JP2008514730A

JP2008514730A - Ｃｄ３０陽性リンパ腫の処置の方法

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Publication number: JP2008514730A
Application number: JP2007534859A
Authority: JP
Inventors: ティボーケラー，; エルク，ポッジェ，ボンストランドマン，; アンドレアエンゲルト，; ピーターボルチマン，; ボリスボエル，
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2008-05-08
Also published as: CA2582016A1; BRPI0516727A; IL182260A0; EP1802345A2; AU2005292227A1; ZA200703154B; KR20070083899A; MX2007003533A; NO20071714L; WO2006039644A3; CN101056655A; WO2006039644A2; US20060177442A1; US7790160B2

Abstract

CD30の発現を特徴とするリンパ腫を抗CD30抗体とプロテアーゼ阻害物質を併用して処置する方法を開示する。

Description

発明の背景
CD30細胞表面分子は腫瘍壊死因子レセプタ（TNF-R）スーパーファミリである。この分子ファミリはそのメンバの間で可変的な相同性を有し、神経成長因子レセプタ（NGFR）、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40、CD95、OX40、Fas、TNF-R1、およびTNF-R2を含む、周囲からのシグナルを細胞調節免疫応答へ伝達する主要な制御分子である。これらの分子は、典型的には、細胞質外領域における複数の高システイン反復を特徴とする（de Bruin, P.C., et
al.Leukemia 9:1620-1627 (1995)）。このファミリのメンバはリンパ腫の増殖および分化の制御に重要であると考えられている。

CD30は、中央ヒンジ配列をもつ6回（ヒト）または3回（マウスおよびラット）高システイン反復を有するI型膜貫通型糖タンパク質である。CD30は、90
kDaの細胞間前駆プロテインから発達した120kDa膜分子として存在する。これは、約90 kDaの可溶性タンパク質（sCD30）として、細胞表面から遊離される。CD30の遊離は生CD30細胞の活性化プロセスとして生じ、単に死にかけているまたは死滅した細胞からの放出によって生じるものではない。CD30タンパク質をコードするcDNAは、モノクローナル抗体Ki-1およびBer-H2による免疫スクリーニングによって、HLTV-1ヒトT細胞株HUT-102の発現ライブラリからクローニングされた(Schwab, U., et al.Nature 299:65 (1982))。マウスおよびラットCD30
cDNAは、それぞれ498および493アミノ酸をコードすることが明らかになっている。ヒトCD30 cDNAは、部分的に高システインドメインの1つから複製されたさらなる90個のアミノ酸をコードする。CD30遺伝子は、ヒトにおいては1p36に、ラットにおいては5q36.2
にマッピングされている。

CD30は、活性化リンパ球様細胞によって選択的に発現される。この細胞表面レセプタは、もともと、ホジキン病のホジキン・リード-スタンバーグ細胞上に発現される抗原に反応性のモノクローナル抗体Ki-1によって同定された(Schwab et al., Nature
299:65 (1982))。したがって、CD30はホジキンリンパ種および血液悪性腫瘍の臨床マーカとして広く使用されている(Froese et al., J.
Immunol. 139:2081 (1987); Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474
(1990))。後に、リンパ腫細胞中のCD30を刺激すると、細胞種、分化の段階、およびその他の刺激の存在によって、増殖、活性化、分化、および細胞死多面的な生物学的作用が誘導されることが明らかになった(Gruss, H.J. et
al., Blood 83:2045-2056 (1994))。悪性腫瘍細胞上のCD30レセプタの過剰発現は、HD由来細胞中のNF-kB の活性化による生存およびアポトーシス抵抗性に寄与すると考えられている(3-5)。

CD30は、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、皮膚T細胞性リンパ腫、結節性小開裂細胞性リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢T細胞性リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞性白血病／リンパ腫(ATLL)、成人T細胞性白血病(T-ALL)、およびエントロ芽球性／中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫を含む、非ホジキンリンパ腫(NHL)のサブセット上に発現されることが明らかになっている(Stein et al., Blood 66:848 (1985); Miettinen, Arch.
Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992); Piris et al., Histopathology
17:211 (1990); Burns et al., Am. J. Clin. Pathol. 93:327(1990);
and Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989)), as well
as several virally-transformed lines such as human T-Cell Lymphotrophic Virus I
or II transformed T-cells, and Epstein-Barr Virus transformed B-cells (Stein et
al., Blood 66:848 (1985); Andreesen et al., Blood
63:1299 (1984))。さらに、CD30発現は胎性期癌、非胎性期癌、悪性黒色腫、間葉性腫瘍、ならびに分化後期の脊髄細胞株およびマクロファージにおいて報告されている(Schwarting et al.,
Blood 74:1678 (1989); Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988);
Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990); Andreesen et al.,
Am. J. Pathol. 134:187 (1989))。

高齢またはHD段階が進行したHD患者の約20乃至30%が一次治療後に再発するだろう。これらの患者のうちさらに40乃至60%を、自家幹細胞移植を併用した高用量薬物療法からなるサルベージ療法で治療できる。たとえば経口エトポシド、クロラムブシル、ビンブラスチン、ゲムシタビン、ビノレルビンなどの数々の単剤療法は、移植できない患者、または数ヶ月もしくは数年間移植が不適格な患者を緩和することができる。プロテオソーム阻害剤、抗CD30抗体、およびドキシル、ナベルビン、およびゲムシタビンなどとの併用療法などのさらに最近開発されたサルベージ療法は、少数の例外を除いて、CD30陽性リンパ腫の処置に対してほとんど無効なままである。

正常人のCD30陽性細胞の割合は非常に小さいために、腫瘍細胞中のCD30発現は、CD30陽性新生細胞に対する治療剤を特異的に標的とする抗体媒介療法の重要な標的となる(Chaiarle,
R., et al. Clin. Immunol. 90(2):157-164 (1999))。しかし、現在までに得られている結果は、明らかに、CD30を免疫療法の有用な標的として確立している一方で、現在入手可能なマウスおよびキメラ抗体は理想的な療法剤にならないということも示している。完全ヒト抗CD30モノクローナル抗体5F11は、ALCLおよびin vitroおよびin vivoにおける各種HD由来細胞株に対して有効であることが示されている。マウスおよびキメラ抗CD30抗体への前記完全ヒト抗体の有効性が向上したにもかかわらず、CD30陽性標的細胞の5F11への感受性の変化が観察されている。CD30陽性リンパ腫の原因であるCD30発現細胞を死滅させる抗体療法の能力の向上が望ましいだろう。

したがって、CD30が媒介する疾患の処置および／または予防に有効な、CD30に対する治療用抗体を改善する必要がある。

発明の概要
本願発明では、アポトーシス抵抗性のメカニズムを調べるために、NF-kB活性への5F11の作用をさまざまなHD由来細胞株で研究した。本願発明は、in
vitroおよび皮下ヒトホジキン腫瘍モデルにおいて、NF-kB活性を抑制するということで知られるプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブと併用した5F11の有効性の向上を実証する。

したがって、本願発明はプロテアソーム阻害剤などのNF-kB 活性の阻害物質と併用した抗CD30モノクローナル抗体を治療上有効な量投与することによる、CD30陽性リンパ腫を有する患者の処置の方法を提供する。

ある実施態様では、前記抗CD30抗体を、抗体の投与量が1
mg/kg乃至25 mg/kgの範囲内であってプロテアソーム阻害剤の用量が0.1 mg/kg to 10 mg/kgである前記プロテアソーム阻害剤と同時に、または少なくとも1日以内に投与する。

別の実施態様では、前記抗CD30抗体を、抗体の投与量が1
mg/kg乃至25 mg/kgの範囲内であってプロテアソーム阻害剤の用量が0.1 mg/kg to 10 mg/kgである前記プロテアソーム阻害剤の投与の少なくとも1日前に投与する。

さらに別の実施態様では、前記抗CD30抗体を、前記プロテアソーム阻害剤の投与の少なくとも1週間前に投与する。この実施態様の別の局面では、前記抗CD30抗体を、前記プロテアソーム阻害剤の投与前に、一週間乃至12週間に少なくとも一回、抗体を1 mg/kg乃至25
mg/kgの範囲内、およびプロテアソーム阻害剤0.1 mg/kg to 10 mg/kgの範囲内で投与するステップを要する。

別の実施態様では、前記抗CD30抗体はたとえば10乃至25
mg/kgの単回大量投与し、抗体投与後、最高1週間に少なくとも1回、抗体投与後、最高2週間に少なくとも1回、抗体投与後、最高3週間に少なくとも1回、抗体投与後、最高4週間に少なくとも1回、抗体投与後、最高1ヶ月に少なくとも1回、抗体投与後、最高2ヶ月に少なくとも1回、または抗体投与後、最高3ヶ月に少なくとも1回、プロテアソーム阻害剤を投与する。

本願発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および制限と捉えられてはならない実施例から明らかになるであろう。本願明細書全体に引用されている参考文献、特許、および公開済みの特許出願すべての内容は、引用によりその全体を明らかに本願明細書に援用する。

発明の詳細な説明
本願発明をより容易に理解するため、まず特定の用語を定義する。さらなる定義を本詳細な説明全体において記述する。

「CD30」および「CD30抗原」という用語は本願明細書では同義に用いられ、細胞が自然に発現するヒトCD30の変異体、イソタイプおよび種相同体のいずれもが含まれる。好ましい実施態様では本願発明の抗体をCD30抗原に結合させると、CD30リガンドのCD30への結合を阻害または遮断することによってCD30を発現する細胞（たとえば腫瘍細胞）の成長を阻害する。「CD30リガンド」という用語は、CD30へのすべての（たとえば生理学的）リガンドを包含する。好ましい実施態様では、前記CD30リガンドはCD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3またはTRAF5である。別の好ましい実施態様では、本願発明の抗体のCD30抗原への結合はCD30発現細胞のエフェクタ細胞の貪食および／または死滅を媒介する。さらに別の好ましい実施態様では、本願発明の抗体のCD30抗原への結合はCD30発現細胞のエフェクタ細胞ADCCを媒介する。

本願明細書に用いられる「成長を阻害する」（たとえば細胞に関して）という文言は、抗CD30抗体と接触させない同細胞の成長と比較して、抗CD30抗体と接触させた場合の成長の測定可能な減少であって、たとえば少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、または100%の細胞の成長の阻害などを含むことを意図する。

「免疫応答」という用語は、たとえば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒細胞および上述の細胞または肝臓が生じる可溶性の高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用であって、侵襲的な病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞、または自己免疫または病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織への選択的な損傷、破壊、または人体からの除去を生じる作用を意味する。

本願明細書に記載される「単離された抗体」は、さまざまな抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（たとえば、CD30を特異的に結合する単離された抗体は、CD30の他の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、CD30に特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するCD30など、その他の抗原に交差反応性を有してよい。さらに、単離された抗体はその他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。

本願明細書に記載の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性、および特定のエピトープへの親和性を示す。

本願明細書に記載の「ヒト抗体」という用語は、フレーム領域およびCDR領域の両方がヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、前記抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する。本願発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列をコードしないアミノ酸配列を含む場合もある（たとえば、in
vitroにおいて無作為もしくは部位特異的突然変異、またはin vivoにおいて体性突然変異によって導入される突然変異）。しかし、本願明細書に記載の「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことは意図しない。

本願明細書に記載の「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を意味する。ある実施態様では、前記ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させたヒト重鎖組換え遺伝子および軽鎖組換え遺伝子を含むゲノムを有する、たとえば組換えマウスなどの組換え非ヒト動物から得られたB細胞を含む

本願明細書に記載の「組換えヒト抗体」という用語は、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子または調製されたハイブリドーマにトランスジェニックなまたはトランス染色体の動物（たとえばマウスなど）から単離された抗体（詳しく後述）、(b)たとえばトランスフェクトーマなどに由来するヒト抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から単離された抗体、(c)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および(d)その他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与するその他の方法によって調製、発現、作製、または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべてのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある実施態様では、そのような組換えヒト抗体はin vitro変異原性（またはヒトIg配列導入動物を用いる場合にはin vivo体細胞変異原性）の影響下にある可能性があり、したがって、前記組換え抗体のV_HおよびV_L
領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列V_HおよびV_L
配列に由来し関連する一方でin vivoにおける抗体生殖細胞系列のレパートリの中に天然に存在しない場合もある配列である。

本願明細書に記載の「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（たとえばIgMまたはIgG1）を意味する。

抗原を認識する抗体」および「抗原意特異的な抗体」という文言は、「抗原に特異的に結合する抗体」という文言とともに本願明細書では同義に用いられる。

「ヒト抗体誘導体」という用語は、たとえば前記抗体と別の物質または抗体との複合体などの、ヒト抗体の修飾型のいずれもを意味する。
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を意味することを意図する。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列の中でつくられてよい。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がある種に由来し定常領域配列が別の種に由来しする抗体であって、たとえば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを意味する。

本願明細書に記載の「ヒトCd30に特異的に結合する」抗体は、K_Dが1 × 10^-7
M以下、より好ましくは5 x 10^-8 M 以下、より好ましくは3 x 10^-8 M
以下、より好ましくは1 x 10^-8 M以下、さらにより好ましくは1 x 10^-9 M
を有するヒトCD30に結合する抗体を意味することを意図する。

本願明細書に記載の「K_assoc」または「K_a」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を意味することを意図し、本願明細書に記載の「K_dis」または「K_d」という用語は特定の抗体-広言相互作用の解離速度を意味することを意図する。本願明細書に記載の「K_D」という用語は解離定数を意味することを意図し、それはK_dのK_aに対する比（すなわちK_d/K_a）から得られ、モル濃度（M）で表される。抗体のK_D値は当業で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のK_D値を決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはBiacore^(R)システムなどのバイオセンサシステムを使用する。

本願明細書に記載のIgG抗体への「高親和性」という用語は、標的抗原へのK_Dが10^-8 M 以下、より好ましくは10^-9
M 以下、およびさらにより好ましくは10^-10 M以下である抗体を意味する。しかし、「高親和性」結合は、その他の抗体のイソタイプによって変化しうる。たとえば、IgMイソタイプへの「高親和性」結合とは、K_Dが10^-7 M 以下、より好ましくは10^-8
M 以下、およびさらにより好ましくは10^-9 M以下である抗体を意味する。

本願明細書に記載の「対象」および「患者」という用語は同義に用いられ、ヒトまたは非ヒト動物のいずれもを意味しうる。「非ヒト動物」という用語には、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などの哺乳類および非哺乳類などのすべての脊椎動物が含まれる。本願発明のある実施態様では、前記患者はヒトである。

本願明細書に記載の「抗体」という用語には、抗体全体、および抗原結合断片（つまり「抗原結合部分」）またはその1本鎖が含まれる。「抗体」には、ジスルフィド結合で連結された少なくとも2本の重（H）鎖および2本の軽（L）鎖からなる糖タンパク質、またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は重鎖可変領域（本願明細書ではV_Hと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、C_H1, C_H2 およびC_H3の3種類のドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本願明細書ではV_Lと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのC_Lからなる。V_HおよびV_L領域は、さらに、相補性決定領域（CDR）とよばれる超可変領域にフレームワーク領域（FR）とよばれるより保存された領域が散在する領域にさらに分割されることもある。各V_HおよびV_L
は、3つのCDRおよび4つのFRからなり、アミノ酸末端からカルボキシ末端に向かってFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（たとえばエフェクタ細胞）および古典的な補体システムの最初の成分（Clq）が含まれる、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することもある。

本願明細書に記載の抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原(たとえば
CD30)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を意味する。完全長抗体の断片が抗体の抗原結合を機能させることがあることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i)V_L、V_H、C_L、およびC_H1ドメインからなる一価断片のFab断片、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される2つのFab断片からなる二価断片のF(ab’)₂断片、(iii)V_HおよびC_H1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の一腕のV_LおよびV_HドメインからなるFv断片、(v)V_HドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature
341:544-546)、および(vi)単離された相補的決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、V_LおよびV_Hは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を用いて、V_LおよびV_Hを1本のタンパク質鎖につくることができる合成リンカによって結合し、V_LおよびV_H領域を組み合わせて一価分子を形成することができる(1本鎖 Fv (scFv)tとして知られる; たとえば、Bird et
al.(1988) Science 242:423-426; and Huston et al.(1988)
Proc. Natl.
Acad. Sci. USA
85:5879-5883を参照)。そのような1本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業に知られる従来技術を用いて得られ、その断片の用途については、無傷の抗体と同様の方法でスクリーニングすることができる。

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合する能力があるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の科学活性表面分類からなり、通常、特異的な3次元構造特性および特異的電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者への結合は失われるが後者は失われないという点で区別される。

本願明細書において、「結合を阻害する」および「結合を遮断する」という用語は、たとえばCD30リガンドのCD30への結合の阻害／遮断を意味する。阻害／遮断は同義に用いられ、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。CD30の阻害／遮断は、好ましくは、たとえばCD30の阻害が誘導する増殖などを阻害または遮断せずにCD30結合が生じる場合に生じる正常レベルまたはタイプの活性を減少または変化させる。阻害および遮断も、抗CD30抗体と接触させない同細胞の成長と比較した、抗CD30抗体と接触させた場合の成長の測定可能な減少であって、たとえば少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、または100%のCD30のそのレセプタへの遮断などを含むことを意図する。

「二特異性分子」という用語は、2つの異なる結合特異性を有する、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体などの任意の物質を含むことを意図する。たとえば、前記分子は、(a)細胞表面抗原、および(b)エフェクタ細胞の表面上のFcレセプタに結合または相互作用することができる。「多特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」という用語は、3つ以上の異なる結合特異性を有する、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体などの任意の物質を含むことを意図する。たとえば、前記分子は、(a)細胞表面抗原、(b)エフェクタ細胞の表面上のFcレセプタ、および(c)少なくとも1つのその他の要素に結合または相互作用することができる。したがって、本願発明には、CD30などの細胞表面抗原、およびエフェクタ細胞上のFcレセプタなどのその他の標的に方向付けられた二特異性、三特異性、四特異性、およびその他の多特異生分子が含まれるが、それらに限定されない。

「二特異性抗体」という用語には、ディアボディも含まれる。ディアボディは、V_HおよびV_Lドメインがポリペプチドの1本鎖上に発現する二価、二特異性の抗体であるが、2つのドメインを同一の鎖状で組み合わせるには短すぎるリンカを用いるので、別の鎖の相補的ドメインを用いて前記ドメインを組み合わせ、2つの抗原結合部位をつくり出す(たとえば Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448;
Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2:1121-1123参照)。

