JP2002532061A - Ａｐｊ受容体とｈｉｖウイルスとの相互作用を調節するための方法及び組成物 - Google Patents

Ａｐｊ受容体とｈｉｖウイルスとの相互作用を調節するための方法及び組成物

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JP2002532061A JP2000568964A JP2000568964A JP2002532061A JP 2002532061 A JP2002532061 A JP 2002532061A JP 2000568964 A JP2000568964 A JP 2000568964A JP 2000568964 A JP2000568964 A JP 2000568964A JP 2002532061 A JP2002532061 A JP 2002532061A
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ミトロビク，ブランスラバ
ツォウ，イーキン
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Abstract

(57)【要約】 孤児性７回膜貫通ドメイン受容体APJは、HIVウイルスによる細胞感染のための補助受容体として機能し得る。CD4及びAPJを同時発現する細胞株の確立によって、HIV感染に関する研究及び抗HIV治療の開発を行うための有用な手段が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 HIVウイルスの細胞への進入には、そのウイルスの外皮タンパク質(env)のCD4
への結合、それに続くいくつかの補助受容体の中の１つとの相互作用が関与して
いる(E.A.Berger, 1997, AIDS, 11:S3-S16;Broder et al., 1997, J.Leukocyte
Biol., 62:20-29;Doms et al., 1997, Virology, 235:279-190;及びMoore et al
., 1997, Curr.Opinion Immunol., 9:551-562)。envタンパク質と適当な補助受
容体との結合が、envの立体構造変化を誘起し、それがウイルス膜と宿主細胞膜
との融合を仲介すると考えられている。ケモカイン受容体CCR5及びCXCR4が、HIV
-1の主要な補助受容体であることが、これまで調べられた全てのHIV-1株が前記
分子の一方又は両方を第二の受容体として利用するということから、同定された
。CCR5は、R5(M指向性)ウイルス株による感染を補助し、一方CXCR4は、X4(T指向
性)ウイルス単離体による感染を補助する(Alkhatib et al., 1996, Science, 27
2:1955-1958;Berger et al., 1998, Nature, 391:240;Choe et al., 1996, Cell
, 85:1135-1148;Deng et al., 1996, Nature, 381:661-666;Doranz et al., 199
6, Cell, 85:1149-1158;Dragic et al., 1996, Nature, 381:667-673;及びFeng
et al., 1996, Science, 272:872-877)。細胞への進入のために、R5-X4(二重指
向性)ウイルスのenvタンパク質は、CD4と共にCCR5又はCXCR4のいずれかを利用す
る。HIV株によるCCR5及びCXCR4の異なる利用性、並びにCD4陽性細胞におけるCCR
5及びCXCR4の発現パターンから、進入レベルでのウイルスの指向性が大まかに説
明される。
【０００２】 CCR5及びCXCR4以外に、多数の他のケモカイン受容体及び７回膜貫通型の孤児(
オーファン)受容体が、１又は複数のウイルス株においてインビトロで補助受容
体として機能することが示された。これらには、CCR2b, CCR3, CCR8, CX3CR1, G
PR1, GPR15, STRL33, US28及びChemR23が含まれる(Choe et al., 1996, Cell 85
:1135-1148;Deng et al., 1997, Nature 388:296-300;Doranz et al., 1996, Ce
ll 85:1149-1158;Farzan et al., 1997, J.Exp.Med.186:405-411;Liao et al.,
1997, J.Exp.Med.195:2015-2023;Pleskoff et al., 1997, Science 276:1874-18
78;Reeves et al., 1997, Virology 231:120-134;Rucker et al., 1997, J.Viro
l.71:8999-9007)。一般に、これらの代わりの補助受容体は、CCR5又はCXCR4のい
ずれかに比べてウイルス感染を効率良く補助しない。しかし代わりの補助受容体
が利用されることから、HIV-1の指向性及び病原性に関する一側面が容易に説明
され得る。例えば、神経疾患は、HIV-1感染により誘発される重症且つ比較的多
発な疾患であり、この場合、ミクログリアが中枢神経系におけるウイルス感染の
主要な標的である(Bagasra et al., 1996, AIDS, 10:573-585;Sharer et al., 1
992, J.Neuropath.Exp.Neurol., 51:3-11;Wiley et al., 1986, Proc.Natl.Acad
.Sci., USA, 83:7089-7093)。ミクログリアは、CCR3及びCCR5の両方を発現して
おり、ウイルス株によるCCR3の利用が、神経指向性と相関することが示唆されて
いる(He et al., 1997, Nature 385: 645-649)。 HIVウイルスのための補助受容体を追加同定することにより、HIV感染の研究及
び制御のための重要な手段が提供されるだろう。
【０００３】発明の要旨 １つの点として、本発明は、APJポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
及び／又はCD4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって形質転換さ
れた組換え真核細胞であって、APJ及びCD4ポリペプチドを共発現する前記細胞に
関する。
【０００４】 本発明はまた、APJの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、APJ及
