PT1682177E

PT1682177E - Utilização de anticorpos antagonistas anti-cd40 para o tratamento da leucemia linfocítica crónica

Info

Publication number: PT1682177E
Application number: PT04810417T
Authority: PT
Inventors: Li Long; Mohammad Luqman; Asha Yabannavar; Sharon Lea Aukerman
Original assignee: Xoma Technology Lt; Novartis Vaccines & Diagnostics Inc
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2010-11-29
Also published as: IL175393A0; CN1929862A; JP2007510664A; CN1929862B; HK1095269A1; KR20070028295A; DE602004028270D1; PL1682177T3; WO2005044304A3; CY1110836T1; CA2544364A1; ATE474598T1; AU2004287480A1; EP2243491A1; WO2005044304A2; EP1682177A2; JP2011116760A; DK1682177T3; US20070110754A1; JP4765037B2

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE "UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTAGONISTAS ANTI-CD40 PARA 0 TRATAMENTO DA LEUCEMIA LINFOCITICA CRÓNICA"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção relaciona-se com métodos para o tratamento da leucemia linfocitica crónica usando anticorpos monoclonais antagonistas anti-CD40.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A leucemia linfocitica crónica (LLC) é uma neoplasia das células B caracterizada pela proliferação de células neoplásicas e sua acumulação na medula óssea, sangue, nódulos linfáticos e baço. A LLC constitui o tipo mais comum de leucemia em adultos no hemisfério ocidental. A incidência de LLC aumenta na população em envelhecimento, correspondendo a média de idade à altura do diagnóstico a cerca de 65 anos. Os actuais protolos de tratamento incluem agentes quimioterápicos tais como a fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), clorambucil, vincristina, pentostatina, ciclofosfamida, alemtuzumab (Campath-lH), doxorubicina e prednisona. A fludarabina é o agente quimioterápico mais eficaz, com taxas de resposta de 17 a 74%, mas a LLC torna-se frequentemente resistente a cursos repetidos do fármaco (Rozman e Montserrat (1995) NEJM 2133:1052) . A sobrevivência média dos pacientes de LLC é de nove anos, se bem que alguns pacientes com mutações dos genes de imunoglobulinas possuam um prognóstico mais favorável. Ver, por exemplo, Rozman e Montserrat (1995) NEJM 2133:1052) e 1

Keating et al. (2003) Hematol. 2003:153. Nos casos em que a LLC evolui para um linfoma de grandes células, a sobrevivência média reduz-se para menos de um ano; de modo similar, os casos de leucemia prolinfocítica possuem um prognóstico mais pobre do que a LLC clássica (Rozman e Montserrat (1995) NEJM 2133:1052). Até ao presente, não se obtiveram evidências da existência de uma cura. O antigénio CD40 é um antigénio da superfície celular com 55 kDa que se encontra presente à superfície das células B normais e neoplásicas, das células dendríticas, de outras células apresentadoras de antigénio (APCs), das células endoteliais, dos monócitos e das células epiteliais. A ligação do ligando de CD40 ao antigénio CD40 a nível da membrana das células B proporciona um sinal coestimulatório positivo que estimula a activação e proliferação das células B, resultando na maturação da célula B até um plasmócito que segrega níveis elevados de imunoglobulina solúvel. As células transformadas de pacientes com linfomas de células B de alto grau e de baixo grau, leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloblástica e doença de Hodgkin expressam CD40. As células B malignas provenientes de diversos tumores da linhagem celular B expressam CD40 em elevado grau e parecem depender da sinalização por CD40 para a sua sobrevivência e proliferação. Este achado converte o antigénio CD40 num alvo potencial para a terapêutica antineoplásica.

Dado o mau prognóstico que é atribuído aos pacientes com leucemia linfocítica crónica, torna-se necessário o desenvolvimento de protocolos terapêuticos alternativos.

As patentes WO 01/83755, WO 02/28480 e WO 02/28904 descrevem anticorpos com a capacidade de se ligar ao CD40, métodos para a produção desses anticorpos e métodos para o seu uso. 2

Ellmark et al. (Immunology 2002, 106, 456-463) refere a modulação da interacção CD40-ligando de CD40 usando fragmentos de anticorpos de cadeia única anti-CD40 humano.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO A invenção fornece um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que é capaz de se ligar especificamente a um antigénio de CD40 humano expresso à superfície de uma célula que expressa o CD40 humano, sendo o referido anticorpo monoclonal isento de actividade agonista significativa, e verificando-se que, quando o referido anticorpo monoclonal se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da referida célula, o crescimento ou diferenciação da referida célula é inibido, para uso num método de tratamento da leucemia linfocítica crónica (LLC) num indivíduo humano, sendo o método caracterizado por compreender a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal anti-CD40 humano, sendo o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; c) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e 3 d) Um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. A invenção fornece ainda o uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula que expressa o CD40 humano, estando o dito anticorpo monoclonal substancialmente isento de actividade agonista significativa, no fabrico de um leucemia linfocítíca crónica (LLC) e sendo que, quando o dito anticorpo monoclonal se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula, o crescimento ou a diferenciação da dita célula são inibidos, sendo o dito anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; 4 c) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os residuos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e d) Um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. A invenção fornece ainda um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40, estando o dito anticorpo monoclonal substancialmente isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40, para uso num método para inibir o crescimento de células de leucemia linfocitica crónica (LLC) que expressam o antigénio CD40, compreendendo o referido método o contacto das referidas células com uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal anti-CD40, sendo o dito anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os residuos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; 5 c) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e d) Um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. A invenção proporciona igualmente o uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo específico a um antigénio CD40, no fabrico de um medicamento para inibir o crescimento de células de leucemia linfocítica crónica (LLC) que expressam o antigénio CD40, estando o dito anticorpo monoclonal isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40, sendo o dito anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; c) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e 6 d) Um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. A invenção proporciona também um método in vitro para inibir o crescimento de células de leucemia linfocítica crónica (LLC) que expressam o antigénio CD40, o referido método compreendendo a colocação em contacto da ditas células com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40, estando o dito anticorpo monoclonal substancialmente isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40, sendo o dito anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito

Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; c) Um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e d) Um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito 7

Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.

Outros aspectos da invenção são apresentados nas Reivindicações anexas.

BREVE RESUMO DA EXPOSIÇÃO São apresentados métodos para o tratamento de um indivíduo humano que sofre de leucemia linfocítica crónica (LLC), compreendendo a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se mostre isento de uma actividade agonista significativa quando ligado a um antigénio CD40 numa célula humana que expressa CD40. São também expostos métodos para inibir o crescimento de células de LLC que expressam o antigénio CD40.

Os anticorpos antagonista anti-CD40 adequados para uso na presente invenção possuem uma elevada afinidade para o CD40 e são caracterizados por uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de pelo menos 10“6 M, preferencialmente de pelo menos cerca de 10“7 M até cerca de 10“8 M e mais preferencialmente de pelo menos cerca de IO"8 M até cerca de 10"12 M. Estes anticorpos monoclonais e seus fragmentos de ligação ao antigénio têm a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana. Estes anticorpos e seus fragmentos estão isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando ligados ao antigénio CD40 em células humanas. Em uma das formas de realização, o anticorpo anti-CD40 ou seu fragmento exibe actividade

antagonista quando ligado ao antigénio CD40 em células B humanas normais. Em outra das formas de realização, o anticorpo anti-CD40 ou seu fragmento exibe actividade 8 antagonista quando ligado ao antigénio CD40 em células B humanas malignas. Os anticorpos monoclonais adequados possuem regiões constantes humanas; preferencialmente, possuem também regiões de "framework" totalmente ou parcialmente humanizadas; e mais preferencialmente são anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, inteiramente humanos. Entre os exemplos de tais anticorpos monoclonais encontram-se os anticorpos aqui designados como CHIR-5.9 e CHIR-12.12, que podem ser produzidos por via recombinante; os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12); um anticorpo monoclonal caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 6, a sequência apresentada em SEQ ID NO:7, a sequência apresentada em SEQ ID NO:8, ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 6 e em SEQ ID NO:7, e ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO:6 e em SEQ ID NO:8; um anticorpo monoclonal caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID N0:2, a sequência apresentada em SEQ ID NO:4, a sequência apresentada em SEQ ID NO:5, ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO:2 e em SEQ ID NO: 4, e ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO:2 e em SEQ ID NO:5; um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO:l, a sequência apresentada em SEQ ID NO:3, e ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO:l e em SEQ ID NO:3; e fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos monoclonais que retêm a capacidade de se ligar 9 especificamente ao CD40 humano, e que são isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando se ligam ao antigénio CD40 nas células humanas. Os exemplos de tais anticorpos monoclonais incluem igualmente um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma 5.9 ou 12.12; um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo caracterizado pelo facto de compreender os resíduos 82-87 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO: 12; um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 num ensaio de ligação competitiva; e um anticorpo monoclonal que constitui um fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 ou de qualquer dos anticorpos monoclonais aqui referidos, sendo que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano.

Numa das formas de realização aqui expostas, os métodos de tratamento são caracterizados pelo facto de compreender a administração a um paciente de uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados ou seus fragmentos de ligação ao antigénio. Uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 ou seu fragmento encontra-se no intervalo de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou de cerca de 7 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. É de reconhecer que o método de tratamento pode compreender uma só administração de uma dose terapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações 10 de uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui identificados como sendo adequados para uso na invenção podem ser modificados. As modificações destes anticorpos antagonistas anti-CD40 incluem, de modo não limitativo, anticorpos anti-CD40 quiméricos imunologicamente reactivos, anticorpos anti-CD40 humanizados e anticorpos anti-CD40 murinos imunologicamente reactivos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 expõe as sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas do mAc CHIR-12.12. As regiões leader (resíduos 1-20 da SEQ ID NO:2), variável (resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2), e constante (resíduos 133-239 da SEQ ID NO:2) da cadeia leve são apresentadas na Figura IA. As regiões leader (resíduos 1-19 da SEQ ID NO:4), variável (resíduos 20-139 da SEQ ID NO:4), e constante (resíduos 140-469 da SEQ ID NO:4) da cadeia pesada são apresentadas na Figura 1B. A região constante alternativa para a cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 apresentada na Figura 1B reflecte a substituição de um resíduo de alanina por um resíduo de serina na posição 153 da SEQ ID NO:4. A sequência completa para esta variante da cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 é apresentada na SEQ ID NO:5. A Figura 2 mostra a sequência codificante para a cadeia leve (Figura 2A; SEQ ID NO:l) e para a cadeia pesada (Figura 2B; SEQ ID NO:3) do mAc CHIR-12.12. A Figura 3 apresenta as sequências de aminoácidos para as cadeias leves e pesadas do mAc CHIR-5.9. As regiões leader (resíduos 1-20 da SEQ ID NO:6), variável (resíduos 21-132 da SEQ ID NO:6), e constante (resíduos 133-239 da SEQ ID NO:6) da cadeia leve são apresentadas na Figura 3A. As regiões leader (resíduos 1-19 da SEQ ID NO:7), variável (resíduos 20-144 da 11 SEQ ID N0:7), e constante (resíduos 145-474 da SEQ ID NO:7) da cadeia pesada são apresentadas na Figura 3B. A região constante alternativa para a cadeia pesada do mAc CHIR-5.9 apresentada na Figura 3B reflecte a substituição de um resíduo de alanina por um resíduo de serina na posição 158 da SEQ ID NO:7. A sequência completa para esta variante da cadeia pesada do mAc CHIR-5.9 é apresentada na SEQ ID NO: 8. A Figura 4 mostra a sequência codificante (Figura 4A; SEQ ID NO:9) para a isoforma curta do CD40 humano (sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4B; SEQ ID NO:10), e a sequência codificante (Figura 4C; SEQ ID N0:11) para a isoforma longa do CD40 humano (sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4D). A Figura 5 mostra que o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 inibe a proliferação, mediada por CD40L, das células cancerosas de pacientes com LLC (n=9) às 48h (Figura 5A) e às 72h (Figura 5B). A Figura 6 mostra que o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 não exibe um efeito estimulador sobre as células de pacientes com LLC (n=9) às 48h (Figura 6A) e às 72h (Figura 6B). A Figura 7 evidencia a maior eficiência da lise celular, mediada por ADCC, da linha celular de LLC EHEB pelo anticorpo monoclonal CHIR-12.12 versus o anticorpo monoclonal Rituxan®. A Figura 8 mostra a temperatura de fusão térmica do CHIR-12.12 em diferentes formulações de pH, medida por calorimetria diferencial de varrimento (DSC).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 termo "tumor", tal como aqui é usado, refere-se a todos os processos tumorais de crescimento e diferenciação celular, benignos ou malignos, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos ou cancerosos. 12

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem, o estado fisiológico em mamíferos que é tipicamente caracterizado por um crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, de modo não limitativo, linfoma e leucemia. "Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteinas que possuem as mesmas caracteristicas estruturais. Enquanto que os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antigénio, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos que não possuem especificidade antigénica. Os polipéptidos deste último tipo são, por exemplo, produzidos em baixos niveis pelo sistema linfóide e em niveis aumentados pelos mielomas. 0 termo "anticorpo" é usado no sentido mais lato e abrange anticorpos de estrutura completa, fragmentos de anticorpos que se podem ligar ao antigénio (p.ex., Fab', F'(Ab>2, Fv, anticorpos de cadeia única, fragmentos diméricos de anticorpos ("diacorpos")) , e péptidos recombinantes compreendendo os aqui referidos. 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui é usado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que formam a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que estejam presentes em quantidades diminutas.

Os "anticorpos nativos" e as "imunoglobulinas nativas" são geralmente glicoproteinas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e por duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação dissulfito covalente, enquanto que entre as cadeias pesadas o número de ligações dissulfito varia segundo os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia leve e 13 pesada possui ainda pontes dissulfito intra-cadeia a espaços regulares. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um dominio variável (VH) seguido por diversos dominios constantes. Cada cadeia leve possui um dominio variável (VL) numa extremidade e um dominio constante na sua outra extremidade; o dominio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro dominio constante da cadeia pesada, e o dominio variável da cadeia leve está alinhado com o dominio variável da cadeia pesada. Crê-se que certos resíduos particulares de aminoácidos formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas. 0 termo "variável" refere-se ao facto de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente quanto à sequência entre os diversos anticorpos e estão envolvidas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não se encontra distribuída de modo uniforme ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos, mas sim concentrada em três segmentos designados por regiões determinantes da complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis que existem nos domínios variáveis tanto das cadeias leves como das cadeias pesadas. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são designadas por regiões de "framework" (FR) . Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreende quatro regiões FR, as quais se encontram principalmente numa configuração em folha β, ligadas por três CDRs, as quais formam "loops" que ligam, e em alguns casos integram, a estrutura em folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas em estreita proximidade por meio das regiões FR e, juntamente com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio nos anticorpos (ver Kabat et al. (1991) NIH Publ. No. 91-3242, Vol. 1, págs. 647-669) . 14

Os domínios constantes não se encontram directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem diversas funções efectoras, tais como a ligação ao receptor de Fc (FcR), a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos, a opsonização, a iniciação da citotoxicidade dependente do complemento e a desgranulaçâo dos mastócitos. 0 termo "região hipervariável", tal como aqui é usado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante da complementaridade" ou "CDR" (i.e., os resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest (5a Ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) e/ou os resíduos de um "loop hipervariável" (i.e., os resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Clothia e Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917) . Os resíduos "de framework" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não fazem parte dos resíduos da região hipervariável.

Os "fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligação ao antigénio ou a região variável do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; fragmentos diméricos de anticorpos ("diacorpos"); anticorpos lineares (Zapata et al, (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão dos anticorpos pela 15 papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio, designados por fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento residual "Fc", cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar com facilidade. 0 tratamento com pepsina fornece um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antigénio e tem a capacidade de estabelecer duas ligações com os antigénios. "Fv" corresponde ao mínimo fragmento de anticorpo que contém um local completo de reconhecimento e ligação ao antigénio. Num elemento Fv de duas cadeias, esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente. Num elemento Fv de cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada e outro de cadeia leve podem estar covalentemente ligados por um linker peptídico flexível de modo a que as cadeias pesada e leve se possam associar numa estrutura "dimérica" análoga à de um elemento Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio à superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo a especificidade de ligação ao antigénio. No entanto, mesmo um só domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e de se ligar a um antigénio, se bem que com uma afinidade mais baixa do que a do local de ligação completo. 0 fragmento Fab contém igualmente o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos à extremidade carboxi do domínio de cadeia pesada CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de "dobradiça" do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui dada a 16 um Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes integra (m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' possuindo cisteínas de "dobradiça" entre ambos. São ainda conhecidas outras associações químicas entre fragmentos de anticorpos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem pertencer a um de dois tipos claramente distintos, designados por kappa (k) e lambda (λ) segundo as sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

As imunoglobulinas dividem-se em classes diferentes consoante a sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e algumas destas podem ainda subdividir-se em subclasses (isotipos), p.ex., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados por alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e a configuração tridimensional das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Os diferentes isotipos possuem diferentes funções efectoras. Por exemplo, os isotipos humanos IgGl e IgG3 medeiam a actividade citotóxica mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC). 0 termo "marcador", tal como aqui é usado, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado directamente ou indirectamente com o anticorpo para gerar um anticorpo "marcado". 0 marcador poderá ser detectável por si só (p.ex., marcadores radioisotópicos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, poderá catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. Os radionuclidos que podem funcionar como 17 marcadores detectáveis incluem, por exemplo, 1-131, 1-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 e Pd-109. 0 marcador poderá também corresponder a uma entidade não detectável, tal como uma toxina. 0 termo "antagonista" é usado no seu sentido mais lato e inclui qualquer molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe ou neutraliza uma actividade biológica de um alvo nativo aqui exposto, ou a transcrição ou tradução deste. A designação "veículos", tal como aqui é usada, inclui veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores que não são tóxicos para a célula ou mamífero que a estes é exposto às dosagens e concentrações utilizadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável corresponde a uma solução aquosa de pH tamponado. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (com menos de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como a polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacáridos, disacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como o EDTA; açúcares alcoólicos tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como o sódio; e/ou surfactantes não iónicos tais como Tween, polietilenoglicol (PEG) e plurónicos. A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (em conjunto) e a administração consecutiva em qualquer ordem. O termo "célula hospedeira", tal como aqui é usado, refere-se a um microorganismo ou a uma célula ou linha celular 18 eucariótica cultivada como entidade unicelular que poderá ser, ou foi, usada como receptor para um vector recombinante ou para outros polinucleótidos de transferência, e inclui a descendência da célula original que foi transfectada. Deve entender-se que a descendência de uma única célula poderá não ser necessariamente idêntica por completo, em morfologia ou em DNA genómico ou total, à célula progenitora original, devido aos fenómenos de mutação natural, acidental ou deliberada.

As "células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e que realizam funções efectoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham a função efectora de citotoxicidade mediada por células e dependente do antigénio (ADCC). Os exemplos de leucócitos humanos que funcionam como mediadores na ADCC incluem as células mononucleadas do sangue periférico (CMSP), células natural killer (NK), monócitos, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos, sendo preferidas as CMSPs e as células NK. Os anticorpos com actividade ADCC são tipicamente dos isotipos igGl ou IgG3. De notar que, para além de isolar anticorpos IgGl e IgG3, poderão produzir-se anticorpos mediadores da ADCC construindo-os a partir de uma região variável de um anticorpo não-ADCC, ou de um fragmento da região variável, e de uma região constante do isotipo IgGl ou IgG3.

Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Ademais, um FcR preferido será aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama), estando incluídos receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII e também as variantes alélicas e as formas de splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor 19 activador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), os quais têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. 0 receptor activador FcyRIIA contém um motivo de activaçâo do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição do imunoreceptor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (ver Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). Os FcRs são expostos em Ravetch e Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capei et al. (1994)

Immunomethods 4:25-34; e de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341. Outros FcRs, incluindo os que serão identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" aqui citado. O termo inclui igualmente o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 e Kim et al. (1994) J. Immunol. 24:249 (1994)).

Existem diversas vias para fabricar anticorpos humanos. Por exemplo, as células secretoras poderão ser imortalizadas por infecção pelo vírus de Epstein-Barr (EBV). No entanto, as células infectadas pelo EBV são difíceis de clonar e geralmente produzem rendimentos relativamente baixos de imunoglobulinas (James e Bell (1987) J. Immunol. Methods 100:5-40). No futuro, a imortalização de células B humanas poderá vir a ser atingida através da introdução de uma combinação definida de genes transformantes. Esta possibilidade é evidenciada por uma demonstração recente de que a expressão da subunidade catalítica da telomerase, juntamente com a grande oncoproteína de SV40 e com um alelo oncogénico de H-ras, resultou na conversão tumorigénica de células epiteliais e de fibroblastos humanos normais (Hahn et al. (1999) Nature 400:464-468). É presentemente possível 20 produzir animais transgénicos (p.ex., ratinhos) que têm a capacidade de, após imunização, produzir diversos anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulinas (Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Lonberg e Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Fishwild et al. (1996)

Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Tomikuza et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727; revisto em Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370). Por exemplo, tem sido descrito que a delecção homozigótica do gene codificando para a região de junção J da cadeia pesada dos anticorpos (JH) em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta numa inibição completa da produção endógena de anticorpos (Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-2555). A transferência do conjunto de genes de imunoglobulinas da linha germinal humana para estes ratinhos mutantes de linha germinal resulta na produção de anticorpos humanos após estimulação com antigénio (Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258). Mendez et al. (1997) (Nature Genetics 15:146-156) criaram uma linha de ratinhos transgénicos que, quando estimulados por um antigénio, geram anticorpos inteiramente humanos de alta afinidade. Tal foi atingido por integração, na linha germinal, de locus de cadeias pesadas e de cadeias leves de uma megabase humana em ratinhos com delecção no segmento endógeno JH, tal como acima descrito. Estes ratinhos (tecnologia Xenomouse® II (Abgenix; Fremont, Califórnia)) são portadores de 1.020 kb de locus de cadeias pesadas humanas contendo aproximadamente 66 genes VH, regiões DH e JH completas, e três regiões constantes diferentes, sendo ainda portadores de 800 kb de um locus κ humano contendo 32 genes Vk, segmentos Jk e genes Ck. Os anticorpos produzidos nesses ratinhos assemelham-se de perto aos encontrados nos seres humanos em todos os aspectos, 21 incluindo o rearranjo de genes, a associação de cadeias e o repertório. Os anticorpos humanos são preferencialmente expressos como anticorpos endógenos devido à delecção do segmento endógeno que evita o rearranjo de genes no locus murino. Tais ratinhos poderão ser imunizados com um antigénio de interesse particular.

Os soros de tais animais imunizados podem ser rastreados quanto à reactividade dos anticorpos contra o antigénio inicial. Os linfócitos podem ser isolados a partir de nódulos linfáticos ou de esplenócitos e podem ainda ser seleccionadas as células B por meio da selecção de células CD138-negativas e CD19-positivas. Em um dos aspectos, tais culturas de células B (CCBs) podem ser fundidas a células de mieloma para gerar hibridomas, tal como particularizado acima.

