能抑制CD40L刺激介导的这些信号转导分子的上游途径(数据未显示)。
CHIR-12.12抑制正常B细胞中信号转导分子TRAF2和TRAF3与CD40胞质结构域的结合
在这些实验中，4.0×106个健康献血者的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中血清饥饿并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激20分钟。于0和20分钟收集细胞。用多克隆抗-CD40(Santa Cruz Biotechnology，CA)免疫沉淀CD40，在Western印迹中用抗-TRAF2 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗-TRAF3 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)和抗-CD40mAb(Santa CruzBiotechnology，CA)检测。
简言之，这些结果显示sCD40L刺激后TRAF2和TRAF3与CD40共同沉淀。相反，用CHIR-12.12处理消除了sCD40L-刺激的正常B细胞中CD40-TRAF2/3信号转导复合物的形成。CD40的表达没有变化(数据未显示)。
不受理论的束缚，这些实验的结果和上述实施例的结果表明CHIR-12.12抗体是具有独特组合特性的双重作用拮抗性抗-CD40单克隆抗体。该完全的人单克隆抗体能阻断B细胞存活和增殖的CD40L-介导的CD40信号转导途径；该拮抗作用最终导致细胞死亡。CHIR-12.12也能介导效应细胞的识别和结合，启动抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12与效应细胞结合，释放溶细胞酶，导致B细胞凋亡和裂解。当在临床前肿瘤模型中比较时，CHIR-12.12是比利妥昔单抗更有效的抗肿瘤抗体。
实施例7：拮抗性抗-CD40抗体的液体药物制剂
为选择拮抗性抗-CD40抗体CHIR-12.12的最佳溶液环境，本项研究的目的是通过生物物理和生物化学方法检测溶液pH对该抗体稳定性的作用。示差扫描量热法(DSC)结果显示CHIR-12.12在pH 5.5-6.5的制剂中构象稳定性最佳。基于SDS-PAGE、体积排阻HPLC(SEC-HPLC)和离子交换HPLC(CEX-HPLC)分析的综合结果，CHIR-12.12在约pH 5.0-5.5时的理化稳定性最佳。鉴于这些结果，含有该抗体的一种推荐的液体药物制剂是用约10mM琥珀酸钠、约150mM氯化钠配制，pH约5.5、含有约20mg/ml的CHIR-12.12的制剂。
材料与方法
用于制剂研究的CHIR-12.12抗体是通过CHO细胞培养方法产生的人单克隆抗体。该MAb的分子量为150kDa，由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。其靶向表达CD40的细胞，包括正常和恶性B细胞上的CD40细胞表面受体来治疗各种癌症和自身免疫/炎性疾病。
用于本项研究的抗-CD40药物是散装的，得自CHO的纯化抗-CD40(CHIR-12.12)。该药物组合物是用10mM琥珀酸钠、150mM氯化钠配制，pH约6.5、浓度约9.7mg/ml的CHIR-12.12。该研究的对照样品是接受的药物，经≤-60℃冻结后在室温融化并在预定的时间点连同稳定性样品一起测试。如表9所示，用不同pH溶液透析该药物来制备稳定性样品并用UV280测定各样品的CHIR-12.12浓度。
表9.CHIR-12.12制剂
  缓冲剂组成   pH   CHIR-12.12浓度(mg/ml)
  10mM柠檬酸钠，150mM氯化钠   4.5   9.0
  10mM琥珀酸钠，150mM氯化钠   5.0   9.3
  10mM琥珀酸钠，150mM氯化钠   5.5   9.2
  10mM柠檬酸钠，150mM氯化钠   6.0   9.7
  10mM柠檬酸钠，150mM氯化钠   6.5   9.4
  10mM磷酸钠，150mM氯化钠   7.0   9.4
  10mM磷酸钠，150mM氯化钠   7.5   9.5
  10mM甘氨酸，150mM氯化钠   9.0   9.5
使用以下方案测定各种制剂中CHIR-12.12抗体的理化稳定性。
示差扫描量热法(DSC)
用MicroCal VP-DSC按1℃/分钟速度从15℃加热至90℃检测不同制剂样品的构象稳定性。
SDS-PAGE
用4-20％Tris-甘氨酸凝胶在非还原和还原条件下评估断裂和聚集。通过考马斯亮蓝染色法检测蛋白质。
体积排阻色谱(SEC-HPLC)
也通过Water Alliance HPLC检测蛋白质的断裂和聚集，所述HPLC使用Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL柱，100mM磷酸钠、pH 7.0作为流动相，流速0.7ml/分钟。
离子交换色谱(CEX-HPLC)
用Waters 600s HPLC系统检测降解相关的荷电变化，所述HPLC系统使用Dionex Propac WCX-10柱，以50mM HEPE，pH 7.3作为流动相A和含有500mM NaCl的50mM HEPE，pH 7.3作为流动相B，流速0.5℃/分钟进行。
结果与讨论
构象稳定性研究
CHIR-12.12的热去折叠表明至少有两次热转换，可能分别代表Fab和Fc结构域的去折叠解链。在较高温度下，该蛋白质可能凝聚导致DSC信号丧失。出于制剂筛选目的，本项研究中将最低的热转换温度定义为解链温度，Tm。图8显示了作为制剂pH函数的热解链温度。较高的热解链温度表明pH 5.5-6.5的该制剂使得抗-CD40具有较高的构象稳定性。
SDS-PAGE分析
pH 4.5-9.0的CHIR-12.12制剂样品于40℃孵育2个月，以SDS-PAGE分析(数据未显示)。在非还原条件下，在pH大于5.5的制剂中观察到分子量(MW)为23kDa和27kDa的(抗体)种类，在所有制剂中均观察到MW为51kDa的(抗体)种类，但在pH5.0-5.5的制剂中明显减少。pH 7.5和pH 9.0的制剂中可见MW为100kDa的(抗体)种类。
在还原条件下，CHIR-12.12还原为MW分别为50kDa和24kDa的游离重链和轻链。100kDa的(抗体)种类似乎不能完全被还原并随着溶液pH的增加而增多，提示在这些分子中可能发生非二硫共价键结合。由于SDS-PAGE上存在身份未知的其它分子，各制剂的稳定性比较根据CHIR-12.12的剩余纯度。pH 5.0-6.0的制剂为CHIR-12.12提供了更稳定的环境。SDS-PAGE几乎没检测到凝聚(数据未显示)。
SEC-HPLC分析
SEC-HPLC分析检测到作为主峰(抗体)种类的完整CHIR-12.12，与该主峰分离开的前峰抗体是凝聚的(抗体)种类，大片段(抗体)种类位于主峰后部的肩峰，小片段(抗体)种类在主峰后检测到。5℃和25℃温育3个月后，在上述制剂中检测到其量可忽略不计的蛋白质片段和凝聚物(＜1.0％)，CHIR-12.12主峰抗体纯度保持在99％以上(数据未显示)。然而，储存于40℃时，蛋白质片段逐步增加，如表10所示，更多的片段在pH 4.5和pH 6.5-9.0时形成。CHIR-12.12制剂于40℃温育3个月后，在pH 7.5和pH 9.0的制剂中检测到约2-3％的凝聚物，而在其它pH的制剂中检测到不到1％的凝聚物(数据未显示)。SEC-HPLC结果表明CHIR-12.12在约pH 5.0-6.0时更稳定。
表10.CHIR-12.12稳定性样品在实时和加速储存条件下的SEC-HPLC结果
  样品                     主峰％                      片段％
  t＝0   40℃1m   40℃2m   40℃3m   t＝0   40℃1m   40℃3m   40℃3m
  对照   99.4   99.2   99.9   99.5   ＜1.0   ＜1.0   ＜1.0   ＜1.0
  pH 4.5   99.4   93.2   86.0   81.3   ＜1.0   6.4   13.2   18.1
  pH 5.0   99.8   98.7   91.3   89.2   ＜1.0   ＜1.0   7.8   10.2
  pH 5.5   99.8   98.9   91.4   90.6   ＜1.0   ＜1.0   7.6   8.8
  pH 6.0   99.6   97.7   90.4   87.3   ＜1.0   1.9   8.2   11.7
  pH 6.5   99.3   93.4   89.0   86.9   ＜1.0   5.6   9.9   12.4