びCD4ポリペプチドを共発現する標的細胞へのHIV感染を阻害する前記抗体、ある
いはAPJ及びCD4ポリペプチドを共発現する１番目の細胞とHIVのenvタンパク質を
発現する２番目の細胞との膜融合を阻害する前記抗体に関する。
【０００５】 本発明はまた、実質的に純粋なAPJのペプチド断片であって、APJ及びCD4ポリ
ペプチドを共発現する標的細胞へのHIV感染を阻害する前記ペプチド、あるいはA
PJ及びCD4ポリペプチドを共発現する１番目の細胞とHIVのenvタンパク質を発現
する２番目の細胞との細胞融合を阻害する前記ペプチドに関する。
【０００６】 更に別の点として、本発明は、HIVウイルスとAPJ受容体との相互作用を調節す
る化合物を同定するための方法に関する。 本発明はまた、APJ及びCD4ポリペプチドを発現する標的細胞へのHIV感染を阻
害する方法であって、前記標的細胞を、有効量のAPJ結合剤又は遮断剤と接触さ
せることを含んで成る前記方法に関する。 本発明はまた、HIV感染又はその関連疾患を有する患者、又はその危険性があ
る患者を治療するための方法であって、治療上有効な量の抗APJ抗体を前記患者
に投与することを含んで成る前記方法に関する。
【０００７】発明の詳細な説明 本発明において、７回膜貫通型孤児受容体であるAPJ(O'Dowd et al., 1993, G
ene 136: 355-360)が、多数のHIV-1及びSIV株のために有効な補助受容体として
機能することが見出された。APJは、いくつかのX4(T指向性)及びR5-X4(二重指向
性)ウイルス株のために非常に有効な補助受容体として機能するが、一方２つのR
5(M指向性)単離体によるAPJの利用効率はそれほど良くない。APJはまた、いくつ
かのSIV株のための補助受容体として機能する。
【０００８】 更に本発明において、APJは、人間の中枢神経系に広く発現していることが見
出された。多数のウイルス株によるAPJの効率的な利用、並びに前記中枢神経系
におけるAPJの発現から、この受容体の利用が、HIVによる神経病症状において重
要であることが指摘される。 また本発明において、CD4陽性Ｔ細胞株C8166におけるAPJの発現が見出された
。
【０００９】 １つの態様では、本発明は、APJ及びCD4ポリペプチドを共発現し、且つ、APJ
ポリペプチド又はCD4ポリペプチドのいずれかをコードする外来性ポリヌクレオ
チドを含有する組換え細胞株に関する。本発明はまた、APJ及びCD4ポリペプチド
を共発現し、且つ、APJポリペプチドコードする外来性ポリヌクレオチド及びCD4
ポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを含有する組換え細胞株に関
する。本文中で「CD4ポリペプチド」とは、哺乳動物のCD4ポリペプチド、好まし
くは人間又はサルのCD4ポリペプチド、あるいはそれらの生物学的に活性な断片
を指す。本文中で「APJポリペプチド」とは、哺乳動物のAPJポリペプチド、好ま
しくは人間又はサルのAPJポリペプチド、あるいはそれらの生物学的に活性な断
片を指す。本文中で「生物学的に活性な」とは、HIV又はSIVウイルスと特異的に
相互作用する能力を有するポリペプチド、及び、APJ又はCD4ポリペプチドと相互
作用する抗体のための少なくとも１つのエピトープを有するポリペプチドを表す
。
【００１０】 本発明は、天然のAPJ及びCD4ポリペプチドだけでなく、変異APJ及びCD4ポリペ
プチドにも関する。本発明では、例えば、APJのアミノ酸配列の変異が考えられ
る。APJタンパク質をコードするDNAを改変することによってAPJタンパク質の変
異を達成し得る。好ましくは、同一又は類似の特性を有するアミノ酸を用いて、
アミノ酸配列の保存的な改変のみを行う。このアミノ酸置換の例には以下の改変
が含まれる：アラニンからセリンに；アルギニンからリシンに；アスパラギンか
らグルタミン又はヒスチジンに；アスパラギン酸からグルタミン酸に；システイ
ンからセリンに；グルタミンからアスパラギンに；グルタミン酸からアスパラギ
ン酸に；グリシンからプロリンに；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミン
に；イソロイシンからロイシン又はバリンに；ロイシンからバリン又はイソロイ
シンに；リシンからアルギニン、グルタミン又はグルタミン酸に；メチオニンか
らロイシン又はイソロイシンに；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又は
メチオニンに；セリンからスレオニンに；スレオニンからセリンに；トリプトフ
ァンからチロシンに；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンに；バ
リンからイソロイシン又はロイシンに。
【００１１】 本発明のポリヌクレオチド配列には、APJ又はCD4ポリペプチドをコードするDN
A, cDNA及びRNA配列が含まれる。前記ポリヌクレオチドには、天然の、合成の、
そして意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、代わりの別の
RNAスプライシングパターンのために、又はRNA転写のための代わりの別のプロモ
ーターの使用のために、当該mRNA配列の部分が改変されてよい。別の例として、
APJ及びCD4ポリヌクレオチドに、部位特異的変異誘発を施してもよい。APJ及びC
D4のポリヌクレオチド配列には、アンチセンス配列も含まれる。また本発明には
、生物学的な活性を有するAPJポリペプチド又は生物学的な活性を有するCD4ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００１２】 適当な細胞の種類には、限定ではなく、下記の種類の細胞が含まれる：NIH3T3
(マウス), Mv 1 lu(ミンク), BS-C-1(アフリカミドリザル), ヒト胎児腎臓(HEK)
293細胞(ATCC CRL 1573)及びウズラのQT6細胞が含まれる。この様な細胞は、例
えば、American Type Culture Collection(ATCC)の細胞株目録に記載されている
。これらの細胞を、当業者に既知の方法によって安定に又は一過性に形質転換し
得る。例えばAusubel, et al., Introduction of DNA Into Mammalian Cells, i
n Current Protocols in Molecular Biology, sections 9.5.1-9.5.6(John Wile
y & Sons, Inc.1995)参照。本発明のにおいて「安定な」形質転換とは、形質転
換細胞が、少なくとも50回分裂する程度に不死であることを意味する。