Em outro aspecto, tais culturas de células B podem ser ainda analisadas quanto à reactividade contra o antigénio inicial, de preferência. Tal análise inclui ELISA com o alvo/proteina antigénica, um ensaio de competição com anticorpos conhecidos que se ligam ao antigénio de interesse, e a ligação in vitro a células CHO ou outras transitoriamente transfectadas que expressam o antigénio alvo. A presente invenção relaciona-se com composições e métodos para o tratamento de pacientes humanos com leucemia linfocitica crónica (LLC). Os métodos envolvem o tratamento com um anticorpo anti-CD40 aqui descrito, ou com um seu fragmento de ligação ao antigénio, sendo que a administração do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigénio promove uma resposta terapêutica positiva no paciente que é submetido a este método terapêutico. Os anticorpos anti-CD40 adequados para uso com os métodos da invenção ligam-se especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana e são isentos de actividade agonista significativa, mas exibem actividade antagonista quando ligados ao antigénio CD40 22 numa célula humana, tal como demonstrado em células B normais e neoplásicas que expressam CD40. Estes anticorpos anti-CD40 e seus fragmentos de ligação ao antigénio são referidos aqui como "anticorpos antagonistas anti-CD40". Tais anticorpos incluem, de modo não limitativo, os anticorpos monoclonais inteiramente humanos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 abaixo descritos e os anticorpos monoclonais que possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12, também descritos abaixo. Estes anticorpos monoclonais, que podem ser produzidos por via recombinante, são abaixo descritos.

Os anticorpos que possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 incluem os anticorpos que interferem competitivamente com a ligação ao CD40 e/ou que se ligam aos mesmos epitopos a que se ligam CHIR-5.9 e CHIR-12.12. Um perito na técnica poderá determinar, recorrendo a métodos padronizados, se um dado anticorpo interfere competitivamente com CHIR-5.9 ou CHIR-12.12.

Quando estes anticorpos se ligam ao CD40 exposto à superfície de células humanas, tais como células B humanas, os anticorpos são isentos de actividade agonista significativa; em algumas formas de realização, a sua ligação ao CD40 exposto à superfície das células humanas resulta na inibição da proliferação e diferenciação dessas células humanas. Assim, os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos da invenção incluem os anticorpos monoclonais que têm a capacidade de exibir actividade antagonista face a células humanas normais e malignas que expressam o antigénio de superfície celular CD40.

Anticorpos Antagonistas Anti-CD40

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 representam anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para 23 uso na presente invenção. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 são anticorpos monoclonais inteiramente humanos anti-CD40 do isotipo IgGi produzidos pelas linhas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12). Estas linhas celulares foram criadas usando esplenócitos de ratinhos xenotipicos imunizados contendo o locus da cadeia pesada de IgGi humana e o locus da cadeia κ humana (tecnologia Xenomouse®; Abgenix; Fremont, Califórnia). Os esplenócitos foram fundidos com as células SP2/0 de mieloma de ratinho (Sierra BioSource). Os hibridomas resultantes foram sub-clonados por diversas vezes para criar as linhas celulares monoclonais estáveis 5.9 e 12.12. Os outros anticorpos da invenção podem ser preparados de modo similar usando ratinhos transgénicos para os locus de imunoglobulinas humanas ou por outros métodos conhecidos da técnica e/ou aqui descritos.

As sequências de aminoácidos das regiões leader, variável e constante da cadeia leve e da cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 são expostas nas Figuras IA e 1B, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID NO:2 (sequência completa da cadeia leve do mAc CHIR-12.12), SEQ ID NO: 4 (sequência completa da cadeia pesada do mAc CHIR-12.12), e SEQ ID NO:5 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 apresentada na SEQ ID NO: 4, sendo que a variante compreende uma substituição, por serina, do residuo de alanina na posição 153 da SEQ ID N0:4). As sequências nucleotidicas codificando para a cadeia leve e para a cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 são expostas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID N0:1 (sequência codificante para a cadeia leve do mAc CHIR-12.12) e a SEQ ID NO:3 (sequência codificante para a cadeia pesada do mAc CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos das regiões leader, variável e constante da cadeia leve e da cadeia pesada do mAc CHIR-5.9 são expostas nas Figuras 3A e 24 3Β, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID NO: 6 (sequência completa da cadeia leve do mAc CHIR-5.9), SEQ ID NO:7 (sequência completa da cadeia pesada do mAc CHIR-5.9), e SEQ ID NO:8 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada do mAc CHIR-5.9 apresentada na SEQ ID NO: 7, sendo que a variante compreende uma substituição, por serina, do resíduo de alanina na posição 158 da SEQ ID N0:7). Adicionalmente, os hibridomas que expressam anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 foram depositados na ATCC com as designações de depósito patenteado PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Para além da actividade antagonista, é preferível que os anticorpos anti-CD40 desta invenção possuam outro mecanismo de acção contra uma célula tumoral. Por exemplo, os anticorpos nativos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 possuem actividade ADCC. Alternativamente, as regiões variáveis dos anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 poderão ser expressas em outro isotipo de anticorpo que possua actividade ADCC. É igualmente possível conjugar formas nativas, formas recombinantes ou fragmentos de ligação ao antigénio de CHIR-5.9 ou de CHIR-12.12 com uma citotoxina, um agente terapêutico ou com um ião metálico radioactivo ou radioisótopo, tal como exposto mais adiante.

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam-se ao CD40 solúvel em ensaios de tipo ELISA, evitam a ligação do ligando de CD40 ao CD40 da superfície celular e deslocam o ligando de CD40 pré-ligado, tal como determinado por ensaios de citometria de fluxo. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 competem um com o outro para a ligação ao CD40 mas não com o 15B8, o anticorpo monoclonal anti-CD40 descrito na patente WO 02/28904. Quando testados in vitro relativamente aos efeitos sobre a proliferação de células B de indivíduos humanos normais, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 agem como anticorpos antagonistas anti-CD40. Adicionalmente, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 não induzem uma forte proliferação dos linfócitos humanos dos 25 indivíduos normais. Estes anticorpos têm a capacidade de destruir as células-alvo que expressam CD40 por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). A afinidade de ligação de CHIR-5.9 para o CD40 humano é de 1,2 x IO”8 M e afinidade de ligação de CHIR-12.12 é de 5 x IO”10 M, tal como determinado pelo ensaio Biacore™.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos da presente invenção exibem uma forte afinidade de ligação a local único para o antigénio da superfície celular CD40. Os anticorpos monoclonais da invenção exibem uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) para o CD40 de pelo menos IO”5 M, pelo menos 3 x 10”5 M, preferencialmente pelo menos 10”6 M a 10”7 M, mais preferencialmente pelo menos 10”8 a 10”12 M, tal como medido usando um ensaio padronizado como o Biacore™. A análise Biacore é bem conhecida neste campo técnico e os seus detalhes são expostos no "BIAapplications Handbook". Os métodos descritos na WO 01/27160 podem ser usados para modular a afinidade de ligação.

Por "antigénio CD40", "antigénio de superfície celular CD40", "receptor CD40" ou "CD40" pretende-se designar uma glicoproteína transmembranar que pertence à família de receptores do factor de necrose tumoral (TNF) (ver, por exemplo, as patentes dos EUA nos. 5.674.492 e 4.708.871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2a Ed.; Academic Press, San Diego)) . Foram já identificadas duas isoformas do CD40 humano, codificadas por variantes de transcrição por splicing alternativo deste gene. A primeira isoforma (também conhecida por "a isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressa sob a forma de um polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEQ ID NO:12 (reportada pela primeira vez com o N° de Acesso Genbank CAA43045, e identificada como isoforma 1 com o N° de Acesso Genbank 26 ΝΡ_001241) , codificado pela SEQ ID N0:11 (ver os Nos. de Acesso Genbank X60592 e NM_001250) ), a qual tem uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. A sequnda isoforma (também conhecida por "isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa sob a forma de um polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEQ ID NO:10 (N° de Acesso Genbank NP_690593), codificado pela SEQ ID NO:9 (N° de Acesso Genbank NM_152854)), que possui igualmente uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. Os polipéptidos precursores destas duas isoformas do CD40 humano têm em comum os seus primeiros 165 resíduos (i.e., resíduos 1-165 da SEQ ID NO:10 e da SEQ ID NO:12). O polipéptido precursor da isoforma curta (mostrada na SEQ ID NO: 10) é codificado por uma variante de transcrição (SEQ ID NO:9) ao qual falta um segmento codificante, o que conduz a uma alteração do molde de leitura (frameshifting); a isoforma de CD40 resultante contém uma forma diferente, mais curta, da extremidade C (resíduos 166-203 da SEQ ID NO:10) relativamente à contida na isoforma longa da CD40 (extremidade C mostrada nos resíduos 166-277 da SEQ ID NO: 12) . Para os fins da presente invenção, os termos "antigénio CD40", "antigénio de superfície celular CD40", "receptor CD40" ou "CD40" abrangem ambas as formas, curta e longa, do CD40. Os anticorpos anti-CD40 da presente invenção ligam-se a um epitopo do CD40 humano que reside no mesmo local tanto na isoforma curta como na isoforma longa deste antigénio de superfície celular, tal como abaixo se faz notar. O antigénio CD40 é apresentado à superfície de uma variedade de tipos celulares, tal como se descreve em outro local desta exposição. Por "apresentado à superfície" e "expresso à superfície" pretende-se significar que o todo ou parte do antigénio CD40 se encontra exposto no exterior da célula. O antigénio CD40 apresentado ou expresso poderá estar parcialmente ou inteiramente glicosilado. 27

Por "actividade agonista" pretende-se indicar que a substância funciona como um agonista. Um agonista combina-se com um receptor numa célula e inicia uma reacção ou actividade que é similar ou idêntica à iniciada pelo ligando natural do receptor. Por exemplo, um agonista do CD4 0 induz qualquer uma, ou todas, das respostas que se seguem, indicadas de modo não limitativo: proliferação e diferenciação de células B, produção de anticorpos, adesão intercelular, geração de células B de memória, mudança de isotipo, regulação positiva da expressão à superfície celular de moléculas de Classe II do MHC e de CD80/86, e secreção de citocinas pró-inflamatórias tais como IL-8, IL-12 e TNF. Por "actividade antagonista" pretende-se indicar que a substância funciona como um antagonista. Por exemplo, um antagonista do CD40 evita ou reduz a indução de qualquer das respostas induzidas pela ligação do receptor CD40 a um ligando agonista, particularmente o CD40L. 0 antagonista pode reduzir a indução de qualquer uma ou de mais do que uma das respostas à ligação de um agonista em 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferencialmente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, mais preferencialmente 70%, 80%, 85%, e ainda mais preferencialmente 90%, 95%, 99% ou 100%. Os métodos para a medição da especificidade de ligação do anticorpo anti-CD40 e do ligando de CD40 e da actividade antagonista são conhecidos dos peritos na técnica e incluem, de forma não limitativa, ensaios de ligação competitiva padronizados, ensaios para a monitorização da secreção de imunoglobulinas pelas células B, ensaios de proliferação de células B, ensaios de proliferação de células B de tipo Banchereau, ensaios de células T helper para produção de anticorpos, ensaios de co-estimulação da proliferação de células B e ensaios de regulação positiva dos marcadores de activação das células B. Ver, por exemplo, os 28 ensaios apresentados em WO 00/75348 e na Patente dos EUA n° 6.087.329.

Por actividade agonista "significativa" pretende-se referir uma actividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% superior à actividade agonista que é induzida por uma substância neutra ou por um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de resposta das células B. Preferencialmente, uma actividade agonista "significativa" corresponde a uma actividade agonista que é pelo menos 2 vezes superior ou pelo menos 3 vezes superior à actividade agonista induzida por uma substância neutra ou por um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de resposta das células B. Assim, por exemplo, quando a resposta das células B pretendida é a proliferação de células B, uma actividade agonista "significativa" seria a indução de um nivel de proliferação de células B pelo menos 2 vezes superior ou pelo menos 3 vezes superior ao nível de proliferação de células B que é induzido por uma substância neutra ou um controlo negativo. Em uma das formas de realização, uma imunoglobulina não específica, por exemplo IgGl, que não se liga ao CD40 serve como controlo negativo. Uma substância "isenta de actividade agonista significativa" exibe uma actividade agonista que não supera em mais do que cerca de 25% a actividade agonista exibida por uma substância neutra ou um controlo negativo, preferencialmente não superando em mais do que cerca de 20%, em mais que 15%, em mais que 10%, em mais que 5%, em mais que 1%, em mais que 0,5%, ou até em mais do que 0,1% a actividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de resposta de células B. Os anticorpos antagonistas anti-CD40 úteis em associação aos métodos desta invenção são isentos de actividade agonista significativa, tal como acima indicado, quando ligados a um 29 antigénio CD40 numa célula humana. Em uma das formas de realização desta invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de actividade agonista significativa relativamente a uma resposta das células B. Em outra forma de realização da invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de actividade agonista significativa em ensaios de mais do que uma resposta das células B (p.ex., proliferação e diferenciação, ou proliferação, diferenciação e produção de anticorpos).

Tal como aqui é usado, o termo "anticorpo anti-CD40" abrange qualquer anticorpo que reconheça especificamente o antigénio CD40 da superfície celular das células B, incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única, e fragmentos destes tais como Fab, F(abf)2, Fv e outros fragmentos que retêm a função de ligação ao antigénio do anticorpo anti-CD40 progenitor. De particular interesse para esta invenção são os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui expostos que partilham as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 acima descritos.

Assim, além dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12, outros anticorpos que seriam úteis na prática de invenção aqui descrita incluem, de modo não limitativo, os seguintes: (1) os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12), depositadas na ATCC como Depósito Patenteado n° PTA-5542 e Depósito Patenteado n° PTA-5543, respectivamente; (2) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO:2; a sequência mostrada em SEQ ID NO:4; a sequência mostrada em SEQ ID NO:5; ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e ambas as sequências mostradas em SEQ 30 ID N0:2 e SEQ ID N0:5; (3) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO: 6, a sequência mostrada em SEQ ID NO:7, a sequência mostrada em SEQ ID NO:8, ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO:7, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID N0:6 e SEQ ID NO:8; (4) um anticorpo monoclonal possuindo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID N0:1, a sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID NO:3, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 3; (5) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que tem a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma 5.9 ou pela linha celular de hibridoma 12.12; (6) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os residuos 82-87 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:10 ou em SEQ ID N0:12; (7) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 num ensaio de ligação competitiva; e (8) um anticorpo monoclonal que consiste num fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou dos anticorpos monoclonais referidos nos pontos (1)-(7) anteriores, sendo que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano. Os peritos na técnica reconhecerão que os anticorpos antagonistas anti-CD40 e os fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos aqui descritos incluem anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antigénio que são produzidos por via recombinante utilizando métodos bem conhecidos da técnica e aqui descritos mais adiante, estando incluídos, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 produzidos por via recombinante. 31

Produção de Anticorpos Anti-CD40

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 para uso na presente invenção podem ser produzidos usando qualquer método de produção de anticorpos conhecido dos peritos na técnica. Assim, podem ser preparados soros policlonais recorrendo a métodos convencionais. Em geral, uma solução contendo o antigénio CD40 é inicialmente usada para imunizar um animal adequado, de preferência um ratinho, rato, coelho ou cabra. Os coelhos ou as cabras são preferidos para a preparação de soros policlonais devido ao volume de soro que é possível obter e à facilidade de acesso a anticorpos marcados anti-coelho e anti-cabra.

Os soros policlonais podem ser preparados num animal transgénico, preferencialmente um ratinho portador de locus de imunoglobulinas humanas. Numa forma de realização preferida, são usadas como imunogénio células Sf9 que expressam CD40. A imunização pode também ser realizada misturando ou emulsifiçando a solução que contém o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante como o adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente (em geral subcutaneamente ou intramuscularmente) . Uma dose de 50-200 yg/injecção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente reforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injecções da proteína em soro fisiológico, preferencialmente usando adjuvante incompleto de Freund. Alternativamente, podem gerar-se anticorpos por imunização in vitro usando métodos conhecidos neste campo, procedimento que, para os fins da presente invenção, é considerado como equivalente à imunização in vivo. Os soros policlonais são obtidos sangrando o animal imunizado para um contentor de plástico ou vidro, incubando o sangue a 25°C durante uma hora e, por fim, incubando-o a 4°C durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (p.ex., a 32 1000 x g durante 10 minutos). Podem obter-se cerca de 20-50 ml por colheita a partir de coelhos. A produção das células Sf9 (de Spodoptera frugiperda) é descrita na Patente dos EUA N°.6.004.552. Abreviadamente, as sequências codificando para o CD40 humano foram recombinadas num baculovirus usando vectores de transferência. Os plasmideos foram co-transfectados com DNA de baculovirus de tipo selvagem em células Sf9. As células Sf9 infectadas com baculovirus recombinante foram identificadas e purificadas por clonagem.

De preferência, o anticorpo será de natureza monoclonal. Por "anticorpo monoclonal" pretende-se designar um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que formam a população são idênticos excepto no que concerne a mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades diminutas. O termo não é limitado por factores como a espécie ou a fonte do anticorpo. O termo abrange imunoglobulinas inteiras assim como fragmentos, como Fab, F(ab')2, Fv e outros, que retêm a função de ligação ao antigénio do anticorpo. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um só local antigénico, i.e., o antigénio de superfície celular CD40 da presente invenção. Adicionalmente, em contraste com o que acontece com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um só determinante no antigénio. O termo "monoclonal" indica que o anticorpo foi obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a usar de 33 acordo com a presente invenção poderão ser produzidos por recurso ao método de hibridomas inicialmente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou utilizando métodos de DNA recombinante (ver, p.ex., a Patente dos EUA N° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J Mol. Biol. 222:581-597; e Patente dos EUA n° 5.514.548.

Por "epitopo" pretende-se indicar a parte de uma molécula antigénica contra a qual é produzido um anticorpo e à qual o anticorpo se ligará. Os epitopos poderão compreender resíduos de aminoácidos lineares (i.e., os resíduos do epitopo estão dispostos sequencialmente um após o outro num arranjo linear), resíduos de aminoácidos não lineares (aqui referidos como "epitopos não lineares"; estes epitopos não estão dispostos sequencialmente), ou ainda compreender tanto resíduos de aminoácidos lineares como resíduos não lineares. 0 termo "epitopo do antigénio CD40", tal como aqui é usado, refere-se a uma estrutura molecular tridimensional (quer linear quer conformacional) que pode exibir imunoreactividade com os anticorpos monoclonais anti-CD40 desta invenção, excluindo o próprio antigénio CD40. Os epitopos do antigénio CD40 poderão compreender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas, mas para os fins da presente invenção serão mais comumente proteínas, oligopéptidos curtos, emuladores de oligopéptidos (i.e., compostos orgânicos que emulam as propriedades de ligação ao anticorpo do antigénio CD40), ou combinações destes. Os emuladores de oligopéptidos adequados são descritos, inter alia, no pedido de patente PCT US 91/04282. 34

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496, ou uma modificação deste. Tipicamente, um ratinho é imunizado com uma solução contendo um antigénio. A imunização pode ser realizada misturando ou emulsificando a solução que contém o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente. Qualquer método de imunização conhecido da técnica poderá ser usado para obter os anticorpos monoclonais da invenção. Após a imunização do animal, o baço (e, opcionalmente, diversos gânglios linfáticos grandes) são removidos e dissociados em células isoladas. Os esplenócitos podem ser rastreados aplicando uma suspensão de células a uma placa ou poço revestido com o antigénio de interesse. As células B que expressam imunoglobulinas ligadas à membrana especificas para o antigénio ligam-se à placa e não são eliminadas pela lavagem. As células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, são então induzidas a fundir-se com as células de mieloma para formar hibridomas e são cultivadas num meio selectivo. As células resultantes são plaqueadas por diluição em série e são ensaiadas quanto à produção de anticorpos que se liguem especificamente ao antigénio de interesse (e que não se liguem a antigénios não relacionados). Os hibridomas secretores do anticorpo monoclonal (mAc) seleccionado são então cultivados in vitro (p.ex., em frascos de cultura celular ou em reactores de fibras ocas), ou in vivo (como ascites em ratinhos).

Como alternativa ao uso de hibridomas, o anticorpo poderá ser produzido numa linha celular tal como uma linha celular CHO, tal como exposto nas Patentes dos EUA nos. 5.545.403; 5.545.405 e 5.998.144. Abreviadamente, a linha celular é transfectada com vectores com a capacidade de expressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Através da 35 transfecção das duas proteínas em vectores separados, podem produzir-se anticorpos quiméricos. Outra vantagem consiste na glicosilação correcta do anticorpo.

Os anticorpos monoclonais contra o CD40 são já conhecidos neste campo técnico. Ver, por exemplo, as secções dedicadas aos antigénios de células B em McMichael, ed. (1987; 1989) Leukocyte Typing III e IV (Oxford University Press, New York); Patentes dos EUA nos. 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; WO 00/63395; Publicações Internacionais nos. WO 02/28905 e WO 02/28904; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494; Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al. (1991) J. Immunol. 146:1836; Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147:8; Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; e Banchereau et al. (1991) Science 251:70. De particular interesse para a presente invenção são os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos que partilham as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 acima descritos.

Adicionalmente, o termo "anticorpo anti-CD40", tal como aqui é usado, abrange anticorpos quiméricos anti-CD40; os anticorpos quiméricos anti-CD40 destinados a uso nos métodos da invenção possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. Por anticorpos "quiméricos" pretende-se referir anticorpos que são preferencialmente obtidos usando técnicas de DNA recombinante e que compreendem tanto componentes humanos (incluindo espécies imunologicamente "aparentadas", p.ex., chimpanzés) como componentes não humanos. Rituxan® constitui um exemplo de um anticorpo quimérico com uma região variável murina e uma região constante humana. 36

Para os fins da presente invenção, a região constante do anticorpo quimérico é, mais preferencialmente, substancialmente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anticorpo quimérico é mais preferencialmente obtida a partir de uma fonte não humana e possui a especificidade antigénica desejada face ao antigénio de superfície celular CD40. A fonte não humana poderá corresponder a qualquer fonte de vertebrado que possa ser usada para gerar anticorpos contra um antigénio humano de superfície celular CD40 ou contra material que compreenda um antigénio humano de superfície celular CD40. Tais fontes não humanas incluem, de forma não limitativa, roedores (p.ex., coelho, rato, ratinho, etc.; ver, por exemplo, a Patente dos EUA n° 4.816.567 e primatas não humanos (p.ex., macaco do Velho Mundo, outros macacos, etc.; ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.750.105 e 5.756.096). Tal como aqui é usada, a expressão "imunologicamente activo", quando usada em referência a anticorpos quiméricos anti-CD40, indica um anticorpo quimérico que se liga ao CD40 humano.

