CN101056655A - 治疗cd30阳性淋巴瘤的方法 - Google Patents

Abstract

公开了使用抗CD30抗体和蛋白酶体抑制剂联合治疗以CD30表达为特征的淋巴瘤的方法。

Description

治疗CD30阳性淋巴瘤的方法

发明背景

CD30细胞表面分子是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的一个成员。该分子家族在其成员中具有不定的同源性，且包括神经生长因子受体(NGFR)、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40、CD95、OX40、Fas、TNF-R1和TNF-R2，它们是从环境向调节免疫应答的细胞转导信号的关键调节分子(1，2)。这些分子一般特征在于在胞质外区域中存在多个富含半胱氨酸的重复(de Bruin，P.C.等人，Leukemia：1620-1627(1995))。据认为该家族的成员对于调节淋巴细胞的增殖和分化是至关重要的。

CD30是具有6个(人类)或3个(鼠和大鼠)富含半胱氨酸的重复的I型跨膜糖蛋白，且具有1个中央铰链序列。CD30以从90kDa的细胞间前体蛋白发展来的120kDa膜分子存在。它作为约90kDa的可溶性蛋白质(sCD30)从细胞表面释放。sCD30的释放作为活CD30细胞的活性过程发生，且不仅仅由从垂死或死亡细胞中的释放引起。已通过用单克隆抗体Ki-1和Ber-H2进行免疫筛选而从HLTV-1人类T-细胞系HUT-102的表达文库中克隆了编码CD30蛋白质的cDNA(Schwab，U.等人，Nature 299：65(1982))。已发现小鼠和大鼠CD30 cDNA分别编码498和493个氨基酸。人类CD30 cDNA编码额外的90个氨基酸，其中部分是一个富含半胱氨酸的结构域的重复。CD30基因已定位于人类中的lp36和大鼠中的5q36.2。

CD30主要由活化的淋巴样细胞表达。细胞表面受体最初通过单克隆抗体Ki-1进行鉴定，该单克隆抗体与表达于何杰金氏病的何杰金氏和Reed-Sternberg细胞上的抗原反应(Schwab等人，Nature299：65(1982))。因此，CD30广泛用作何杰金氏淋巴瘤和相关的血液恶性肿瘤的临床标记(Froese等人，J.Immunol.139：2081(1987)；Carde等人，Eur.J.Cancer 26：474(1990))。后来确定淋巴样细胞中CD30的刺激诱导多效生物学效应，包括增殖、激活、分化和细胞死亡，取决于细胞型、分化阶段和其它刺激物的存在(Gruss，H.J.等人，Blood 83：2045-2056(1994))。据认为，恶性细胞上CD30受体的过度表达对HD来源的细胞的NF-kB激活引起的存活率和凋亡抗性起作用(3-5)。

已经显示CD30表达于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的亚型上，包括伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特氏淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)和中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤(Stein等人，Blood 66：848(1985)；Miettinen，Arch.Pathol.Lab.Med.116：1197(1992)；Piris等人，Histopathology 17：211(1990)；Burns等人，Am.J.Clin.Pathol.93：327(1990)；和Eckert等人，Am.J.Dermatopathol.11：345(1989))，以及几种病毒转化的品系，如人类T细胞嗜淋巴细胞病毒I或II转化的T细胞和EB病毒转化的B细胞(Stein等人，Blood 66：848(1985)；Andreesen等人，Blood 63：1299(1984))。此外，也在胚胎性癌、非胚胎性癌、恶性黑素瘤、间充质肿瘤和骨髓细胞系和巨噬细胞中在分化晚期记录到了CD30表达(Schwarting等人，Blood 74：1678(1989)；Pallesen等人，Am J.Pathol.133：446(1988)；Mechtersheimer等人，Cancer 66：1732(1990)；Andreesen等人，Am.J.Pathol.134：187(1989))。

大约20-30％的年龄较大或HD期的HD患者将在一线治疗后复发。由高剂量药物治疗联合自体干细胞移植组成的补救治疗能够治愈这些患者中另外的40-60％。大量单药方案，例如口服依托泊苷、苯丁酸氮芥、长春碱、吉西他滨、长春瑞滨，能够在几个月或几年的时间里缓解移植失败或者不适合移植的患者(Devizzi等人，Annals ofOncology 5：817-820，1994)。最近发展的补救治疗，如蛋白酶体抑制剂、抗CD30抗体以及联合方案，例如盐酸多柔比星脂质体(doxil)、诺维本和吉西他滨，除了几个例外以外，仍然对治疗CD30阳性淋巴瘤大部分无效。

由于正常个体中CD30阳性细胞的百分比相当小，所以CD30在肿瘤细胞中的表达使其成为抗体介导的治疗的重要目标，以特异性地将治疗剂导向CD30阳性的赘生性细胞(Chaiarle，R.等人，Clin.Inmunol.90(2)：157-164(1999))。然而，尽管迄今获得的结果清楚地确定CD30是免疫治疗的有用目标，但该结果也显示目前可用的鼠和嵌合抗体未构成理想的治疗剂。已经显示全人抗CD30单克隆抗体5F11在体外和体内对ALCL和各种HD来源的细胞系有效(17)。尽管全人抗体与鼠和嵌合抗CD30抗体相比有效性提高，但是观察到CD30阳性靶细胞对5F11的敏感性的变化。抗体治疗杀死导致CD30阳性淋巴瘤的表达CD30的细胞的能力的提高是期望的。

因此，存在对改进的治疗性抗CD30抗体的需要，该抗体对于治疗和/或预防由CD30介导的疾病是有效的。

发明概述

在本发明中，在各种HD来源的细胞系中研究了5F11对NF-kB激活的效果，以研究细胞凋亡抗性的机制。本发明证明5F11联合硼替佐米(bortezomib)的效果提高，硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，已知在体外和在皮下人何杰金肿瘤模型中都能够抑制NF-kB激活。

因此，本发明提供治疗CD30阳性淋巴瘤患者的方法，包括施用治疗有效量的抗CD30单克隆抗体联合NF-kB活性抑制剂，如蛋白酶体抑制剂。

在一个实施方案中，抗CD30抗体与蛋白酶体抑制剂同时给药，或者至少在1天内给药，抗体剂量为1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶体抑制剂剂量为0.1mg/kg至10mg/kg。

在另一个实施方案中，抗CD30抗体至少在蛋白酶体抑制剂给药前1天给药，抗体的剂量为1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶体抑制剂的剂量为0.1mg/kg至10mg/kg。

在另一个实施方案中，抗CD30抗体至少在蛋白酶体抑制剂给药前1周给药。该实施方案的另一方面包括在蛋白酶体抑制剂给药前最多12周每周至少一次给药，抗体的剂量为1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶体抑制剂的剂量为0.1mg/kg至10mg/kg。

在另一个实施方案中，抗CD30抗体以单次大剂量给药，例如10至25mg/kg，然后在抗体给药后最多1周施用蛋白酶体抑制剂至少一次；在抗体给药后最多2周至少一次；在抗体给药后最多3周至少一次；在抗体给药后最多4周至少一次；在抗体给药后最多1个月至少一次；在抗体给药后最多2个月至少一次；或者在抗体给药后最多3个月至少一次。

本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。

附图说明

图1：用5F11和MG132处理后L540细胞中凋亡的诱导。L540细胞与PBS(对照)、交联的5F11、MG132或5F11和MG132的组合一起培养16小时。凋亡细胞通过膜联蛋白-FITC染色进行标记，通过FACS分析估计给出活细胞和凋亡细胞的百分比。示出了三个独立实验的结果。

图2：交联的5F11和MG132的组合降低了表达CD30的细胞系的细胞存活率。

XTT试验显示在存在(菱形)或不存在(三角)5F11的情况下，何杰金细胞系L540(A)，L428(B)和ALCL系Karpas299(C)和CD30阴性细胞系REH(E)在暴露于含量渐增的硼替佐米后的存活率。亚毒性浓度的5F11和交联GaH抗体与浓度逐渐增加的硼替佐米联用。在加入硼替佐米之前，细胞与单克隆抗体预孵育30分钟。孵育48小时后估计细胞存活率。在5F11存在下硼替佐米对于表达CD30的细胞的IC₅₀降低。在加入5F11之前细胞与硼替佐米预孵育30分钟不增加硼替佐米对L428细胞的细胞毒性(D)。示出了对照实验(5F11，菱形)和山羊抗人抗体(十字形)和5F11+GaH(圆形)的结果。该图表示三个独立的实验。

图3：5F11和硼替佐米对SCID小鼠中皮下L540Cy何杰金肿瘤的肿瘤生长的影响。当L540来源的肿瘤达到大约100mm³的体积时，将小鼠随机分为4组，接受PBS、5F11(100μg)、硼替佐米(10ng)或5F11和硼替佐米的组合。给出了每只小鼠的肿瘤体积。箭头指示治疗天数。在独立的实验中，分别在5F11和5F11+硼替佐米组中用4只动物重现这些结果(数据未示出)。

图4：5F11和硼替佐米对NF-κB的亚细胞分布和转录活性的影响。

L428细胞用报道构建体pCMV-luc(转染对照)或pNF-κB-luc(第2-4条)或pNF-κB-luc以及表达载体IkB-M(第5-7条)转染。转染效率约为10％，DNA总量保持恒定。在过夜恢复后，转染子用PBS(基础)、5F11或硼替佐米处理24小时。测定细胞的萤光素酶活性(RLU)，示出了NF-κB-依赖的启动子活性的相对水平。

发明详述

为了使本发明更易于理解，首先定义了某些术语。额外的定义贯穿于详述中提出。

术语“CD30”和“CD30抗原”在此处可互换应用，且包括由细胞天然表达的人类CD30的任何变体、同种型和物种同系物。在一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30抗原的结合通过抑制或阻断CD30配体与CD30的结合抑制了表达CD30的细胞(如肿瘤细胞)的生长。术语“CD30配体”包括CD30的所有(如生理学)配体。在一个优选实施方案中，CD30配体是CD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3或TRAF5。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30抗原的结合介导表达CD30的细胞的效应细胞吞噬作用和/或杀伤。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30抗原的结合介导表达CD30的细胞的效应细胞ADCC。

如在此处所用的，术语“抑制生长”(如涉及细胞)意欲包括与不接触抗CD30抗体的相同细胞的生长相比，当接触抗CD30抗体时细胞生长中任何可测量的降低，如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的细胞生长抑制。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常人细胞或组织。

如此处所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD30的分离的抗体基本不含特异性结合除CD30以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合CD30的分离的抗体与诸如来自其他物种的CD30分子等其他抗原可能具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

如此处所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

如此处所用的术语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，如此处所用的术语“人抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。

术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物例如转基因小鼠中获得。

如此处所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列向其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经受体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列而言的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列尽管是源自人种系V_H和V_L序列并与之相关的序列，但可能并非在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。

如此处所用的，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。

短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。

术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的偶联物。

术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。

如此处所用的，术语“特异性结合人CD30”的抗体是指以1×10^-7M或更低、更优选5×10^-8M或更低、更优选3×10^-8M或更低、更优选1×10^-8M或更低、甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合的抗体。

如此处所用的术语“K_assoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如此处所用的术语“K_dis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如此处所用的术语“K_D”是指解离常数，它是由K_d与K_a的比值获得的(即K_d/K_a)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以用本领域建立的方法测定。测定抗体K_D的一种优选方法是使用表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore^系统。

如此处所用的，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的K_D为10^-8M或更低、更优选10^-9M或更低、甚至更优选10^-10M或更低。但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，“高亲和力”结合是指抗体具有10^-7M或更低、更优选10^-8M或更低、甚至更优选10^-9M或更低的K_D。

如此处所用的，术语“受试者”和“患者”可互换使用并且包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。在本发明的特定实施方案中，患者是人。

这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端至羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

如此处所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原(例如CD30)的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过能够使它们形成一条蛋白质链的合成接头连接在一起，其中V_L和V_H区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

术语“表位”指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性的分子表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的带电特征。构象和非构象表位的区别在于存在变性溶剂时与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。