  pH 7.0   99.2   93.9   87.4   85.1   ＜1.0   5.5   11.1   13.5
  pH 7.5   99.1   92.8   84.4   81.9   ＜1.0   6.4   12.9   16.2
  pH 9.0   99.3   82.4   61.6   50.6   ＜1.0   15.4   36.2   47.6
CEX-HPLC分析
CEX-HPLC分析检测到作为主峰(抗体)种类的完整的CHR-12.12，酸性变体早于主峰(抗体)种类洗脱，C-末端添加了赖氨酸的变体在主峰(抗体)种类之后洗脱。表11显示剩余的主峰CHIR-12.12(抗体)种类和酸性变体的百分比取决于溶液的pH。可能由于早期发酵和纯化方法所致，对照样品已经含有高比例的酸性(抗体)种类(约33％)。CHIR-12.12对pH较高的溶液敏感有两个事实证明。首先，pH 9.0的最初制剂样品(t＝0)已经比对照多产生了12％的酸性(抗体)种类。其次，随着pH上升酸性(抗体)种类的百分比急剧增加。可能由于脱氨基作用导致荷电变化相关的降解。上述数据表明CHIR-12.12的该类型的降解在约pH 5.0-5.5处最少。
表11.在实时和加速储存条件下不同pH制剂中CHIR-12.12的CEX-HPLC峰面积百分比
  样品                       主峰％                     酸性变体％
  t＝0   5℃3m   25℃3m   40℃1m   40℃2m   t＝0   5℃3m   25℃3m   40℃1m   40℃2m
  对照   49.2   49.8   49.8   49.2   50.3   32.0   33.7   33.7   32.0   33.6
  pH 4.5   48.5   49.7   43.7   39.7   30.0   32.5   32.6   38.0   44.2   56.4
  pH 5.0   49.6   49.8   48.3   40.6   31.4   32.7   31.8   35.0   44.3   57.1
  pH 5.5   50.7   50.3   48.1   40.0   30.2   32.6   31.8   37.8   48.9   63.3
  pH 6.0   50.2   49.9   47.9   37.4   23.9   33.1   33.6   38.5   54.9   72.7
  pH 6.5   49.4   49.9   42.3   29.7   14.6   33.3   33.6   47.7   65.2   84.6
  pH 7.0   49.7   49.9   21.9   -   -   34.4   36.4   64.4   -   -
  pH 7.5   49.3   48.3   12.7   -   -   35.3   40.1   79.2   -   -
  pH 9.0   41.3   31.8   -   -   -   44.7   59.9   -   -   -
结论
pH对CHIR-12.12的构象和理化稳定性有显著影响。荷电变化相关的降解确定为CHIR-12.12的主要降解途径，该降解在pH 5.0-5.5时最少。根据总的稳定性数据，一种含有该抗体的推荐的液体药物制剂是用约10mM琥珀酸钠、约150mM氯化钠配制的pH约5.5、含有约20mg/ml的CHIR-12.12的制剂。
实施例8：用CHIR-5.9和CHIR-12.12做的临床研究
临床目标
总目标是通过用抗-CD40IgG1靶向CLL癌细胞来提供对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的有效疗法。虽然可在I期获得对活性的一些衡量，但这些疾病的信号转导在II期测定。该药物首先作为单一药物进行研究，但在随后的过程中联用了其它药物、化疗和放疗。
I期
·在患慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的对象中评价安全性和药代动力学-剂量递增。
·根据安全性、耐受性和CD40的血清标记变化选择剂量。一般寻找MTD，但其它效力指标(CD40+CLL细胞的消除等)也足够确定剂量。
·考虑一种以上的剂量，其中一些在II期中可能需要。
·患者每周给药并进行实时药代动力学(Pk)取样。最初的4周周期进行最大给药。Pk依据所研究的疾病、CD40密度等可能有很大不同。
·该试验对CLL患者公开。
·根据安全性、剂量和抗肿瘤活性的初步证据决定终止还是继续研究。
·在II期测定应答速率所确定的药物活性。
·鉴定II期的剂量。
II期
在CLL患者中进行几项试验。在随机化的II期方法中可能测试多种剂量或多种给药时间方案。
·靶向不符合当前护理标准的CLL(患者)群(化疗失败)
√根据II期治疗概念的证据决定终止还是继续研究
√决定替代标记是否可用作临床效力的早期指标
√鉴定III期的剂量
III期
III期取决于II期中在何处检测到信号与何种竞争性疗法可认为是标准的。如果信号是在无治疗标准的疾病阶段，则单臂(single arm)、良好控制的研究可用作关键性试验。如果存在认为是标准的竞争性药物，则可进行一对一(head-to-head)的研究。
本文所述发明所属领域的技术人员可从本文的描述和相关附图中获益进而可对本发明作出许多改进和其它实施方案。因此，应理解本发明不受限于以上公开的具体实施方案，所述改进和其它实施方案均包括在附加权利要求的范围内和本文所公开的实施方案内。虽然本文使用了特定的术语，但它们仅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
说明书中述及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域技术人员的水平。如同每篇单独的出版物或专利申请特定且独立地用作参考一样，所有出版物和专利申请纳入本文作为参考。
                                     序列表
                                     序列表
<110>L.奥克曼(Aukerman，Lea)
     L.隆(Long，Li)
     M.卢克曼(Luqman，Mohammad)
     A.亚巴娜发(Yabannavar，Asha)
     I.扎罗(Zaror，Isabel)
<120>拮抗性抗-CD40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的应用
<130>PP22708.002(284267)
<150>60/611,794
<151>2004-09-21
<150>60/565,710
<151>2004-04-27
<150>60/525,579
<151>2003-11-26
<150>60/517,337
<151>2003-11-04
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR12.12人抗-CD40抗体的轻链的编码序列
<221>CDS
<222>(1)...(720)
<400>1
atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct  48
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
 1               5                   10                  15
gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc    96
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
             20                  25                  30
gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
         35                  40                  45
ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag    192
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
     50                  55                  60
cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
