ES2204944T3 - Genes y proteinas de fusion inhibidores del complemento terminal. - Google Patents
Genes y proteinas de fusion inhibidores del complemento terminal.Info
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Abstract
SE SUMINISTRAN SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE LLEVAN CODIFICADAS PROTEINAS QUIMERICAS QUE COMPRENDEN UNA PORCION FUNCIONAL DE UN COMPLEMENTO INHIBIDOR DE UN TERMINAL PRINCIPAL, COMO EL CD59, Y UN CAMPO HETEROLOGO A TRAVES DE LA MEMBRANA. EL COMPLEMENTO INHIBIDOR DE UN TERMINAL PRINCIPAL ES MODIFICADO PARA INACTIVAR SU SECUENCIA DE SEÑAL GPI. EL CAMPO HETEROLOGO A TRAVES DE LA MEMBRANA SIRVE PARA ANCLAR LA PROTEINA QUIMERICA A LA MEMBRANA DE LA CELULA SIN INTERFERIR SUBSTANCIALMENTE CON LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DEL COMPLEMENTO DEL COMPLEMENTO TERMINAL INHIBIDOR. LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO Y PROTEINAS QUIMERICAS CODIFICADAS PUEDEN USARSE PARA PROTEGER A LAS CELULAS DE UN ATAQUE COMPLEMENTARIO.
Description
Genes y proteínas de fusión inhibidores del
complemento terminal.
La presente invención se refiere a proteínas
inhibidoras del complemento terminal que se han modificado
genéticamente para alterar su unión a la superficie celular y a las
utilizaciones médicas de dichas nuevas moléculas.
El sistema del complemento actúa junto con otros
sistemas inmunológicos del cuerpo para defenderse contra la
intrusión de patógenos celulares y víricos. Existen por lo menos 25
proteínas del complemento, que se encuentran como colección compleja
de proteínas del plasma y cofactores de membrana. Las proteínas del
plasma elaboran aproximadamente el 10% de las glubulinas en el suero
de los vertebrados. Los componentes del complemento consiguen sus
funciones defensivas inmunitarias interactuando en una serie de
intrincados pero precisos casos de unión de la membrana y de
escisión enzimática. La cascada del complemento resultante conduce a
la producción de productos con funciones opsónicas,
inmunorreguladoras y líticas.
El aspecto lítico de la función del complemento
se efectúa mediante la permeabilización de las membranas de las
células objetivo como acción directa de un montaje de proteínas del
complemento conocidas individualmente como "componentes del
complemento terminal" y, en su montaje funcional, como complejo
de ataque a la membrana, o "MAC". (Véase Esser, 1991; y Bhakdi,
et al., 1991). Las acciones de MAC, denominadas en lo
sucesivo "ataque del complemento", crean poros o parches
agujereados que conducen a la destrucción de los gradientes osmótico
e iónico en las células objetivo, que, a concentraciones de MAC
bastante grandes, producen la muerte celular. Concentraciones más
bajas de MAC pueden producir otros efectos, incluyendo la activación
de células endoteliales y plaquetas. La actividad MAC inapropiada
puede producir daño patológico a las células y a los tejidos.
La cascada del complemento evoluciona a través de
la vía clásica o de la vía alternativa. Estas vías comparten muchos
componentes, y aunque se diferencian en sus primeras etapas, ambas
convergen y comparten los mismos componentes del complemento
terminal responsables del ataque al complemento y la activación y/o
destrucción de células objetivo.
La vía clásica del complemento se inicia
típicamente mediante el reconocimiento del anticuerpo y de la unión
a una zona antígena en una célula objetivo. La vía alternativa es
generalmente independiente del anticuerpo y se puede iniciar
mediante determinadas moléculas o superficies patógenas. Ambas vías
convergen en el punto en el que el componente C3 del complemento se
escinde mediante una proteasa activa (que es distinta en cada vía)
para dar C3a y C3b. Otras vías que activan el ataque del complemento
pueden actuar más tarde en la secuencia de los casos que conducen a
varios aspectos de la función del complemento, incluyendo la
formación del MAC.
C3a es una anafilotoxina que puede ocasionar la
desgranulación de las células madre, dando como resultado la
liberación de histamina y otros mediadores de inflamación. C3b
presenta múltiples funciones. Como opsonina, se une a las bacterias,
virus y otras células y partículas y se adhieren a ellas durante la
eliminación en la circulación. C3b puede formar también un complejo
con otros compuestos únicos en cada vía al formar convertasa C5
clásica o alternativa, que escinde C5 en C5a (otra anafilotoxina) y
C5b, que es el primero de los componentes del complemento terminal
que elaboran el MAC. (Entre los diversos medios por los que se puede
iniciar el ataque del complemento, las enzimas proteolíticas con
especifidades para las proteínas objetivo relativamente amplias,
incluyendo plasmina, elastasa y catepsina G, pueden escindir C5 con
el fin de simular la acción de la convertasa C5 y producir C5b
activa). C5b se combina sucesivamente con C6, C7 y C8 para formar el
complejo C5b-8 en la superficie de la célula
objetivo. El MAC activo (C5b-9) se forma en la unión
de diversas moléculas C9.
Normalmente, el sistema del complemento está en
estado continuo de cambio espontáneo. C3 puede adquirir
espontáneamente las funciones C3b, formando una convertasa C3
funcional y conduciendo a la formación de más C3b. El C3b generado
de esta manera espontánea puede formar además convertasa C5 e
iniciar de este modo las etapas finales en la cascada que forma el
MAC.
En condiciones normales, la circulación sanguínea
diluirá y dispersará las bajas concentraciones de componentes del
complemento activados espontáneamente, ayudando de este modo a
prevenir el crecimiento de MAC en cualquier situación en el sistema
vascular. Además, la regulación homeostática de las acciones de las
proteínas autólogas del complemento para prevenir el ataque
autoinmunitario está mediada por las proteínas inhibidoras de
complemento endógeno específico (CIP), que se pueden encontrar en
las superficies de la mayoría de las células humanas.
Ordinariamente, la circulación sanguínea y la acción de las CIP
bastan para hacer a las células resistentes a los niveles normales
de activación espontánea del complemento sin lesión o lisis. En
condiciones de inflamación de corta duración y en varios estados
patológicos en que la activación del complemento y la formación de
MAC están aceleradas, la cantidad normal y la actividad de los
inhibidores endógenos del complemento pueden ser inadecuados para
proteger las células autólogas procedente de la lisis provocada por
MAC y/o la activación sublítica celular provocada por MAC. La
actividad endógena de CIP puede ser también insuficiente cuando
existe extasis de la sangre y/o cuando existen defectos o
deficiencias de inhibidores naturales.
Se han identificado numerosas CIP que sirven para
proteger las células de las alteracciones mediadas por el
complemento de especies concordantes. Véase Zalman, et al.,
1986; Schonermark, et al., 1986; Nose, et al., 1990 y
Sugita, et al., 1988. Estos inhibidores actúan en varios
puntos definidos en la cascada del complemento. Por ejemplo, CD55,
conocido también como factor acelerador de descomposición (DAF),
ejerce sus principales efectos inhibidores en las acciones de
convertasa C3.
En los casos en los que la cascada del
complemento se inicia en los puntos en la vía después de la etapa de
la convertasa C3, tal como la generación de C5b activo por proteasas
de amplio espectro, son ineficaces DAF y otros inhibidores con
complemento que actúan en las primeras etapas en la secuencia en
cascada. Existen, sin embargo, inhibidores que no comparten esta
insuficiencia. Estos inhibidores actúan en las etapas finales en el
montaje del MAC y de este modo pueden bloquear eficazmente el ataque
al complemento iniciado por casi cualquier medio. Estos inhibidores
son conocidos como "inhibidores terminales del complemento" o
"CIP terminales".
La CIP terminal caracterizada más a fondo es la
proteína humana CD59 (conocida también como "protectina",
"MACIF" o "p18"). CD59 es un glucoproteína con un peso
molecular aparente de 18 a 21 kilodaltons que protege las células de
la lisis mediada por el complemento. C59 se une en el exterior de la
célula mediante un grupo glucolípido de
glucosil-fosfatidilinositol (GPI) que se ancla en la
membrana celular. CD59 se encuentra asociado a las membranas que
forman la superficies de la mayoría de las células humanas
incluyendo eritrocitos, linfocitos y células vasculares
endoteliales. (véase, por ejemplo, Sims et al., patente U.S.
nº 5.135.916).
CD59 parece que funciona compitiendo con C9 por
la unión a C8 en el complejo C5b-8, disminuyendo de
este modo la formación de MAC de C5b-9 (Rollins,
et al., 1990). CD59 actúa de este modo para reducir tanto la
estimulación celular como la lisis celular mediante los MAC
(Rollins, et al., 1990; Rollins, et al., 1991;
Stefanova, et al., 1989; Sugita, et al., 1988; Davies,
et al., 1989; Holguin, et al., 1989; Okada, et
al., 1989a; Meri, et al., 1990; Whitlow, et al.,
1990 y Harada, et al., 1990). Esta actividad de CD59 es para
la mayor parte de las especies selectivas, que bloquean más
eficazmente la formación de los MAC en condiciones en las que C8 y
C9 proceden de suero homólogo (a saber, humano) (Venneker, et
al., 1992). La asimilación de CD59 purificado en la membrana
plasmática de los eritrocitos no humanos, (que se cree que protegen
del ataque al complemento no humano homólogo por acción de sus
propias proteínas inhibidoras del complemento de la superficie
celular) y de los oligodendrocitos (células cerebrales que se cree
que están menos protegidas, sino del todo, por las proteínas de la
superficie celular, pero pueden estar protegidas in vivo por
la barrera sanguínea del cerebro) ha demostrado que CD59 puede
proteger estas células de la lisis celular mediada por el
complemento humano. (Rollins, et al., 1990; Rollins, et
al., 1991; Stefanova, et al., 1989; Meri, et al.,
1990; Whitlow, et al., 1990; Okada, et al., 1989b; y
Wing, et al., 1992).
Los ADNc que codifican CD59 han sido clonados y
la estructura del gen de CD59 se ha caracterizado (Davies,
et al., 1989; Okada, et al., 1989b; Philbrick, et al., 1990; Sawada, et al., 1989 y Tone, et al., 1992). Se ha demostrado que células de mamífero no humano transfectadas con el ADNc de CD59 clonado y expresando de este modo la proteína CD59 humana en sus superficies celulares, ganan resistencia a la lisis celular mediada por el complemento (Zhao, et al., 1991 y Walsh, et al., 1991).
et al., 1989; Okada, et al., 1989b; Philbrick, et al., 1990; Sawada, et al., 1989 y Tone, et al., 1992). Se ha demostrado que células de mamífero no humano transfectadas con el ADNc de CD59 clonado y expresando de este modo la proteína CD59 humana en sus superficies celulares, ganan resistencia a la lisis celular mediada por el complemento (Zhao, et al., 1991 y Walsh, et al., 1991).
Se ha publicado que CD59 está estructuralmente
relacionado con los antígenos murinos Ly-6
(Philbrick, et al., 1990 y Petranka, et al., 1992).
Los genes que codifican estos antígenos, conocidos también como
proteínas activadoras del linfocito T, son miembros de la familia
del multigen Ly-6 e incluyen
Ly-6A.2, Ly-6B.2,
Ly-6C.1, Ly-6C.2 y
Ly-6E.1. El gen que codifica el antígeno de las
células del timocito B murinas ThB es también un miembro de esta
familia (Shevach, et al., 1989 y Gumley, et al.,
1992).
Se han descrito numerosas proteínas víricas
inhibidoras con complemento y de primates no humanos que son
similares en estructura y función a CD59 (véase Rother, et
al., 1994; Albretcht, et al., 1992; solicitud de patente
U.S. en trámite con la presente, generalmente asignada, nº de serie
08/105.735, presentada el 11 de agosto de 1993 por William L. Fodor,
Scott Rollins, Russell Rother y Stephen P. Squinto y titulada
"Complement Inhibitor Proteins of Non-Human
Primates"; y asignada frecuentemente y la solicitud de
patente PCT en trámite con la presente serie nº PCT/US93/00672,
presentada el 12 de enero de 1993 por Bernhard Fleckenstein y
Jens-Christian Albrecht y titulada, "Complement
Regulatory Proteins of Herpesvirus Saimiri".
Estas proteínas (BABCIP (SEC ID nº:1), AGMCIP
(SEC ID nº:2), SQMCIP (SEC ID nº:3), OWMCIP (SEC ID nº:4), MARCIP
(SEC ID nº:5) y HVS-15 (SEC ID nº:6)) comparten
todas las homologías de la secuencia de ataque, incluyendo una
disposición distintiva conservada de cisteínas dentro de sus
secuencias de aminoácidos. Estos modelos conservados se perciben más
fácilmente alineando las secuencias de las proteínas de modo que los
restos de cisteína estén en registro como se observa en la Fig.