如在此处所用的，术语“抑制结合”和“阻断结合”指抑制/阻断CD30配体与CD30的结合。抑制/阻断可互换应用，且包括部分和完全的抑制/阻断。CD30的抑制/阻断优选地降低或改变当不存在抑制或胆断发生CD30结合时发生的活性的正常水平或类型，如抑制CD30诱导的增殖。抑制和阻断也意欲包括与不接触抗CD30抗体的CD30相比，当接触抗CD30抗体时CD30的结合亲和力的任何可测量的降低，如对CD30与其受体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的阻断。

术语“双特异性分子”意欲包括任何具有两种不同的结合特异性的试剂，如蛋白质、肽或蛋白质或肽复合物。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”意欲包括任何具有超过两种不同的结合特异性的试剂，如蛋白质、肽或蛋白质或肽复合物。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面的Fc受体和(c)至少一种其他成分结合或相互作用。因此，本发明包括，但不局限于双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子，该分子导向于细胞表面抗原如CD30，或导向于其他目标，如效应细胞上的Fc受体。

术语“双特异性抗体”也包括二价双抗体(diabodies)。二价双抗体是二价的双特异性抗体，其中V_H和V_L结构域表达于单个多肽链上，但应用的连接体太短以至于在相同的链上的两个结构域之间不能配对，从而使得结构域与另一个链的互补性结构域配对并生成2个抗原结合位点(参见如Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure  2：1121-1123)。如在此处所用的，术语“异种抗体”指两种或多种抗体、抗体结合片段(如Fab)、其衍生物或连接在一起的抗原结合区，其至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上Fc受体的结合特异性和对目标细胞如肿瘤细胞上抗原或表位的结合特异性。

如在此处所用的，“异源抗体”是相对于产生该抗体的转基因非人类生物进行定义的。该术语指具有如下氨基酸序列或编码性核酸序列的抗体，该氨基酸序列或编码性核酸序列相应于在不由转基因非人类动物组成的生物中发现的序列，且通常来自除转基因非人类动物之外的物种。

如在此处所用的，“异源杂交抗体”指其有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠的轻链结合的人类重链的抗体是异源杂交抗体。异源杂交抗体的例子包括上述嵌合和人源化的抗体。

如在此处所用的，“糖基化模式”定义为共价附着于蛋白质，更具体地为免疫球蛋白上的糖单位的模式。异源抗体的糖基化模式特征在于基本与由非人类转基因动物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式相似，此时，本领域技术人员将认识到异源抗体的糖基化模式与转基因的CH基因源自的物种相比更加类似于非人类转基因动物中的该糖基化模式。

如在此处所用的，应用于一个主题的术语“天然存在的”指该主题可在自然中发现。例如，存在于生物(包括病毒)中的可从天然来源分离且未由人类在实验室中进行有目的的修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

如在此处所用的，术语“重排的”指一种重链和轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中在分别编码基本完整的V_H或V_L结构域的构象中，V区段的位置紧紧接近D-J或J区段。重排的免疫球蛋白基因座可通过与种系DNA的比较进行鉴定；重排的基因座具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。

如在此处所用的，关于V区段的术语“未重排的”或“种系构型”指其中V区段未进行重组从而紧紧接近D或J区段的构型。

抗CD30抗体

抗CD30抗体是本领域公知的，例如5F11，HeFi-1，C10，M44，AC10，Ber-H2，HRS-1，HRS-3，HRS-4，Ki-1，Ki-2，Ki-3，Ki-4，Ki-5，Ki-6，Ki-7，IRac和M67。优选地，在本发明方法中使用的抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一个特定实施方案中，抗体是全人抗体。用于本发明方法的优选抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体以高亲和力与人CD30特异性结合，优选地表现出以下一种或多种特性：

(a)与CD30的结合亲和力的亲和常数为至少约10⁷M^-1，优选约10⁸M^-1，更优选约10⁹M^-1至10¹⁰M^-1或更高；

b)与CD30的结合常数(K_assoc)至少约为10³，更优选约10⁴，最优选约10⁵M^-1S^-1；

c)与CD30的解离常数(K_dis)约为10^-3s^-1，优选约10^-4s^-1，更优选约10^-5s^-1，最优选10^-6s^-1；

d)调理表达CD30的细胞的能力；

e)在人效应细胞存在下，在约10μg/ml或更低(例如在体外)浓度时，抑制表达CD30的细胞(例如肿瘤细胞)的生长和/或介导其吞噬作用和杀伤的能力；或

f)通过部分或完全阻断CD30配体与CD30的结合(CD30配体的例子包括CD153，TRAF1，TRAF2，TRAF3和TRAF5)而与CD30结合和抑制CD30功能(例如CD30介导的效应)的能力。

优选地，该抗体以5×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合，以4×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合，以3.5×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合，以3×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合，或以2.8×10^-9M或更低的K_D与人CD30结合。

评价抗体对CD30的结合能力的标准试验在本领域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印迹分析和RIA。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准试验如Biacore分析来评价。

单克隆抗体17G1、2H9和5F11

用于本发明的优选抗体包括人单克隆抗体17G1、2H9和5F11，它们在公开号为2004/0006215的美国专利申请中表征和描述，该申请在此全文引用作为参考。17G1、2H9和5F11的V_H氨基酸序列分别在SEQ ID NO：2、6和10中示出。17G1、2H9和5F11的V_L氨基酸序列分别在SEQ ID NO：4、8和12中示出。

假定这些抗体中的每一个都能够与CD30结合，则V_H和V_L序列可以“混合并匹配”，产生供本发明方法使用的其他的抗-CD30结合分子。CD30与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA)检测。优选地，当V_H和V_L链混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的V_H序列被替换为结构上相似的V_H序列。同样，优选地，来自特定V_H/V_L配对的V_L序列被替换为结构上相似的V_L序列。

因此，在一个方面，本发明的方法可以使用一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：2、6和10的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：4、8和12的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体特异性结合CD30，优选人CD30。

优选的重链和轻链组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区；或

(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区；或

(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明的方法中可以使用包含17G1、2H9和5F11的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。17G1、2H9和5F11的V_H CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16、28和40中。17G1、2H9和5F11的V_H CDR2的氨基酸序列示于SEQ IDNO：17、29和41中。17G1、2H9和5F11的V_H CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18、30和42中。17G1、2H9和5F11的V_KCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：22、34和46中。17G1、2H9和5F11的V_K CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23、35和47中。17G1、2H9和5F11的V_K CDR3的氨基酸序列示于SEQ IDNO：24、36和48中。CDR区用Kabat系统(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interesr，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。

假如这些抗体均能与CD30结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、CDR2和CDR3区提供的，则V_H CDR1、CDR2和CDR3序列与V_K CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有V_H CDR1、CDR2和CDR3和V_K CDR1、CDR2和CDR3)，产生本发明中使用的其他的抗-CD30结合分子。CD30与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA，Biacore分析)检测。优选地，当V_H CDR序列混合并匹配时，来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当V_K CDR序列混合并匹配时，来自特定V_K序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个V_H和/或V_L CDR区序列替换为来自此处公开的单克隆抗体17G1、2H9和5F11的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的V_H和V_L序列。

因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：16、28和40的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含选自SEQ ID NO：17、29和41的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含选自SEQ ID NO：18、30和42的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含选自SEQ ID NO：22、34和46的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含选自SEQ ID NO：23、35和47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和

(f)包含选自SEQ ID NO：24、36和48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；

其中该抗体特异性结合CD30，优选人CD30。

在一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR3。

在另一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：28的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：29的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR3。

在另一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：40的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：41的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：42的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR3。

具有特定种系序列的抗体的用途

在某些实施方案中，本发明方法中使用的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。

例如，在一个优选实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分，包含产自或源自人V_H 4-34或人V_H 3-11基因的重链可变区，其中该抗体特异性结合CD30。在另外的优选实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分，包含产自或源自人V_K L15基因、人V_K A27基因或人V_K L6基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD30。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)包含产自或源自人V_H 4-34或3-11基因(该基因分别编码SEQ ID NO：49和51所示的氨基酸序列)的重链可变区；

(b)包含产自或源自人V_K L15或V_K A27或V_K L6基因(该基因分别编码SEQ ID NO：50、52和53所示的氨基酸序列)的轻链可变区；且

(c)特异性结合CD30，优选人CD30。

分别具有V_H 4-34和V_K L15的V_H和V_K的抗体的一个例子是5F11。分别具有V_H 3-11和V_k A27的V_H和V_K的抗体的一个例子是2H9。

如此处所用的，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该抗体包含“产自”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。“产自”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般来说，源自特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，该人抗体可能表现与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。

同源抗体

在另一实施方案中，本发明中有用的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了优选的抗-CD30抗体的需要的功能特性。

例如，在本发明的方法中有用的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：2、6和10的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：4、8和12的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-8M或更低的K_D与人CD30结合；

(d)该抗体与CD30的结合常数(K_assoc)至少约为10³，更优选约10⁴，最优选约10⁵M^-1S^-1；

(e)该抗体与CD30的解离常数(K_dis)约为10^-3s^-1，优选约10^-4s^-1，更优选10^-5s^-1，最优选10^-6s^-1；

(f)该抗体具有调理表达CD30的细胞的能力；

(g)该抗体具有在人效应细胞存在下，在约10μg/ml或更低(例如在体外)浓度时，抑制表达CD30的细胞(例如肿瘤细胞)的生长和/或介导其吞噬作用和杀伤的能力；或

h)该抗体具有通过部分或完全阻断CD30配体与CD30的结合(CD30配体的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而结合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介导的效应)的能力。

在各种实施方案中，该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在另外一些实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的V_H和V_L区高度(即80％或更高)同源的V_H和V_L区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ IDNO：1、3、5、7、9和11的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能(即以上(c)和(d)所述的功能)。

如此处所用的，两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。

两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM 120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http：//www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。

另外，或者，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索，例如用来鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有保守修饰的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如17G1、2H9或5F11)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗-CD30抗体的需要的功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：18、30和42的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：24、36和48的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(c)该抗体以1×10^-8M或更低的K_D与人CD30结合；

(d)该抗体与CD30的结合常数(K_assoc)至少约为10³，更优选约10⁴，最优选约10⁵M^-1S^-1；

(e)该抗体与CD30的解离常数(K_dis)约为10^-3s^-1，优选约10^-4s^-1，更优选10^-5s^-1，最优选10^-6s^-1；

(f)该抗体具有调理表达CD30的细胞的能力；

(g)该抗体具有在人效应细胞存在下，在约10μg/ml或更低(例如在体外)浓度时，抑制表达CD30的细胞(例如肿瘤细胞)的生长和/或介导其吞噬作用和杀伤的能力；或

h)该抗体具有通过部分或完全阻断CD30配体与CD30的结合(CD30配体的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而结合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介导的效应)的能力。

在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQID NO：17、29和41的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：23、25和47的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：16、28和40的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ IDNO：22、34和46的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。

在各种实施方案中，该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

如此处所用的，术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即以上(c)至(j)所述的功能)。

与本发明的抗-CD30抗体结合相同表位的抗体

除了此处所述的抗体以外，本发明的方法可以使用与此处所述的任一CD30单克隆抗体结合相同簇(A、B或C)或更优选相同表位的抗体(即能够与本发明的任一单克隆抗体交叉竞争结合CD30的抗体，例如17G1、2H9和5F11)。这些交叉竞争抗体可以根据它们在标准CD30结合测定中与17G1、2H9和5F11交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本发明抗体的交叉竞争。受试抗体抑制例如17G1、2H9或5F11与人CD30结合的能力证明，该受试抗体可以与该抗体竞争结合人CD30，因此与该抗体结合人CD30上相同的表位。在一个优选实施方案中，与17G1、2H9或5F11结合人CD30上相同表位的抗体是人单克隆抗体，该人单克隆抗体可以使用本领域公知的方法如此处所述制备和分离。

工程化(engineered)和修饰的抗体

本发明中使用的抗体还可以如下制备：用此处所公开的抗体的一种或多种V_H和/或V_L序列作为起始材料，工程化一种修饰的抗体，该修饰的抗体可能具有与此处公开的起始抗体相比改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来工程化抗体。另外，或者，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如改变该抗体的效应功能。