Os anticorpos anti-CD40 humanizados representam anticorpos anti-CD40 adicionais adequados para uso na invenção. Por "humanizado" pretende referir formas de anticorpos anti-CD40 que contêm uma sequência mínima derivada de sequências de imunoglobulinas não humanas. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável (também conhecida como região determinante da complementaridade ou CDR) do receptor são substituídas por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como o ratinho, rato, coelho, ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. A expressão "região determinante da complementaridade" refere-se a sequências de aminoácidos que em conjunto definem a 37 afinidade de ligação e a especificidade da região Fv natural do local de ligação de uma imunoglobulina nativa. Ver, p.ex., Clothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat et al. (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242). O termo "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere as funções efectoras. Nos desenvolvimentos anteriores dirigidos para a produção de anticorpos não imunogénicos destinados a uso na terapêutica de doenças humanas, as regiões constantes de ratinho foram substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos humanizados derivavam de imunoglobulinas humanas. No entanto, estes anticorpos humanizados ainda provocavam uma resposta imune indesejável e potencialmente perigosa em seres humanos e verificou-se uma perda de afinidade. Os anticorpos anti-CD40 humanizados para uso na presente invenção possuem características de ligação similares às exibidas pelos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. A humanização pode essencialmente ser efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo sequências CDR de roedores ou sequências CDR mutantes de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Ver igualmente as Patentes dos EUA nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Em alguns casos, os resíduos dentro das regiões de "framework" de uma ou mais regiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes (ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370). Adicionalmente, os anticorpos humanizados poderão compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas 38 para conseguir um refinamento adicional do desempenho do anticorpo (i.e., para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente o total de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, sendo que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões de "framework" correspondem às de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes consultar Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Deste modo, tais anticorpos "humanizados" poderão incluir anticorpos nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Ver também a Patente dos EUA n° 6.180.370 e Publicação Internacional N° WO 01/27160, nas quais são expostos anticorpos humanizados e técnicas para a produção de anticorpos humanizados possuindo uma afinidade melhorada para um antigénio predeterminado. São também abrangidos pelo termo "anticorpos anti-CD40" os anticorpos anti-CD40 xenogénicos ou modificados produzidos num hospedeiro mamífero não humano, mais particularmente um ratinho transgénico, caracterizado por locus inactivados de imunoglobulinas (Ig) endógenas. Nestes animais transgénicos, os genes endógenos competentes para a expressão de subunidades 39 leves e pesadas das imunoglobulinas do hospedeiro são colocados em situação de não funcionalidade e são substituídos pelos locus análogos de imunoglobulinas humanas. Estes animais transgénicos produzem anticorpos humanos na ausência substancial de subunidades leves ou pesadas das imunoglobulinas do hospedeiro. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.877.397 e 5.939.598.

De preferência, são obtidos anticorpos inteiramente humanos contra CD40 através da imunização de ratinhos transgénicos. Este tipo de ratinhos é obtido usando a tecnologia XenoMouse® (Abgenix; Fremont, Califórnia), que é exposta nas Patentes dos EUA nos. 6.075.181, 6.091.001 e 6.114.598. Para produzir os anticorpos aqui referidos, os ratinhos transgénicos para o locus de cadeia pesada de IgGi humana e para o locus de cadeia leve κ humana foram imunizados com células Sf9 que expressam CD40 humano. Os ratinhos podem ainda ser transgénicos para outros isotipos. Os anticorpos inteiramente humanos com utilidade na presente invenção são caracterizados por propriedades de ligação similares às exibidas pelos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui expostos.

Os fragmentos dos anticorpos anti-CD40 serão adequados para uso na invenção desde que retenham a desejada afinidade do anticorpo de extensão completa. Assim, um fragmento de um anticorpo anti-CD40 reterá a capacidade de se ligar ao antigénio CD40 da superfície das células B. Tais fragmentos são caracterizados por propriedades semelhantes às do anticorpo antagonista anti-CD40 de extensão completa correspondente, isto é, os fragmentos ligar-se-ão especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana e estão isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando ligados a um antigénio CD40 numa célula que expressa 40 CD40 humano. Tais fragmentos são aqui referidos como fragmentos "de ligação ao antigénio".

Os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo que são considerados como adequados compreendem uma porção de um anticorpo de extensão completa, geralmente a sua região de ligação ao antigénio ou a sua região variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, de modo não limitativo, os fragmentos Fab, F(ab')2 e Fv e as moléculas de anticorpo de cadeia única. Por "Fab" entende-se um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que é composto pela cadeia leve e por parte da cadeia pesada. Por F(ab')2 entende-se um fragmento bivalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que contém ambas as cadeias leves e parte de ambas as cadeias pesadas. Os fragmentos de anticorpos de tipo "Fv de cadeia única" ou "sFv" são fragmentos que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, sendo que estes domínios se encontram presentes numa só cadeia polipeptídica. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 e 5.856.456. Geralmente, o polipéptido Fv compreende ainda um linker polipeptídico entre os domínios Vh e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antigénio. Para uma revisão dos sFv, ver Pluckthun (1994) em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg & Moore (Springer-Verlag, New York, págs. 269-315. Os fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui expostos podem igualmente ser conjugados com uma citotoxina para efectuar a destruição das células-alvo cancerosas, tal como abaixo se descreve.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos geradas usando as técnicas descritas em, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) e Patente dos EUA n° 5.514.548. Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628, e Marks 41 et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597, descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas fágicas. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (da gama dos nM) por rearranjo de cadeias (Marks et al. (1992) Biol/Technology 10:779-783), assim como a infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas fágicas de grande extensão (Waterhouse et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:2265-2266). Assim, estas técnicas constituem alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridomas para o isolamento de anticorpos monoclonais.

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos derivavam da digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al. (1985) Science 229:81). No entanto, estes fragmentos podem agora ser directamente produzidos por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpos acima referidas. Alternativamente, podem recuperar-se fragmentos Fab'-SH directamente a partir de E. coli, os quais podem ser quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 poderão ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos tornar-se-ão evidentes para o técnico experimentado.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 com utilidade para os métodos da presente invenção incluem os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui expostos, assim como anticorpos que 42 diferem destes anticorpos mas retêm as CDRs; e anticorpos com uma ou mais adição (ões), delecção (ões) ou substituição (ões) de aminoácidos, sendo que a actividade antagonista é medida através da inibição da proliferação e/ou diferenciação das células B. A invenção abrange ainda os anticorpos antagonistas anti-CD40 desimunizados, que podem ser produzidos tal como descrito em, por exemplo, as Publicações Internacionais nos. WO 98/52976 e WO 00/34317. Deste modo, os resíduos dos anticorpos antagonistas anti-CD40 desta invenção são modificados de modo a tornar os anticorpos não imunogénicos ou menos imunogénicos para os seres humanos, mantendo no entanto a sua actividade antagonista face às células humanas que expressam CD40, sendo tal actividade medida através dos ensaios apontados em outro local desta descrição. São também abrangidas pelo âmbito destas reivindicações as proteínas de fusão que compreendem um anticorpo antagonista anti-CD40 da invenção, ou um seu fragmento, podendo estas proteínas de fusão ser sintetizadas ou expressas a partir dos vectores polinucleotídicos correspondentes, tal como é já conhecido neste campo técnico. Tais proteínas de fusão estão descritas em referência à conjugação de anticorpos, tal como se refere mais adiante.

Os anticorpos da presente invenção poderão apresentar variações de sequência que são produzidas usando métodos descritos em, por exemplo, as Publicações de Patentes nos. EP 0 983 303 AI, WO 00/34317 e WO 98/52976. Por exemplo, foi já demonstrado que as sequências contidas na CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue às moléculas de classe II do MHC e desencadeie uma resposta indesejada por parte das células T helper. Uma substituição conservativa permitirá que o anticorpo retenha a actividade de ligação mas perca a capacidade de desencadear uma resposta indesejada por parte das células T helper. Quaisquer destas substituições, 43 conservativas ou não conservativas, podem ser efectuadas usando métodos conhecidos da técnica, tais como os métodos referidos em outro local desta descrição, e os anticorpos obtidos estarão abrangidos pelo âmbito desta invenção. Os anticorpos variantes podem ser testados por métodos de rotina quanto à sua actividade antagonista, afinidade e especificidade usando os métodos aqui descritos.

Um anticorpo produzido por qualquer dos métodos acima descritos, ou por outro método que aqui não tenha sido exposto, será abrangido pelo âmbito desta descrição se possuir pelo menos uma das seguintes actividades biológicas: inibição da secreção de imunoglobulinas por células B humanas periféricas normais estimuladas por células T; inibição da proliferação das células B humanas periféricas normais estimuladas por células T Jurkat; inibição da proliferação das células B humanas periféricas normais estimuladas por células que expressam o CD40L ou o CD40 solúvel; e inibição da proliferação de células B malignas humanas tal como abaixo se refere. Ver igualmente os ensaios descritos em Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; e as Patentes dos EUA nos. 5.674.492 e 5.847.082.

Um ensaio representativo para a detecção de anticorpos antagonistas anti-CD40 específicos para os epitopos do antigénio CD40 aqui identificados é designado por "ensaio de ligação competitiva". Os ensaios de ligação competitiva são ensaios serológicos nos quais os anticorpos desconhecidos são detectados e quantificados em função da sua capacidade para inibir a ligação de um ligando marcado conhecido ao seu 44 anticorpo específico. Estes ensaios são também referidos como ensaios de inibição competitiva. Num ensaio de ligação competitiva representativo, o polipéptido CD40 marcado é precipitado por anticorpos candidatos numa amostra, por exemplo, em combinação com anticorpos monoclonais dirigidos contra um ou mais epitopos dos anticorpos monoclonais da invenção. Os anticorpos anti-CD40 que reagem especificamente contra um epitopo de interesse podem ser identificados através do rastreio de uma série de anticorpos preparados contra uma proteína CD40 ou um fragmento da proteína que compreende o epitopo particular da proteína CD40 de interesse. Por exemplo, para o CD40 humano, os epitopos de interesse incluem epitopos que compreendem resíduos de aminoácidos lineares e/ou não lineares da isoforma curta do CD40 humano (ver o N° de Acesso Genbank NP_690593) apresentada na Figura 4B (SEQ ID NO:10), codificada pela sequência apresentada na Figura 4A (SEQ ID NO: 9; ver também o N° de Acesso Genbank NM_152854), ou da isoforma longa do CD40 humano (ver os Nos. de Acesso Genbank CAA43045 e NP_001241) apresentada na Figura 4D (SEQ ID NO:12), codificada pela sequência apresentada na Figura 4C (SEQ ID N0:11; ver os Nos. de Acesso Genbank X60592 e M_001250). Alternativamente, poderão usar-se ensaios de ligação competitiva com anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados e previamente identificados com o fim de seleccionar anticorpos monoclonais comparáveis aos anticorpos previamente identificados.

Os anticorpos utilizados em tais imunoensaios poderão ser marcados ou não marcados. Os anticorpos não marcados poderão ser utilizados em aglutinação; os anticorpos marcados poderão ser usados numa grande variedade de ensaios, utilizando uma larga gama de marcadores. A detecção da formação de um complexo de anticorpo-antigénio entre um anticorpo anti-CD40 e um epitopo de interesse pode ser facilitada através da ligação 45 de uma substância detectável ao anticorpo. Os meios de detecção adequados incluem o uso de marcadores tais como radionuclidos, enzimas, coenzimas, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, cromogénios, substratos ou co-factores enzimáticos, inibidores enzimáticos, complexos de grupos prostéticos, radicais livres, partículas, corantes e outros. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; como exemplo de material luminescente encontra-se o luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina; e os exemplos de materiais radioactivos adequados incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Tais reagentes marcados podem ser usados em uma variedade de ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, enzimoimunoensaios, p.ex., ELISA, imunoensaios de fluorescência e semelhantes. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA Nos. 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; e 4.233.402.

Quaisquer dos anticorpos antagonistas anti-CD40 anteriormente descritos ou seus fragmentos podem ser conjugados antes de serem utilizados nos métodos desta invenção. Os métodos para a produção de anticorpos conjugados são conhecidos neste campo técnico. Assim, o anticorpo anti-CD40 pode ser marcado usando uma marcação indirecta ou uma abordagem de marcação indirecta. Por "marcação indirecta" ou "abordagem de marcação indirecta" pretende-se indicar que um agente quelante está covalentemente ligado a um anticorpo e que pelo menos um radionuclido é inserido no agente quelante. 46

Ver, por exemplo, os agentes quelantes e os radionuclidos descritos em Srivagtava e Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603. Os marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos (particularmente 32P e 125l), reagentes densos aos electrões, enzimas e ligandos que possuem parceiros de ligação especifica. Os enzimas são tipicamente detectados através da sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano (HRP) é geralmente detectada através da sua capacidade para converter a 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) em um pigmento azul, quantificável com um espectrofotómetro. O termo "parceiro de ligação especifica" refere-se a uma proteína que tem a capacidade de se ligar a uma molécula de ligando com uma elevada especificidade, como por exemplo no caso de um antigénio e de um anticorpo monoclonal específico para este. Outros parceiros de ligação específica incluem a biotina e a avidina ou a estreptavidina, IgG e proteína A, e os numerosos pares de receptor-ligando conhecidos da técnica. Deve notar-se que a descrição acima não pretende categorizar os diferentes marcadores em classes distintas, uma vez que o mesmo marcador pode funcionar de diversos modos. Por exemplo, o 125I pode servir como marcador radioactivo ou como um reagente denso aos electrões, e a HRP poderá funcionar como uma enzima ou como um antigénio para um mAc. Ainda, podem combinar-se vários marcadores para obter o efeito desejado. Por exemplo, os mAcs e a avidina requerem também marcadores para a colocação em prática desta invenção; assim, poder-se-á marcar um mAc com biotina e detectar a sua presença com avidina marcada com 125l, ou com um mAc anti-biotina marcado com HRP. Outras permutas e possibilidades se tornarão evidentes a um técnico de perícia média neste campo, sendo consideradas como equivalentes no âmbito da presente invenção.

Alternativamente, o anticorpo anti-CD40 pode ser marcado usando uma "marcação directa" ou uma "abordagem de marcação 47 directa", em que um radionuclido é covalentemente ligado directamente a um anticorpo (tipicamente através de um resíduo de aminoácido). Os radionuclidos preferidos são indicados em Srivagtava e Mease (1991), supra. A abordagem de marcação indirecta é particularmente preferida. Ver também, por exemplo, as Publicações Internacionais Nos. WO 00/52031 e WO 00/52473, em que é usado um linker para ligar um marcador radioactivo a anticorpos; e as formas marcadas de anticorpos anti-CD40 descritas na Patente dos EUA n° 6.015.542.

Adicionalmente, um anticorpo (ou um seu fragmento) pode ser conjugado com uma porção molecular terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico ou um ião metálico radioactivo ou radioisótopo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é lesivo para as células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e purimicina e seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem, de modo não limitativo, antimetabolitos (p.ex., fludarabina, 2-clorodesoxiadenusina, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina-platina (II)(DDP)cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (p.ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes anti- 48 mitóticos (p.ex., vincristina e vinblastina). Os radioisótopos incluem, de modo não limitativo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90,

Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 e semelhantes. Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica; a porção molecular de fármaco não deve ser tomada como limitada aos agentes quimioterápicos clássicos. Por exemplo, a porção molecular de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como a abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como o factor de necrose tumoral, interferão alfa, interferão beta, factor de crescimento dos nervos, factor de crescimento derivado das plaquetas, activador do plasminogénio tecidular; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador das colónias de granulócitos/macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulador das colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento.

As técnicas para a conjugação de tais porções moleculares terapêuticas com anticorpos são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Amon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), págs. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2a ed.; Mareei Dekker, Inc.), págs. 623-653; Thorpe (1985), "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, ed. Pinchera et al., págs. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Itália, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic 49

Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), págs. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.

Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, tal como descrito na Patente dos EUA N° 4.676.980. Adicionalmente, poderão usar-se linkers entre os marcadores e os anticorpos da invenção (ver a Patente dos EUA N° 4.831.175). Os anticorpos, ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio, poderão ser directamente marcados com iodo radioactivo, indio, itrio ou outra partícula radioactiva conhecida neste campo técnico (Patente dos EUA N° 5.595.721). O tratamento poderá consistir numa combinação do tratamento com anticorpos conjugados e não conjugados administrados simultaneamente ou subsequentemente (WO 00/52031 e WO 00/52473) .

Variantes de Anticorpos Antagonistas Anti-CD40

Poderão usar-se variantes biologicamente activas apropriadas dos anticorpos antagonistas anti-CD40 em associação aos métodos desta invenção. Tais variantes reterão as propriedades de ligação desejadas do anticorpo antagonista anti-CD40 progenitor. Os métodos para a produção de variantes de anticorpos estão bastante difundidos neste campo técnico.

Por exemplo, podem preparar-se variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descritos, efectuando mutações na sequência de DNA clonada que codifica para o anticorpo de interesse. Os métodos de mutagénese e alteração de sequências nucleotídicas são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan 50

Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente dos EUA N° 4.873.192; e as referências ai citadas. Podem encontrar-se orientações sobre substituições apropriadas de aminoácidos que não afectam a actividade biológica do polipéptido de interesse no modelo de Dayhoff et al. (1978), em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). As substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes, poderão ser preferidas. Os exemplos de substituições conservativas incluem, de modo não limitativo, Gly<->Ala, Val<->Ile<->Leu, Asp<->Glu, Lys<->Arg, Asn<->Gln, e Phe<->Trp<->Tyr.

Na construção de variantes do polipéptido que constitui o anticorpo antagonista anti-CD40 de interesse, são feitas modificações de modo a que as variantes continuem a possuir a actividade desejada, i.e., uma afinidade de ligação semelhante, a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana e ausência de actividade agonista significativa, exibindo por outro lado actividade antagonista quando em ligação a um antigénio CD40 numa célula humana que expressa CD40. Obviamente, quaisquer mutações efectuadas no DNA codificando para o polipéptido variante não devem colocar a sequência fora do molde de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que poderiam produzir uma estrutura secundária de mRNA. Ver a Publicação do Pedido de Patente EP N° 75.444.

Adicionalmente, a região constante de um anticorpo antagonista anti-CD40 pode ser alvo de mutação de modo a alterar a função efectora de diversos modos. Por exemplo, ver 51 a Patente dos EUA N° 6.737.056B1 e a Publicação do Pedido de Patente US N° 2004/0132101A1, que expõem mutações dos Fc que optimizam a ligação dos anticorpos aos receptores de Fc.

Preferencialmente, as variantes de um anticorpo antagonista anti-CD40 de referência possuem sequências de aminoácidos que têm pelo menos 70% ou 75% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da molécula de referência de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descritos, ou com uma porção mais curta da molécula de referência do anticorpo. Mais preferencialmente, as moléculas partilham uma identidade de sequência de pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99%. Para os fins da presente invenção, a percentagem de identidade de sequência é determinada usando o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman, usando uma análise de espaçamentos (gaps) com os parâmetros de gap open penalty de 12 e gap extension penalty de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman é exposto em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Uma variante poderá, por exemplo, diferir do anticorpo antagonista anti-CD40 de referência em apenas 1 a 15 resíduos de aminoácidos, apenas 1 a 10 resíduos de aminoácidos, tal como apenas 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou até apenas 1 resíduo de aminoácido.

No que diz respeito ao alinhamento óptimo de duas sequências de aminoácidos, o segmento contíguo da sequência variante de aminoácidos poderá ter resíduos adicionais de aminoácidos ou ter sofrido uma delecção de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos de referência. O segmento contíguo usado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 resíduos de 52 aminoácidos contíguos, podendo chegar a 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos. Podem estabelecer-se correcções quanto à identidade de sequência associadas a substituições conservativas de resíduos ou a espaçamentos na sequência (ver o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman). A estrutura química precisa de um polipéptido que tem a capacidade de se ligar especificamente ao CD40 e de reter a actividade antagonista, particularmente quando ligado ao antigénio CD40 em células B malignas, depende de diversos factores. Uma vez que se encontram presentes na molécula grupos amino e carboxilo ionizáveis, poderá obter-se um polipéptido particular sob a forma de sal acídico ou básico, ou na forma neutra. Todas as preparações deste tipo que retenham a sua actividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas são incluídas na definição de anticorpos antagonistas anti-CD40, tal como aqui é usada. Ainda, a sequência primária de aminoácidos do polipéptido poderá ser aumentada por derivatização usando porções moleculares de açúcar (glicosilação) ou outras moléculas suplementares tais como lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. A sequência poderá ainda ser aumentada por conjugação com sacáridos. Certos aspectos de tal aumento são atingidos através dos sistemas de processamento pós-tradução do hospedeiro produtor; outras modificações poderão ser introduzidas in vitro. Em qualquer caso, tais modificações são incluídas na definição de um anticorpo anti-CD40 tal como aqui é usada, com a ressalva de que as propriedades antagonistas do anticorpo anti-CD40 não sejam destruídas. Será de esperar que tais modificações possam afectar quantitativa ou qualitativamente a actividade, aumentando ou reduzindo a actividade do polipéptido, nos diversos ensaios. Ainda, os resíduos individuais de aminoácidos na cadeia poderão ser modificados por oxidação, redução ou outra derivatização, e o 53 polipéptido poderá ser submetido a corte para obter fragmentos que retêm a actividade. Tais alterações que não destroem a actividade antagonista não afastam a sequência polipeptídica da definição de anticorpos anti-CD40 de interesse, tal como esta é aqui usada.

Os desenvolvimentos técnicos neste campo fornecem orientações substanciais relativas à preparação e uso de variantes polipeptidicas. Na preparação de variantes dos anticorpos anti-CD40, um perito na técnica poderá prontamente determinar as modificações da sequência de nucleótidos ou da sequência de aminoácidos da proteína nativa que resultarão numa variante adequada para uso como um componente terapeuticamente activo de uma composição farmacêutica a utilizar em associação aos métodos aqui expostos. Métodos Terapêuticos Utilizando os Anticorpos Antagonistas

Anti-CD40 da Invenção

Os métodos aqui apresentados são dirigidos ao uso de anticorpos antagonistas anti-CD40 no tratamento de indivíduos (i.e. pacientes) que sofrem de leucemia linfocítica crónica (LLC) sendo que as células deste campo expressam o antigénio CD40. Por "células de leucemia linfocítica crónica que expressam CD40" pretende-se referir células LLC que expressam o antigénio CD40. 0 sucesso do tratamento da LLC depende de quão avançado se encontra o cancro à altura do diagnóstico e de o indivíduo ter já recebido ou ir receber outros métodos terapêuticos em combinação com a administração de anticorpo anti-CD40.Os métodos para a detecção da expressão de CD40 em células são bem conhecidos da técnica e incluem, de modo não limitativo, técnicas de PCR, imunohistoquímica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA e semelhantes.