【００１３】 外来性のAPJ又はCD4ポリヌクレオチドを、誘導的又は構成的発現のための調節
要素を用いて発現させてよい。一般的に用いられる構成的又は誘導的プロモータ
ーが、当業界に周知である。例えば、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモー
ター(例えばメタロチオネインプロモーター)又は哺乳動物ウイルスに由来するプ
ロモーター(例えばレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)、アデノウイルスの
後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を用い得る。外来性
のAPJ又はCD4ポリヌクレオチドの転写のために、組換えDNA操作又は合成技術に
よって作成されたプロモーターを用いてもよい。
【００１４】 所望タンパク質をコードする配列及びそれに作用可能に連結されたプロモータ
ーを、線状の非複製性DNA(又はRNA)分子として、又は、好ましくは共有結合によ
る閉環状分子として受容細胞に導入し得る。この様な分子は自律複製できないの
で、所望タンパク質の発現は、前記導入配列の一過的な発現を介して行われ得る
。あるいは、前記導入配列の宿主染色体への組込みを介して、永久的な発現が行
われ得る。
【００１５】 好ましい態様では、前記導入配列を、受容宿主内で自律複製できるプラスミド
又はウイルスベクターに組込む。このために、広範な種類のベクターが用いられ
る。特定のプラスミド又はウイルスベクターを選択する際に、以下のことが重要
な要素となる。すなわち、当ベクターを含有しない受容細胞から、当ベクターを
含有する受容細胞を同定且つ選択することの容易さ；特定の宿主において望まれ
るベクターのコピー数；そして、異なる種の宿主細胞間でのシャトルベクターで
あることを希望するかどうか。
【００１６】 発現のために、いくつかのベクター系が利用できるだろう。１つ目のベクター
系は、動物ウイルス、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス又はSV40ウイルスに由来する、自律複製する染色体外プラスミドを
供給するDNA要素を利用したものである。２つ目のウイルス系は、ワクシニアウ
イルス発現ベクターである。３つ目のウイルス系は、宿主染色体への所望遺伝子
配列の組込みに頼るものである。
【００１７】 前記の導入配列が染色体内に安定に組み込まれた細胞を、その発現ベクターを
含有する宿主細胞の選択を可能にする１又は複数のマーカー(例えば外来性遺伝
子)を導入することによって、選択できる。この様なマーカーは、独立栄養性宿
主に原栄養性を、あるいは殺生物剤耐性、例えば抗生物質耐性又は重金属耐性、
例えば銅耐性を付与するものでよい。この選択性マーカー遺伝子を、発現させる
DNA配列に直接連結するか、又は同時形質転換により同一細胞に導入することが
できる。mRNAの最適な合成のために、その他の要素を必要とする場合もある。こ
の様な要素には、スプライスシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、及び
停止シグナルが含まれる。前記要素を組込んだcDNA発現ベクターの例が、Okayam
a, H., Mol.Cell.Biol., 3:280 (1983)などに記載されている。
【００１８】 発現のために、当該構成体を含有するベクター又はDNA配列を調製し、そのDNA
構成体を適当な宿主に導入（形質転換）することができる。このために種々の方
法、例えば、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、微
注入法、リポソーム供給法、ウイルス感染法、又はその他の従来の方法を用い得
る。
【００１９】 別の態様では、本発明は、ヒトのCD4及びAPJポリペプチドを共発現する細胞を
有するトランスジェニック動物に関する。この様なトランスジェニック動物は、
HIV感染の研究、及びより有効な抗HIV治療の開発のためのモデル系となる。
【００２０】 本文中の用語「動物」とは、人間以外の全ての哺乳動物種を指す。これには、
発生の全ての段階、例えば胚及び胎児段階、にある動物個体も含まれる。本発明
では農業用動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギなど）、齧歯類（例
えばマウス）、及び家庭用動物（例えばネコ及びイヌ）も対象に含まれる。
【００２１】 「トランスジェニック」動物とは、細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作、例
えばマイクロインジェクション又は組換えウイルス感染によって、直接又は間接
的に獲得した遺伝情報を有する細胞を含有する任意の動物を指す。本文中の「ト
ランスジェニック」とは、古典的な交配又はインビトロ受精を意味せず、むしろ
１又は複数の細胞が組換えDNA分子を獲得した動物を指す。当該分子が、その動
物の染色体に組み込まれることが非常に好ましいが、本発明では、染色体外で複
製するDNA配列の使用も考えられ、例えば酵母人工染色体の使用もあり得る。
【００２２】 用語「トランスジェニック動物」にはまた、生殖細胞系のトランスジェニック
動物も含まれる。生殖細胞系トランスジェニック動物は、生殖細胞系に当該遺伝
情報が取り込まれ、そのためその情報を子孫に伝達する能力が付与されたトラン
スジェニック動物のことである。その様な子孫が実際に、当該情報の一部又は全
部を有する場合、それらもまたトランスジェニック動物と言える。
【００２３】 非常に好ましくは、本発明のトランスジェニック動物の作成は、当該ポリヌク
レオチドが成熟動物の生殖細胞のDNAに安定に組み込まれ、それが通常のメンデ
ル様式で遺伝される様に、APJポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び
／又はCD4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを一細胞期胚(single cel
l embryos)に導入することによる。胚のマイクロ操作技術の進展により、現在で
は、哺乳動物の受精卵に外来性ポリヌクレオチドを導入することができる。例え
ば、全能性又は多能性幹細胞を、微注入法、リン酸カルシウム沈殿法、リポソー
ム融合法、レトロウイルス感染法、又はその他の方法によって形質転換すること
ができ、次にその形質転換細胞を胚内に導入し、そしてその胚をトランスジェニ
ック動物まで育てる。好ましい方法では、発生中の胚に、所望のポリヌクレオチ
ドを含有するレトロウイルスを感染させ、そしてその感染胚からトランスジェニ
ック動物を育てる。
