DE69531607T2

DE69531607T2 - Fusionsgene für den inhibitor des terminalen komplements und proteine

Info

Publication number: DE69531607T2
Application number: DE69531607T
Authority: DE
Inventors: P. Russell ROTHER; Scott Rollins; P. Stephen SQUINTO
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2015-03-02
Also published as: CA2184356A1; ES2204944T3; WO1995023512A1; EP0750458B1; JPH09510088A; DE69531607D1; AU1985895A; US5847082A; AU683158B2; EP0750458A1; EP0750458A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft terminate Komplementinhibitorproteine, welche genetisch hergestellt wurden, um ihre Anheftung an die Zelloberfläche zu verändern, und medizinische Verwendungen solcher neuen Moleküle.
Hintergrund der Erfindung
I. Das Komplementsystem
Das Komplementsystem wirkt in Verbindung mit anderen immunologischen Systemen des Körpers zur Verteidigung gegen das Eindringen von zellulären und viralen Pathogenen. Es gibt wenigsten 25 Komplementproteine, die man als komplexe Sammlung von Plasmaproteinen und Membran-Cofaktoren findet. Die Plasmaproteine machen etwa 10% der Globuline in Vertebratenserum aus. Komplementbestandteile erreichen ihre immunabwehrenden Funktionen, indem sie in einer Reihe von komplizierten aber präzisen enzymatischen Spaltungs- und Membranbindungsereignissen Wechselwirken. Die resultierende Komplementkaskade führt zu der Produktion von Produkten mit opsonischen, immunregulatorischen und lytischen Funktionen.
Der lytische Aspekt der Komplementfunktion wird durch die Permeabilisierung von Zielzellmembranen als eine unmittelbare Wirkung einer Menge von Komplementproteinen bewirkt, die im einzelnen als „terminale Komplementbestandteile" und in ihrer funktionalen Menge als der Membranangriffskomplex oder „MAC" bekannt sind. (siehe Esser, 1991, und Bhakdi et al., 1991.) Die Wirkungen des MAC, nachfolgend als „Komplementangriff" bezeichnet, erzeugen Poren oder durchlässige Stellen, die zu der Zerstörung von osmotischen und ionischen Gradienten in Zielzellen führen, was bei ausreichend hohen MAC-Konzentrationen zum Zelliod führt. Niedrigere Konzentrationen von MACs können andere Effekte produzieren, einschließlich der Aktivierung von Endothelzellen und Blutplättchen. Ungenügende MAC-Aktivität kann zu pathologischem Schaden an Zellen und Geweben führen.
Die Komplementkaskade schreitet über den klassischen Weg oder den alternativen Weg voran. Diese Wege teilen sich viele Bestandteile und, obwohl sie sich in ihren frühen Stufen unterscheiden, laufen beide zusammen und teilen sich die gleichen terminalen Komplementbestandteile, die für einen Komplementangriff und die Aktivierung und/oder Zerstörung von Zielzellen verantwortlich sind.
Der klassische Komplementweg wird typischerweise durch Antikörpererkennung von und Bindung an eine antigene Stelle einer Zielzelle initiiert. Der alternative Weg ist normalerweise von Antikörper unabhängig und kann durch mehrere Moleküle auf Pathogenoberflächen initiiert werden. Beide Wege laufen an dem Punkt zusammen, wo der Komplementbestandteil C3 von einer aktiven Protease (welche bei jedem Weg verschieden ist) unter Erhalt von C3a und C3b gespalten wird. Andere Wege, die den Komplementangriff aktivieren, können in der Abfolge von Ereig nissen, die zu verschiedenen Aspekten der Komplementfunktion führen, einschließlich der Bildung des MAC, später wirken.
C3a ist ein Anaphylatoxin, welches Degranulierung von Mastzellen induzieren kann, was zur Freisetzung von Histamin und anderen Entzündungsvermittlern führt. C3b hat mehrere Funktionen. Wie Opsonin bindet es an Bakterien, Viren und andere Zellen und Teilchen und markiert sie für eine Entfernung aus dem Kreislauf. C3b kann auch einen Komplex bilden mit anderen Bestandteilen, die für jeden Weg einzigartig sind, unter Ausbildung klassischer oder alternativer C5-Konvertase, welche C5 in C5a (ein weiteres Anaphylatoxin) und C5b, welche der erste der terminalen Komplementbestandteile ist, die den MAC bilden, spaltet. (Unter den verschiedenen Mitteln, durch welche ein Komplementangriff initiiert werden kann, können proteolytische Enzyme mit relativ breiten Zielproteinspezifitäten, einschließlich Plasmin, Elastase und Cathepsin G, C5 spalten, so daß die Wirkung von C5-Konvertase nachgeahmt wird, und aktives C5b bilden.) C5b kombiniert nacheinander mit C6, C7 und C8 unter Bildung des C5b-8 Komplexes an der Oberfläche der Zielzelle. Nach einer Bindung mehrerer C9-Moleküle wird der aktive MAC (C5b-9) gebildet.
II. Regulierung des Komplementsystems
Normalerweise befindet sich das Komplementsystem in einem kontinuierlichen Zustand von spontanem Umsatz. C3 kann spontan C3b-Funktionen annehmen, wobei es funktionale C3-Konvertase bildet und zur Bildung von C3b führt. Das auf diese spontane Weise erzeugte C3b kann auch C5-Konvertase ausbilden und somit die letzten Stufen in der Kaskade, die den MAC bildet, initiieren.
Unter normalen Bedingungen wird die Blutströmung die niedrigen Mengen an spontan aktivierten Komplementbestandteilen verdünnen und verteilen und somit dazu beitragen, den MAC-Aufbau an irgendeinem Ort in dem Gefäßsystem zu verhindern. Darüber hinaus wird eine homeostatische Regulierung der Wirkungen autologer Komplementproteine zur Verhinderung eines Autoimmunangriffs durch spezifische endogene Komplementinhibitorproteine (CIPs), die man auf den Oberflächen der meisten menschlichen Zellen finden kann, verhindert. Normalerweise reichen die Blutströmung und die Wirkung von CIPs aus, Zellen gegen normale Mengen an spontaner Komplementaktivierung ohne Beschädigung oder Lyse resistent zu machen. Unter Bedingungen akuter Entzündung und in verschiedenen Krankheitsstadien, bei denen Komplementaktivierung und MAC-Bildung beschleunigt sind, können die normale Menge und Aktivität von endogenen Komplementinhibitoren ungeeignet sein, autologe Zellen vor MAC-induzierter Lyse und/oder sublytischer MAC-induzierter Zellaktivierung zu schützen. Endogene CIP-Aktivität kann auch ungenügend sein, wo es einen Stasis des Blutes oder wo es Defekte in oder Mängel an natürlich vorkommenden Inhibitoren gibt.
Es wurde eine Anzahl von CIPs identifiziert, die dazu dienen, Zellen vor Beschädigung zu schützen, die durch Komplement von übereinstimmenden Spezies vermittelt wird. Siehe Zalman et al., 1986; Schonermark et al., 1986; Nose et al., 1990; und Sugita et al., 1988. Diese Inhibitoren wirken an verschiedenen definierten Stellen in der Komplementkaskade. Zum Beispiel ent wickelt CD55, auch bekannt als Zerfall beschleunigender Faktor (DAF), seine größten inhibitorischen Wirkungen auf die Aktivitäten von C3-Konvertase.
In Fällen, wo die Komplementkaskade an Stellen in dem Weg nach der C3-Konvertasestufe initiiert wird, wie durch die Erzeugung von aktiver C5b durch Breitspektrumproteasen, sind DAF und andere Komplementinhibitoren, die in früheren Stufen in der Kaskadenabfolge wirken, ineffektiv. Es gibt jedoch Inhibitoren, die diesen Mangel nicht teilen. Diese Inhibitoren wirken in den letzten Stufen beim Zusammenfügen von MAC und können daher einen Komplementangriff, der durch nahezu jedes Mittel initiiert wird, wirksam blockieren. Diese Inhibitoren sind als „terminale Komplementinhibitoren" oder „terminale CIPs" bekannt.
III. Terminale CIPs
Das am sorgfältigsten charakterisierte terminale CIP ist das menschliche Protein CD59 (auch bekannt als „Protektin", „MACIF" oder „p18"). CD59 ist ein Glycoprotein mit einer erscheinenden Molekularmasse von 18 bis 21 Kilodalton, das Zellen vor komplementvermittelter Lyse schützt. CD59 ist an der Außenseite der Zelle durch einen Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Glycolipidrest, der in der Zellmembran verankert ist, angebunden. CD59 findet man assoziiert mit den Membranen, welche die Oberflächen der meisten menschlichen Zellen bilden, einschließlich Erythrozyten, Lymphozyten und vaskulären Endothelzellen. (Siehe zum Beispiel Sims et al., US-Patent Nr. 5,135,916.)
CD59 scheint zu wirken, indem es mit C9 um eine Bindung an C8 in dem C5b-8-Komplex in Konkurrenz tritt, wobei die Bildung des C5b-9-MAC herabgesetzt wird (Rollins et al., 1990). CD59 wirkt somit unter Reduzierung sowohl von Zellstimulation als auch Zellyse durch MACs (Rollins et al., 1990; Rollins et al., 1991; Stefanova et al., 1989; Sugita et al., 1988; Davies et al., 1989; Holguin et al., 1989; Okada et al., 1989a; Meri et al., 1990; Whitlow et al., 1990 und Harada et al., 1990). Diese Aktivität von CD59 ist größtenteils speziesselektiv, blockiert höchst effizient die Bildung von MACs unter Bedingungen, unter denen C8 und C9 von homologem (d. h. menschlichem) Serum erhalten wird (Venneker et al., 1992). Die Assimilation von gereinigtem CD59 in der Plasmamembran von nichtmenschlichen Erythrozyten (von denen man annimmt, daß sie vor homologem nichtmenschlichem Komplementangriff durch die Wirkung ihrer eigenen Zelloberflächenkomplementinhibitorproteine geschützt sind) und Oligodendrozyten (Gehirnzellen, von denen man annimmt, daß sie weniger, wenn überhaupt, durch Zelloberflächenproteine geschützt sind, die aber in vivo durch die Blut-Hirn-Schranke geschützt sein können) zeigte, daß CD59 diese Zellen vor Zellyse, die durch menschliches Komplement vermittelt wird, schützen kann. (Rollins et al., 1990; Rollins et al., 1991; Stefanova et al., 1989; Meri et al., 1990; Whitlow et al., 1990; Okada et al., 1989b und Wing et al., 1992.)
cDNAs, die CD59 kodieren, wurden kloniert, und die Struktur des CD59-Gens wurde charakterisiert (Davies et al., 1989; Okada et al., 1989b; Philbrick et al., 1990; Sawada et al., 1989 und Tone et al., 1992). Für nichtmenschliche Säugerzellen, die mit der klonierten CD59-cDNA transfiziert waren und dabei das menschliche CD59-Protein auf ihren Zelloberflächen exprimier ten, wurde gezeigt, daß sie Resistenz gegen komplementvermittelte Zellyse erhalten (Zhao et al., 1991 und Walsh et al., 1991).
Von CD59 wurde berichtet, daß es strukturell mit den Nagerantigenen Ly-6 verwandt ist (Philbrick et al., 1990 und Petranka et al., 1992). Die Gene, welche diese Antigene kodieren, auch bekannt als T-Zell-aktivierende Proteine, sind Mitglieder der Ly-6-Multigenfamilie und umfassen Ly-6A.2, Ly-6B.2, Ly-6C.1, Ly-6C.2 und Ly-6E.1. Das Gen, welches das Thymozyten-B-Zellantigen ThB des Nagers kodiert, ist ebenfalls ein Mitglied dieser Familie (Shevach et al., 1989 und Gumley et al., 1992).
Eine Anzahl viraler und nichtmenschlicher Primatenkomplementinhibitorproteine, die in Struktur und Funktion CD59 ähnlich sind, wurde beschrieben (siehe Rother et al., 1994; Albrecht et al., 1992; allgemein zugeordnet der parallel anhängigen US-Patentanmeldung Seriennummer 08/105,735, eingereicht am 11. August 1993 von William L. Fodor, Scott Rollins, Russel Rother und Stephen P. Squinto, mit dem Titel „Complement Inhibitor Proteins of Non-Human Primates" und die allgemein zugeordnete und parallel anhängige PCT-Patentanmeldung Seriennummer PCT/US93/00672, eingereicht am 12. Januar 1993 von Bernhard Fleckenstein und Jens-Christian Albrecht, mit dem Titel „Complement Regulatory Proteins of Herpesvirus Saimiri".
Diese Proteine – BABCIP (SEQ ID NO: 1), AGMCIP (SEQ ID NO: 2), SQMCIP (SEQ ID NO:3), OWMCIP (SEQ ID NO: 4), MARCIP (SEQ ID NO: 5) und HVS-15 (SEQ ID NO: 6) – teilen sich alle beachtliche Sequenzhomologien, einschließlich einer unterscheidungskräftigen konservierten Anordnung von Cysteinen innerhalb von deren Aminosäuresequenzen. Diese konservierten Muster werden am einfachsten durch Ausrichten der Sequenzen der Proteine, so daß die Cysteinreste übereinander stehen, wie man es in 1 sieht, wahrgenommen.