1.
\newpage
Los restos de cisteína de muchas proteínas forman
un elemento estructural denominado en la técnica como "eje central
de cisteína". En las proteínas en que tienen lugar, los ejes
centrales de cisteína juegan papeles esenciales en la determinación
de la doble estructura tridimensional terciaria y de la función
última de la molécula. Las proteínas de la familia del multigen
Ly-6, además de varias otras proteínas, comparten
una estructura particular de eje central de cisteína referidas a
ésta como "motivo Ly-6". Por ejemplo, el
receptor activador del plasminógeno de euroquinasa (uPAR; Roldan,
et al., 1990) y una de las diversas glucoproteínas del
calamar de función desconocida (Sgp2; Williams, et al., 1988)
contiene el motivo Ly-6.
Los subconjuntos de proteínas que tienen el
motivo Ly-6 pueden ser identificados por la
presencia de restos de aminoácidos conservados inmediatamente
adyacentes a los restos de cisteína. Dicha conservación de los
aminoácidos específicos en un subconjunto de proteínas puede estar
asociada a aspectos específicos de la doble estructura terciaria y a
la última función de las proteínas. Estos modelos conservados se
perciben más fácilmente alineando las secuencias de las proteínas de
forma que los restos de cisteína estén en registro.
Como se ha expuesto de forma completa en la
solicitud de patente U.S. en trámite nº de serie 08/105.735, citada
anteriormente, las partes relevantes de la cual se incorporan en la
presente memoria como referencias, se ha identificado una serie de
proteínas inhibidoras C5b-9 de primates no humanos
que se caracterizan por una estructura con eje central de cisteína
que define un subconjunto específico del motivo
Ly-6 general.
Particularmente, estas CIP de primates no humanos
incluyen polipéptidos que comprenden un eje central de cisteína con
un motivo Ly-6, caracterizado por la fórmula:
(1)Cys-X_{2}-Cys-X_{6-9}-Cys-X_{5}-Cys-X_{6}-Cys-X_{12}-Cys-X_{5}-Cys-X_{17}-Cys-X_{0}-Cys-X_{4}-Cys.
Además, las proteínas inhibidoras
C5b-9 de primates no humanos incluyen secuencias de
aminoácidos que conforman la fórmula siguiente:
(2)Cys-X_{2}-Cys-Pro-X_{5-8}-Cys-X_{4}-Asn-Cys-X_{5}-(Thr
o Ser)-Cys-X_{11}-(Gln o
Arg)-Cys-X_{4}-
(Asn o
Asp)-Cys-X_{17}-Cys-X_{0}-Cys-X_{4}-Cys.
En ambas fórmulas, X en X_{n} indica un péptido
que contiene cualquier combinación de aminoácidos, la n en X_{n}
representa la longitud de los restos de aminoácido del péptido y
cada X en cualquier posición puede ser igual o diferente que
cualquier otra X de la misma longitud en cualquier otra
posición.
Como se describió de forma completa en las
solicitudes PCT, generalmente asignadas, pendientes de publicación,
anteriormente citadas, nº de serie PCT/US 93/00672, las pociones
relevantes de las que se incorporan en la presente memoria como
referencia, y en Albrecht, et al., 1992, se ha descubierto
una proteína del herpesvirus saimiri con actividad inhibidora
de C5b-9 (denominada en la presente memoria
"HVS-15"). Esta proteína vírica presenta el
motivo Ly-6 que es característico de las proteínas
inhibidoras C5b-9 de primate no humano discutidas
anteriormente, es decir, su estructura está descrita por las
fórmulas (1) y (2) anteriores.
En la discusión que sigue, las CIP terminales que
comprenden motivos Ly-6 se denominan "CIP con
terminal Ly-6". Estas CIP satisfarán en
general la fórmula (1) anterior y preferentemente también la fórmula
(2). Son de esperar, sin embargo, algunas variaciones, en el espacio
entre cualquiera de las dos a diez cisteínas que elaboran el motivo
Ly-6 y en los aminoácidos adyacentes en las CIP con
terminal todavía no caracterizado de otras especies.
Asimismo, Petranka et al., 1993, y Norris,
et al., 1993, han publicado que en CD59 (SEC ID nº:7) el
enlace disulfuro entre Cys6 y Cys13, además del enlace disulfuro
entre Cys64 y Cys69, se puede romper por sustitución de estas
cisteínas por serinas sin comprometer sustancialmente la
funcionalidad de CD59. Estas cisteínas corresponden a la segunda,
tercera, novena, y décima cisteínas en las fórmulas anteriores. Por
consiguiente, tal como se utiliza en la presente memoria, el término
"CIP con terminal Ly-6" se piensa que incluye
también las proteínas del inhibidor de complemento terminal que
conforman las fórmulas anteriores, pero con todas o algunas de las
cisteínas segunda, tercera, novena, y décima sustituidas con serina
u otro aminoácido.
Además de las CIP con terminal
Ly-6 descritas anteriormente, se han descrito en la
bibliografía otras CIP unidas a la membrana, incluyendo las
siguientes:
(a) CD46 (proteína del cofactor de membrana, MCP,
véase, por ejemplo, la publicación de la patente PCT nº WO 91/02002)
es una proteína de transmembrana (TM) de 350 aminoácidos hallada en
todas las células excepto en los glóbulos rojos. CD46 se une a C3b,
y una vez unida, activa la actividad de las proteasas que escinden
C3b en fragmentos inactivos, impidiendo de este modo la acumulación
de C3b en la superficie celular y, a su vez, protegiendo las células
del ataque del complemento. Ambas formas de CD46 unida y segregada a
la membrana se han descrito en la bibliografía (Purcell et
al., 1991).
(b) CD55 (factor acelerador de descomposición,
DAF), mencionado anteriormente, es una proteína de la superficie
celular anclada en GPI presente en todas las células incluidos los
glóbulos rojos. A diferencia de CD46, CD55 no destruye C3b. Además,
CD55 impide que C3b reaccione con otros componentes del complemento,
contraviniendo de este modo la citolisis mediada por el complemento.
Tanto la membrana unida como las formas segregadas de CD55 se han
descrito en la bibliografía (Moran et al., 1992).
(c) CD35 (receptor del complemento 1, CR1) se
encuentra en un grupo selecto de linfocitos, además de eritrocitos,
neutrófilos y eosinófilos y provoca la degradación de las moléculas
C3b que se adhieren a las células vecinas.
(d) Factor H y proteína de unión a C4b, ambos
inhiben la actividad alternativa de la convertasa C3.
La activación intrínseca del ataque del
complemento a través de la vía alternativa durante el almacenamiento
de los órganos del donante es responsable de determinados problemas
asociados con el trasplante del órgano que surgen como resultado de
la estimulación y/o lisis celular por el MAC de
C5b-9 (Brasile et al. 1985). El ataque del
complemento ex vivo conduce a la viabilidad vascular reducida
e integridad vascular reducida cuando se trasplantan los órganos
almacenados, aumentando la probabilidad de rechazo del
trasplante.
El diez por ciento de los riñones
alotrasplantados con emparejamientos idénticos a HLA son rechazados
por mecanismos in vivo (Brasile, et al. 1987). En el
78% de los pacientes que rechazan órganos en estas condiciones, se
observan anticuerpos citotóxicos que se unen a moléculas en las
superficies de las células endoteliales vasculares (Brasile, et
al. 1987). Dicha citoxicidad del anticuerpo está mediada por el
ataque del complemento y es responsable del rechazo de los órganos
sólidos trasplantados, incluyendo riñones y corazones (Brasile,
et al. 1987; Brasile, et al. 1985). El cebado del
anticuerpo, el rechazo mediado por el complemento es generalmente
rápido e irreversible, fenómeno denominado rechazo hiperagudo.
En el marco del xenotrasplante, como cuando se
trasplantan órganos no humanos en pacientes humanos, se observa casi
siempre la activación del ataque del complemento por anticuerpos
dirigidos contra moléculas en las superficies de las células
endoteliales que recubren los vasos del órgano del donante. El
predominio de dichos anticuerpos xenorreactivos tiene en cuenta la
aparición casi universal del rechazo hiperagudo de los
xenotrasplantes (Dalmasso,
et al., 1992). Los primates del viejo mundo, incluyendo los seres humanos, presentan niveles altos de anticuerpos "naturales" circulantes preexistentes que reconocen principalmente los determinantes de carbohidrato expresados en la superficie de células xenógenas de especies discordes. Una prueba reciente indica que la mayoría de estos anticuerpos reaccionan con galactosa (Gal(\alpha1-3)Gal) (Sandrin et al. 1993).
et al., 1992). Los primates del viejo mundo, incluyendo los seres humanos, presentan niveles altos de anticuerpos "naturales" circulantes preexistentes que reconocen principalmente los determinantes de carbohidrato expresados en la superficie de células xenógenas de especies discordes. Una prueba reciente indica que la mayoría de estos anticuerpos reaccionan con galactosa (Gal(\alpha1-3)Gal) (Sandrin et al. 1993).
Los primates del viejo mundo carecen de
transferasa \alpha-1,3-galactosa
funcional apropiada y por lo tanto no expresan este epítopo de
carbohidrato. Por consiguiente, después de un trasplante de un
órgano vascularizado de donante xenógeno, estos anticuerpos de
valoración elevada se unen al epítopo de
Gal(\alpha1-3)Gal en el endotelio
vascular y activan el complemento del receptor a través de la vía
clásica. La respuesta inflamatoria masiva que asegura la activación
de la cascada del complemento conduce a la destrucción del órgano
del donante en minutos a horas.
Los anticuerpos xenorreactivos no son
responsables exclusivamente del rechazo hiperagudo de los órganos
discordes en todos los casos. Por ejemplo, los eritrocitos de
algunas especies pueden activar el complemento humano mediante la
vía alternativa y los lechones recién nacidos producidos para estar
exentos de anticuerpos preformados rechazan los xenotrasplantes casi
inmediatamente. Es por consiguiente probable que en algunas
combinaciones de especies, la activación de la vía del complemento
alternativo contribuya al rechazo del trasplante.
Expresadas endógeneamente, las proteínas
inhibidoras con complemento asociado a la membrana protegen las
células endoteliales del complemento autólogo. Sin embargo, la
limitación de la especie de inhibidores del complemento les hacen
relativamente ineficaces con respecto al complemento regulador del
suero xenógeno discorde. La falta de terapias eficaces dirigidas a
eliminar este anticuerpo y el rechazo hiperagudo mediado por el
complemento presenta una barrera importante al trasplante con éxito
de órganos de animales discordes en receptores humanos.
Hace poco, se ha publicado un informe sobre un
trasplante de hígado de mandril al hombre, en el que el órgano
xenógeno del donante falló al presentar síntomas de rechazo
hiperagudo (Starzl, et al., 1993). Los bajos niveles de
anticuerpos anti-mandril probablemente al estar
presentes en la sangre humana, hacen menos probables las respuestas
hiperagudas. Sin embargo, se cree que las CIP de mandril recién
descubiertas, que se ha demostrado que están relacionadas con CD59 y
son que son eficaces contra el complemento humano, también
desempeñaron un papel en el mantenimiento de la integridad de este
órgano xenotrasplantado. (Véase la solicitud de patente U.S. nº de
serie 08/105.735, citada anteriormente).
La falta de rechazo hiperagudo observado en el
xenotrasplante de mandril al hombre descrito anteriormente sugiere
que las proteínas inhibidoras del complemento eficaces contra el
complemento humano pueden, en combinación con otras estrategias
anti-rechazo, permitir el xenotrasplante seguro y
eficaz de órganos de animales transgénicos que expresan dichas
proteínas en pacientes humanos.
Las CIP con terminal anclado a GPI comparten
determinadas propiedades que les hacen menos deseables que las
proteínas de transmembrana (TM) para su utilización como agentes
inhibidores del complemento para la protección de células u órganos
trasplantados.
Las CIP con terminal anclado a GPI, incluyendo
CD59, BABCIP, y AGMCIP, se pueden escindir de la superficies
celulares mediante enzimas específicas de fosfolipasa que hidrolizan
los anclajes de GPI. Dichas fosfolipasas están presentes en el suero
(fosfolipasa D, Davitz, et al., 1987), y se pueden liberar
también de las células en respuesta a la isquemia (fosfolipasa C,
Vakeva et al., 1992). Como la isquemia es una concomitancia
inevitable del trasplante, el proceso del trasplante puede servir
para eliminar las CIP con terminal anclado a GPI introducidas
natural y/o artificialmente de muchas células dentro del órgano
trasplantado que pretenden proteger.