【００２４】 最も好ましい方法では、適当なポリヌクレオチドを、胚の、好ましくは一細胞
期の胚の前核又は細胞質に同時注入し、その胚を成熟トランスジェニック動物に
成長させる。これらの技術は周知である。例えば、哺乳動物（マウス、ブタ、ウ
サギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ）の受精卵に外来性DNAを微注入するための標準的実
験方法に関する参考書には、Hogan et al., Manipulating The Mouse Embryo(Co
ld Spring Harbor Press 1986);Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:86(191
1);Palmiter et al., Cell 41:343(1985);Kraemer et al., Genetic Manipulati
on of The Early Mammalian Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press 198
5);Hammer et al., Nature 315:680(1985);Purcel et al., Science 244:128(19
86);Wagner et al., U.S.Patent No.5, 175, 385;Krimpenfort et al., U.S.Pat
ent No.5, 175, 384がある。
【００２５】 APJ又はCD4をコードするポリヌクレオチドを、ベクター内の転写及び停止調節
下に適切な読み枠で融合することにより、遺伝的構成体を作ることができ、これ
を次に、従来の方法に従って、例えば細菌ベクターの調製法によって増幅する。
例えば、標準的な参考書であるSambrook et al., Molecular Cloning: a Labora
tory Manual (Cold Spring Harbor Press 1989)参照。その後そのベクターから
、増幅された構成体を切り出し、トランスジェニック動物の作成に用いるために
精製する。
【００２６】 ヒトCD4遺伝子を保有するトランスジェニック動物の作成が報告されている。S
nyder et al., Mol. Reprod. & Devel. 40:419-428 (1995)及びDunn et al., J.
Gen. Virology 76:1327-1336 (1995)参照。
【００２７】 別の態様では、本発明は、APJと結合し、且つCD4陽性標的細胞へのHIVの進入
を阻害するか、又はCD4及びAPJポリペプチドを発現する１番目の細胞種とenvタ
ンパク質を発現する２番目の細胞種との細胞間融合を阻害する抗体に関する。本
文中、envタンパク質とは、HIVウイルス、HIV-1又はHIV-2のいずれかに由来する
、あるいはSIVウイルスに由来する任意のenvタンパク質を意味する。細胞による
任意のenvタンパク質の発現により、典型的にはその細胞表面にenvタンパク質の
gp120部分が出現する。本発明の抗体は、gp120のAPJへの結合も阻害し得る。こ
の様な抗体は、HIV感染の研究及びより有効な抗HIV治療の開発において、実験手
段及び診断手段に成り得る。更に、抗APJ抗体を含有する医薬組成物は、有効な
抗HIV治療薬に成り得る。
【００２８】 envにより仲介される細胞融合、CD4陽性細胞へのHIVの進入、又はAPJへのgp12
0の結合を妨害するために適した抗体は、APJポリペプチドの細胞外領域、例えば
図９に示す通り、第一細胞外領域（アミノ酸１〜25）、第二細胞外領域（アミノ
酸91〜103）、第三細胞外領域（アミノ酸168〜198）、又は第四細胞外領域（ア
ミノ酸272〜284）の少なくとも一部分に特異的なものである。好ましい抗体は、
第一細胞外領域又は第二細胞外領域のいずれかの部分を含んで成るエピトープを
認識するものである。特に好ましい抗体は、第一細胞外領域内に存在するアミノ
酸配列Asn-Tyr-Tyr-Gly(配列番号３)を含んで成るエピトープを認識するもので
ある。
【００２９】 本発明の抗APJ抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びに
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の断片が含まれる。ポリクローナル抗体
の調製は当業者に周知である。例えばGreen et al., Production of Polyclonal
Antisera, in Immunochemical Protocols(Manson, ed.), Pages 1-5(Humana Pr
ess 1992);Coligan et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,
Rats, Mice and Hamsters, in Current Protocols in Immunology, section 2.4
.1(1992)参照。
【００３０】 同様にモノクローナル抗体の調製も従来方法による。例えばKohler & Milstei
n, Nature 256:495(1975);Coligan et al., Current Protocols in Immunology,
sections 2.5.1-2.6.7;及びHarlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual,
page 726(Cold Spring Harbor Pub.1988)参照。端的には、抗原を含有する組成
物をマウスに注射し、血清試料中の抗体生産を確認し、その脾臓からＢリンパ球
を取り出し、そのＢリンパ球をメラノーマ細胞と融合させてハイブリドーマを作
成し、そのハイブリドーマを株化し、抗原に対する抗体を生産する陽性株を選択
し、そしてそのハイブリドーマ培養から抗体を単離する。種々の確立した方法に
よって、ハイブリドーマ培養から、モノクローナル抗体を単離且つ精製すること
ができる。この様な単離方法には、プロテイン-Aセファロースによる親和性クロ
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、抗原親和性クロマトグラフィ
ー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えばColigan et al., Cu
rrent Protocols in Immunology, sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-