Cysteinreste von vielen Proteinen bilden ein strukturelles Element, daß man auf dem Gebiet als ein „Cysteinrückgrat" bezeichnet. In Proteinen, in welchen diese auftreten, spielen Cysteinrückgrate wesentliche Rollen bei der Bestimmung der dreidimensionalen Faltung, der Tertiärstruktur und der letztendlichen Funktion des Moleküls. Die Proteine der Ly-6-Multigenfamilie, wie auch mehrere andere Proteine, haben eine bestimmte Cysteinrückgratstruktur gemeinsam, die hierin als das „Ly-6-Motiv" bezeichnet wird. Zum Beispiel enthält der menschliche Urokinase-Plasminogenaktivator-Rezeptor (uPAR; Roldan et al., 1990} und eines von mehreren Tintenfischglycoproteinen mit unbekannter Funktion (Sgp2; Williams et al., 1988) das Ly-6-Motiv.
Untermengen von Proteinen mit dem Ly-6-Motiv können durch das Vorhandensein konservierter Aminosäurereste in unmittelbarer Nachbarschaft zu den Cysteinresten identifiziert werden. Solch eine Konservierung spezifischer Aminosäuren innerhalb einer Untermenge von Proteinen kann mit spezifischen Aspekten der Faltung, der Tertiärstruktur und der letztendlichen Funktion der Proteine einhergehen. Diese konservierten Muster erkennt man am einfachsten durch Ausrichten der Sequenzen der Proteine, so daß die Cysteinreste übereinanderstehen.
Wie es vollständig in der oben genannten parallel anhängigen US-Patentanmeldung Seriennummer 08/105,735 diskutiert wird, deren relevanten Teile durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden, wurde eine Reihe nichtmenschlicher Primaten-C5b-9-Inhibitionsproteine identi fiziert, welche durch eine Cysteinrückgratstruktur charakterisiert sind, die eine spezifische Untermenge des allgemeinen Ly-6-Motivs definiert.
Speziell umfassen diese nichtmenschlichen Primaten-CIPs Polypeptide, die ein Cysteinrückgrat mit einem Ly-6-Motiv enthalten, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: Cys-X2-Cys-X6-9-Cys-X5-Cys-X6-Cys-X12-Cys-X5-Cys-X17-Cys-X0-Cys-X4-Cys. (1)
Darüber hinaus umfassen die nichtmenschlichen Primaten-C5b-9-Inhibitionsproteine Aminosäuresequenzen, die der folgenden Formel entsprechen: Cys-X2-Cys-Pro-X5-8-Cys-X4-Asn-Cys-X5-(Thr or Ser)-Cys-X11-(Gln or Arg)-Cys-X4-(Asn or Asp)-Cys-X17-Cys-X0-Cys-X4-Cys. (2)
In beiden Formel bedeutet das X in X_n ein Peptid, das irgendeine Kombination von Aminosäuren enthält, das n in X_n repräsentiert die Länge des Peptides in Aminosäureresten, und jedes X an irgendeiner Position kann das gleiche oder ein anderes als jedes andere X der gleichen Erstreckung in irgendeiner anderen Position sein.
Wie es vollständig in der oben genannten, parallel anhängigen, allgemein zugeordneten PCT-Anmeldung Seriennummer PCT/US93/00672, deren relevante Abschnitte durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden, und in Albrecht et al., 1992, diskutiert wird, wurde ein Protein des Herpesvirus Saimiri mit C5b-9-Inhibitionsaktivität entdeckt (hierin als „HVS-15" bezeichnet). Dieses virale Protein besitzt das Ly-6-Motiv, welches für die oben diskutierten nichtmenschlichen Primaten-C5b-9-Inhibitionsproteine charakteristisch ist, d. h. seine Struktur wird durch die oben genannten Formeln (1) und (2) beschrieben.
In der nachfolgenden Diskussion werden CIPs, welche Ly-6-Motive umfassen, als „Ly-6-terminale CIPs" bezeichnet. Diese CIPs erfüllen im allgemeinen die obige Formel (1) und vorzugsweise auch Formel (2). Gewisse Variationen im Abstand zwischen irgendwelchen zwei der zehn Cysteine, die das Ly-6-Motiv bilden, und in den benachbarten Aminosäuren sind jedoch in noch nicht charakterisierten terminalen CIPs anderer Spezies zu erwarten.
Auch Petranka et al., 1993, und Norris et al., 1993, haben berichtet, daß in CD59 (SEQ ID NO:7) die Disulfidbindung zwischen Cys6 und Cys13 sowie die Disulfidbindung zwischen Cys64 und Cys69 durch Austausch dieser Cysteine gegen Serine unterbrochen sein kann, ohne die Funktionalität von CD59 wesentlich einzuschränken. Diese Cysteine entsprechen den zweiten, dritten, neunten und zehnten Cysteinen in den oben genannten Formeln. Dementsprechend soll der Begriff „Ly-6-terminales CIP" wie er hierin verwendet wird, auch terminale Komplementinhibitorproteine umfassen, die mit den oben genannten Formeln übereinstimmen, bei denen jedoch alle oder einige der zweiten, dritten, neunten oder zehnten Cysteine gegen Serin oder eine andere Aminosäure ausgetauscht sind.
IV. Andere Zelloberflächenkomplementinhibitorproteine
Zusätzlich zu den Ly-6-terminalen CIPs, die oben diskutiert werden, wurden andere membrangebundene CIPs in der Literatur beschrieben, einschließlich der folgenden:

(a) CD46 (Membran-Cofaktor-Protein, MCP, siehe zum Beispiel PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/02002) ist ein 350 Aminosäuren langes Transmmembran (TM)-Protein, das man auf allen Zellen mit der Ausnahme von roten Blutzellen findet. CD46 bindet an C3b und fördert, wenn es einmal gebunden ist, die Aktivität von Proteasen, welche C3b in inaktive Fragmente spalten, wodurch eine C3b-Ansammlung auf der Zelloberfläche verhindert wird und Zellen wiederum vor Komplementangriff geschützt werden. In der Literatur wurde sowohl von membrangebundenen als auch segregierten Formen von CD46 berichtet (Purcell et al., 1991).
(b) CD55 (zerfallbeschleunigender Faktor, DAF), wie oben erwähnt, ist ein GPI-verankertes Zelloberflächenprotein, das auf allen Zellen, einschließlich roten Blutzellen, vorhanden ist. Anders als CD46 zerstört CD55 C3b nicht. CD55 verhindert vielmehr, das C3b mit anderen Komplementbestandteilen reagiert, wodurch es komplementvermittelter Cytolyse entgegenwirkt. In der Literatur wurde sowohl von membrangebundenen als auch segregierten Formen von CD55 berichtet (Moran et al., 1992).
(c) CD35 (Komplementrezeptor 1, CR1) findet man auf einer ausgewählten Gruppe von Lymphozyten sowie Erythrozyten, Neutrophilen und Eosinophilen, und es verursacht Abbau von C3b-Molekülen, die an benachbarten Zellen haften.
(d) Faktor H- und C4b-Bindungsprotein hemmen beide alternative C3-Konvertaseaktivität.

V. Transplantation
Intrinsische Aktivierung von Komplementangriff über den alternativen Weg während der Lagerung von Donororganen ist für bestimmte Probleme, die mit Organtransplantation einhergehen, welche in Folge von Endothelzellstimulation und/oder -lyse durch den C5b-9-MAC auftreten, verantwortlich (Brasile et al., 1985). Ex vivo Komplementangriff führt zu verminderter vaskulärer Überlebensfähigkeit und verminderter vaskulärer Integrität, wenn gelagerte Organe transplantiert werden, was die Wahrscheinlichkeit von Transplantatabstoßung erhöht.
Zehn Prozent der allogen transplantierten Nieren mit identischen Übereinstimmungen von HLA werden durch immunologische In vivo-Mechanismen abgestoßen (Brasile et al., 1987). In 78% der Patienten, die Organe unter diesen Bedingungen abstoßen, findet man cytotoxische Antikörper, die an Moleküle auf den Oberflächen von vaskulären Endothelzellen binden (Brasile et al., 1987). Diese Antikörpercytotoxizität wird durch Komplementangriff vermittelt und ist für die Abstoßung von transplantierten festen Organen, einschließlich Nieren und Herzen, verantwortlich (Brasile et al. 1987; Brasile et al., 1985). Von Antikörper initiierte, komplementvermittelte Abstoßung verläuft üblicherweise schnell und irreversibel, ein Phänomen, das man als hyperakute Abstoßung bezeichnet.
In der xenogenen Situation, wenn nichtmenschliche Organe in menschliche Patienten transplantiert werden, wird eine Aktivierung von Komplementangriff durch Antikörper, die gegen Moleküle auf den Oberflächen von Endothelzellen, welche die Gefäße des Donororgans auskleiden, gerichtet ist, fast immer beobachtet. Die Verbreitung solcher xenoreaktiver Antikörper erklärt das nahezu universelle Auftreten von hyperakuter Abstoßung von Xenotransplantaten (Dalmasso et al., 1992). Primaten der alten Welt, einschließlich Menschen, besitzen hohe Mengen an bereits bestehenden, zirkulierenden, „natürlichen" Antikörpern, die vornehmlich Kohlenhydratdetermi nanten erkennen, die auf der Oberfläche von xenogenen Zellen von nicht übereinstimmenden Spezies exprimiert werden. Ein kürzlicher Nachweis zeigt, daß die meisten dieser Antikörper mit Galactose in einer α1-3-Verknüpfung mit Galactose (Gal(α1-3)Gal) reagieren (Sandrin et al., 1993).
Primaten der alten Welt fehlt die geeignete funktionale α1,3-Galactose-Transferase, und sie exprimieren daher dieses Kohlenhydratepitop nicht. Nach einer Transplantation eines vaskularisierten xenogenen Donororgans binden daher diese Antikörper mit hohem Titer an das Gal(α1-3)Gal-Epitop an dem vaskulären Endothel und aktivieren das Komplement des Empfängers über den klassischen Weg. Die massive inflammatorische Reaktion, die nach Aktivierung der Komplementkaskade folgt, führt zu der Zerstörung des Donororgans innerhalb von Minuten bis Stunden.
Xenoreaktive Antikörper sind nicht in allen Fällen ausschließlich verantwortlich für hyperakute Abstoßung von unpassenden Organen. Zum Beispiel können Erythrozyten von einigen Spezies menschliches Komplement über den alternativen Weg aktivieren, und neugeborene Schweine, die frei von zuvor gebildeten Antikörpern sind, stoßen Xenotransplantate nahezu sofort ab. Es ist daher wahrscheinlich, daß in einigen Spezieskombinationen eine Aktivierung des alternativen Komplementweges zur Transplantatabstoßung beiträgt.
Endogen exprimierte, membranassoziierte Komplementinhibitionsproteine schützen normalerweise Endothelzellen vor autologem Komplement. Jedoch macht die Speziesbeschränkung von Komplementinhibitoren diese relativ unwirksam in Bezug auf eine Regulierung von nichtpassendem xenogenem Serumkomplement. Das Fehlen wirksamer Therapien mündete in der Eliminierung dieses Antikörpers, und komplementvermittelte hyperakute Abstoßung stellt eine Hauptbarriere für die erfolgreiche Transplantation von nichtpassenden Tierorganen in menschliche Empfänger dar.
Kürzlich wurde ein Bericht über eine Lebertransplantation vom Pavian auf den Menschen veröffentlicht, bei welcher das xenogene Donororgan keine Anzeichen von hyperakuter Abstoßung aufwies (Starzl et al., 1993). Die geringen Mengen an Anti-Pavian-Antikörpern, die wahrscheinlich in menschlichem Blut vorhanden sind, machen hyperakute Reaktionen weniger wahrscheinlich. Es wird jedoch angenommen, das kürzlich entdeckte Pavian CIPs, von denen gezeigt wurde, daß sie mit CD59 verwandt und gegen menschliches Komplement wirksam sind, auch eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität dieses xenotransplantierten Organs spielten. (Siehe US-Patentanmeldung Seriennummer 08/105,735, auf welche oben verwiesen wurde.)
Das Fehlen hyperakuter Abstoßung, wie man es in dem Xenotransplantat vom Pavian auf den Menschen beobachtet hat, wie oben diskutiert, legt nahe, daß Komplementinhibitorproteine, die gegen menschliches Komplement wirksam sind, in Kombination mit anderen Anti-Abstoßungsstrategien eine sichere und wirkungsvolle Xenotransplantation von transgenen Tierorganen, welche solche Proteine exprimieren, in menschliche Patienten erlauben können.
VI. GPI-verankerte CIPs und Modifikationen davon
GPI-verankerte terminale CIPs haben bestimmte Eigenschaften gemein, die sie für eine Verwendung als komplementhemmende Mittel für den Schutz von transplantierten Zellen oder Organen weniger wünschenswert machen als Transmembran (TM)-Proteine.