 65                  70                  75                  80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa    384
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg    432
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys  *
225                 230                 235
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体的轻链
<400>2
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>3
<211>2016
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体的重链的编码序列(包括内含子)
<400>3
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgagg aaagtaatag ataccatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagatcac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggggt 360
atagcagcac ctgggcctga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 420
agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720
ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 780
tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 840
gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 900
tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 960
tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020
ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1080
aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140
gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1200
agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1260
cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320
acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380
aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1440
caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1500
tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1560
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1620
cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1680
tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1740
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1800
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1860
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                           2016
<210>4
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体的重链
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>5
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体的变体的重链
<400>5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>6
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-5.9人抗-CD40抗体的轻链
<400>6
Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>7
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-5.9人抗-CD40抗体的重链
<400>7
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
 1               5                  10                  15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            340                 345                 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        435                 440                 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>8
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CHIR-5.9人抗-CD40抗体的变体的重链
<400>8
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
 1               5                  10                  15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            340                 345                 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        435                 440                 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>9
<211>612
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(612)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40的短同种型的编码序列
<400>9
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc    48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                   10                  15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta    96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg    144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa    192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac    240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
 65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc    288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg    336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc    384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag    432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa    480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt    528
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt    576
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa                    612
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln  *
        195                 200
<210>10
<211>203
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln
        195                 200
<210>11
<211>834
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(834)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40的长同种型的编码序列
<400>11
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc    48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                   10                  15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta    96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg    144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa    192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac    240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
 65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc    288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg    336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc    384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag    432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa    480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag    528
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg    576
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc    624
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat    672
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac    720
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat    768
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca    816
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
gtg cag gag aga cag tga                                            834
Val Gln Glu Arg Gln  *
        275
<210>12
<211>277
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
        275

Claims (22)

1.一种治疗人对象的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的能特异性结合表达于人CD40表达细胞表面上的人CD40抗原的人抗-CD40单克隆抗体，所述单克隆抗体无明显的激动活性，藉此，当所述单克隆抗体结合在所述细胞表面表达的CD40抗原时，抑制所述细胞的生长或分化，所述人抗-CD40单克隆抗体选自：
a)单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体；
c)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：6所示序列、SEQ ID NO：7所示序列、SEQ ID NO：8所示序列、同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示序列，和同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示序列；
d)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列，和同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
e)具有由含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列，和同时含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列；
f)与能结合杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体的表位相结合的单克隆抗体；
g)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位相结合的单克隆抗体；
h)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-89的表位相结合的单克隆抗体；
i)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
j)前项a)所述的单克隆抗体或前项c)-i)中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体是重组产生的；和
k)为前项a)-j)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体以至少约10-6M-10-12M的亲和力(KD)与所述人CD40抗原结合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