2.9.3;Barnes et al., Purification of Immunoglobulin G(IgG), in Methods i
n Molecular Biology, Vol.10, pages 79-104(Humana Press 1992)参照。
【００３１】 モノクローナル抗体のインビトロ及びインビボ生産方法は、当業者に周知であ
る。適当な培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地又はRPMI1640培地、場合に
より哺乳動物の血清、例えばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖維持補助体、
例えば正常マウスの腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージを補充した前
記培地中で、インビトロ生産を行い得る。インビトロ生産では、比較的に純粋な
抗体調製品が得られ、しかも大量の所望の抗体を得るために生産規模の拡大が可
能である。大規模なハイブリドーマの培養を、通気反応器(airlift reactor)又
は連続撹拌反応器における均一縣濁培養によって、あるいは固定式又は捕獲式(e
ntrapped）細胞培養によって行い得る。インビボ生産は、抗体生産性腫瘍を増殖
させるために生産細胞株を、それの親細胞に組織適合する哺乳動物に、例えば共
通遺伝子性(osyngeneic)マウスに注射することによって行われ得る。場合によっ
ては、注射の前に当動物を、炭化水素、特に油、例えばプリスタン(テトラメチ
ルペンタデカン)によって初期化する。１〜３週間後に当動物の体液から所望の
モノクローナル抗体を回収する。
【００３２】 ここに開示した抗APJ抗体の治療適用もまた、本発明の一部である。例えば、
本発明の抗体は、人間より下等な霊長類の抗体から得てもよい。ヒヒにおいて治
療上有用な抗体を生産するための一般的な方法が、Goldenberg et al., WO91/11
465 (1991)及びLosman et al., Int.J.Cancer 46:310 (1990)に記載されている
。
【００３３】 あるいは、治療上又は診断上有用な抗APJ抗体は、「ヒト化した(humanized)」
モノクローナル抗体に由来するものでよい。ヒト化したモノクローナル抗体の作
成は、マウス免疫グロブリンの可変性重鎖及び軽鎖からマウスの相補的決定領域
をヒトの可変ドメインに移し、次にマウスの対応部分の枠組み領域内でヒト残基
を置換することによる。ヒト化したモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使
用により、マウスの定常部の免疫原生に伴う潜在的な問題が回避される。マウス
免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングするための一般的技術は、例えば
Orlandi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。
ヒト化したモノクローナル抗体を生産するための技術は、例えばJones et al.,
Nature 321:522(1986);Riechmann et al., Nature 332:323(1988);Verhoyen et
al., Science 239:1534(1988);Carter et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89:42
85(1992);Sandhu, Crit.Rev.Biotech. 12:437(1992);及びSinger et al., J.Imm
unol.150:2844(1933)に記載されている。
【００３４】 本発明の抗体はまた、免疫グロブリンの組合せ(combinatorial)ライブラリー
から単離したヒトの抗体断片に由来するものでもよい。例えばBarbas et al., M
ethods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol.2, page 119 (1991)及び
Winter et al., Ann.Rev.Immunol. 12: 433 (1994)参照。ヒト免疫グロブリンの
ファージライブラリーを作成するために有用なクローニング及び発現ベクターを
、例えばStratagene Cloning Systems (La Jolla, CA)から得ることができる。
【００３５】 更に本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来するものでもよい。この
様な抗体を、抗原投与に対して特異的なヒト抗体を生産する様に工学的に改変さ
れたトランスジェニックマウスから得る。この技術において、ヒトの重鎖及び軽
鎖の遺伝子座の要素を、内在性の重鎖及び軽鎖の遺伝子座を標的として破壊した
胚細胞系に由来するマウス株に導入する。このトランスジェニックマウスは、ヒ
ト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そしてこのマウスを、ヒト抗
体を分泌するハイブリドーマを作成するために用いることができる。トランスジ
ェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al., Nature Genet
. 7:13 (1994); Lonberg et al., Nature 368:856 (1994); 及びTaylor et al.,
Int. Immunol. 6:579 (1994)に記載されている。
【００３６】 本発明の抗体断片を、当該抗体のタンパク質分解性の加水分解によって、又は
前記断片をコードするDNAの大腸菌による発現によって調製することができる。 従来の方法によって、抗体全体をペプシン又はパパインによって消化すること
によって抗体断片を得ることができる。例えば、F(ab')2と称する5S断片を得る
ために、抗体をペプシンによって酵素的に分解することによって抗体断片を得る
ことができる。更に3.5Sの一価断片Fab'及びFc断片を直接作成するために、前記
断片をチオール還元剤によって切断することができ、場合によっては、ジスルフ
ィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基の保護基を用いる。これらの方法は
、例えば、Goldenberg, 米国特許4,036,945及び4,331,647に記載されている。ま
たNisonhoff et al., Arch.Biochem.Biophys.89:230(1960);Porter, Biochem.J.