Podem utilizar-se diversos critérios para classificar os estádios da LLC. Os métodos aqui expostos podem ser utilizados 54 para tratar as LLCs classificadas de acordo com o sistema de classificação de Rai-Binet. No sistema Rai, existem três estádios: o estádio 0, em que apenas está presente a linfocitose; o estádio I, em que está presente linfoadenopatia; o estádio II, em que está presente esplenomegália, linfoadenopatia ou ambas; o estádio III, em que está presente anemia, organomegália ou ambas (a progressão é definida pela perda de peso, fadiga, febre, organomegália maciça e uma contagem de linfócitos em ascenção rápida); e o estádio IV, em que estão presentes anemia, trombocitopénia, organomegália ou uma combinação destas. Segundo o sistema de estadiamento de Binet existem apenas três categorias: o estádio A, em que a linfocitose está presente e menos do que três nódulos linfáticos estão aumentados (este estádio inclui todos os pacientes do estádio 0 de Rai, metade dos pacientes do estádio I de Rai e um terço dos pacientes do estádio II de Rai) ; o estádio B, em que existe o envolvimento de três ou mais nódulos linfáticos; e o estádio C, em que está presente anemia, trombocitopénia ou ambas. O sistema de classificação de Rai-Binet pode ser combinado com as avaliações da mutação dos genes de imunoglobulinas para proporcionar uma caracterização mais exacta do estádio da doença. A presença de genes de imunoglobulinas com mutações correlaciona-se com um prognóstico melhorado.

Os métodos da presente exposição são aplicáveis ao tratamento da LLC classificada segundo qualquer dos critérios referidos. Assim como se podem utilizar estes critérios para caracterizar os estádios progressivos da doença, estes mesmos critérios, i.e., anemia, linfoadenopatia, organomegália, trombocitopénia e mutação dos genes das imunoglobulinas, podem ser monitorizados para avaliar a eficácia do tratamento. O termo "tratamento" é aqui definido como a aplicação ou administração de um anticorpo antagonista anti-CD40, ou de um 55 seu fragmento de ligação ao antigénio, ao paciente, ou a aplicação ou administração de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio a um tecido ou linha celular isolados de um paciente, sendo que o paciente sofre de LLC, um sintoma associado com a LLC ou uma predisposição para o desenvolvimento da LLC, sendo o propósito desta aplicação ou administração o de curar, aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a LLC, quaisquer sintomas de LLC ou a predisposição para o desenvolvimento de LLC.

Por "tratamento" pretende-se também significar a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos antagonistas anti-CD40 ou seu fragmento de ligação ao antigénio a um indivíduo, ou a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo antagonista anti-CD40 ou seu fragmento de ligação ao antigénio a um tecido ou linha celular isolados de um indivíduo, o qual sofre de LLC, um sintoma de LLC ou uma predisposição para o desenvolvimento de LLC, sendo o propósito desta aplicação ou administração o de curar, aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a LLC, quaisquer sintomas associados à LLC ou a predisposição para o desenvolvimento de LLC.

Por "actividade antitumoral" pretende-se indicar uma redução na taxa de proliferação ou acumulação de células malignas que expressam CD40, e deste modo um declínio na taxa de crescimento de um tumor existente ou de um tumor que se desenvolve durante a terapia, e/ou a destruição de células neoplásicas (tumorais) existentes ou de células neoplásicas formadas de novo, e deste modo uma diminuição da dimensão total de um tumor durante a terapia. A terapia com pelo menos um anticorpo anti-CD40 (ou com um seu fragmento de ligação ao antigénio) causa uma resposta fisiológica que é benéfica no que respeita ao tratamento da LLC quando a doença compreende 56 células que expressam o antigénio CD40. Reconhece-se que os métodos aqui descritos podem ter utilidade na prevenção da proliferação adicional e desenvolvimento de células de LLC que poderiam sobrevir durante a terapêutica.

De acordo com os métodos aqui descritos, pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) , tal como definido em outro local desta descrição, é usado para promover uma resposta terapêutica positiva em relação ao tratamento ou prevenção da LLC. Por "resposta terapêutica positiva", em relação ao tratamento de um cancro, pretende-se significar uma melhoria da doença em associação à actividade antitumoral destes anticorpos ou dos seus fragmentos de ligação ao antigénio, e/ou uma melhoria dos sintomas associados à doença. Deste modo, observa-se um efeito anti-proliferativo, a prevenção de novos desenvolvimentos tumorais, uma redução do tamanho do tumor, uma redução do número de células cancerosas (i.e. neoplásicas), incremento da morte das células neoplásicas, inibição da sobrevivência das células neoplásicas, inibição, uma taxa aumentada de sobrevivência do paciente e/ou uma diminuição de um ou mais dos sintomas mediados pela estimulação das células que expressam CD40. Assim, por exemplo, uma melhoria da doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Por "resposta completa" pretende-se indicar a ausência de doença clinicamente detectável com normalização de quaisquer resultados anteriormente anormais dos estudos radiográficos, da medula óssea e do liquido cefaloraquidiano (LCR). Uma tal resposta terá de persistir durante pelo menos um mês após o tratamento de acordo com os métodos aqui expostos. Alternativamente, uma melhoria da doença pode ser categorizada como uma resposta parcial. Por "resposta parcial" pretende-se indicar uma diminuição de pelo menos cerca de 50% de toda a massa tumoral mensurável (i.e., o número de células tumorais 57 presentes no indivíduo) na ausência de novas lesões e persistindo pelo menos durante um mês. Uma tal resposta é aplicável apenas a tumores mensuráveis. A resposta do tumor pode ser avaliada face às alterações de morfologia do tumor (i.e., massa tumoral total, dimensão do tumor e semelhantes) usando técnicas de avaliação tais como imagiologia por ressonância magnética (IRM), imagiologia por raios X, tomografia axial computorizada (TAC), citometria de fluxo ou analise de separação de células activadas por flurorescencia (FACS), imagiologia bioluminescente, por exemplo, imagiologia com luciferase, cintigrafia óssea e biópsia do tumor, incluindo medulograma. Para além destas respostas terapêuticas positivas, o indivíduo submetido a terapia com o anticorpo antagonista anti-CD40 ou com um seu fragmento de ligação ao antigénio poderá experienciar o efeito benéfico de uma melhoria dos sintomas associados à doença.

Por "dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" pretende-se indicar uma quantidade de anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio que, quando administrada, induz uma resposta terapêutica positiva no que diz respeito ao tratamento de um paciente com LLC. Em algumas formas de realização, uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento encontra-se no intervalo de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou de cerca de 7 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. É reconhecido que o método de tratamento poderá compreender uma só administração de uma dose terapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações de uma dose 58 terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio.

Uma outra forma de realização desta exposição consiste no uso de anticorpos antagonistas anti-CD40 para a monitorização diagnóstica dos níveis de proteínas em tecidos como parte de um procedimento de teste clínico, p.ex., para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada através do acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem diversos enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioactivos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui o luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina; e os exemplos de materiais radioactivos adequados incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 podem ser usados em combinação com agentes quimioterápicos conhecidos, isoladamente ou em combinação com cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (p.ex., esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoferese, transplante de medula e semelhantes), radioterapia, quimioterapia, outra terapia antineoplásica com anitcorpos monoclonais, terapia com esteróides, terapia com IL-2, interferão alfa, para o tratamento da LLC. Desta forma, os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos, ou os seus fragmentos de ligação ao 59 antigénio, são administrados em combinação com pelo menos uma terapêutica antitumoral, incluindo mas não de modo limitativo, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, outra terapia antineoplásica com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) que se dirija contra o antigénio de superfície celular CD52 nas células B malignas; rituximab (Rituxan®), que se dirija contra o antigénio de superfície celular CD20 nas células B malignas, ou outro anticorpo terapêutico anti-CD20, por exemplo, o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®); ou o anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas); terapia com interferão alfa, terapia com interleucina 2 (IL-2), terapia com IL-12, IL-15 ou IL-21 ou terapia com esteróides, sendo que a terapia antineoplásica adicional é administrada antes, durante ou após a terapia com anticorpos anti-CD40. Assim, quando as terapias combinadas compreendem a administração de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio em combinação com a administração de outro agente terapêutico, tal como quimioterapia, radioterapia, ou terapia com interferão alfa , IL-2, e/ou esteróides, os métodos aqui apresentados abrangem a coadministração, usando formulações separadas ou uma só formulação farmacêutica, e a administração consecutiva em qualquer ordem. Quando os métodos aqui expostos compreendem regimes terapêuticos combinados, estas terapias poderão ser administradas em simultâneo, i.e., o anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é administrado concomitantemente ou na mesma moldura temporal que a outra terapêutica antineoplásica (i.e., as terapias são administradas concomitantemente, mas o anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio não é administrado precisamente ao mesmo tempo que a outra terapêutica 60 antineoplásica) . Alternativamente, o anticorpo anti-CD40 da presente invenção, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, poderá igualmente ser administrado antes ou depois da outra terapêutica antineoplásica. A administração sequencial das diferentes terapêuticas antineoplásicas pode ser efectuada independentemente de o indivíduo tratado ter respondido ou não ao primeiro curso de terapia, para reduzir a possibilidade de recidivas. Quando as terapêuticas combinadas compreendem a administração do anticorpo anti-CD40, ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, em combinação com a administração de um agente citotóxico, o anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é preferencialmente administrado antes da administração do agente citotóxico.

Em algumas formas de realização da invenção, os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos, ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio, são administrados em combinação com quimioterapia, e opcionalmente em combinação com um transplante autólogo de medula, podendo o anticorpo e o(s) agente (s) quimioterápico (s) ser administrados em sequência (por qualquer ordem) ou simultaneamente (i.e., concomitantemente ou na mesma moldura temporal). Os exemplos de agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona.

Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, é administrado em combinação com fludarabina. Numa tal forma de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado antes da administração de fludarabina. Em formas de realização alternativas, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado após o tratamento com 61 fludarabina. Em ainda outras formas de realização, é administrada fludarabina em simultâneo com o anticorpo antagonista anti-CD40.

Em outras formas de realização da invenção, o clorambucil, um fármaco alquilante, é administrado em combinação com um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou com um seu fragmento de ligação ao antigénio. Numa tal forma de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado antes da administração de clorambucil. Em formas de realização alternativas, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado após o tratamento com clorambucil. Em ainda outras formas de realização, o clorambucil é administrado em simultâneo com o anticorpo antagonista anti-CD40.

Em ainda outras formas de realização, os regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona) e CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina) podem ser combinados com a administração de um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Numa tal forma de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado antes da administração dos regimes contendo antraciclinas. Em outras formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado após o tratamento com os regimes contendo antraciclinas. Em ainda outras formas de realização, o regime contendo antraciclinas é administrado em simultâneo com o anticorpo antagonista anti-CD40.

Em formas de realização alternativas, um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, é administrado em combinação com alemtuzumab (Campath®, distribuído por Berlex Laboratories, 62

Richmond, Califórnia). 0 alemtuzumab é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante (Campath-1H) que se dirige contra o antigénio CD52 expresso em células B malignas. Numa tal forma de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado antes da administração de alemtuzumab. Em outras formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40 é administrado após o tratamento com alemtuzumab. Em ainda outras formas de realização, o alemtuzumab é administrado em simultâneo com o anticorpo antagonista anti-CD40.

Em outras formas de realização, os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, podem ser usados em combinação com outro agente que possua propriedades anti-angiogénicas, tal como a talidomida ou o interferâo alfa. Estes últimos agentes poderão ser eficazes nos casos em que um paciente exiba resistência à terapêutica de primeira linha. Alternativamente, os anticorpos antagonistas anti-CD40 podem ser administrados a um indivíduo em combinação com quimioterapia em doses elevadas, isoladamente ou em associação ao transplante autólogo de medula óssea.

Em formas de realização alternativas, um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ser usado em combinação com outros agentes imonoterapêutieos, nomeadamente IL-2. A IL-2, um agente que tem o efeito conhecido de expandir o número de células natural killer (NK) efectoras em pacientes tratados, poderá ser administrada antes de, ou concomitantemente com, o anticorpo antagonista anti-CD40 da invenção. Este número expandido de células NK efectoras poderá conduzir a uma actividade ADCC aumentada por parte do anticorpo antagonista anti-CD40. 63

Adicionalmente, pode também usar-se uma terapêutica de combinação com dois ou mais agentes terapêuticos e um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito para o tratamento de LLC. Os exemplos incluem, de modo não limitativo, a terapêutica de combinação tripla, em que dois agentes quimioterápicos são administrados em combinação com um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito, e em que um agente quimioterápico e outro anticorpo monoclonal anti-neoplásico (por exemplo, alemtuzumab, rituximab ou anticorpo anti-CD20), por exemplo o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD23 são administrados em combinação com um anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descrito. Os exemplos destas combinações incluem, de modo não limitativo, combinações de fludarabina, ciclofosfamida e o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio; e combinações de fludarabina, um anticorpo anti-CD20, por exemplo, rituximab (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, Califórnia), e o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.

Formulações Farmacêuticas e Modos de Administração

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 desta invenção são administrados a uma concentração que é terapeuticamente eficaz para evitar ou tratar a leucemia linfocitica crónica. Para atingir este objectivo, os anticorpos poderão ser formulados usando uma variedade de excipientes aceitáveis conhecidos da técnica. Tipicamente, os anticorpos são administrados por injecção, por exemplo intravenosa ou intraperitoneal. Os 64 métodos para realizar esta administração são conhecidos dos técnicos de perícia média. É igualmente possível obter composições que podem ser administradas por via tópica ou oral, ou que podem ser transmitidas através de membranas mucosas. A administração intravenosa ocorre preferencialmente por infusão ao longo de um período de cerca de 1 até cerca de 10 horas, mais preferencialmente ao longo de cerca de 1 até cerca de 8 horas, ainda mais preferencialmente ao longo de cerca de 2 até cerca de 7 horas, e mais preferencialmente ainda ao longo de cerca de 4 até cerca de 6 horas, dependendo do anticorpo anti-CD40 a administrar. A infusão inicial da composição farmacêutica poderá ser administrada ao longo de um período de cerca de 4 até cerca de 6 horas, sendo as infusões subsequentes administradas mais rapidamente. As infusões subsequentes podem ser administradas ao longo de um período de cerca de 1 até cerca de 6 horas, incluindo, por exemplo, cerca de 1 até cerca de 4 horas, cerca de 1 até cerca de 3 horas, ou cerca de 1 até cerca de 2 horas.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os exemplos de vias de administração possíveis incluem a administração parentérica (p.ex., intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutânea (SC) ou infusão), oral e pulmonar (p.ex., inalação), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa e rectal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como a água para injecção, soro fisiológico, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico e metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como o ácido 65 etilenodiaminatetraacético; tampões como os acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos e bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser armazenada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos multidose de vidro ou de plástico.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 são tipicamente fornecidos por técnicas padronizadas num tampão farmaceuticamente aceitável, por exemplo, soro fisiológico estéril, água tamponada estéril, propilenoglicol, combinações dos anteriores, etc. Os métodos de preparação dos agentes administráveis por via parentérica estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Ver também, por exemplo, WO 98/56418, que descreve as formulações farmacêuticas estabilizadas de anticorpos adequadas para uso em associação nos métodos aqui descritos. A quantidade de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 ou seu fragmento a administrar é prontamente determinada por um técnico de pericia média sem necessidade de recorrer a experimentação indevida. Os factores que influenciam o modo de administração e a quantidade respectiva de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento) incluem, de modo não limitativo, a doença em causa sujeita á terapêutica, a gravidade da doença, a história da doença e a idade, altura, peso, estado de saúde e forma física do indivíduo a tratar. De forma similar, a quantidade de anticorpo antagonista anti-CD40 ou seu fragmento a administrar será dependente do modo de administração e de o regime a aplicar ao indivíduo prever uma dose única ou doses múltiplas deste agente antitumoral. Geralmente, é preferida uma dose mais elevada de anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento em 66 função do aumento de peso do indivíduo a tratar. A dose de anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento a administrar encontra-se no intervalo de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, preferencialmente no intervalo de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg. Assim, por exemplo, a dose poderá ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg ou 50 mg/kg.

Em outra forma de realização aqui exposta, o método compreende a administração de doses múltiplas do anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento. O método poderá compreender a administração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ou mais doses terapeuticamente eficazes de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento. A frequência e duração de administração de doses múltiplas das composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento poderão ser facilmente determinadas por um perito na técnica sem o recurso a experimentação indevida. Adicionalmente, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode incluir um só tratamento ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos. Num exemplo preferido, um indivíduo é tratado com anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio em quantidades no intervalo de entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana durante cerca de 1 a 10 semanas, preferencialmente durante cerca de 2 a 8 semanas, mais preferencialmente durante cerca de 3 a 7 semanas, e ainda mais preferencialmente durante cerca de 4, 5 ou 6 semanas. O tratamento poderá realizar-se anualmente para prevenir as recidivas ou por indicação da ocorrência de uma recidiva. Deve ainda ter-se em conta que a 67 dosagem eficaz do anticorpo, ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, usada para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do curso de um tratamento em particular. As alterações de dosagem poderão resultar de, e evidenciar-se a partir dos resultados de, ensaios de diagnóstico tais como os acima descritos. Assim, numa das formas de realização, o regime de dosagem inclui uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou seu fragmento aos dias 1, 7, 14 e 21 de um período de tratamento. Em outra forma de realização, o regime de dosagem inclui uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento aos dias 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 de uma semana num período de tratamento. Outras formas de realização incluem um regime de dosagem com uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento aos dias 1, 3, 5 e 7 de uma semana num período de tratamento; um regime de dosagem incluindo uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento aos dias 1 e 3 de uma semana num período de tratamento; e um regime de dosagem preferido incluindo uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento ao dia 1 de uma semana num período de tratamento. 0 período de tratamento poderá compreender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses ou um ano. Os períodos de tratamento poderão ser subsequentes ou separados entre si por um dia, uma semana, 2 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses ou um ano.

Em algumas formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio variam entre cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca 68 de 40 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, entre cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou entre cerca de 7 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Assim, por exemplo, a dose de um qualquer anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, por exemplo o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, poderá ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou quaisquer outras doses dentro do intervalo de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Poderá ser administrada a mesma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio ao longo de cada semana de dosagem com anticorpo. Alternativamente, poderão usar-se diferentes doses terapeuticamente eficazes de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio ao longo do curso de um periodo de tratamento.

Em outras formas de realização da invenção, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro local desta exposição, pode encontrar-se na gama de dosagens mais baixa (i.e., de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg) , encontrando-se as doses subsequentes na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg). 69

Em formas de realização alternativas, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro local desta exposição, pode encontrar-se na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg) , encontrando-se as doses subsequentes na gama de dosagens mais baixa (i.e., de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg). Assim, em uma forma de realização, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio é de cerca de 20 mg/kg a cerca de 35 mg/kg, incluindo cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg e cerca de 35 mg/kg, e as doses terapeuticamente eficazes subsequentes de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio são de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo cerca de 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg e cerca de 15 mg/kg.

Em algumas das formas de realização da invenção, a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 é iniciada pela administração de uma "dose de carga" do anticorpo ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio ao indivíduo que necessite da terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40. Por "dose de carga" pretende-se indicar uma dose inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio que é administrada ao indivíduo, sendo que a dose administrada de anticorpo ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio se encontra na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg). A "dose de carga" pode ser administrada sob a forma de administração única, por exemplo, uma infusão única em que o anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é administrado por via IV, ou em administrações múltiplas, por exemplo, infusões múltiplas em que o anticorpo anti-CD40 ou um 70 seu fragmento de ligação ao antigénio é administrado por via IV, desde que a "dose de carga" completa seja administrada dentro de um período de cerca de 24 horas. Após a administração da "dose de carga", o indivíduo recebe então a administração de uma ou mais doses terapeuticamente eficazes adicionais do anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio. As doses terapeuticamente eficazes subsequentes podem ser administradas, por exemplo, de acordo com um regime de dosagem semanal, ou uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada quatro semanas. Em tais formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes subsequentes encontram-se geralmente na gama de dosagens mais baixa (i.e., 0, 003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg).

Alternativamente, em algumas formas de realização, após a "dose de carga", as doses terapeuticamente eficazes subsequentes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio são administradas de acordo com um "regime de manutenção", em que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 2 meses, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14 semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18 semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22 semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses, uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez a cada 10 meses, uma vez a cada 11 meses, ou uma vez a cada 12 meses. Em tais formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio encontram-se na gama de dosagens mais baixa (i.e., 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg), particularmente quando as doses subsequentes são administradas a intervalos mais 71 frequentes, desde, por exemplo, uma vez a cada duas semanas até uma vez por mês, ou na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg) , particularmente quando as doses subsequentes são administradas a intervalos menos frequentes, por exemplo quando as doses subsequentes são administradas com um espaçamento entre si de cerca de um mês a cerca de 12 meses.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 presentes nas composições farmacêuticas aqui descritas e destinados a uso com os métodos aqui expostos poderão ser nativos ou obtidos por técnicas recombinantes, e poderão advir de qualquer fonte, incluindo fontes de mamíferos tais como, p.ex., ratinho, rato, coelho, primata, porco e humano. Preferencialmente, tais polipéptidos derivam de uma fonte humana, e mais preferencialmente são proteínas humanas recombinantes derivadas de linhas celulares de hibridoma.

As composições farmacêuticas úteis para os métodos aqui descritos compreendem variantes biologicamente activas dos anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção. Tais variantes retêm a actividade biológica desejada do polipéptido nativo, de tal modo que a composição farmacêutica que compreende o polipéptido variante possui o mesmo efeito terapêutico que a composição farmacêutica que compreende o polipéptido nativo quando administrada a um indivíduo. Isto é, o anticorpo variante anti-CD40 funciona como um componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica de um modo semelhante ao observado com o anticorpo antagonista nativo, por exemplo CHIR-5.9 ou CHIR-12.12, expressos pelas linhas celulares de hibridoma 5.9 ou 12.12, respectivamente. Encontram-se disponíveis neste campo técnico diversos métodos para determinar se um anticorpo variante anti-CD40 retém a actividade biológica desejada e se, deste modo, pode servir como agente terapeuticamente activo na composição 72 farmacêutica. A actividade biológica das variantes de anticorpos pode ser medida usando ensaios especificamente concebidos para a medição da actividade do anticorpo antagonista nativo, incluindo os ensaios aqui descritos. [0124] Qualquer composição farmacêutica que compreenda um anticorpo antagonista anti-CD40 possuindo as caracteristicas de ligação aqui descritas como componente terapeuticamente activo pode ser usada com os métodos aqui descritos. Assim, podem preparar-se composições liquidas, liofilizadas ou secas em spray compreendendo um ou mais anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção sob a forma de uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa para administração subsequente a um indivíduo de acordo com os métodos aqui expostos. Cada uma destas composições compreenderá pelo menos um dos anticorpos antagonistas anti-CD40 da presente invenção como componente terapeuticamente ou profilacticamente activo. Por "componente terapeuticamente ou profilacticamente activo" pretende-se indicar que o anticorpo anti-CD40 é especificamente incorporado na composição para produzir uma resposta terapêutica ou profiláctica desejada no que diz respeito ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou distúrbio num indivíduo quando a composição farmacêutica é administrada a esse indivíduo. De preferência, as composições farmacêuticas compreendem os apropriados agentes estabilizantes, agentes formadores de volume ou ambos, para minimizar os problemas associados à perda de estabilidade e de actividade biológica das proteínas durante a preparação e armazenagem.