可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含17G1、2H9或5F11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，但是含有构架序列的修饰。因此，这些抗体含有单克隆抗体17G1、2H9或5F11的V_H和V_L CDR序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。

这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline V_HSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals aStrong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均在此引用作为参考。

用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明使用的优选单克隆抗体使用的V_H 4-34构架序列(SEQ ID NO：49)和/或V_H 3-11构架序列(SEQID NO：51)和/或V_K I15构架序列(SEQ ID NO：50)和/或V_K A27构架序列(SEQ ID NO：52)和/或V_K L6构架序列(SEQ ID NO：53)。V_H CDR1、CDR2和CDR3序列和V_K CDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一种类型的可变区修饰是突变V_H和/或V_K CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选地引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗-CD30单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有：(a)V_H CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：16、28和40的氨基酸序列，或与SEQID NO：16、28和40相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：17、29和41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17、29和41相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_HCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：18、30和42的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：18、30和42相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_K CDR1区，其包含选自SEQID NO：22、34和46的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：22、34和46相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_K CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：23、35和47的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23、35和47相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_K CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：24、36和48的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：24、36和48相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。

本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其V_H和/或V_K内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种已知的方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。

另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、或者甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。

除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本发明的抗体工程化为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化，以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是为了，例如，促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更特别地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A

(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等人的美国专利No.6,165,745号中详细记载。

在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利No.6,277,375所述。或者，为了提高生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变该抗体，使之含有来自IgGFc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述。

在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。

在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。

在另外一个实施例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。

在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公布WO00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

在另一实施方案中，改变抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利No.5,714,350和6,350,861中更详细地描述。

另外，或者，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，因此这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的工程化细胞系，因此该工程化细胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。

本发明方法中可以使用的抗体可以进行的另一种修饰包括PEG化。例如，为了提高抗体的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，一般在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。如此处所用的术语“聚乙二醇”意在包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

将抗体进行工程化的方法

如上所述，能够利用具有此处公开的V_H和V_K序列的抗-CD30抗体，通过修饰V_H和/或V_K序列或与之连接的恒定区，产生新的抗-CD30抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗-CD30抗体例如17G1、2H9或5F11的结构特征，产生结构上相关的抗-CD30抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人CD30结合。如上所述，例如，17G1、2H9或5F11的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗-CD30抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定必须实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。

因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-CD30抗体的方法，包括：

(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：16、28和40的CDR1序列、选自SEQ ID NO：17、29和41的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：18、30和42的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：22、34和46的CDR1序列、选自SEQ ID NO：23、35和47的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：24、36和48的CDR3序列；

(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和

(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。

可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。

优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-CD30抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：

(a)以1×10^-8M或更低的K_D与人CD30结合；

(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：4、8和12的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-8M或更低的K_D与人CD30结合；

(d)该抗体与CD30的结合常数(K_assoc)至少约为10³，更优选约10⁴，最优选约10⁵M^-1S^-1；

(e)该抗体与CD30的解离常数(K_dis)约为10^-3s^-1，优选约10^-4s^-1，更优选10^-5s^-1，最优选10^-6s^-1；

(f)该抗体具有调理表达CD30的细胞的能力；

(g)该抗体具有在人效应细胞存在下，在约10μg/ml或更低(例如在体外)浓度时，抑制表达CD30的细胞(例如肿瘤细胞)的生长和/或介导其吞噬作用和杀伤的能力；或

h)该抗体具有通过部分或完全阻断CD30配体与CD30的结合(CD30配体的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而结合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介导的效应)的能力。

改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的，如实施例中所述的标准试验(例如流式细胞术、结合测定)来评价。

在工程化本发明抗体的方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-CD30抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗-CD30抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。

编码本发明的抗体的核酸分子

此处描述了编码本发明中有用的特定抗体的核酸分子(SEQ IDNO：1，3，5，7，9和11)。这些核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法从其他细胞成分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质中分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。

本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的核酸。

本发明优选的核酸分子是编码17G1、2H9或5F11单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码17G1、2H9和5F11的VH序列的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：1、5和9中。编码17G1、2H9和5F11的VL序列的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：3、7和11中。

一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段可操作地连接。如在本文中使用的术语“可操作地连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。

通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子可操作地连接，可以将分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子可操作地连接。

通过将编码VI的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子可操作地连接，可以将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选的是κ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另外一个片段可操作地连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL和VH区通过该柔性接头连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。

本发明的单克隆抗体的制备

通过多种技术能制备本发明有用的单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。

本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其工程化为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利No.5,225,539，和Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗CD30人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在此分别称作HuMab小鼠^和KM小鼠^的小鼠，并且在此通称为“人Ig小鼠”。这些小鼠是本领域众所周知的(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474)：856-859)；综述Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，于下面的文献中详细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文在此引入作为参考。进一步参见，美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都属于Lonberg和Kay；和Surani等人的美国专利No.5,545,807；PCT公布号WO 92/03918,WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO99/45962，都属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。

在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此称为“KM小鼠^”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中详细描述。

再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明使用的抗-CD30抗体。例如，可以使用一种称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。

而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明使用的抗-CD30抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗-CD30抗体。

也可以使用筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。

也可以用SCID小鼠制备本发明使用的人单克隆抗体，该SCID小鼠中重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。

人Ig小鼠的免疫

用于产生人抗体的人Ig小鼠的免疫在公布号为2004/0006215的美国专利申请中详细描述，在此全文引用作为参考。其中也描述了产生抗CD30的全人单克隆抗体的详细程序。

产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的制备

为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。针对抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。这些方法是本领域众所周知的，在美国US 2004/0006125中描述。

产生本发明单克隆抗体的转染瘤的制备

例如，利用本领域公知并且在US 2004/0006125中详细记载的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染瘤系统中产生本发明使用的抗体。

人单克隆抗体与CD30结合的表征

为了表征本发明的人单克隆CD30抗体的结合，可通过如ELISA对来自被免疫的小鼠的血清进行检验。在ELISA规程的一个典型(但非限制性的)例子中，将微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml纯化的CD30包被，然后用PBS中5％的牛血清清蛋白封闭。将来自CD30免疫的小鼠血浆的稀释物加入到每一个孔中，并于37℃温育1-2小时。将平板用PBS/Tween洗涤，然后于37℃与偶联到碱性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂温育1小时。洗涤后，将平板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并在405-650的OD进行分析。优选地，将发展了最大效价的小鼠用于融合。

如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与CD30免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将高亲合力结合CD30的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140℃下，用于抗体纯化。

为了纯化人抗-CD30抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD₂₈₀确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

为了确定选择的人抗-CD30单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的CD30包被的ELISA板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。

为了确定被纯化的抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。例如，在4℃下用10μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用5％BSA封闭之后，平板与10μg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。

为了证明单克隆抗体与表达CD30的活细胞的结合，可应用流式细胞术。在流式细胞术规程的典型(但非限制性)例子中，使表达CD30的细胞系(在标准生长条件下生长)与含有0.1％BSA和20％小鼠血清的各种浓度的单克隆抗体混合，并于37℃温育1小时。洗涤后，使细胞在与第一抗体染色相同的条件下与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。样品可通过FAcscan设备进行分析，该设备应用光学和侧面散射的性质来为单细胞画门(gate)。除流式细胞仪测定之外或代替该测定，可应用作为替代的应用荧光显微镜的测定。细胞可精确地如上所述进行染色，并由荧光显微镜进行检查。该方法使得能够观察到单个细胞，但依赖于抗原的密度可能灵敏性降低。

抗CD30的人IgG可进一步通过蛋白质印迹法检验与CD30抗原的反应性。例如，可以制备来自表达CD30的细胞的细胞提取物，并将其进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％的小鼠血清进行封闭，并用要检验的单克隆抗体进行探测。人IgG的结合可应用抗人IgG的碱性磷酸酶进行探测，并用BCIP/NBT底物片剂进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。

抗CD30的人单克隆抗体的吞噬和细胞杀伤活性

除与CD30的特异性结合之外，可对人类单克隆抗CD30抗体介导表达CD30的细胞的吞噬作用和杀伤的能力进行检验。单克隆抗体活性的体外检验将在检验体内模型之前提供初始的筛选。简言之，来自健康供体的多形核细胞(PMN)或其他效应细胞可通过FicollHypaque密度离心及随后裂解污染的红细胞而进行纯化。洗涤的PMN可悬浮于补充了10％热灭活的胎牛血清的RPMI中，并以效应细胞对肿瘤细胞(效应细胞∶肿瘤细胞)的各种比例与⁵¹Cr标记的表达CD30的细胞混合。然后可以添加各种浓度的纯化的人抗CD30IgG。可以使用无关人IgG作为阴性对照。测定可于37℃进行4-18小时。可通过测量释放入培养上清液中的⁵¹Cr以测定样品的细胞溶解。也可对抗CD30单克隆抗体的相互组合进行检验，以确定多个单克隆抗体是否增强了细胞溶解。

也可在体内模型(如小鼠)中检验与CD30结合的人单克隆抗体，以确定它们在介导表达CD30的细胞如肿瘤细胞的吞噬作用和杀伤中的功效。例如，可基于如下标准选择这些抗体，该标准不是排他的：

1)与表达CD30的活细胞结合；

2)与CD30结合的高亲和力；

3)与CD30上独特的表位的结合(以消除当组合应用时具有互补活性的单克隆抗体将竞争结合相同表位的可能性)；

4)表达CD30的细胞的调理作用；

5)在存在人类效应细胞时介导表达CD30的细胞的生长抑制、吞噬作用和/或杀伤。

本发明优选的人单克隆抗体满足这些标准的一个或多个，且优选地满足全部标准。在一个特定实施方案中，这些人单克隆抗体组合应用，如作为包含两种或多种抗CD30单克隆抗体或其片段的药物组合物应用。例如，具有不同但互补活性的人抗CD30单克隆抗体可在单个治疗中进行组合，以实现所需的治疗或诊断作用。其一个例子为一种组合物，该组合物含有在效应细胞存在时介导对目标细胞的高效杀伤的抗CD30人单克隆抗体与另一种抑制表达CD30的细胞生长的人抗CD30单克隆抗体。

与CD30结合的双特异性/多特异性分子

在本发明方法的另一实施方案中，抗CD30的人单克隆抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到另一个功能性分子上，如另一个肽或蛋白质(例如Fab′片段)上，生成可与多个结合位点或目标表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体或其抗原结合部分可与一个或多个其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)。本发明中有用的双特异性分子包括US 2004/0006215所述的那些。在一个特定实施方案中，双特异性抗体是H22xKi4，它也记载在US2004/0006215中。

如在此处所用的，“效应细胞特异性抗体”指结合效应细胞的Fc受体的抗体或功能性抗体片段。用于本发明中的优选抗体在未由内源免疫球蛋白结合的位点处结合效应细胞的Fc受体。

如在此处所用的，术语“效应细胞”指与免疫反应的识别阶段和活化阶段相反，参与免疫反应的效应阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括髓样或淋巴样来源的细胞，如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL)、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体，并发挥特定的免疫功能。在优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，如嗜中性粒细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcγRI的单核细胞、巨噬细胞参与目标细胞的特异性杀伤和将抗原呈递到免疫系统的其他成分或与呈递抗原的细胞结合。在其他实施方案中，效应细胞可吞噬目标抗原、目标细胞或微生物。效应细胞上特定FcR的表达可由体液因子如细胞因子调节。例如，已发现FcγRI的表达可由干扰素γ(IFN-γ)上调。该增强的表达可增加带有FcγRI的细胞对目标的细胞毒性活性。效应细胞可吞噬或溶解目标抗原或目标细胞。

“目标细胞”应指受试者(如人类或动物)中任何不需要的细胞，该细胞可由本发明的组合物(如人单克隆抗体、双特异性或多特异性分子)导向。在优选实施方案中，目标细胞是表达或过度表达CD30的细胞，例如CD30阳性淋巴瘤。表达CD30的细胞一般包括肿瘤细胞，如膀胱、乳腺、结肠、肾、卵巢、前列腺、肾细胞、扁平细胞、肺(非小细胞)和头颈肿瘤细胞。其他目标细胞包括滑膜成纤维细胞。