4.一种治疗人对象的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，包括给予所述对象有效量的特异性结合人CD40抗原结构域2的拮抗性抗-CD40单克隆抗体，其中所述抗体当与人CD40抗原结构域2结合时无明显的激动活性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体是人抗体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体是重组产生的。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体具有选自以下的抗体的结合特异性：杂交瘤细胞系5.9产生的抗体和杂交瘤细胞系12.12产生的抗体。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体选自专利保藏号为PTA-5542的ATCC保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体和专利保藏号为PTA-5543的ATCC保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体具有单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9的结合特异性。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位结合。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体选自：
a)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列和同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列：
b)具有由含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列和同时含有SEQID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列；
c)与能结合杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体的表位相结合的单克隆抗体；
d)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位相结合的单克隆抗体；
e)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
f)前项a)-e)中任一项所述单克隆抗体，其中所述抗体是重组产生的；和
g)为CHIR-12.12单克隆抗体的抗原结合片段或前项a)-f)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力。
12.一种抑制表达CD40抗原的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的能特异性结合所述CD40抗原的人抗-CD40单克隆抗体接触，所述单克隆抗体当结合CD40抗原时无明显的激动活性，所述抗体选自：
a)单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体；
c)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：6所示序列、SEQ ID NO：7所示序列、SEQ ID NO：8所示序列、同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示序列和同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示序列；
d)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列和同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
e)具有由含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列和同时含有SEQID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列；
f)与能结合杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体的表位相结合的单克隆抗体；
g)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位相结合的单克隆抗体；
h)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-89的表位相结合的单克隆抗体；
i)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
j)前项a)所述的单克隆抗体或前项c)-i)中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体是重组产生的；和
k)为前项a)-j)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体以至少约10-6M-10-12M的亲和力(KD)与所述人CD40抗原结合。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述片段选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
15.一种抑制表达CD40抗原的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的特异性结合人CD40抗原的结构域2的拮抗性抗-CD40单克隆抗体接触，其中所述抗体当与人CD40抗原的结构域2结合时无明显的激动活性。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体是人抗体。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体重组产生的。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体具有选自以下的抗体的结合特异性：杂交瘤细胞系5.9产生的抗体和杂交瘤细胞系12.12产生的抗体。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体选自专利保藏号为PTA-5542的ATCC保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体和专利保藏号为PTA-5543的ATCC保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体具有单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9的结合特异性。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体与含有SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位结合。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体选自：
a)含有选自以下的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列和同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
b)具有由含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列和同时含有SEQID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列；
c)与能结合杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体的表位相结合的单克隆抗体；
d)与含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示人CD40序列的残基82-87的表位相结合的单克隆抗体；
e)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
f)前项a)-e)中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体是重组产生的；和
g)为CHIR-12.12单克隆抗体的抗原结合片段或前项a)-f)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力。
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