GPI-verankerte terminale CPIs, einschließlich CD59, BABCIP und AGMCIP, können durch spezifische Phospholipaseenzyme, die GPI-Anker hydrolisieren, von Zelloberflächen abgespalten werden. Solche Phospholipasen sind in dem Serum vorhanden (Phospholipase D, Davitz et al., 1987) und können auch von Zellen als Antwort auf Ischämie freigesetzt werden (Phospholipase C, Vakeva et al., 1992). Da Ischämie eine unvermeidbare Begleiterscheinung von Transplantation ist, kann das Verfahren der Transplantation dazu dienen, native und/oder künstlich eingebrachte GPI-verankerte terminale CIPs aus den wirklichen Zellen innerhalb des transplantierten Organs, das sie schützen sollen, zu entfernen.
Ein weiterer Mechanismus, durch den GPI-verankerte Proteine von der Zelloberfläche entfernt werden, ist die Aufnahme solcher Proteine in Membranvesikel und das anschließende Ausbringen der Vesikel aus der Zelle. Diese Vesikulierung kann als Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie durch ischämieinduzierten Komplementangriff, auftreten. Es wurde berichtet, daß sich GPI-verankerte Proteine in diesen Vesikeln relativ zu ihrer Konzentration in der Zellmembran anreichern, ein Phänomen, das die Einbeziehung dieser Proteine in den Vesikulierungsprozess selbst wiederspiegeln kann (Butikofer et al., 1989; Brown et al., 1992; Whitlow et al., 1993). Diese bevorzugte Aufnahme in ausgeworfene Vesikel kann die Konzentrationen von GPI-verankerten Proteinen auf der Zelloberfläche, einschließlich der Konzentrationen von GPI-verankerten terminalen CIPs reduzieren. Diese Reduzierungen terminaler CIP-Konzentrationen, insbesondere als Reaktion auf Komplementangriff, können gerade zu solchen Zeiten auftreten, zu denen eine Hemmung von Komplement am meisten benötigt wird.
Zusätzlich zu ihrer Empfänglichkeit für eine Entfernung von der Zelloberfläche unterliegen GPI-verankerte Proteine auch dem Problem, daß ihre Produktion in verschiedenen Zelltypen begrenzt sein kann. Das heißt, daß nur so viele GPI-verankerte Moleküle normalerweise von einer Zelle innerhalb eines gegebenen Zeitfensters produziert werden können, daß das Eindringen von Genen für weitere GPI-verankerte Proteine tatsächlich nicht zu einer wesentlichen Erhöhung der Menge an Protein, das tatsächlich auf der Zelloberfläche vorhanden ist, führen muß.
Der beschränkende Fall dieses Problems umfaßte Zellen, die nicht in der Lage sind, irgendwelche GPI-verankerten Proteine zu produzieren. Die klinische Erkrankung der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie (PNH) bezieht Zellen von diesem Typ ein, insbesondere Blutzellen, die keine GPI-verankerten terminalen CIPs produzieren. Wie es in der parallel anhängigen, allgemein zugeordneten US-Patentanmeldung Seriennummer 08/206,189 mit dem Titel „Method for the Treatment of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria", die gleichzeitig in den Namen von Russell Rother, Scott A. Rollins, Seth A. Fidel und Stephen P. Squinto eingereicht wurde, diskutiert wird, können PNH-Zellen durch die Verwendung der hierin beschriebenen transmembranalen, terminalen CIPs gegen Komplementangrift resistent gemacht werden.
Ein weiterer Nachteil von GPI-verankerten Proteinen schließt die Fähigkeit dieser Proteine ein, Signale in die Zellen weiterzuleiten, nachdem sie durch spezifische Antikörper vernetzt wurden und voraussichtlich nach Bindung ihrer natürlichen Liganden (Okada et al., 1989b; Seaman et al., 1991; Su et al., 1991; Deckert et al., 1992; Cinek et al., 1992; Card et al., 1991; Groux et al., 1989 und Stefanova et al., 1991). Mögliche unverwünschte zelluläre Reaktionen auf solche intrazellulären Signale können Phospholipaseaktivierung und/oder -freisetzung umfassen, und die Stimulierung von Vesikelbildung und Ausbringung, welche beide oben diskutiert werden, können zum Verlust von GPI-verankerten Proteinen von der Zelloberfläche führen. Daher können die äußersten GPI-verankerten terminalen CIPs, die zum Schutz der Zellen eines transplantieren Organs vor Komplementangriff verwendet werden, die zellulären Ereignisse aktivieren, die zu deren Entfernung von der Zelloberfläche führen.
Es wurden Arbeiten durchgeführt, bei welchen die Mittel zur Anheftung von GPI-verankerten Proteinen an die äußere Zelloberfläche gegenüber ihren natürlichen GPI-Ankern durch Austausch von anderen verankernden Resten variiert wurden (Su et al., 1991 und Lublin et al., 1991).
Zum Beispiel wurde von chimären Derivaten von CD55, welche die Aminosäuren von 1– 304 von CD55, verbunden mit einem Fragment von CD46, welches die Transmembrandomäne des Proteins enthält (d. h. Aminosäuren 270–350 von CD46), oder mit einem Fragment von dem menschlichen Haupthistokompatibilitätsprotein HLA-B44, welches die Transmembrandomäne umfaßt (d. h. Aminosäuren 262–338 von HLA-B44), enthalten, berichtet, daß sie Funktionsniveaus beibehalten, die denjenigen von nativem CD55 äquivalent sind (Lublin et al., 1991). Bezugnehmend auf die vorliegende Erfindung wurden signifikanterweise keine solchen Substitutionen mit terminalen CIPs durchgeführt, und es wurden keine solchen Moleküle für die klinische Verwendung und insbesondere für die Verwendung zur Konstruktion von transgenen Organen für die Transplantation entwickelt.
VII. Proteinstruktur und -funktion
Geringfügige Veränderungen von Proteinprimärstrukturen (Aminosäuresequenzen) können weitreichende Auswirkungen auf deren funktionale Eigenschaften haben. Das am besten bekannte Beispiel für dieses Phänomen der Fall von Sichelzellanämie, bei der eine einzelne Aminosäureveränderung, nämlich eine Veränderung im Rest 6 der Beta-Kette von Hämoglobin von Glu nach Val, ausreichend ist, die Sauerstoffbindungseigenschaften des Hämoglobinmoleküls zu verändern und dabei die Sichelzellerkrankung zu verursachen.
Das Einfügen von heterologen Aminosäuresequenzen, die neue Domänenstrukturen repräsentieren, in ein Protein kann auch erhebliche Auswirkungen auf die funktionalen Eigenschaften des Proteins haben. Zum Beispiel verändert die Einfügung eines 10 Aminosäuren langen Epitops des c-myc Proto-Onkogens (bekannt als die myc-Markierung) in das int-1 Proto-Onkogen die funktionalen Eigenschaften von int-1. Speziell werden C57MG-Säugerepithelzellen von Wildtyp-int-1 transformiert, aber nicht von dem mit mycmarkierten int-1, während man eine Resffunktion des mit mycmarkierten int-1-Gens in einem empfindlicheren Test, der Wirkungen auf Drosophila-Entwicklung untersucht, findet (McMahon et al., 1989).
Darüber hinaus kann eine Substitution von homologen Sequenzen von heterologen Proteinen tiefgreifende Auswirkungen auf die Proteinfunktion haben. Zum Beispiel reduziert ein Austausch einer der zwei am weitesten carboxylterminal liegenden, 12 Aminosäuren langen Abschnitte des Gens für den Nervenwachstumsfaktor der Maus durch homologe Abschnitte aus dem verwandten, aus Mäusehirn abgeleiteten Gen für neurotrophen Faktor die Aktivität des Moleküls um 50%. Dies bedeutet, daß der carboxyterminale Bereich besonders empfindlich für eine Substitution mit einer homologen Sequenz aus einem heterologen Protein ist, wobei solch eine Substitution eine ausreichende Wirkung auf die Proteinfunktion hat, daß die Aktivität um 50% herabgesetzt wird. Eine ähnliche Abnahme der Aktivität findet man nach Substitution des aminoterminalen Endes (Suter et al., 1992).
Man nimmt an, daß alle Ly-6-terminalen CIPs die Eigenschaft gemein haben, daß sie mittels einer GPI-Verknüpfung an Zellmembranen gebunden sind. Wie man es auf dem Gebiet versteht, fällt die Zufügung solch eines GPI-Restes zu einem entstehenden Protein mit einer proteolytischen Prozessierungsstufe zusammen, die eine Anzahl von Aminosäureresten von dem carboxylterminalen Ende des Polypeptids entfernt. Dementsprechend umfassen reifende Ly-6-terminale CIPs nicht alle der Aminosäuren, die durch die Nukleinsäuremoleküle der vollen Länge, welche sie kodieren, spezifiziert sind. Speziell umfassen Sie nicht einige oder alle der abstromigen Aminosäurereste des Cysteinrückgrat-Ly-6-Motivs, z. B. die Aminosäuren abstromig von Cystein 69 von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 (CD59) und abstromig von Cystein 72 von SEQ ID NO: 3. (Wie es hierin verwendet wird, bedeutet „abstromig" in Richtung des carboxylterminalen Endes des Polypeptids oder in Richtung des 3'-Endes des kodierenden Strangs des Nukleinsäuremoleküls, welches für das Polypeptid kodiert, und „aufstromig" bedeutet in Richtung des aminoterminalen Endes des Polypeptids oder in Richtung des 5'-Endes des kodierenden Strangs des Nukleinsäuremoleküls, welches für das Polypeptid kodiert.) Es ist nicht bekannt, welche Aminosäuren abstromig von dem Ly-6-Cysteinrückgratmotiv in einem dieser terminalen CIPs vorhanden oder abwesend sind, wenn sie sich in dem reifen, GPI-verankertern Zustand befinden.
Wie es unten ausführlich diskutiert wird, umfaßt die vorliegende Erfindung die Entfernung ausgewählter Aminosäuren von diesen Ly-6-terminalen CIPs abstromig des Ly-6-Motivs. In Anbetracht des vorgenannten Standes der Technik war vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, welchen Wirkungen solch eine Aminosäureenffernung auf die Funktion von terminalem CIP haben würde. Insbesondere war nicht bekannt, ob Ly-6-terminate CIPs nach solch einer Entfernung irgendeine komplementhemmende Aktivität behalten würden.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, die Wirkungen von GPI-Ankern auf die Proteinfunktion zu untersuchen. Im Fall von CD55 führt die Substitution von Proteinfragmenten, die eine Transmembrandomäne enthalten, gegen die carboxylterminalen Sequenzen, von denen man annimmt, daß sie in die Zufügung des GPI-Ankers involviert sind, (nachfolgend als die „GPI-Signalsequenz" bezeichnet) zu einem Protein mit gleicher Aktivität wie das native GPI-verankerte Protein (Lublin et al., 1991). In dem Fall des Ly-6-Proteins , Ly-6E (Ly-6E.1), welches ein GPI-verankertes Zelloberflächenprotein ist, das strukturell mit CD59 verwandt ist (Philbrick et al., 1990), erzeugt die Substitution eines Fragmentes, das eine Transmembrandomäne enthält, gegen die carboxylterminalen GPI-Signalsequenzen abstromig zu dem Ly-6-Motiv ein nichtfunktionales Protein, d. h. ein Protein, welches nicht in der Lage ist, T-Zellen zu aktivieren (Su et al., 1991).
Zusammenfassung der Erfindung
In Anbetracht des Vorausgegangenen ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, neue Proteine bereitzustellen, die zur Steuerung des Komplementsystems von Menschen oder anderen Tieren verwendet werden können. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuresequenzen und damit verbundene gentechnische Konstrukte für die Herstellung solcher Proteine entweder in vitro oder in vivo bereitzustellen.
Insbesondere ist die Aufgabe der Erfindung, neue Proteine bereitzustellen, die Ly-6-terminale Komplementinhibitoren sind, die jedoch mittels einer unabhängigen GPI-Verankerung an der Zelloberfläche verankert sind. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Moleküle dieses Typs bereitzustellen, die kein aktivierendes Signal in die Zellen, an welche sie gebunden sind, z. B. Endothelzellen, Lymphozyten oder Blutplättchen, entweder nach Antikörpervernetzung oder nach Bindung des terminalen CIP an dessen Lieganden übertragen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Moleküle dieses Typs bereitzustellen, die von den Oberflächen der Zellen, an welche sie gebunden sind, durch die Wirkungen von lipidspaltenden Enzymen, wie Phospholipasen, nicht entfernt werden können, und welche nicht übermäßig in Speichervesikel aufgenommen werden.