嵌合的小鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可由本领域公知的重组DNA技术生产。例如，用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以去除编码鼠Fc的区域，并替代为编码人类Fc恒定区的基因的等价部分。(参见Robinson等人，国际专利申请PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际中请WO 86101533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人(1988Science 240：1041-1043)；Liu等人(1987)PNAS84：3439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；Shaw等人，1988，J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)。

嵌合抗体可进一步通过用来自人类Fv可变区的等价序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列而进行人源化。人源化抗体的综述由Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207和Oi等人，1986，BioTechniques 4：214提供。这些方法包括分离、处理和表达编码来自至少一个重链或轻链的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这种核酸的来源是本领域技术人员众所周知的，例如，可从7E3获得，即一种产生抗GPII_bIII_a抗体的杂交瘤。然后，可将编码嵌合抗体的重组DNA或其片段克隆入适当的表达载体中。适当的人源化抗体可选择地由CDR替代产生。美国专利号5,225,539；Jones等人，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等人，1988 Science 239：1534和Beidler等人，1988 J.Immunol.141：4053-4060。

特定的人类抗体的所有CDR均可由至少一部分非人类的CDR替代，或者仅有一些CDR可由非人类的CDR替代。仅需要替代将人源化抗体结合到Fc受体上所必需的CDR的数目。

抗体可通过任何能够用源自非人类抗体的CDR替代至少一部分人类抗体的CDR的方法进行人源化。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的方法(于1989年3月26日提交的英国专利申请GB 2188638A)，将其内容清楚地引入作为参考。人类CDR可应用寡核苷酸定点诱变而由非人类的CDR替代，如描述于题为Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin  G onHuman Mononuclear Phagocytes的国际申请94/10332中的那样。

同样在本发明范围内的是嵌合的和人源化的抗体，其中特定的氨基酸已被替代、缺失或添加。具体而言，优选的人源化抗体在构架区中具有氨基酸替代，从而改进与抗原的结合。例如，在一种具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人类构架区中的氨基酸可由位于小鼠抗体中相应位点的氨基酸替代。已知这种替代在一些例子中可改进人源化抗体与抗原的结合。此处将氨基酸已进行添加、缺失或替代的抗体称为修饰的抗体或改变的抗体。

术语修饰的抗体也意欲包括已通过如缺失、添加或替代抗体的部分进行修饰的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例知，抗体可通过缺失恒定区并将其替代为意欲增加抗体的半衰期如血清半衰期、稳定性或亲和力的恒定区而进行修饰。任何修饰均在本发明范围之内，只要双特异性和多特异性分子具有至少一个对FcγRI特异性的抗原结合区，并触发至少一种效应功能。

本发明的双特异性和多特异性分子可应用化学技术(参见如D.M.Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(参见授予Reading的美国专利号4,474,893)或重组DNA技术制备。

具体而言，本发明的双特异性和多特异性分子可通过应用本领域中公知的和在此处提供的实施例中描述的方法偶联组分结合特异性如抗-FcR和抗-CD30结合特异性而制备。例如，双特异性和多特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后相互偶联。当结合特异性为蛋白质或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来既亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见如Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其他方法包括那些由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等人(Science(1985)229：81-83和Glennie等人，(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所描述的方法。优选的偶联试剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。

当结合特异性是抗体时(如两种人源化抗体)，它们可通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个巯基残基，优选为1个。

可选择地，两种结合特异性可在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性和多特异性分子是MAb×MAb，MAb×Fab，Fab×F(ab′)₂或配体×Fab融合蛋白质时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性和多特异性分子，如双特异性分子，可为单链分子，如单链双特异性抗体，包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可为单链分子，或者可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性和多特异性分子的方法描述于如美国专利号5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。

双特异性和多特异性分子与其特异性目标的结合可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或蛋白质印迹测定进行证实。这些测定的每一个通常通过应用对感兴趣的复合物特异性的标记试剂(如抗体)检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可应用如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段进行检测。可选择地，该复合物可应用多种其他免疫测定中的任何一种进行检测。例如，抗体可为放射性标记的并用于放射免疫测定(RIA)中(参见如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月，在此处将其引入作为参考)。放射性同位素可通过以下方法检测，如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影。

免疫偶联物

另一方面，本发明中使用的抗体可以与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素的治疗性部分偶联。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺白)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的Mylotarg^TM；Wyeth。

可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明中使用的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型，用于偶联治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。

本发明中使用的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括Zevalin^TM(IDECPharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。

本发明方法中使用的抗体偶联物可以修饰特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。

将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies’84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

蛋白酶体抑制剂

本发明需要施用通过直接或间隔抑制的NF-κB的抑制剂，联合抗CD30抗体，以治疗CD30阳性淋巴瘤。蛋白酶体抑制剂在本发明的方法中有用。在一个特定实施方案中，蛋白酶体抑制剂降低或阻断了哺乳动物细胞中发现的26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性。26S蛋白酶体是一种大蛋白质复合体，降解泛素化的蛋白质和间接激活NF-κB途径。蛋白酶体活性的选择性抑制具有大量的可能与癌症治疗有关的效果，包括减弱控制细胞炎症应答的转录因子NF-κB的活性，和抑制bcl-2的活性，bcl-2是一种与细胞存活有关的基因。提高的NF-κB和bcl-2活性使癌细胞能够防御标准化学治疗剂的治疗。通过阻断NF-κB和bcl-2的正常功能，蛋白酶体抑制剂可以导致癌细胞的死亡。因此，例如通过抑制26S蛋白酶体的活性直接或间接降低NF-κB活性的化合物，能够在本发明的方法中使用。

蛋白酶体活性的抑制剂及其制备方法是本领域公知的，例如，美国专利No.5,780,454，6,066,730，6,083,903，6,297,217，6,465,433，6,548,668，6,617,317和6,747,150中描述的硼酸和酯化合物。其它蛋白酶体抑制剂包括肽醛，例如ALLnL(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨醛(N-acetyl-leucinyl-leucycil-norleucynal)，MG101)、LLM(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-甲硫氨醛(N-acetyl-leucinyl-leucynil-methional)、Z-LLnV(苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正缬氨醛(carbobenzoxyl-leucinyl-leucynil-norvalinal)，MG115)、Z-LLL(苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛(carbobenzoxyl-leucinyl-leucynil-leucynal)，MG132)，乳胞素及其β-内酯(Lactacystine，b-lactone)、硼酸肽(Boronic Acid Peptides)、泛素连接酶抑制剂(Ubiquitin Ligase Inhibitors)、环孢菌素A、FK506(他克莫司)和脱氧精胍菌素。

另外，可以通过DNA结合试验检测化合物抑制NF-κB激活的能力(Palombella，等人，Cell 78.773(1994))。例如，可以由未处理的或用待测化合物预处理1小时的TNF-α处理的细胞制备全细胞提取物。使用来源于人IFN-β基因启动子的PRDII探针根据电泳迁移率变动分析测定NF-κB的DNA结合活性。作为NF-κB激活的间接测定指标，可以利用细胞表面荧光免疫结合试验测定初级人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上E-选择素、I-CAM-1和V-CAM-1的细胞表面表达。由于E-选择素、I-CAM-1和V-CAM-1处于NF-κB的调控下，NF-κB激活的抑制导致细胞表面上这些粘附分子水平降低。

在本发明的一个特定实施方案中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米(Millenium Pharmaceuticals；Cambridge，MA)，它是26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，在美国专利No.5,780,454中描述。在另外一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂是MG-132(Calbiochem，CA)。

如此处使用的短语“抑制NF-κB的化合物”用来指直接或间接影响NF-κB活性，从而使NF-κB活性降低或阻断，以致引起凋亡的任意化合物。上述蛋白酶体抑制剂是间接影响NF-κB活性的化合物的例子。

药物组合物

本发明的方法使用(i)一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的抗CD30抗体或其抗原结合部分，和(ii)一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的蛋白酶体抑制剂。抗体组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)如本文所述的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，抗体药物组合物可以含有结合CD30上的不同表位或具有互补活性的抗体组合(或免疫偶联物或双特异性分子)。

本发明中使用的药物组合物也可以进一步与其它的药物联用。例如，需要时，本发明的联合治疗，即抗体和蛋白酶体抑制剂，可包括至少一种其他的抗肿瘤或细胞抑制或细胞毒性剂。可在联合治疗中使用的其他治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。

如此处所用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(如通过注射或输注)。根据给药途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。

这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂范围外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体的给药，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至25mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，12.5mg/kg体重、15mg/kg体重、或20mg/kg体重、或25mg/kg体重、或在1-25mg/kg范围内。一个治疗方案的例子需要每周同时给予抗体和蛋白酶体抑制剂组合物一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗-CD30抗体的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。

对于蛋白酶体抑制剂的给药，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更典型地为0.01至25mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重、12.5mg/kg体重、15mg/kg体重、或20mg/kg体重、或在1-20mg/kg范围内。一个治疗方案的例子需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗-CD30蛋白酶体抑制剂的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该蛋白酶体抑制剂使用如下剂量方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常在有必要时多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

另外，抗体和蛋白酶体抑制剂也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的抗-CD30抗体和蛋白酶体抑制剂的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于CD30+肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在如下文实施例部分所述的预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。另外，也可以通过本领域技术人员公知的试验检查该化合物的体外抑制能力，来评价组合物的这种性能。这些测定在下文的实施例中描述，例如XTT测定、报道基因测定、TUNEL测定、膜联蛋白。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如受试者的大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。如此处所用的短语“肠胃外给药”是指肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

此外，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p 120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本发明的组合物可以通过本领域公知的多种方法施用。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或模式将根据期望的结果而不同。活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustained andcontrolled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1978。

为了通过特定给药途径施用本发明的化合物，有必要将化合物包裹上阻止其失活的材料，或者将该化合物与该材料共同给药。例如，该化合物可以在适当的载体中给受试者给药，例如脂质体或稀释剂。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水型CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂外，涉及其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卯磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

对于治疗组合物，本发明的制剂包括那些适合于口服、经鼻的、局部的(包括经口的和舌下的)、直肠的、阴道的和/或肠胃外施用的制剂。这些制剂可方便地以单位剂量形式存在，且可通过药剂学领域中公知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将依赖于要治疗的受试者和特定的给药模式而变化。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量通常为产生治疗作用的组合物的量。通常，在100％中，该量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。

如在此处所用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外给药的”指不同于肠的和局部给药的给药模式，通常通过注射，且包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。

抗体和蛋白酶体抑制剂组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

当本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，它们可单独施用，或者作为药物组合物施用，该药物组合物含有如与药学上可接受的载体组合的0.01-99.5％(更优选地为0.1-90％)的活性成分。

不管所选择的给药途径如何，将可以以适当的水合形式施用的本发明化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员公知的常规方法制备为药学上可接受的剂量形式。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本领域普通的医生或兽医易于确定并开具有效量的所需药物组合物。例如，医生或兽医可以由低于为实现所需的治疗作用所必需的剂量开始应用药物组合物中应用的本发明化合物，并逐渐增加剂量，直到实现了所需的作用。通常，本发明组合物适当的日用剂量为可有效产生治疗作用的最小剂量。这种有效剂量通常依赖于上述因素。优选的是通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下进行施用，且优选的是施用于目标部位近处。如果需要，治疗组合物的有效日用剂量可在一日中以适当间隔以单独施用的2次、3次、4次、5次、6次或更多次亚剂量进行施用，任选地以单位剂量的形式。尽管可能单独施用本发明的化合物，但优选的是作为药物制剂(组合物)施用。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同类型可包括本发明的制剂，以及本发明的分子的成分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，将本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包括导向性部分。在一个最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过快速注射送递到靠近所需区域的部位，如炎症或感染部位，或者肿瘤部位。组合物必须具有易于注射的流动程度。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

相对于未治疗的受试者而言，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。组合物抑制肿瘤的能力可在预示在人类肿瘤中的功效的动物模型中进行评估。可选择地，组合物的该性质可通过用技术人员公知的试验检查化合物抑制如体外抑制的能力而进行评估。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤大小，或者缓解患者的症状。本领域技术人员能够基于如下因素确定这种量，该因素如受试者大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