73:119(1959);Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol.1, page 422(Acad
emic Press 1967);及びColigan et al., Current Protocols in Immunology, se
ctions 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4参照。
【００３７】 抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽−重鎖断片を形成するための重鎖
及び軽鎖の分離、断片の更なる切断、あるいは他の酵素的、化学的又は遺伝的技
術も、当該抗体が認識する抗原と結合する断片を作るために用いられ得る。
【００３８】 例えば、Fv断片は、VH鎖とVL鎖の結合体を含んで成る。Inbar et al., Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 69:2659 (1972)の記載通り、この結合は非共有結合でよい。
あるいは、前記可変鎖を、分子間ジスルフィド結合、又はグルタルアルデヒドな
どの化学薬品による架橋結合によって連結することができる。例えばSandhu, Cr
it.Rev.Biotech. 12:437 (1992)参照。好ましくは、当Fv断片は、ペプチドリン
カーによって結合されたVH鎖及びVL鎖を含んで成る。これらの単鎖性抗原結合タ
ンパク質(sFv)を、オリゴヌクレオチドによって連結されたVH及びVLドメインを
コードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を作成することによって調製する。
この構造遺伝子を発現ベクター内に挿入し、これを次に大腸菌などの宿主細胞内
に導入する。この組換え宿主細胞は、前記の２つのVドメインを架橋するリンカ
ーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を生産する。sFvを生産するための方法
は、例えばWhitlow et al., Methods:A Companion to Methods in Enzymology,
Vol.2, page 97(1991);Bird et al., Science 242:423-426(1988);Ladner et al
., U.S.Patent No.4, 946, 778;Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77(1993
);及びSandhu, Crit. Rev.Biotech. 12:437(1992)に記載されている。
【００３９】 抗体断片の別の型は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドであ
る。CDRペプチド(「最小認識単位」)を、注目の抗体のCDRをコードする遺伝子を
作成することによって得ることができる。例えばポリメラーゼ鎖反応法によって
抗体生産細胞のRNAから当該可変領域を合成し、そして前記遺伝子を調製する。
例えばLarrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol
.2, page 106 (1991)参照。
【００４０】 別のHIV補助受容体であるCXCR4ケモカイン受容体に結合する抗体は、感染のた
めにCXCR4受容体を利用するHIV株の融合を妨害することが示されている(Feng, e
t al., Science 272:872 (1996); Endres, et al., Cell 87:745 (1996))。
【００４１】 別の態様では、本発明は「APJ変異体」に関する。本文中でAPJ変異体とは、AP
Jの構造体の少なくとも部分を擬似し、且つCD4及びAPJポリペプチドを発現する
標的細胞へのHIVの進入を阻害するか、又はCD4及びAPJポリペプチドを発現する
１番目の細胞種と、envタンパク質を発現する２番目の細胞種との細胞間融合を
阻害する分子を意味する。HIV単離株のenvタンパク質は、細胞表面のAPJとの結
合を介して、HIVの感染性に関与し得る。特定の理論によって本発明を限定する
ことを望まないが、本発明者は、APJ変異体は、envとの結合に関してAPJと競合
することによって、HIVの感染性を妨害し得ると考える。
【００４２】 １つの態様では、本発明は、APJよりも少ないアミノ酸残基を有するペプチド
及びペプチド誘導体であるAPJ変異体に関する。この様なペプチド及びペプチド
誘導体は、HIV感染の研究及びより有効な抗HIV治療の開発において研究用及び診
断用手段に成り得る。本発明のAPJのペプチド及びペプチド誘導体には、APJの細
胞外領域、例えば、図９に示した第一細胞外領域（アミノ酸１〜25）、第二細胞
外領域（アミノ酸91〜103）、第三細胞外領域（アミノ酸168〜198）、又は第四
細胞外領域（アミノ酸272〜284）に相当するものが含まれる。HIVの別の補助受
容体であるCCR5補助受容体の細胞外ループに相当するペプチドは、以前に、HIV-
1のenvを発現する細胞と、CD4及びCCR5を共発現するマウス細胞との融合を阻害
することが示されている(Combadiere et al., PCT/US97/09586, WO97/45543)。
好ましいペプチド及びペプチド誘導体は、第一細胞外領域又は第二細胞外領域の
いずれかの一部分に相当するものである。特に好ましいペプチド又はペプチド誘
導体は、第一細胞外領域内のアミノ酸配列Asn-Tyr-Tyr-Gly(配列番号３)を包含
するものである。
【００４３】 本発明のために有用であるAPJ変異体には、APJの類似体、相似体、突然変異体
及び擬似体が含まれる。当変異体を、化学的修飾、タンパク質分解酵素的消化、
又はそれらの組合せによって、APJ自体から直接作ることができる。更に遺伝子
工学的手法、並びにアミノ酸配列からの直接的なポリペプチド合成法を用いるこ
ともできる。
【００４４】 αアミノ基のt-BOC又はFMOC保護法などの一般的な方法によって、本発明のペ
プチドを合成することができる。両方法は、当該ペプチドのＣ末端から始めて単
一アミノ酸を各段階毎に付加する段階的合成を用いる(Coligan, et al., Curren
t Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9参照)。本発明
のペプチドを、周知の固相式ペプチド合成法(Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:
2149(1962)及びStewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman,
San Francisco, 1969)pp.27-62)によって、0.1-1.0mMolアミン/gポリマーを含有
するコポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)を用いて合成することもできる。化学
合成の終了時に、当ペプチドを脱保護化し、そして液体HF−10％アニソールによ
って約1/4〜１時間０℃で処理することによって前記ポリマーから切り離すこと
ができる。前記試薬を蒸発させた後、当ペプチドを、１％酢酸溶液によって前記
ポリマーから抽出し、次に凍結乾燥して粗生成物を得る。一般にこの粗生成物を
、標準的な方法、例えば５％酢酸を溶媒としたSephadex G-15上でのゲル濾過に
よって精製することができる。このカラムの適当な分画を凍結乾燥することによ
って、均一なペプチド又はペプチド誘導体が得られ、次にそれを、例えばアミノ
酸分析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外線吸光
分光分析、モル旋光度、溶解度などの標準的な方法によって特性評価し、そして
固相式エドマン分解分析によって定量することができる。
【００４５】 あるいは、当業者に周知の組換え法によってペプチドを生産することもできる
。 本文中の用語「実質的に精製された」とは、その他のタンパク質、脂質、炭水
化物、核酸、及び天然に含有されるその他の生物学的物質が実質的に存在しない
分子、例えばペプチドを指す。例えば、実質的に純粋な分子、例えばポリペプチ
ドとは、乾燥重量で少なくとも60％の注目の分子を意味し得る。当業者は、標準
的なタンパク質精製方法によってAPJペプチドを精製することができ、そして当
ポリペプチドの純度を、標準的な方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動
(例えばSDS-PAGE)、カラムクロマトグラフィー(例えば高性能液体クロマトグラ
フィーHPLC)、及びアミノ末端アミノ酸配列分析によって決定することができる
。
【００４６】 APJの結合性及び機能を擬似する非ペプチド性化合物（擬似物）を、Saragovi
et al., Science 253:792-95 (1991)に示された方法によって生産することがで
きる。擬似物とは、タンパク質の二次構造を擬似する分子のことである。例えば
Johnson et al., Peptide Turn Mimetics, Biotechnology and Pharmacy, Pezzu
to et al., Eds. (Chapman and Hall, New York 1993)参照。ペプチド擬似物を
使用する基礎原理は、タンパク質中のペプチド骨格が、分子相互作用を促進する
様にアミノ酸側鎖を適応させるために主に存在するということである。本発明の
この目的のために、適当な擬似物をAPJ自体の等価物と見なすことができる。
【００４７】 より長いペプチドを、ペプチドを互いに連結する「天然化学」連結技術(Dawso
n et al., Science 266:776 (1994))によって生産することができる。ゲノム又
はcDNAクローニング法による組換え技術によって、変異体を作ることができる。
部位特異的及び領域特異的変異誘発方法を用いることもできる。Current Protoc
ols in Molecular Biology, Vol.1, ch.8(Ausubel et al., eds., J.Wiley & So
ns 1989 & Supp.1990-93);Protein Engineering(Oxender & Fox eds., A.Liss,
Inc.1987)参照。更に、変異誘発のためにリンカースキャン法及びPCR法を用いる
こともできる。PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press 1989); Current
Protocols in Molecular Biology, Vols.1 & 2前出、参照。前記方法と共に使用
するタンパク質の配列決定、構造及びモデル化方法が、前記のProtein Engineer
ing及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols.1 & 2に開示されてい
る。
【００４８】 前記化合物を用いた場合、当業者は、本文中の細胞間融合の検査系及び感染性
の検査系の観点から、当化合物を本発明に使用できることを日常作業的に確認す
ることができる。
【００４９】 本発明はまた、CD4及びAPJポリペプチドを発現する標的細胞へのHIVの進入を
阻害する種々の医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物を、本発明のAPJ変異体
又は抗APJ抗体を担体、賦形剤及び添加剤又は補助剤と組み合せて、患者への投
与に適する形にすることによって、調製する。頻繁に用いられる担体又は補助剤
には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他
の糖、タルク、ミルク、タンパク質、ゼラチン、スターチ、ビタミン、セルロー
ス及びその誘導体、動物性及び植物性油、ポリエチレングリコール及び溶媒、例
えば滅菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールが含まれる。静脈注
射用媒体は液体及び栄養補給剤を含有する。保存剤には、抗微生物剤、酸化防止
剤、キレート化剤及び不活性ガスが含まれる。その他の医薬上容認される担体に
は、水性溶液、非毒性賦形剤、例えば塩、保存剤、緩衝剤、そして例えばReming
ton's Pharmaceutical Science, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405
-1412, 1461-1487 (1975)に記載された類似物が含まれる。当医薬組成物のpH及
び種々の成分の正確な濃度を、当業界の標準技術に従って調整する。Goodman an
d Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed)参照。
【００５０】 別の態様では、本発明は、標的細胞へのHIVの進入を阻害する方法に関する。
この方法は、治療上有効な量の、本発明の化合物及び医薬上容認される担体を含