Zur Lösung der vorgenannten und anderer Aufgaben liefert die vorliegende Erfindung gemäß einiger ihrer Gesichtspunkte die vollständigen cDNA-Sequenzen von chimären Genen, die chimäre Proteinprodukte kodieren, welche die Fusion eines Ly-6-terminalen CIP mit einer heterologen Transmembran (TM)-Domäne umfassen. Vor der Fusion werden ausgewählte Aminosäurereste, die abstromig von dem Ly-6-Motiv des terminalen CIP angeordnet sind, entfernt. Die Erfindung umfaßt auch die chimären Proteinprodukte, die von diesen Genen kodiert werden, wobei diese chimären Moleküle nachfolgend als TMTCIPs (d. h. transmembranale terminale Komplementinhibitorproteine) bezeichnet werden. In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besitzen die chimären Proteine mehr als 50% der komplementinhibierenden Aktivität des nativen, GPI-verankerten terminalen CIP, von welchem das TMTCIP abgeleitet ist, wobei diese Aktivität vorzugsweise unter Verwendung eines Farbstofffreisetzungstests des nachfolgend in Beispiel 4 beschriebenen Typs gemessen wird.
Der von den TMTCIPs der Erfindung bereitgestellte Schutz vor Komplementangriff kann über Gentransfer für die therapeutische Prävention gegen pathologischen Komplementangriff bei z. B. einer Transplantation bereitgestellt werden. In einer bevorzugten Form solch einer Therapie kann die Expression des TMTCIP auf die Oberflächen von Zellen von nichtmenschlichen Tierorganen, z. B. Organen nichtmenschlicher transgener Tiere, gerichtet sein, um diese Organe bei Transplantation in einen menschlichen Patienten vor Komplementangriff zu schützen.
Die anhängenden Figuren, welche in die Beschreibung eingebunden sind und Teil derselben darstellen, erläutern bestimmte Gesichtspunkte der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, bestimmte Prinzipien der Erfindung zu erklären. Es ist selbstverständlich klar, daß sowohl die Figuren als auch die Beschreibung nur beispielhaft und für die Erfindung nicht beschränkend sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt aneinander ausgerichtete Aminosäuresequenzen von Mensch, afrikanischer grüner Meerkatze, Pavian, Eulenaffe, Pinseläffchen (Krallenaffe, Seidenäffchen), Totenkopfäffchen und Herpesvirus Saimiri Ly-6-terminalen CIPs (CD59, AGMCIP, BABCIP, OWNCIP, MARCIP, SQMCIP bzw. HVS-15). Die Cysteinreste, welche das Ly-6-Cysteinrückgratmotiv jedes Proteins bilden, sind unterstrichen.
2 zeigt einen Vergleich der Zelloberflächenexpression von CD59-Epitopen auf Balb/3T3-Zellen. Die drei Kurven repräsentieren Zelloberflächenexpressionsprofile eines positiven Balb/3T3-Klons, der das CD59-MCP-TMTCIP (CD59-TM) exprimiert, einer nativen menschlichen CD59 Transfektande (CD59-GPI) als eine Positivkontrolle und eines Vektors (pcDNA3, Invitrogen, San Diego, CA) ohne Insert-Transfektande (Vektorkontrolle) als eine Negativkontrolle.
3 zeigt einen Vergleich der Zelloberflächenexpression von CD59-Epitopen auf Maus-L-Zellen. Die breite Kurve repräsentiert Zelloberflächenexpressionsprofile von vereinigten L-Zellen, die mit retroviralen Virionenpartikeln, die unter Verwendung des pL-CD59-MCP-TM-SN-Vektors (CD59-TM) erzeugt wurden, transduziert sind. Ebenfalls gezeigt sind Profile von vereinigten L-Zellen, die entweder mit retroviralen Virionenpartikeln, die unter Verwendung des pL-CD59-GPI-SN-Vektors (CD59-GPI) erzeugt wurden, oder mit retroviralen Virionenpartikeln, die unter Verwendung des pLXSN-Vektors ohne Insertion (Vektorkontrolle) erzeugt wurden, als Negativkontrollen transduziert sind.
4 zeigt Zelloberflächenmengen von CD59-Antigenen auf stabil transfizierten Balb/3T3-Zellen vor und nach PI-PLC-Verdau. 4A zeigt Daten, die unter Verwendung eines Klons erhalten wurden, der das native, menschliche CD59-Molekül (CD59-GPI) exprimiert. 4B zeigt Daten, die unter Verwendung eines Klons erhalten wurden, der das CD59-MCP-TMTCIP (CD59-TM) exprimiert. In jedem Bild repräsentieren die mit "A" und "B" markierten Kurven Zellen, die mit dem sekundären Antikörper alleine, ohne bzw. mit PI-PLC-Behandlung, gefärbt wurden. In jedem Bild repräsentieren die mit "C" und "D" markierten Kurven Zellen, die sowohl mit dem primären (CD59-spezifischen) Antikörper und dem sekundären Antikörper mit bzw. ohne PI-PLC-Behandlung gefärbt wurden.
5 zeigt Daten, die aus Farbstoffreisetzungstests erhalten wurden, welche unter Verwendung der transfizierten Balb/3T3-Zellen, die zum Erhalt der Daten von 2 und 4 verwendet wurden, durchgeführt wurden. Die Zellen wurden mit 20% menschlichem, von C8 abgereichertem Serum, das mit einem Gemisch aus gleichen Teilen gereinigtem C8 und C9 versetzt war, behandelt. Die Mengen in Mikrogramm pro Milliliter Endkonzentration des Gemisches an zugegebenem menschlichem C8 und C9 sind an der Abszisse und der Prozentsatz Farbstoffreisetzung an der Ordinate angegeben.
6 zeigt Daten, die aus Farbstoffreisetzungstests erhalten wurden, welche unter Verwendung der transfizierten Maus-L-Zellen, welche zum Erhalt der Daten von 3 verwendet wurden, durchgeführt wurden. Die Zellen wurden mit 20% menschlichem, von C8 abgereichertem Serum, das mit einem Gemisch aus gleichen Teilen von gereinigtem menschlichem C8 und C9 versetzt war, behandelt. Die Mengen in Mikrogramm pro Milliliter Endkonzentration des zugegebenen Gemisches von menschlichem C8 und C9 sind and der Abszisse und der Prozentsatz Farbstoffreisetzung an der Ordinate angegeben.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie es oben diskutiert wird, liefert die vorliegende Erfindung die vollständigen cDNA-Sequenzen von chimären Genen, die chimäre Porteinprodukte kodieren, welche die Fusion eines Ly-6-terminalen CIP und einer heterologen Transmembrandomäne umfassen.
I. Terminale CIPs
Eine Vielzahl terminaler CIPs kann zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Insbesondere können Ly-6-terminale CIPs verwendet werden. Zusätzlich dazu, daß sie die in den Formeln (1) und (2) oben gezeigten Homologien gemein haben, haben die Ly-6-terminalen CIPs auch eine Vielzahl anderer Homologien gemein, welche man in den ausgerichteten Aminosäuresequenzen von 1 sehen kann. Homologien, die man abstromig von dem Ly-6-Cysteinmotiv dieser terminalen CIPs findet, umfassen ein N, das dem letzten C des Ly-6-Motives unmittelbar folgt, ein weiteres N 6 bis 8 Reste abstromig von dem letzten C des Ly-6-Motives (welches hierin als das "Verkürzungs-Asn" bezeichnet wird) und die nachfolgende Konsensussequenz, die hierin nachfolgend als die "abstromige Konsensussequenz" bezeichnet wird und welche das vorgenannte Verkürzungs-Asn an der dritten Position in der Sequenz enthält:
(L oder I) (E oder K) N (G oder I) (G oder K) (T oder R) (S oder T) (L oder I) S (K oder E oder D) K (T oder A) (V oder I oder L) (L oder V) L L (V oder L) (A oder T oder I) (P oder L) (F oder L) L (A oder V) (A oder T) A W (S oder C oder N) (L oder R oder F) (N oder P) (P oder L).
Zusätzlich zu diesen strukturellen Gemeinsamkeiten hat die Untersuchung der Ly-6-terminalen CIPs aus 1 gezeigt, daß sie die Fähigkeit gemein haben, die Aktivität von menschlichem Komplement erheblich zu hemmen. (Siehe US-Patentanmeldung Seriennummer 08/105,735 und PCT-Patentanmeldung Seriennummer PCT/US93/00672, auf die oben Bezug genommen wird). Insbesondere besaß jedes von CD59, AGMCIP, BABCIP, OWNCIP, SQMCIP und HVS-15 erhebliche inhibitorische Aktivität auf menschliches Komplement. MARCIP wurde nicht getestet, jedoch wird erwartet, daß es diese Aktivität auch besitzt.
II. Transmembrandomänen
Wie es auf dem Gebiet bekannt ist, können sich Transmembranproteine einmal oder mehrmals über die Länge ihrer Aminosäureketten durch die Membran erstrecken. Es gibt im Allgemeinen zwei verschiedene Wege, auf welche ein Transmembranprotein, das sich nur einmal durch die Membran erstreckt, in eine Membran eingebettet sein kann. Am häufigsten besitzen diese Proteine ihre einzelne Transmembrandomäne in Richtung des carboxylterminalen Endes der Polypeptidekette angeordnet und sind so ausgerichtet, daß die zu der Transmembrandomäne aminoterminale Region außerhalb der Zelle oder in einem nicht zytoplasmatischen zellulären Kompartiment liegt, und die zu der Transmembrandomäne carboxylterminale Region liegt in dem zytoplasmatischen Kompartiment. Die zweite Ausrichtung eines Transmembranproteins mit einer einzelnen membranüberspannenden Transmembrandomäne ist das Gegenteil dieser häufigen Anordnung, d. h. die zu der Transmembrandomäne aminoterminale Region liegt in dem zytoplasmatischen Kompartiment, und die zu der Transmembrandomäne carboxylterminale Region ist außerhalb der Zelle oder in einem nicht zytoplasmatischen zellulären Kompartiment angeordnet.
Andere Transmembranproteine durchqueren die Membran mehrmals. Am häufigsten besitzen eukaryontische Repräsentanten dieses Typs von Transmembranproteinen sieben aufeinanderfolgende Transmembrandomänen, von denen die meisten durch kurze hydrophile Schlaufenregionen miteinander verbunden sind.
Transmembranproteine umfassen im Allgemeinen wenigstens eine zusammenhängende Strecke von Aminosäureresten, welche in der Lipiddoppelschichtmembran liegen (nachfolgend hierin als "Membranaminosäuren" bezeichnet), und wenigstens zwei zusammenhängende Strecken von Aminosäureresten, welche sich von der Membran weg erstrecken, eine im Allgemeinen zytoplasmatisch (hierin nachfolgend als "zytoplasmatische Aminosäuren" bezeichnet) und eine im Allgemeinen extrazellulär oder abgesondert in einem nicht zytoplasmatischen zellulären Kompartiment (hierin nachfolgend als "extrazelluläre Aminosäuren" bezeichnet). Soweit hierin darauf Bezug genommen wird, umfassen zytoplasmatische Aminosäuren und extrazelluläre Aminosäuren immer wenigstens einen geladenen Aminosäurerest in unmittelbarer Nachbarschaft zu den Membranaminosäuren (hierin nachfolgend als die "erste zytoplasmatische Aminosäure" bzw. die "erste extrazelluläre Aminosäure" bezeichnet).
Membranaminosäuren sind gekennzeichnet als Gruppen von wenigstens etwa 20 Aminosäuren (dem Minimum, das im Allgemeinen zum Überspannen einer Membran benötigt wird), von denen die meisten hydrophobe (ungeladene) Aminosäuren sind. Geladene (hydrophile) Aminosäuren fehlen üblicherweise in diesen Gruppen, aber in einigen Fällen können zwei hydrophile Reste mit gegensätzlicher Ladung innerhalb der Membran nahe beieinander liegen, wo sie sich gegenseitig neutralisieren.
Transmembrandomänen, die von einer Vielzahl von Transmembranproteinen abgeleitet sind, können für die Durchführung der Erfindung verwendet werden. Jedoch können Transmembrandomänen mit zytoplasmatischen Aminosäuren, welche Cysteinreste in enger Nähre zu der erste zytoplasmatischen Aminosäure aufweisen, in geringeren Mengen auf der Zelloberfläche exprimiert werden als Transmembrandomänen, die solche Cysteine nicht enthalten. Es wird angenommen, daß diese verringerte Expression aus der Neigung dieser Cysteinreste zur Ausbildung intermolekularer Bindungen mit ähnlich plazierten Cysteinen benachbarter entstehender Transmembranproteinmoleküle resultiert. Solche intermolekularen Cysteinverknüpfungen verursachen Aggregation der entstehenden Transmembranproteine im Allgemeinen innerhalb des Golgi-Apparates (wo in der typischen Zelle neusynthetisierte Transmembranporteine prozessiert werden) und blockieren damit den Transport solcher entstehender Proteine an die Zelloberfläche.