组合物必须是无菌的，且流动性达到该组合物可通过注射器送递的程度。除水之外，载体可为等渗缓冲的盐溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适当的混合物。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。在许多情形中，在组合物中优选地包含等渗剂，例如，糖；多元醇(polyalcohol)，如甘露醇、山梨糖醇；和氯化钠。注射型组合物长期的吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，如单硬脂酸酯或明胶来实现。

如上所述，当活性化合物得到适当保护时，该化合物可应用如惰性稀释剂或可同化的可食用载体进行口服。

例如，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有致瘤性病症的受试者，如特征在于存在表达CD30的肿瘤细胞的病症，包括如何杰金氏病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T细胞或B细胞淋巴瘤。本发明的人抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有其他病症的患者，如自身免疫病，包括如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。

在一个特定实施方案中，本发明的方法用于在体内治疗、预防或诊断多种CD30-相关的疾病.其中CD30-相关的疾病的例子包括癌症、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T细胞或B细胞淋巴瘤。其它CD30-介导的疾病包括自身免疫病，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。

在一个特定实施方案中，本发明的抗体(如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可用于治疗或预防何杰金氏病(HD)，这是因为抗体可限制CD30在HD和其他致瘤性疾病的进展中所起的作用。何杰金氏病是一类淋巴瘤。淋巴瘤是在淋巴系统中发展的癌症，淋巴系统是身体免疫系统的一部分。因为在身体的许多部分存在淋巴组织，所以HD几乎可在身体的任何部分开始。癌可扩散到身体中的几乎任何器官或组织，包括肝、骨髓(身体大骨骼中产生血细胞的海绵组织)和脾。已报道何杰金氏和Reed-Sternberg细胞中CD30升高的表达与HD的区分性诊断相关。因此，本发明的CD30抑制性抗体联合蛋白酶体抑制剂可用于预防或阻断导致HD的CD30的作用，因而，可用于预防或治疗该疾病。

本发明的人抗体(如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)与蛋白酶体抑制剂组合也可用于阻断或抑制CD30的其他作用。例如，已知CD30也由多种非何杰金氏淋巴瘤亚型进行有规律的表达。因此，本发明抗体的另一个用途包括预防和治疗与非何杰金氏淋巴瘤有关的疾病。这些疾病包括伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特氏淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞淋巴瘤(T-ALL)和中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤。

在另一个特定实施方案中，本发明的方法也可用于阻断或抑制CD30的其他作用。例如，已知可溶性CD30有规律地从表达CD30的细胞表面释放。在患有多种致病性和自身免疫病症的患者血清中已报道有升高的sCD30水平。因此，抗CD30抗体联合蛋白酶体抑制剂的另一个用途包括预防或治疗疾病，包括阻断或抑制sCD30的释放。这些疾病包括，但不局限于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病和Omen氏综合征。

在体内和体外通过本发明的方法施用抗体和蛋白酶体抑制剂药物组合物的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用。使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。

如前所述，本发明的人抗-CD30抗体和蛋白酶体抑制剂可以与诸如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂等一种或多种其他治疗剂共同给药。抗体可以与该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。对于后者(分开给药)，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗如抗癌治疗例如放射治疗共同应用。这些治疗剂包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/m²的剂量静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天1次。与其他化疗剂共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同的机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。

靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)有关的效应细胞，也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所治疗的受试者中获得。靶特异性效应细胞可以作为细胞在生理学可接受的溶液中的悬浮液给药。施用的细胞数可以是10⁸-10⁹个的数量级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处如表达CD30的肿瘤细胞处的集中，以及通过例如吞噬作用实现对细胞的杀伤。给药途径也可以不同。

应用靶特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一起进行。例如，使用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或具有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-CD30抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂一起使用。

本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcαR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽以及将其清除。抗-Fc受体的混合物也可以用于该目的。

具有补体结合位点，如来自IgG1、-2或-3或IgM的补体结合部分的本发明使用的抗体和蛋白酶体抑制剂药物组合物，也可以在补体的存在下使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适宜的效应细胞离体处理含有靶细胞的细胞群体能够通过加入补体或含有补体的血清来实现。补体蛋白的结合能够改善用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一实施方案中，用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞也能够被补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不激活补体。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可以与补体一起施用。因此，在本发明的范围内包括含有人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为补体与人抗体、多特异性或双特异性分子紧密接近。另外，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清也可以单独施用。

因此，可以给用本发明的抗体和蛋白酶体抑制剂组合物治疗的患者(在本发明的人抗体给药之前、同时或之后)另外施用另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，该治疗剂可以增强或增加人抗体的治疗效果。

在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcα受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

在另一个实施方案中，受试者可额外用淋巴因子制剂进行治疗。应用淋巴因子制剂可诱导不高度表达CD30的癌细胞表达CD30。淋巴因于制剂可导致肿瘤细胞中更均一的CD30表达，这可导致更有效的治疗。适合于施用的淋巴因子制剂包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子及其组合。这些制剂可在静脉内施用。适当的淋巴因子剂量为10,000-1,000,000单位/患者。

本发明使用的抗体和蛋白酶体抑制剂组合物也可用于导向于表达FcγR或CD30的细胞，例如标记这些细胞。对于这种用途，结合剂可以与可被检测的分子连接。因而，本发明提供了来自体内或在体外定位表达Fc受体如FcγR或CD30的细胞的方法。可被检测的标记可为如放射性同位素、荧光化合物、醇或酶辅因子。

在另外一些实施方案中，本发明提供了通过给受试者施用上述人抗体而治疗受试者中CD30介导的病症的方法，如何杰金氏病、成人T细胞淋巴瘤、传染性单核细胞增多症和系统性红斑狼疮。将这种抗体及其衍生物用于抑制与某些病症相关的CD30诱导的活性，如增殖和分化。可由本发明的抗体抑制的其他CD30诱导的活性包括增加的sCD30产生、增加的IL-4表达和增加的Th2表型的产生。通过使抗体与CD30接触(如通过给受试者施用抗体)，CD30诱导这种活性的能力受到抑制，因而相关的病症得到治疗。优选的抗体与对CD30特异性的表位结合，因而，有利地抑制CD30诱导的活性，但不干扰结构相关的表面抗原如NGFR、CD27和CD40的活性。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防由人CD30介导的致瘤性病症的方法，如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T细胞或B细胞淋巴瘤。该方法包括以治疗和预防病症的有效量给受试者施用本发明的抗体组合物。抗体组合物可单独施用，或者与另一种治疗剂一起施用，如与该抗体组合物联合或协同作用以治疗或预防CD30介导的疾病的细胞毒性剂或放射毒性剂。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗何杰金氏病的方法。在另一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗ALCL的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防由人CD30介导的自身免疫病的方法，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状膝肿、桥本甲状膝炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。该方法包括以治疗和预防病症的有效量给受试者施用本发明的抗体组合物。抗体组合物可单独施用，或者与另一种治疗剂一起施用，如与该抗体组合物联合或协同作用以治疗或预防CD30介导的疾病的免疫抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明的免疫偶联物可用于通过使这种化合物与抗体连接而使用蛋白酶体抑制剂将化合物(如治疗剂、标记、细胞毒素、放射毒素、免疫抑制剂等)导向于在其表面上结合有(如膜结合的或与CD30受体结合的)CD30的细胞。因而，本发明也提供了来自体内或在体外定位表达CD30和CD30受体的细胞的方法，该细胞如何杰金氏细胞或Reed-Sternberg细胞(如具有可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可选择地，免疫偶联物可用于通过将细胞毒素或放射毒素导向于CD30而杀伤在其表面上结合有(如膜结合的或与CD30受体结合的)CD30的细胞。

本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将该实施例理解为进一步的限制。

实施例

人抗CD30抗体激活NF-κB并且使淋巴瘤细胞对蛋白酶体抑制剂诱导的凋亡敏感

5F11是一种抗CD30的全人单克隆抗体，已经显示在体外及体内有效诱导表达CD30的淋巴瘤细胞系的生长停滞或杀伤。但是，某些细胞系证明对5F11诱导的凋亡有部分乃至完全抗性。在该实施例中，测试了5F11和硼替佐米的组合的效果，硼替佐米是一种具有抗肿瘤活性的蛋白酶体抑制剂。使用XTT存活检验、TUNEL测定和FACS分析，发现5F11和硼替佐米对何杰金细胞系(L540，L428)和表达CD30的ALCL Karpas 299有协同细胞毒性作用。而且，SCID小鼠中皮下L540来源的人何杰金肿瘤的生长被5F11和硼替佐米的组合抑制，而单独每种药物的组合效果效果较差。在体外所见的5F11和硼替佐米的协同作用依赖于使用的日程，仅在同时加入两者或者首先用5F11预孵育细胞时观察到。

材料与方法

细胞系

何杰金来源的细胞系(L540和L428)、间变性大细胞淋巴瘤来源的Karpas299和CD30-阴性急性淋巴性白血病来源的细胞系REH从德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures(DMSZ))获得，以前已有描述。所有细胞都在添加了10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FCS)、50μg/ml链霉素、50μg/ml青霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中在37℃和5％CO₂气氛下培养。培养基在进行试验前24小时每周更换两次。在FCS和不含抗生素的培养基(简单培养基)中进行测定。

抗体、试剂和质粒

抗CD30抗体5F11由Medarex Inc.(Bloomsbury，NJ)惠赠。山羊抗人Fc抗体(GaH)购自Dianova/Jackson，USA。蛋白酶体抑制剂MG-132购自Calbiochem，CA，硼替佐米(Velcade)购自Millennium，MA。

兔抗p65-IgG和FITC-标记的小鼠抗兔IgG从Santa Cruz，USA获得。测定NF-κB激活的表达载体和报道构建体(NF-κB-luc，IkBaM)购自Clontech，BD Biosciences，CA(Mercury Vector Set)。

XTT-试验

96孔微量滴定板(组织培养级，平底)的每个孔中培养2×10⁴个细胞。细胞在37℃下与5μg/ml抗CD30抗体5F11和25μg/ml交联的抗体山羊抗人(GaH)预孵育。孵育30分钟后，添加指定浓度的硼替佐米，每孔的总体积最多200μl，细胞在37℃下孵育48小时。每个测定一式三份进行。对照孔的孵育时间和浓度(单独的和组合的每种抗体，硼替佐米而不含5F11)如上所述。

为了测定细胞存活率，将细胞用含有1.49mM XTT和0.025mM吩嗪硫酸甲酯的新鲜简单培养基脉冲4小时，应用ELISA读数器(Bio-Tek，Winooski，Vermont，USA)测量样品在450nm和650nm(参考波长)的分光光度吸收值。计算与未处理的对照培养相比，达到四唑鎓甲酰苯胺(tetrazolium carboxanilide)更新的50％减少所需的浓度(IC₅₀)。

瞬时转染和萤光素报道基因测定

在1ml培养基中的5×10⁶ L428细胞通过电穿孔用10μg NF-κB-luc、IkBaM和CMV-GFP瞬时转染。将细胞接种于含有另外2ml简单培养基的六孔板中。37℃孵育24小时后，检测GFP转染的细胞的绿色荧光，作为瞬时转染率的指示，瞬时转染率为5％至10％不等。在37℃下，细胞与20μg/ml 5F11+100μg/ml GaH孵育2小时，或与10ng/ml硼替佐米或这两者或简单培养基孵育12小时。收集细胞后，用PBS(磷酸缓冲液)洗涤两次。

用1ml冰冷的报道裂解缓冲液(Promega)进行裂解，裂解液在-70℃冷冻1小时。使用30μl裂解液在96孔光度板(luminometry-plate)中测定萤光素酶活性，并通过发光法(luminometry)分析。使用用报道基因转染的未处理的细胞获得基线NF-κB活性。所有测定都一式三份进行，以获得平均值和标准差。