Otro mecanismo por el que las proteínas ancladas
a GPI se eliminan de la superficie celular es la incorporación de
dichas proteínas en las vesículas de la membrana y al posterior
desprendimiento de las vesículas de la célula. Dicha vesiculación
puede ocurrir en respuesta a varios estímulos, tal como el ataque
del complemento producto por la isquemia. Se ha publicado que las
proteínas ancladas a GPI se concentran en estas vesículas en
relación con su concentración en la membrana celular, fenómeno que
puede reflejar la implicación de estas proteínas en el propio
procedimiento de vesiculación (Butikofer, et al., 1989;
Brown, et al., 1992; Whithlow, et al., 1993). Dicha
incorporación preferencial en las vesículas desprendidas puede
reducir las concentraciones de proteínas ancladas a GPI en la
superficie de la célula, incluyendo las concentraciones de las CIP
terminales ancladas a GPI. Tales reducciones de concentraciones de
CIP terminal pueden tener lugar, particularmente en respuesta al
ataque del complemento, precisamente en los momentos en que se
necesita más la inhibición del complemento.
Además de su susceptibilidad a la eliminación de
la superficie celular, las proteínas ancladas a GPI también adolecen
del problema de que su producción puede estar limitada en varios
tipos de células. Esto es, únicamente de este modo muchas moléculas
ancladas a GPI pueden ser producidas normalmente por una célula en
un tiempo dado, así que introduciendo genes para proteínas ancladas
además a GPI no pueden producir, de hecho, aumentos sustanciales en
la cantidad de proteína actualmente presente en la superficie
celular.
El caso límite de este problema implica a las
células que son incapaces de producir alguna de las proteínas
ancladas a GPI. La enfermedad clínica de la hemoglobinuria
paroxística nocturna (PNH) implica a células de este tipo,
específicamente, células sanguíneas que no producen las CIP con
terminal anclado a GPI. Tal como se expuso en la solicitud de
patente en trámite con la presente, generalmente asignada, nº de
serie 08/206.189, titulada "Method for the Treatment of
Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria", que está siendo
presentada conjuntamente con ésta en nombre de Russell Rother, Scott
A. Rollins, Seth A. Fidel y Stephen P. Squinto, las células con PNH
se pueden hacer resistentes al ataque del complemento mediante la
utilización de las CIP terminales de la transmembrana descritas en
la presente memoria.
Un inconveniente adicional de las proteínas
ancladas a GPI implica la capacidad de estas proteínas para
transducir señales en la célula en el momento de ser reticuladas por
anticuerpos específicos y supuestamente en el momento de unirse a su
ligando natural (Okada, et al., 1989b; Seaman, et al.,
1991; Su, et al., 1991; Deckert, et al., 1992;
Cinek,
et al., 1992; Card, et al., 1991; Groux, et al., 1989; y Stefanova, et al., 1991). Posibles respuestas celulares indeseables a dichas señales intracelulares pueden incluir la activación y/o liberación de la fosfolipasa y la estimulación de la formación y eliminación de la vesícula, ambas expuestas anteriormente, pueden producir la pérdida de proteínas ancladas a GPI de la superficie celular. Por lo tanto, las CIP con terminal muy anclada a GPI que se utilizan para proteger las células de un órgano trasplantado del ataque del complemento pueden activar los casos celulares que conducen a su eliminación de la superficie celular.
et al., 1992; Card, et al., 1991; Groux, et al., 1989; y Stefanova, et al., 1991). Posibles respuestas celulares indeseables a dichas señales intracelulares pueden incluir la activación y/o liberación de la fosfolipasa y la estimulación de la formación y eliminación de la vesícula, ambas expuestas anteriormente, pueden producir la pérdida de proteínas ancladas a GPI de la superficie celular. Por lo tanto, las CIP con terminal muy anclada a GPI que se utilizan para proteger las células de un órgano trasplantado del ataque del complemento pueden activar los casos celulares que conducen a su eliminación de la superficie celular.
Se ha llevado a cabo trabajo en el que se han
variado los medios de unión de las proteínas ancladas a GPI a la
superficie celular externa de sus anclajes a GPI naturales mediante
sustitución de otros grupos de anclaje (Su, et al., 1991; y
Lublin, et al., 1991).
Por ejemplo, los derivados mixtos de CD5, que
contienen los aminoácidos 1 a 304 de CD55 unidos a un fragmento de
CD46 que incluye el dominio de transmembrana de la proteína (es
decir, los aminoácidos 270 a 350 de CD46) o a un fragmento de la
proteína HLA-B44 humana con histocompatibilidad
importante que incluye su dominio de transmembrana (es decir, los
aminoácidos 262 a 338 de HLA-B44), se ha publicado
que conservan niveles de función equivalentes a CD55 natural
(Lublin, et al., 1991). Con respecto a la presente invención,
ninguna de tales sustituciones se ha realizado de forma
significativa, con las CIP terminales y ninguna de dichas moléculas
se ha desarrollado para su utilización clínica y, en particular,
para su utilización en órganos transgénicos constructivos para
trasplante.
Alteraciones menores de las estructuras primarias
de la proteína (secuencias de aminoácidos) pueden presentar
profundos efectos en sus propiedades funcionales. El ejemplo mejor
conocido de este fenómeno es el caso de la anemia depranocítica, en
el que una sola alteración de aminoácido, a saber, un cambio en el
resto 6 de la cadena beta de hemoglobina de Glu a Val, es suficiente
para cambiar las propiedades de unión del oxígeno de la molécula de
hemoglobina y producir de este modo la anemia depranocítica.
La inserción de las secuencias heterólogas de
aminoácidos que representan nuevas estructuras de dominio en una
proteína pueden presentar también efectos significativos en las
propiedades funcionales de la proteína. Por ejemplo, la introducción
de un epítopo de 10 aminoácidos del protooncogén c-myc
(conocido por la identificación myc) en el protooncogén
int-1 altera las propiedades funcionales de int-1.
Específicamente, las células epiteliales C57MG de las mamas se
transforman en int-1 de tipo natural, pero no en int-1
con identificación myc, mientras que la función residual del
gen int-1 con identificación myc se observa en un
análisis más sensible examinando los efectos sobre el desarrollo de
Drosophila (McMahon et al., 1989).
Además, la sustitución de secuencias homólogas de
proteínas heterólogas pueden presentar profundos efectos en la
función de la proteína. Por ejemplo, la sustitución de los dos
segmentos de 12 aminoácidos carboxil-terminales del
gen del factor de crecimiento de nervios del ratón con segmentos
homólogos procedente del gen del factor neurótrofo derivado del
cerebro del ratón relacionado, reduce la actividad de la molécula en
el 50%. Esto es, la zona carboxil-terminal es
particularmente sensible a la sustitución por una secuencia homóloga
de una proteína heteróloga, teniendo suficiente impacto dicha
sustitución en la función de la proteína para disminuir la actividad
en el 50%. Una disminución similar en la actividad se observa
después de la sustitución del terminal amino (Suter, et al.,
1992).
Se cree que todas las CIP con terminal
Ly-6 comparten la propiedad de estar unidas a
membranas celulares por medio de un enlace GPI. Tal como se entiende
en esta materia, la adición de tal grupo GPI a una proteína activa
coincide con una etapa de tratamiento proteolítico que elimina
numerosos restos de aminoácidos del terminal carboxilo del
polipéptido. Por consiguiente, las CIP maduras con terminal
Ly-6 no incluyen todos los aminoácidos especificados
por moléculas completas de ácido nucleico que los codifican.
Específicamente, no incluyen algunos o todos los restos de
aminoácido corriente abajo del motivo Ly-6 del eje
central de cisteína, p. ej.: los aminoácidos corriente abajo de la
cisteína 69 de la SEC ID nº:1, SEC ID nº:2, SEC ID nº:4, SEC ID
nº:5, SEC ID nº:6, SEC ID nº:7 (CD59) y corriente abajo de la
cisteína 72 de la SEC ID nº:3. (Tal como se utiliza en la presente
memoria, "corriente abajo" significa con respecto al terminal
caboxilo del polipéptido o con respecto al extremo 3' de la cadena
de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido y
"corriente arriba" significa con respecto al terminal amino del
polipéptido o con respecto al extremo 5' de la cadena de la molécula
de ácido nucleico que codifica el polipéptido). No se sabe qué
aminoácidos corriente abajo del motivo Ly-6 del eje
central de cisteína están presentes o ausentes en alguna de estas
CIP terminales cuando están ancladas a GPI en estado maduro.
Tal como se expone con detalle a continuación, la
presente invención implica la eliminación de aminoácidos
seleccionados de dichas CIP con terminal Ly-6
corriente abajo del motivo Ly-6. En vista del estado
de la técnica anterior, no se sabía, antes de la presente invención,
qué efectos podrían presentar tales aminoácidos en la función de la
CIP terminal. En particular, no se sabía si las CIP con terminal
Ly-6 conservarían alguna actividad inhibidora del
complemento después de dicha eliminación.
Se han hecho varios intentos para examinar los
efectos de los anclajes de GPI en la función de la proteína. En el
caso de CD55, la sustitución de fragmentos de proteína que contienen
un dominio de transmembrana por secuencias con terminal carboxilo se
cree que está implicadas en la adición del anclaje de GPI
(denominada en lo sucesivo "secuencia con señal GPI") produce
una proteína con actividad igual a la proteína natural anclada a GPI
(Lublin, et al., 1991). En el caso de la proteína con
Ly-6, Ly-6E
(Ly-6E.1), que es una proteína con superficie
celular anclada a GPI que está estructuralmente relacionada con CD59
(Philbrick, et al., 1990), la sustitución de un fragmento que
contiene un dominio de transmembrana por secuencias con señal de GPI
con terminal carboxilo corriente abajo del motivo
Ly-6 produce una proteína no funcional, es decir,
una proteína que no es capaz de activar los linfocitos T (Su, et
al., 1991).
En vista de lo anterior, un objetivo de la
presente invención es proporcionar nuevas proteínas que se puedan
utilizar para controlar el sistema con complemento de pacientes
humanos y otros animales. Un objeto adicional de la invención
consiste en proporcionar secuencias de ácido nucleico y
construcciones modificadas genéticamente asociadas para producir
dichas proteínas in vitro o in vivo.
Más particularmente, un objetivo de la invención
consiste en proporcionar nuevas proteínas que son inhibidores de
complemento terminal Ly-6 pero que están ancladas a
la superficie celular mediante anclaje independiente de GPI. Un
objetivo adicional de la invención consiste en proporcionar
moléculas de este tipo que no transmitan una señal de activación a
las células a las que estén unidas, p. ej.: células endoteliales,
linfocitos o plaquetas, después de la reticulación del anticuerpo o
en el momento de la unión de la CIP terminal a su ligando. Un
objetivo adicional de la invención consiste en proporcionar
moléculas de este tipo que no se puedan eliminar de las superficies
de las células a las que estén unidas mediante acciones de las
enzimas que escinden el líquido, tales como las fosfolipasas y que
no se incorporen preferentemente en las vesículas desprendidas.
Para conseguir los anteriores y otros objetivos,
la presente invención, según determinados aspectos, proporciona las
secuencias completas de ADNc de los genes mixtos que codifican los
productos mixtos de proteínas que comprenden la fusión de una CIP
con terminal Ly-6 con un dominio heterólogo de
transmembrana (TM). Antes de la fusión, se eliminan los restos de
aminoácidos seleccionados situados corriente abajo del motivo
Ly-6 de la CIP terminal. La invención también
comprende los productos mixtos de proteína codificados por estos
genes, siendo denominadas en lo sucesivo tales moléculas mixtas
TMTCIP (es decir proteínas inhibidoras de complemento terminal de
transmembrana). En las formas de realización preferidas de la
invención, las proteínas mixtas tienen más del 50% de actividad
inhibidora del complemento de la CIP natural, con terminal anclado a
GPI a partir de la cual se deriva TMTCIP, en la que dicha actividad
se mide preferentemente utilizando una determinación de liberación
en seco del tipo descrito más adelante en el Ejemplo 4.
La protección del ataque del complemento ofrecida
por las TMTCIP de la invención se puede proporcionar mediante
transferencia génica para la prevención terapéutica del ataque del
complemento patológico, por ejemplo, en el trasplante. En una forma
preferida de dicha terapia, la expresión de la TMTCIP puede estar
dirigida a las superficies de las células de los órganos animales no
humanos, p. ej.: órganos de animales transgénicos no humanos, para
proteger dichos órganos del ataque del complemento en el momento del
trasplante a un paciente humano.