Bezugnehmend auf die TMTCIP-Moleküle der Erfindung ist anzumerken, daß Transfektion von Säugerzellen mit einem Expressionsvektor, der ein chimäres terminales CIP kodiert, welches eine putative Transmembrandomäne von dem Herpesvirus Saimiri CCPH-Gen enthält (siehe PCT-Patentanmeldung Seriennummer PCT/US93/00672, wie oben erwähnt), nicht zu ausreichend hohen Mengen an Zelloberflächenexpressionen von terminalen CIP-Epitopen für eine Detektion durch FACS-Analyse führt (siehe Beispiel 1). Die zytoplasmatischen Aminosäuren dieser putativen Transmembrandomäne umfassen Cysteinreste, die einen Abstand von zwei und fünf Aminosäuren von der erste zytoplasmatischen Aminosäure, einem Histidin, haben. Es wird angenommen, daß das Vorhandensein dieser Cysteine für die niedrigen Niveaus der Expression, die man bezüglich dieser putativen Transmembrandomäne findet, verantwortlich sind. Aus diesem Grund sind Transmembrandomänen von diesem Typ für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung nicht bevorzugt.
Wie er hierin verwendet wird, soll der Begriff "Transmembrandomäne" folgendes umfassen: 1) den Anteil eines Transmembranproteins, welcher die Membran überspannt, d. h. die mindestens etwa zwanzig Membranaminosäuren, die normalerweise für diesen Zweck erforderlich sind, 2) die benachbarten, überwiegend geladenen zytoplasmatischen Aminosäuren innerhalb von etwa fünf bis etwa zehn Resten von den Membranaminosäuren und 3) die benachbarten, überwiegend geladenen extrazellulären Aminosäuren innerhalb von etwa fünf bis etwa zehn Resten von den Membranaminosäuren. Die benachbarten überwiegend geladenen zytoplasmatischen und extrazellulären Aminosäuren sind an der Verankerung des Proteins in er Membran beteiligt. Wie es oben diskutiert wird, umfassen bevorzugte Transmembrandomänen nicht zytoplasmatische Aminosäuren, die Cysteinreste innerhalb von fünf Aminosäuren der ersten zytoplasmatischen Aminosäure sind.
Obwohl es möglich ist, eine Proteinsequenz zu untersuchen und einen Bereich mit etwa 20 aufeinanderfolgenden hydrophoben Aminosäuren auszuwählen, enthalten einige Transmembrandomänen, wie es oben diskutiert wird, eine Anzahl hydrophiler Aminosäuren, die hier und da zwischen den vorwiegend hydrophoben Resten eingefügt sind. Dementsprechend lassen sich Transmembrandomänen effizienter durch Verwendung von Hydrophobizitätsmaßstäben zur Berechnung von Hydropathieplots identifizieren (Branden, et al., 1991).
Hydrophobizitätsmaßstäbe liefern einen Zahlenwert für die Hydrophobizität einzelner Aminosäuren. Diese Maßstäbe wurden auf der Grundlage von Löslichkeitsmessungen von Aminosäuren in verschiedenen Lösungsmitteln, Dampfdrücken von Seitenkettenanalogen, Analyse von Seitenkettenverteilungen innerhalb von löslichen Porteinen und theoretischen Energieberechnungen entwickelt (Kyte, et al., 1982; und Engelman, et al., 1986).
Hydropathieplots werden anhand von Aminosäuresequenzen unter der Verwendung von Hydrophobizitätswerten wie folgt berechnet. Zuerst wird für jede Position in der Sequenz ein hydropathischer Index berechnet. Der hydropathische Index ist der Mittelwert der Hydrophobizität der Aminosäuren innerhalb eines "Fensters" von üblicherweise 19 Resten Länge um jede Position herum. Die hydropathischen Indizes werden dann gegenüber der Aminosäuresequenzposition zur Erzeugung des Hydropathieplots aufgetragen.
Transmembrandomänen werden dann anhand der Hydropathieplots durch suchen nach Bereichen, wo der hydropathische Index hoch ist, für eine Anzahl aufeinanderfolgender Positionen in der Sequenz identifiziert, z. B. indem man nach Regionen mit breiten Peaks mit hohen positiven (d. h. hydrophoben) Werten sucht.
Hinsichtlich der vorliegenden Erfindung wird die Transmembrandomäne vorzugsweise einen hydropathischen Index von mehr als etwa +0,5 haben, wobei man den Maßstab von Kyte et al. (Kyte et al., 1982) und ein Fenster von 19 Aminosäuren über eine Region von wenigstens etwa 12 Aminosäureresten verwendet.
Zusätzliche angrenzende Aminosäuren des Transmembranproteins können in den chimären Molekülen der Erfindung enthalten sein oder von diesen kodiert werden, vorausgesetzt, daß solche zusätzlichen Aminosäuren das Eindringen der Transmembrandomäne in die Membran, den Transport des entstehenden chimären Proteins zu der Zelloberfläche oder die komplementhemmende Aktivität des terminalen CIP-Bereiches des chimären Moleküls nicht wesentlich beeinträchtigen.
Obwohl die Moleküle der vorliegenden Erfindung mit jeder funktionalen Transmembrandomäne aufgebaut sein können, ist eine aus einem Protein mit nur einer einzelnen Transmembrandomäne, das den Carboxylterminal zu dessen Transmembrendomäne angeordneten Bereich in dem Zytoplasma hat, bevorzugt. Eine große Anzahl solcher Proteine wurde in der Literatur beschrieben, einschließlich der folgenden: CD46; die Haupthistokompatibilitätsantigene und verwandte Transmembranproteine der Immunglobobulinmultigensuperfamilie, einschließlich interzellulärer Anheftungsmoleküle, wie ICAM-1 (CD54), ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1, PECAM-1 (CD31) und HCAM (CD44); die Selektine, einschließlich E-Selektin, L-Selektin und P-Selektin (CD62); die Amyloidvorläuferproteine von Alzheimer; der Insulinrezeptor; der Epidermiswachstumsfaktorrezeptor; das gp41-Protein des Aidsvirus HIV; die p21-Proteine von HTLV1 und HTLV2; und die p15E-Proteine der Nager- und Katzenleukämieviren.
TM-Domänen, die von irgendeinem dieser Proteine sowie von anderen Transmembranproteinen abgeleitet sind, können zu Durchführung der Erfindung verwendet werden. Diese Domänen können am einfachsten verwendet werden, indem man das gesamte Carboxylende des Transmembranproteins, beginnend bei einem Punkt aufstromig von der Transmembrandomäne, in das chimäre Molekül aufnimmt. Eine besonders bevorzugte TM-Domäne ist diejenige, welche die Aminosäuren 294 bis 326 von CD46 (MCP, SEQ ID NO: 8) darstellt. Diese Domäne kann bequem zusammen mit den Aminosäuren 327 bis 350 verwendet werden, welche das Carboxylende des CD46-Proteins abstromig von der Transmembrandomäne dieses Moleküls umfaßt, und zusammen mit den Aminosäuren 270 bis 293 aufstromig der TM-Domäne, welche das Eindringen der CD46-TM-Domäne in Zellmembrane nicht stören und, wie es nachfolgend gezeigt wird, die komplementhemmende Aktivität von Ly-6-terminalen CIPs nicht hemmen.
Zusätzlich zur Verwendung von Hydropathieplots zur Identifizierung von TM-Domänen, die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können solche Domänen auch biochemisch identifiziert werden unter Verwendung von zum Beispiel Proteaseverdautechniken oder durch Herstellen von chimären Proteinen, die lösliche Proteine enthalten, welche funktionsfähig mit Signalsequenzen verknüpft sind, und die putative Transmembrandomänen enthalten, und durch Untersuchen der chimären Proteine hinsichtlich Membraneindringung.
III. TMTCIP-Gene und Vektoren, die solche Gene enthalten
Die Isolierung, Verkürzung und Fusion der Nukleinsäurefragmente, die das terminale CIP und die TM-Domäne kodieren, werden unter Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuretechniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt, einschließlich: PCR-Erzeugung der gewünschten Fragmente und/oder Restriktionsverdau von klonierten Genen, PCR-Fusion der gewünschten Fragmente oder enzymatische Ligation von Restriktionsverdauprodukten (Sambrook, et al., 1989, und Ausubel et al., 1992). Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle, welche die TMTCIPs der Erfindung kodieren, oder einige oder alle der Nukleinsäurefragmente, die zum Zusammensetzen der chimären Gene für die TMTCIPs verwendet werden, auf chemischen Wege synthetisiert werden (Talib et al., 1991).
Die chimären Gene der Erfindung werden hergestellt durch 1) Verkürzung der Nukleinsäuresequenz für Ly-6-terminales CIP zur Entfernung ausgewählter Aminosäurereste abstromig zu dem Ly-6-Motiv, um die normale GPI-Signalsequenz zu inaktivieren, und 2) Fusionieren der verkürzten Sequenz mit einer Sequenz, die eine ausgewählte TM-Domäne und gewünschte Aminosäuren, welche die TM-Domäne umgeben, kodiert.
Die Verkürzung der Nukleinsäuresequenz, die das Ly-6-terminale CIP kodiert, wird wenigstens einige der carboxylterminalen Aminosäurereste abstromig zu dem Asn, welches zwischen 6 und 8 Aminosäureresten hinter dem letzten (zehnten) Cys des Ly-6-Motivs angeordnet ist, entfernen. Dieses Asn ist auch an der dritten Position in der abstromigen Konsensussequenz, die oben angegeben ist, lokalisiert, d. h. es ist das Verkürzungs-Asn, wie es oben definiert ist. Alle bekannten Ly-6-terminalen CIPs umfassen solch ein Verkürzungs-Asn.
In einigen Fällen werden sämtliche der Aminosäurereste nach dem Verkürzungs-Asn entfernt. Alternativ können weniger als alle entfernt werden, wobei das Kriterium ist, daß eine ausreichende Anzahl an Resten entfernt wird, so daß die GPI-Signalesequenz funktionsunfähig ist. Im Allgemeinen besteht der einfachste Ansatz darin, alle Aminosäurereste abstromig zu dem Verkürzungs-Asn zu entfernen. Wenn es erwünscht ist, kann sich die Verkürzung weiter aufstromig von dem Verkürzungs-Asn erstrecken, wobei sie vorzugsweise an einem Punkt abstromig von dem letzten Cys des Ly-6-Motivs beginnt. Verkürzungen, die aufstromig von dem letzten Cys des Ly-6-Motivs beginnen, sind im Allgemeinen nicht bevorzugt, aber sie können verwendet werden, wenn es erwünscht ist. Das Kriterium für Verkürzungen aufstromig von dem Verkürzungs-Asn ist das Erfordernis, daß das TMTCIP mehr als 50% der komplementhemmenden Aktivität des elterlichen (nativen) Ly-6-terminalen CIP aufweist.
Hinsichtlich der Ly-6-terminalen CIPs aus 1 umfasst die bevorzugte Verkürzung sämtliche der Aminosäuren abstromig von Asn 77 von BABCIP (SEQ ID NO: 1), Asn 75 von AGMCIP (SEQ ID NO: 2), Asn 80 von SQMCIP (SEQ ID NO: 3), Asn 77 von OWMCIP (SEQ ID NO: 4), Asn 77 von MARCIP (SEQ ID NO: 5), Asn 77 von HVS-15 (SEQ ID NO: 6), und Asn 77 von CD59 (SEQ ID NO: 7). Unter diesen Ly-6-terminalen CIPs ist CD59 bevorzugt. Wie es oben diskutiert wird, stammt eine bevorzugte TM-Domäne aus CD46. Dementsprechend umfaßt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Reste 1 bis 77 von CD59 (SEQ ID NO: 7), fusioniert mit den Aminosäuren 270 bis 350 von CD46 (SEQ ID NO: 8).
Zusätzlich zu dem Vorgenannten liefert die vorliegende Erfindung rekombinante Expressionsvektoren, welche Nukleinsäurefragmente enthalten, die chimäre TMTCIPs der Erfindung kodieren. Das Nukleinsäuremolekül, das für solch ein chimäres Protein kodiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingesetzten proteinkodierenden Sequenz enthält. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch von den Genen, die zum Aufbau der Fusionsgene der Erfindung, und/oder deren flankierenden Bereichen geliefert werden.
Die Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen für Expressionsvektorsysteme, die zur Steuerung der Expression in Vertebratenzellen zu verwenden sind, können durch virale Quellen bereitgestellt werden. Zum Beispiel sind allgemein verwendete Promotoren und Verstärker erhältlich von Polyoma-Virus, Adenovirus, Simian-Virus 40 (SV40), dem Molony-Nagerleukämievirus (MMLV), einschließlich der langen terminalen Wiederholung (MMLV-LTR), und humanem Cytomegalovirus (CMV), einschließlich dem Promotor und Verstärker des frühen Gens 1 von Cytomegalovirus. Retrovirale Expressionsvektoren sind ein bevorzugtes System zur Expression der TMT-CIPs der Erfindung.
Die Manipulation von retroviralen Nukleinsäuren zum Aufbau retroviraler Vektoren und von verpackenden Zellen erreicht man unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind. Siehe Ausubel et al., 1992, Band 1, Abschnitt III (Einheiten 9.10.1 bis 9.14.3); Sambrook et al., 1989; Miller et al., 1989; Egilitis et al., 1988; US-Patente Nummern 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767 und 5,124,263; sowie PCT-Patentveröffentlichungen Nummern WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829 und WO 93/14188.