TUNEL测定和使用间接免疫荧光的NF-κB检测

提供细胞离心涂片器(Cytospins)(1min，1000U/min)以在单细胞水平上测定5F11和/或硼替佐米对L428和L540细胞中的凋亡和NFκB-激活的作用。将2×10⁵个细胞接种到六孔微量滴定板上的3ml简单培养基(对照)中，或含有5F11+GaH(5μg/25μg/ml)或硼替佐米(10nM)或两者。5F11的孵育时间为30分钟，交联的GaH为1小时，硼替佐米为至少6小时，均在37℃下。玻片在室温下干燥过夜，用冰冷的丙酮固定(孵育30秒钟)。用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red(Roche))按照厂商说明进行TUNEL试验。最后，细胞用含有DAPI的VECTASHIELD封固培养基(Mounting Medium)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封固，或用兔抗-p65抗体(Santa Cruz，10nM)和FITC标记的小鼠抗兔第二抗体(10nM)染色。细胞离心涂片器制品通过荧光显微镜检查进行分析。

为了排除非特异性抗体结合，未处理的细胞的玻片用兔抗p65-IgG或FITC-偶联的小鼠抗兔-IgG或DAPI染色。

膜联蛋白V结合试验

2×10⁵ L540细胞与5F11/GaH、硼替佐米或两者在如上所述的简单培养基中37℃孵育12小时(一式三份)。为了检测凋亡细胞，在如推荐的用偶联到荧光素的膜联蛋白V染色后，通过流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸向质膜外部小叶的移位(FACS calibur Bengton &Dickinson流式细胞仪)(膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒I，BDBioscience，USA)。利用三份重复计算平均值和标准差。

SDS-PAGE和Western印迹分析

在1×Laemmli溶液中制备全细胞蛋白质提取物(10μg)，使用4-15％的凝胶通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Hybond-C，Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Freiburg，Germany)上，用Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)在室温下封闭1小时。免疫印迹与从Apoptosis Sampler Kits I和II(BDBioscience，CA)获得的第一抗体在含10％胎牛血清的PBS中孵育。c-flip特异性抗体购自Sigma(F-6550)。结合的抗体1/10000稀释的辣根过氧化物酶偶联的驴抗小鼠或兔IgG mAb第二抗体(Dianova，Hamburg，Germany)或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Dianova)检测。按照厂商说明，用ECL Western印迹检测试剂(Amersham Pharmacia)显示蛋白质。

电泳迁移率变动分析

进行电泳迁移率变动分析(EMSA)来显示NF-κB与DNA的结合。来自不同抗体处理的细胞的核蛋白质提取物(5μg；20mMHEPES，pH 7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA)与³²p-标记的具有NF-κB结合序列的寡核苷酸(Santa Cruz)在室温下孵育30分钟。在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上利用电泳分离DNA/蛋白质复合物。

人HD的异种移植模型

人HD的异种移植模型在以前已经描述(17)。通过将重悬浮在200μL PBS中的L540Cy细胞(1×10⁷)注射到无病原体重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(FOX CHASE SCID；Taconic M&B A/S，Ry，Denmark)的右胁中建立皮下实体L540Cy肿瘤。每3天测量肿瘤发展，使用公式(长度×宽度×高度/2)确定肿瘤体积。具有建立的大约100mm³的肿瘤的动物随机分为4组，接受100μg 5F11(在200μL PBS中，腹膜内)，6小时后经尾静脉静脉内接受10ng硼替佐米或单独的每种试剂，总共注射4次。对照小鼠只接受PBS。当对照组肿瘤直径中值超过2500mm³时(第50天)，停止实验并杀死小鼠。治疗组和对照组各由4只动物组成，结果经重复实验证实。

结果

5F11抗体和硼替佐米的组合提高了针对HD-和ALCL-来源的细胞系的细胞毒性

在单细胞水平上分析了部分凋亡抗性HD来源的细胞系L540对5F11的细胞反应。为了同时显示5F11的结合和凋亡，在进行TUNEL测定之前，将L540细胞与5F11和FITC标记的交联山羊抗人抗体一起孵育。所有L540细胞都在与5F11和GaH-FITC孵育后染色，表明整个群体都是CD30阳性的。使用这些细胞的TUNEL测定表明所有细胞都以相当的水平结合5F11，而只有一部分细胞凋亡。这些数据提示L540细胞通过5F11对CD30刺激的差异应答可能是由于甚至在单细胞型中下游信号分子的异源表达。已知在何杰金氏细胞中表达的一种这样的候选物是转录因子NF-κB，它保护肿瘤细胞免于凋亡。

如果5F11诱导L540细胞中的NF-κB激活，从而使这些细胞耐受凋亡，则在NF-κB抑制时凋亡率应当提高。因此，将细胞暴露于MG132与5F11/GaH的组合，MG132是一种已知抑制NF-κB阻抑物IkB降解的蛋白酶体抑制剂。5F11和MG132的组合在大多数细胞中诱导凋亡，尽管每种试剂都使用亚毒性浓度。利用膜联蛋白-V染色和FACS分析对凋亡率进行定量。单独的抗体或MG132没有使凋亡较对照组增多，而组合的凋亡率大约为60％。总之，数据证明5F11-介导的CD30交联和硼替佐米对凋亡的诱导具有协同作用(参见，图M-1G)。

5F11和蛋白酶体抑制的细胞毒性能力通过对不同细胞系的XTT存活率试验来确定。显示的是使用蛋白酶体抑制剂bortexomib的实验，但是用MG132获得类似的结果(数据未示出)。在检测的每一种细胞系中，硼替佐米与5F11的组合显然降低了细胞存活率。在导致存活率最小降低的硼替佐米浓度(25ng/ml)时，当用亚毒性浓度的5F11预处理时，L540细胞被完全杀死。对于Karpas 299细胞和L428细胞获得类似的结果，它们甚至在较高浓度时仍耐受5F11(17)。为了分析5F11预孵育是否是协同作用所必需的，将顺序改变为首先将L428与硼替佐米孵育30分钟，然后与抗体孵育。如图2所示，这种设置没有提高硼替佐米的细胞毒活性。因此，5F11结合诱导的CD30信号可能对于硼替佐米对HD-来源的细胞系的细胞毒性的显著提高是非常重要的。

为了证明细胞毒性协同作用对CD30是否是特异性的，用不表达CD30的急性淋巴细胞性白血病细胞系REH进行XTT试验。REH细胞也被硼替佐米以剂量依赖的方式杀死，而与5F11预孵育对其细胞毒性能力没有影响(图2E)。

5F11和硼替佐米组合在人何杰金氏模型中的体内活性

也在实体皮下L540Cy何杰金氏肿瘤模型中分析了硼替佐米和5F11组合的活性。向荷瘤小鼠给予5F11、硼替佐米、5F11和硼替佐米的组合、或PBS。动物首先注射5F11，然后在6小时后施用硼替佐米；重复治疗一次4天(q×天×4)。如图3所示，与接受PBS的对照组相比，5F11和硼替佐米都诱导显著延迟的肿瘤生长。在用5F11和硼替佐米的组合处理的动物中获得甚至更具有希望的结果，因为肿瘤生长几乎完全被抑制。最重要的是，生长抑制在治疗后保持数周(用箭头标出)，而单独接受5F11或硼替佐米的动物的肿瘤显示肿瘤进展。来源于如所示治疗的L540荷瘤小鼠的肿瘤切片用苏木精染色。组织内肿瘤细胞的密度在5F11联合硼替佐米治疗后显著降低。治疗6周后L540肿瘤的组织学检查显示来源于5F11和硼替佐米联合治疗的小鼠的肿瘤组织内具有无肿瘤区。

5F11依赖的CD30信号激活NF-κB

用抗-p65mab和FITC标记的第二抗体对甲醇固定的未处理的L540细胞检测F-κB亚单位p65。NF-κB的表达水平和核定位在用交联的5F11刺激后提高，而暴露于硼替佐米导致细胞核中不含NF-κB

(细胞核用DAPI染色)。

数据提示单独的5F11可能不足以在所有何杰金氏细胞系中诱导凋亡，抗性群体似乎表现出提高的对硼替佐米的敏感性。这种作用可能是由于存活因子NF-κB的活化，NF-κB是HD中凋亡抗性的一种关键因子。另外，NF-κB是最佳表征的硼替佐米的靶标之一。在与交联的5F11和/或硼替佐米孵育后分析何杰金细胞系L540和L428中的NF-κB的亚细胞分布。在未处理的L540细胞中可检测到低水平的NF-κB亚单位p65的表达。该蛋白质定位于细胞质中，部分在细胞核中，反映了NF-κB在何杰金氏细胞中的组成型表达(4)。与5F11/GaH孵育诱导了NF-κB依赖性抗体染色和核积累的提高，证明了响应于CD30信号的NF-κB激活。当5F11刺激后30分钟给予硼替佐米时这种作用被抑制，并且导致细胞核不含NF-κB，这在6和8小时后观察到。与未处理的细胞的NF-κB染色的比较表明甚至组成型表达的NF-κB也被隔离在细胞质中。分析NF-κB分布的L428细胞在5F11+/-硼替佐米处理后获得类似的结果。

利用NF-κB-反应性萤光素酶报道基因转染的L428细胞测定NF-κB转录活性的激活(图4)。5F11刺激导致报道基因大约2倍激活。这种激活在硼替佐米的存在下被抑制，这也降低了NF-κB报道基因的基线活性。当编码IkBaM(即NF-κB抑制剂IkB的组成活性突变体)的表达载体共转染时，没有观察到萤光素酶基因的激活，表明测定的效应是NF-κB特异性的。暴露于5F11后细胞中NF-κB的DNA结合活性用电泳迁移率变动分析(EMSA)进行测定。在未处理的L540和L428细胞中可以检测到NF-κB DNA结合，暴露于交联的5F11提高了这两种细胞系中的DNA结合。在这种设置下使用抗CD30抗体Ber-H2作为不能激活NF-κB的对照(泳道3和6)，它们不诱导HD-来源的细胞系对硼替佐米的敏感性的任何提高，如在XTT试验中所测定的。发现5F11-处理的L540细胞的活细胞显示强NF-κB染色，而这在凋亡细胞中未见到，从而支持了上述观点。

5F11和硼替佐米调节抗凋亡蛋白c-flip的表达水平

已经报道有几种因子阻断凋亡级联，因此，通过Western印迹法测定与前存活(pro-survival)基因的NF-κB激活有关的候选蛋白质的表达水平。有意思的是，观察到半胱天冬酶(caspase)抑制剂c-flip的表达具有最显著的变化。在用5F11刺激CD30后，在L540和L428细胞中c-flip被强烈诱导。相反，在细胞与硼替佐米共孵育6、8、16小时后观察到c-flip的下调。只观察到bcl-2和bax表达有较少改变，在5F11交联或硼替佐米处理后TRADD和FADD的表达水平保持不变。

讨论

该实施例提供了证据证明HD细胞对CD30介导的细胞死亡的耐受性是由于NF-κB的激活，这可以用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理而克服。这一结论基于以下几点：(1)在单细胞水平上分析通过人抗体5F11的CD30刺激对NF-κB表达的影响，其中观察到抗性细胞的凋亡中表达提高。这在对5F11-介导的细胞死亡不敏感的L428细胞系中观察到，也在部分敏感性细胞系L540的抗性群体中观察到；和(2)在5F11存在下使用亚毒性浓度的硼替佐米抑制NF-κB导致凋亡急剧增加。这在体外和皮下HD肿瘤模型中均得到证明，因为5F11和硼替佐米的组合比单独的每种试剂更有效地抑制肿瘤生长。这种组合相对于单独5F11治疗的优点在2-3周后最突出，反映了5F11介导的信号传导的动力学。开始时用5F11刺激在某些细胞中诱导凋亡，而抗性细胞显示增殖率等同于、甚至高于未处理的对照细胞所估计的。尽管在许多研究中已经使用CD30受体进行靶向免疫治疗，但是对许多单克隆抗体和抗体-毒素偶联物的临床评价却令人失望(18-21)。一个例子是未偶联的mAb Ber-H2，它能够在体外有效地杀死恶性肿瘤细胞，但是在临床上显示没有治疗上的益处(20)。非常类似的，与皂草素毒素偶联的Ber-H2的免疫毒素在HD患者中只显示短暂的反应(21)。此处提供的数据提示CD30引导的免疫治疗与硼替佐米的组合将改善临床结果。