Los dibujos adjuntos, que están incorporados y
constituyen parte de la memoria, ilustran determinados aspectos de
las formas de realización preferidas de la invención y, junto con la
descripción, sirven para explicar determinados principios de la
invención, debiendo entenderse, desde luego, que tanto los dibujos
como la descripción son solamente explicativos y no son limitativos
de la invención.
La Fig. 1 muestra las secuencias de aminoácidos
alineadas del hombre, mono verde africano, mandril, mono buho, tití,
mono ardilla y las CIP con terminal Ly-6 de
Herpesvirus Saimiri (CD59, AGMCIP, BABCIP, OWMCIP, MARCIP,
SQMCIP Y HVS-15, respectivamente). Los restos de
cisteina que componen el motivo del eje central de cisteína
Ly-6 de cada proteína están subrayados.
Ly-6 de cada proteína están subrayados.
La Fig. 2 muestra una comparación de la expresión
de la superficie celular de los epítopos de CD59 en células
Balb/3T3. Los tres trazados representan los perfiles de la expresión
de la superficie celular de un clon positivo de Balb/3T3 que expresa
CD59-MCP TMTCIP (CD59-TM),
transfectante de CD59 natural humano (CD59-GPI) como
referencia positiva y un vector (pADNc3, Invitrogen, San Diego, CA)
sin transfectante de inserción (Vector referencia) como referencia
negativa.
La Fig. 3 muestra una comparación de la expresión
de la superficie celular de los epítopos de CD59 en células L de
ratón. El trazado ancho representa los perfiles de la expresión de
la superficie celular de las células L agrupadas, transducidas con
partículas de virión retrovírico generadas utilizando el vector
pL-CD59-MCP-TM-SN
(CD59-TM). También se muestran los perfiles de las
células L agrupadas, transducidas con partículas de virión
retrovírico generadas utilizando el vector
pL-CD59-GPI
(CD59-GPI) o con partículas de virión retrovírico
generadas utilizando el vector pLXSN sin inserción (Vector control),
como controles negativos.
La Fig. 4 muestra los niveles de superficie
celular de antígenos de CD59 en células de Balb/3T3 transfectadas
establemente antes y después de la digestión en
PI-PLC. La Fig. 4A muestra los datos obtenidos
utilizando un clon que expresa la molécula CD59 natural humana
(CD59-GPI). Fig. 4B muestra los datos obtenidos
utilizando un clon que expresa CD59-MCP TMTCIP
(CD59-TM). En cada panel, estos trazos etiquetados
"A" y "B" representan las células teñidas con el
anticuerpo secundario solo, sin o con tratamiento de
PI-PLC, respectivamente. En cada panel, los trazos
etiquetados "C" y "D" representan las células teñidas
tanto con el anticuerpo primario (CD59 específico) como con el
anticuerpo secundario con o sin tratamiento de
PI-PLC, respectivamente.
La Fig. 5 muestra los datos obtenidos a partir de
las pruebas de liberación del colorante realizadas utilizando
células de Balb/3T3 transfectadas, empleadas para obtener los datos
de la Fig. 2 y de la Fig. 4. Se probaron las células con suero
humano al 20% reducido en C8, complementado con una mezcla a partes
iguales de C8 y C9 humanos purificados. Las cantidades añadidas de
la mezcla de C8 y C9 humanos, en una concentración final de
microgramos por mililitro, están indicadas en abscisas y el
porcentaje de liberación de colorante está indicado en
ordenadas.
La Fig. 6 muestra los datos obtenidos a partir de
las pruebas de liberación del colorante realizadas utilizando
células L transfectadas de ratón empleadas para obtener los datos de
la Fig. 3. Se probaron las células con suero humano al 20% reducido
en C8 complementado con una mezcla en partes iguales de C8 y C9
humanos purificados. Las cantidades añadidas de la mezcla de C8 y C9
humanos, en una concentración final de microgramos por mililitro,
están indicadas en abscisas y el porcentaje de liberación de
colorante está indicado en ordenadas.
Según se expuso anteriormente, la presente
invención proporciona secuencias completas de ADNc de genes híbridos
que codifican productos de proteínas que comprenden la fusión de una
CIP con terminal Ly-6 y un dominio heterólogo de
transmembrana.
En la práctica de la invención se pueden utilizar
diversas CIP terminales. En particular, se pueden utilizar las CIP
con terminal Ly-6. Además de compartir las
homologías mostradas en las fórmulas (1) y (2) anteriores, las CIP
con terminal Ly-6 comparten también otras varias
homologías que se pueden observar en las secuencias de aminoácidos
alineados de la Fig. 1. Las homologías observadas corriente abajo
del motivo de cisteína Ly-6 de estas CPI terminales
comprenden un N inmediatamente después del último C del motivo
Ly-6, otros 6 a 8 restos con N corriente abajo de la
última C del motivo Ly-6 (denominada en la presente
memoria "Asn de truncamiento") y la siguiente secuencia de
consenso, denominada en lo sucesivo "secuencia de consenso
corriente abajo" que incluye el Asn de truncamiento mencionado
anteriormente y la tercera posición en la secuencia:
Además de las comunidades estructurales, la
determinación de las CIP con terminal Ly-6 de la
Fig. 1 ha demostrado que comparten la capacidad de inhibir
prácticamente la actividad del complemento humano. (Véase la
solicitud de patente nº de serie 08/105.735 y la solicitud de
patente PCT nº de serie PCT/US93/00672, citada anteriormente). En
particular, cada uno de las CD59, AGMCIP, BABCIP, OWNCIP, SQMCIP y
HVS-15 presentaban importante actividad inhibidora
del complemento humano. No se probó MARCIP, pero es de esperar
también que presente dicha actividad.
Como es sabido en esta materia, las proteínas de
transmembrana pueden abarcar la membrana una o varias veces a lo
largo de la longitud de sus cadenas de aminoácidos. Existen en
general dos formas diferentes en las que una proteína de
transmembrana que atraviesa la membrana solamente puede estar
embebida una vez en una membrana. Lo más habitualmente, estas
proteínas presentan su único dominio de trasmembrana situado hacia
el extremo del terminal carboxilo de la cadena de polipéptido y
están orientadas de modo que la zona amino-terminal
en el dominio de transmembrana es exterior a la célula o está en un
compartimento celular no citoplásmico y la zona del terminal
carboxilo en el dominio de transmembrana está en el compartimento
del citoplasma. La segunda orientación de una proteína de
transmembrana con una única membrana que atraviesa el dominio de
trasmembrana es la opuesta a esta disposición habitual, esto es, la
zona amino-terminal en el dominio de transmembrana
está en el compartimento ciplásmico y la zona
carboxilo-terminal en el dominio de transmembrana
está situada en el exterior de la célula o en un compartimento
celular no citoplásmico.
Otras proteínas de transmembrana atraviesan la
membrana varias veces. Lo más frecuentemente, representantes
eucariotas de este tipo de proteína de transmembrana poseen siete
dominios de transmembrana consecutivos, la mayoría de ellos
conectados mediante zonas cortas de bucle hidrófilo.
Las proteínas de transmembrana incluyen en
general por lo menos una extensión contigua de restos de aminoácidos
que reside en la membrana bicapa de lípido (denominados en lo
sucesivo "aminoácidos de membrana"), y por lo menos dos
extensiones contiguas de restos de aminoácidos que se extienden a
partir de la membrana, uno generalmente citoplásmico (denominados en
lo sucesivo "aminoácidos citoplásmicos) y otro generalmente
extracelular o secuestrado en un compartimento celular citoplásmico
(denominados en lo sucesivo "aminoácidos extracelulares). Tal
como se refiere en la presente memoria, aminoácidos citoplámicos y
aminoácidos extracelulares comprenden por lo menos un resto de
aminoácido cargado inmediatamente adyacente a los aminoácidos de
membrana (denominado en la presente memoria "primer aminoácido
citoplásmico" y "primer aminoácido extracelular"
respectivamente.
Los aminoácidos de membrana están caracterizados
como grupos de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos (el
mínimo generalmente necesario para atravesar una membrana), la
mayoría de los cuales son aminoácidos hidrófobos (sin carga). Los
aminoácidos con carga (hidrófilos) están habitualmente de estos
grupos, pero en algunos casos dos restos hidrófilos de carga opuesta
pueden encontrarse muy próximos dentro de la membrana donde se
neutralizan entre sí.
En la práctica de la invención se pueden utilizar
dominios de transmembrana derivados de varias proteínas de
transmembrana. Sin embargo, los dominios de transmembrana con
aminoácidos citopásmicos que incluyen restos de cisteína en estrecha
proximidad con el primer aminoácido citoplásmico se puede expresar a
niveles más bajos en la superficie celular que los dominios de
transmembrana que no contienen dichas cisteínas. Esta expresión
reducida se cree que resulta de la propensión de estos restos de
cisteína a formar enlaces intermoleculares con las cisteínas
situadas de forma similar de las moléculas de proteína nacientes
adyacentes. Dichos enlaces de cisteína intermolecular producen el
agregado de las proteínas de transmembrana nacientes, generalmente
dentro del aparato de Golgi (donde se procesan proteínas de
transmembrana recién sintetizadas dentro de la célula típica) y de
este modo bloquea el transporte de dichas proteínas nacientes en la
superficie celular.
Con respecto a las moléculas TMTCIP de la
invención, es destacable que la transfección de células de mamífero
con un vector de expresión que codifica un terminal CIP híbrido que
contiene un supuesto dominio de transmembrana procedente del gen
CCPH de herpesvirus saimiri (véase la solicitud de la patente
PCT nº de serie PCT/US93/00672, mencionada anteriormente) no produce
niveles bastante grandes de expresión de superficie celular de
epítopos CIP terminales que se han de detectar por análisis de FACS
(véase el Ejemplo 1). Los aminoácidos citoplásmicos de este supuesto
dominio de transmembrana comprenden los restos de cisteína
espaciados dos y cinco aminoácidos del primer aminoácido
citoplásmico, histidina. La presencia de estas cisteínas se cree que
es responsable de los bajos niveles de expresión observados en este
supuesto dominio de transmembrana. Por esta razón, no se prefieren
los dominios de transmembrana de este tipo para su utilización en la
presente invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "dominio de transmembrana" tiene la finalidad de
comprender: 1) la porción de una proteína de transmembrana que
atraviesa la membrana, es decir, los aproximadamente veinte
aminoácidos de membrana, por lo menos, requeridos para esta
finalidad, 2) los aminoácidos citoplásmicos adyacentes con carga
predominante dentro de los aproximadamente cinco a aproximadamente
diez restos de aminoácidos citoplásmicos, y 3) los aminoácidos
extracelulares adyacentes con carga predominante dentro de los
aproximadamente cinco a aproximadamente diez restos de aminoácidos
de membrana. Estos aminoácidos citoplásmicos y extracelulars
adyacentes están implicados en el anclaje de la proteína a la
membrana. Como se expuso anteriormente, los dominios de
transmembrana no incluyen aminoácidos citoplásmicos que son restos
de cisteína dentro de los cinco aminoácidos del primer aminoácido
citoplásmico.
Aunque es posible examinar una secuencia de
proteína y escoger una zona con aproximadamente 20 aminoácidos
hidrófobos consecutivos, algunos dominios de transmembrana, como los
expuestos anteriormente, contienen un número pequeño de aminoácidos
hidrófilos entremezclados dentro de sus restos predominantemente
hidrófobos. Por consiguiente, los dominios de transmembrana se
identifican más eficazmente utilizando escalas de hidrofobia para
informatizar representaciones de hidropatía (Branden, et al.,
1991).
Las escalas de hidrofobia proporcionan un valor
numérico para la hidrofobia de aminoácidos individuales. Estas
escalas se han desarrollado sobre la base de mediciones de
solubilidad de aminoácidos en diferentes disolventes, presiones de
vapor de análogos con cadena lateral, análisis de distribuciones con
cadena lateral dentro de proteínas solubles y cálculos de energía
teórica (Kyte, et al., 1982 y Engelman, et al.,
1986).
Las representaciones de hidropatía se
informatizan a partir de secuencias de aminoácidos que utilizan los
índices de hidrofobia de la forma siguiente. En primer lugar, se
calcula un índice hidropático para cada posición en la secuencia. El
índice hidropático es el valor medio de la hidrofobia de los
aminoácidos dentro de una "ventana", generalmente de 19 restos
de longitud, alrededor de cada posición. A continuación se
representan los índices hidropáticos frente a la posición de la
secuencia de aminoácidos para producir la representación de
hidropatía.
A continuación se identifican los dominios de
transmembrana a partir de las representaciones de hidropatía
investigando las zonas en las que el índice hidropático es elevado
para un número de posiciones consecutivas en la secuencia, p. ej.:
investigando zonas con picos anchos con índices positivos elevados
(es decir, hidrófobos).