Poderão adicionar-se agentes de formulação às composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo antagonista anti-CD40 da invenção. Estes agentes de formulação poderão incluir, de modo não limitativo, óleos, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sais, tampões, albumina, surfactantes 73 ou agentes formadores de volume. Preferencialmente, os hidratos de carbono incluem açúcares ou açúcares alcoólicos como os mono-, di- ou polisacáridos, ou glucanos solúveis em água. Os sacáridos ou glucanos podem incluir frutose, glucose, manose, sorbose, xilose, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, α e β-ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietilamido e carboximetilcelulose, ou suas misturas. 0 termo "açúcar alcoólico" é definido como um hidrocarboneto C4 a C8 possuindo um grupo hidroxilo, e inclui galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol e arabitol. Estes açúcares ou açúcares alcoólicos podem ser usados individualmente ou em combinação. A concentração de açúcar ou açúcar alcoólico encontra-se entre 1,0% e 7% p/v, mais preferencialmente entre 2,0% e 6,0% p/v. De preferência, os aminoácidos incluem as formas levógiras (L) da carnitina, arginina e betaína; no entanto, poderão adicionar-se outros aminoácidos. Os polímeros preferidos incluem polivinilpirrolidona (PVP) com um peso molecular médio entre 2.000 e 3.000, ou polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular médio entre 3.000 e 5.000. Os surfactantes que podem ser adicionados à formulação são expostos nas EP nos. 270.799 e 268.110.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente com um polímero para aumentar a sua semi-vida circulante, por exemplo. Os polímeros preferidos, e os métodos para os conjugar com péptidos, são expostos nas Patentes dos EUA Nos. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; e 4.609.546. Os polímeros preferidos são os polióis polioxietilados e o polietilenoglicol (PEG). O PEG é solúvel em água à temperatura ambiente e possui a fórmula geral de R (0-CH2—CH2) nO—R em que R pode ser hidrogénio ou um grupo protector tal como um grupo alquilo ou alcanol. De preferência, o grupo protector possui entre 1 e 8 átomos de 74 carbono, correspondendo mais preferencialmente a metilo. 0 símbolo n é um número inteiro positivo, preferencialmente entre 1 e 1.000, mais preferencialmente entre 2 e 500. O PEG possui um peso molecular médio preferido de entre 1.000 a 40.000, mais preferencialmente entre 2.000 e 20.000 e ainda mais preferencialmente entre 3.000 e 12.000. De preferência, o PEG possui pelo menos um grupo hidroxi, correspondendo este mais preferencialmente a um grupo hidroxi terminal. É este grupo hidroxi que é preferencialmente activado para reagir com um grupo amino livre do inibidor. No entanto, deve notar-se que o tipo e quantidade dos grupos reactivos pode fazer-se variar de modo a se obter um conjugado covalente de PEG/anticorpo da invenção.

Os polióis polioxietilados solúveis em água são também úteis para a presente invenção. Estes incluem sorbitol polioxietilado, glucose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), e semelhantes. É preferido o POG. Uma das razões para tal é a de que a estrutura principal de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma estrutura principal que ocorre naturalmente em, por exemplo, os mono-, di- e triglicéridos dos animais e dos seres humanos. Deste modo, esta ramificação não corresponderá necessariamente à introdução de um agente estranho no organismo. O POG possui um peso molecular preferido na mesma gama que o PEG. A estrutura do POG é apresentada em Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070, e é encontrada uma exposição sobre conjugados de POG/IL-2 na Patente dos EUA N° 4.766.106.

Um outro sistema de administração de fármacos destinado a aumentar a semi-vida de circulação é o lipossoma. Os métodos de preparação dos sistemas de administração com lipossomas são expostos em Gabizon et al. (1982) Câncer Research 42:4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129; e Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. Existem outros sistemas de 75 administração de fármacos bem conhecidos neste campo técnico que se encontram descritos em, p.ex., Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) págs. 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277.

Os agentes de formulação a incorporar numa composição farmacêutica deverão proporcionar estabilidade ao anticorpo antagonista anti-CD40 ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio. Isto é, o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio deverão reter a sua estabilidade fisica e/ou quimica e possuir a actividade biológica desejada, i.e., uma ou mais das actividades antagonistas aqui anteriormente definidas, incluindo, de modo não limitativo, a inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B periféricas humanas normais estimuladas por células T; inibição da sobrevivência e/ou proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células T Jurkat; inibição da sobrevivência e/ou proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células que expressam CD40L ou pelo ligando de CD40 solúvel (sCD40L); inibição dos sinais intracelulares anti-apoptóticos de "sobrevivência" em qualquer célula estimulada por sCD40L ou por CD40L em fase sólida; inibição da transdução de sinal por CD40 em qualquer célula em consequência da ligação ao sCD40L ou ao CD40L em fase sólida; e inibição da proliferação de células B humanas malignas, tal como já referido em outro local desta descrição.

Os métodos para a monitorização da estabilidade das proteínas são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Mareei Dekker, Inc., New York, New York); e os ensaios de estabilidade abaixo descritos. Geralmente, a estabilidade da proteína é medida a uma temperatura escolhida durante um período especificado de 76 tempo. Em formas de realização preferidas, uma formulação farmacêutica estável de anticorpos proporciona estabilidade ao anticorpo antagonista anti-CD40 ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio quando armazenada à temperatura ambiente (a cerca de 25°C) durante pelo menos 1 mês, pelo menos três meses ou pelo menos 6 meses, e/ou é estável a cerca de 2-8°C durante pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses.

Uma proteína tal como um anticorpo, quando formulada numa composição farmacêutica, é considerada como retendo a sua estabilidade física num dado ponto de tempo se não evidenciar sinais visuais (i.e ., descoloração ou perda de limpidez) ou sinais mensuráveis (por exemplo, usando a cromatografia de exclusão molecular (SEC) ou a dispersão da luz UV) de precipitação, agregação e/ou desnaturação naquela composição farmacêutica. Em relação à estabilidade química, uma proteína tal como um anticorpo, quando formulada numa composição farmacêutica, é considerada como retendo a sua estabilidade química num dado ponto de tempo se as medições de estabilidade química forem indicativas de que a proteína (i.e., o anticorpo) retém a actividade biológica de interesse naquela composição farmacêutica. Os métodos para monitorização de alterações da estabilidade química são bem conhecidos da técnica e incluem, de modo não limitativo, métodos para a detecção de formas quimicamente alteradas da proteína como as que resultam de cortes de ligações, usando, por exemplo, SDS-PAGE, SEC e/ou espectrometria MALDI/TOF; e a degradação associada a alterações da carga molecular (por exemplo, associada à desamidação), usando, por exemplo, a cromatografia de troca iónica. Ver, por exemplo, os métodos abaixo expostos.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, quando formulado numa composição farmacêutica, é considerado como retendo uma actividade 77 biológica desejada a um dado ponto de tempo se a actividade biológica desejada àquele tempo diferir em não mais do que cerca de 30%, preferencialmente em não mais do que cerca de 20% da actividade biológica desejada exibida na altura em que a composição farmacêutica foi preparada, tal como determinado por um ensaio adequado para a actividade biológica desejada. Os ensaios para a medição da actividade biológica desejada dos anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui apresentados, e dos seus fragmentos de ligação ao antigénio, podem ser efectuados tal como descrito nos Exemplos. Ver igualmente os ensaios descritos em Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; e as Patentes dos EUA Nos. 5.674.492 e 5.847.082.

Em algumas formas de realização desta invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, é formulado numa formulação farmacêutica liquida. O anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser preparado usando qualquer método conhecido neste campo, incluindo os métodos expostos acima. Em uma das formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é produzido por via recombinante numa linha celular CHO.

No seguimento da sua preparação e purificação, o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser formulado como uma formulação farmacêutica 78 líquida do modo aqui exposto. Quando o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio se destina a ser armazenado antes da sua formulação, este poderá ser congelado, por exemplo, a ^-20°C, sendo depois descongelado à temperatura ambiente para se proceder à formulação. A formulação farmacêutica líquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. A quantidade de anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigénio presente na formulação tem em consideração a via de administração e o volume da dose desejado.

Deste modo, a composição farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio numa concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50.0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 40,0 mg/ml, cerca de 1.0 mg/ml a cerca de 30,0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25.0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, ou cerca de 15,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 10,0 mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 15,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de 25,0 mg/ml a cerca de 30,0 mg/ml, cerca de 30.0 mg/ml a cerca de 35,0 mg/ml, cerca de 35,0 mg/ml a cerca de 4 0,0 mg/ml, cerca de 4 0,0 mg/ml a cerca de 4 5,0 mg/ml, ou cerca de 45,0 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml. Em outras formas de realização, a composição farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio numa concentração de cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 16,0 mg/ml, cerca de 17,0 mg/ml, cerca de 18,0 mg/ml, cerca 79 de 19,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml, cerca de 21,0 mg/ml, cerca de 22,0 mg/ml, cerca de 23,0 mg/ml, cerca de 24,0 mg/ml ou cerca de 25,0 mg/ml. A composição farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão que mantém o pH da formulação dentro do intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0, incluindo o pH de cerca de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 e outros valores dentro do intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Em algumas formas de realização, o tampão mantém o pH da formulação no intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5, cerca de 5,0 a cerca de 6,0, cerca de 5,0 a cerca de 5,5, cerca de 5,5 a cerca de 7,0, cerca de 5,5 a cerca de 6,5 ou cerca de 5,5 a cerca de 6,0.

Qualquer tampão adequado que mantém o pH da formulação líquida de anticorpo anti-CD40 no intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0 pode ser usado na formulação, desde que a estabilidade fisico-química e a actividade biológica desejada do anticorpo sejam mantidas, tal como acima se fez notar. Os tampões adequados incluem, de modo não limitativo, ácidos convencionais e os seus sais, podendo o contra-ião corresponder a, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou magnésio. Os exemplos de ácidos convencionais e dos seus sais que podem ser usados para tamponar a formulação farmacêutica líquida incluem, de modo não limitativo, os tampões de ácido succínico ou succinato, ácido cítrico ou citrato, ácido acético ou acetato, ácido tartárico ou tartarato, ácido fosfórico ou fosfato, ácido glucónico ou gluconato, ácido glutâmico ou glutamato, ácido aspártico ou aspartato, ácido maleico ou maleato, e ácido málico ou malato. A concentração de tampão na formulação pode corresponder a cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 80 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Em algumas formas de realização, a concentração de tampão na formulação está entre cerca de 5 mM e cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mm, 13 mM, 14 mM, 15 mM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM.

Em algumas formas de realização da invenção, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão de succinato ou de citrato a uma concentração que mantém o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, preferencialmente de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5. Por "tampão de succinato" ou "tampão de citrato" pretende-se indicar um tampão que compreende um sal de ácido succínico ou um sal de ácido cítrico, respectivamente. Numa forma de realização preferida, o contra-ião do succinato ou do citrato é o catião de sódio, e deste modo o tampão corresponde a succinato de sódio ou a citrato de sódio, respectivamente. No entanto, é de esperar que qualquer catião seja eficaz. Outros catiões possíveis para o succinato ou para o citrato incluem, de modo não limitativo, potássio, amónio, cálcio e magnésio. Tal como acima se fez notar, a concentração de tampão succinato ou citrato na formulação pode variar entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 MM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Em algumas formas de realização, a concentração de tampão na formulação encontra-se no intervalo de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ou 81 cerca de 15 mM. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml e tampão de succinato ou de citrato, por exemplo, tampão de succinato de sódio ou de citrato de sódio, a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, preferencialmente cerca de 10 mM.

Nos casos em que é desejável que a formulação farmacêutica liquida esteja perto da isotonicidade, a formulação farmacêutica liquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, poderá ainda conter uma porção de um agente isotonicizante que seja suficiente para tornar a formulação praticamente isotónica. Por "praticamente isotónica" pretende-se indicar que a formulação aquosa tem uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg, preferencialmente de cerca de 240 a cerca de 340 mmol/kg, mais preferencialmente de cerca de 250 a cerca de 330 mmol/kg, ainda mais preferencialmente de cerca de 260 a cerca de 320 mmol/kg, e mais preferencialmente ainda de cerca de 270 a cerca de 310 mmol/kg. Os métodos para a determinação da isotonicidade de uma solução são bem conhecidos dos peritos neste campo técnico. Ver, por exemplo, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoe. 48:628.

Os peritos na técnica conhecem diversos solutos farmaceuticamente aceitáveis que serão úteis para proporcionar isotonicidade a composições farmacêuticas. O agente 82 isotonicizante poderá corresponder a qualquer reagente que tenha a capacidade de ajustar a pressão osmótica da formulação farmacêutica líquida da presente invenção até um valor que praticamente iguale o de um fluido corporal. Deve utilizar-se um agente isotonicizante que seja fisiologicamente aceitável. Assim, a formulação farmacêutica líquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, poderá ainda conter componentes destinados a proporcionar isotonicidade, por exemplo, cloreto de sódio; aminoácidos como alanina, valina e glicina; açúcares e açúcares alcoólicos (polióis), incluindo, de modo não limitativo, glucose, dextrose, frutose, sacarose, maltose, manitol, trealose, glicerol, sorbitol e xilitol; ácido acético, outros ácidos orgânicos ou os seus sais, e quantidades relativamente pequenas de citratos ou fosfatos. O técnico de perícia média conhecerá ainda outros agentes adequados para proporcionar uma tonicidade óptima à formulação líquida.

Em algumas formas de realização preferidas, a formulação farmacêutica líquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, compreende ainda cloreto de sódio como agente isotonicizante. A concentração de cloreto de sódio na formulação dependerá da contribuição dos outros componentes para a tonicidade. Em algumas formas de realização, a concentração de cloreto de sódio está entre cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de 250 mM, cerca de 50 83 mM a cerca de 200 mM, cerca de 50 mM a cerca de 175 mM, cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, cerca de 75 mM a cerca de 175 mM, cerca de 75 mM a cerca de 150 mM, cerca de 100 mM a cerca de 175 mM, cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, cerca de 100 mM a cerca de 150 mM, cerca de 125 mM a cerca de 175 mM, cerca de 125 mM a cerca de 150 mM, cerca de 130 mM a cerca de 170 mM, cerca de 130 mM a cerca de 160 mM, cerca de 135 mM a cerca de 155 mM, cerca de 140 mM a cerca de 155 mM, ou cerca de 145 mM a cerca de 155 mM. Numa destas formas de realização, a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM. Em outras formas de realização semelhantes, a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM, o tampão é succinato de sódio ou citrato de sódio a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e a formulação possui um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e cerca de 10 mM de succinato de sódio ou de citrato de sódio, a um pH de cerca de 5,5. A degradação de proteínas devido ao ciclo de congelamento e descongelamento ou à fragmentação mecânica durante o processamento das formulações farmacêuticas líquidas desta invenção pode ser inibida pela incorporação de surfactantes na formulação de modo a reduzir a tensão superficial na interface solução-ar. Assim, em algumas formas de realização, a 84 formulação farmacêutica líquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, um tampão para manter o pH da formulação dentro do intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, e ainda um surfactante. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica líquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, um tampão para manter o pH da formulação dentro do intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, um agente isotonicizante como o cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, e ainda um surfactante.

Os surfactantes típicos utilizados são os surfactantes não iónicos, incluindo os ésteres de polioxietileno-sorbitol tais como o polisorbato 80 (Tween 80) e o polisorbato 20 (Tween 20) ; ésteres de polioxipropileno-polioxietileno como o Pluronic F68; álcoois polioxietilénicos como o Brij 35; simeticone; polietilenoglicol, tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; e polioxietileno-p-t-octilfenol, tal como Triton X-100. O processo clássico de estabilização de composições farmacêuticas através de surfactantes ou de emulsificantes está descrito em, p.ex., Levine et al. (1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3):160-165. Um surfactante preferido utilizado na prática da presente invenção é o polisorbato 80. Quando a formulação inclui um surfactante, este é tipicamente adicionado numa quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0% (p/v), cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, cerca de 0,001% a cerca de 0,4%, cerca de 0,001% a cerca de 0,3%, cerca de 0,001% a cerca de 0,2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, cerca de 0,01% a cerca de 0,5%, cerca de 0,01% a cerca de 0,2%, cerca de 0,03% 85 a cerca de 0,5%, cerca de 0,03% a cerca de 0,3%, cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,05% a cerca de 0,2%.

Assim, em algumas formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio; o tampão é o succinato de sódio ou o citrato de sódio a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM; a formulação possui um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0 ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5; e a formulação compreende ainda um surfactante, por exemplo, polisorbato 80, numa quantidade de cerca de 0,001% até cerca de 1,0% ou de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%. Tais formulações poderão também opcionalmente incluir um agente isotonicizante, tal como cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 150 mM. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou de cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, incluindo cerca de 20 mg/ml; cerca de 50 mM a cerca de 200 mM de cloreto de sódio, incluindo cerca de 150 mM de cloreto de sódio; succinato de sódio ou citrato de sódio entre cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, incluindo cerca de 10 mM de succinato de sódio ou de citrato de sódio; cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, incluindo cerca de 150 mM; e opcionalmente um surfactante, por exemplo, polisorbato 80, numa quantidade de cerca de 0,001% até cerca de 1,0%, incluindo de cerca de 0,001% a cerca de 86 0,5%; sendo que a formulação farmacêutica líquida tem um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0. A formulação farmacêutica líquida poderá estar essencialmente isenta de conservantes e de outros veículos, excipientes ou estabilizantes tais como os acima referidos. Alternativamente, a formulação poderá conter um ou mais conservantes, por exemplo, agentes antibacterianos, veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes como os acima descritos, desde que estes não afectem adversamente a estabilidade fisico-química do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. Os exemplos de veículos, excipientes e estabilizantes adequados incluem, de modo não limitativo, agentes tamponantes adicionais, co-solventes, surfactantes, antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina, agentes quelantes como o EDTA, complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína), e polímeros biodegradáveis tais como poliésteres. Pode encontrar-se uma exposição aprofundada sobre a formulação e selecção de veículos, estabilizantes e isomólitos farmaceuticamente aceitáveis em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) .

Após a preparação da formulação farmacêutica líquida ou de outra composição farmacêutica tal como aqui descrito, esta pode ser liofilizada para evitar a degradação. Os métodos para a liofilização de composições líquidas são bem conhecidos dos técnicos de perícia média. Imediatamente antes do uso, a composição poderá ser reconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer, água destilada ou soro fisiológico estéril, por exemplo) que poderá incluir ingredientes adicionais. Após a reconstituição, a composição é 87 preferencialmente administrada aos indivíduos utilizando os métodos já conhecidos dos peritos neste campo técnico.

Uso de Anticorpos Antagonistas Anti-CD40 no Fabrico de Medicamentos A presente exposição proporciona igualmente o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento que se destina ao tratamento da LLC num indivíduo, sendo o medicamento coordenado com o tratamento com pelo menos uma outra terapêutica antineoplásica. Por "coordenado" pretende-se indicar que o medicamento se destina a ser usado antes de, durante, ou após o tratamento do indivíduo com pelo menos uma outra terapêutica antineoplásica. Os exemplos de outras terapêuticas anti-neoplásicas incluem, de modo não limitativo, as descritas acima, por ex., cirurgia; radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), VAD (vincristina, doxorubicina com dexametasona), MP (melfalan com prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados em quimioterapia, tais como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginase, e antimetabolitos, incluindo, de modo não limitativo, citarabina, metotrexato, dacarbazina, 5-fluorouracilo, β-tioguanina, 6-mercaptopurina e nelarabina; outras terapêuticas anti-neoplásicas com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou 88 outro anticorpo anti-CD52 que se dirija contra a glicoproteina de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®) , o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD20 que se dirija contra o antigénio CD20 nas células B malignas; anticorpo anti-CD19 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecífico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpo antineoplásico que se dirija contra o factor de crescimento do endotélio vascular humano; anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22); o anticorpo α-Μ-CSF, dirigido contra o factor estimulador de colónias de macrófagos; anticorpos dirigidos contra o receptor activador do factor nuclear-kappaB (RANK) e o seu ligando (RANKL); anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD38 dirigido contra o antigénio CD38 nas células B malignas; anticorpos dirigidos contra receptores de classe II do complexo major de histocompatibilidade (anticorpos anti-MHC) expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) dirigidos contra o antigénio CD40 nas células B malignas; e anticorpos dirigidos contra o receptor 1 do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL-Rl) (por exemplo, o anticorpo monoclonal agonista humano HGS-ETR1), expresso em vários tumores e tumores de origem hematopoiética; terapêutica antitumoral baseada em moléculas pequenas, incluindo, de modo não limitativo, inibidores dos microtúbulos ou da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e os análogos da dolastatina; o agente de ligação à tubulina 89 Τ900607; XL119; e o inibidor da topoisomerase aminocamptotecina) , SDX-105 (cloridrato de bendamustina), ixabepilona (um análogo da epotilona, também conhecido como BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurina (PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid), Affinitak™ (inibidor anti-sentido da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos), análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da produção da proteína Bcl-2 pelas células neoplásicas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®), inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores de pequena molécula da quinase (por exemplo, CHIR-258), inibidores de pequena molécula do VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula da proteína de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação híbrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico (SAHA), e FR—901228) e agentes apoptóticos tais como o Trisenox® (trióxido de arsénio) e Xcytrin® (motexafin-gadolínio); terapêuticas antineoplásicas baseadas em vacinas/imunoterapias, incluindo, de modo não limitativo, abordagens de vacinação (por exemplo, Id-KLH, oncofagos, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia de idiotipos activos (por exemplo, a Imunoterapia Personalizada MyVax®, formalmente designada por GTOP-99), Promune® (CpG 7909, um agonista sintético para o receptor "toll-like" 9(TLR9)), terapia com interferão alfa, terapia com interleucina 2 (IL-2), terapia com IL-12, terapia com IL-15 e terapia com IL-21; terapia com esteróides; ou outra terapia 90 antineoplásica; sendo que o tratamento com a terapêutica antineoplásica adicional, ou com as terapêuticas anti-neoplásicas adicionais, ocorre antes, durante ou depois do tratamento do indivíduo com o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como acima referido. Numa tal forma de realização, a presente invenção proporciona o uso do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com LLC, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos outra terapêutica anti-neoplásica, como referido acima.

Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona o uso do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, no fabrico de um medicamento para o tratamento da LLC, num indivíduo, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com quimioterapia, em que a quimioterapia é seleccionada do grupo que consiste em fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona, e regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), e quaisquer combinações dos mesmos; sendo que o medicamento se destina a ser usado antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com a outra terapêutica anti-neoplásica ou, em caso de terapêuticas múltiplas em combinação, antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com as outras terapêuticas anti-neoplásicas.

Noutras formas de realização, a invenção proporciona o uso do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um mieloma múltiplo, num 91 indivíduo, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com poutro anticorpo anti-neoplásico seleccionado a partir do grupo que consiste em alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 direccionado contra a glicoproteína de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD20 direccionado contra o antigénio CD20 nas células B malignas; anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152), anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22) e quaisquer combinações destes; sendo que o medicamento se destina a ser usado antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com a outra terapêutica anti-neoplásica ou, no caso de terapêuticas múltiplas em combinação, antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com as outras terapêuticas anti-neoplásicas.