本願明細書に記載の「ヘテロ抗体」という用語は、2つ以上の抗体、抗体結合断片（たとえばFab）、その誘導体、または異なる特異性を有する少なくとも2つの相互に結合した抗原結合領域を意味する。これらの異なる特異性には、エフェクタ細胞上のFcレレプタへの結合特異性、およびたとえば腫瘍細胞などの標的細胞上の抗原またはエピトープへの結合特異性が含まれる。

本願明細書に記載の「非相同性抗体」は、そのような抗体を産生する組換え非ヒト生物に関連して定義される。この用語は、組換え非ヒト動物に含まれない生物に認められるものに相当し、一般に組換え非ヒト動物以外の種に由来するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を意味する。

本願明細書に記載の「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を意味する。たとえば、マウス軽鎖と会合させたヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、上述のキメラおよびヒト化抗体が含まれる。

本願明細書に記載の「グリコシル化パターン」は、タンパク質に共有結合する糖単位のパターン、より具体的には免疫グロブリンタンパク質として定義される。非相同性抗体のグリコシル化パターンは、当業者が非相同性抗体のグリコシル化パターンが、組換え遺伝子のCH遺伝子が由来する種よりも非ヒト組換え動物の種における前記グリコシル化パターンにより類似すると認識する場合、非ヒト組換え動物の種によって産生された抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質的に類似していることを特徴とすることができる。

本願明細書において対象物に対して用いられる「天然の」という用語は、対象物が自然の中に認められるという事実を意味する。たとえば、自然における供給源から単離することができる生物に存在し、実験室において人間によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然である。

本願明細書に記載の「再編された」という用語は、Vセグメントが基本的に完全なV_HまたはV_L
ドメインをそれぞれ立体的にコードするD-JまたはJセグメントに隣接する場所に位置する場合の、重鎖または軽鎖免疫グロブリン座位の立体構造を意味する。再編された免疫グロブリン遺伝子座位は、生殖細胞系列との比較により同定することができ、再編座位は少なくとも1つの組換えヘプタマ／ノナマ相同性要素を有するだろう。

Vセグメントに関して本願明細書に記載の「再編されていない」または「生殖細胞系列立体構造」という用語は、Vセグメントが組み換えられていないためにDまたはJセグメントに隣接しない場合の構造を意味する。

抗CD30抗体
CD30に対する抗体は、たとえば5F11、HeFi-1、C10、M44、AC10、Ber-H2、HRS-1、HRS-3、HRS-4、Ki-1、Ki-2、Ki-3、Ki-4、Ki-5、Ki-6、Ki-7、IRac、およびM67など、当業に公知である。好ましくは、本願発明の方法で使用される抗体はキメラ、ヒト化、またはヒトである。ある実施態様では、前記抗体は完全ヒト抗体である。本願発明に記載の方法への使用に好ましい抗体は、前記抗体のある機能的特徴または特性によって特徴付けられる。たとえば、前記抗体はヒトCD30に高親和性で特異的に結合し、好ましくは以下にあげる1つ以上の特徴を示す。

a) 親和定数が少なくとも約10⁷
M^-1、好ましくは10⁸ M^-1、より好ましくは約10⁹
M^-1乃至10¹⁰ M^-1またはそれ以上の親和定数を有するCD30への結合親和性。

b) 少なくとも約10³、より好ましくは約10⁴、および最も好ましくは約10⁵M^-1S^-1のCD30との会合定数（K_assoc）。

c) 約10-3s-1、好ましくは約10^-4s^-1、より好ましくは10^-5s^-1、および最も好ましくは10^-6s^-1のCD30からの解離定数（K_dis）。

d) CD30を発現する細胞のオプソニン化能力。

e) 約10
μg/ml以下の濃度におけるヒトエフェクタ細胞の存在下での、CD30発現細胞（たとえば腫瘍細胞）の成長の阻害、ならびに／または貪食および死滅の能力。

または、f) CD30への結合能力、およびCD30に結合するCD30リガンドを部分的または完全に遮断することによるCD30機能の阻害能力（たとえばCD30媒介作用）(CD30
リガンドの例には、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5が含まれる)。

好ましくは、前記抗体はK_Dが5 x 10^-9 M以下のヒトCD30に結合するか、K_Dが4
x 10^-9 M以下のヒトCD30に結合するか、K_Dが3.5
x 10^-9 M以下のヒトCD30に結合するか、K_Dが3
x 10^-9 M以下のヒトCD30に結合するか、またはK_Dが2.8
x 10^-9 M以下のヒトCD30に結合する。

CD30に対する抗体の結合能力を評価する標準アッセイは、たとえばELISA、ウェスタンブロット、およびRIAが含まれる当業に知られている。好ましいアッセイは実施例に詳述する。前記抗体の結合動力学（たとえば結合親和性）も、Biacore分析など、当業に知られる標準アッセイによって評価することができる。

モノクローナル抗体17G1、2H9および5F11
本願発明に使用される好ましい抗体には、本願明細書に引用によりその全体を援用する米国特許出願公報第2004/0006215号に特徴付けられ記載される、ヒトモノクローナル抗体17G1、2H9および5F11が含まれる。17G1、2H9および5F11のV_Hアミノ酸配列は、それぞれ配列番号第2、6、および10に示される。17G1、2H9および5F11のV_Lアミノ酸配列は、それぞれ配列番号第4、8、および12に示される。

これらの各抗体がCD30に結合できる場合、V_HおよびV_L配列を「混合およびマッチング」して、本願発明の方法に用いるためのその他の抗CD30結合分子をつくることができる。このように「混合およびマッチングさせた」抗体のCD30結合は、上述および実施例に記載される結合アッセイ（たとえばELISAなど）を用いて試験することができる。好ましくは、V_HおよびV_L鎖が混合およびマッチングされた場合、特定のV_H/V_L 対のV_H配列を構造的に類似するV_H配列に置き換える。同様に、好ましくは、特定のV_H/V_L 対のV_L配列を構造的に類似するV_L配列に置き換える。

したがって、ある局面では、本願発明の方法はモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、
(a) 配列番号第2、6、および10からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
(b) 配列番号第4、8、および12からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み、
当該抗体がCD30、好ましくはヒトCd30に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分を用いることができる。
好ましい重鎖と軽鎖の組み合わせには、
(a) 配列番号第2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
(b) 配列番号第4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b) 配列番号第6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(b) 配列番号第8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
または、(c) 配列番号第10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(b) 配列番号第12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
が含まれる。

別の局面では、17G1、2H9および5F11の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、またはその組み合わせを含む抗体を、本願発明の方法に使用することができる。17G1、2H9および5F11のVH
CDR1のアミノ酸配列は、配列番号第16、28、および40に示される。17G1、2H9および5F11のV_H
CDR2のアミノ酸配列は、配列番号第17、29、および41に示される。17G1、2H9および5F11のV_H
CDR3のアミノ酸配列は、配列番号第18、30、および42に示される。17G1、2H9および5F11のV_k
CDR1のアミノ酸配列は、配列番号第22、34、および46に示される。17G1、2H9および5F11のV_k
CDR2のアミノ酸配列は、配列番号第23、35、および47に示される。17G1、2H9および5F11のV_k
CDR3のアミノ酸配列は、配列番号第24、36、および48に示される。CDR領域はKabatシステムを用いて描写する（Kabat,
E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,
Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication
No. 91-3242）。

これらの各抗体がCD30に結合できて、抗原結合特異性がCDR1、CDR2、およびCDR3領域によって主に提供される場合、V_H CDR1、CDR2、およびCDR3
配列ならびに V_k CDR1、CDR2、およびCDR3配列を「混合およびマッチング」して（つまり、異なる抗体に由来するCDRは混合およびマッチングできるが、各抗体はV_H CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにV_k
CDR1、CDR2、およびCDR3を含有しなければならない）、本願発明に用いるその他の抗CD30結合分子をつくることができる。このように「混合およびマッチングさせた」抗体のCD30結合は、上述および実施例に記載される結合アッセイ（たとえばELISA、Biacore分析など）を用いて試験することができる。好ましくは、V_H CDR配列が混合およびマッチングされた場合、特定のV_H配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列をを構造的に類似するCDR配列に置き換える。好ましくは、V_H
CDR配列が混合およびマッチングされた場合、特定のV_H配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を構造的に類似するCDR配列に置き換える。新規V_HおよびV_L配列は、1つ以上のV_Hおよび／またはV_L
CDR配列を、モノクローナル抗体抗体17G1、2H9および5F11について本願明細書に開示されるCDR配列に由来する構造的に類似する配列と置換して作製できることは、当業者には容易に理解されるだろう。

したがって、別の局面では、本願発明の方法は単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、
(a) 配列番号第16、28、および40からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
(b) 配列番号第17、29、および41からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
(c) 配列番号第18、30、および42からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
(d) 配列番号第22、34、および46からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e) 配列番号第23、35、および47からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
(f) 配列番号第24、36、および48からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
当該抗体がCD30、好ましくはヒトCd30に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分を用いることができる。

好ましい実施態様では、前記抗体は、
(a) 配列番号第16のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1と、
(b) 配列番号第17のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2と、
(c) 配列番号第18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3と、
(d) 配列番号第22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1と、
(e) 配列番号第23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2と、
(f) 配列番号第24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3と、
を含む。

別の好ましい実施態様では、前記抗体は、
(a) 配列番号第28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1と、
(b) 配列番号第29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2と、
(c) 配列番号第30のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3と、
(d) 配列番号第34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1と、
(e) 配列番号第35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2と、
(f) 配列番号第36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3と、
を含む。

さらに別の好ましい実施態様では、前記抗体は、
(a) 配列番号第40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1と、
(b) 配列番号第41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2と、
(c) 配列番号第42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3と、
(d) 配列番号第46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1と、
(e) 配列番号第47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2と、
(f) 配列番号第48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3と、
を含む。

特定の生殖細胞系列配列を有する抗体の使用
ある実施態様では、本願発明に使用される抗体は、ある生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域および／またはある生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子の軽鎖可変領域を含む。

たとえば、好ましい実施態様では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ヒトV_H 4-34遺伝子またはヒトV_H
3-11 遺伝子の産生物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含み、当該抗体は特異的にCD30に結合する。その他の好ましい実施態様では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ヒトV_K L15 遺伝子またはヒトV_K
A27 遺伝子の産生物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含み、当該抗体は特異的にCD30に結合する。さらに別の好ましい実施態様では、本願発明は単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、当該抗体が、
(a) ヒトV_H
4-34または3-11遺伝子（その遺伝子がそれぞれ配列番号第49および51にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする）の産生物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含み、
(b) ヒトV_K
L15 またはV_K A27 またはV_K L6 遺伝子（その遺伝子がそれぞれ配列番号第50、52および53にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする）の産生物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含み、
(c) CD30、好ましくはヒトCD30に特異的に結合する、
抗体または抗原結合部分を提供する。

V_H 4-34およびV_K L15のV_HおよびV_K
を有する抗体の例は、5F11である。V_H 3-11およびV_K
A27のV_HおよびV_K を有する抗体の例は、17G1である。V_H
4-34およびV_K L6のV_HおよびV_K
を有する抗体の例は、2H9である。

本願明細書に記載の通り、ヒト抗体は、その抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を用いるシステムから得られる場合、ある生殖細胞系列配列の「産生物」であるかまたはそれらに「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。そのようなシステムには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する組換えマウスを対象の抗原で免疫するステップか、または対象の抗原を有するファージを提示するヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするステップを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の産生物であるかまたは由来するヒト抗体は、前記ヒト抗体のアミノ酸配列をッヒト生殖細胞系列グロブリンのアミノ酸配列と比較して、前記ヒト抗体の配列に最も近い配列のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することによって、同定することができる。あるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の「産生物」であるかまたは「由来する」ヒト抗体は、たとえば天然に生じる体細胞突然変異または意図的に誘導された部位特異的突然変異による生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有することがある。しかし、特定のヒト抗体は典型的に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも90%同一であって、その他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合に、ヒト抗体をヒトのものであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合には、ヒト抗体のアミノ酸配列は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と、少なくとも95%、または少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%同一であってよい。典型的には、あるヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とのアミノ酸の差異が10個以下であろう。ある場合には、そのヒト抗体のアミノ酸は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と、アミノ酸の違いが5個以下、または4、3、2、または1個以下であってよい。

相同的な抗体
さらに別の実施態様では、本願発明に有用な抗体は、本願明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、当該抗体は好ましい抗CD30抗体の望ましい機能的特性を保持する。

たとえば、本願発明の方法に有用なモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
(a) 配列番号第2、6、および10からなるグループから選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、
(b) 配列番号第4、8、および12からなるグループから選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
(c) 前記抗体が、K_Dが1x10^-8 M 以下のヒトCD30に結合するか、
d) 前記抗体が少なくとも約10³、より好ましくは約10⁴、および最も好ましくは約10⁵M^-1S^-1のCD30との会合定数（K_assoc）を有するか、
e) 前記抗体が約10^-3s^-1、好ましくは約10^-4s^-1、より好ましくは10^-5s^-1、および最も好ましくは10^-6s^-1のCD30からの解離定数（K_dis）を有するか、
f) 前記抗体が、CD30を発現する細胞をオプソニン化する能力を有するか、
g) 前記抗体が、約10
μg/ml以下の濃度におけるヒトエフェクタ細胞の存在下での、CD30発現細胞（たとえば腫瘍細胞）の成長を阻害し、ならびに／または貪食および死滅させる能力を有するか、
または、(h) 前記抗体が、CD30への結合能力、およびCD30に結合するCD30リガンドを部分的または完全に遮断することによるCD30機能の阻害能力（たとえばCD30媒介作用）(CD30
リガンドの例には、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5が含まれる)を有する。

各種実施態様において、前記抗体は、たとえばヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってよい。

他の実施態様では、V_Hおよび／またはV_L アミノ酸配列は、上述の配列に85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%であってよい。上述の配列のV_HおよびV_L
に高い（つまり80% 以上の）相同性を有するV_HおよびV_L
を有する抗体は、配列番号第1、3、5、7、9および11をコードする核酸分子の突然変異誘発（たとえば部位特異的またはPCRによる突然変異誘発など）のあとで、本願明細書に記載の機能的アッセイを用いて、コードされた組換え抗体を獲得した機能について試験することによって、得ることができる。
本願明細書に記載の、2つのアミノ酸配列間の相同性の割合は、2つの配列間における同一性の割合に等しい。前記の2つの配列間の同一性の割合は、前記配列によって共有された同一の位置の数の関数（つまり相同性％＝同一の位置の数／位置の合計数×100）であり、2つの配列の最適化アラインメントに導入する必要のあるギャップ数、および各ギャップの長さを考慮する。制限ではない以下の例に記載の通り、配列の比較と2つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。

アミノ酸配列間の同一性の割合は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (Comput.
Appl. Biosci., 4:11-17
(1988)) のアルゴリズムを用いて、PAM120重み残基表、ギャップ長さペナルティ12、ギャップペナルティ4を用いて、決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ブロッサム62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、GCGソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに導入された、Needleman
and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムを用いて、16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重みおよび1、2、3、4、5、または6の長さ重みを用いて決定することができる。

さらに、または代替的に、本願発明のタンパク質配列は「クエリ配列」としてさらに用いることができ、たとえば関連配列を同定するための公的データベースに対する検索を実行することができる。そのような検索は、Altschul, et
al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10のXBLAST プログラム (バージョン2.0) を用いて行うことができる。BLASTタンパク質探索は、本願発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=
50、ワード長=3を用いて行うことができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、ギャップBLASTをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように用いることができる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（たとえばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いてよい。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。

保存的修飾を有する抗体
ある実施態様では、本願発明の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、この場合において、1つ以上のこれらのCDR配列が本願明細書に記載の好ましい抗体（たとえば17G1、2H9または5F11）、またはその保存的修飾に基づいた特定のアミノ酸配列を含み、当該抗体が本願発明の抗CD30抗体の望ましい機能的特性を保有する。したがって、本願発明はCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域とCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、
(a) 重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号第18、30、および42のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含むか、
(b) 軽鎖可変領域CDR3配列が、配列番号第24、36、および48のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含むか、
(c) 前記抗体が、K_Dが1x10^-8 M 以下のヒトCD30に結合するか、
d) 前記抗体が少なくとも約10³、より好ましくは約10⁴、および最も好ましくは約10⁵M^-1S^-1のCD30との会合定数（K_assoc）を有するか、
e) 前記抗体が約10^-3s^-1、好ましくは約10^-4s^-1、より好ましくは10^-5s^-1、および最も好ましくは10^-6s^-1のCD30からの解離定数（K_dis）を有するか、
f) 前記抗体が、CD30を発現する細胞をオプソニン化する能力を有するか、
g) 前記抗体が、約10
μg/ml以下（たとえばin vitroにおいて）の濃度におけるヒトエフェクタ細胞の存在下での、CD30発現細胞（たとえば腫瘍細胞）の成長を阻害し、ならびに／または貪食および死滅させる能力を有するか、
または、(h) 前記抗体が、CD30への結合能力、およびCD30に結合するCD30リガンドを部分的または完全に遮断することによるCD30機能の阻害能力（たとえばCD30媒介作用）(CD30
リガンドの例には、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5が含まれる)を有する、
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好ましい実施態様では、重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号第17、29、および41のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み、軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号第23、35、および47のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含む。別の好ましい実施態様では、重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号第16、28、および40のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み、軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号第22、34、および46のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含む。

本願明細書に記載の「保存的配列修飾」という用語は、前記アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著しく影響しないか、または変化させないアミノ酸修飾を意味することを意図する。そのような保存的修飾には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。部位特異的突然変異誘発、およびPCR媒介突然変異誘発などの当業に公知の標準技術によって、本願発明の抗体に修飾を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当業で定義されている。このファミリには、塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本願発明の抗体のCDR領域内の1つ以上のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリのその他のアミノ酸残基と置換することもでき、その組換え抗体は、本願明細書に記載の機能的アッセイを用いて、獲得した機能（つまり、上の(c)乃至(j)に記載した機能）について試験することができる。

本願発明の抗CD30抗体と同一のエピトープに結合する抗体
本願明細書に記載の抗体に加えて、本願発明の方法は、ヒトCD30上で、上述のCD30モノクローナル抗体（つまり、たとえば17G1、2H9および5F11など、本願明細書に記載のモノクローナル抗体のいずれかとCD30への結合に関して交差競合する能力を有する抗体）のいずれかと同じクラスタ（A、BまたはC）、またはより好ましくは同じエピトープに結合する抗体を用いることができる。そのような交差競合抗体は、標準CD30結合アッセイにおける17G1、2H9または5F11と交差競合する能力に基づいて同定することができる。たとえば、BIAcore分析、ELISAアッセイ、またはフローサイトメトリはを用いて、本願発明の抗体との交差競合を実現することができる。テスト抗体の、たとえば17G1、2H9または5F11などのヒトCD30への結合を阻害する能力によって、前記テスト抗体がヒトCD30への結合についてそのような抗体と競合する可能性があり、抗体などのヒトCD30上の同じエピトープに結合することが実証される。好ましい実施態様では、17G1、2H9または5F11と同一のヒトCD30上のエピトープに結合する抗体は、当業に公知の方法論を用いて本願明細書に記載されるとおりに調製および分離することができるヒトモノクローナル抗体である。