TNF-R1是TNF家族的受体，能够通过衔接蛋白(adapterprotein)的募集引发凋亡，但是也能够通过NF-κB激活和抗凋亡靶基因保护细胞免于死亡(最新综述；22)。在转染的HeLa细胞中，与TNF-R2、CD40或CD30共同刺激可以提高TNF-RI-诱导的细胞死亡。这似乎依赖于TRAF2的消耗(23)，TRAF2是对于NF-κB激活非常关键的TNF-R相关因子之一。CD30介导的共转染的TRAF-2的消耗、NF-κB失活和提高的凋亡在转染的胚胎肾癌细胞系(24，25)和ALCL系Karpas299(15)中也观察到。然而，这一机制迄今为止还没有在HD来源的细胞中得到证明，最近对于TRAF1，已经报道了在HD淋巴瘤和ALCL来源的细胞中的一种不同的功能(26)。相反，该实施例证明使用硼替佐米直接抑制NF-κB途径显然提高了HD和ALCL来源的细胞系中CD30介导的凋亡率。

用硼替佐米使原来的抗性肿瘤细胞对TRAIL介导的凋亡敏感主要不依赖于NF-κB抑制，因为半胱天冬酶8的切割提高(27)和抗凋亡蛋白c-flip的减少(28)似乎分别克服了抗性。我们观察到被NF-κB上调并且也经历泛素化和蛋白酶体降解的c-flip的表达(29，30)在CD30刺激后被激活，但是当添加硼替佐米时降低。有意思的是，最近显示c-flip是H-RS细胞中死亡受体抗性的关键调节物(31-33)。HD细胞中c-flip的表达也依赖于CD30、CD40和RANK信号调节的异常活性的MEK/ERK途径(34)。

NF-κB报道基因测定、免疫荧光和Western印迹分析证明，5F11刺激导致最初NF-κB和下游抗凋亡蛋白c-flip的初期激活，提示通过5F11的CD30信号传导可诱导肿瘤细胞对硼替佐米的敏感性。可以得出结论，当CD30刺激与蛋白酶体抑制组合时，凋亡诱导和生长刺激的平衡响应于CD30信号而向凋亡转移。在本实施例中观察到的5F 11和硼替佐米组合的体外和体内活性提示对于HD患者的治疗具有治疗价值。

其它参考文献

1.Croft，M.Costimulation of T cells by OX40，4-1BB，and CD27.Cytokine Growth Factor Rev，14：265-273，2003.

2.Cheng，X.，Kinosaki，M.，Murali，R.，and Greene，M.I.The TNFreceptor superfamily：role in immune inflammation and bone formation.Immunol Res，27：287-294，2003.

3.Izban，K.F.，Ergin，M.，Huang，Q.，Qin，J.Z.，Martinez，R.L.，Schnitzer，B.，Ni，H.，Nickoloff，B.J.，and Alkan，S.Characterization ofNF-kappaB expression in Hodgkin′s disease：inhibition of constitutivelyexpressed NF-kappaB results in spontaneous caspase-independentapoptosis in Hodgkin and Reed-Sternberg cells.Mod Pathol，14：297-310，2001.

4.Horie，R.，Higashihara，M.，and Watanabe，T.Hodgkin′slymphoma and CD30 signal transduction.Int J Hematol，77：37-47，2003.

5.Horie，R.，Watanabe，T.，Morishita，Y.，Ito，K.，Ishida，T.，Kanegae，Y.，Saito，I.，Higashihara，M.，Mori，S.，and Kadin，M.E.Ligand-independent signaling by overexpressed CD30 drives NF-kappaB activation in Hodgkin-Reed-Sternberg cells.Oncogene，21：2493-2503，2002.

6.Schneider，C.and Hubinger，G.Pleiotropic signal transductionmediated by human CD30：a member of the tumor necrosis factorreceptor(TNFR)family.Leuk Lymphoma，43：1355-1366，2002.

7.Smith，C.A.，Farrah，T.，and Goodwin，R.G.The TNF receptorsuperfamily of cellular and viral proteins：activation，costimulation，anddeath.Cell，76：959962，1994.

8.Arch，R.H.，Gedrich，R.W.，and Thompson，C.B.Tumornecrosis factor receptor-associated factors(TRAFs)--a family of adapterproteins that regulates life and death.Genes Dev，12：2821-2830，1998.

9.Baker，S.J.and Reddy，E.P.Modulation of life and death by theTNF receptor superfamily.Oncogene，17：3261-3270，1998.

10.Chiarle，R.，Podda，A.，Prolla，G.，Podack，E.R.，Thorbecke，G.J.，and Inghirami，G.CD30 overexpression enhances negative selectionin the thymus and mediates programmed cell death via a Bcl-2-sensitivepathway.J Immunol，163：194-205，1999.

11.Su，C.C.，Chiu，H.H.，Chang，C.C.，Chen，J.C.，and Hsu，S.M.CD30 is involved in inhibition of T-cell proliferation by Hodgkin′sReed-Sternberg cells.Cancer Res，64：2148-2152，2004.

12.Tarkowski，M.Expression and a role of CD30in regulation ofT-cell activity.Curr 0pin Hematol，10：267-271，2003.

13.Chakrabarty，S.，Nagata，M.，Yasuda，H.，Wen，L.，Nakayama，M.，Chowdhury，S.A.，Yamada，K.，Jin，Z.，Kotani，R.，Moriyama，H.，Shimozato，O.，Yagita，H.，and Yokono，K.Critical roles ofCD30/CD30L interactions in murine autoimmune diabetes.Clin ExpImmunol，133：318-325，2003.

14.Gruss，H.J.，Boiani，N.，Williams，D.E.，Armitage，R.J.，Smith，C.A.，and Goodwin，R.G.Pleiotropic effects of the CD30 ligand onCD30-expressing cells and lymphoma cell lines.Blood，83：2045-2056，1994.

15.Mir，S.S.，Richter，B.W.，and Duckett，C.S.Differentialeffects of CD30 activation in anaplastic large cell lymphoma andHodgkin disease cells.Blood，96：4307-4312，2000.

16.Levi，E.，Pfeifer，W.M.，and Kadin，M.E.CD30-activation-mediated growth inhibition of anaplastic large-cell lymphoma cell lines：apoptosis or cell-cycle arrest？Blood，98：1630-1632，2001.

17.Borchmann，P.，Treml，J.F.，Hansen，H.，Gottstein，C.，Schnell，R.，Staak，O.，Zhang，H.F.，Davis，T.，Keler，T.，Diehl，V.，Graziano，R.F.，and Engert，A.The human anti-CD30 antibody 5F11 shows in vitroand in vivo activity against malignant lymphoma.Blood，102：3737-3742，2003.

18.Horie，R.and Watanabe，T.The biological basis of Hodgkin′slymphoma.Drug News Perspect，16：649-656，2003.

19.Barth，S.，Huhn，M.，Matthey，B.，Tawadros，S.，Schnell，R.，Schinkothe，T.，Diehl，V.，and Engert，A.Ki-4(scFv)-ETA′，a newrecombinant anti-CD30 immunotoxin with highly specific cytotoxicactivity against disseminated Hodgkin tumors in SCID mice.Blood，95：3909-3914，2000.

20.Falini，B.，Flenghi，L.，Fedeli，L.，Broe，M.K.，Bonino，C.，Stein，H.，Durkop，H.，Bigerna，B.，Barbabietola，G.，Venturi，S.，and et al.Invivo targeting of Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin′sdisease with monoclonal antibody Ber-H2(CD30)：immunohistologicalevidence.Br J Haematol，82：3845，1992.

21.Falini，B.，Bolognesi，A.，Flenghi，L.，Tazzari，P.L.，Broe，M.K.，Stein，H.，Durkop，H.，Aversa，F.，Corneli，P.，Pizzolo，G.，and et al.Response of refractory Hodgkin′s disease to monoclonal anti-CD30immunotoxin.Lancet，339：1195-1196，1992.

22.Wajant，H.，Henkler，F.，and Scheurich，P.The TNF-receptor-associated factor family：scaffold molecules for cytokine receptors，kinases and their regulators.Cell Signal，13：389-400，2001.

23.Fotin-Mleczek，M.，Henkler，F.，Samel，D.，Reichwein，M.，Hausser，A.，Parmryd，I.，Scheurich，P.，Schmid，J.A.，and Wajant，H.Apoptotic crosstalk of TNF receptors：TNF-R2-induces depletion ofTRAF2 and IAP proteins and accelerates TNF-R1-dependent activationof caspase-8.J Cell Sci，115：27572770，2002.

24.Duckett，C.S.，Gedrich，R.W.，Gilfillan，M.C.，and Thompson，C.B.Induction of nuclear factor kappaB by the CD30 receptor ismediated by TRAF1 and TRAF2.Mol Cell Biol，17：1535-1542，1997.

25.Duckett，C.S.and Thompson，C.B.CD30-dependentdegradation of TRAF2：implications for negative regulation of TRAFsignaling and the control of cell survival.Genes Dev，11：2810-2821，1997.

26.Durkop，H.，Hirsch，B.，Hahn，C.，Foss，H.D.，and Stein，H.Differential expression and function of A20 and TRAF 1in Hodgkinlymphoma and anaplastic large cell lymphoma and their induction byCD30 stimulation.J Pathol，200：229-239，2003.

27.Johnson，T.R.，Stone，K.，Nikrad，M.，Yeh，T.，Zong，W.X.，Thompson，C.B.，Nesterov，A.，and Kraft，A.S.The proteasomeinhibitor PS-341 overcomes TRAIL resistance in Bax and caspase 9-negative or Bcl-xL overexpressing cells.Oncogene，22：4953-4963，2003.

28.Sayers，T.J.，Brooks，A.D.，Koh，C.Y.，Ma，W.，Seki，N.，Raziuddin，A.，Blazar，B.R.，Zhang，X.，Elliott，P.J.，and Murphy，W.J.The proteasome inhibitor PS-34l sensitizes neoplastic cells to TRAIL-mediated apoptosis by reducing levels of c-FLIP.Blood，102：303-310，2003.

29.Kreuz，S.，Siegmund，D.，Scheurich，P.，and Wajant，H.NF-kappaB inducers upregulate cFLIP，a cycloheximide-sensitive inhibitorof death receptor signaling.Mol Cell Biol，21：3964-3973，2001.

30.Kim，K.W.，Kim，B.J.，Chung，C.W.，Jo，D.G.，Kim，I.K.，Song，Y.H.，Kwon，Y.K.，Woo，H.N.，and Jung，Y.K.Caspasecleavage product lacking aminoterminus of IkappaBalpha sensitizesresistant cells to TNF-alpha and TRAILinduced apoptosis.J CellBiochem，85：334-345，2002.

31.Mathas，S.，Lietz，A.，Anagnostopoulos，I.，Hummel，F.，Wiesner，B.，Janz，M.，Jundt，F.，Hirsch，B.，Johrens-Leder，K.，Vornlocher，H.P.，Bommert，K.，Stein，H.，and Dorken，B.c-FLIPMediates Resistance of Hodgkin/Reed-Sternberg Cells to DeathReceptor-induced Apoptosis.J Exp Med，199：1041-1052，2004.

32.Thomas，R.K.，Kallenborn，A.，Wickenhauser，C.，Schultze，J.L.，Draube，A.，Vockerodt，M.，Re，D.，Diehl，V.，and Wolf.J.Constitutive expression of c-FLIP in Hodgkin and Reed-Sternberg cells.Am J Pathol，160：1521-1528，2002.

33.Dutton，A.，O′Neil，J.D.，Milner，A.E.，Reynolds，G.M.，Starczynski，J.，Crocker，J.，Young，L.S.，and Murray，P.G.Expressionof the cellular FLICEinhibitory protein(c-FLIP)protects Hodgkin′slymphoma cells from autonomous Fas-mediated death.Proe Natl AcadSci U S A，101：6611-6616，2004.

34.Zheng，B.，Fiumara，P.，Li，Y.V.，Georgakis，G.，Snell，V.，Younes，M.，Vauthey，J.N.，Carbone，A.，and Younes，A.MEK/ERKpathway is aberrantly active in Hodgkin disease：a signaling pathwayshared by CD30，CD40，and RANK that regulates cell proliferation andsurvival.Blood，102：1019-1027，2003.