Desde el punto de vista de la presente invención,
el dominio de transmembrana tendrá preferentemente un índice
hidropático mayor de aproximadamente +0,5, utilizando la escala de
Kyte et al. (Kyte, et al., 1982) y una ventana de 19
aminoácidos, sobre una zona de por lo menos 12 restos de
aminoácidos.
Se pueden incluir aminoácidos contiguos
adicionales de la proteína de transmembrana en o codificar mediante
moléculas híbridas de la invención siempre que estos aminoácidos
adicionales no perjudiquen de forma sustancial la inserción del
dominio de transmembrana en la membrana, el transporte de la
proteína híbrida naciente en la superficie de la célula o la
actividad inhibidora del complemento de la porción CIP terminal de
la molécula híbrida.
Mientras las moléculas de la presente invención
se pueden construir con un dominio de transmembrana funcional, se
prefiere un derivado de una proteína con sólo un único dominio de
transmembrana y con la zona carboxilo-terminal para
su dominio de transmembrana en el citoplasma. Se han descrito un
gran número de dichas proteínas en la bibliografía, incluyendo las
siguientes: CD46; los principales antígenos con histocompatibilidad
y proteínas de transmembrana relacionadas de la superfamilia de
multigenes de inmunoglobina incluyendo las moléculas de adhesión
intercelular, tales como ICAM-1 (CD54),
ICAM-2, ICAM-3,
VCAM-1, PECAM-1 (CD31) y HCAM
(CD44); las selectinas, incluyendo selectina E, selectina L y
selectina P (CD62); la proteína precursora del amiloide de
Alzheimer; el receptor de insulina; el receptor del factor de
crecimiento epidérmico; la proteína gp41 del virus del SIDA, VIH;
las proteínas p21 de HTLV1 y HTLV2; y las proteínas p15E de los
virus de la leucemia murina y felina.
Se pueden utilizar en la práctica de la invención
los dominios TM derivados de cualquiera de estas proteínas, además
de otras proteínas de transmembrana. Estos dominios se pueden
utilizar más fácilmente incorporando dentro la molécula híbrida del
terminal carboxilo completo de la proteína de transmembrana que
empieza en el punto corriente arriba del dominio de transmembrana.
Un dominio TM particularmente preferido es el que constituyen los
aminoácidos 294 a 326 de CD46 (MCP, (SEC ID nº: 8). Este dominio se
puede utilizar convenientemente junto con los aminoácidos 327 a 350,
que comprenden el terminal carboxilo de la proteína CD46 corriente
abajo del dominio de transmembrana de esta molécula y junto con los
aminoácidos 270 a 293 corriente arriba del dominio TM que no
interfiere con la inserción del dominio TM de CD46 dentro de las
membranas celulares y, como se muestra a continuación, no inhibe la
actividad inhibidora del complemento de las CIP con terminal
Ly-6.
Además al utilizar las representaciones de
hidropatía para identificar dominios TM adecuados para su
utilización en la presente invención, tales dominios se pueden
identificar también bioquímicamente utilizando, por ejemplo,
técnicas de digestión con proteasa o construyendo moléculas híbridas
que contienen proteínas solubles operativamente unidas a secuencias
con señal y que contienen supuestos dominios de transmembrana y
analizando la inserción de la membrana de la proteína híbrida.
El aislamiento, el truncamiento y la fusión de
los fragmentos de ácido nucleico que codifican el terminal CIP y el
dominio TM se realizan utilizando técnicas de ácido nucleico
recombinante conocidas en la materia, incluyendo: Regeneración por
PCR de los fragmentos deseados y/o digestión con restricción de los
genes clonados; fusión por PCR de los fragmentos deseados; o enlace
enzimático de los productos de digestión con restricción
(Sambrook,
et al., 1989 y Ausubel et al., 1992). Como alternativa, se pueden sintetizar por medios químicos las moléculas de ácido nucleico que codifican las TMTCIP de la invención o cualquiera de los fragmentos utilizados para montar los genes híbridos para las TMTCIP (Talib, et al., 1991).
et al., 1989 y Ausubel et al., 1992). Como alternativa, se pueden sintetizar por medios químicos las moléculas de ácido nucleico que codifican las TMTCIP de la invención o cualquiera de los fragmentos utilizados para montar los genes híbridos para las TMTCIP (Talib, et al., 1991).
Los genes híbridos de la invención se preparan
mediante: 1) truncamiento de la secuencia de ácido nucleico para una
CIP con terminal Ly-6 con el fin de eliminar los
restos de aminoácidos seleccionados corriente abajo del motivo
Ly-6 para inactivar la secuencia normal con señal
GPI, y 2) fusión de la secuencia truncada con una secuencia que
codifica un dominio TM seleccionado y los aminoácidos deseados que
rodean el dominio TM.
El truncamiento de la secuencia del ácido
nucleico que codifica la CIP con terminal Ly-6
eliminará por lo menos alguno de los restos de aminoácidos con
terminal carboxilo corriente abajo de Asn que está situado entre los
restos de aminoácidos 6 y 8 después del último (décimo) Cys y del
motivo Ly-6. Este Asn está también situado en la
tercera posición en la secuencia de consenso corriente abajo
presentada anteriormente, es decir, es el Asn de truncamiento
definido anteriormente. Todas las CIP con terminal
Ly-6 conocidas incluyen dicho Asn de
truncamiento.
En algunos casos, se eliminan todos los restos de
aminoácidos después del Asn de truncamiento. Como alternativa, se
puede eliminar menos de la totalidad, siendo el criterio que se
eliminan suficiente número de restos con el fin de que sea
inoperante la secuencia con señal GPI. En general, el enfoque más
sencillo es eliminar los restos de aminoácidos corriente abajo del
Asn de truncamiento. Si se desea, el truncamiento puede abarcar
además corriente arriba del Asn de truncamiento, preferentemente
empezando en un punto corriente abajo del último Cys del motivo
Ly-6. En general no se prefieren los truncamientos
que empiezan corriente arriba del último Cys del motivo
Ly-6, pero se pueden utilizar si se desea. El
criterio para los truncamientos corriente arriba del Asn de
truncamiento es el requisito de que TMTCIP posea más del 50% de la
actividad inhibidora del complemento de la CIP con terminal
Ly-6 precursora (natural).
Desde el punto de vista de las CIP con terminal
Ly-6 de la Fig. 1, el truncamiento preferido
comprende todos los aminoácidos corriente abajo de Asn 77 de BABCIP
(SEC ID nº: 1), Asn 75 de AGMCIP (SEC ID nº: 2), Asn 80 de SQMCIP
(SEC ID nº: 3), Asn 77 de OWMCIP (SEC ID nº: 4), Asn 77 de MARCIP
(SEC ID nº: 5), Asn 77 de HVS-15 (SEC ID nº: 6) y
Asn 77 de CD59 (SEC ID nº: 7). De estas CIP con terminal
Ly-6, se prefiere CD-59. Como se
expuso anteriormente, un dominio TM preferida es el de CD46. Por
consiguiente, una forma de realización particularmente preferida de
la invención comprende los restos 1 a 77 de CD-59
(SEC ID nº: 7) fusionados a los aminoácidos 270 a 350 de CD46 (SEC
ID nº: 8).
Además de lo anterior, la presente invención
proporciona vectores con expresión recombinante que incluyen
fragmentos de ácido nucleico que codifican las TMTCIP híbridas de la
invención. La molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína
híbrida se puede insertar en un vector con expresión apropiada, es
decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la
transcripción y la traducción de la secuencia insertada que codifica
la proteína. Las señales de transcripción y traducción necesarias
pueden también ser aportadas por los genes utilizados para construir
los genes de fusión de la invención y/o sus zonas de flanqueo.
Las secuencias de control de transcripción y de
traducción para los sistemas con vector de expresión que se han de
utilizar para dirigir la expresión en las células de vertebrados
pueden estar aportadas por fuentes víricas. Por ejemplo, activadores
y potenciadores habitualmente utilizados proceden de Polyoma
virus, Adenovirus, Simian Virus 40 (SV40), el virus de leucemia
murina Molony (MMLV), incluyendo la repetición larga terminal
(MMLV-LTR), y el citomegalovirus humano (CMV),
incluyendo el activador y el potenciador del gen 1 primero inmediato
al citomegalovirus. Los vectores con expresión retrovírica son un
sistema preferido para la expresión de las TMTCIP de la
invención.
La manipulación de ácidos nucleicos retrovíricos
para construir vectores retrovíricos y concentrado de eritrocitos se
realiza utilizando técnicas conocidas en la materia. Véase Ausubel
et al., 1992, volumen 1, sección III (unidades 9.10.1 -
9.14.3); Sambrook, et al., 1989; Miller, et al., 1989;
Eglitis, et al., 1988; patentes US nº 4.650.764, nº
4.861.719,
nº 4.980.289, nº 5.122.767 y nº 5.124.263; además de las publicaciones de las patentes PCT nº WO 85/05629, nº WO 89/07150, nº WO 90/02797, nº WO 90/02806, nº WO 90/13641, nº WO 92/05266, nº WO 92/07943, nº WO 92/14829 y nº WO 93/14188.
nº 4.980.289, nº 5.122.767 y nº 5.124.263; además de las publicaciones de las patentes PCT nº WO 85/05629, nº WO 89/07150, nº WO 90/02797, nº WO 90/02806, nº WO 90/13641, nº WO 92/05266, nº WO 92/07943, nº WO 92/14829 y nº WO 93/14188.
En particular, los vectores retrovíricos de la
invención se pueden preparar y utilizar de la forma siguiente. En
primer lugar, se construye un vector retrovírico TMTCIP y se
concentra en partículas víricas transductoras no infecciosas
(viriones) utilizando un sistema de concentración anfótropo,
preferentemente uno adecuado para su utilización en aplicaciones de
terapia génica.
Ejemplos de dichos sistemas de concentración se
encuentran en, por ejemplo, Miller et al., 1986;
Markowitz,
et al., 1988; Cosset, et al., 1990; patentes U.S. nº 4.650.764, nº 4.861.719, nº 4.980.289, nº 5.122.767 y nº 5.124.263 y publicaciones de patente PCT nº WO 85/05629, nº WO 89/07150, nº WO 90/02797, nº WO 90/02806, nº WO 90/13641, nº WO 90/13641, nº WO 92/05266, nº WO 92/07943, nº WO 92/14829 y nº WO 93/14188. Un concentrado de eritrocitos preferido es la línea celular de concentrado de eritroitos PA317 (ATCC CRL 9078).
et al., 1988; Cosset, et al., 1990; patentes U.S. nº 4.650.764, nº 4.861.719, nº 4.980.289, nº 5.122.767 y nº 5.124.263 y publicaciones de patente PCT nº WO 85/05629, nº WO 89/07150, nº WO 90/02797, nº WO 90/02806, nº WO 90/13641, nº WO 90/13641, nº WO 92/05266, nº WO 92/07943, nº WO 92/14829 y nº WO 93/14188. Un concentrado de eritrocitos preferido es la línea celular de concentrado de eritroitos PA317 (ATCC CRL 9078).
La generación de "células productoras" se
realiza introduciendo vectores retrovíricos en el concentrado de
eritrocitos. Ejemplos de dichos vectores retrovíricos se encuentran
en, por ejemplo, Korman, et al., 1987;
Morgenstern, et al., 1990; patentes U.S. nº 4.405.712,
nº 4.980.289 y nº 5.112.767 y las publicaciones de
patentes PCT nº WO 85/05629, nº WO 90/02797 y nº WO 92/07943. Un
vectro retrovírico preferido es el vector pLXSN con expresión
derivado de MMLV (Miller, et al., 1989). El vector
retrovírico utilizado en la práctica de la presente invención se
modificará para incluir el gen híbrido que codifica la TMTCIP.
Las células productoras generadas por los
procedimientos anteriores se utilizan para producir partículas de
vector retrovírico (viriones). Esto se realiza cultivando células en
un medio de cultivo adecuado. Preferentemente, se recogen los
viriones del cultivo y se administran a las células objetivo que se
han de transducir, p. ej.: células xenógenas que se han de utilizar
para el trasplante en un paciente cuyo complemento se puede inhibir
mediante el CIP con terminal
Ly-6 de la TMTCIP, células de un órgano xenógeno que se han de utilizar para el trasplante de dicho paciente, las propias células del paciente y otras células que se han de proteger del ataque por el complemento, además de células madre tales como las células madre embrionarias no humanas, que se pueden utilizar para generar células transgénicas, tejidos u órganos para trasplantes. Como alternativa, cuando es practicable, las células objetivo se pueden cultivar conjuntamente con las células productoras. Los tampones y las condiciones adecuados para el almacenamiento estable y la posterior utilización de los viriones se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, et al., 1992.