操作および修飾抗体
本願発明に使用される抗体は、修飾抗体を操作するための開始物質として、本願明細書に開示される抗体に由来する1つ以上のV_Hおよび／またはV_L配列を使用して調製することができ、修飾抗体は本願明細書に開示される抗体から特性を変化させたものであってよい。抗体は、たとえば1つ以上のCDR領域内および／または1つ以上のフレームワーク領域内など、1つまたは両方の可変領域（すなわちV_Hおよび／またはV_L）内の1つ以上の残基を修飾することによって操作することができる。さらに、または代替的に、抗体は、たとえば前記抗体のエフェクタ機能を変化させるために、定常領域内の残基を変化させることによって操作することができる。

実行可能な可変領域の操作の1種がCDR移植法である。抗体は、6つの重鎖および軽鎖相補的決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を主に介して標的抗原と相互作用する。この理由のために、CDR内のアミノ酸配列はCDR外の配列間よりも個々の抗体間の方が多様性に富む。CDR配列はほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列に移植された、天然の特異的な抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクタを作製することによって、天然の特異的な抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（たとえば、Riechmann, L. et
al.(1998) Nature 332:323-327、Jones, P. et al.(1986)
Nature 321:522-525、Queen, C. et al.(1989)
Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033、Winterの米国特許第5,225,539号、およびQueen
et al.の米国特許5,530,101; 5,585,089号、5,693,762号、および6,180,370
を参照）。

したがって、本願発明の別の実施態様は、17G1、2H9または5F11に由来するCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関連する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体17G1, 2H9 or 5F11 のV_HおよびV_L
CDR 配列を含有するが、これらの抗体の異なるフレームワーク配列を含有してもよい。

そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的DNAデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA配列は、"VBase"
ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネット上でhttp://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseから入手可能）、およびそれぞれの内容を引用を持って本願明細書に明らかに援用するKabat, E. A., et al.(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department
of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et
al.(1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences
Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different
Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J.
P. L. et al.(1994) "A Directory of Human Germ-line V_H
Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見つけることができる。

本願発明の抗体に用いられる好ましいフレームワーク配列は、本願発明の特定の抗体によって用いられるフレームワーク配列に構造的に類似するものであって、たとえば、本願発明に用いられる好ましいモノクローナル抗体に使用される、V_H 4-34フレームワーク配列(配列番号第49)
および／または V_H 3-11 フレームワーク配列(配列番号第51)
および／またはV_K L15 フレームワーク配列(配列番号第50)
および／またはV_k A27 フレームワーク配列(配列番号第52)
および／またはthe V_K L6 フレームワーク配列(配列番号第53)に類似するものである。V_H
CDR1、CDR2、およびCDR3 配列、ならびにV_K
CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に認められるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植するか、またはCDR配列が前記生殖細胞系列配列と比較して1つ以上の突然変異を含有するフレームワークに移植することができる。たとえば、ある場合には、抗体の抗原結合能力を維持または向上させるためにフレームワーク領域内の残基を突然変異させるのが有益であることがわかっている(たとえば
Queen et alの米国特許第5,530,101号、5,585,089号、5,693,762号、および6,180,370
号を参照)。

可変領域修飾の別のタイプは、V_Hおよび／またはV_K CDR1、CDR2および／またはCDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、対象の抗体の1つ以上の結合特性（たとえば親和性など）を向上させるものである。部位特異的突然変異誘発またはPCRによる突然変異誘発を実施して突然変異を導入し、その抗体の結合またはその他の対象の機能的特性への作用を、本願明細書に記載され、実施例に提供されるin vitroまたはin vivoにおいて評価することができる。好ましくは、保存的な修飾（上述のとおり）が導入される。突然変異はアミノ酸置換、付加、または欠失であってよいが、好ましくは置換である。さらに、典型的にはCDR領域内の1、2、3、4、または5個以下の残基を組み換える。

したがって、別の実施態様では、本願発明は単離された抗CD30モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、当該抗体または抗原結合部分が、(a) 配列番号第16、28、および40からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第16、28、および40と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_H CDR1 領域と、(b) 配列番号第17、29、および41からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第17、29、および41と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_H CDR2 領域と、(c) 配列番号第18、30、および42からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第18、30、および42と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_H CDR3 領域と、(d) 配列番号第22、34、および46からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第22、34、および46と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_K CDR1 領域と、(e) 配列番号第23、35、および47からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第23、35、および47と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_K CDR2 領域と、(f) 配列番号第24、36、および48からなるグループから選択されるアミノ酸配列、または配列番号第24、36、および48と比較して、1、2、3、4、または5ヶ所のアミノ酸に置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列からなるV_K CDR3 領域と、
からなる重鎖可変領域を含む、単離された抗CD30モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。

本願発明の操作された抗体には、たとえば前記抗体の特性を向上させるなどのため、V_Hおよび／またはV_K内のフレームワーク残基に修飾を施した抗体が含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、前記抗体の免疫原性を提言させるために施される。たとえば、ある既知のアプローチは、突然変異によって、1つ以上のフレームワーク残基を相当する生殖細胞系列配列に戻す方法である。より具体的には、体細胞突然変異した抗体は、前記抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有してよい。そのような残基は、前記抗体フレームワーク配列を、前記抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定することができる。

別の種類のフレームワーク修飾は、前記フレームワーク領域内、または1つ以上のCDR領域内の1つ以上の残基を突然変異させて、T細胞エピトープを除外して前記抗体がもちうる免疫原性を低減させることに関与する。このアプローチは、「脱免疫」ともよばれ、Carr et al.の米国特許公報第20030153043号にさらに詳述されている。

フレームワークまたはCDR領域内に施した修飾に加えて、またはその代わりに、本願発明に用いられる抗体を操作して、典型的には血清半減期、補体結合、Fcレセプタ結合、および／または抗原依存性細胞傷害性などの、抗体の1つ以上の機能的特性を変化させるためにFc領域内に修飾を含めることができる。さらに、本願発明の抗体を化学修飾（たとえば1つ以上の化学部分を前記抗体に付加させることができる）、または修飾して、そのグリコシル化を変化させ、前記抗体の1つ以上の機能的特性を再び変化させることもできる。これらの実施態様はそれぞれ、以下に詳述される。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスによる。

ある実施態様では、CH1のヒンジ領域を、当該ヒンジ領域にあるシステイン残基の数をたとえば増加または減少させるなど変化させるように修飾する。このような方法は、Bodmer et al.の米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域にあるシステイン残基の数を変更して、たとえば、軽鎖と軽鎖の会合を促進するか、または前記抗体の安定性を増加または低減する。

別の実施態様では、抗体のFcヒンジ領域を突然変異させて前記抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、未変性Fcヒンジドメインブドウ球菌タンパク質A（SpA）に関して、前記抗体がSpA結合を障害するように、1つ以上のアミノ酸突然変異をFcヒンジ断片のCH2-CH3
ドメイン境界領域に導入する。このような方法は、Ward et alの米国特許第6,165,745号にさらに記載されている。

別の実施態様では、前記抗体を、生物学的半減期が増加するように修飾する。さまざまなアプローチが可能である。たとえば、以下の突然変異、Wardの米国特許第6,277,375
号に記載のT252L、T254S、T256Fの1つ以上を導入することができる。代替的には、Presta et al.の米国特許第5,869,046号および6,121,022号に記載されるように、生物学的半減期を増加するために、前記抗体は、IgGのFc領域のCH2ドメインにある2つのループから取り出したサルベージレセプタ結合エピトープを含むように、CH1またはCL領域内を変化させることができる。

さらに他の実施態様では、前記Fc領域は、前記抗体のエフェクタT細胞機能を変化させるために異なるアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を置換することによって変化させる。たとえば、前記抗体が、エフェクタリガンドへの親和性が変化しているが親抗体の抗原結合能力は保持されるように、アミノ酸残基234、
235、 236、 237、
297、 318、 320および322から選択される1つ以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することができる。親和性を変化させるエフェクタリガンドは、たとえば、Fcレセプタまたは補体のC1成分であってよい。このような方法は、Winter et al.の米国特許第5,624,821
号および5,648,260号にさらに記載されている。

別の例では、前記抗体が、C1q結合を変化さるか、および／または補体依存性細胞傷害性を低下または消滅させるように、アミノ酸残基329、
331、
および322から選択される1つ以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することができる。このような方法は、Idusogie et al.の米国特許第6,165,745号にさらに記載されている。

別の例では、アミノ酸231および239番を1つ以上アミノ酸残基と置換して、前記抗体の補体を固定する能力を変化させる。このような方法は、Bodmer et al.のPCT特許公報第WO 94/29351 号にさらに記載されている。

さらに別の例では、前記Fc領域を修飾し、抗体依存生細胞傷害性（ADCC）を媒介する前記抗体の能力を高めるか、および／または以下の位置238、
239、 248、 249、
252、 254、 255、
256、 258、 265、
267、 268、 269、
270、 272、 276、
278、 280、 283、
285、 286、 289、
290、 292、 293、
294、 295、 296、
298、 301、 303、
305、 307、 309、
312、 315、 320、
322、 324、 326、
327、 329、 330、
331、 333、 334、
335、 337、 338、
340、 360、 373、
376、 378、 382、
388、 389、 398、
414、 416、 419、
430、 434、 435、
437、 438 または 439番の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって、Fcγレセプタへの前記抗体の親和性を高める。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRn ヒトIgG1上の結合部位はマッピングされ、結合が改善された変異種は既述されている（Shields,
R.L. et al.(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照）。位置256、 290、 298、 333、 334および339 番の特異的突然変異は、FcγRIIIへの結合を向上させることが示された。さらに、以下の突然変異の組み合わせがFcγRIII結合を向上することが示されている。それは、T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A およびS298A/E333A/K334Aである。

さらに別の実施態様では、前記の抗体のグリコシル化を修飾する。たとえば、グリコシル化された抗体を作製することができる（つまり、前記抗体はグリコシル化が欠如している）。グリコシル化を変化させて、たとえば抗原への前記抗体の親和性を増加することができる。そのような糖の修飾は、たとえば前記抗体配列内の1つ以上のグリコシル化の部位を変化させることによって行われる。たとえば、1つ以上のアミノ酸を置換させて、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が消失して、その部位のグリコシル化を消失させることができる。そのようなグリコシル化によって、抗原への前記抗体の親和性を増加させることもできる。そのような方法は、Co et al.による米国特許第5,714,350
号および6,350,861 号にさらに記載されている。

さらに、または代替的に、フコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体か、もしくは二分化GlcNac構造を多く有する抗体など、変種のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変化させたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を上昇させることが証明されている。そのような糖修飾は、たとえば変化させたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で前記抗体を発現させることによって行うことができる。変化させたグリコシル化機構を有する細胞は当業で説明されており、本願発明の組換え抗体を発現し、変化させたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。たとえば、Hanai et al. によるEP
1,176,195には、機能的に障害されたFUT8遺伝子を有する細胞株が記述されている。このFUT8遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードしており、そのような細胞の中で発現した抗体が低フコシル化を示す。Presta によるPCT特許公報第WO 03/035835 号には、変異CHO細胞株、フコースのAsn(297)-結合糖への結合能力が低いLec13が記述されており、それによって、その宿主細胞に発現される抗体の低フコシル化が生じる（Shields, R.L. et al.(2002) J.
Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et
al. によるPCT特許公報第WO 99/54342 号には、操作された細胞株の中に発現した抗体が、前記抗体の高ADCC活性を生じる二分化GlcNac構造の増加を示すような、糖タンパク修飾グリコシルトランスフェラーゼ(たとえば β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII (GnTIII))
を発現するように操作された細胞株が記述されている。

本願発明に用いることができる、作製可能な抗体の別の修飾には、ペグ化が含まれる。抗体をペグ化すると、たとえば前記抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、前記抗体またはその断片を、典型的に、1つ以上のPEG基が前記抗体または抗体断片に結合するような条件下において、ポリエチレングリコール（PEG）であって、たとえばPEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。好ましくは、前記ペグ化は、反応性PEG分子（または類似する反応性水溶性ポリマ）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって、行われる。本願明細書に記載の、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（C1乃至C10）アルコキシ-またはアリロキシ-ポリエチレングリコール、もしくはポリエチレングリコールマレイミドなど、その他のタンパク質を誘導するために使用されている、PEGのいずれの形状をも包含することを意図する。ある実施態様では、ペグ化される抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化の方法は、当業に知られており、本願発明の抗体に応用することができる。たとえば、Nishimura et al. によるEP
0 154 316 およびIshikawa et al.によるEP 0 401 384 を参照のこと。

抗体の操作方法
上述のとおり、本願明細書に開示されるV_HおよびV_K
配列を有する抗CD30抗体を用いて、V_Hおよび／もしくはV_K
配列、またはそこに結合する定常領域を修飾することによって、新しい抗CD30抗体を作製することができる。したがって、本願発明の別の局面では、本願発明の抗CD30抗体、たとえば.
17G1、2H9または5F11の構造的特徴を用いて、本願発明の抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する、構造的に関連する抗CD30抗体を作製する。たとえば、17G1、2H9または5F11の1つ以上のCDR領域、またはその突然変異体を、既知のフレームワーク領域および／またはCDRに組換え的に組み合わせ、上述されているとおり、本願発明のさらなる組換え操作された抗CD30抗体を作製することができる。その他の種類の修飾には、前セクションに記載のものが含まれる。この操作方法のための開始物質は、本願明細書に提供される1つ以上のV_Hおよび／またはV_K配列、または1つ以上のそのCDR領域である。操作した抗体を作製するために、本願明細書に提供される1つ以上のV_Hおよび／またはV_K配列、または1つ以上のそのCDR領域を有する抗体を実際に調製する（つまりタンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、前記配列に含まれる情報を、元の配列から誘導した「第2世代」配列を作製するための開始物質として用い、「第2世代」配列を調製し、タンパク質として発現させる。

したがって、別の実施態様では、本願発明は、
(a) (i)配列番号第16、28および40からなるグループから選択されるCDR1配列と、配列番号第17、29および41からなるグループから選択されるCDR2配列と、および／または配列番号第18、30および42からなるグループから選択されるCDR3配列からなる重鎖可変領域抗体配列、ならびに／または(ii)配列番号第22、34および46からなるグループから選択されるCDR1配列と、配列番号第23、35および47からなるグループから選択されるCDR2配列と、および／または配列番号第24、36および48からなるグループから選択されるCDR3配列からなる軽鎖可変領域抗体配列、を提供するステップと、
(b) 重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を変化させて、少なくとも1つの変化させた抗体配列を作製するステップと、
(c) 前記の変化させた抗体配列をタンパク質として発現させるステップと、
を含む抗CD30抗体の調製の方法を提供する。

標準の分子生物学技術を用いて、変化させた抗体配列を調製および発現させることができる。

好ましくは、前記の変化させた抗体配列によってコードされた抗体は、本願明細書に記載の抗CD30抗体の機能的特性を1つ、一部、またはすべて保持するものであって、その機能的特性には、
(a) K_Dが1x10^-8 M 以下のヒトCD30に結合するか、
(b) 配列番号第4、8、および12からなるグループから選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
(c) 前記抗体が、K_Dが1x10^-8 M 以下のヒトCD30に結合するか、
(d) 前記抗体が少なくとも約10³、より好ましくは約10⁴、および最も好ましくは約10⁵M^-1S^-1のCD30との会合定数（K_assoc）を有するか、
e) 前記抗体が約10^-3s^-1、好ましくは約10^-4s^-1、より好ましくは10^-5s^-1、および最も好ましくは10^-6s^-1のCD30からの解離定数（K_dis）を有するか、
f) 前記抗体が、CD30を発現する細胞をオプソニン化する能力を有するか、
g) 前記抗体が、約10
μg/ml以下（たとえばin
vitroにおいて）の濃度におけるヒトエフェクタ細胞の存在下での、CD30発現細胞（たとえば腫瘍細胞）の成長を阻害し、ならびに／または貪食および死滅させる能力を有するか、
または、(h) CD30への合能力、およびCD30に結合するCD30リガンドを部分的または完全に遮断することによるCD30機能の阻害能力（たとえばCD30媒介作用）(CD30
リガンドの例には、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5が含まれる)、
が、それらに限定されずに含まれる。

変化させた抗体の機能的特性は、実施例に記載されるものなど（たとえばフローサイトメトリ、結合アッセイなど）、当業で入手可能な、および／または本願明細書に記載の標準アッセイを用いて評価することができる。

本願発明の抗体の操作方法のある実施態様では、突然変異を抗CD30抗体コード配列の全体または一部分を無作為にまたは選択的に導入することができ、得られた修飾抗CD30抗体を、本願明細書に記載のとおり、結合および／またはその他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。突然変異方法は、当業に記述されている。たとえば、ShortによるPCT特許公報第WO
02/092780 号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ、またはそれらの組み合わせを用いて抗体の突然変異を作製およびスクリーニングする方法を記述している。代替的には、Lazar et al. によるPCT公報第WO
03/074679 は、抗体の生理化学的特性を最適化するための計算スクリーニングを用いた方法を記述している。

本願発明の抗体をコードする核酸分子
本願発明に有用なある抗体をコードする核酸分子を本願明細書に記載する（配列番号第1、3、5、7、9、および11）。前記核酸は、全細胞、細胞ライセート、または精製もしくは実質的に純粋な状態であってよい。核酸は、アルカリ／SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動法、およびその他の当業に公知の方法を含む、標準技術によって、たとえば細胞性核酸またはタンパク質などその他の細胞性成分またはその他の汚染物質から精製されている場合に、「単離されている」または「実質的に純粋である」。F. Ausubel, et al.,
ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley
Interscience, New Yorkを参照。本願発明の核酸は、たとえばDNAまたはRNAであってよく、イントロン配列を含有しないことがある。好ましい実施態様では、前記核酸はcDNA分子である。

本願発明の核酸は、標準の分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマによって発現される抗体の場合、ハイブリドーマがつくる前記抗体の軽鎖および重鎖をコードするCDNAは、標準のPCR増幅、またはcDNAクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体の場合（たとえばファージディスプレイ技術をもちいた）、前記抗体をコードする核酸は、前記ライブラリから回収することができる。