Speziell können die retroviralen Vektoren der Erfindung wie folgt hergestellt und verwendet werden. Zuerst wird ein retroviraler Vektor mit TMTCIP konstruiert und in nichtinfektiöse, transduzierende virale Partikel (Virionen) unter Verwendung eines amphotropischen Verpackungssystems, vorzugsweise eines solchen, das zur Verwendung in Gentherapieanwendungen geeignet ist, verpackt.
Beispiele für solche Verpackungssysteme findet man zum Beispiel bei Miller et al., 1986; Markowitz et al., 1988; Cosset et al., 1990; und in den US-Patenten Nummern 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767 und 5,124,263; und PCT-Patentveröffentlichungen Nummern WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829 und WO 93/14188. Eine bevorzugte Verpackungszelle ist die PA317-Verpackungszelllinie (ATCC CRL 9078).
Die Erzeugung von "Herstellerzellen" erreicht man durch Einbringen von retroviralen Vektoren in die Verpackungszellen. Beispiele für solche retroviralen Vektoren findet man zum Beispiel in Korman et al., 1987; Morgenstern et al., 1990; US-Patenten Nummern 4,405,712, 4,980,289 und 5,112,767; und PCT-Patentveröffentlichungen Nummern WO 85/05629, WO 90/02797 und WO 92/07943. Ein bevorzugter retroviraler Vektor ist der von MMLV abgeleitete Expressionsvektor pLXSN (Miller et al., 1989). Der bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendete retrovirale Vektor wird so modifiziert sein, daß er das chimäre Gen, welches das TMTCIP kodiert, enthält.
Die Herstellerzellen, die nach dem vorgenannten Verfahren erzeugt werden, werden zur Herstellung der retroviralen Vektorpartikel (Virionen) verwendet. Dies erreicht man durch kultivieren der Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium. Vorzugsweise werden die Virionen aus der Kultur geerntet und den zu transduzierenden Zielzellen verabreicht, z. B. xenogenen Zellen, die für eine Transplantation in einen Patienten verwendet werden sollen, dessen Komplement durch Ly-6-terminalen CIP des TMTCIP gehemmt werden kann, Zellen eines xenogenen Organs, das zur Transplantation in solch einen Patienten verwendet werden soll, die eigenen Zellen des Patienten und andere Zellen, die vor Komplementangriff geschützt werden sollen, sowie Stammzellen, wie nichtmenschliche embryonische Stammzellen, die zur Erzeugung transgener Zellen, Gewebe oder Organe zur Transplantation verwendet werden können. Alternativ können die Zielzellen, wenn es praktikabel ist, mit den Herstellerzellen gemeinsam kultiviert werden. Geeignete Puffer und Bedingungen für eine stabile Lagerung und anschließende Verwendung der Virionen kann man zum Beispiel bei Ausubel et al., 1992, finden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die retroviralen Vektorpartikel der Erfindung enthalten, können in einer Vielzahl von Dosiseinheitsformen verabreicht werden. Die Dosis wird entsprechend z. B. dem speziellen Vektor, der Art und Weise der Verabreichung, der speziellen Krankheit, die behandelt wird, und deren Schwere, der gesamten Gesundheit und dem Zu stand und Alter des Patienten, dem Zustand der Zellen, die behandelt werden, und der Beurteilung des Arztes variieren. Dosismengen für eine Transduktion von Säugerzellen liegen im Allgemeinen zwischen etwa 10⁶ und 10¹⁴ koloniebildenden Einheiten von retroviralen Vektorpartikeln pro Behandlung.
Eine Vielzahl pharmazeutischer Formulierungen kann für eine Verabreichung der retroviralen Vektorpartikel der Erfindung verwendet werden. Geeignete Formulierungen findet man zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Auflage, 1985, und werden einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfassen, wie Kochsalzlösung, gepufferte (z. B. phosphatgepufferte) Kochsalzlösung, Hank-Lösung, Ringer-Lösung, Dextrose/Kochsalzlösung, Glukoselösungen und ähnliche. Die Formulierungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, soweit es erforderlich ist, wie tonizitätseinstellende Mittel, Benetzungsmittel, bakterizide Mittel, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel und ähnliche.
IV. Transgene Tiere
Gemäß bestimmter Gesichtspunkte der Erfindung werden die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung manipulierter, nichtmenschlicher transgener Tiere verwendet (z. B. Nager, z. B. Maus, Ratte, Wasserschwein und ähnliche, Lagomorph, z. B. Kaninchen, Hase und ähnliche, Huftier, z. B. Schwein, Kuh, Ziege, Schaf und ähnliche etc.), welche die TMTCIPs der Erfindung auf den Oberflächen ihrer Zellen (z. B. Endothelzellen) exprimieren, wobei Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Diese Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mikroinjektion, z. B. von Vorkernen, Elektroporation von Eizellen oder Zygoten, Kerntransplantation und/oder die stabile Transfektion oder Transduktion von embrionischen Stammzellen, die von dem ausgewählten Tier abgeleitet sind.
Ein gemeinsames Element dieser Techniken umfaßt die Herstellung einer transgenen Transkriptionseinheit. Solch eine Einheit umfaßt ein DNA-Molekül, welches im Allgemeinen folgendes enthält: 1) einen Promotor, 2) die interessierende Nukleinsäuresequenz, d. h. die Sequenz, welche das TMTCIP der vorliegenden Erfindung kodiert, und 3) eine Polyadenylierungssignalsequenz. Andere Sequenzen, wie Verstärker- und Intronsequenzen, können enthalten sein, wenn es erwünscht ist. Die Einheit kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden, indem man ein Restriktionsfragment eines Plasmidvektors, welcher das TMTCIP-Protein in z. B. Säugerzellen exprimiert, isoliert. Vorzugsweise ist das Restriktionsfragment frei von Sequenzen, welche Replikation in bakteriellen Wirtszellen steuern, da solche Sequenzen dafür bekannt sind, daß sie schädliche Auswirkungen auf die Embryonenüberlebensfähigkeit haben.
Das bekannteste Verfahren zur Herstellung transgener Tiere ist dasjenige, das zur Herstellung transgener Mäuse durch Superovulation eines Donorweibchens, chirurgische Entfernung des Eis, Injektions der Transgen- Transkriptionseinheit in den Vorkern des Embryos und Einbringen des transgenen Embryos in den Fortpflanzungstrakt einer pseudoschwangeren Wirtsmutter, üblicherweise der gleichen Spezies, verwendet wird. Siehe Wagner, US-Patent Nummer 4,873,191, Brinster et al., 1985, Hogan et al., 1986, Robertson 1987, Pedersen et al., 1990.
Die Verwendung dieses Verfahrens wird von den Fachleuten auf dem Gebiet auch in breitem Maße zur Herstellung von transgenem Vieh eingesetzt. Als ein Beispiel werden transgene Schweine routinemäßig durch die Mikroinjektion einer Transgen- Transkriptionseinheit in Schweineembryonen hergestellt. Siehe zum Beispiel PCT-Veröffentlichung Nummer WO92/11757. Kurzgefaßt kann dieses Verfahren zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden.
Zuerst wird die Transgen- Transkriptionseinheit über ein Gel isoliert und durch zum Beispiel eine ELUTIP-Säule (Schleicher & Schuell, Keene, NH) ausgiebig gereinigt, gegen pyrogenfreien Injektionspuffer dialysiert (10 mM Tris, pH 7,4, + 0,1 mM EDTA in pyrogenfreiem Wasser) und zur Embryoneninjektion verwendet.
Embryonen werden aus dem Eileiter einer hormonell synchronisierten, bezüglich Ovulation induzierten Sau, vorzugsweise im Vorkernstadium, gewonnen. Sie werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, welches etwa 0,5 ml Embryonentransfermedium (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% fötalem Kälberserum) enthält, gegeben. Diese werden für 12 Minuten bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Embryonen werden aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer ausgezogenen und polierten Pasteur-Pipette abgenommen und in eine 35 mm Petrischale zur Untersuchung gegeben. Wenn das Zytoplasma mit Lipid noch trübe ist, so daß die Vorkerne nicht klar sichtbar sind, werden die Embryonen erneut für weitere 15 Minuten zentrifugiert. Embryonen, die mikroinjiziert werden sollen, werden in einem Tropfen Medium (etwa 100 μl) in die Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale plaziert. Zur Abdeckung dieses Tropfens und zum Füllen des Deckels zur Verhinderung, daß das Medium verdampft, wird Silikonöl verwendet. Der Petrischalendeckel, welcher die Embryonen enthält, wird auf ein Inversionsmikroskop gesetzt, das sowohl mit einer Heizbühne (37,5–38°C) als auch einer Hoffman-Modulation-Konstrastoptik (200 × Endvergrößerung) ausgerüstet ist. Eine fein ausgezogene und polierte Mikropipette wird zur Stabilisierung der Embryonen verwendet, während etwa 1–2 Pikoliter Injektionspuffer, der etwa 200–500 Kopien der gereinigten Transgen- Transkriptionseinheit enthält, in den Kern, vorzugsweise den männlichen Vorkern, mit einer anderen fein ausgezogenen und polierten Mikropipette ausgeliefert werden. Embryonen, die das Mikroinjektionsverfahren überleben, was durch morphologische Betrachtung beurteilt wird, werden in ein Polypropylenröhrchen (2 mm ID) zur Überführung in die pseudoschwangere Empfängersau gegeben.
Nachkommen werden hinsichtlich des Vorhandenseins des Transgens durch Isolieren von genomischer DNA aus Gewebe, das vom Schwanz eines jeden Ferkels entnommen wurde, und Unterziehen von etwa 5 Mikrogramm dieser genomischen DNA einer Nukleinsäurehybridisierungsanalyse mit einer transgenspezifischen Sonde getestet.
Eine weitere allgemein verwendete Technik zur Erzeugung nichtmenschlicher trangsgener Tiere umfaßt die genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), wie es in der PCT-Patentveröffentlichung Nummer WO 93/02188 und bei Robertson, 1987, beschrieben ist. Gemäß dieser Technik werden ES-Zellen, wie es zum Beispiel bei Robertson, 1987, und in dem US-Patent Nummer 5,166,065 von Williams et al. beschrieben ist, gezüchtet. Genetisches Material wird in die embryonalen Stammzellen eingebracht durch zum Beispiel Elektroporation zum Beispiel nach dem Verfahren von McMahon et al., 1990, oder durch Transduktion mit einem retroviralen Vektor zum Beispiel nach dem Verfahren von Robertson et al., 1986, oder nach einer der verschiedenen Techniken, die von Lovell-Badge, 1987, beschrieben werden.
Chimäre Tiere werden erzeugt, wie es zum Beispiel bei Bradley, 1987, beschrieben ist. Kurzgefaßt werden genetisch modifizierte, nichtmenschliche ES-Zellen in Blastozysten eingebracht, und die modifizierten Blastozysten werden dann in pseudoschwangere, nichtmenschliche weibliche Tiere implantiert. Chimäre werden unter den Nachkommen zum Beispiel durch die Beobachtung von Mosaikschichtfärbung, die aus Unterschieden in dem Stamm, der zur Verwendung der ES-Zellen verwendet wird, und dem Stamm, der zur Herstellung der Blastozysten verwendet wird, resultiert, und unter Herstellung nichtchimärer transgener Tiere gezüchtet.
Andere Verfahren für die Herstellung von transgenen Tieren sind in dem US-Patent Nummer 5,032,407 von Wagner et al., und der PCT-Veröffentlichung Nummer WO 90/08832 offenbart.
Neben anderen Anwendungen sind transgene Tiere, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, als Modellsysteme zum Testen der Xenotransplantation von deren manipulierten Geweben oder Organen und als Quellen für manipulierte Gewebe oder Organe für die Xenotransplantation geeignet. Die Expression funktionaler TMTCIPs auf den Oberflächen von Endothelzellen und/oder anderen Zelltypen in den Geweben und Organen (z. B. hormonproduzierenden Zellen, wie solchen in den Pankreasinseln) der transgenen Tiere wird einen erhöhten Schutz für diese Zellen, Gewebe und Organe vor hyperakuter, komplementvermittelter Abstoßung nach Xenotransplantation in Empfängertieren, z. B. Menschen, deren Komplement durch das Ly-6-terminate CIP des TMTCIP gehemmt werden kann, liefern. Zusätzlich zu deren Verwendung bei der Herstellung von Organen für die Transplantation können die TMTCIP-Nukleinsäurekonstrukte der Erfindung auch zur Manipulation kultivierter Zellen (z. B. Endothelzellen) verschiedener Spezies für eine anschließende Verwendung in der Transplantation verwendet werden.