Ly-6 de la TMTCIP, células de un órgano xenógeno que se han de utilizar para el trasplante de dicho paciente, las propias células del paciente y otras células que se han de proteger del ataque por el complemento, además de células madre tales como las células madre embrionarias no humanas, que se pueden utilizar para generar células transgénicas, tejidos u órganos para trasplantes. Como alternativa, cuando es practicable, las células objetivo se pueden cultivar conjuntamente con las células productoras. Los tampones y las condiciones adecuados para el almacenamiento estable y la posterior utilización de los viriones se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, et al., 1992.
Las composiciones farmacéuticas que contienen las
partículas del vector retrovírico de la invención se pueden
administrar en varias formas de dosificación unitaria. La dosis
variará según, p. ej.: el vector concreto, la forma de
administración, la enfermedad concreta que se está tratando y su
gravedad, la salud en general y el estado y la edad del paciente, el
estado de las células que se está tratando y el criterio del médico.
Las concentraciones de la dosis para la transducción de las células
del mamífero están comprendidas generalmente entre aproximadamente
10^{6} y 10^{14} unidades de partículas de vector retrovírico
formadoras de colonias por tratamiento.
Se pueden utilizar diversas formulaciones
farmacéuticas para la administración de partículas de vector
retrovírico de la invención. Las formulaciones adecuadas se
encuentran en, por ejemplo,
\hbox{ Remington's Pharmaceutical
Sciences }, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17ª
ed., 1985 e incluyen un excipiente farmacéuticamente eficaz tal como
solución salina, solución salina tamponada (p. ej.: tamponada con
fosfato), solución de Hank, solución de Ringer, dextrosa/solución
salina, soluciones de glucosa y similares. Cuando se requiera las
formulaciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables, tales como, agentes para el ajuste de
la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas,
conservantes, estabilizantes y similares.
Según determinados aspectos de la invención, las
moléculas de ácido nucleico de la presente invención se utilizan
para generar animales transgénicos no humanos modificados
genéticamente (por ejemplo, roedores, p. ej.: ratón, rata, capibara
y similares, lagomorfos, p. ej.: conejo, liebre y similares,
ungulados, p. ej.: cerdo, vaca, cabra, oveja y similares, etc.) que
expresan las TMTCIP de la invención en las superficies de sus
células (p. ej.: células endoteliales) utilizando técnicas conocidas
en la materia. Estas técnicas incluyen, pero o se limitan a
microinyección, p. ej.: de pronúcleos, electroporación de huevos o
zigotos, trasplante nuclear y/o la transfección o transducción
estable de células madre embrionarias procedentes del animal
seleccionado.
Un elemento común de estas técnicas implica la
preparación de una unidad de transcripción transgénica. Dicha unidad
comprende una molécula de ADN que generalmente incluye: 1) un
activador, 2) la secuencia de ácido nucleico en cuestión, es decir,
la secuencia que codifica la TMTCIP de la presente invención, y 3)
una secuencia con señal de poliadelinación. Si se desea se pueden
incluir otras secuencias, tales como, las secuencias del potenciador
y del intrón. La unidad se puede preparar convenientemente aislando
un fragmento de restricción de un vector del plásmido que expresa la
proteína TMTCIP en células de mamífero, por ejemplo.
Preferentemente, el fragmento de restricción está exento de
secuencias que dirigen la replicación a las células huesped
bacterianas ya que dichas secuencias son conocidas por presentar
efectos perjudiciales en la viabilidad del embrión.
El procedimiento mejor conocido mejor conocido
para producir animales transgénicos es el que se utiliza para
producir ratones transgénicos mediante superovulación de la hembra
donante, eliminación quirúrgica del huevo, inyección de la unidad de
transcripción transgénica en los pronúcleos del embrión e
introducción del embrión transgénico en el aparato reproductor de
una madre huesped pseudopreñada, generalmente de la misma especie.
Véase Wagner, patente U.S. nº 4.873.191, Brinster, et al.,
1985, Hogan, et al., 1986, Robertson 1987, Pedersen, et
al., 1990.
Los expertos en la materia practican asimismo
ampliamente la utilización de este procedimiento para producir
ganado transgénico. Como ejemplo, se producen cerdos transgénicos de
forma rutinaria mediante la microinyección de una unidad de
transcripción transgénica en los embriones del cerdo.
Véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 92/11757. En resumen,
este procedimiento puede, por ejemplo, ser realizado de la forma
siguiente.
En primer lugar, se aisla la unidad de
transcripción transgénica, como gel y se purifica extensamente a
través de, por ejemplo, una columna ELUTIP (Schleicher &
Schuell, Keene, NH), dializada frente a tampón de inyección exento
de pirógenos (Tris 10 mM, pH 7,4 + EDTA 0,1 mM en agua exenta de
pirógenos) y se utiliza para inyección en el embrión.
Los embriones se recuperan del oviducto de una
cerda a la que se provoca la ovulación, hormonalmente sincronizada,
preferentemente en la etapa pronuclear. Se colocan en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml que contiene aproximadamente 0,5 ml de
medio de transferencia de embrión (solución salina tamponada con
fosfato con suero de ternero fetal al 10%). Estos se centrifugan
durante 12 minutos a 16.000 \times g en una microcentrífuga. Se
retiran los embriones del tubo de microcentrífuga con una con una
pipeta Pasteur alargada y limpia y se colocan en una placa de Petri
de 35 mm para examen. Si el citoplasma es todavía opaco con lípidos
de modo que los pronúcleos no son claramente visibles, se
centrifugan los embriones otra vez durante 15 minutos adicionales.
Los embriones que se han de microinyectar se colocan en una gota de
medio (aproximadamente 100 \mul) en el centro de la tapa de una
placa de Petri de 100 mm. Se utiliza aceite de silicona para cubrir
esta gota y llenar la tapa para impedir la evaporación del medio. La
tapa de la placa de Petri que contiene los embriones se coloca en un
microscopio invertido equipado tanto con una etapa calentada (37,5 a
38ºC) como con ópticas de contraste de modulación de Hoffman
(aumento final: 200\times). Se utiliza una micropipeta muy fina
alargada y limpia para estabilizar los embriones, mientras que se
liberan dentro del núcleo aproximadamente 1 a 2 picolitros de tampón
de inyección que contiene aproximadamente 200 a 500 copias de la
unidad de transcripción transgénica purificada, preferentemente en
el pronúcleo masculino, con otra espátula fina y una micropipeta
limpia. Los embriones que sobreviven al proceso de microinyección
clasificados mediante observación morfológica se cargan en un tubo
de polipropileno (ID de 2 mm) para su transferencia a una cerda
receptora pseudopreñada.
Se determina la presencia del transgen en las
crías aislando ADN genómico del tejido extraído de la cola de cada
lechón y sometiendo aproximadamente 5 microgramos de este ADN
genómico a análisis de hibridación del ácido nucleico con una sonda
específica transgénica.
Otra técnica utilizada frecuentemente para
generar animales transgénicos no humanos implica la manipulación
genética de células madre embrionarias no humanas (células ES)
descritas en la publicación de la patente nº WO 93/02188 y
Robertson, 1987.
Según esta técnica, las células ES se cultivan
como se describe en, por ejemplo, Robertson, 1987, y en la patente
U.S. nº 5.166.065 de Williams et al. El material genético se
introduce en las células madre embrionarias mediante, por ejemplo,
electroporación según, por ejemplo, el procedimiento de McMahon,
et al., 1990 o mediante transducción con un vector
retrovírico según, por ejemplo, el procedimiento de Robertson, et
al., 1986, o por cualquiera de las diversas técnicas descritas
or Lovell-Badge, 1987.
Se generan animales híbridos según describe, por
ejemplo, Bradley, 1987. En resumen, se introducen células ES no
humanas modificadas genéticamente dentro de blastocistos y a
continuación se implantan los blactocistos modificados en animales
hembra no humanos pseudopreñados. Se seleccionan híbridos de entre
las crías, por ejemplo, mediante la observación de la coloración del
mosaico de cabra resultante de las diferencias en la cepa utilizada
para preparar los blastocistos y se crían para producir animales
transgénicos no híbridos.
Otros procedimientos para la producción de
animales transgénicos se dan a conocer en la patente U.S.
nº 5.032.407 de Wagner et al., y en la
publicación PCT nº WO 90/08832.
Entre otras aplicaciones, los animales
transgénicos preparados según la invención son útiles como sistemas
modelo para probar el xenotrasplante de sus tejidos u órganos
modificados genéticamente y como fuentes de tejidos u órganos
modificados genéticamente para xenotrasplantes. La expresión de las
TMTCIP funcionales en las superficies de las células endoteliales
y/o otros tipos de células en los tejidos y órganos (p. ej.: las
células productoras de hormonas tales como las de los islotes
pancreáticos) de animales transgénicos proporcionarán un aumento de
protección en estas células, tejidos y órganos a partir del rechazo
hiperagudo mediado por el complemento después del xenotrasplante en
animales receptores, p. ej.: pacientes humanos, cuyo complemento
puede ser inhibido por la CIP con terminal Ly-6 de
la TMTCIP. Además de su utilización para producir órganos para
trasplante, las construcciones de ácido nucleico de TMTCIP de la
invención se pueden también utilizar para modificar genéticamente
células cultivadas (p. ej.: células endoteliales, de varias especies
para su utilización posterior en trasplantes.
Aunque en la presente memoria se describen e
ilustran las formas de realización específicas de la invención, debe
entenderse que estas modificaciones se pueden realizar sin apartarse
del espíritu y alcance de la invención.
Por ejemplo, se pueden modificar las estructuras
primarias de aminoácidos de las TMTCIP de la invención creando
sustituciones de aminoácidos o mutaciones de ácido nucleico. Por lo
menos alguna actividad reguladora del complemento debería permanecer
después de dichas modificaciones. De igual modo, las mutaciones que
no cambian las secuencias de aminoácido, p. ej.: terceros cambios de
nucleótidos en cordones degenerados, están incluidas dentro del
alcance de la invención. Están también incluidas las secuencias que
comprenden los cambios que se observan en las variantes alelas
naturales de los genes CIP y TM utilizados para crear las
TMTCIP.
\newpage
Sin pretender limitarla en ninguna manea, la
presente invención se describirá más completamente mediante los
siguientes ejemplos.
Se construyó una forma de transmembrana de CD59
(CD59-TM) según la presente invención, sustituyendo
la zona carboxilo terminal que contiene la señal de anclaje GPI de
CD59 por la zona carboxilo terminal, incluyendo el dominio de
transmembrana, de MCP (CD46). Se preparó, por digestión del plásmido
pCD59/CCPH (véase más adelante) con SspI y BamHI, un
fragmento de restricción de aproximadamente 314 bp (denominado en lo
sucesivo CD59_{77}) que contiene CD59 truncado en el "Asn de
truncamiento" descrito anteriormente, es decir, el aminoácido 77
de la proteína madura.
Se amplificó por PCR el terminal carboxilo de
CD46 utilizando como plantilla ARNm de células HeLa transcrito al
contrario y los siguientes cebadores: 5'-CGCGAGGCCT
ACTTACAAGC CTCCAG-3' (SEC ID nº: 9) y
5'-CGCGCTATTC AGCCTCTCTG CTCTGC-3' (SEC ID nº: 10). Estos oligonucleótidos amplificaron un fragmento que codifica los aminoácidos 270 a 350 de la proteína madura, zona mostrada anteriormente que comprende un dominio de transmembrana funcional (Lublin, et al., 1991). Se clonó el fragmento de aproximadamente 250 bp producido por esta reacción de PCR en un vector de plásmido utilizando el equipo de clonación T/A (Invitrogen, San Diego, CA). El vector del plásmido pCRII incluido en este equipo sirvió de receptor y la construcción del plásmido resultante se amplificó y se purificó en E. Coli. Se determinó posteriormente la secuencia de la inserción MCP para confirmar que el plásmido contenía la secuencia mostrada en SEC ID nº: 11.
5'-CGCGCTATTC AGCCTCTCTG CTCTGC-3' (SEC ID nº: 10). Estos oligonucleótidos amplificaron un fragmento que codifica los aminoácidos 270 a 350 de la proteína madura, zona mostrada anteriormente que comprende un dominio de transmembrana funcional (Lublin, et al., 1991). Se clonó el fragmento de aproximadamente 250 bp producido por esta reacción de PCR en un vector de plásmido utilizando el equipo de clonación T/A (Invitrogen, San Diego, CA). El vector del plásmido pCRII incluido en este equipo sirvió de receptor y la construcción del plásmido resultante se amplificó y se purificó en E. Coli. Se determinó posteriormente la secuencia de la inserción MCP para confirmar que el plásmido contenía la secuencia mostrada en SEC ID nº: 11.