本願発明の好ましい核酸分子は、17G1、2H9または5F11モノクローナル抗体のVHおよびVL配列をコードするものである。17G1、2H9および5F11のVH配列をコードするDNA配列は、それぞれ配列番号第2、5、および9に示される。17G1、2H9および7F11のVL配列をコードするDNA配列は、それぞれ配列番号第3、7、および11に示される。

VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られれば、これらのDNA断片を、たとえば前記可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子をscFv遺伝子に転換するために、標準組換えDNA技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、VLまたはVHコードDNA断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカなどの別のタンパク質をコードする別のDNA断片に、動作可能に結合する。この文脈に用いられる「動作可能に結合する」という用語は、2つのDNA断片を、2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸がインフレームにとどまるように結合することを意味することを意図する。

VH領域をコードする単離されたDNAを、前記VHコードDNAを重鎖定常領域（CH1、CH2およびCH3）をコードする別のDNA分子に動作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に転換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当業に知られており（Kabat, E. A., et
al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,
U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を包含するDNA断片は標準PCR増幅によって得ることができる。前記重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域であってよいが、最も好ましいのはIgG1またはIgG4である。Fab断片重鎖遺伝子では、VHコードDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に動作可能に結合することができる。

VL領域をコードする単離されたDNAを、前記VLコードDNAを軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に動作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子（およびFab軽鎖遺伝子）に転換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当業に知られており（Kabat, E. A., et al.(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department
of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を包含するDNA断片は標準PCR増幅によって得ることができる。前記軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であってよいが、最も好ましくはκ定常領域である。

scFv遺伝子を作製するために、VHおよびVL配列が、VLおよびVH領域がフレキシブルリンカによって連結されている近接する1本鎖タンパク質として発現されうるように、たとえばアミノ酸配列(Gly₄
-Ser)₃をコードするなど、フレキシブルリンカをコードする別の断片に、VHおよびVLコードDNA断片を動作可能に結合する。

本願発明のモノクローナル抗体の産生
本願発明に有用なモノクローナル抗体（mAbs）は、たとえばKohler
and Milstein (1975) Nature 256:495の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術など、従来のモノクローナル抗体の方法論を含む各種技術によって作製することができる。基本的には体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、たとえばBリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換など、モノクローナル抗体を作製する他の技術を用いることができる。

ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は十分に確立された方法である。融合のための免疫化された脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技術は当業に知られる。融合のパートナ（たとえばマウス骨肉腫細胞）および融合方法も知られる。

本願発明のキメラまたはヒト化抗体は、上述のとおり調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、対象のマウスハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（たとえばヒト）免疫グロブリンを含有するように操作することができる。たとえば、キメラ抗体を作製するために、前記マウス可変領域を、当業に知られる方法を用いてヒト定常領域に結合させることができる（たとえばCabilly et al.の米国特許第4,816,567号を参照）。ヒト化抗体を作製するために、前記マウスCDR領域を、当業に知られる方法を用いてヒトフレームワークに挿入することができる（たとえばWinterの米国特許第5,225,539号、およびQueen et al.の米国特許第5,530,101、5,585,089、5,693,762および6,180,370号を参照）。

好ましい実施態様では、本願発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。CD30に対するそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の部分を持つ遺伝子導入または染色体導入マウスを用いて作製することができる。これらの遺伝子導入および染色体導入マウスには、本願明細書ではそれぞれHuMAbマウス^(R)およびKMマウス^(R)とよばれるマウスが含まれ、本願明細書ではまとめて「ヒトIgマウス」とよぶ。これらのマウスは当業に公知である（たとえば、Lonberg, et al.(1994)
Nature 368(6474):856-859; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of
Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D.
(1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93, and Harding, F. and
Lonberg, N.(1995) Ann.
N.Y. Acad. Sci. 764:536-546を参照）。HuMabマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスがもつゲノム修飾は、本願明細書にその内容全体を引用により具体的に援用する、Taylor, L. et al. (1992)
Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993)
International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993)
Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO
J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920;
Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591;
and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851にさらに説明されている。さらに、Lonberg and Kayの米国特許第5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、および5,770,429号、Surani
et al.の米国特許第5,545,807号、Lonberg
and KayのPCT公報第WO 92/03918、WO
93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO
98/24884およびWO 99/45962、ならびにKorman et al.のPCT公報第WO
01/14424 号を参照のこと。

別の実施態様では、本願発明のヒト抗体は、たとえばヒト重鎖導入遺伝子をもつマウス、およびヒト軽鎖導入染色体など、導入遺伝子および導入染色体上のヒト免疫グロブリンをもつマウスを用いて作製することができる。本願明細書で「KMマウス^(R)」とよばれるそのようなマウスは、Ishida et al.のPCT公報第WO
02/43478 号に詳述されている。

よりさらに、代替的なヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する導入遺伝子動物系は当業に知られており、本願発明に使用される抗CD30抗体を作るために使用することができる。たとえば、Xenoマウス (Abgenix, Inc.社)とよばれる代替的な導入遺伝子システムを用いることができ、そのようなマウスは、たとえばKucherlapati et al.の米国特許第5,939,598、6,075,181号、6,114,598号、6,
150,584号および6,162,963号に記載される。

さらに、代替的なヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する染色体導入動物系は当業に知られており、本願発明に使用される抗CD30抗体を作るために使用することができる。たとえば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を両方もつ、「TCマウス」とよばれるマウスを用いることができ、そのようなマウスはTomizuka et
al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシが当業に記述されており（Kuroiwa et al.(2002) Nature
Biotechnology 20:889-894）、本願発明に使用される抗CD30抗体を作るために使用することができる。

本願発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするファージディスプレイ方法を用いて調製することができる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ方法は当業に確立している。たとえば、Ladner et al.の米国特許第5,223,409、5,403,484、および5,571,698号、Dower
et al.の米国特許第5,427,908および5,580,717号、McCafferty
et al.の米国特許第5,969,108および6,172,197号、Griffiths
et alの米国特許第5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915および6,593,081号を参照のこと。

本願発明に用いられるヒトモノクローナル抗体は、免疫化によってヒト抗体応答が生じるようにヒト免疫細胞が再構築されたSCIDマウスを用いて調製することもできる。そのようなマウスは、たとえばWilson et al.による米国特許第5,476,996 号および5,698,767 号に記載されている。

ヒトIgマウスの免疫化
ヒト抗体を育成するためのヒトIgマウスの免疫化は、引用により本願明細書にその全体を援用する、米国特許出願公報第2004/0006215号に詳述されている。CD30に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製する詳細な手順も本願明細書に記載する。

本願発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本願発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウスに由来する脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、マウス骨肉腫細胞株などの好適な不死化細胞に融合することができる。その結果得られたハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。そのような方法論は当業に公知で、米国2004/0006125に記載される。

本願発明のヒトモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本願発明に用いられる抗体は、たとえば当業に公知の組換えDNA技術と遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを用いて宿主細胞トランスフェクトーマシステムの中で産生することができる。

CD30に対するヒトモノクローナル抗体の結合の特徴付け
本願発明のヒトモノクローナルCD30抗体の結合を特徴付けるために、免疫化マウスの血清を、たとえばELISAなどで試験することができる。ELISAプロトコルの典型的な（しかし制限ではない）例では、マイクロタイタープレートを0.25μg/mlの精製CD30のPBS溶液でコーティングしてから、PBS中の5%ウシ血清アルブミンで遮断する。CD30免疫化マウスに由来する血漿の希釈物を各ウエルに加え、37℃で1乃至2時間かけて導入する。前記プレートをPBS/ツイーンで洗浄し、アルカリホスファターゼにヤギ抗ヒトIgG Fcを結合させた特異的ポリクローナル試薬で、37℃、1時間インキュベートする。洗浄後、前記プレートをpNPP基質（1
mg/ml）で展開し、ODが405乃至650で分析する。好ましくは、最高の力価を生じたマウスを融合に使用する。

上述のELISAアッセイを用いて、CD30免疫原に対して陽性の反応性を示すハイブリドーマについてスクリーニングすることもできる。CD30への高い結合活性で結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴付けを行う。親細胞の反応性を保持する（ELISAによる）各ハイブリドーマの1つのクローンを、-140℃に保存された5乃至10本のバイアル細胞銀行を作製するために、および抗体精製のために選択することができる。

ヒト抗CD30抗体を生成するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットルスピナフラスコ中で成長させることができる。上清をろ過し、濃縮してからタンパク質Aセファロースによる親和性クロマトグラフィにかけることができる（ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。溶出されたIgGを、純度を確保するためにゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィで検査することができる。バッファ溶液をPBSに交換し、濃度を吸光度1.43を用いてOD₂₈₀ で測定することができる。前記モノクローナル抗体をアリコートに分けて、-80℃で保存することができる。

選択されたヒト抗CD30モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬を用いて各抗体をビオチン化することができる。標識していないモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合研究を、上述のとおり、CD30でコーティングされたELISAプレートを用いて行うことができる。ビオチン化MAb結合を、ストレプ-アビジン-アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。

精製抗体のイソタイプを決定するために、イソタイプELISAを行うことができる。たとえば、マイクロタイタープレートのウエルを、4℃で一晩、10μg/mlの抗ヒトIgでコーティングすることができる。5%BSAでブロッキングしてから、室温で2時間、前記プレートを10μg/mlのモノクローナル抗体または精製されたイソタイプ対照と反応させる。その後、前記ウエルを、ヒトIgG1またはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。上述のとおり、プレートを展開して分析する。

CD30を発現する生細胞に対するモノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリを使用することができる。フローサイトメトリのプロトコルの典型的な（しかし制限ではない）例では、CD30を発現する細胞株を0.1%BSAと20%マウス血清を含有するPBSに入れた各種濃度のモノクローナル抗体と混合し、37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、前記細胞を、一次抗体染色と同一の条件下で蛍光標識抗ヒトIgG抗体と反応させた。前記サンプルを、FACScan装置によって、単細胞をゲートでコントロールする光および側面散乱特性を用いて分析することができる。蛍光顕微鏡を用いた代替的なアッセイは、（それに加えて、またはその代わりに）フローサイトメトリアッセイを用いてもよい。細胞を、上述のとおり正確に染色し、蛍光顕微鏡で検査することができる。この方法により、個別の細胞の可視化が可能になるが、前記抗原の密度によって感受性が低下するかもしれない。

抗CD30ヒトIgGは、さらにウェスタンブロットによってCD30との反応性を試験することができる。たとえば、CD30を発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移動させ、20%マウス血清でブロックし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT 基質錠剤（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で展開することができる。

CD30に対するヒトモノクローナル抗体の貪食および細胞死滅活性
CD30への特異的な結合に加えて、ヒトモノクローナル抗体抗CD30抗体を、CD30を発現する細胞の貪食および死滅を媒介する能力について試験することができる。in
vitroにおけるモノクローナル抗体活性の試験は、in vivoモデルの前の初期スクリーニングを提供するだろう。簡単に説明すると、健康なドナーの多形核細胞（PMN）またはその他のエフェクタ細胞をFicoll Hypaque 密度遠心分離法によって精製し、汚染赤血球を溶解することができる。洗浄したPMNを、10%熱不活性ウシ胎仔血清を加えたRPMIに懸濁し、CD30を発現する⁵¹Cr標識細胞と、腫瘍細胞に対するエフェクタ細胞の各種比（エフェクタ細胞：腫瘍細胞）で混合することができる。それから、各種濃度の精製ヒト抗CD30IgGを加えることができる。無関係なヒトIgGを陰性対照として用いることができる。アッセイは、4乃至18時間、37℃で行うことができる。サンプルは、⁵¹Crの培養液上清への放出量を測定することによって、細胞溶解についてアッセイすることができる。抗CD30モノクローナルは、相互に組み合わせて、複数のモノクローナル抗体で細胞溶解が増強されるかどうかを決定するために試験することもできる。

CD30に結合するヒトモノクローナル抗体は、たとえば腫瘍細胞などCD30を発現する細胞の貪食または死滅を媒介する効率を測定するために、in
vivoモデル（たとえばマウス）でテストすることもできる。これらの抗体を、たとえば、これらに限定されることを意図しない以下の基準に基づいて選択することができる。それは、
1.) CD30を発現する生細胞への結合、
2.) CD30への結合の高親和性、
3.) CD30上の固有エピトープへの結合（相補的な活性を有するモノクローナル抗体が、組み合わせて用いられる場合、同エピトープへの結合と競合する可能性を削除するため）、
4.) CD30を発現する細胞のオプソニン化、
5.) ヒトエフェクタ細胞の存在下における、CD30を発現する細胞の成長阻害、貪食および／または死滅の媒介、
である。

本願発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、これらの基準の1つ以上、および好ましくはすべてにあてはまる。ある実施態様では、前記ヒトモノクローナル抗体は、たとえば2つ以上の抗CD30モノクローナル抗体もしくはその断片を含む薬学的組成物などと組み合わせて使用する。たとえば、望ましい治療または診断効果を達成するために、異なるが相補的な活性を有するヒト抗CD30モノクローナル抗体を単一療法と組み合わせることができる。この具体例は、エフェクタ細胞の存在下において高効率の標的細胞の死滅を媒介する抗CD30ヒトモノクローナル抗体と、CD30を発現する細胞の成長を阻害する別のヒト抗CD30モノクローナル抗体とを組み合わせて含有する組成物であろう。

CD3に結合する二特異性／多特異性分子
本願発明の方法のさらに別の実施態様では、CD30に対するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、たとえば別のペプチドまたはタンパク質（たとえばFab’断片）に誘導されるかまたは結合させて、複数の欠乏部分または標的エピトープに結合する二特異性または多特異性分子を作製させることができる。たとえば、本願発明の抗体または抗原結合部分は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体など、1つ以上のその他の結合部分に（たとえば化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合、またはその他などによって）機能的に連結させることができる。本願発明に有用な二特異生分子には、米国2004/0006215に記載のものが含まれる。ある実施態様では、前記二特異性抗体は、米国2004/0006215に記載のH22xKi4である。

本願明細書に記載の「エフェクタ細胞特異的抗体」は、エフェクタ細胞のFcレセプタに結合する抗体または機能的抗体断片を意味する。本願発明に使用される好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンが結合していない部位にあるエフェクタ細胞のFcレセプタに結合する。

本願明細書に記載の「エフェクタ細胞」という用語は、免疫応答の認知期および活性化期と対照的な、免疫応答のエフェクタ期に関与する免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞には、たとえば、リンパ球（たとえば、B細胞および細胞傷害性T細胞（CTL）を含むT細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球などの、骨髄性またはリンパ球様由来の細胞が含まれる。エフェクタ細胞の一部は、特異的なFcレセプタを発現し、特異的な免疫機能を有する。好ましい実施態様では、エフェクタ細胞は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）を誘導する能力があり、たとえばADCCを誘導する能力がある好中球などである。たとえば、FcRを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的死滅、および免疫系の他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。他の実施態様では、エフェクタ細胞は、標的抗原、標的細胞、または微生物を貪食することができる。エフェクタ細胞上のあるFcRの発現は、サイトカインなど体液性の因子によって制御することができる。たとえば、FcγRIの発現は、インターフェロンγ（INF-γ）によって上方調節されることがわかっている。この高発現により、標的に対するFcγRIを有する細胞の細胞毒性が上昇する。エフェクタ細胞は、標的抗原、または標的細胞を貪食または溶解することができる。

「標的細胞」は、本願発明の組成物（たとえばヒトモノクローナル抗体、二特異性または多特異性分子）が標的とすることができる、被験体（たとえばヒトまたは動物）に望ましくないいずれの細胞をも意味する。好ましい実施態様では、前記標的細胞は、たとえばCD30陽性リンパ腫など、CD30を発現または過剰発現する細胞である。CD30を発現する細胞には、典型的には、膀胱、胸部、大腸、腎、卵巣、前立腺、腎細胞、扁平上皮細胞、肺（非小細胞）、および頭頸部腫瘍細胞などの、腫瘍細胞が含まれる。その他の標的細胞には、滑膜線維芽細胞が含まれる。

キメラマウス-ヒトモノクローナル抗体（つまりキメラ抗体）は、当業に知られる組換えDNA技術によって産生することができる。たとえば、マウス（または他種）モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で切断し、マウスFcをコードする領域を取り除き、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の等価部分を置換する。（たとえば、Robinson et al., 国際特許公報PCT/US86/02269、Akira,
et al., 欧州特許公報184,187、Taniguchi,
M., ., 欧州特許出願第171,496号、
Morrison et al., 欧州特許出願第173,494号、Neuberger
et al., 国際出願第 WO 86/01533号、Cabilly
et al. 米国特許第 4,816,567号、Cabilly
et al., 欧州特許出願第125,023号、Better
et al.(1988 Science 240:1041-1043)、Liu et al.(1987)
PNAS 84:3439-3443、Liu et al., 1987, J.
Immunol. 139:3521-3526、Sun et al.(1987) PNAS
84:214-218、Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005、Wood
et al.(1985) Nature 314:446-449、and Shaw et al.,
1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559）。

前記キメラ抗体は、ヒトFv可変領域と等価な配列に結合する抗原に直接関与しないFv可変領域の配列と交換することによって、さらにヒト化することができる。ヒト科キメラ抗体の一般的な総説は、Morrison, S. L.,
1985, Science 229:1202-1207 およびby Oi et al.,
1986, BioTechniques 4:214に提供される。これらの方法には、少なくとも1つの重鎖または軽鎖に由来する免疫グロブリンFv可変領域の全体または一部分をコードする、核酸配列を単離、操作、および発現するステップが含まれる。そのような核酸の供給源は当業に公知であり、たとえば7E3、抗GPII_bI
II_a抗体産生ハイブリドーマから得ることもできる。その後、キメラ抗体またはその断片をコードする組換えDNAを、適切な発現ベクタにクローニングすることができる。好適なヒト化抗体は、米国特許第 5,225,539号、Jones
et al.1986 Nature 321:552-525、Verhoeyan et al.1988
Science 239:1534、およびBeidler et al.1988 J.
Immunol. 141:4053-4060のCDR置換によって、組換え的に産生することができる。

あるヒト抗体のCDRの全体を非ヒトCDRの少なくとも一部分と置換することもでき、またはCDRの一部分だけを非ヒトCDRと置換することもできる。Fcレセプタに対するヒト化抗体の結合に必要なCDR数を交換する必要しかない。

抗体は、ヒト抗体のCDRの少なくとも一部分を非ヒト抗体に由来するCDRと交換することができる、いずれかの方法によってヒト化することができる。Winterは、本願発明のヒト化抗体を調製するために使用できる方法を、その内容を引用により明らかに援用する1987年3月26日に提出した英国特許出願第GB
2188638Aに記述している。ヒトCDRは、Humanized
Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytesという標題の国際特許出願第WO
94/10332 号に記載されるオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘導を用いて、非ヒトCDRと置換することもできる。