V. Repräsentative Modifikationen
Obwohl spezielle Ausführungsformen der Erfindung hierin beschrieben und erläutert werden, ist es klar, daß Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Gedanken und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Zum Beispiel können die primären Aminosäurestrukturen der TMTCIPs der Erfindung modifiziert werden, indem man Animosäuresubstitutionen oder Nukleinsäuremutationen erzeugt. Wenigstens etwas komplementregulierende Aktivität sollte nach solchen Modifikationen erhalten bleiben. In gleicher Weise sind Nukleinsäuremutationen, welche die Aminosäuresequenzen nicht verändern, z. B. Veränderungen des dritten Nukleotids in degenerierten Kodons, vom Umfang der Erfindung erfaßt. Ebenfalls eingeschlossen sind Sequenzen, die Veränderungen enthalten, die man als natürlich vorkommende allelische Varianten der CIP- und TM-Gene, die zur Erzeugung der TMTCIPs verwendet werden, findet.
Ohne hierdurch in irgendeiner Weise eine Beschränkung zu beabsichtigen, wird die vorliegende Erfindung anhand der nachfolgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
Beispiel 1
Expressionsvektoren und retrovirale Virionenpartikel, die ein CD59/MCP TMTCIP enthalten
Eine Transmembranform von CD59 (CD59-TM) wurde gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert, indem die carboxylterminale Region, die das GPI-Ankersignal von CD59 enthält, gegen die carboxylterminale Region, einschließlich der Transmembrandomäne, von MCP (CD46) ausgetauscht wurde. Ein etwa 314 Bp Restriktionsfragment (hierin nachfolgend als CD59₇₇ bezeichnet), das CD59 enthielt, welches an dem „Verkürzungs-Asn", welches oben beschrieben ist, d. h. Aminosäure 77 des reifen Proteins, verkürzt war, wurde durch Verdau des Plasmides pCD59/CCPH (siehe unten) mit SspI und BamHI hergestellt.
Der Carboxylterminus von CD46 wurde mittels PCR unter Verwendung von revers transkribierter HeLa-Zell-mRNA als Vorlage und der nachfolgenden Primer vervielfältigt: 5'-CGCGAGGCCT ACTTACAAGC CTCCAG-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-CGCGCTATTC AGCCTCTCTG CTCTGC-3' (SEQ ID NO: 10). Diese Oligonukleiotide vervielfältigten ein Fragment, das die Aminosäuren 270–350 des reifen CD46-Proteins kodieren, ein Bereich, von dem früher gezeigt wurde, daß er eine funktionale Transmembrandomäne enthält (Lublin et al., 1991). Das etwa 250 Bp Fragment, das durch diese PCR-Reaktion hergestellt wurde, wurde in einen Plasmidvektor unter Verwendung des T/A-Klonierungskit (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert. Der in diesem Kit enthaltene Plasmidvektor pCRII diente als der Empfänger, und das resultierende Plasmidkonstrukt wurde in E. coli vervielfältigt und gereinigt. Die MCP-Insertion wurde anschließend sequenziert, um zu bestätigen, daß das Plasmid die in SEQ ID NO: 11 gezeigte Sequenz enthielt.
Eine endogene StuI-Schnittstelle, die man an dem 5'-Ende des CD46-PCR-Fragments findet, wurde dazu verwendet, diese Domäne an die SspI-Schnittstelle an dem 3'-Ende von CD59₇₇ in dem eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) unter Erhalt des Plasmides pcDNA3/CD59-MCP-TM (ATCC-Bezeichnung 69530) zu ligieren.
Das resultierende Konstrukt wurde mit EcoRI linearisiert, die ungepaarten Enden wurden aufgefüllt, und BamHI-Verbindungsstücke (#1071, New England Biolabs, Tozer, MA) wurden an die erhaltenen stumpfen Enden ligiert. Dieses verknüpfte Konstrukt wurde mit BamHI verdaut, und das freigesetzte Fragment wurde in die BamHI-Schnittstelle des retroviralen Vektors pLXSN (Miller et al., 1989) unter Erhalt von pL-CD59-MCP-TM-SN subkloniert. Konstrukte mit der korrekten Orientierung für eine Expression wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert und durch Sequenzierung bestätigt.
Ein DNA-Fragment, das den Carboxylterminus des CCPH-Gens kodiert, wurde durch PCR-Vervielfältigung unter Verwendung des Plasmides pKS-/mCCPH (ATCC-Bezeichnung 69178) als Vorlage und die folgenden Primer hergestellt: 5'-CCGGACCTGT GTAACTTTAA CGAACAGCTT GAAAATATTG GTAGGATATG CAATGGAAAT TGTTACAAC-3' (SEQ ID NO: 12) und 5'-TAGTTACTGC CCGGACATGC-3' (SEQ ID NO: 13). Wie es oben für das MCP-PCR-Fragment beschrieben ist, wurde das etwa 250 Bp CCPH-PCR-Produkt in das Plasmid pCRII unter Erhalt des Plasmides pCRII/CCPH kloniert, und die CCPH-Insertion wurde sequenziert, um zu bestätigen, daß das Plasmid die gewünschte Sequenz enthielt, in diesem Fall SEQ ID NO: 14.
Das pCRII/CCPH-Plasmid wurde dann mit AvaII und EcoRI verdaut, und das Insertionsfragment wurde gereinigt und in einer Drei-Wege-Ligationsreaktion mit dem mit BamHI und EcoRI geschnittenen Plasmid pcDNA/AMP (Invitrogen) und einem 300 Basenpaare langen BamHI-AvaII-Fragment, das aus einem CD59-cDNA-Konstrukt der vollen Länge in pUC19 isoliert worden war (Philbrick et al., 1990), subkloniert. Das Produkt dieser Drei-Wege-Ligation wird hierin als das Plasmid pCD59/CCPH bezeichnet.
Dieses Plasmid wurde in Balb-3T3-Zellen transfiziert, und die Zellen wurden hinsichtlich Zelloberflächenexpression von CD59-Epitopen durch indirekte Immunfluoreszenz, wie es unten in Beispiel 2 beschrieben ist, untersucht. Wie es oben diskutiert wird, enthält die putative TM-Domäne von CCPH zwei zytoplasmatische Aminosäuren innerhalb von fünf Aminosäuren von der ersten zytoplasmatischen Aminosäure, die Cysteinreste sind, eine Charakteristik, von der man annimmt, daß sie zu niedrigen Niveaus an Zellexpression führt. Zelloberflächenexpression von CD59-Epitopen lag tatsächlich unterhalb der durch den Test der indirekten Immunfluoreszenz detektierbaren Mengen.
Kontrollvektoren
CD59 der vollen Länge, welches das GPI-Ankersignal enthielt (CD59-GPI), wurde in mit BamHI-EcoRI verdauten pcDNA3 (Invitrogen) als ein BamHI-EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pc8-hCD59-103 (ATCC-Bezeichnung 69231) unter Erhalt des Plasmides pcDNA3-CD59-GPI kloniert.
Retrovirales Vektorplasmid pL-CD59-GPI-SN wurde hergestellt, in dem man ein etwa 1100 Bp EcoRI-Fragment aus einem CD59-cDNA-Konstrukt der vollen Länge in pUC19 (Philbrick et al., 1990) isolierte und dieses Fragment in das Plasmid pLXSN ligierte. Konstrukte mit der korrekten Orientierung für eine Expression wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert.
Amphotrope Virusproduktion
Amphotropes Virus wurde durch eine zwischenzeitlich ecotrope Verpackungszellinie hergestellt, wie bei Warrren et al., 1987. Kurzgesagt wurden psi 2-Zellen (erhalten von Dr. Stephen L. Warrren, Department of Pathology, Yale University School of Medicine, New Haven, CT) mit pLXSN oder den pLXSN-Konstrukten, die oben beschrieben sind, d. h. pL-CD59-MCP-TM-SN oder pL-CD59-GPI-SN, unter Anwendung von DMSO-Schock, gefolgt von Selektion in DMEM, das 500 μg/ml (aktives) G418 und 10% hitzeinaktiviertes FCS enthielt, transfiziert. Transfektanten wurden vereinigt, und ein 24 Stunden-Überstand wurde von den Zellen bei 90% Konfluenz geerntet. Der ecotropische Virenstamm wurde zum Infizieren der amphotropen Verpackungszellinie PA317 (ATCC-Bezeichnung CRL 9078) verwendet. Diese Zellen wurden auch in dem gleichen Medium mit G418 selektiert, woraufhin ein Viren stamm von vereinigten Transduktanden in dem gleichen Medium ohne G418 gesammelt wurde.
Beispiel 2
Expression des CD59/MCP TMTCIP durch Säugerzellen
Zellen der Mausfibroblastenzellinie Balb/3T3 (ATCC-Bezeichnung CCL 163) wurden stabil mit pcDNA3-CD59-GPI, pcDNA3/CD59-MCP-TM oder pcDNA3 alleine unter Verwendung der Kalziumphosphatmethode (Ausubel et al., 1992) transfiziert. Die Zellen wurden in DMEM, das 10% hitzeinaktiviertes FCS und 500 μg/ml G418 (aktiv) enthielt, selektiert, und Kolonien wurden unter Verwendung eines Klonierungszylinders isoliert.
Maus-L-Zellen wurden von Dr. Peter Cresswell, Immunobiology Department, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, erhalten. Diese Maus-L-Zellen waren nicht in der Lage, GPI-verankerte Proteine zu exprimieren (Ferguson et al., 1988). L-Zellen wurden mit den amphotropen Virusüberständen, die unter Verwendung von pL-CD59-GPI-SN, pL-CD59-MCP-TM-SN oder pLXSN alleine erhalten worden waren, transfiziert, in dem 1 ml der Virusstammlösung zu 5 × 10⁵ L-Zellen in Medium, das 8 μg/ml Polybren enthielt, hinzugefügt wurde. Nach einer Inkubation über Nacht wurde Medium, das 500 μg/ml G418 enthielt, hinzugegeben und die Selektion für 14 Tage fortgesetzt. Transduzierte L-Zellen wurden selektiert und als ein Pool analysiert. Gegen G418 resistente Zellen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von CD59-Antigenen auf der Zelloberfläche durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung monoklonaler und polykionaler Antikörperpräparationen untersucht. Eine polyklonale Kaninchen-Anti-CD59-Antikörperpräparation, #349, die durch Injektion von Kaninchen mit CD59, das aus menschlichen Erythrozyten gereinigt worden war, wie es von Sims et al., 1989 beschrieben wird, wurde von Dr. Peter Sims (Blood Research Institute, Milwaukee, WI) bereitgestellt. Der Anti-CD59-mAb, MEM-43, wurde von Biodesign International, Kennebunkport, ME, bezogen.
Indirekte Zelloberflächenimmunfluoreszenzanalyse wurde typischenwreise an 2,5 × 10⁵ Zellen mit 50 μg/ml des primären polyklonalen Antikörpers oder 20 μg/ml des monoklonalen Antikörpers in 1 × PBS, das 2% fötales Rinderserum enthielt, durchgeführt. Mit FITC konjugierte Antiseren Ziege-Anti-Kaninchen-IgG oder Ziege-Anti-Maus-IgG wurden als sekundäre Antikörper verwendet (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines FACSort-Instrumentes gemessen (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA).
2 zeigt Zelloberflächenexpressionsprofile eines positiven Balb/3T3-Klons, der CD59-TM exprimiert, sowie einer nativen menschlichen CD59 (CD59-GPI)-Transfektande als eine positive Kontrolle und einer Transfektande mit einem Vektor (pcDNA3) ohne Insertion (Vektorkontrolle) als eine Negativkontrolle. Wie es darin gezeigt ist, band im wesentlichen die gleiche Menge an Anti-CD59-Antikörper an die Oberflächen von Zellen, die das CD59-TM-Fusionsprotein exprimierten, wie an die Zellen der Positivkontrolle banden, die natives CD59 exprimierten. Dieses Ergebnis zeigt, daß äquivalente Mengen an CD59-Antigenen auf den Balb/3T3-Zellen der Erfindung (CD59-TM) und denjenigen der Positivkontrolle (CD59-GPI) vorhanden waren.
Die vereinigten L-Zell-Transfektanden zeigten einen weiten Bereich an CD59-TM-Expression, während, wie erwartet, in Zellen, die GPI-verankterte Proteine nicht exprimieren können, CD59-GPI nicht exprimiert wurde (3).
Beispiel 3
In Säugerzellen exprimiertes TMTCIP wird durch Verdau mit Phosphatidylinositol-Phospholipase C nicht beeinflußt
Zur Untersuchung hinsichtlich des Vorhandenseins eines GPI-Ankers wurden Zellen mit Phosphatidylinositol-Phospholipase C (PI-PLC, Boehringer-Mannheim Corporation, Biomedical Products Division, Indianapolis, Indiana) mit 1 U/ml für eine Stunde bei 37°C vor der FACS-Analyse behandelt. Diese Behandlung hydrolisiert (spaltet) GPI-Anker und setzt somit GPI-verankerte Proteine von der Zelloberfläche frei. PI-PLC-Verdau wurde an Balb/3T3-Zellen, die CD59-TM-TMTCIP (oder CD59-GPI als eine Kontrolle) exprimierten, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 4 dargestellt. In diesen Experimenten behielten zum Schein behandelte Zellen (kein PI-PLC) das TMTCIP und natives CD59 auf ihren Zelloberflächen (siehe Kurve D in 4A und 4B), wogegen PI-PLC-Behandlung zum Verlust von Zelloberflächen-CIPs bei den Kontrollzellen mit nativem CD59 (siehe Kurve C in 4A) aber nicht bei den CD59-TM-Zellen (siehe Kurve C in 4B) führte. Diese Experimente zeigen, daß CD59-TM nicht durch eine GPI-Verknüpfung an der Zellmembran verankert ist und daß CD59-TM gegen die Wirkung von Lipaseenzymen, die einen Glycosyl-Phosphatidylinositol (GPI)-Anker spalten können, im wesentlichen resistent sind.