Em ainda outras formas de realização, a presente invenção proporciona o uso do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou dos seus fragmentos de ligação ao antigénio, no fabrico de um medicamento para o tratamento da LLC, num indivíduo, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com pelo menos uma outra terapêutica anti-neoplásica baseada em pequenas moléculas seleccionada a partir do grupo que consiste em SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos), análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da produção da proteína Bcl-2 pelas células neoplásicas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®), inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ 92 (bortezomib)), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação híbrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico (SAHA), e FR-901228), e quaisquer combinações destes; ou outra terapia anti-neoplásica, por exemplo, imunização do gene CD154 (e por exemplo, ISF-154); em que o medicamento deve ser usado antes, durante ou depois do tratamento do indivíduo com outra terapêutica anti-neoplásica, ou no caso de terapêuticas múltiplas em combinação, antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com as outras terapêuticas anti-neoplásicas.

Em algumas formas de realização, o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, aqui descritos, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, é coordenado com o tratamento com outras terapêuticas anti-neoplásicas. Sem que consitua uma limitação, os exemplos incluem a coordenação do medicamento com o tratamento com dois agentes quimioterápicos, por exemplo a coordenação com o tratamento de fludarabina e ciclofosfamida; e a coordenação do medicamento com o tratamento de um agente quimioterápico, por exemplo, fludarabina, e outro anticorpo monoclonal anti-neoplásico, por exemplo alemtuzumab, rituximab, ou outro anticorpo anti-CD20, incluindo o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou o anticorpo anti-CD23. Quando o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 é coordenado com outras duas terapêuticas anti-neoplásicas, o uso do medicamento pode ser antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com uma ou ambas as terapêuticas anti-neoplásicas. A invenção também proporciona o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui expostos ou um seu fragmento de 93 ligação ao antigénio, no fabrico de um medicamento para o tratamento da LLC, em que o medicamento é usado num indivíduo que já foi pré-tratado com pelo menos uma outra terapêutica anti-neoplásica. Por "pré-tratado" ou "pré-tratamento" pretende-se indicar que o indivíduo recebeu já uma ou mais de entre outras terapêuticas anti-neoplásicas antes de receber o medicamento que compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio. Os termos "pré-tratado" ou "pré-tratamento" incluem indivíduos que foram tratados com pelo menos uma outra terapêutica anti-neoplásica ou outras terapêuticas anti-neoplásicas 2 anos, 18 meses, 1 ano, 6 meses, 2 meses, 6 semanas, 1 mês, 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias, ou até um dia antes da iniciação do tratamento com o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, aqui descrito, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Não é necessário que o indivíduo tenha respondido ao pré-tratamento com a terapêutica ou terapêuticas anti-neoplásicas anteriores. Assim, o indivíduo que recebe o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio poderá ter respondido ou poderá não ter respondido ao pré-tratamento com a terapêutica anti-neoplásica anterior, ou a uma ou mais das terapêuticas anti-neoplásicas anteriores quando o pré-tratamento compreende terapêuticas anti-neoplásicas múltiplas, por exemplo, cirurgia e quimioterapia; cirurgia e outra terapêutica de anticorpo anti-neoplásica; quimioterapia e outra terapêutica de anticorpo anti-neoplásica; ou cirurgia, quimioterapia e outra terapêutica de anticorpo anti-neoplásica.

Assim, em algumas formas de realização, a invenção proporciona o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui 94 apresentados, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento a utilizar num indivíduo que necessite de tratamento para a LLC, tendo o indivíduo sido pré-tratado com uma ou mais das outras terapêuticas antineoplásicas que se seguem: cirurgia; radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula óssea, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina, clorambucil, cladrabina, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina, ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas tais como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina mais prednisona) e CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona mais doxorubicina); outras terapêuticas antineoplásicas com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®); rituximab (Rituxan®) ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD20; ou anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas); terapêutica com interferão alfa; terapêutica com interleucina-2 (IL-2); terapêutica com IL-12, IL-15 ou IL-21; ou terapêutica com esteróides. "Tratamento", no contexto do uso coordenado de um medicamento tal como aqui descrito com uma ou mais entre outras terapêuticas anti-neoplásicas, é aqui definido como a aplicação ou administração do medicamento ou da outra terapêutica anti-neoplásica a um indivíduo, ou a aplicação ou administração do medicamento ou de outra terapêutica anti-neoplásica a um tecido ou linha celular isolados de um indivíduo, sendo que o indivíduo sofre de uma leucemia linfocítica crónica, um sintoma associado com um tal cancro ou uma predisposição para o desenvolvimento de um tal cancro, sendo o propósito o de curar, aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afectar o cancro, quaisquer sintomas associados ao cancro ou a predisposição para o desenvolvimento do cancro. 95

Os exemplos que se seguem são apresentados com fins

ilustrativos e não com o intuito de limitar a invenção. EXPERIMENTAÇÃO

Introdução

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 usados nos exemplos abaixo são os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12. Os anticorpos anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12 são anticorpos monoclonais (mAcs) anti-humanos do subtipo IgGi humano, gerados por imunização de ratinhos transgénicos portadores do locus de cadeia pesada de IgGi humana e do locus de cadeia leve κ humana (tecnologia Xenomouse®; Abgenix; Fremont, Califórnia). Usaram-se como imunogénio células de insecto SF9 expressando o dominio extracelular do CD40.

Resumidamente, fundiram-se esplenócitos de ratinhos imunizados com células de mieloma murino SP 2/0 ou P 3 x 63Ag8.653 a uma razão de 10:1 usando polietilenoglicol a 50% tal como previamente descrito por de Boer et al. (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. As células fundidas foram ressuspensas em meio IMDM completo suplementado com hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM) , timidina (0,016 mM) e 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts) . As células fundidas foram então distribuídas entre os poços de placas de cultura de tecidos com 96 poços, de modo a que cada poço contivesse em média um hibridoma em desenvolvimento.

Após 10-14 dias, os sobrenadantes das populações de hibridoma foram rastreados quanto à produção de anticorpos específicos. Para o rastreio da produção de anticorpos específicos pelos clones de hibridoma, os sobrenadantes de cada poço foram reunidos num pool e inicialmente testados por ELISA quanto à especificidade da actividade anti-CD40. Os positivos foram então usados para a marcação por fluorescência 96 das células B transformadas por EBV, tal como descrito para o ensaio FACS padrão. As células de hibridoma positivas foram clonadas duas vezes por diluição limitante em IMDM/FBS contendo 0,5 ng/ml de hIL-6.

Fundiram-se um total de 31 baços de ratinho com as células de mieloma de ratinho SP2/0 para gerar 895 anticorpos que reconhecem o CD40 recombinante em ensaios ELISA. Em média, aproximadamente 10% dos hibridomas usando a tecnologia XenoMouse® da Abgenix poderão conter cadeia leve lambda de ratinho em vez de cadeia kappa humana. Os anticorpos contendo cadeia leve lambda de ratinho foram seleccionados e eliminados. Um subconjunto de 260 anticorpos que evidenciou igualmente a ligação ao CD40 da superfície celular foi seleccionado para análise mais completa. Os hibridomas estáveis seleccionados durante uma série de procedimentos de subclonagem foram usados para caracterização mais detalhada através de ensaios de ligação e funcionais.

Os clones de 7 outros hibridomas foram identificados como possuindo actividade antagonista. Com base na sua potência antagonista relativa e nas actividades ADCC, foram seleccionados dois clones de hibridoma para avaliação mais detalhada (Tabela 1 abaixo) . Estes clones são designados por 131.2F8.5.9 (5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12).

Tabela 1. Resumo do conjunto inicial de dados obtidos com os anticorpos IgGl anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12

Hibridoma progenitor Clones de hibridoma Ligação à superfície celular Antagonista ADCC CDC CMCC# Sequência de DNA da região V 131.2F5 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ 12047 Sim 153.8E2 153.8E2D10D6.12.12 +++ +++ ++++ - 12056 Sim A linha de hibridoma de ratinho 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) e a linha de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) foram 97 depositadas na American Type Culture Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209 (USA)] sob os Números de Depósito Patenteado PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Os cDNAs codificando para as regiões variáveis dos anticorpos candidatos foram amplificados por PCR, clonados e sequenciados. As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 são apresentadas nas Figuras IA e 1B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO: 2 (cadeia leve para o mAc CHIR-12.12) e a SEQ ID NO:4 (cadeia pesada para o mAc CHIR-12.12). É apresentada na Figura 1B uma variante para a cadeia pesada do mAc CHIR-12.12 (ver também a SEQ ID NO:5), que difere da SEQ ID NO:4 no facto de possuir um resíduo de serina a substituir o resíduo de alanina da posição 153 da SEQ ID NO:4. As sequências de nucleótidos codificando para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 são apresentadas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO:l (sequência codificante para a cadeia leve para o mAc CHIR-12.12) e a SEQ ID NO:3 (sequência codificante para a cadeia pesada do mAc CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-5.9 são apresentadas nas Figuras 3A e 3B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO:6 (cadeia leve para o mAc CHIR-5.9) e a SEQ ID NO:7 (cadeia pesada para o mAc CHIR-5.9). É apresentada na Figura 3B uma variante para a cadeia pesada do mAc CHIR-5.9 (ver também a SEQ ID NO:8), que difere da SEQ ID NO:7 no facto de possuir um resíduo de serina a substituir o resíduo de alanina na posição 158 da SEQ ID NO:7.

Tal como esperado para os anticorpos que derivam de hibridomas independentes, existe uma variação substancial nas sequências de nucleótidos das regiões determinantes da complementaridade (CDRs). Crê-se que a diversidade na região 98 CDR3 de VH seja a que mais significativamente determina a especificidade do anticorpo.

Tal como evidenciado por análise FACS, os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam-se especificamente ao CD40 humano e podem evitar a ligação do ligando de CD40. Ambos os mAcs podem competir com o ligando de CD40 pré-ligado ao CD40 da superfície celular. A afinidade de ligação do CHIR-5.9 ao CD40 humano é de 1,2 x 10"8 M e a afinidade de ligação do CHIR-12.12 ao CD40 humano é de 5 x IO’10 M.

Os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9 são antagonistas fortes e inibem in vitro a proliferação, mediada pelo ligando de CD40, das células B normais, assim como das células cancerosas de doentes com NHL e LLC. In vitro, ambos os anticorpos destroem as células cancerosas primárias de doentes com NHL, por ADCC. Verificou-se uma actividade antitumoral dependente da dose num modelo de xenotransplante de linfoma humano. A leucemia linfocítica crónica (LLC) a células B é caracterizada pela acumulação in vivo de células B CD5+ de vida prolongada. No entanto, quando cultivadas in vitro, as células de LLC morrem rapidamente por apoptose. Pensa-se que a protecção contra a apoptose in vivo resulte do fornecimento de sinais de sobrevivência provenientes do microambiente. A estimulação de CD40 nas células LLC através do ligando de CD40 foi identificada como um destes sinais de sobrevivência.

Os estudos que se seguem foram efectuados com o fim de determinar se os mAbs antagonistas anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12 exibem as seguintes propriedades: (1) ligação às células de leucemia linfocítica crónica (LLC) em pacientes; (2) promoção da morte celular das células de LLC em pacientes através do bloqueio dos sinais de sobrevivência induzidos pelo ligando de CD40; (3) manifestação de alguma actividade estimuladora/inibidora própria face às células de leucemia 99 linfocítica crónica (LLC); e/ou (4) mediação da ADCC como modo de acção.

Exemplo 1: CHIR-5.9 e CHIR-12.12 Conseguem Bloquear a Sobrevivência e a Proliferação Mediadas por CD40 das Células Cancerosas de Pacientes com LLC

Os anticorpos candidatos conseguem bloquear a sobrevivência e proliferação mediada por CD40 das células cancerosas de pacientes com LLC. As células de pacientes com LLC foram cultivadas em suspensão sobre células CHO fixadas por formaldeido que expressam CD40L, sob dois tipos diferentes de condições: adição de anticorpo IgG de isotipo humano (controlo); e adição do anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou do CHIR-12.12. Todos os anticorpos foram adicionados a concentrações de 1, 10 e 100 μρ/ιηΐ na ausência de IL-4. As contagens de células foram realizadas às 24 e às 48 h através de um ensaio de MTS. Foram recuperados números reduzidos de células a partir das culturas tratadas com CHIR-5.9 (n=6) e das tratadas com CHIR-12.12 (n=2) quando em comparação com o grupo de controlo. As maiores diferenças em números de células entre as culturas tratadas com o mAc anti-CD40 e as culturas tratadas com o anticorpo de controlo foram registadas ao ponto de tempo de 48 h. Estes dados encontram-se resumidos na Tabela 2.

Tabela 2. O efeito dos anticorpos candidatos sobre a sobrevivência e proliferação induzida por CD40 das células cancerosas de pacientes com LLC, segundo medição efectuada 48 horas após a iniciação da cultura

Paciente# Cone. De Acs (pg/ml) Números relativos de células % redução dos números de células IgGl CHIR- 5.9/5.11 CHIR- 12.12 CHIR- 5.9/5.11 CHIR- 12.12 1 1 269,31 25,27 ND 90,62 ND 10 101,58 33,07 ND 67,44 ND 100 130,71 40,16 ND 69,28 ND 2 1 265,55 75,8 ND 71,46 ND 10 227,57 128,5 ND 43,53 ND 100 265,99 6,4 ND 97,59 ND 100 3 1 85, 9 35,39 ND 58,80 ND 10 70,44 39,51 ND 43,91 ND 100 77,65 20,95 ND 73,02 ND 4 1 80,48 15,03 ND 81,32 ND 10 63,01 19,51 ND 69,04 ND 100 55,69 3, 65 ND 93,45 ND 5 1 90,63 91,66 89,59 -1,14 1,15 10 78,13 82,28 60,41 -5,31 22,68 100 63,53 86,47 39,59 -36,11 37,68 6 1 130,21 77,6 71,88 40,40 44,80 10 131,77 78,13 73,96 40,71 43,87 100 127,08 76,56 82,29 39,75 35,25 *% redução comparada com Acs de controlo=100-(Acs de teste/Acs de controlo)*100 _

Um segundo estudo revelou resultados similares. Neste estudo, as células primárias de LLC de 9 pacientes foram cultivadas em suspensão sobre células CHO fixadas por formaldeido que expressam CD40L, na presença ou na ausência de 1, 10, ou 100 μς/πιΐ do mAc anti-CD40 CHIR-12.12, tal como acima descrito, usando IgG não especifica como controlo. Após 48 e 72 horas, a proliferação das culturas foi medida tal como acima referido. Na ausência do mAc anti-CD40 CHIR-12.12, as células primárias de LLC ou resistiram à morte celular espontânea ou proliferaram. Este efeito foi inibido na presença do mAc CHIR-12.12, o qual restabeleceu a morte das células de LLC. Assim, estes resultados demonstram que a proliferação das células de LLC induzida por CD40 é inibida pelo mAc anti-CD40 CHIR-12.12 tanto às 48 como às 72 horas. Ver as Figuras 5A e 5B.

Foram efectuadas experiências semelhantes em células de LLC não estimuladas na presença do mAc CHIR-12.12 isolado. O mAc CHIR-12.12 (10 μς/ιηΐ) isolado não induziu a proliferação da LLC e, deste modo, não teve um efeito estimulador sobre as células de LLC quando comparado com a IgG de controlo (10 μρ /ml) às 48 e 72 horas. Ver as Figuras 6A e 6B. 101

Exemplo 2: Capacidade do mAc Anti-CD4Q CHIR-12.12 para Lisar as Linhas Celulares de Leucemia Linfocltica Crónica (LLC) por Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo (ADCC) A linha celular de LLC EHEB foi cultivada com o mAb antagonista anti-CD40 CHIR-12.12 ou com o anticorpo anti-CD20 Rituxan® (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, Califórnia) e com células NK humanas, isoladas de fresco a partir de doações de sangue de voluntários normais, como células efectoras. A percentagem de lise especifica foi medida com base na libertação de marcador pelas células alvo. 0 mAc anti-CD40 CHIR-12.12 exibiu actividade de lise de modo dependente da dose e atingiu niveis máximos de lise à concentração de 0.1 μg/ml (Figura 7). Tal como mostra a Figura 7, o mAc CHIR-12.12 induziu uma maior lise celular mediada por ADCC do que o anticorpo Rituxan® (lise especifica máxima com mAc CHIR-12.12 = 27,2% versus lise específica máxima com Rituxan® = 16,2%; p=0.007). Com base nestes resultados, verificou-se estarem presentes nas células alvo aproximadamente 10 vezes mais locais de ligação para o anticorpo anti-CD20 do que para o anticorpo anti-CD40 (ver Tabela 3), o que indica que a linha celular de LLC EHEB expressa menos moléculas CD40 em comparação com a expressão de CD20. De facto, a linha celular alvo de LLC expressou 509.053113.560 moléculas de CD20 em comparação com 48.4161584 moléculas de CD40. Assim, a superior ADCC mediada pelo mAc CHIR-12.12 não se deveu à maior densidade de moléculas de CD40 nesta linha celular de LLC em comparação com as moléculas de CD20. 102

Tabela 3: razão entre os locais de ligação na linha celular alvo EHEB.

Linha Celular % Máxima de Lise Razão entre os locais de ligação máximos de CD20/CD40 mAc CHIR 12.12 Rituxan® EHEB 27,19 16,21 10,51

Exemplo 3: CHIR-5.9 e CHIR-12.12 Ligam-se a um Epitopo no CD40 que é Diferente do de 15B8

Os anticorpos candidatos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 competem entre si para a ligação ao CD40 mas não competem com 15B8, um mAc anti-CD40 IgG2 (ver Publicação Internacional N° WO 02/28904). Foram concebidos estudos de ligação competitiva de anticorpos usando Biacore que utilizam chips biosensores CM5 com proteina A imobilizada através de acoplamento por amina, tendo a proteina A imobilizada sido usada para capturar os anticorpos anti-CD40, CHIR-12.12 ou 15B8. Observaram-se curvas normais de associação/dissociação com concentrações variáveis de CD40-his (dados não apresentados). Para os estudos de competição, CHIR-12.12 ou 15B8 foram capturados à superfície da proteína A. Subsequentemente foi passado um fluxo do complexo Fab CD40-his/CHIR-5.9 (100 nM CD40:1 μΜ Fab de CHIR-5.9), a concentrações variáveis, sobre a superfície modificada. No caso de CHIR-12.12, não se observou a associação do complexo, o que indica que CHIR-5.9 bloqueia a ligação de CHIR-12.12 ao CD40-his. Com o anticorpo 15B8, observou-se a associação do complexo Fab de CHIR-5.9, o que indica que CHIR-5.9 não bloqueia a ligação de 15B8 ao local de ligação no CD40. No entanto, a taxa de deslocamento do complexo aumentou de forma muito marcada (dados não apresentados).

Foi igualmente determinado que os anticorpos 15B8 e CHIR-12.12 não competem para a ligação ao CD40-his. Esta experiência foi efectuada capturando o anticorpo CHIR-12.12 103 sobre o chip biosensor com proteína A, bloqueando os locais de ligação residuais da proteína A com hlgGi de controlo, promovendo a ligação com CD40-his e seguidamente fazendo passar um fluxo de 15B8 sobre a superfície modificada. 0 anticorpo 15B8 ligou-se sob estas condições, o que indica que CHIR-12.12 não bloqueia a ligação de 15B8 ao CD40.

Exemplo 4: Propriedades de Ligação dos mAc CHIR-12.12 e CHIR- 5.9 A proteína A foi imobilizada sobre os chips biosensores CM5 através de acoplamento por amina. Os anticorpos monoclonais humanos anti-CD40, a 1,5 μρ/ιηΐ, foram capturados à superfície modificada do biosensor durante 1,5 minutos a 10 μΐ/min. Fez-se passar um fluxo de CD40-his recombinante solúvel sobre a superfície do biosensor a diversas concentrações. O anticorpo e o antigénio foram diluídos em HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% Surfactante P20 (HBS-EP). Foram determinadas as constantes cinéticas e de afinidade usando o software Bioevaluation com um modelo de interacção/ajuste global de 1:1.

Tal como mostra a Tabela 4, abaixo, existe uma diferença de 121 vezes entre a taxa de deslocamento de CHIR-5.9 e o de CHIR-12.12, resultando numa afinidade 24 vezes superior do anticorpo CHIR-12.12.

Tabela 4. Resumo das propriedades de ligação dos anticorpos anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12.

Anticorpo ka(M-l seg-1) kd (seg-1) KD (nM) Anti-CD40, CHIR-5.9 (12,35+0,64)xl05 (15,0 ± 1,3) xl0~3 12,1510,35 Anti-CD40, CHIR-12.12 (2,41±0,13)xlO5 (1,24 ± 0,06) xl0~4 0,51+ 0,02 104

Para determinar a localização do epitopo de CD40 que é reconhecido pelos anticorpos monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9, foram realizadas análises por SDS-PAGE e Western Blot. Usou-se CD40 purificado (0,5 μς) que foi separado num gel NUPAGE a 4-12% sob condições redutoras e não redutoras, transferido para membranas de PVDF e sondado com anticorpos monoclonais à concentração de 10 μς/ιηΐ. Os blots foram sondados com IgG anti-humana conjugada com fosfatase alcalina e desenvolvidos usando o substrato estabilizado para a fosfatase alcalina Western Blue® (Promega).

Os resultados indicam que o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 reconhece epitopos tanto na forma reduzida como na forma não reduzida de CD40, sendo que a forma não reduzida de CD40 exibe uma maior intensidade do que a forma reduzida de CD40 (Tabela 5; blots não apresentados). O facto de o reconhecimento ser positivo para ambas as formas de CD40 indica que este anticorpo interage com um epitopo conformacional do qual uma parte corresponde a uma sequência linear. O anticorpo monoclonal CHIR-5.9 reconhece principalmente a forma não reduzida de CD40, sugerindo que este anticorpo interage com um epitopo principalmente conformacional (Tabela 5; blots não apresentados).

Tabela 5. Identificação de domínios.

Domínio 1 Domínio 2 Domínio 3 Domínio 4 mAc CHIR.12.12 - + - - mAc CHIR-5.9 - + - - mAc 15B8 + - - -

Para mapear a região antigénica de CD40, os quatro domínios extracelulares de CD40 foram clonados e expressos em células de insecto sob a forma de proteínas de fusão com GST. 105 A secreção dos quatro domínios foi assegurada com um sinal de secreção de GP67. 0 sobrenadante das células de insecto foi analisado por SDS-PAGE e Western Blot para identificar o domínio que continha o epitopo. 0 anticorpo monoclonal CHIR-12.12 reconhece um epitopo no Domínio 2 tanto em condições redutoras como em condições não redutoras (Tabela 6; blots não apresentados). Por contraste, o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 exibe um reconhecimento muito fraco do Domínio 2 (Tabela 6; blots não apresentados). Nenhum destes anticorpos reconheceu os Domínios 1, 3 ou 4 nesta análise.