本願発明の範囲内には、特定のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたキメラまたはヒト抗体もある。特に、好ましいヒト化抗体は、抗原への結合を向上させるために、フレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。たとえば、マウスCDRを有するヒト化抗体において、ヒト化フレームワーク領域に位置するアミノ酸を、マウス抗体の相当する位置にあるアミノ酸と置換することができる。そのような置換は、ある場合には、ヒト化抗体の抗原への結合を向上させることが知られている。アミノ酸が付加、欠失、または置換された抗体は、本願明細書では修飾抗体、または組換え抗体とよばれる。

修飾抗体という用語は、抗体の欠失、付加、または置換部分などによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体も含まれることを意図する。たとえば、抗体を、定常領域を欠失させ、その領域をたとえば血清半減期、前記抗体の安定性または親和性の上昇を意味する定常領域と置換することによって、修飾することができる。いずれの修飾も、二特異性および多特異性分子がFcγRに特異的な抗原結合領域を少なくとも1つ有し、少なくとも1つのエフェクタT細胞機能を誘導する限り、本願発明の範囲内である。

本願発明の二特異性および多特異性分子は、化学的技術（たとえばD. M. Kranz et al.(1981) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78:5807参照）、「ポリドーマ」技術（たとえばReadingの米国特許第4,474,893号参照）、または組換えDNA技術を用いて作製することができる。

特に、本願発明の二特異性および多特異性分子は、当業に知られる方法、および本願明細書に提供される実施例に記載の方法を用いて、たとえば抗FcRおよび抗CD30結合特異性などの構成結合特異性を結合させることによって調製することができる。たとえば、前記二特異性および多特異性分子の各結合特異性は、別々に作製してからお互いに結合させることができる。前記結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合のために、各種のカップリングまたは交差結合物質を使用することができる。交差結合物質の例には、タンパク質A、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（SATA）、5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸（SPDP）、およびスルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロハキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）が含まれる（たとえばKarpovsky et al.(1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu,
MA et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。その他の方法には、Paulus
(Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132)、Brennan et al.(Science
(1985) 229:81-83)、およびGlennie et al.(J. Immunol.
(1987) 139:2367-2375)に記述されるものが含まれる。好ましい結合物質は、SATAおよびスルホSMCCであって、どちらもPierce Chemical Co. 社（イリノイ州ロックフォード）から入手できる。

前記結合の特異性が抗体（たとえば2つのヒト化抗体）である場合、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合させることができる。特に好ましい実施態様では、結合前に、前記ヒンジ領域が、奇数の、好ましくは1つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾する。

代替的には、両方の結合特異性は、同一のベクタにコードされ、同一の宿主細胞に発現し組み立てられる。この方法は、二特異性および多特異性分子がMAb x MAb, MAb x Fab,
Fab x F(ab')₂またはリガンドx Fab融合タンパク質である場合、特に有用である。たとえば二特異性分子など、本願発明の二特異性および多特異性分子は、1本鎖二特異性抗体、1本鎖抗体と結合決定因子を含む1本鎖二特異性分子、または2つの結合決定因子を含む1本鎖二特異性分子など、1本鎖分子であってよい。二特異性および多特異性分子も1本鎖分子であってよく、または少なくとも2つの1本鎖分子を含んでもよい。二特異性分子および多特異性分子を調製する方法は、たとえば米国特許第5,260,203号、米国特許第5,455,030号、米国特許第4,881,175号、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,476,786号、米国特許第5,013,653号、米国特許第5,258,498号、および米国特許第5,482,858号に記載される。

二特異性および多特異性分子の、その標的への結合は、酵素免疫吸着法（ELISA）、放射免疫法、FACS分析、バイオアッセイ（たとえば成長阻害）またはウェスタンブロット法によって確認することができる。これらの各アッセイは、一般に、特に対象のタンパク質抗体複合体の存在を、対象の複合体に特異的な標識された試薬（たとえば抗体など）を用いて検出する。たとえば、FcR抗体複合体は、前記抗体FcR複合体を認識し特異的に結合する、たとえば酵素結合抗体または抗体断片などを用いて検出することができる。代替的には、前記複合体は、他の各種免疫アッセイのいずれかを用いて検出することができる。たとえば、前記抗体を放射能標識し、放射免疫測定法（RIA）に用いることができる（たとえば、引用により本願明細書に援用されるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh
Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March,
1986を参照）。放射性同位体は、ガンマ線カウンタもしくはシンチレーションカウンタの使用、またはオートラジオグラフィなどの手法によって検出することができる。

免疫複合体
別の局面では、本願発明に用いられた抗体は、細胞毒素などの治療部分、薬物（たとえば免疫抑制剤）、または放射性毒素に結合させることができる。そのような複合体は、本願明細書では「免疫複合体」とよばれる。1つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は、「免疫毒素」とよばれる。細胞毒素または細胞毒性物質には、細胞に有害な（たとえば死滅させる）いずれの物質も含まれる。例には、タキソール、シトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンならびにその類似体または相同体が含まれる。治療物質にはさらに、たとえば、代謝拮抗物質（たとえばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラシクリン（たとえばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、および抗分裂剤（たとえばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。

本願発明の抗体に結合できる治療用細胞毒素の他の好ましい例には、ダウノカルマイシン、カリケアミシン、マイタンシン、およびアウリスタチン、ならびにその誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合体の例は、市販されている（Wyeth-Ayerst社、Mylotarg（登録商標））

細胞毒素を、当業で使用可能なリンカ技術によって、本願発明に用いられる抗体に結合させることができる。細胞毒素を抗体に結合するために使用されているリンカタイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカが、それらに限定されずに含まれる。リンカは、たとえば、リソソーマルコンパートメント内での低pHによる切断に感受性があるか、または選択的にカテプシンなどの腫瘍組織に発現するプロテアーゼなどの、プロテアーゼによる切断に感受性があるものを選択してよい。

細胞毒性、リンカ、および治療薬と抗体の結合方法の種類についてのさらなる考察については、Saito, G. et
al. (2003)
Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003)
Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer
Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763;
Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091;
Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv.
Rev. 53:247-264を参照。

本願発明に用いられる抗体は、放射性同位体に結合させて、放射性免疫複合体ともよばれる細胞毒性放射性医薬品を作製することもできる。診断または治療に用いられる抗体に結合させることができる放射性同位体の例には、ヨウ素¹³¹、インジウム¹¹¹、イットリウム⁹⁰、およびルテチウム¹⁷⁷が、それらに限定されずに含まれる。放射性免疫複合体の調製方法は、当業に確立されている。放射性免疫複合体の例は市販されており、ゼバリン^TM（IDECファーマシューティカルズ社）、およびBexxarTM（コリクサ・ファーマシューティカルズ社）を含み、本願発明の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製するために類似の方法を用いることができる。

本願発明の方法に用いられる抗体複合体は、所与の生物学的応答を修飾することができ、前記薬物部分は古典的な化学療法剤と限定的に解釈されない。たとえば、前記薬物部分は、望ましい生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質には、たとえば、酵素的にかっせいな毒素または活性なその断片であって、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素など、腫瘍壊死因子またはインターフェロンγなどのタンパク質、生物学的応答修飾剤であって、たとえばリンホカイン、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、またはその他の成長因子など、が含まれてよい。

そのような治療部分を抗体に結合させる技術は当業に公知で、たとえば、Arnon et al.,
"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer
Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.),
pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Hellstrom et al.,
"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd
Ed.), Robinson et al.(eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、Thorpe,
"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",
in Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et
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Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody
In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And
Therapy, Baldwin et al.(eds.), pp.303-16(Academic Press 1985)、およびThorpe
et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin
Conjugates", Immunol.Rev., 62:119-58(1982)を参照のこと。

プロテアソーム阻害物質
本願発明は、CD30陽性リンパ腫を治療するために抗CD30抗体と併用する、直接的または間接的阻害のいずれかによるNF-κBの阻害物質の投与を必要とする。プロテアソーム阻害物質は本願発明の方法に有用である。ある実施例では、前記プロテアソーム阻害物質は哺乳動物細胞に認められる26Sプロテアソームのキモトリプシン様活性を低下または遮断する。26Sプロテアソームは、ユビキチン化タンパク質を分解して、NF-κB経路を間接的に活性化する、大きいタンパク質複合体である。プロテアソーム活性の選択的阻害には、細胞性炎症応答を制御する転写因子、NF-κBの活性の低下、および細胞の生存に関与する遺伝子、bcl-2の活性の阻害を含む、癌治療に関与することができる多数の作用がある。NF-κBおよびbcl-2 活性が高いと、癌細胞が標準的な化学療法剤による治療に対して自らを防御するようになる。プロテアソーム阻害物質は、NF-κBおよびbcl-2の正常な機能を遮断することによって、癌細胞死を生じることができる。したがって、26Sプロテアソームの活性の阻害などによる、直接的または間接的にNF-κB活性を低減する化合物を、本願発明の方法に用いることができる。

プロテアソーム活性の阻害物質、およびその製造方法は当業に公知であり、たとえば米国特許第5,780,454、6,066,730、6,083,903、6,297,217、6,465,433、6,548,668、6,617,317、および6,747,150号に記載のボロン酸およびエステル化合物などである。その他のプロテオソーム阻害化合物には、たとえば、ALLnL (N-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-ノルロイシナル、MG101)、LLM
(N-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-メチオナル)、Z-LLnV
(カルボベンゾキシル-ロイシニル-ロイシニル-ノルバリナル、MG115)、Z-LLL(カルボベンゾキシル-ロイシニル-ロイシニル-ロイシナル、MG132)、ラクタシスチン、b-ラクトン、ボロン酸ペプチド、ユビキチンリガーゼ阻害物質、シクロスポリンA,、FK506 (タクロリムス)およびデオキシスペルグアリンが含まれる。

さらに、化合物のNF-κBの活性を阻害する能力について、DNA結合アッセイによって試験することができる（Palombella, et al.,
Cell 78.773 (1994)）。たとえば、全細胞抽出物を、未処理の細胞、またはテスト化合物で1時間予処理したTNF-α処理細胞から調製することができる。NF-κBのDNA結合活性を、ヒトIFN-β遺伝子プロモータのPRDIIプローブを用いた電気泳動移動度シフトアッセイで測定することができる。NB-κB活性の間接的な測定として、Eセレクチンの細胞表面発現、I-CAM-1、および1次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）のV-CAM-1を、細胞表面経口免疫結合アッセイを用いて決定することができる。E-セクレチン、I-CAM-1、およびV-CAM-1はNF-κBの調節制御下にあるため、NF-κB活性を阻害すると、細胞表面のこれらの接着分子のレベルが低下する。

本願発明のある実施態様では、26Sプロテアソームのキモトリプシン様活性の可逆的な阻害物質であり、米国特許第5,780,454号に記載の、前記プロテアソーム阻害物質はボルテゾミブ（ミレニアム・ファーマシューティカルズ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）である。別の実施態様では、前記プロテアソーム阻害物質はMG-132（カルバイオケム社、カリフォルニア州）である。

本願明細書に記載の「NF-κBを阻害する化合物」という文言は、NF-κBの活性に直接的または間接的に作用してアポトーシスを引き起こすためにNF-κBの活性を低減または遮断する任意の化合物を意味するために用いられる。上述のプロテアソーム阻害物質は、NF-κBの活性に間接的に作用するような化合物の例である。

薬学的組成物
本願発明の方法は、(i)本願発明の抗CD30モノクローナル抗体1つもしくはその組み合わせ、またはその抗原結合部分を含有し、薬学的に許容な担体とともに調合した、たとえば薬学的組成物などの組成物、および(ii)薬学的に許容な担体とともに調合したプロテアソーム阻害物質を含有する、たとえば薬学的組成物などの組成物、を用いる。抗体組成物には、本願明細書に記載の、1つの抗体もしくは（たとえば2つ以上の異なる）抗体の組み合わせ、または免疫複合体もしくは二特異性分子が含まれてよい。たとえば、抗体薬学的組成物は、CD30上の異なるエピトープに結合する、または相補的な活性を有する抗体（または免疫複合体もしくは二特異性分子）の組み合わせを含むことができる。

本願発明に使用される薬学的組成物は、さらに、さらなる物質と組み合わせることもできる。たとえば、望ましくは、本願発明の併用療法、つまり抗体とプロテアソーム阻害物質には、少なくとも1つのその他の抗腫瘍または細胞増殖抑制性または細胞毒性物質が含まれる。併用療法に用いることができるさらなる治療物質の例は、本願発明の抗体の用途についてのセクションに詳しく後述する。

本願明細書に用いられる「薬学的に許容な担体」という文言には、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合な類似物などが含まれる。好ましくは、前記担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与に好適である。投与経路に応じて、前記活性化合物、つまり抗体、免疫複合体、または二価特異性分子を、前記化合物を不活化する可能性がある酸の活性およびその他の天然の条件から保護するために、前記化合物を物質でコーティングしてもよい。

本願発明の薬学的化合物には、1つ以上の薬学的に許容な塩が含まれてもよい。「薬学的に許容な塩」には、本願発明の化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくないいかなる毒性作用をも与えない塩を意味する（たとえば、Berge,
S.M., et al.(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩、および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、およびホスホン酸などの無毒性無機酸、ならびに脂肪族モノ、およびジカルボン酸フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、および脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸から誘導されたものが含まれる。塩基性塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにN,N-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの無毒性有機アミンから誘導されたものが含まれる。

本願発明の薬学的組成物は、薬学的に許容な抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容な抗酸化剤の例には、(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、二硫化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファトコフェロールなど、(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などが含まれる。

本願発明の薬学的組成物に用いてよい好適な水性担体および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。

このような組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んでよい。微生物の存在の防御は、上述の滅菌手順、およびたとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの各種抗菌剤および抗真菌剤を含むことによって確保することができる。さらに、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射可能な剤形の吸収を持続させるために、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含んでもよい。

薬学的組成物には、滅菌水溶液、または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が含まれる。このような培地および物質を薬学的に活性な物質に使用することは、当業に知られている。任意の従来の培地または物質が前記活性化合物と不適合ではない限り、本願発明の薬学的組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も、当該組成物に組み込むことができる。

治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下において滅菌および安定でなければならない。前記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高濃度の薬物に好適なその他の規則的な構造として調合することができる。前記担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、ポリエチレングリコール、および液体状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油などを含む溶媒又は分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。多くの場合、たとえば糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物に含めることが望ましいだろう。注射可能な組成物の吸収を持続させるために、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませてもよい。

滅菌された注射可能な溶液は、適切な溶媒中に入れた必要量の前記活性化合物を、必要に応じて上述の成分1つまたはそれらの組み合わせに組み入れてから滅菌精密ろ過によって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上述の物質のうちの必要なその他の成分を含む滅菌担体に前記活性化合物を組み入れて調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前記活性成分の粉末に加えて予め滅菌ろ過されたその溶液から得られた任意の追加の望ましい成分を得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。

単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療の対象、および特定の治療形態によって変化するだろう。単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量であろう。一般に、100%のうち、この量は、薬学的に許容な担体と組み合わせた活性成分の約0.01 乃至約99%であって、好ましくは約0.1乃至約70%であって、最も好ましくは約1乃至約30%の範囲内であろう。

投与計画は、最適な望ましい応答（たとえば治療応答）を提供するように調整する。たとえば、1回のボーラス投与でもよく、投与量を数回に分割して長期間投与してもよく、または前記投与量を治療状況の必要性に比例して減少させてもよい。非経口組成物を、投与の簡便性と製剤の均一性のために投与単位剤形に調剤することは、特に有利である。本願明細書に用いられる投与単位剤形は、治療される対象に単位投与量として好適な物理的に分散した単位であって、必要な薬学的担体とともに望ましい治療効果を生じるように計算された、予め決められた量の活性化合物を含む各単位を意味する。本願発明の投与単位剤形の仕様は、(a)前記活性化合物に特有の性質および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(b)個体の治療用の当該活性化合物を調合する技術に固有の限界によって支配され、およびそれらに依存する。

前記抗体の投与のための投与量は体重1kgあたり約0.0001乃至100
mg、より典型的には0.01乃至25 mgの範囲内である。たとえば、投与量は、体重1kgあたり0.3 mg、体重1kgあたり1 mg、体重1kgあたり3 mg、体重1kgあたり5 mgまたは体重1kgあたり5 mg、体重1kgあたり12.5 mg、体重1kgあたり15 mg、体重1kgあたり20 mg、体重1kgあたり25 mg、または体重1kgあたり1乃至25 mgの範囲内であってよい。例示的な治療計画は、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月に1回、または3乃至6ヶ月に1回、前記抗体およびプロテアソーム阻害物質を同時に投与する必要がある。本願発明の抗CD30抗体の好ましい投与計画には、静脈内投与による体重1kgあたり1mg、または体重1kgあたり3mgが含まれ、前記抗体は以下の投与スケジュール、(i)4週間に6回、その後3ヶ月に1回、(ii)3週間に1回、(iii)体重1kgあたり3mg、その後3週間に1回、体重1kgあたり1mg、の1つを用いて投与する。

前記プロテアソーム阻害物質の投与のための投与量は宿主の体重1kgに対して約0.0001乃至100
mg、より典型的には0.01乃至25 mgの範囲内である。たとえば、投与量は、体重1kgあたり0.3 mg、体重1kgあたり1 mg、体重1kgあたり3 mg、体重1kgあたり5 mgまたは体重1kgあたり10 mg、体重1kgあたり12.5 mg、体重1kgあたり15 mg、体重1kgあたり20 mg、体重1kgあたり25 mg、または体重1kgあたり1乃至20 mgの範囲内であってよい。例示的な治療計画は、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月に1回、または3乃至6ヶ月に1回、投与する必要がある。本願発明の抗CD30プロテアソーム阻害物質の好ましい投与計画には、静脈内投与による体重1kgあたり1mg、または体重1kgあたり3mgが含まれ、前記プロテアソーム阻害物質は以下の投与スケジュール、(i)4週間に6回、その後3ヶ月に1回、(ii)3週間に1回、(iii)体重1kgあたり3mg、その後3週間に1回、体重1kgあたり1mg、の1つを用いて投与する。

一部の方法では、異なる結合特異性を有するモノクローナル抗体2つ以上を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の投与量は指示された範囲内である。抗体は通常、複数の機会に投与される。1回ずつの投与の間隔は、たとえば1週間、1ヶ月、3ヶ月、または1年であってよい。間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の血中濃度の測定によって示されるとおりに不規則であってもよい。ある方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約1乃至1000μg/ml、および一部の方法では約25乃至300μg/mlになるように調節する。