Beispiel 4
Funktionsanalyse von CD59-TM in Mauszellen
Die funktionale Aktivität von TMTCIP-Molekülen, die in transfizierten Maus-Balb/3T3-Zellen und transduzierten Maus-L-Zellen exprimiert wurden, wurde mittels eines Farbfreisetzungstests untersucht, der in der Messung des Ausflusses von Molekülen aus dem Zytoplasma, speziell des zytoplasmatischen Indikatorfarbstoffs Calcein AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) bestand.
Transfizierte Zellen, die CD59-TM-TMTCIP exprimierten, sowie Zellen, die mit den Elternexpressionsvektoren ohne CD59-TM-kodierenden Insertionen (als Kontrollen) transfiziert waren, wurden in 96-Well-Platten bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit 200 μl eingestellter Hank-Salzlösung, die 10 mg/ml Rinderserumalbumin (HBSS/BSA) enthielt, gewaschen.
Calcein AM wurde hinzugefügt (10 μM Endkonzentration), und die Platten wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um den Farbstoff von den Zellen aufnehmen und durch zelluläre Esterasen in ein polares Fluoreszenzderivat, das in unbeschädigten Zellen zurückgehalten wird, umwandeln zu lassen. Die Wells wurden dann zweimal mit HBSS/BSA zur Entfernung von außerhalb der Zellen verbliebenem Farbstoff gewaschen. Die Zellen wurden dann mit Anti-Balb/3T3-IgG (2 mg/ml in HBSS/BSA), welches als ein Aktivator des klassischen Komplementweges diente, inkubiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 23°C wurde ungebundenes IgG weggewaschen.
Die Zellen wurden dann bei 37°C für 30 Minuten in der Gegenwart von menschlichem, von C8 abgereichertem Serum, das mit gereinigtem C8 und C9 versetzt war, inkubiert, damit komplementvermittelte Schädigung auftreten konnte. Menschliches, von C8 abgereichertes Serum sowie gereinigtes C8 und C9 wurden von der Quidel Corporation, San Diego, CA, erhalten. Das Medium, in dem die Zellen schwammen, wurde dann auf eine saubere 96-Well-Platte für die Fluoreszenzmessung überführt.
Unter den Bedingungen dieses Tests wird das polare Fluoreszenzderivat von Calcein AM nur in das Medium, in dem die Testzellen schwimmen, freigesetzt, wenn die Integrität der Zellmembranen beeinträchtigt ist. Daher liefert die Fluoreszenz von Calcein AM, das in das Medium freigesetzt wird, in welchem die Testzellen schwimmen, gegenüber demjenigen, das in den Zellen zurückgehalten wird, ein indirektes aber genaues Maß für die Höhe an komplementvermittelter Schädigung, welche die Zellen erfahren. Restlicher, zellgebundener Farbstoff wurde anhand eines Lysates mit 1% SDS der Zellen, die in den 96-Well-Kulturplatten enthalten waren, bestimmt. Dies erlaubte die Berechnung des Prozentsatzes an Farbstoftreisetzung unter Verwendung der folgenden Formeln: Gesamt = freigesetzt + zurückgehalten und%-Freisetzung = (freigesetzt gesamt) × 100. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Millipore CYTOFLUOR 2350-Fluoreszenzplattenlesers (490 nm Anregung, 530 nm Emission) gemessen.
Der Farbstoffreisetzungstest zeigte, daß CD59-TM für transfizierte Balb/3T3-Klone, die äquivalente Mengen an CD59-GPI oder CD59-TM exprimierten (2), ein Niveau des Schutzes vor Komplementangriff lieferte, das zu demjenigen, das durch das native, GPI-verankerte CD59-GPI-Molekül erreicht wurde (5), äquivalent war. Insbesondere waren Zellen, die eines dieser Moleküle exprimierten, etwa dreimal effektiver bei der Verhinderung von komplementvermittelter Lyse bei 2,5 μg/ml C8/C9 als Zellen, die mit dem pcDNA3-Vektor alleine transfiziert waren, welche vollständig lysiert wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, daß 1) CD59-TM auf der Oberfläche von Balb/3T3-Zellen stabil exprimiert werden kann und 2) dieses chimäre Molekül eine zu nativem CD59 vergleichbare Funktion aufweist. Die Beibehaltung von Niveaus an komplementregulierender Aktivität durch CD59-TM wie beim Wildtyp ist dahingehend von erheblicher Bedeutung, daß es zeigt, daß die Funktionalität des CD59-Moleküls durch Verkürzung, gekoppelt mit einer Hinzufügung einer TM-Domäne, nicht wesentlich verändert wird. Dieses Ergebnis konnte vorher nicht vorhergesagt werden, insbesondere weil von anderen Veränderungen des CD59-Moleküls, z. B. Verkürzung des Carboxylterminus ohne Hinzufügung einer TM-Domäne oder Veränderungen einzelner Aminosäuren, gezeigt wurde, daß Moleküle produziert werden mit erheblich veränderter Expression und/oder Funktionalität. Siehe zum Beispiel Nakano et al., 1993; Norris et al., 1993 und Petranka et al., 1993.
Farbstoffreisetzungstests wurden auch an Maus-L-Zellen durchgeführt, die mit den retroviralen Virionenpartikeln transduziert waren, welche unter Verwendung des pL-CD59-MCP-TM-SN-Vektors, des pL-CD59-GPI-SN-Vektors oder des pLXSN-Vektors ohne Insertion erzeugt worden waren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 6 dargestellt. Nur L-Zellen, die mit retroviralen Partikeln transduziert waren, welche unter Verwendung von pL-CD59-MCP-TM-SN erzeugt worden waren, zeigten wesentlichen Schutz gegen Komplementangrift. Diese Ergebnisse zeigen, daß das chimäre CD59-TM-Molekül erfolgreich in einer Zellinie exprimiert werden kann, die nicht in der Lage ist, GPI-verankerte Proteine zu exprimieren, und daß das Molekül zum Schutz der Zelle vor Komplementlyse wirkt.
Die vorgenannten Ergebnisse zeigen, daß CD59 seine Ly-6-terminale Komplementinhibitionsaktivität beibehält, wenn es eher durch eine heterologe Transmembrandomäne als einen GPI-Anker an der Zellmembran verankert ist. Dieses fundamentale Ergebnis zeigt in Verbindung mit der konservierten Natur aller bekannten Ly-6-terminalen Komplementinhibitionsproteine (siehe US-Patentanmeldung Seriennummer 08/105,735 und PCT-Patentanmeldung Seriennummer PCT/US93/006772), daß eine heterologe Transmembrandomäne gegen die GPI-Signalsequenz eines Ly-6-terminalen Komplementinhibitionsproteins ausgetauscht werden kann, ohne die komplementhemmende Aktivität des Proteins wesentlich zu verändern.
Im Vergleich zur Verwendung eines nativen Ly-6-terminalen CIP haben die TMTCIPs der Erfindung die Vorteile, daß sie keine Zellaktivierung des Typs produzieren können, welcher von dem Vorhandensein des GPI-Ankers des nativen Ly-6-terminalen CIP abhängt, und daß sie durch die Wirkung von Phospholipaseenzymen nicht von der Zelloberfläche entfernt werden können und weniger zugänglich für vesikulären Austrag sind. Diese Vorteile machen die TMTCIPs der Erfindung geeigneter als native Ly-6-terminale CIPs für viele medizinische Anwendungen, einschließlich der Erleichterung der Transplantation von xenogenen Organen.
Obwohl bevorzugte und andere Ausführungsformen der Erfindung hierin beschrieben wurden, können andere Ausführungsformen, einschließlich einer Vielzahl von Modifikationen, vom Fachmann auf dem Gebiet erdacht und durchgeführt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel können die primären Aminosäurestruktu ren der Fusionsproteine der Erfindung durch Erzeugung von Aminosäuremutanten modifiziert werden. Solche Mutanten sollten mehr als 50% der komplementregulierenden Aktivität des elterlichen terminalen CIP beibehalten. Andere Modifikationen und Variationen umfassen die Bildung von Derivaten des Fusionsproteins, welche kovalente oder aggregierte Konjugate des Proteins oder von dessen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden umfassen. Die nachfolgenden Patentansprüche sollen die speziellen Ausführungsformen, die hierin angegeben sind, sowie solche Modifikationen, Variationen und Äquivalente abdecken.
In dieser Anmeldung wurde auf verschiedene Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen Bezug genommen. Die Lehren und Offenbarungen dieser Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden in ihrer Gesamtheit durch die Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständiger zu herschreiben.
Hinterlegungen
Die Plasmide, pcDNA3/CD59-MCP-TM, pc8-hCD59-103 und pKS-/mCCPH, die oben diskutiert werden, wurden bei der American Type Culture, Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Vereinigte Staaten von Amerika, in E. coli hinterlegt und erhielten die Bezeichnungen 69530, 69231 bzw. 69178. Diese Hinterlegungen wurden gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens (1977) vorgenommen.
Die oben angegebenen Hinterlegungen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern 69530, 69231 und 69178 wurden am 6. Januar 1994, 29. Januar 1993 bzw. 6. Januar 1993 vorgenommen. Die Hinterlegung 69530 wurde in dem Escherichi acoli-Stamm TOP10F' vorgenommen, welcher den folgenden Genotyp aufweist: F'{lacI^q TN10(Tet^R)} mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R) endA1 nupG. Die Hinterlegungen 69231 und 69178 wurden in dem Escherichia coli-Stamm DH5α vorgenommen, welcher den folgenden Genotyp aufweist: F^– Φ80dlacZΔM15 Δ (lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_k ^–, m_k ⁺) supE44 λ^– thi-1 gyrA96 relA1.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt: (a) eine Sequenz, welche ein chimäres Protein codiert mit (i) einem ersten Polypeptidbereich mit einem Teil eines Inhibitorproteins des elterlichen terminalen Komplements, wobei der Teil ein vollständiges Ly-6-Motiv umfaßt und eine funktionsfähige Signalsequenz, welche die Bindung eines Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Ankers steuert, nicht umfaßt, und (ii) einem zweiten Polypeptidbereich, der mit dem ersten Polypeptidbereich verknüpft ist, wobei der zweite Polypeptidbereich eine Transmembrandomäne von einem heterologen Protein umfaßt, oder (b) eine Sequenz, die zu (a) komplementär ist, oder (c) sowohl (a) als auch (b).
Chimäres Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt: (i) einen ersten Polypeptidbereich mit einem Teil eines Inhibitorproteins des elterlichen terminalen Komplements, wobei der Teil ein vollständiges Ly-6-Motiv umfaßt und eine funktionsfähige Signalsequenz, welche die Bindung eines Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Ankers steuert, nicht umfaßt, und (ii) einen zweiten Polypeptidbereich, der mit dem ersten Polypeptidbereich verknüpft ist, wobei der zweite Polypeptidbereich eine Transmembrandomäne von einem heterologen Protein umfaßt.
Nukleinsäuremolekül oder chimäres Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das chimäre Protein mehr als 50% der komplementhemmenden Aktivität des Inhibitorproteins für das elterliche terminale Komplement aufweist.
Nukleinsäuremolekül oder chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Teil des Inhibitorproteins für das elterliche terminate Komplement das elterliche Protein ohne stromabwärts von dessen Ly-6-Motiv gelegene Aminosäurereste umfaßt.
Nukleinsäuremolekül oder chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das chimäre Protein komplementhemmende Aktivität gegen menschliches Komplement aufweist.
Nukleinsäurevektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5 umfaßt, welches funktionsfähig mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verknüpft ist, so daß ein Wirt, der diesen Vektor enthält, das chimäre Protein exprimiert.
Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Vektor nach Anspruch 6 enthält.
Verfahren zum Schützen eines nicht menschlichen Organs vor einem Angriff von menschlichem Komplement, dadurch gekennzeichnet, daß es das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 5 in eine pluripotente Zelle, die in der Lage ist, ein nicht menschliches transgenes Tier zu produzieren, und Herstellen des nicht menschlichen transgenen Tiers aus der Zelle umfaßt, wobei die Widerstandsfähigkeit eines Organs des nicht menschlichen transgenen Tiers gegen einen Angriff von menschlichem Komplement verstärkt wird.
Transgene Zelle, Gewebe oder nicht menschliches Organ für die Transplantation, welche/welches ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 5 exprimiert oder ein chimäres Protein nach einem der Ansprüche 2, 3, 4 und 5 exprimiert.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 5 oder eines chimären Proteins nach einem der Ansprüche 2, 3, 4 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments für die Vorbeugung gegen pathologischen Komplementangriff.