Se utilizó una zona StuI endógena
descubierta en el extremo 5' del fragmento CD46 por PCR para unir
este dominio a la zona SspI en el extremo 3' de CD59_{77}
en el vector pADNc3 de expresión eucariótica (Invitrogen, San Diego,
CA) para dar el plásmido
pADNc3/CD59-MCP-TM (denominación
ATCC 69530).
Se linealizó la construcción resultante con
EcoRI, se rellenaron los extremos independientes y se unieron
las conexiones BamHI (nº 1071, New England Biolabs, Tozer,
MA) en los extremos romos resultantes. Se digirió está construcción
conectada con BamHI y se subclonó el fragmento liberado en la
zona BamHI del vector pLXSN retrovírico (Miller, et
al., 1989) para dar
pL-CD59-MCP-TM-SN.
Se identificó la expresión en las construcciones con orientación
correcta mediante análisis de enzima de restricción y se confirmó
por secuenciado.
Se preparó mediante amplificación por PCR un
fragmento de ADN que codifica el terminal carboxilo del gen CCPH
utilizando el plásmido pKS-/mCCPH (denominación ATCC nº 69178) como
plantilla y los siguientes cebadores: 5'-CCGGACCTGT
GTAACTTTAA CGAACAGCTT GAAAATATTG GTAGGATATG CAATGGAAAT
TGTTACAAC-3' (SEC ID nº: 12) y 5'-TAGTTACTGC CCGGACATGC-3' (SEC ID nº: 13). Tal como se describió anteriormente para el fragmento MCP por PCR, se clonó los aproximadamente 250 bp de producto CCPH por PCR dentro del plásmido pCRII, dando el plásmido pCRII/CCPH y se secuenció la inserción CCPH para confirmar que el plásmido contenía la secuencia deseada, en este caso la secuencia SEC ID nº: 14.
TGTTACAAC-3' (SEC ID nº: 12) y 5'-TAGTTACTGC CCGGACATGC-3' (SEC ID nº: 13). Tal como se describió anteriormente para el fragmento MCP por PCR, se clonó los aproximadamente 250 bp de producto CCPH por PCR dentro del plásmido pCRII, dando el plásmido pCRII/CCPH y se secuenció la inserción CCPH para confirmar que el plásmido contenía la secuencia deseada, en este caso la secuencia SEC ID nº: 14.
Se digirió a continuación el plásmido pCRII/CCPH
con AvaII y EcoRI, se purificó el fragmento de la
inserción y se subclonó en una reacción de enlace de tres vías con
plásmido pcADN/AMP (Invitrogen) cortado en BamHI y
EcoRI y un fragmento de aproximadamente 300 pares de bases
BamHI - AvaII aislado de la construcción de ADNc CD59
completa en pUC19 (Philbrick et al., 1990). El producto de
este enlace de tres vías se denomina en la presente invención
pCD59/CCPH.
Se transfectó este plásmido en células Balb/3T3 y
se probó la expresión de la superficie celular de epítopos CD59 en
las células por inmunofluorescencia indirecta, como se describe a
continuación en el Ejemplo 2. Como se expuso anteriormente, el
supuesto dominio TM de CCPH contiene dos aminoácidos citoplásmicos,
dentro de los cinco aminoácidos del primer aminoácido citoplásmico,
que son restos de cisteína, propiedad que se cree que se produce a
bajas concentraciones de la expresión de la superficie celular. La
expresión de la superficie celular de los epítopos CD59 fue en
efecto inferior a las concentraciones detectables por análisis de
inmunofluorescencia indirecta.
Se clonó CD59 completo que contiene la señal del
anclaje GPI (CD59-GPI en pADNc3 (Invitrogen)
digerido en BamHI - EcoRI como un fragmento
BamHI - EcoRI obtenido a partir del plásmido
pc8-hCD59-103 (denominación ATCC
69231) para dar el plásmido
pADNc3-CD59-GPI.
El plásmido
pL-CD59-GPI-SN del
vector retrovírico se produjo aislando un fragmento EcoRI de
aproximadamente 1100 bp a partir de una construcción de ADNc de CD59
completa en pUC19 (Philbrick et al., 1990) y uniendo este
fragmento con el plásmido pLXSN. Se identificó la expresión en las
construcciones con orientación correcta mediante análisis de enzima
de restricción.
Se produjo virus anfótropo mediante una línea
celular de eritrocitos ecótropa intermedia según describió Warren
et al., 1987. En resumen, se transfectaron células psi 2
(obtenidas por el Dr. Stephen L. Warren, Department of Pathology,
Yale University School of Medicine, New Haven, CT) con pLXSN o
construcciones pLXSN descritas anteriormente, es decir,
pL-CD59-MCP-TM-S
ó pL-CD59-GPI-SN,
utilizando un choque de DMSO seguido de selección en DMEM que
contiene 500 \mug/ml de G418 (activo) y FCS al 10% inactivado por
calor. Se agruparon los transfectantes y se recogió el sobrenadante
de las células a las 24 horas a una confluencia del 90%. Se utilizó
el choque de virus ecótropos para infectar la línea celular PA317
(denominación ATCC CRL 9078) anfótropa de concentrado de
eritrocitos. Estas células se seleccionaron también en el mismo
medio con G418 después de recoger la solución madre del virus de los
transductores agrupados en el mismo medio sin G418.
Se transfectaron de forma estable células de la
línea celular del fibroblasto murino, Balb/3T3 (denominación ATCC
CCL 163) con pADNc3-CD59-GPI,
pADNc3/CD59-MCP-TM o pADNc3 solos
utilizando el procedimiento del fosfato de calcio (Ausubel, et
al., 1992). Se seleccionaron las células en DMEM conteniendo FCS
al 10% inactivadas con calor y 500 \mug/ml de G418 (activo) y se
aislaron las colonias utilizando probetas de clonación.
Se consiguieron células L de ratón del Dr. Peter
Cresswell, Departamento de Inmunobiología, Escuela de Medicina de la
Universidad de Yale, New Haven, CT. Dichas células L de ratón son
incapaces de expresar las proteínas ancladas en GPI (Ferguson, et
al., 1988). Se transdujeron células L con los sobrenadantes de
virus anfótropos obtenidos utilizando
pL-CD59-GPI-SN,
pL-CD59-MCP-TM-SN
o pLXSN solos añadiendo 1 ml de solución madre de virus a 5 \times
10^{5} células L en un medio que contenía 8 \mug/ml de
polibreno. Después de incubación toda la noche, se añadió medio
conteniendo 500 \mug/ml de G418 y se continuó la selección durante
14 días. Se seleccionaron y analizaron como grupo células L
transducidas. Se analizó la presencia de antígenos CD59 en células
resistentes a G418 en la superficie celular mediante
inmunofluorescencia indirecta utilizando preparaciones de
anticuerpos monoclonales y policlonales. Una preparación de
anticuerpo anti-CD59 policlonal de conejo, nº 349,
que se produjo inyectando conejos con CD59 purificada de eritrocitos
humanos, descrita por Sims et al., 1989, fue proporcionada
por el Dr. Peter Sims (Blood Research Institute, Milwaukee, WI). Los
anti- CD59 mAb, MEM-43, se adquirieron en el
Biodesign International, Kennebunkport, ME.
El análisis por inmunofluorescencia indirecta de
la superficie celular se realizó típicamente en 2,5 \times
10^{5} células con 50 \mug/ml de anticuerpo policlonal primario
ó 20 \mug/ml del anticuerpo monoclonal en 1 \times PBS
conteniendo 2% de suero bovino fetal. Se utilizaron IgG
anti-conejo de cabra o antisuero conjugado con FITC
IgG anti-ratón de cabra como anticuerpos secundarios
(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Se midió la
fluorescencia utilizando un instrumento FACSort
(Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San José,
CA).
La Fig. 2 ilustra los perfiles de expresión de la
superficie celular de un clon positivo Balb/3T3 que expresa
CD59-TM, además de un transfectante CD59 humano
natural (CD59-GPI) como referencia positiva y un
vector (pADNc3) sin transfectante con inserción (vector de
referencia) como referencia negativa. Tal como se muestra en la
presente invención, prácticamente se unió la misma cantidad de
anticuerpo anti-CD59 a las superficies de las
células que expresan la proteína de fusión CD5-TM
que el que se unió a las células de referencia positiva que expresan
el CD59 natural. Este resultado demuestra que en las células Bal/3T3
de la invención (CD59-TM) y en las de referencia
positiva (CD59-GPI) estaban presentes cantidades
equivalentes de antígenos CD59.
Los transfectantes agrupados de la célula L
presentaron un amplio intervalo de expresión de
CD59-TM, tal como es de esperar en las células que
no pueden expresar las proteínas ancladas a GPI,
CD59-GP no se expresó (Figura 3).
Para probar la presencia de un anclaje GIP, se
trataron células con fosfatidilinisitol-fosfolipasa
C (PI-PLC, Boehringer-Mannheim
Corporation, Biomedical Products Division, Indianapolis, Indiana) a
1 U/ml durante 1 h a 37ºC antes del análisis por FACS. Este
tratamiento hidroliza (escinde) anclajes GIP y de este modo libera
proteínas ancladas a GIP de la superficie celular. Se realizó la
digestión PI-PLC en células de Balb/3T3 que expresan
la TMTCIP de CD59-TM (o CD59-GPI
como referencia). En la Figura 4 se presentan los resultados de
estos experimentos. En estos experimentos, falsas células tratadas
(ninguna PI-PLC) mantuvieron la TMTCIP y la CD59
natural en sus superficies celulares (véase la curva D en la Fig. 4A
y Fig. 4B), mientras que el tratamiento con PI-PLC
produjo la pérdida de las CIP de la superficie celular de las
células de referencia CD59 naturales (véase la curva C en la Fig.
4A), pero no las células CD59-TM (véase la curva C
en la Fig. 4B). Estos experimentos demuestran que
CD59-TM no está anclada a la membrana celular
mediante un enlace GPI y que CD59-TM es
prácticamente resistente a la acción de las enzimas lipasa que
pueden escindir un anclaje
glucosil-fosfatidilinisitol (GPI).
Se evaluó la actividad funcional de las moléculas
TMTCIP expresada en células Balb/3T3 transfectadas de ratón y
células L transducidas de ratón, mediante una determinación de
liberación de colorante que consistía en medir la salida de
moléculas del citoplasma, particularmente el colorante indicador
citoplásmico, Calcein AM (Molecular Probes, Inc., Eugene,
Oregón).
Se cultivaron en confluencia en placas de 96
pocillos células transfectadas que expresan la TMTCIP de
CD59-TM, además de células transfectadas con
vectores de expresión materna sin CD59-TM que
codifica inserciones (como referencias). Se lavaron las células
dos veces con 200 \mul de solución equilibrada de sales de Hank
que contiene 10 mg/ml de albúmina de suero bovino (HBSS/BSA).
Se añadió Calcein AM (10 \muM final) y se
incubaron las placas a 37ºC durante 30 minutos para dejar que el
colorante se introduzca en las células y se convierta mediante
esterasas celulares en un derivado fluorescente polar que se
mantiene dentro de las células no dañadas. Se lavaron a continuación
los pocillos dos veces con HBSS/BSA para eliminar el colorante
restante fuera de las células. Se incubaron a continuación las
células con IgG de anti-Balb-3T3 (2
mg/ml en HBSS/BSA), que sirvió como activador de la vía clásica del
complemento. Después de una incubación de 30 minutos a 23ºC, se lavó
la IgG no unida.
Se incubaron a continuación las células a 37ºC
durante 30 minutos en presencia de suero humano con insuficiencia en
C8 humano complementado con C8 y C9 purificados para permitir que
tenga lugar la alteración mediada por el complemento. Se adquirieron
en Quidel Corporation, San Diego, CA, suero humano eliminado el C8,
además de C8 y C9 purificado. Se transfirió a continuación el medio
que baña las células a una placa limpia de 96 pocillos para medición
por fluorescencia.
En las condiciones de esta prueba, el derivado
polar fluorescente de Calcein AM se libera solamente en el medio que
baña las células de la prueba si están involucradas todas las
membranas celulares. Por lo tanto, la fluorescencia de Calcein AM
liberada en el medio que baña las células de la prueba frente a la
conservada en las células proporciona una medida indirecta, pero
exacta del nivel de alteración mediado por el complemento conservado
en las células. Se determinó el colorante restante asociado a las
células a partir de un lisado de SDS al 1% de las células
conservadas en las placas de cultivo de 96 pocillos. Esto permitió
el cálculo del porcentaje de liberación de colorante utilizando las
fórmulas siguientes: Total = liberada + mantenida, y, % de
liberación = (liberada total) \times 100. Se midió la
fluorescencia utilizando un lector de placas de fluorescencia
Millipore CYTOFLUOR 2350 (490 nm de excitación, 530 nm de
emisión).