代替的には、抗体およびプロテアソーム阻害物質は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、投与回数が少なくてすむ。用量および頻度は患者の体内における前記抗体の半減期により変化する。一般に、半減期の長さは、ヒト抗体が最長で、それに次いでヒト抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体の順である。投与用量および頻度は、処置が予防かまたは治療かによって変化してよい。予防の用途では、比較的低用量を、長期間、比較的少ない回数で投与する。一部の患者は、一生、処置を受け続ける。治療の用途には、疾患の進行が低下または終了するまで、好ましくは患者の疾患の症状が部分的または完全に緩和を示すまで、比較的高い用量を比較的短い間隔で投与する必要がある場合もある。その後、患者は、予防のために投与されてよい。

本願発明の薬学的組成物の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与形態に望ましい治療応答を達成するために有効でありながら、その患者に有毒ではないような活性成分量を得られるように、変化させてよい。選択された用量レベルは、本願発明に用いられる特定の組成物またはそのエステル、塩、もしくはアミド、投与経路、投与時間、使用された特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、特定の組成物とともに用いたそのほかの薬物、化合物、および／または物質、治療対象患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態、および既往歴を含む各種要因、ならびに医療関連業者に公知の同様の各種薬物動態学的要因に依存するだろう。

本願発明に用いられるCD30抗体およびプロテアソーム阻害物質の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の症状がない期間の回数および期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害または身体障害の予防を生じる。たとえば、CD30陽性腫瘍の処置のため、「治療上有効な投与量」は、細胞成長または腫瘍成長を、未処置被験体と比較して、好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、およびさらに好ましくは少なくとも約80%阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、たとえば後述の実施例に記述される、ヒト腫瘍における効果を予測できる動物モデル系において評価することができる。代替的には、組成物のこの特性は、当業者に知られるアッセイによって、前記化合物の、in vitroにおける阻害などの阻害の能力を調べることによって評価することができる。そのようなアッセイは、たとえばXTTアッセイ、報告遺伝子アッセイ、TUNELアッセイ、アネキシンなど、後述の実施例に記載する。治療上有効な量の治療用化合物は、腫瘍サイズを縮小するか、または被験体の症状を緩和することができる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重症度、選択された組成物または投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるだろう。

本願発明の組成物は、当業に知られる各種方法のうち1つ以上を用いて1つ以上の投与経路で投与することができる。当業者には理解されるであろうとおり、投与経路および／または形態は、望まれる結果によって変化するだろう。本願発明の抗体の好ましい投与経路には、たとえば注射または輸液による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、またはその他の非経口投与経路が含まれる。本願明細書に記載の「非経口投与」という文言は、経腸および局所投与をのぞく投与形態で通常は注射による投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、眼窩内、嚢内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜内、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内注射および輸液が、それらに限定されずに含まれる。

代替的には、本願発明の抗体は、局所、表皮、または粘膜の投与経路など、たとえば経鼻、経口、経膣、直腸、舌下、または局所的な非非経口投与経路によって投与することもできる。

前記活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む、制御放出製剤などの、急速な放出から前記化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する多くの方法は、特許化されているか、または一般に当業者に知られている。たとえばSustained
and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1978を参照。

治療用組成物は当業に知られる医療用装置で投与することができる。たとえば、好ましい実施態様では、本願発明の治療用組成物は、米国特許第5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、または4,596,556号に開示される装置など、無針皮下注射装置で投与することができる。本願発明に有用な公知の移植物およびモジュールの例には、制御された速度で医薬品を投与する移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号、皮膚を介して医薬品を投与する治療用装置を開示する米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で医薬品を送達するための医療用注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号、連続的な薬物送達用の移植可能な流速可変注入装置を開示する米国特許第4,447,224号、マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号、および浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,475,196号が含まれる。これらの特許は本願明細書に引用により援用される。その他のそのような移植物、送達システムおよびモジュールは、当業者にたくさん知られている。

ある実施態様では、本願発明のヒトモノクローナル抗体は、in
vivoにおいて確実に適切な分布となるように調合することができる。たとえば、血液脳関門（BBB）は、疎水性が高い化合物の多くを排除する。本願発明の治療用化合物が確実にBBBを通過するために（望ましい場合）、前記化合物をたとえばリポソーム中に調製することができる。リポソームを製造する方法は、たとえば、米国特許第4,522,811、5,374,548、および5,399,331号を参照。前記リポソームは、特異的な細胞または組織に選択的に輸送して、標的薬物送達を促進する1つ以上の部分を含んでよい（たとえば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的な標的部分には、葉酸塩またはビオチン（たとえば、Low et al.の米国特許第5,416,016号）、マンノシド（Umezawa et
al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et
al.(1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al.(1995) Antimicrob.Agents
Chemother.39:180）、表面タンパク質Aレセプタ（Briscoe et al.(1995)
Am. J. Physiol. 1233:134）、p120（Schreier et al.(1994)
J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる。さらに、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123;
J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。

本願発明の組成物は、当業に知られる各種方法によって投与することができる。当業者には理解されるであろうとおり、投与経路および／または形態は、望まれる結果によって変化するだろう。前記活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む、制御放出製剤などの、急速な放出から前記化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する多くの方法は、特許化されているか、または一般に当業者に知られている。たとえばSustained
and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1978を参照。

特定の投与経路によって本願発明の化合物を投与するために、不活性化を防ぐ物質で前記化合物をコーティングするか、またはそのような物質を前記化合物と同時投与する必要があるかもしれない。たとえば、前記化合物は、たとえばリポソームまたは希釈剤などの適切な担体に入れて、被験体に投与することもできる。薬学的に許容な希釈剤には、食塩水、およびバッファ水溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水CGFエマルション、および従来のリポソームが含まれる（Strejan et
al.(1984) J. Neuroimmunol. 7:27）。

薬学的組成物には、滅菌水溶液、または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調整用滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質へのそのような媒質および物質の使用は、当業に知られる。任意の従来の媒質または作用物質が活性化合物と適合性がない場合以外は、本願発明の薬学的組成物へのそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も、前記組成物に組み込むことができる。

治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下において滅菌および安定でなければならない。前記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高濃度の薬物に好適なその他の規則的な構造として調合することができる。前記担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、ポリエチレングリコール、および液体状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油などを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。多くの場合、たとえば糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を前記化合物に含めることが望ましいだろう。注射可能な組成物の吸収を持続させるために、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませてもよい。

薬学的に許容な抗酸化剤の例には、(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、二硫化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファトコフェロールなど、(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などが含まれる。

治療用組成剤用の本願発明の製剤には、経口、経鼻、局所（口内および舌下）、直腸内、経膣および／又は非経口投与に好適なものが含まれる。当該製剤は、便利のいいように単回投与剤形になっていてよく、薬学の当業に知られる任意の方法で調製されてよい。単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療対象の対象、および特定の治療形態によって変化するだろう。単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量であろう。一般に、100%のうち、この量は活性成分の約0.01
乃至約99%であって、好ましくは約0.1乃至約70%であって、最も好ましくは約1乃至約30%の範囲内であろう。

本願明細書に記載の「非経口投与」および「非経口に投与した」という文言は、経腸および局所投与をのぞく投与形態で通常は注射による投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、眼窩内、嚢内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜内、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸液が、それらに限定されずに含まれる。

前記抗体およびプロテアソーム阻害物質組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んでよい。微生物の存在の防御は、上述の滅菌手順、およびたとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの各種抗菌剤および抗真菌剤を含むことによって確保することができる。さらに、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射可能な剤形の吸収を持続させるために、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含んでもよい。

本願発明の化合物を医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、そのまま投与してもよく、たとえば0.01乃至99.5% (より好ましくは0.1 乃至90%)の活性成分を薬学的に許容な担体と合わせて含有する薬学的な組成物として投与してもよい。

選択された投与経路にかかわらず、好適な水和状で用いることもできる本願発明の化合物、および／または本願発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容の剤形に調製される。

当業の医師または獣医師は、有効量の所要の薬学的組成物を容易に決定し処方することができる。たとえば、医師または獣医師は、望ましい治療上の効果を達成するために、薬学的組成物に用いられる本願発明の組成物の投与量を所要レベルよりも少量から開始し、望ましい効果が得られるまで投与量を徐々に増加させることができる。一般に、本願発明の組成物の好適な一日投与量は、治療上の効果を生ずるために有効な最低投与量である化合物の量であろう。このように有効な投与量は、一般に、上述の要因に依存するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的の部位の近くに投与する。望ましくは、当該治療用組成物の有効な一日投与量を、一日に適切な間隔をおいて2、3、4、5、または6回以上のサブ投与量に分けて、選択的に単回投与剤形で投与することもできる。本願発明の化合物は単体で投与することも可能であるが、当該化合物は薬学的製剤（組成物）として投与することが好ましい。

ある実施態様では、本願発明のヒトモノクローナル抗体は、in
vivoにおいて確実に適切な分布となるように調合することができる。たとえば、血液脳関門（BBB）は、疎水性の高い化合物の多くを排除する。本願発明の治療用化合物が確実にBBBを通過するために（望ましい場合）、前記化合物をたとえばリポソーム中に調製することができる。リポソームを製造する方法は、たとえば、米国特許第4,522,811、5,374,548、および5,399,331号を参照。前記リポソームは、特異的な細胞または組織に選択的に輸送して、標的薬物送達を促進する1つ以上の部分を含んでよい（たとえば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的な標的部分には、葉酸塩またはビオチン（たとえば、Low et al.の米国特許第5,416,016号）、マンノシド（Umezawa
et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et
al.(1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al.(1995) Antimicrob.Agents
Chemother.39:180）、表面タンパク質Aレセプタ（Briscoe et al.(1995)
Am. J. Physiol. 1233:134）、本願発明の製剤を含んでよいさまざまな種、および本願発明の分子の成分、p120（Schreier et
al.(1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる。さらに、also K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123;
J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。本願発明のある実施態様では、本願発明の治療用化合物はリポソーム中に調合され、より好ましい実施態様では、前記リポソームには標的部分が含まれる。最も好ましい実施態様では、前記リポソーム中の治療用化合物は、たとえば炎症または感染部位、または腫瘍部位など、望ましい領域に近い部位にボーラス注射することによって送達する。前記組成物は、注射容器への充填が容易な程度、流動的でなければならない。前記組成物は、製造および保存の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

「治療上有効な投与量」は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を、未処置被験体と比較して、好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、およびさらに好ましくは少なくとも約80%阻害する。化合物の癌を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効果を予測できる動物モデル系において評価することができる。代替的には、組成物のこの特性は、当業者に知られるアッセイによって、前記化合物の、in vitroにおける阻害などの阻害の能力を調べることによって評価することができる。治療上有効な量の治療用化合物は、腫瘍サイズを縮小するか、または被験体の症状を緩和することができる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重症度、および選択された組成物または投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるだろう。

前記組成物は、注射器で送達できる程度、滅菌されており流動的でなければならない。水に加えて、前記担体は、たとえば等張性緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、ポリエチレングリコール、および液体状ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物であってよい。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。多くの場合、たとえば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムなどの等張剤を前記化合物に含めることが望ましい。注射可能な組成物の吸収を持続させるために、たとえばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませてもよい。

上述のとおり前記活性化合物が好適に保護される場合、前記化合物はたとえば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体とともに経口投与することもできる。

たとえば、本願発明のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、たとえばホジキン病、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、成人T細胞リンパ腫（ATL）、血管免疫芽球性リンパ節症（AILD）様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔性リンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化腫瘍（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、およびその他のT細胞またはB細胞リンパ腫などを含む、CD30を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる疾患などの、発癌性疾患の被験者を処置するために用いることができる。本願発明のヒト抗体、抗体組成物および方法は、たとえば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブス（バセドウ）病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核症、HIVおよびヘルペスウイルス関連疾患を含む自己免疫性疾患などの、その他の疾患を有する被験体を処置するために利用することもできる。

ある実施例では、本願発明の方法は、各種のCD30関連疾患を処置、予防、または診断するために、in
vivoにおいて用いられる。D30関連疾患の例には、とりわけ、癌、たとえばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、成人T細胞リンパ腫（ATL）、血管免疫芽球性リンパ節症（AILD）様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔性リンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化腫瘍（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、およびその他のT細胞またはB細胞リンパ腫などが含まれる。その他のCD30媒介疾患には、とりわけ、自己免疫性疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブス（バセドウ）病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核症、HIVおよびヘルペスウイルス関連疾患などが含まれる。

ある実施態様では、前記抗体はCD30がホジキン病（HD）とその他の発癌性疾患の進行に果たす役割を制限するため、本願発明の方法はHDを処置または予防するために用いられる。ホジキン病はリンパ腫の1種である。リンパ腫は、体内の免疫系の部分であるリンパ系に生じる癌である。リンパ組織は体内の多くの部分にあるため、HDはからだのほぼどの部分にも発生しうる。癌は、肝臓、骨髄（体の大きな骨の中にあるスポンジ状組織で血液細胞をつくる）、および脾臓を含む、体内のほとんどどの器官または組織にも広がりうる。ホジキン病細胞およびリード-スターンバーグ細胞中の高いCD30発現は、HDの鑑別診断と相関があると報告されている。したがって、CD30阻害抗体をプロテアソーム阻害物質と組み合わせて、HDを笑見るCD30の作用を予防または遮断することができ、したがって、この疾患を予防または処置することができる。

ヒト抗体（たとえばヒトモノクローナル抗体、多特異性および二特異性分子）をプロテアソーム阻害物質と合わせて用い、CD30のその他の作用を遮断または阻害することもできる。たとえば、CD30も各種の非ホジキンリンパ腫亜種によって定期的に発現されることが知られている。したがって、本願発明の方法のさらに別の用途には、非ホジキンリンパ腫に関与する疾患の予防または処置が含まれる。これらの疾患には、バーキットリンパ種、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、皮膚T細胞リンパ腫、結節性核切れ込み小細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）、成人T細胞白血病（T-ALL）、および胚中心細胞／中心細胞（cb/cc）濾胞性リンパ腫癌が含まれる。

別の実施態様では、本願発明の方法は、CD30のさらにその他の作用を遮断または阻害するために用いることができる。たとえば、可溶性CD30はCD30発現細胞の表面から定期的に遊離されることが知られている。各種の発癌性および自己免疫性疾患を有する患者の血清で、高sCD30値が報告されている。したがって、抗CD30抗体とプロテアソーム阻害物質を組み合わせたさらに別の用途には、sCD30の遊離の遮断または阻害に関与する疾患の予防または処置が含まれる。そのような疾患には、自己免疫性疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブス（バセドウ）病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群が、それらに限定されずに含まれる。

In
vivoおよびin
vitroにおける本願発明の方法の抗体およびプロテアソーム阻害物質薬学的組成物の好適な投与経路は、当業に公知であり、当業者は選択することができる。たとえば、前記抗体組成物は注射（たとえば、静脈内または皮下）によって投与することができる。使用される分子の好適な用量は、対象の年齢および体重、ならびに前記抗体組成物の濃度および／または剤形によって変化するだろう。

上述のとおり、本願発明に用いられるヒト抗CD30抗体およびプロテアソーム阻害物質は、たとえば細胞毒性剤、放射能毒性剤、または免疫抑制剤などの、1つ以上の治療剤と併用投与することができる。前記抗体は前記薬剤（免疫複合体としての）と結合させることができ、または前記薬剤から分離して投与することもできる。後述の場合（分離投与）、前記抗体は前記薬剤の前後、または同時に投与することができ、またはたとえば放射能などの抗癌療法などのその他の既知の療法と併用してもよい。そのような治療剤には、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの、それ自体は患者に対して有毒または亜毒性であるレベルでのみ有効である、抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは4週間に1回、投与量100mg/m²を静脈内投与し、アドリアマイシンは21日に1回、60乃至75mg/m²を静脈内投与する。他の化学療法剤との併用投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果が得られるさまざまな機序によって働く2種類の抗癌剤を提供する。そのような併用投与は、前記抗体に対する反応性をなくすような、薬剤耐性の発生または抗癌性の変化のせいで生じる問題を解決できる。

本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多特異性および二特異性分子）に結合したエフェクタ細胞などの、標的特異的エフェクタ細胞も治療剤として用いることができる。標的用のエフェクタ細胞はマクロファージ、好中球、または単球であってよい。その他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞、およびその他のIgGまたはIgAレセプタを有する細胞が含まれる。望ましい場合には、エフェクタ細胞は処置される被験体から得ることができる。標的特異性エフェクタ細胞は、生理学的に許容な溶液に入れた細胞懸濁液として投与することができる。投与された細胞の数は、約10⁸乃至10⁹であってよく、治療目的によって変化するだろう。一般に、前記の量は、たとえばCD30発現腫瘍細胞などの標的細胞に局在化し、たとえば貪食作用などによって細胞を死滅させるのに十分だろう。投与経路も変化させることができる。

標的特異性エフェクタ細胞による治療は、標的となった細胞を除去するためのその他の技術を併用して行うことができる。たとえば、本願発明の組成物および／またはこれらの組成物を備えたエフェクタ細胞を用いた抗腫瘍療法は、化学療法と併用することができる。さらに、併用免疫療法を用いて、2つの異なる細胞毒性エフェクタ群を腫瘍細胞の拒絶に方向付けることもできる。たとえば、抗FcγRIまたは抗CD3に結合した抗CD30抗体は、IgGまたはIgAレセプタ特異性結合物質を併用することができる。

本願発明の二特異性および多特異性分子を用いて、細胞表面のレセプタをキャップして排除することなどによって、エフェクタ細胞上のFcγRまたはFcαRレベルを調節することもできる。抗Fcレセプタの混合物もこの目的に用いることができる。

本願発明に用いられる抗体およびプロテアソーム阻害物質薬学的組成物は、相補体に結合するIgG1、2、もしくは3、またはIgMの部分など、相補体に結合する部位を有するので、相補体の存在下においても用いることができる。ある実施態様では、標的細胞を含む細胞群を本願発明の結合剤および適切なエフェクタ細胞でex
vivoにおいて処理する際に、補体または補体を含有する血清を添加することができる。本願発明の結合剤でコーティングした標的細胞の貪食作用は、相補体タンパク質の結合によって促進させることができる。別の実施態様では、本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多特異性および二特異性分子）でコーティングした標的細胞は、補体によって溶解することもできる。さらに別の実施態様では、本願発明の組成物は活性補体である。

本願発明の組成物（たとえばヒト抗体、多特異性および二特異性分子）は、補体とともに投与することもできる。したがって、ヒト抗体、多特異性または二特異性分子、および血清または補体を含む組成物は本願発明の範囲内である。これらの組成物は、前記補体がヒト抗体、多特異性または二特異性分子の近隣に位置する場合に有用である。代替的には、本願発明のヒト抗体、多特異性または二特異性分子、および前記補体または血清は別々に投与することができる。