Tabela 6. Análise do Domínio 2. C. redutoras C. não redutoras mAc CHIR.12.12 ++ +++ mAc CHIR-5.9 + +

Para definir com maior precisão o epitopo reconhecido pelo mAc CHIR-12.12, sintetizaram-se péptidos do Domínio Extracelular 2 de CD40, que corresponde à sequência PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (resíduos 61-104 da sequência apresentada em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12). Foram geradas membranas SPOTs (Sigma) contendo trinta e cinco péptidos lOmeros com um offset de 1 aminoácido. Foi efectuada uma análise por Western Blot com mAc CHIR-12.12 e beta-galactosidase-IgG anti-humana como anticorpo secundário. Procedeu-se ao stripping do blot e este foi re-sondado com mAc CHIR-5.9 para determinar a região reconhecida por este anticorpo. Na análise de SPOTs, a sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 a 10 μρ/ΓηΙ forneceu reacções positivas nas manchas 18 a 22. A região de sequência abrangida por estes péptidos é apresentada na Tabela 7. 106

Tabela 7. Resultados da sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 na análise de SPOTs.

Mancha Região de Sequência número 18 HQHKYCDPNL (resíduos 78-87 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO: 12) 19 QHKYCDPNLG (resíduos 79-88 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:12) 20 HKYCDPNLGL (resíduos 80-89 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 21 KYCDPNLGLR (resíduos 81-90 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 22 YCDPNLGLRV (resíduos 82-91 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12)

Estes resultados correspondem a um epitopo linear de: YCDPNL (resíduos 82-87 da sequência apresentada em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID N0:12). Este epitopo contém Y82, D84 e N86, previstos como estando envolvidos na interacção CD40-ligando de CD40. A análise de SPOTs com o mAc CHIR-5.9 evidenciou um fraco reconhecimento dos péptidos representados pelas manchas 20-22 e mostrados na Tabela 8, sugerindo o envolvimento da região YCDPNLGL (resíduos 82-89 da sequência apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12) na sua ligação ao CD40. Deve notar-se que os mAcs CHIR-12.12 e CHIR-5.9 competem entre si para a ligação ao CD40 na análise de BIACORE.

Tabela 8. Resultados da sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9 na análise de SPOTs.

Mancha número Região de Sequência 20 HKYCDPNLGL (resíduos 80-89 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 21 KYCDPNLGLR (resíduos 81-90 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 22 YCDPNLGLRV (resíduos 82-91 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12)

Os epitopos lineares identificados pelas análises de SPOTs encontram-se no módulo Bl de CD40. A sequência do módulo BI de CD40 é: 107 HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (resíduos 80-103 da SEQ ID NO:10 ou da SEQ ID NO:12).

No interior do epitopo linear identificado para o CHIR-12.12 encontra-se C83. Sabe-se que este resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfito com C103. É provável que o epitopo conformacional do mAc CHIR-12.12 contenha esta ligação dissulfito (C83-C103) e/ou os aminoácidos circundantes que se encontram conformacionalmente perto de C103.

Exemplo 6: CHIR-12.12 Bloqueia as Vias de Sobrevivência e Sinalização de CD40 Mediadas por CD40L em Células B Humanas Normais O ligando de CD40 solúvel (CD40L) activa as células B e induz vários aspectos das respostas funcionais, incluindo o aumento da sobrevivência e da proliferação e a activação das vias de sinalização de NFkB, ERK/MAPK, PI3K/Akt e p38. Adicionalmente, a estimulação de CD40 mediada por CD40L proporciona sinais de sobrevivência através da redução da clivagem de PARP e da indução das proteínas anti-apoptóticas, XIAP e Mcl-1, em células B normais. A estimulação de CD40 mediada por CD40L recruta igualmente TRAF2 e TRAF3 para a ligação ao domínio citoplasmático de CD40.

Os estudos que se seguem demonstram que CHIR-12.12 inibiu directamente todos estes efeitos de estimulação em células B humanas normais. Por exemplo, o tratamento com CHIR-12.12 resultou no aumento da clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP, assim como na redução de XIAP e de Mcl-1 de um modo dependente do tempo e da dose, restabelecendo a apoptose das células B. O tratamento com CHIR-12.12 inibiu também a fosforilação da quinase IkB (IKK) α e β (via NFkB) , ERK, Akt e p38 em resposta à estimulação de CD40 mediada por CD40L.

Adicionalmente, verificou-se que CHIR-12.12 não desencadeava 108 estes efeitos apoptóticos sem uma estimulação inicial de CD40 mediada por CD40L. CHIR-12.12 inibiu a sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 através da indução da clivagem de PARP.

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 μς/ιηΐ de sCD4 0L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR-12.12 (10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0, 20 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas. Detectou-se caspase-9 clivada, caspase-3 clivada, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, observou-se que a estimulação de CD40 mediada por CD40L proporcionou sinais de sobrevivência, uma vez que não resultou no aumento dos níveis de caspase-9 clivada, caspase-3 clivada ou PARP clivada ao longo do tempo, o que indica que as células não estavam a sofrer apoptose. No entanto, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento destes produtos de clivagem, indicando que o tratamento com CHIR-12.12 anulou os efeitos da ligação do ligando de CD40 sobre a sinalização de sobrevivência em células B normais estimuladas por sCD40L, restabelecendo a apoptose das células B (dados não apresentados). O mAc CHIR-12.12 inibiu a expressão de proteínas anti-apoptóticas de "sobrevivência".

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 μρ/πιΐ de SCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR-12.12 (10 μg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0, 20 109 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas. Detectou-se Mcl-1, XIAP, CD40 e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares. Abreviadamente, a estimulação por sCD40L resultou numa expressão mantida de Mcl-1 e de XIAP ao longo do tempo. No entanto, o tratamento das células estimuladas por sCD40L com CHIR-12.12 resultou numa diminuição da expressão destas proteínas ao longo do tempo (dados não apresentados) . Uma vez que Mcl-1 e XIAP constituem sinais "de sobrevivência" capazes de bloquear a via apoptótica, estes resultados demonstram que o tratamento com CHIR-12.12 remove o bloqueio contra a apoptose em células B normais estimuladas por sCD40L. 0 tratamento com CHIR-12.12 inibiu a fosforilação de ΐκκα (Serl80) e de IKK β (Ser 181) em células B normais.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 μρ/ιηΐ de sCD4 0L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR-12.12 (10

Hg/ml) e igG de controlo. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se IKKot (Serl80) e ΙΚΚβ (Ser 181) fosforilados e controlos de ΙΚΚβ total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, a estimulação por SCD40L resultou na fosforilação de IKKa (Ser 180) e IKK β (Ser 181) ao longo do tempo; no entanto, o tratamento com CHIR-12.12 anulou esta resposta à estimulação por sCD40L em células B normais (dados não apresentados). O tratamento com CHIR-12.12 inibiu a sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 num modo dependente da dose.

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) 110 foram estimuladas com 1 μς/ιηΐ de SCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 μς/ιηΐ) e IgG de controlo. As células foram colhidas às 24 horas. Detectou-se PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento da clivagem de PARP em células estimuladas por sCD40L de um modo dependente da dose, anulando deste modo a via de sinalização de sobrevivência em células B normais estimuladas por sCD40L (dados não apresentados). CHIR-12.12 inibiu a expressão de proteínas anti-apoptóticas "de sobrevivência" num modo dependente da dose.

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 μg/ml de SCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, uK). Foram então adicionados CHIR-12.12 (0,5, 2 e 10 μς/ιτιΐ) e IgG de controlo. As células foram colhidas às 22 horas. Detectou-se Mcl-1, XIAP, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, o tratamento com CHIR-12.12 reduziu a expressão de Mcl-1 e XIAP e aumentou a expressão de PARP clivada em células estimuladas por sCD40L de um modo dependente da dose, anulando assim estes bloqueios à via apoptótica em células B normais estimuladas por sCD40L (dados não apresentados). CHIR-12.12 não afectou a expressão de proteínas anti-apoptóticas, parp clivada e xiap na ausência de sinalização com CD40L solúvel.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) 111 foram tratadas com CHIR-12.12 (10 μς/ιηΐ) e IgG de controlo (i.e., as células não foram pré-estimuladas com sCD40L antes da adição de anticorpo). As células foram colhidas às 0, 4, 14 e 16 horas. Detectou-se XIAP, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, os resultados mostram que, sem a estimulação por SCD40L, as células expressaram concentrações aumentadas de PARP clivada enquanto que a expressão de XIAP permaneceu constante, tanto nas células tratadas com a IgG de controlo como nas tratadas com CHIR-12.12 (dados não apresentados). Estes dados indicam que CHIR-12.12 não desencadeia a apoptose em células B humanas normais sem estimulação por CD40L. CHIR-12.12 inibe a fosforilação de iKKa (Ser 180) e ΐκκβ (Ser 181), Akt, ERK e p38 em células B normais.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 μρ/πιΐ de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). As culturas foram tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 μg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se fosfo-IKKa, fosfo-ΙΚΚβ, ΙΚΚβ total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-p38 e p38 total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, a estimulação por sCD40L resultou no incremento da fosforilação de ΙΚΚα/β, da fosforilação de ERK, da fosforilação de Akt e da fosforilação de p38, deste modo conduzindo à sobrevivência e/ou proliferação das células. O tratamento das células com CHIR-12.12 anulou os efeitos da 112 estimulação por sCD40L sobre estas vias de sinalização em células B normais (dados não apresentados). CHIR-12.12 Inibe as vias de sinalização múltipla, tais como as vias de PI3K e MEK/ERK, na cascata de sinalização de CD40.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 μς/ιηΐ de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). As culturas foram também tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 μg/ml), Wortmanin (um inibidor de PI3K/Akt, 1 e 10 μΜ), LY 294002 (um inibidor de PI3K/Akt, 10 e 30 μΜ) e PD 98095 (um inibidor de MEK, 10 e 30 μς/ιηΐ) . As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-ΙΚΚα/β, e total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, os resultados mostram que a estimulação com CHIR-12.12 anulou a fosforilação de todas estas moléculas de transdução de sinal, enquanto que os inibidores da transdução de sinal exibiram apenas uma anulação especifica da sinalização, indicando que a inibição por CHIR-12-12 se exerce provavelmente a montante destas moléculas de transdução de sinal mediadas pela estimulação por CD40L (dados não apresentados). CHIR-12.12 inibe a ligação das moléculas de sinalização TRAF2 e TRAF3 ao domínio citoplasmático de CD40 em células B normais.

Nestas experiências, 4,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro durante 4 horas em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 μg/ml de sCD40L 113 (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) durante 20 minutos. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. O CD40 foi imunoprecipitado usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), e foi sondado num Western Blot com mAc anti-TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA) , mAc anti-TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA) e mAc anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Abreviadamente, os resultados mostram que TRAF2 e TRAF3 co-precipitaram com CD40 após a estimulação por SCD40L. Por contraste, o tratamento com CHIR-12.12 anulou a formação do complexo de sinalização CD40-TRAF2/3 em células B normais estimuladas por SCD40L. Não ocorreram alterações da expressão de CD40 (dados não apresentados).

Sem que se pretenda uma limitação a qualquer teoria, os resultados destas experiências, e os resultados nos exemplos acima expostos, indicam que o anticorpo CHIR-12.12 é um anticorpo monoclonal antagonista anti-CD40 de dupla acção que possui uma combinação única de atributos. Este anticorpo monoclonal inteiramente humano bloqueia as vias de sinalização por CD40 mediadas por CD40L dirigidas à sobrevivência e proliferação de células B; este antagonismo conduz em última instância à morte celular. CHIR-12.12 medeia igualmente o reconhecimento e a ligação pelas células efectoras, iniciando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Uma vez estabelecida a ligação entre CHIR-12.12 e as células efectoras, são libertadas enzimas citoliticas, conduzindo à apoptose e lise das células B. CHIR-12.12 evidenciou-se como um anticorpo antitumoral mais potente do que o rituximab nas comparações efectuadas em modelos tumorais pré-clínicos. 114

Exemplo 7: Formulação Farmacêutica Líquida para os Anticorpos

Antagonistas Anti-CD40 0 objectivo deste estudo foi o de investigar os efeitos do pH da solução sobre a estabilidade do anticorpo antagonista anti-CD40 CHIR-12.12, recorrendo a métodos biofísicos e bioquímicos para seleccionar o meio óptimo de solução para este anticorpo. Os resultados da Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) mostraram que a estabilidade de conformação de CHIR-12.12 é óptima em formulações com um pH de 5,5-6,5. Com base numa análise resultante da combinação de SDS-PAGE, HPLC de exclusão molecular (SEC-HPLC) e HPLC de troca catiónica (CEX-HPLC), determinou-se que a estabilidade fisicoquímica de CHIR-12.12 é óptima a um pH de cerca de 5,0-5,5. Tendo em vista estes resultados, uma formulação farmacêutica líquida recomendada compreendendo este anticorpo corresponderá a uma formulação contendo CHIR-12.12 a cerca de 20 mg/ml formulado em cerca de 10 mM de succinato de sódio, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e possuindo um pH de cerca de 5,5.

Materiais e Métodos O anticorpo CHIR-12.12 usado nos estudos de formulação é um anticorpo monoclonal humano produzido através de um processo de cultura de células CHO. Este mAc tem um peso molecular de 150 kDa e consiste em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas entre si por ligações dissulfito. O anticorpo dirige-se contra o receptor de superfície celular CD40 presente em células que expressam CD40, incluindo células B normais e malignas, com o fim de tratar diversos cancros e doenças autoimunes/inflamatórias. A substância farmacológica anti-CD40 usada neste estudo foi um lote de anti-CD40 (CHIR-12.12) purificado derivado de células CHO. A composição da substância farmacológica foi de 115 9,7 mg/ml de anticorpo CHIR-12.12 em 10 mM de citrato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio a pH 6,5. A amostra de controlo neste estudo correspondeu à substância farmacológica recebida, que foi congelada a ^ - 60°C, descongelada à TA e testada juntamente com amostras de teste da estabilidade a pontos de tempo pré-determinados. As amostras para teste da estabilidade foram preparadas por diálise da substância farmacológica contra soluções de diferentes pH e a concentração de CHIR-12.12 em cada amostra foi determinada por UV 280, tal como apresentado na Tabela 9.

Tabela 9. Formulações de CHIR-12.12.

Composição do Tampão pH Concentração de CHIR-12.12 (mg/ml) 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio LO 9,0 10 mM succinato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 5,0 9,3 10 mM succinato de sódio, 150 mM cloreto de sódio LO LO 9,2 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 6,0 9,7 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 6,5 9,4 10 mM fosfato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 7,0 9,4 10 mM fosfato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 7,5 9,5 10 mM glicina, 150 mM cloreto de sódio 9,0 9,5 A estabilidade fisicoquímica do anticorpo CHIR-12.12 nas diversas formulações foi ensaiada usando os protocolos que se seguem.

Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) A estabilidade conformacional das diferentes amostras de formulação foi monitorizada usando um VP-DSC MicroCal com aquecimento entre 15°C e 90°C a l°C/min. 116

SDS-PAGE A fragmentação e agregação foram estimadas usando um gel de Tris-Glicina a 4-20% sob condições não redutoras e redutoras. A proteína foi detectada por coloração com azul de Coomassie.

Cromatoqrafia de Exclusão Molecular (SEC-HPLC) A fragmentação e agregação da proteína foram igualmente medidas por um aparelho de HPLC Water Alliance com uma coluna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 como fase móvel a uma taxa de fluxo de 0,7 ml/min.

Cromatografia de Troca Catiónica (CEX-HPLC) A degradação relacionada com a alteração de carga foi medida usando um sistema de HPLC Waters 600s com uma coluna

Dionex Propac WCX-10, com HEPES 50 mM, pH 7,3 como fase móvel A e HEPES 50 mM contendo NaCl 500 mM, pH 7,3 como fase móvel B, a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min.

Resultados e discussão

Estudo de estabilidade conformacional. O desdobramento térmico de CHIR-12.12 revelou pelo menos duas transições térmicas, provavelmente representando a fusão por desdobramento dos domínios Fab e Fc, respectivamente. A temperaturas superiores, a proteína provavelmente sofreu agregação, resultando na perda do sinal de DSC. Para fins de avaliação da formulação, a temperatura de transição térmica mais baixa foi definida como correspondendo à temperatura de fusão, Tm, neste estudo. A Figura 8 mostra a temperatura de fusão térmica como função dos pHs da formulação. As formulações a pH 5,5-6,5 forneceram anti-CD40 com uma estabilidade conformacional superior, tal como demonstrado pelas temperaturas de fusão térmica mais elevadas. 117

Análise por SDS-PAGE.

As amostras da formulação de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 foram incubadas a 40°C durante 2 meses e foram submetidas a análise por SDS-PAGE (dados não apresentados). Sob condições não redutoras, foram observadas espécies com pesos moleculares (PM) de 23 kDa e 2,7 kDa nas formulações com pH acima de 5,5, tendo-se observado espécies com PM de 51 kDa em todas as formulações, mas aparecendo menos a pH 5,0-5,5. Surgiu uma espécie com PM de 100 kDa a pH 7,5 e a pH 9,0.

Sob condições redutoras, CHIR-12.12 foi reduzido a cadeias pesadas e cadeias leves livres com PMs de 50 kDa e de 24 kDa, respectivamente. A espécie de 100 kDa pareceu não ser completamente redutível e aumentou com o aumento do pH da solução, sugerindo a possível ocorrência de uma associação covalente não-dissulfito nas moléculas. Uma vez que surgiram outras espécies com identidades desconhecidas na análise por SDS-PAGE, a comparação da estabilidade de cada formulação é baseada na pureza remanescente de CHIR-12.12. As formulações a pH 5,0-6,0 proporcionaram um meio mais estável para CHIR-12.12. Foram detectados poucos agregados por SDS-PAGE (dados não apresentados) .

Análise por SEC-HPLC. A análise por SEC-HPLC detectou o CHIR-12.12 intacto como a espécie do pico principal, uma espécie de agregação como espécie de um pico dianteiro separada da espécie do pico principal, uma espécie de grande fragmento como um pico de "ombro" precedendo a espécie do pico principal, e espécies de pequenos fragmentos foram detectadas após a espécie do pico principal. Após incubação a 5°C e a 25°C durante 3 meses, foram detectadas quantidades negligíveis de fragmentos e de agregados de proteínas (< 1,0%) nas formulações acima e a espécie CHIR-12.12 do pico principal permaneceu com uma pureza 118 superior a 99% (dados não apresentados). No entanto, desenvolveram-se gradualmente fragmentos de proteínas por armazenagem a 40°C, e mais fragmentos se formaram a pH 4,5 e a pH 6,5-9,0, tal como mostra a Tabela 10. Após incubação das formulações de CHIR-12.12 a 40°C durante 3 meses, foram detectados cerca de 2-3% de agregados a pH 7,5 e a pH 9,0, enquanto que nas formulações a outros pH se detectaram menos de 1% de agregados (dados não apresentados) . Os resultados de SEC-HPLC indicam que CHIR-12.12 é mais estável ao pH de cerca de 5,0-6,0.

Tabela 10. Resultados de SEC-HPLC das amostras de estabilidade de CHIR-12.12 sob condições de armazenagem em tempo real e aceleradas.

Amostra % Pico principal % Fragmentos t=0 O O n O O n 40°C t=0 40°C 40°C 40°C lm 2m 3m lm 2m 3m Controlo 99,4 99,2 99, 9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 pH 4,5 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1 pH 5,0 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2 pH 5,5 99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8 pH 6,0 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7 pH 6,5 99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0 5, 6 9,9 12,4 pH 7,0 99,2 93,9 87,4 85,1 <1,0 5,5 11,1 13,5 pH 7,5 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2 pH 9,0 99,3 82,4 61,6 50,6 <1,0 15,4 36,2 47,6

Análise por CEX-HPLC. A análise por CEX-HPLC detectou o CHIR-12.12 intacto como formando a espécie do pico principal; as variantes acídicas eluíram mais cedo do que a espécie do pico principal e as variantes de adição C-terminal de lisina eluíram após a espécie do pico principal. A tabela 11 mostra a dependência que as percentagens da espécie remanescente de CHIR-12.12 do 119 pico principal e das variantes acidicas manifestam relativamente ao pH da solução. A amostra de controlo continha já um elevado grau de espécies acidicas (~33%), provavelmente devido a processos de fermentação e purificação ocorridos em fases precoces. A susceptibilidade de CHIR-12.12 a soluções de pH mais elevado é evidenciada por dois factos. Em primeiro lugar, a amostra da formulação inicial a pH 9,0 (t=0) gerou à partida mais 12% de espécies acidicas do que o controlo. Em segundo lugar, a percentagem de espécies acidicas registou um aumento acentuado com o aumento de pH. A degradação relacionada com a mudança de carga é provavelmente devida a desamidação. Os dados acima indicam que este tipo de degradação de CHIR-12.12 foi minimizada no intervalo de pH de cerca de 5,0-5,5.

Tabela 11. Percentagem da área de pico por CEX-HPLC para o mAc CHIR-12.12 em diferentes formulações de pH sob condições de armazenagem em tempo real e aceleradas.

Amostra % Pico principal % Variantes acidicas 5°C 25°C 40°C O O O 5°C 25°C 40°C 40°C t=0 3m 3m lm 2m t=0 3m 3m lm 2m Control 0 49,2 49,8 49,8 49,2 50,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6 pH 4,5 48,5 49,7 43,7 39,7 30,0 32,5 32,6 38,0 44,2 56,4 pH 5,0 49, 6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 35,0 44,3 57,1 pH 5,5 50,7 50,3 48,1 40,0 30,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3 pH 6,0 50,2 49, 9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38,5 54,9 72,7 pH 6,5 49, 4 49, 9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 65,2 84,6 pH 7,0 49, 7 49, 9 21,9 - - 34,4 36,4 64,4 - - pH 7,5 49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40,1 79,2 - - pH 9,0 41,3 31,8 - - - 44,7 59,9 - - - 120

Conclusão 0 pH tem um efeito significativo sobre as estabilidades conformacional e fisicoquímica de CHIR-12.12. A degradação relacionada com a mudança de carga foi determinada como sendo a principal via de degradação de CHIR-12.12, tendo esta sido minimizada a pH 5,0-5,5. Com base nos dados globais de estabilidade, uma formulação farmacêutica liquida recomendada compreendendo este anticorpo será uma formulação compreendendo CHIR-12.12 a cerca de 20 mg/ml formulado em cerca de 10 mM de succinato de sódio, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e possuindo um pH de cerca de 5,5.

Exemplo 8: Estudos Clínicos com CHIR-5.9 e CHIR-12.12

Objectivos Clínicos O objectivo global é o de proporcionar uma terapêutica eficaz para leucemia linfocítica crónica através do direccionamento contra esssas células cancerígenas com um IgGl anti-CD40. O sinal para estas doenças é determinado na fase II, se bem que algumas medidas de actividade possam ser obtidas na fase I. Inicialmente o agente é estudado como agente único, mas será combinado com outros agentes, com quimioterápicos e radioterapia, à medida que prossegue o desenvolvimento.