Las pruebas de liberación de colorante
demostraron que para los clones Balb/3T3 transfectados que
expresan niveles equivalentes de CD59-GPI o
CD59-TM (Fig. 2, CD59-TM
proporcionaron un nivel de protección procedente del ataque del
complemento equivalente al proporcionado por la molécula natural
CD59-GPI, anclada a GPI (Fig. 5). En particular, las
células que expresan ambas moléculas fueron aproximadamente tres
veces más eficaces, impidiendo la lisis mediada por el complemento a
2,5 \mug/ml de C8/C9, que las células transfectadas con el vector
pADNc3 solo, que se lisaron fácilmente.
Estos resultados demuestran que 1)
CD-59-TM se puede expresar de forma
estable en la superficie de las célulasBalb/3T3, y 2) esta molécula
híbrida posee una función comparable a la CD59 natural. La retención
de niveles de tipo natural de la actividad reguladora del
complemento mediante CD59-TM es de considerable
importancia al demostrar que la funcionalidad de la molécula CD59 no
está prácticamente alterada por el truncamiento acoplado con la
adición de un dominio TM. Este resultado podría no haber sido
predicho con anterioridad, especialmente desde otras alteraciones de
la molécula CD59, p. ej.: el truncamiento del terminal carboxilo sin
adición de un dominio TM, o las alteraciones de aminoácidos
individuales, se ha demostrado que producen moléculas con expresión
y/o funcionalidad sustancialmente alteradas. Véase, por ejemplo,
Nakano, et al., 1993; Norris, et al., 1993 y Petranka, et
al., 1993.
Se realizaron también pruebas de liberación de
colorante en células L transducidas de ratón con partículas
retrovíricas de virión generadas utilizando el vector
pL-CD59-MCP-TM-SN,
el vector
pL-CD59-GPI-SN o el
vector pLXSN sin inserción. Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Fig. 6. Únicamente las células L transducidas con
partículas retrovíricas generadas utilizando
pL-CD59-MCP-TM-SN
demostraron protección sustancial frente al ataque del complemento.
Estos resultados demuestran que la molécula híbrida
CD59-TM puede expresarse con éxito en una línea
celular incapaz de expresar proteínas ancladas a GPI y que la
molécula funciona para proteger las células de la lisis del
complemento.
Los resultados anteriores demuestran que CD59
conserva su actividad inhibidora del complemento con terminal
Ly-6 cuando se ancla a la membrana celular mediante
un dominio de transmembrana heterólogo, antes que un anclaje GPI.
Este resultado fundamental, en combinación con la naturaleza
conservada de todas las proteínas inhibidoras de complemento
terminal Ly-6 (véase la solicitud de patente U.S. nº
de serie 08/105.735 y la solicitud de patente U.S. nº de serie
PCT/US93/006772), indica que se puede sustituir un dominio de
transmembrana heterólogo por la secuencia con señal de una proteína
inhibidora de complemento con terminal Ly-6 sin
alterar prácticamente la actividad inhibidora del complemento de la
proteína.
En comparación al utilizar una CPI natural con
terminal Ly-6, las TMTCIP de la invención presentan
las ventajas de que no pueden producir la activación celular del
tipo que depende de la presencia del anclaje GPI de la CPI natural
con terminal Ly-6 y que no se pueden eliminar de la
superficie celular por la acción de enzimas de fosfolipasa y son
menos propensas al desprendimiento vesicular. Estas ventajas hacen a
las TMTCIP de la invención más adecuadas que las CPI naturales con
terminal Ly-6 para varias aplicaciones médicas,
incluyendo la facilitación del trasplante de órganos
xenogenéticos.
Aunque se han descrito en la presente memoria
formas de realización preferidas y otras de la invención, expertos
en la materia pueden percibir y practicar otras formas de
realización, incluyendo una variedad de modificaciones, sin
apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, se pueden
modificar las estructuras primarias de aminoácidos de las proteínas
de fusión de la invención creando mutantes de aminoácidos. Dichos
mutantes conservarían más del 50% de la actividad reguladora del
complemento de la CPI madre terminal. Otras modificaciones y
variaciones incluyen la formación de derivados de la proteína de
fusión al incluir conjugados covalentes o agregados de la proteína o
sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Las siguientes
reivindicaciones están destinadas a cubrir las formas de realización
específicas indicadas además de dichas modificaciones, variaciones y
equivalentes.
En toda esta solicitud, se ha hecho referencia a
varias publicaciones y solicitudes de patente. Las enseñanzas y
descripciones de estas publicaciones, patentes y solicitudes de
patentes están incorporadas íntegramente en la presente memoria como
referencia dentro de esta solicitud para describir más completamente
el estado de la técnica al que pertenece la presente invención.
Los plásmidos
pADNc3/CD59-MCP-TM,
pc8-hCD59-103 y pKS/mCCPH, expuestos
anteriormente, se han depositado en la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852,
Estados Unidos de América, en E. coli y se les ha asignado
las denominaciones 69530, 69231 y 69178, respectivamente. Estos
depósitos se realizaron bajo el Tratado de Budapest sobre
Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos con
fines de Procedimiento de Patente (1977).
Los depósitos mencionados anteriormente que
tienen los números de acceso ATCC 69530, 69231 y 69178 fueron
realizados el 6 de enero de 1.994, 29 de enero de 1993 y 6 de enero
de 1993, respectivamente. El depósito 69530 se realizó en la cepa
TOP10F' de Escherichia coli que presenta el siguiente
genotipo: F'{lacI^{q} TN10(Tet^{R})} mcrA
\Delta (mrr-hsdRMS-mcrBC)
\phi80lacZ\DeltaM15 \DeltalacX74 deoR
recA1 araD139
\Delta(ara-leu)7697 galU galK
rpsL(Str^{R}) endA1 nupG. Los
depósitos 69231 y 69168 se realizaron en la cepa DH5\alpha de
Escherichia coli que presenta el siguiente genotipo: F^{-}
\phi80lacZ\DeltaM15
\Delta(lacZYA-argF)U169 recA1
endA1 hsdR17(r_{k}-, m_{k}+) supE44
\lambda^{-} thi-1 gyrA96 relA1.
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Zhao, et al., 1991. J. Biol.
Chem. 266:13418-13422.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Rother, Russell
\hskip3.38cmRollins, Scott
\hskip3.38cmSquinto, Stephen P
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Genes y proteínas de fusión inhibidores de complemento terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Maurice M. Klee
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1951 Burr Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Fairfield
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Connecticut
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 06430
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: 3,5 pulg, capacidad 720 Kb
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Dell 486/50
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS 6.2
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: Word Perfect 6.0
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/205.720
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO / AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Klee, Maurice M.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.399
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: ALX-129PCT
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (203) 255 1400
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (203) 254 1101
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 763 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de BABCIP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papio hamadryas
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- BANCO DE GENES: ADNc de ZAPII Lambda de bazo de mandril
\hskip5.5cmCatálogo del banco nº 936103,
\hskip5.5cmStratagene Cloning Systems,
\hskip5.5cmLa Jolla, California
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 469 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de AGMCIP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cercopithecus aethiops
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: COS-1 (ATCC CRL 1650)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 396 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de SQMCIP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saimiri sciureus
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: DPSO 114/74 (ATCC CCL 194)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 387 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc con codificación completa de OWMCIP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aotus trivirgatus
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: OMK (ATCC CRL 1556)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 387 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc con codificación completa de MARCIP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saguinus nigricollis
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: 1283.Lu (ATCC CRL 6297)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1039 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de HVS-15
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Herpesvirus saimiri
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Albretht, J.C.
\hskip4.1cmNicholas, J.
\hskip4.1cmCameron, K.R.
\hskip4.1cmNewman, C.
\hskip4.1cmFleckenstein, B.
\hskip4.1cmHoness, R.W.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Herpesvirus saimiri posee un gen que especifica un homólogo de la glucoproteína CD59 de la membrana celular.
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Virology
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 190
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 527-530
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1992
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1139 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de CD59
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Philbrick, W.M.
\hskip4.1cmPalfree, R.G.E.
\hskip4.1cmMaher, S.E.
\hskip4.1cmBridgett, M.M.
\hskip4.1cmSirlin, S.
\hskip4.1cmBothwell, A.L.M.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: El antígeno de C59 es un homólogo estructural de los antígenos Ly-6 murinos, pero carece de la inducivilidad del interferón.
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: European Journal of Immunology
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 20
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 87-92
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- FECHA: ENERO-1990
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1530 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: ADNc completo de MCP (CD46)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Lublin, D.M.
\hskip4.1cmLiszewski, M.K.
\hskip4.1cmPost, T.W.
\hskip4.1cmArce, M.A.
\hskip4.1cmLeBeau, M.M.
\hskip4.1cmRebentisch, M.B.
\hskip4.1cmLemons, R.S.
\hskip4.1cmSeya, T.
\hskip4.1cmAtkinson, J.P.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Clonación molecular y situación cromosómica de la proteína con cofactor de membrana (MCP): Prueba para inclusión en la familia de multigenes de proteínas reguladoras con complemento.
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Journal of Experimental Medicine
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 168
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 181-194
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1988
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCGAGGCCT ACTTACAAGC CTCCAG
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: Sí
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCGCTATTC AGCCTCTCTG CTCTGC
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 261 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Producto PCR de MCP
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCGGACCTGT GTAACTTTAA CGAACAGCTT GAAAATATTG GTAGGATATG
\hfill50
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAATGGAAAT TGTTACAAC
\hfill69
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: Sí
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTAGTTACTGC CCGGACATGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 264 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Producto CCPH PCR
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
Claims (10)
1. Molécula de ácido nucleico,
caracterizada porque comprende:
- (a)
- una secuencia que codifica una proteína híbrida que comprende:
- (i)
- una primera zona de polipéptido que comprende una parte de una proteína madre inhibidora de complemento terminal, incluyendo dicha parte un motivo Ly-6 completo y que no incluye una secuencia con señal operativa que dirige el ataque de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI); y
- (ii)
- una segunda zona de polipéptido unida a dicha primera zona de polipéptido, comprendiendo dicha segunda zona de polipéptido un dominio de transmembrana de una proteína heteróloga; o
- (b)
- una secuencia complementaria a (a); o
- (c)
- tanto (a) como (b).
2. Proteína híbrida, caracterizada porque
comprende:
- (i)
- una primera zona de polipéptido que comprende una parte de una proteína madre inhibidora de complemento terminal, incluyendo dicha parte un motivo Ly-6 completo y que no incluye una secuencia con señal operativa que dirige el ataque de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI); y
- (ii)
- una segunda zona de polipéptido unida a dicha primera zona de polipéptido, comprendiendo dicha segunda zona de polipéptido un dominio de transmembrana de una proteína heteróloga.
3. Molécula de ácido nucleico o proteína híbrida
según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha
proteína híbrida posee más del 50% de la actividad inhibidora del
complemento de la proteína materna inhibidora del complemento
terminal.
4. Molécula de ácido nucleico o proteína híbrida
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la parte
de la proteína materna inhibidora del complemento terminal comprende
dicha proteína materna menos los residuos de aminoácido corriente
abajo de su motivo Ly-6.
5. Molécula o proteína según las reivindicaciones
1 a 4, en la que la proteína híbrida posee una actividad inhibidora
del complemento frente al complemento humano.
6. Vector de ácido nucleico, caracterizado
porque comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 3 a 5 unida operativamente a una segunda
molécula de ácido nucleico, de modo que un huésped que contiene
dicho vector expresa dicha proteína híbrida.
7. Célula huésped recombinante,
caracterizada porque comprende un vector según la
reivindicación 6.
8. Procedimiento para proteger un órgano no
humano del ataque del complemento humano, caracterizado
porque comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico
según la reivindicación 5 en una célula pluripotente capaz de
producir un animal transgénico no humano y la producción de dicho
animal transgénico no humano a partir de dicha célula, de modo que
aumenta la resistencia de un órgano de dicho animal transgénico no
humano al ataque del complemento.
9. Célula transgénica, tejido u órgano no humano
para trasplante que expresan una molécula de ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 ó 5, o que expresan una
proteína híbrida, según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4 y
5.
10. Utilización de una molécula de ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 ó 5 o una proteína
híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4 ó 5, para
la preparación de un medicamento para la prevención del ataque
patológico del complemento.
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