したがって、本願発明の抗体およびプロテアソーム阻害物質で処置された患者は、前記ヒト抗体の治療効果を促進または増強する、細胞毒性剤または放射能毒性剤など、別の治療剤をさらに（本願発明のヒト抗体を投与する前後、または同時に）投与することができる。

他の実施態様では、前記被験体は、たとえばサイトカインで前記被験体を処置するなど、FcγまあはFcαレセプタの発現または活性を、たとえば促進または阻害するなど、調節する物質でさらに処置することができる。多特異性分子での処置の際に投与するための好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンγ（IFN-g）、および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。

別の実施態様では、前記被験体はリンホカイン調製物でさらに処置することができる。CD30を高度に発現しない癌細胞にリンホカイン調製物を用いると、発現を誘導することができる。リンホカイン調製物は、腫瘍の細胞の中でCD30をより均一な発現を生じ、より効果的な治療を生じることができる。投与に好適なリンホカイン調製物には、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子、およびそれらの組み合わせが含まれる。これらは静脈内投与することができる。リンホカインの好適な投与量は、10,000乃至1,000,000単位／患者である。

本願発明に用いられる抗体およびプロテアソーム阻害物質組成物は、たとえばそのような細胞を標識するためなど、RcγRまたはCD30を発現する細胞を狙うために使用することもできる。そのような用途の場合、前記結合剤を検出できる分子に結合することができる。したがって、本願発明は、たとえばFcγRまたはCD30など、Fcレセプタを発現する細胞をex vivoまたはin vitroにおいて局在化する方法を提供する。検出可能な標識は、たとえば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子であってよい。

他の実施態様では、本願発明は、たとえばホジキン病、成人T細胞リンパ腫、感染性単核症、および全身性エリテマトーデスなどの、CD30が媒介する被験体における疾患を、上述のヒト抗体を前記被験体に投与することによって処置する方法を提供する。そのような抗体およびその誘導体を用いて、たとえば増殖および分化など、特定の疾患に関連する、CD30が誘導する活性を阻害する。本願発明の抗体によって阻害することができるその他のCD30が誘導する活性には、sCD30の産生の増加、IL-4の発現の増加、およびTh2表現型の産生の増加が含まれる。前記抗体をCD30に接触させることによって（たとえば前記抗体を被験体に投与することによって）、CD30がそのような活性を誘導する能力が阻害され、関連疾患が治療される。好ましい抗体は、CD30に特異的なエピトープに結合し、CD30が誘導した活性を有利に阻害するが、NGFR、CD27およびCD40などの康応的に関連する表面抗原の活性を阻害しない。

したがって、別の実施態様では、本願発明は、たとえばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、成人T細胞リンパ腫（ATL）、血管免疫芽球性リンパ節症（AILD）様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔性リンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化腫瘍（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、およびその他のT細胞またはB細胞リンパ腫など、ヒトCD30によって媒介される発癌性疾患を処置または予防する方法を提供する。この方法は、本願発明の抗体組成物を、前記疾患を処置または予防するのに有効な量、被験体に投与するステップに関連する。前記抗体組成物は、単体で、または、抗体組成物と併せて、または相乗的にCD30媒介疾患を処置または予防するように作用する細胞毒性または放射能毒性物質など、別の治療用物質とともに投与することができる。特に好ましい実施態様では、本願発明はホジキン病を治療する方法を提供する。さらに別の好ましい実施態様では、本願発明はALCLを治療する方法を提供する。

別の実施態様では、本願発明は、たとえば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブス（バセドウ）病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核症、HIVおよびヘルペスウイルス関連疾患など、ヒトCD30によって媒介される自己免疫性疾患を治療または予防する方法を提供する。前記方法は、本願発明の抗体組およびプロテアソーム阻害物質組成物を、前記疾患を処置または予防するのに有効な量、被験体に投与するステップに関連する。前記組成物は、単体で、または、抗体組成物と併せてまたは相乗的にCD30媒介疾患を処置または予防するように作用する免疫抑制剤など、別の治療用物質とともに投与することができる。

さらに別の実施態様では、本願発明の免疫複合体は、前記抗体に結合することによってCD30がその表面に結合した（たとえば膜に結合した、またはC30レセプタに結合した）化合物（たとえば治療物質、標識、細胞毒、放射能毒、免疫抑制剤など）を標的とするプロテアソーム阻害物質として用いることができるしたがって、前記発明は、（たとえば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子などの検出可能な標識を有する）ホジキン細胞またはリード-スターンバーグ細胞などのCD30発現細胞およびCD30レセプタをex vivoまたはin
vitroで局在化させる方法も提供する。代替的には、前記免疫複合体を用いて、CD30への細胞毒素または放射能毒を標的とすることによって、CD30が表面に結合している細胞を死滅させることができる。

本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明をさらに制限するものと解釈されてはならない。

ヒト抗CD30抗体は、NF-κBを活性化させ、リンパ腫細胞にプロテアソーム阻害物質誘導アポトーシスに対する感受性を持たせる。

5F11は、in
vitroおよびin vivoのいずれもにおいて、CD30発現リンパ腫細胞株の成長停止または死滅の誘導に効果があると示された、CD30に対する完全ヒトモノクローナル抗体である。しかし、一部の細胞株は、5F11誘導アポトーシスに対する部分的または完全な抵抗性を示すことが明らかになった。本実施例では、5F11と抗腫瘍活性を有するプロテアソーム阻害物質であるボルテゾミブの組み合わせの有効性を試験した。XTT生存能力テスト、TUNELアッセイおよびFACS解析を用いて、ホジキン細胞株（L540、L428）およびCD30ALCLカーパス299を発現するCD30に対する5F11とボルテゾミブの細胞毒性の相乗作用を調べた。さらに、SCIDマウスにおける皮下L540由来ヒトホジキン腫瘍の成長を、5F11とボルテゾミブの併用によって阻害しが、それぞれの作用物質単体の作用を合わせたところ有効性が小さかった。in vitroにおいて認められた5F11およびボルテゾミブの相乗性は、使用された計画によって変化し、この2種類を同時に加える場合、または前記細胞を5F11と最初に予めインキュベートした場合のみ、認められる。

材料および方法
細胞株
ホジキン由来細胞株（L540およびL428）、未分化大細胞リンパ腫由来カルパス299およびCD30陰性球性リンパ性白血病由来細胞株REHは、German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures (DMSZ)から入手した。このことについてはすでに記述されている。すべての細胞を、熱不活性ウシ胎仔血清（FCS）、50μg/mlストレプトマイシン、50μg/mlペニシリン、および2mM Lグルタミンを添加したRPMI-1640培地で、5% CO₂の環境下で37℃で培養した。培地を1週間に2回、およびアッセイを行う24時間前に交換した。アッセイは、FCSおよび無抗生物質培地（単純培地）において行われた。

抗体、試薬、およびプラスミド
抗CD30抗体5F11は、Medarex Inc.社（ニュージャージー州ブルームズベリー）の好意により提供された。ヤギ抗ヒトFc抗体（GaH）は、米国Dianova/Jackson社から購入した。プロテアソーム阻害物質MG-132は、カリフォルニア州Calbiochem社から、およびボルテゾミブ（ベルケード）はマサチューセッツ州Millennium社から購入した。

ウサギ抗p65-IgGおよびFITC標識マウス抗ウサギIgGは、米国サンタクルズから入手した。NF-κB活性を測定するための発現ベクタおよびレポータ構成物（NF-κB-luc,
IkBaM）は、カリフォルニア州のBD Biosciences Clontech社（マーキュリーベクターセット）から得た。

XTTアッセイ
2x10⁴個の細胞を、96穴マイクロタイタープレート（組織培養級平底）の各ウエルでインキュベートした細胞は、37℃で5μg/ml 抗CD30抗体5F11および25μg/mlの架橋抗体ヤギ抗ヒト（GaH）で予めインキュベートした。30分間のインキュベート後、ボルテゾミブを前記濃縮液に、1ウエルにつき合計容量が最高200μlになるように加え、細胞を48時間、37℃でインキュベートした。各測定は3回繰り返した。インキュベーション時間および対照ウエルの濃度（各抗体は単体および組み合わせ、5F11欠如下におけるボルテゾミブ）は上述のとおりだった。

細胞の生存能力を測定するために、細胞を、1.49 mM XTTおよび0.025mMフェナジン-エトスルフェートを含有する新鮮単純培地に加え、ELISAリーダで450nmと650nmの吸光度を測定して比較した（Bio-Tek社、米バーモント州ウィヌースキ）。未処理対照培地と比較したテトラゾリウムカルボキサリニドのターンオーバを50%減少させるために必要な濃度（IC₅₀）を計算した。

一過性形質移入およびルシフェラーゼレポータ遺伝子アッセイ
1 ml の培地中に入れた5x10⁶ 個のL428細胞を、10μgのNF-κB-luc、IkBaM
およびCMV-GFPを用いた電気穿孔法によって一過性で形質移入する。細胞を、2mlの単純培地をさらに加えた6穴プレートに播種する。37℃で24時間インキュベーションした後、GFP形質移入細胞を、形質移入の効率を示す緑色蛍光について調べた。この効率は5%乃至10%の間で変化した。細胞を、20μg/ml 5F11＋100μg/ml
GaHで2時間、または10 ng/ml ボルテゾミブもしくはその両方もしくは単純培地で12時間のいずれかの条件において、37℃でインキュベートした。

1mlの氷冷レポータ溶解バッファ（プロメガ社）を用いて溶解を行い、ライセートを-70℃で1時間凍結させた。ルシフェラーゼの活性を、30μlのライセートを用いて96穴ルミノメトリプレートで測定し、ルミノメトリで解析した。レポータ遺伝子を形質移入した未処理細胞を用いて、NF-κB活性のベースラインを得た。すべてのアッセイは3回繰り返し、平均と標準偏差を求めた。

TUNELアッセイおよび間接的免疫蛍光法によるNF-κBの検出
サイトスピンを提供して（1000U/分で1分）、L428およびL540細胞における、5F11および／またはボルテゾミブがアポトーシスおよびNFκB活性に与える細胞レベルでの作用を決定した。2x10⁵ 個の細胞を、6穴マイクロタイタープレートの、3ml単純培地（対照）または5F11+GaH
(5μg/25μg/ml) もしくはボルテゾミブ（10nM）もしくはその両方の中に播種した。インキュベーション時間は、5F11については30分、架橋GaHでは1時間、およびボルテゾミブについては最低6時間で、すべて37℃だった。スライドを室温で1晩乾燥させ、氷冷アセトンで固定した（30秒インキュベーション）。TUNELアッセイを、In Situ
Cell Death Detection Kit、TMR red （ロシュ社）を用いて、製造者の指示に従って行った。最後に、細胞を、VECTASHIELD
DAPI含有封入剤（ベクターラボラトリズ社、カリフォルニア州、バーリンゲーム）で封入するか、またはウサギ抗p65抗体（サンタクルズ、10nM）および2次FITC標識マウス抗ウサギ抗体（10nM）で染色した。サイトスピン調製物を蛍光顕微法によって分析した。

非特異的抗体結合を排除するために、未処理細胞のスライドを、ウサギ抗p65-IgG、またはFITC複合マウス抗ウサギIgG、またはDAPIのいずれかで染色した。

アネキシンV結合アッセイ
2x10⁵個のL540細胞を、5F11/GaH、ボルテゾミブ、もしくは両方のいずれかで、または上述の単純培地中で、37℃で12時間インキュベートした（3回繰り返し）。アポトーシス細胞を検出するために、血漿膜の外葉へのホスファチジルセリンの移動を、フルオレセインに結合させたアネキシンVで推奨通り染色したあと、フローサイトメトリ（FACS内径Bengton &
Dickinson フローサイトメトリ）で測定した3回繰り返して平均と標準偏差を計算した。

SDS-PAGE
およびウエスタンブロット法
全細胞タンパク質抽出物を1倍のLaemmli
溶液（10μg）に入れて調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いて、4乃至15%ゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し（Hybond-C、アマシャム・ファーマシア・バイオテク社、独フライブルグ）、Roti-Block （Roth社、独カルルスルーエ）で室温で1時間ブロックした。免疫ブロットを、10%ウシ胎仔血清を添加したPBSに入れたApoptosis
Sampler Kits I and II (BD バイオサイエンス社、カリフォルニア州) から得た1次抗体でインキュベートした。c-フリップ特異性抗体をシグマ社から購入した（F-6550）。結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ2次ロバ抗マウスまたはウサギIgG
mAb（ディアノバ社、独ハンブルグ）、または西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスIgG（ディアノバ社）を1/10000に希釈したもので検出した。タンパク質を、ECLウェスタンブロット検出試薬を用いて、製造者の指示に従って可視化した。

電気泳動移動度シフトアッセイ
電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を、NF-κBのDNAへの結合を可視化するために行った。さまざまな抗体で処理した細胞の核タンパク質抽出物（5 μgの20 mM HEPES、pH
7.9、400 mM NaCl、1mM EDTA、1mM
EGTA）をNF-κB結合配列（サンタクルズ）を有する³²P標識オリゴヌクレオチドで、室温で30分間インキュベートした。DNA/タンパク質複合体を、6%未変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動を用いて分離した。

ヒトHDの異種移植モデル
ヒトHDの異種移植モデルはすでに記述されている（17）。皮下充実性L540Cy腫瘍を、200μL
PBSに再懸濁させたL540Cy細胞（1 x 10⁷個）を病原体をもたない重症複合免疫不全症（SCID）マウスの右側に注射して確立した。腫瘍の発生は3日に1回に測定し、腫瘍の容量は公式（長さx幅x高さ/2）で決定した。約100mm³の確立した腫瘍を有する動物を4グループに無作為に分けた。それらは100μgの5F11（200μL PBSに入れて腹腔内投与）、および6時間後に10ngボルテゾミブを尾部静脈から静脈内投与、または各薬剤単体で合計4回注射で投与した。対照マウスはPBSのみを投与された。対照群の腫瘍直径の中間直が2500mm3（50日目）を超えた場合に、実験を停止してマウスを屠殺した。治療群および対照群はそれぞれ4匹からなり、実験を繰り返して結果を確認した。

結果
5F11抗体およびボルテゾミブの併用はHDおよびALCL由来細胞株に対する細胞毒性を高める
1細胞レベルの部分的アポトーシス耐性HD由来細胞株L540における5F11への細胞応答を解析した。5F11の結合とアポトーシスを同時に可視化するために、TUNELアッセイを行う前に、L540細胞を5F11およびFITC標識架橋ヤギ抗ヒト抗体でインキュベートした。すべてのL540細胞を、5F11およびGaH-FITCでインキュベーションしてから染色したところ、細胞群全体がCD30陽性であることが示唆された。これらの細胞を用いたTUNELアッセイの結果、同程度のレベルの5F11に結合したすべての細胞がアポトーシスを生じたが、細胞のサブセットはそうならないことが明らかになった。これらのデータは、5F11によるCD30刺激へのL540のディファレンシャルな応答は、1細胞種においても、下流シグナル伝達分子の異種性発現による可能性があると示唆している。ホジキン細胞に発現されることが知られている1つの候補因子が、腫瘍細胞をアポトーシスから保護する転写因子NF-κBである。

L540細胞において5F11がNF-κB活性を誘導し、その細胞にアポトーシスに対する抵抗性を付与するとすると、NF-κBを阻害すればアポトーシス率は上がるはずである。そこで、細胞に、NF-κBリプレッサIkBの分解を阻害することで知られるプロテアソーム阻害物質MG132を、5F11/GaHとともに接触させた。5F11とMG132の併用によって、ほとんどの細胞にアポトーシスを誘導したが、それぞれの物質は亜毒性の濃度で用いた。アポトーシス率はアネキシンV染色およびFACS分析によって定量化した。前記抗体またはMG132単体では、アポトーシスは対照と比較して増加しなかったが、併用した場合のアポトーシス率は約60%だった。これらをもとに、前記データは、5F11媒介CD30架橋とボルテゾミブの、アポトーシス誘導への相乗効果を実証している（図M-1G参照）。

5F11および婦と手亜ソーム阻害物質の細胞毒性は、さまざまな細胞株についてのXTT生存可能性アッセイによって決定した。しかし、プロテアソーム阻害物質ボルテゾミブを使用した実験から、MG132を用いて類似の結果が得られたことが示されている（データ非表示）。試験した各細胞株では、ボルテゾミブと5F11を併用すると明らかに細胞の生存能力が低下した。生存能力の低下を最小限にとどめるボルテゾミブの濃度（25 ng/ml）では、L540細胞は、5F11を亜毒性濃度で予め処理した場合、完全に死滅した。さらに高い濃度でも5F11に抵抗性を示すカーパス299細胞およびL428細胞についても同様の結果が得られた（17）。5F11による事前のインキュベーションが相乗性に必要かどうかを調べるために、処理の順序を、L428を最初にボルテゾミブで30分間インキュベーションした後で前記抗体でインキュベーションするように変更した。図2に示すとおり、この設定はボルテゾミブの細胞毒性を上げなかった。したがって、5F11結合によって誘導されたCD30シグナル伝達は、HD由来細胞株に対するボルテゾミブの細胞毒性を劇的に上昇させるために重要かもしれない。

細胞毒性の相乗性がCD30に特異的であるかどうかを証明するために、CD30を発現しない急性リンパ球性白血病細胞株REHでXTTアッセイを行った。REH細胞もボルテゾミブによって用量依存的に死滅したが、5F11による事前のインキュベーションはその細胞毒性には影響を与えなかった（図2E）。

ヒトホジキンモデルにおける5F11およびボルテゾミブの組み合わせのin
vivo活性
充実性皮下L540Cyホジキン腫瘍モデルにおけるボルテゾミブと5F11の組み合わせの活性も分析した。腫瘍をもつマウスに5F11、ボルテゾミブ、5F11とボルテゾミブの組み合わせ、またはPBSのいずれかを投与した。そのマウスに、最初5F11を注射し、それから6時間後、ボルテゾミブを投与して、この処置を4日に1回繰り返した（q x 日数 x
4）。図3に示すように、5F11とボルテゾミブは、PBSを投与された対照群と比較して、腫瘍成長の有意な遅れを誘発した。5F11とボルテゾミブの組み合わせで処理した動物では、さらに有望な結果が得られ、腫瘍はほぼ完全に阻害された。最も重要なのは、成長の阻害が処理後7週間持続したのに対し、5F11またはボルテゾミブのいずれかの単体を投与されたマウスの腫瘍は進行が認められた。指示通りに処理したL540腫瘍をもつマウスに由来する腫瘍の断片をヘマトキシリンで染色した。その組織の中の腫瘍細胞の密度は、5F11とボルテゾミブを組み合わせて投与したあと、劇的に減少した。処理から6週間後のL540の組織学検査では、5F11とボルテゾミブの組み合わせで処理されたマウスに由来する腫瘍組織の中に、腫瘍のない領域が認められる。