等同方案

仅仅应用常规实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确定，在此处描述的本发明特定实施方案的许多等同方案。这种等同方案意欲包含在下面的权利要求中。

作为参考引入在此将所有此处引用的专利、未决的专利申请和其他出版物均整体引入作为参考。

                    序列表

                    序列表

<110>米德列斯公司等

<120>治疗CD30阳性淋巴瘤的方法

<130>MXI-327PC

<150>60/615284

<151>2004-10-01

<160>53

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>348

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(348)

<400>1

gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg    48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1               5                  10                  15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct    96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser

             20                  25                  30

tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg    144

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

         35                  40                  45

gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gac tct gtg    192

Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

     50                  55                  60

aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat    240

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr

 65                  70                  75                  80

ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                 85                  90                  95

gcg agg gtt cat tgg tac ttc cat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc    336

Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

            100                 105                 110

act gtc tcc tca                                                    348

Thr Val Ser Ser

        115

<210>2

<211>116

<212>PRT

<213>人

<400>2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

            100                 105                 110

Thr Val Ser Ser

        115

<210>3

<211>324

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(324)

<400>3

gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg    48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

 1               5                   10                  15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc    96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

             20                  25                  30

tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc    144

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

         35                  40                  45

atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt    192

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

     50                  55                  60

ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag    240

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

 65                  70                  75                  80

cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg    288

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

                 85                  90                  95

tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa                    324

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>4

<211>108

<212>PRT

<213>人

<400>4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

 1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

            20                  25                  30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65                  70                  75                  80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

                85                  90                  95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>5

<211>348

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(348)

<400>5

cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag    48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

 1               5                   10                  15

acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac    96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

             20                  25                  30

tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att    144

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

         35                  40                  45

ggg gaa atc aat cat agt gga agc acc aag tac acc ccg tcc ctc aag    192

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

     50                  55                  60

agc cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag cac caa ttc tcc ctg    240

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu

 65                  70                  75                  80

aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg    288

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                 85                  90                  95

aga gag act gtc tac tac ttc gat ctc tgg gge cgt ggc acc ctg gtc    336

Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

            100                 105                 110

act gtc tcc tca                                                    348

Thr Val Ser Ser

        115

<210>6

<211>116

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

 1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

            100                 105                 110

Thr Val Ser Ser

        115

<210>7

<211>321

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(321)

<400>7

gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg    48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

 1               5                   10                  15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta agc agc aac    96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

             20                  25                  30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

         35                  40                  45

tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ctc agt ggc    192

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly

     50                  55                  60

agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

 65                  70                  75                  80

gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt caa cag cgt agc aac tgg ccg tgg    288

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp

                 85                  90                  95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa                        321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

 1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>9

<211>336

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(336)

<400>9

cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag    48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

 1               5                   10                  15

acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt gct tac    96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr

             20                  25                  30

tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att    144

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

         35                  40                  45

ggg gac atc aat cat ggt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc ctc aag    192

Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

     50                  55                  60

agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg    240

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

 65                  70                  75                  80

aag ctg aac tct gta acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg    288

Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                 85                  90                  95

agc cta act gcc tac tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca    336

Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

            100                     105                     110

<210>10

<211>112

<212>PRT

<213>人

<400>10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1                5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr

            20                  25                  30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

<210>11

<211>321

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(321)

<400>11

gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga    48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

 1               5                   10                  15

gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg    96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

             20                  25                  30

tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc    144

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

         35                  40                  45

tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat gat agt tac cct atc    288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile

                 85                  90                  95

acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa                        321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>12

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

 1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>13

<211>15

<212>DNA

<213>人

<400>13

aactcttgga tgagc                                                    15

<210>14

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>14

Asn Ser Trp Met Ser

 1               5

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人

<400>15

aacataaacg aagatggaag tgagaaattc tatgtggact ctgtgaaggg c            51

<210>16

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>16

Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Gl u Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys

 1               5                   10                  15

Gly

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人

<400>17

gttcattggt acttccatct c                                             21

<210>18

<211>5

<212>DNA

<213>人

<400>18

yhwyh                                                               5

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人

<400>19

agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc                             36

<210>20

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>20

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

 1               5                   10

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人

<400>21

ggtgcatcca gcagggccac t                                            21

<210>22

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>22

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

 1               5

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>23

cagcagtatg gtagc tcacc gtggacg                                     27

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>24

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

 1               5

<210>25

<211>15

<212>DNA

<213>人

<400>25

ggttactact ggagc                                                   15

<210>26

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>26

Gly Tyr Tyr Trp Ser

 1               5

<210>27

<211>48

<212>DNA

<213>人

<400>27

gaaatcaatc atagtggaag caccaagtac accccgtccc tcaagagc               48

<210>28

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>28

Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser

 1               5                  10                  15

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人

<400>29

gagactgtct actacttcga tctc                                          24

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>30

Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu

 1               5

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人

<400>31

agggccagtc agagtgtaag cagcaactta gcc                                33

<210>32

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>32

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

 1               5                  10

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人

<400>33

gatgcatcca acagggccac t                                             21

<210>34

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>34

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

 1               5

<210>35

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>35

caacagcgta gcaactggcc gtggacg                                       27

<210>36

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>36

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr

 1               5

<210>37

<211>15

<212>DNA

<213>人

<400>37

gcttactact ggagc                                                    15

<210>38

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>38

Ala Tyr Tyr Trp Ser

 1               5

<210>39

<211>48

<212>DNA

<213>人

<400>39

gacatcaatc atggtggagg caccaactac aacccgtccc tcaagagt                48

<210>40

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>40

Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

 1               5                  10                  15

<210>41

<211>12

<212>DNA

<213>人

<400>41

ctaactgcct ac                                                       12

<210>42

<211>4

<212>PRT

<213>人

<400>42

Leu Thr Ala Tyr

 1

<210>43

<211>33

<212>DNA

<213>人

<400>43

cgggcgagtc agggtattag cagctggtta acc                                33

<210>44

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>44

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Thr

 1               5                  10

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人

<400>45

gctgcatcca gtttgcaaag t                                             21

<210>46

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>46

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

 1               5

<210>47

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>47

caacagtatg atagttaccc tatcacc                                      27

<210>48

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>48

Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr

 1               5

<210>49

<211>291

<212>DNA

<213>人

<400>49

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc  60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc  120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac  180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag a           291

<210>50

<211>285

<212>DNA

<213>人

<400>50

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca  120

gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct  240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct                  285

<210>51

<211>294

<212>DNA

<213>人

<400>51

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc  60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct  120

ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat  180

gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat  240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga        294

<210>52

<211>288

<212>DNA

<213>人

<400>52

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc  60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa  120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca  180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag  240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacct               288

<210>53

<211>285

<212>DNA

<213>人

<400>53

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc  60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct  120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc  180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct  240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcct                  285

Claims (31)

1.一种治疗CD30阳性淋巴瘤的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的(i)结合CD30的单克隆抗体，和(ii)抑制NF-κB活性的化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述抑制NF-κB活性的化合物是蛋白酶体抑制剂。

3.权利要求2的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂抑制26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性。

4.权利要求2的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、ALLnL(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨醛，MG101)、LLM(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-甲硫氨醛)、Z-LLnV(苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正缬氨醛，MG115)、Z-LLL(苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛，MG132)、乳胞素及其β-内酯、硼酸肽、泛素连接酶抑制剂、环孢菌素A、FK506(他克莫司)和脱氧精胍菌素。

5.一种治疗CD30阳性淋巴瘤的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的人单克隆抗体5F11和硼替佐米。

6.前述任一项权利要求的方法，其中所述患者在蛋白酶体抑制剂给药之前接受抗体给药。

7.一种治疗CD30阳性淋巴瘤的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的抑制NF-κB的化合物，其中所述患者以前接受过包括施用治疗有效量的抗CD30抗体的治疗。

8.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包括人IgG重链和人κ轻链。

9.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述抗体包括人IgG1或IgG3重链。

10.前述任一项权利要求的方法，其中所述单克隆抗体包括包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人重链可变区和包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人轻链可变区，其中：

(a)人重链可变区CDR3序列选自SEQ ID NO：18、30和42及其保守修饰；

(b)人轻链可变区CDR3序列选自SEQ ID NO：24、36和48及其保守修饰；

(c)该抗体以至少10⁷M^-1的亲和常数与人CD30结合；

(d)该人抗体在抗体依赖的细胞毒性(ADCC)试验中介导CD30⁺肿瘤细胞的裂解；和

(e)该人抗体在体内抑制CD30⁺肿瘤细胞的生长。

11.权利要求10的方法，其中人重链可变区CDR2序列选自SEQ ID NO：17、29和41及其保守修饰；人轻链可变区CDR2序列选自SEQ ID NO：23、35和47及其保守修饰。

12.权利要求11的方法，其中人重链可变区CDR1序列选自SEQ ID NO：16、28和40及其保守修饰；人轻链可变区CDR1序列选自SEQ ID NO：22、34和46及其保守修饰。

13.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体以至少10⁸M^-1的亲和常数与人CD30结合。

14.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体以至少10⁹M^-1的亲和常数与人CD30结合。

15.权利要求10的方法，其中人重链可变区FR1、FR2、FR3和FR4序列来源于人重链VH_4-34或VH_3-11种系序列。

16.权利要求10的方法，其中人轻链可变区FR1、FR2、FR3和FR4序列来源于人轻链L15、A27或L6种系序列。

17.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包括人重链可变区和人轻链可变区，其中：

(a)人重链可变区包括选自SEQ ID NO：2、6、10的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2、6和10至少80％同源的序列；

(b)人轻链可变区包括选自SEQ ID NO：4、8、12的氨基酸序列和与SEQ ID NO：4、8和12至少80％同源的序列；

(c)该人抗体以至少10⁷M^-1的亲和常数与人CD30结合；

(d)该人抗体在抗体依赖的细胞毒性(ADCC)试验中介导CD30⁺肿瘤细胞的裂解；和

(e)该人抗体在体内抑制CD30⁺肿瘤细胞的生长。

18.权利要求17的方法，其中所述抗体以至少10⁸M^-1的亲和常数与人CD30结合。

19.权利要求17的方法，其中所述抗体以至少10⁹M^-1的亲和常数与人CD30结合。

20.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗体包括来源于人重链VH_4-34种系序列的人重链可变区和来源于人轻链L15种系序列的人轻链可变区，其中：

(a)人重链可变区包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10至少80％同源的序列；

(b)人轻链可变区包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列或与SEQ IDNO：12至少80％同源的序列；

(c)该人抗体以至少10⁷M^-1的亲和常数与人CD30结合；

(d)该人抗体在抗体依赖的细胞毒性(ADCC)试验中介导CD30⁺肿瘤细胞的裂解；和

(e)该人抗体在体内抑制CD30⁺肿瘤细胞的生长。

21.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的人重链可变区和人轻链可变区。

22.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的人重链可变区和人轻链可变区。

23.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的人重链可变区和人轻链可变区。

24.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗体由杂交瘤产生，其中所述杂交瘤是由从转基因非人动物中获得的B细胞与无限增殖化细胞融合而制备的，该动物具有包括人重链转基因或转染色体和人轻链转基因或转染色体的基因组。

25.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述抗体选自5F11、AC-10、HeFi-1或与5F11、AC-10、HeFi-1竞争结合CD-30的抗体。

26.一种抑制表达CD30的细胞生长的方法，包括使所述细胞接触有效细胞生长抑制量的抗体和蛋白酶体抑制剂，使所述细胞的生长受到抑制。

27.一种治疗或预防以CD30表达性肿瘤细胞生长为特征的疾病的方法，包括给患者施用结合CD30的单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。

28.权利要求27的方法，其中所述疾病选自何杰金氏病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T细胞或B细胞淋巴瘤。

29.权利要求27的方法，其中所述疾病是何杰金氏病。

30.权利要求27的方法，其中所述疾病是非何杰金氏淋巴瘤。

31.权利要求30的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

Images