Fase I • Avaliação da segurança e da farmacocinética - escalamento da dose em indivíduos com neoplasias de leucemia linfocítica crónica (LLC). • Escolha de doses baseada na segurança, tolerabilidade e alteração nos marcadores séricos de CD40. Em geral é procurada uma dose terapêutica média, mas poderá ser adequado reunir outras indicações de eficácia (deplecção 121 em células LLC CD40+, etc) para o estabelecimento da dose. • Consideração do uso de mais do que uma dose, pois poderá ser necessário transferir algum estabelecimento da dose para a fase II. • A dosagem para os pacientes é estabelecida semanalmente através de amostragem farmacocinética em tempo real (Pk). Inicialmente, um ciclo de 4 semanas corresponde à dosagem máxima permitida. A Pk poderá ser altamente variável, dependendo do estado da doença, da densidade de CD40, etc. • Este(s) ensaio(s) é(são) aberto(s) a indivíduos com LLC. • A decisão de descontinuar ou continuar os estudos baseia-se na segurança, na dose e nas indicações preliminares de actividade antitumoral. • A actividade do fármaco, determinada através da taxa de resposta, é determinada na Fase II. • Identificar a(s) dose(s) para a Fase II.

Fase II

Serão iniciados diversos ensaios clínicos em indivíduos com LLC. Mais do que uma dose, e mais do que um regime poderá ser testado num ambiente randomizado de fase II. • Estabelecer como alvo uma população de LLC que tenha falhado na resposta ao tratamento padrão actualmente usado (falhas da quimioterapia) </ A decisão de descontinuar ou continuar o estudo é baseada na prova do conceito terapêutico na Fase II ✓ Determinar se um marcador substituto pode ser usado como indicador precoce da eficácia clínica 122

* Identificar doses para a Fase III

Fase III A fase III dependerá da altura em que o sinal for detectado na fase II, e das terapêuticas competidoras que são consideradas como padrão de referência. Se o sinal surgir numa fase da doença para a qual não exista terapêutica de referência, então poderá delinear-se um ensaio-pivô de um só braço e bem controlado. Se existirem terapêuticas competidoras que são consideradas como terapêuticas de referência, então serão realizados estudos comparativos. Os peritos no campo técnico a que pertencem estas invenções reconhecerão a possibilidade de efectuar muitas modificações e de criar outras formas de realização das invenções aqui apresentadas, tomando como base os ensinamentos apresentados nesta descrição e nas Figuras. Assim, deve depreender-se que as invenções não devem ser limitadas às formas de realização especificas que foram apresentadas, e que as modificações e outras formas de realização possíveis são entendidas como pertencendo ao âmbito das reivindicações anexas e das formas de realização aqui expostas. Se bem que nesta exposição se tenham utilizado alguns termos específicos, estes foram usados apenas num sentido genérico e descritivo e não com fins limitativos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Aukerman, Lea Long, Li

Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel 123 <12 Ο > Uso de Anticorpos Monoclonais Antagonistas Anti-CD40 para o Tratamento da Leucemia Linfocitica Crónica <130> PP22708.002 (284267) <150> 60/611,794 <151> 2004-09-21 <150> 60/565,710 <151> 2004-04-27 <150> 60/525,579 <151> 2003-11-26 <150> 60/517,337 <151> 2003-11-04 <160> 12 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1

<211> 720 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência codificante para a cadeia leve do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 <221> CDS <222> (1)...(720) 124 < 4 Ο Ο > 1 atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg 999 ctg cta atg ctc tgg gtc tet 48 Met Ala Leu Pr© Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Vai Ser i 5 10 15 99» tcc agt ggg gat att gtg atg set cag tet cca ctc tcc ctg acc $6 Gly Ser Ser Gly Asp Ilé Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 gtc acc cct gga gag ccg gee tcc ate tcc tgc agg tcc agt cag age 144 V«1 Thr Pro Gly Glu Pr© Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 etc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tvr As n Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag gtc ctg ate tet ttg ggt tet aat «99 çcc 240 Pro Gly 01 n Ser Pro Gin Vai Leu lie Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 55 70 75 eo tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Vai Pro Aap Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 50 55 125 336 aca ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac Thr Leu LyS Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 10Q 105 110 tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggC CCt ggg aec aaa Cys Môt Gin Ala Arg Gin Thr PrO Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtg gat ate aga cga act gtg gct gea cca tet gte ttc ate ttc c-cg Vai Asp lie Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe ile Phe Pro 130 135 140 cca tet gat oag caq ttg aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Âlâ Ser Val Val Cys Leu 1.45 150 155 160 ctg aat aac ttc tat ecc aga gag gee aaa gta eag tgg aag gtg gat teu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Ãsp 165 170 175 aac gee etc caa teg ggt aac tcc. eag gag agt gte aca ç*g eag gac Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 180 185 190 age aag gac age aec tac age etc age age aec ctg acg ctg age ôc3â Sei Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser The Leu Thr Leu Ser Lys 135 200 205 gea gac tac gag aaa cac aaa gte tac gee tgc gaa gte aec cafc eag Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 210 215 220 ggc ctg age teg cec gte aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys * 225 230 235 384 4 32 480 528 576 €24 672 720

<210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve do anticorpo humano anti-CD40 12.12 <400> 2 126

Mefc Ala Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Lee Met Leu Tcp Vai Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Vai Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 7U 75 BQ Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys X le Ser Arg vai Glu Ala GlU Asp Vai Gly vai Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin Ala Arg Gin Thr pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Vai Asp Ile Arg Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai vai Cys Leu 145 150 155 160 Leu A$n Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin 210 215 220 Gly Leu ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 2016

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência codificante para a cadeia pesada do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 (com introns) < 4 0 0 > 3 127 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgetattt fcaagaggtgt ecagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtç gtccagcctg ggagqtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctccagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttafca tcatatgagg aaagtaatag ataceatgca 240 gactccgtga agggccgaet eaccatctcc agagacaatt ccaagatcac çctgtatctg 300 caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggggt 360 atagcagcac ctgggcctga ctactggggc çagggaaçcc tggtcaccgt cteetcagca 420 agcaccaagg gcccatccgc cttccccctg gcgcccgcta gçaagagcaç ctctggggge 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 840 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca çtcctcagga 600 çtctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ecctccagca gcttgggçac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa geccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720 ccagcacagg gagggagggt gtçtgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 780 tcceggctat gcagtcccag tecagggcag caaggcaggc cecgtctgcc tcctcacccg 840 gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggte ttctggcttt ttccccaggc 900 tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cocaggcçct gcacacaaag gggcaggtgc 960 tgggctcaga cctgccaaça gccatatccg ggaggsçcct geeectgaec taagcccacc 1020 ccaaaggcca aactetccac txcetcâgcfc cggacacott çtctcctccc agatfcççagt 1080 aácitcccaat cttctctctg cagagcccaa stcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140 gtgcccaggt aagccagecc aggcctcgcc ctecagcfcca aggcgggaca ggtgccetag 1200 agtagcctgc atccagggae aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tcçatctctt 1260 cctcagcaec tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320 acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380 aagaccctga ggtoaagfctc aacfcggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgeesaga 1440 caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1500 tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt âcâagfcgcaa ggtctccaac aaagcectcc 1560 cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccassggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1620 câcatggaca gaggccggct cggcccacec tctgccctga gagtgaccgc tgtaccâacc 1680 tctgtcccta cagggcagoc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccggçag 1740 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcfctcta tcccagcgac 1800 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ecggagaaea actacaagac cacgcctccc 1860 gtgctggact ccgacggctc ettcttectc tatageaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920 tggcageagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 2016

<210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia pesada do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 <400> 4 128

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala 11* Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val 12* Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 ?0 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Lie Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pto Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 ISO 155 180 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro val 165 170 175 Thr Vai Ser Trp Asn Set Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 185 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr .Ue Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr HiS Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leh 245 250 255 Leu Gly Gly Pro ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val val Val Asp Vai 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val 250 295 300 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 105 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HÍS Gin ASp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Glh Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val ASp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser 4S0 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 129 465 < 210 > 5 <211> 469

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 <400> 5 130 mt Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu val Ala 11® Leu Arg Gly "1 A 5 10 15 Vil Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Vai Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arq Ser Leu Arg Léu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met HiS Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Vai Ilè Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 30 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile S5 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Gys Ala Arg Asp Gly Gly lie Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ma Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Vai ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val HiS Thr Phe 160 185 190 Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr Bis Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Vâl Asp val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu val HÍS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gllí Glu Gin Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 34S 350 Pro Ils Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Axg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin 310 375 380 Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 385 390 39S 400 Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 4ÍÔ 415 Pro Pro Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 42Ô 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Vai Met iUs Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu $er 450 ✓ 455 460 Leu Ser pro Gly Lys 131 465

< 210 > 6 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 5.9 <400> 6

Met Ala Leu Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Mèt Léu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gin Pro Pro Leu ser Ser Pro 20 25 30 Vai Thr Leu Gly Gin Pro Ale Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 teu Vai His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg 50 55 60 Pro Gly Gin PEO Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu 65 70 75 80 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin vai Thr Gin Phe Pro His Thr Phe C-ly Gin Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Xle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Xle Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Léu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu G1r Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cy$ Glu Val Thr His Gin 21Q 215 220 Gly Leu Ser ser Pro val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial 132 <220> <223> Cadeia pesada do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 5.9 <400> 7

Met Gly Ser Thr Ala He Leu Ala Leu Leu Leu Ala val Leu Gin Giy 1 5 10 15 Vai Cys Ala Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 2Ô 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Xle Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp mt Gly I1q 11 ô Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Frc Ser Fhe Gin Gly Gin Val Thr Ile $ar Ala Asp Lys Ser He Ser 85 00 95 Thr Ala Tyr teu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Giy Arg ASp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 133 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vâl Fhe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Vai Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Vâl HiS Thr Phe Pro Ala Vâl Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 teu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Ue Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Vâl Glu Pro LyS Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Hôfc Ue Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 * Vai Vai Vâl Asp Vai Ser HiS Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp 280 295 300 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vâl His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai vai Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 kís Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 tys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gin Pro Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 38Q Met Thr Lys Asn Gin Vâl Ser Leu The Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Xle Ala Vâl Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val ASp Lys Ser Arg Trp Gin Gl» Gly Asn 435 440 445 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 555 460 GlR Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 8 470

<211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 5.9 134 < 4 Ο Ο >

Mefc Giy Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin Gly 1 5 10 15 Vai cys Ala Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Ρεα Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Τϊτε Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai Arg Gin «et Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly lie ile Tyr Pro Gly Rsp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 §5 135

Thr Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phê PtO Leu Ala Pro Ser Ser Lys us 150 155 160 Ser Thr Sê r Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Vai Hls Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Vâl Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Léu Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys ASfl vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 225 230 235 240 Arg Vai Glu Pro Lys $er Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 345 250 25$ Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 27S 280 285 Vai vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser vai Leu Thr Vai Leu 325 3 30 335 His Gin ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg GlU Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp lie Ala Vâl Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu As h 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 4 20 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 435 440 445 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu Hls Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gin Lyâ Sêr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 9 <211> 612

< 212 > DNA <213> Homo sapiens 136 < 2 2 Ο >

<221> CDS <222> (1)..._(612) <221> caract mista <222> (0)..._(0) CD40 <223> Sequência codificante para a isoforma curta do humano < 4 0 0 > 9 atg gtt cgt ctg cct ctg csg tgc gtc etc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48

Met Vai Atg teu Pro Lêu Gin Cys Vai teu Trp Glv tys Leu Leu Yhr 1 5 10 15 137 96 96 gct gtc cat ccô gaa ccá Ccc act gea tgc aga gaa aaã cag tae cta Ala Vâl Híâ Pro Glu *0 H O Pro Thr Ãla Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 ata aae agt cag tgc tgt tet ttg tgc cag cca gga cag aaa Ctg gtg 119 Asn Ser Gin Cys cys Ser Leu cys Gin Pro Gly Gin Lys Leu Vai 35 40 45 agt gac tge aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro cys Gly Glu 50 55 60 age gaa tte cta gac acc tgg aae aga gag aca eac tgc eae cag cac Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His 65 70 75 80 aaa tae tgc gac CCC aae cta ggg Ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Vai Gin Gin Lys Gly Thr 85 90 95 tea gaa aca gac ecc ate tgc acc fcgt gaa ggc tS9 cac tgt acg Ser Glu Thr Asp Thr 11« cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 no agt gag gee tgt gag age tgt gtc ctg eac ege tea tgc teg ccc ggc Ser 61 u Ala Cy3 Glu Ser Cys Vai Leu His Arg Sèr Cys Ser Prõ Gly 1.15 120 125 ttt ggg gtc Ô&tJ cag att gct aca ggg gtt tet gat acc ate tgc gag Phe G1 y Vai Lys Gin Ile Ala Thr Gly Vai Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 ecc tgc ccâ gtc ggc tte ttc tcc aae. gtq tea tet gct ttc gaa θ33 Pro Cys Pro vai Gly Phe Phe Ser Asn Vai Sgr Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 tgt eac cct tgg aca sgg tcc eca gga teg gct gag age cct ggt ggt Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser AlS Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175 gat ccc cat cat Ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ÇQt Asp Pro His BiS Leu Arg Asp Pro Vai Cys Bis Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 ctt tat caa âââ 991 ggc cs â gaa gee aae caa taa Leu fyr Glr. Lys Gly Gly Gin Glu Ala Asn Gin * 195 200 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 612

< 210 > 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 138

Met Vai Arg Leu Pro Leu Gin Cys vai Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala vai His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gin cys cys Ser Leu Cys Gin Pro Gly Gin Lys Leu Vai 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Giu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His $5 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Vai Gin Gin Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr ASp Thr 11« Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 no Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys vai Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Vai Lys Glu Ile Ala Thr Gly Vai Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 PrO Cys Pro Vai Gly Phe Phe Ser Asn vai Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175 Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro vai Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Gin Lys Gly Gly Gin Glu Ala Asn Gin 195 200 < 210 > 11 <211> 834 < 212 > DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . . . (834) <221> caract_mista <222> (0) . . . (0) <223> Sequência codificante para a isoforma longa do CD40 humano <400> 11 139 âtg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc etc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48 Met Val Arg Leu Pro Leu Gin Cys Vai Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 gct gtc cat cca gaa cca ccc act gea tgc aga gaa aaa cag tac cta 96 ala Vai His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 ata aac agt cag tgc tgt tet ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gfcg 144 lie Asn Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cys Gin Pro Gly Gin Lys Leu Val 35 40 45 agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 age gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 240 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His 65 70 75 80 tac tgc gac ccc â&C cta ggg ctt gtc cag cag aag ggc acc 288 Lys Tyr Cys A«p Pro Asn Leu Gly leu Arg Vâl Gin Gin Lys Gly Thr 85 90 95 tea gaa aca gac acc ate tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg 336 Ser Glu Thr Asp Thr 11« Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 agt ?ag gee tgt gsg age tgt gtc ctg cac ege tea tgc teg ccc ggc 384 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Vai Leu His Ara Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 ttt ggg gtc aag cag att gçt aca ggg gtt tet gst acc ate tgc 432 Phe Gly Vai Lys Gin lie Ala Thr Gly Vai Ser Asp Thr ile Cys Glu 130 135 140 140 CCC tgc cca gtc ggc ttc ttc tCC aat gtg tea tet gct ttc gaa SSâ 480 Pro Cys Pro vai Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser ser àla irhe Glu .Lys 145 150 155 16Õ tgt eac cct tgg aca age tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag 528 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Va.l Val Gin Gin 165 170 175 gca ggc aça aac aag aet gat gtt gtc tgt ggt CCC cag gat cgg ctg 576 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gin Asp Arg Léu 180 185 190 aga gcc ctg gtg gtg ate CCC ate ate ttc ggg ate ctg tfct gcc ate 624 Arg Ãla LâU Val Val Xle Pro xle Ile Phe Gly Xle Leu Pht: Ala ile 195 300 205 ctc ttg gtg ctg gtc ttt ate ââã aag gtg gcc aag aag cca acc aat 672 Leu Leu Val Leu vai Phè Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 sag gcc CCC eac eco aag cag gaa CCC cag gag ate aat ttt ccc gac 720 Lys Ala Pro Hís Pro Lys Gin Glu Pro Gin Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 23Ô 235 240 gat ctt cct gge tcc ââc act gct gct cca gtg cag gag act tta eat 768 Asp Leu Pro Gly Sor Asn Thr Ala Ala Pro val Gin Glu Thr Leu His 245 250 255 gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agfc ege ate tea 816 Gly Cys Gin pro val Thr Gin Glu Asp Gly Lys Gin Set Arg Ile Ser 260 265 270 ► gtg cag g«g aga cag tga 834 Vai Gin Glu Arg Gin * 275 <210> 12 <211> 277

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 141

Met. Vai Arg Leu Pro Leu Glu Cys Vai Lau Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Vai His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 11® Asn Ser O li Gin Cys Cys Ser Leu λ n cys Gin Pro Gly Gin à Lys Léu val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu <1 ÇJ Pro Cys Gly Glu 50 55 80 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His SS 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gin Gin Lys Gly Thr 85 80 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His CyS Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Vai Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Vai Lys Gin Ile Ala Thr Gly Vai Ser Asp Thr ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Vai Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gin Gin 155 170 175 Ala Gly Thr ASTí Lys Thr Asp Vai Vai Cys Gly Pro Gin Asp Arg Leu 180 185 180

Arg Ala Leu Val vai Ile Pro ile Ile Phe Gly lie Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gin Glu Pro Gin Glu Ile Ash Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser A$n Thr Ala Ala Pro Val Gin Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gin Pro Val Thr Gin Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg rie ser 260 265 270 Val Gin Glu Arg Gin 275

Lisboa, 18 de Novembro de 2010 142

Claims

REIVINDICAÇÕES 1- Um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana que expressa CD40, sendo o dito anticorpo monoclonal isento de actividade agonista significativa, e sendo que, quando o dito anticorpo monoclonal se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula, o crescimento ou diferenciação da dita célula são inibidos, para uso num método de tratamento de um indivíduo humano para a leucemia linfocítica crónica (LLC), caracterizado por compreender a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal humano anti-CD40, caracterizado por o dito anticorpo ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo compreendendo os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo compreendendo os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; e d) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito 1 Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
2- 0 uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula que expressa o CD40 humano, sendo o dito anticorpo monoclonal isento de actividade agonista significativa, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um indivíduo humano para a leucemia linfocitica crónica (LLC) e sendo que, quando o dito anticorpo monoclonal se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula, o crescimento ou diferenciação da dita célula são inibidos, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal anti-CD40 humano ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; e d) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a 2 partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
3- Um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40, sendo o referido anticorpo monoclonal isento de actividade antogonista significativa quando ligado ao antigénio CD40, para uso num método para inibir o crescimento das células da leucemia linfocitica crónica (LLC) que expressam o antigénio CD40, o referido método compreendendo a colocação em contacto das referidas células com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40, caracterizado por o dito anticorpo ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo caracterizado pelo facto de compreender os residuos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo caracterizado pelo facto de compreender os residuos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; e d) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha 3 celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
4- 0 uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que tem a capacidade de se ligar de modo especifico a um antigénio CD40, no fabrico de um medicamento para inibir o crescimento das células da leucemia linfocitica crónica (LLC) que expressam o antigénio CD40, sendo o dito anticorpo monoclonal isento de actividade agonista significativa quando se liga ao antigénio CD40, caracterizado por o dito anticorpo ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; e d) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como 4 Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
5- Um método in vitro para inibir o crescimento das células da leucemia linfocitica crónica (LLC), que expressam o antigénio CD40, caracterizado por o referido método compreender a colocação em contacto das ditas células com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano, que é capaz de se ligar de forma especifica com o referido antigénio CD40, caracterizado por o dito anticorpo ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12; e d) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
6- O anticorpo, uso ou método de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o referido 5 anticorpo monoclonal anti-CD40 humano ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: (i) um anticorpo monoclonal compreendendo um dominio variável de cadeia leve contendo os resíduos 44-54, 70-76 e 109-117 da SEQ ID NO:2 ou SEQ.ID NO:6; (ii) um anticorpo monoclonal compreendendo um domínio variável de cadeia pesada contendo os resíduos 50-54, 69-84 e 114- 121 da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:7; (iii) um anticorpo monoclonal compreendendo um domínio variável de cadeia leve contendo os resíduos 46-52, 70-72 e 111-116 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:6; (iv) um anticorpo monoclonal compreendendo um domínio variável de cadeia pesada contendo os resíduos 45-51, 72-74 e 115- 120 da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:7;
7- O anticorpo, uso ou método de acordo com a Reivindicação N°.6, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 humano compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2; (ii) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:2; (iii) SEQ ID NO:2; (iv) resíduos 20-139 da SEQ ID NO:4; (v) resíduos 20-469 da SEQ ID NO: 4; (vi) SEQ ID NO:4; (vii) resíduos 20-469 da SEQ ID NO: 5; (viii) SEQ ID NO:5; (ix) resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-139 da SEQ ID NO:4; (x) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-469 da SEQ ID NO:4; (xi) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-469 da SEQ ID NO:5; (xii) SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4; e 6 (xiii) SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:5.
8- O anticorpo, uso ou método de acordo com a Reivindicação N°.6, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 humano compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos 21-132 da SEQ ID NO:6/ (ii) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:6; (iii) SEQ ID NO:6; (iv) resíduos 20-144 da SEQ ID NO: 7; (v) resíduos 20-474 da SEQ ID NO:7; (vi) SEQ ID NO:7; (vii) resíduos 20-474 da SEQ ID NO:8; (viii) SEQ ID NO:8; (ix) resíduos 21-132 da SEQ ID NO: 6 e resíduos 20-144 da SEQ ID NO:7; (x) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:6 e resíduos 20-474 da SEQ ID NO: 7; (xi) resíduos 21-239 da SEQ ID NO: 6 e resíduos 20-474 da SEQ ID NO:8; (xii) SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7; e (xiii) SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8.
9- O anticorpo, uso ou método de acordo com qualquer uma das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por o referido anticorpo ser seleccionado a partir do grupo que consiste no anticorpo CHIR-5.9, produzido pela linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, e no anticorpo CHIR-12.12, produzido pela linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543.
10- O anticorpo, uso ou método de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal se ligar ao dito antigénio CD40 humano com uma afinidade (KD) de, pelo menos, IO"6 M. 7 11- 0 anticorpo, uso ou método, de acordo com a Reivindicação N°.10, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal se ligar ao dito antigénio CD40 humano com uma afinidade (KD) de, pelo menos, 10"8 M. 12- 0 anticorpo, uso ou método de acordo com qualquer uma das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal constituir um fragmento de ligação ao antigénio do referido anticorpo monoclonal anti-CD40, o dito fragmento retendo a capacidade de se ligar de modo especifico ao dito antigénio CD40 humano. 13- 0 anticorpo, uso ou método, de acordo com a Reivindicação N°.12, caracterizado por o dito fragmento ser seleccionado a partir do grupo que consiste num fragmento Fab, um fragmento F(ab')2r um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única. 14- 0 anticorpo, uso ou método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal ser produzido numa linha celular CHO. Lisboa, 18 de Novembro de 2010 8