5F11依存CD30シグナル伝達が活性化するNF-κB
F-κBサブユニットp65を、メタノールで固定した未処理L540細胞の抗p65mabおよび2次FITC標識抗体を用いて検出した。NF-κBの発現レベルおよび核局在化は、架橋した5F11で刺激したあとに上昇するが、ボルテゾミブに曝露すると、細胞核からNF-κBが排除される（細胞核はDAPIで染色した）。

そのデータから、5F11単体ではすべてのホジキン細胞株にアポトーシスを誘発するには十分ではないと考えられるが、抵抗性群はボルテゾミブに対する感受性の上昇を示しているらしいということが示唆されている。そのような作用は、HDのアポトーシス耐性の主因子である生存因子NF-κBの活性化によるものであると考えられる。さらに、NF-κBは、もっともよく特徴付けされたボルテゾミブの標的の1つである。ホジキン細胞株L540およびL428のNF-κBの細胞下分布を、架橋5F11および／またはボルテゾミブでのインキュベーション後に分析した。NF-κBサブユニットp65の低レベルの発現が、未処理L540細胞で検出することができた。前記タンパク質は細胞質および部分的に細胞核に局在化しており、ホジキン細胞のNF-κBの構成的発現を反映していた。5F11/GaHによるインキュベーションはNF-κB依存抗体染色および核内蓄積の増加を誘導しており、CD30シグナル伝達に応答したNF-κB活性化を実証した。この作用は、ボルテゾミブを5F11刺激から30分後に投与した場合に阻害され、細胞核からのNF-κBの排除を引き起こした。この減少は6乃至8時間後に認められた。未処理細胞のNF-κB染色と比較すると、構成的に発現したNF-κBも細胞質に捕捉されていることが示唆される。L428細胞において、5F11+/-ボルテゾミブによる処置後にNF-κB分布を解析したところ、同様の結果が得られた。

NF-κB応答性ルシフェラーゼレポータ遺伝子を形質移入したL428細胞を用いて、NF-κBの転写活性の活性化を測定した（図4）。5F11による刺激によって、前記レポータ遺伝子の活性化は約2倍になった。この活性化はボルテゾミブが存在すると抑制され、NF-κBレポータの基礎活性も低減した。NF-κB阻害物質IkBの構成的活性化突然変異IkBaMをコードする発現ベクタを同時導入した場合、ルシフェラーゼ遺伝子の活性化は認められず、測定された作用はNF-κB特異的であることが示唆された。5F11への接触後の細胞中のNF-κBDNA結合活性を、電気穿孔移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて測定した。NF-κB
DNA結合は、未処理L540でもL428細胞でも検出可能で、どちらの細胞株でも架橋5F11への接触によってDNA結合が増加した。この設定における対照として用いた抗CD30抗体Ber-H2は、NF-κBを活性化せず（レーン3および6）、XTTアッセイで測定した場合、HD由来細胞株のボルテゾミブへの感受性は増加しなかった。この説の裏付けとして、生5F11処理L540細胞がアポトーシス細胞に認められない強力なNF-κB染色が認められることがわかった。

抗アポトーシスタンパク質フリップの発現レベルは5F11およびボルテゾミブで調節される
いくつかの因子がアポトーシスカスケードを遮断すると報告されているため、生存促進性遺伝子のNF-κB活性化に関連する候補タンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法で測定した。興味深いことに、カスケード阻害因子c-フリップの発現について、非常に劇的な変化が見られた。cフリップは、5F11によるCD30の刺激後にL540およびL428において強く誘導された。対照的に、ボルテゾミブでの前記細胞の同時インキュベーションを6、8、および16時間行った後で、cフリップの下方調節が見られた。bcl-2およびbaxにおける変化はわずかしか認められず、TRADDおよびFADDの発現レベルは、5F11架橋またはボルテゾミブ処理後も変化しないままだった。

考察
本実施例は、HD細胞のCD30媒介細胞死への抵抗性は、NF-κBの活性化によるものであってプロテアソーム阻害物質ボルテゾミブでの処理によって克服することができるという証拠を提供している。この結論は、(1)ヒト抗体5F11によるCD30刺激が1細胞レベルのNF-κB発現に与える作用の分析であって、当該分析において耐性細胞のアポトーシスにおける発現の増加が認められた分析から得られた。これは、5F11媒介細胞死に感受性のないL428細胞株、および部分的に感受性の細胞下部L540の耐性群に認められた。そして(2)5F11の存在下におけるボルテゾミブの亜毒性濃度を用いたNF-κBの阻害はアポトーシスの急増を引き起こした。これがin vitroおよび皮下HD腫瘍モデルにおいて示されたのは、5F11およびボルテゾミブの組み合わせがそれぞれの物質単体よりも効率的に腫瘍成長を阻害したからだった。組み合わせたほうが5F11処置のみよりも有利な点は2乃至3週間後に最も明らかとなり、5F11媒介シグナル伝達の動力学が反映された。一部の細胞では5F11による初期の刺激がアポトーシスを誘導したが、抵抗性細胞は、未処理対照細胞についての推定値に匹敵し、より高い増殖率を示した。CD30レセプタはさまざまな研究で標的免疫療法のために用いられるが、多くのモノクローナル抗体および抗体毒素複合体についての臨床評価は残念な結果に終わっている（18乃至21）。一例は、非複合mAb
Ber-H2である。これはin vitroにおいて悪性細胞を効率的に死滅させる能力があるが、臨床上の治療の利点は見つからなかった（20）。同様に、サポリン毒素に結合したBer-H2の免疫毒素は、HD患者に一過性の応答しか示さなかった（21）。本願明細書に提示したデータから、CD30に対する免疫療法とボルテゾミブを組み合わせると臨床結果が向上するだろうということが示唆される。

TNF-R1は、アダプタータンパク質の導入によってアポトーシスを誘導する能力があるTNFファミリのレセプタだが、NF-κBおよび抗アポトーシス標的遺伝子の活性化による死滅から細胞を守ることもできる（最近の総説(22)）。トランスフェクトしたHeLa細胞の場合、TNF-RI誘導細胞死はTNF-R2、CD40またはCD30との共刺激によって促進することができる。これは、NF-κB活性化二重様なTNF-R関連因子の一つ、TRAF2 (23)の減少に依存しているようである。CD30による同時導入したTRAF-2の減少、NF-κBの不活化、およびアポトーシスの促進は、形質導入胚性腎癌腫細胞株（24、25）およびALCL株Karpas299（15）にも認めれる。しかし、この機序はこれまでのところHD由来細胞には認められず、最近、TRAF1についてはHD
リンパ腫およびALCL由来細胞のディファレンシャルな機能が報告されている（26）。対照的に、本実施例は、ボルテゾミブを用いたNF-κB経路の直接的な阻害が明らかにHDおよびALCL由来細胞株においてCD30によるアポトーシスを促進することを実証した。

ボルテゾミブによるTRAIL媒介アポトーシスにもともと抵抗性の腫瘍細胞の感作は、NF-κB阻害に主に依存しているわけではなく、caspase8（27）の切断の促進および抗アポトーシスタンパク質cフリップの減少（28）はそれぞれ抵抗性を克服するようである。本願発明者らは、NF-κBによって上方調節され、ユビキチン化されプロテアソームによって分解された（29、30）cフリップの発現は、CD30の刺激後は活性化したが、ボルテゾミブが加えられると減少した。興味深いことに、最近、cフリップはH-RS細胞における死滅レセプタ耐性の主要な調節因子であることが示された（31乃至33）。HD細胞におけるcフリップの発現は、CD30、CD40およびRANKシグナル伝達（34）によって調節される異常に活性なMEK/ERK 経路にも依存する。

NF-κBレポータ遺伝子アッセイ、免疫蛍光法、およびウェスタンブロット法によって、5F11刺激がNF-κBおよび下流抗アポトーシスタンパク質cフリップの初期活性化を引き起こすことを実証した。これは、5F11によるCD30シグナル伝達が前記腫瘍細胞のボルテゾミブへの感作を誘導することを示唆している。CD30シグナル伝達に応答したアポトーシス誘発と成長刺激のバランスは、CD30の刺激がプロテアソーム阻害と組み合わさるとアポトーシスの方に傾くという結論になると考えられる。本実施例に見られる5F11およびボルテゾミブの組み合わせのin vitroおよびin vivo活性によって、HD患者の処置における治療上の価値が示唆される。

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等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できるであろう。このような等価物は、添付の請求の範囲の包含するところである。

引用による援用
本願明細書に引用されるすべての特許、係属特許出願、およびその他の出版物は、その全体を引用することによりここに援用する。

5F11およびMG132による処理後のL540細胞におけるアポトーシスの誘導L540細胞を、PBS（対照）、架橋5F11、MG132、または5F11とMG132の組み合わせによって、16時間培養した。アポトーシス細胞をアネキシンV-FITC染色によって標識し、生細胞およびアポトーシス細胞の割合はFACS解析による推定値とした。独立した3回の実験の結果を示す。架橋5F11およびMG132の組み合わせによってCD30発現細胞下部の細胞生存能力が低下する。5F11の存在下（ひし形）および欠如下（三角形）においてボルテゾミブの量を増やしながら接触させたあとの、ホジキン細胞株L540 (A)、L428(B)およびALCL株Karpas299 (C)、ならびにCD30陰性細胞株REH(E) の生存能力を示すXTTアッセイ。亜毒性濃度の5F11および架橋GaH抗体をボルテゾミブの濃度を増加させながら組み合わせた。前記細胞を30分間mabで予めインキュベートしてからボルテゾミブを加えた。細胞生存能力の推定は、インキュベーションから48時間後に行った。CD30発現細胞では、ボルテゾミブのIC₅₀は5F11の存在下において低下する。5F11を加える前に、前記細胞を30分間ボルテゾミブで予めインキュベーションしても、L428細胞について、ボルテゾミブの細胞毒性は上昇しない。対照実験（5F11ひし形）およびヤギ抗ヒト抗体（十字）および5F11+GaH （丸）の結果を示す。図は3回の独立した実験の代表である。 SCIDマウスにおける皮下L540Cyホジキン腫瘍の腫瘍成長への5F11およびボルテゾミブの作用マウスを無作為に4グループに分けて、L540由来腫瘍の容量が約100mm3に達したものにPBS、5F11（100μg）、ボルテゾミブ（10ng）、または5F11およびボルテゾミブの組み合わせを投与した。各マウスの腫瘍容量を示す。矢印は処置の日数を示す。独立の実験において、これらの結果は、5F11および5F11＋ボルテゾミブ群でそれぞれ、マウス4匹について再現された。 NF-κBの細胞下分布および転写活性への5F11およびボルテゾミブの作用 L428に、レポータ構成物pCMV-luc（トランスフェクション対照）、またはpNF-κB-luc（棒グラフ2乃至4）、もしくはpNF-κB-lucと発現ベクタIkB-M（棒グラフ5乃至7）のいずれかを形質導入した。トランスフェクション効率は約10%で、DNAの総量は一定に保たれた。1晩の回復期の後、導入物をPBS（基準）、5F11またはボルテゾミブで24時間処理した。前記細胞のルシフェラーゼ活性（RLU）を測定し、NF-κB依存プロモータ活性の相対レベルを示すために表示する。

Claims

CD30陽性リンパ腫を処置する方法であって、治療上有効な量の(i)CD30に結合するモノクローナル抗体、および(ii)NF-κB活性を阻害する化合物を、処置する必要がある患者に投与するステップによって処置する方法。
請求項１に記載の方法であって、当該方法においてNF-κB活性を阻害する化合物がプロテアソーム阻害物質である、方法。
請求項２に記載の方法であって、当該方法において前記プロテアソーム阻害物質が26Sプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する、方法。
請求項２に記載の方法であって、当該方法において、プロテアソーム阻害化合物が、ALLnL (N-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-ノルロイシナル、MG101)、LLM
(N-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-メチオナル)、Z-LLnV
(カルボベンゾキシル-ロイシニル-ロイシニル-ノルバリナル、MG115)、Z-LLL(カルボベンゾキシル-ロイシニル-ロイシニル-ロイシナル、MG132)、ラクタシスチン、b-ラクトン、ボロン酸ペプチド、ユビキチンリガーゼ阻害物質、シクロスポリンA,、FK506 (タクロリムス)およびデオキシスペルグアリンから選択される、方法。
CD30陽性リンパ腫を処置する方法であって、治療上有効な量のヒトモノクローナル抗体5F11およびボルテゾミブを、処置する必要がある患者に投与するステップによって処置する方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において、患者が、プロテアソーム阻害物質投与の前に前記抗体を投与される、方法。
CD30陽性リンパ腫を処置する方法であって、治療上有効な量のNF-κBを阻害する化合物を、処置する必要がある患者に投与するステップによって処置する方法であって、当該方法において、患者が治療上有効な量の抗CD30抗体を投与されるステップを含む治療を予め受ける、方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において前記抗体がヒトIgG重鎖およびヒトκ軽鎖を含む、方法。
請求項1乃至７の方法であって、当該方法において前記抗体がヒトIgG1またはIgG3重鎖を含む、方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において、前記モノクローナル抗体は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4配列を含むヒト重鎖可変領域、およびFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4配列を含むヒト軽鎖可変領域を含み、
(a) ヒト重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号第18、30、および42、およびその保存的修飾からなるグループから選択され、
(b) ヒト軽鎖可変領域CDR3配列が、配列番号第24、36、および48、およびその保存的修飾からなるグループから選択され、
(c) 前記抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁷
M^-1の親和定数で結合し、
(d) 前記ヒト抗体が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイにおいてCD30⁺ 腫瘍細胞の溶解を媒介し、
(e) 前記ヒト抗体がin vivoにおいてCD30⁺腫瘍細胞の成長を阻害する、
方法。
請求項１０に記載の方法であって、当該方法において、ヒト重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号第17、29、および41およびその保存的修飾からなるグループから選択され、ヒト軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号第23、35、および47、およびその保存的修飾からなるグループから選択される、方法。
請求項11に記載の方法であって、当該方法において、ヒト重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号第16、28、および40およびその保存的修飾からなるグループから選択され、ヒト軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号第22、34、および46およびその保存的修飾から選択される、方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において、前記抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁸ M^-1の親和定数で結合する、方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において、前記抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁹
M^-1の親和定数で結合する、方法。
請求項１０に記載の方法であって、当該方法においてヒト重鎖可変領域FR1、FR2、FR3およびFR4配列はヒト重鎖VH_4-34
またはVH_3-11生殖細胞系列配列に由来する、方法。
請求項１０に記載の方法であって、当該方法においてヒト軽鎖可変領域FR1、FR2、FR3およびFR4配列はヒト軽鎖L15、A27またはL6
生殖細胞系列配列に由来する、方法。
前述の請求項のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において前記抗体がヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含み、
(a) ヒト重鎖可変領域が、配列番号第2、6、および10、ならびに配列番号第2、6、および10に少なくとも80%相同な配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
(b) ヒト軽鎖可変領域が、配列番号第4、8、および12、ならびに配列番号第4、8、および12に少なくとも80%相同な配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、
(c) 前記ヒト抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁷
M^-1の親和定数で結合し、
(d) 前記ヒト抗体が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイにおいてCD30⁺ 腫瘍細胞の溶解を媒介し、
(e) 前記ヒト抗体がin vivoにおいてCD30⁺腫瘍細胞の成長を阻害する、
方法。
請求項１７に記載の方法であって、当該方法において、前記抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁸
M^-1の親和定数で結合する、方法。
請求項１７に記載の方法であって、当該方法において、前記抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁹
M^-1の親和定数で結合する、方法。
請求項1乃至16のいずれか一つに記載の方法であって、当該方法において前記抗体がヒト重鎖VH_4-34生殖細胞系列配列に由来するヒト重鎖可変領域、およびヒト軽鎖L15生殖細胞系列配列に由来するヒト軽鎖可変領域を含み、
(a) ヒト重鎖可変領域が、配列番号第10のアミノ酸配列、および配列番号第10に少なくとも80%相同な配列を含み、
(b) ヒト軽鎖可変領域が、配列番号第12のアミノ酸配列、または配列番号第12に少なくとも80%相同な配列を含み、
(c) 前記ヒト抗体が、ヒトCD30と、少なくとも10⁷
M^-1の親和定数で結合し、
(d) 前記ヒト抗体が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイにおいてCD30⁺ 腫瘍細胞の溶解を媒介し、
(e) 前記ヒト抗体がin vivoにおいてCD30⁺腫瘍細胞の成長を阻害する、
方法。
請求項1乃至16に記載の方法であって、当該方法において前記抗体が、配列番号第2および配列番号第4にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖およびヒト軽鎖可変領域を含む、方法。
請求項1乃至16に記載の方法であって、当該方法において前記抗体が、配列番号第6および配列番号第8にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖およびヒト軽鎖可変領域を含む、方法。
請求項1乃至16に記載の方法であって、当該方法において前記抗体が、配列番号第10および配列番号第12にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖およびヒト軽鎖可変領域を含む、方法。
請求項１乃至１６のいずれか一つに記載の方法であって、前記抗体がハイブリドーマによって産生され、当該方法において前記ハイブリドーマが不死化細胞に融合させたヒト重鎖組換え遺伝子または組換え染色体、およびヒト軽鎖組換え遺伝子または組換え染色体を含むゲノムを有する、組換え非ヒト動物から得られたB細胞から調製された、方法。
請求項１乃至９のいずれか一つに記載される方法であって、当該方法において前記抗体が5F11、AC-10、HeFi-1、または5F11、AC-10、HeFi-1のCD30への結合と競合する抗体から選択される、方法。
CD30発現細胞の成長を阻害する方法であって、前記細胞の成長を阻害するように、有効に細胞成長を阻害する量の抗体およびプロテアーゼ阻害物質を前記細胞と接触させるステップを含む、方法。
CD30を発現する腫瘍細胞の成長を特徴とする疾患を処置または予防する方法であって、CD30およびプロテアーゼ阻害物質に結合するモノクローナル抗体を患者に投与するステップを含む、方法。
請求項２７に記載の方法であって、、当該方法において、前記疾患が、ホジキン病、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、成人T細胞リンパ腫（ATL）、血管免疫芽球性リンパ節症（AILD）様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔性リンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化腫瘍（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、およびその他のT細胞またはB細胞リンパ腫からなるグループから選択される、方法。
請求項27に記載の方法であって、当該方法において前記疾患がホジキン病である、方法。
請求項27に記載の方法であって、当該方法において前記疾患が非ホジキンリンパ腫である、方法。
請求項30に記載の方法であって、当該方法において非ホジキンリンパ腫が未分化大細胞リンパ腫（ALCL）である、方法。