有する医薬組成物を患者に投与することを含んで成る。本発明の医薬組成物の投
与は、当業者に周知の方法によって行われる。「患者」とは、任意の哺乳動物、
好ましくは人間を指す。例えば、HIV-1血清陽性の母親から生まれた新生児の脳
に神経障害が認められている(Kolson et al., 1998, Adv.Virus Res. 50:1-47)
。従って、特に好ましい方法は、HIVに感染した又は感染の危険性がある胎児患
者を、抗APJ抗体又はAPJペプチド断片の投与によって治療する方法である。好ま
しくは、抗APJ抗体及びAPJペプチド断片を、母親への投与を介して胎児患者に投
与する。
【００５１】 好ましくは当医薬組成物を投与単位で調製且つ投与する。固形投与単位は錠剤
、カプセル剤及び坐剤である。患者治療のために、当化合物の活性、投与様式、
当該疾患の性質及び重症度、患者の年齢及び体重に応じて、異なった一日投与量
が必要である。しかし一定の状況下では、より多い又は少ない投与量が適当な場
合もある。一日投与量を、個別の投与単位形又はいくつかのより小さな投与単位
形で一回投与するか、あるいは小さく分割した投与形を一定間隔で複数回投与す
ることができる。
【００５２】 本発明の医薬組成物を、一般的には局所的に、静脈に、経口的に、腸管外に又
は移植体として投与するが、原理的には直腸に適用することもできる。適当な固
体又は液体の医薬剤形は、例えば顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠剤、（ミクロ）カ
プセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、縣濁剤、クリーム剤、エアゾル剤、点滴剤
(drops)又はアンプル型の注射溶液、そして活性化合物の遅延性放出のための製
剤である。これらの製剤には、前記通り、賦形剤及び添加剤及び／又は補助剤、
例えば崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑沢剤、香料、甘味料又は溶解剤が通
常用いられる。当医薬組成物は、種々の薬物供給系での使用に適するものである
。現在の薬物供給法に関する簡単な説明のために、Langer, Science 249: 1527-
1533 (1990)を参照すること。
【００５３】 本発明の医薬組成物を局所的に又は全身性に投与し得る。「治療上有効な量」
とは、当該疾患及びその合併症の症状を予防、治療、又は少なくとも部分的に停
止するために必要である本発明の化合物の量を意味する。このために有効な量は
、当然、当疾患の重症度、並びに患者の体重及び総状態に依存するだろう。典型
的には、インビトロで用いた投与量からインサイチュでの当医薬組成物の投与に
有用な量を有効に推定し、そして動物モデルを用いて、特定の疾患を治療するた
めに有効な投与量を決定することができる。これに関する種々の考察が、例えば
Gilman et al.(eds.)(1990)Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases
of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press;及びRemington's Pharmaceutical
Sciences, 17th ed.(1990), Mack Publishing Co., Easton, PAに記載されてい
る。
【００５４】 本発明の別の好ましい態様は、HIV感染に対する感受性を診断することである
。APJ受容体をコードするヌクレオチド配列及びAPJ受容体に対する抗体は、感染
感受性の診断に特に有用であり得る。この場合当受容体レベルがより高いほど、
HIV感染の危険性が増加することを意味する。例えば、中枢神経系の組織におい
てAPJ受容体がより高レベルであれば、HIV感染に伴う神経病発症の危険性が増加
し得る。
【００５５】 当受容体のヌクレオチド配列又はその断片を用いて、ノーザンブロット法、定
量的PCRなどの当業界に既知の適当な方法によって、APJのRNA発現レベルを測定
することができる。
【００５６】 あるいは抗APJ抗体を用いて、ウエスタンブロット法などの標準的な方法によ
って、APJ受容体を発現する細胞の存在を検出することができ、そしてFACS又はE
LISAなどの標準的な方法によって、その発現レベルを定量することができる。任
意の生物学的組織試料において、APJの発現レベルが基準レベルより高いことは
、HIV感染に対する感受性が増加することを意味する。大きな個体集団を検査す
ることによって基準レベルを確立し得る。
【００５７】 好ましい態様では、本発明は、抗HIV薬理活性に関して化合物（試験化合物）
をスクリーニングするための方法に関する。 １つの態様では、抗HIV薬理活性を有する化合物をスクリーニングするために
、細胞融合検査を行う。この細胞融合検査では、APJ及びCD4ポリペプチドを共発
現するある種類の真核細胞を、HIVの外皮タンパク質(env)を発現する別の種類の
真核細胞とインキュベーションする。次にこれらの２種類の細胞間の融合を検査
する。前記細胞を混合する前又は後に、試験化合物を当インキュベーション溶液
に加え、そして細胞の融合率に対するその効果を、任意の方法、例えば形態学的
観察、又は当細胞融合検査に用いられる指示体系によって決定する。細胞融合検
査に有用な指示体系は、細胞間融合によって１つ目の細胞内の１つ目の成分が、
２つめの細胞内の２つ目の成分に接触すると、検出可能シグナルが生じる様にな
る要素の組合せでよい。例えば１つめの成分は、T7ポリメラーゼなどのポリメラ
ーゼをコードする遺伝子であり、２つ目の成分は、T7プロモーターの支配下にあ
るリポーター分子をコードする遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子である。例
えば、細胞融合時に活性βガラクトシダーゼリポーター分子を生じる系も考えら
れる。
【００５８】 別の態様では、抗HIV薬理活性を有する化合物をスクリーニングするために、
感染性検査を行う。感染性検査では、APJ及びCD4ポリペプチドを発現する標的真
核細胞を、HIVのenvタンパク質を発現する試験ウイルスとインキュベーションす
る。次に当試験ウイルスの標的細胞への感染を検査する。標的細胞と試験ウイル
スとを混合する前又は後に、試験化合物を当インキュベーション溶液に加え、そ
して標的細胞の感染率に対する試験化合物の効果を任意の方法で決定する。当試
験ウイルスはリポーターウイルスでよく、この場合そのenvタンパク質が、リポ
ーターウイルス上に偽出現する。あるいは当試験ウイルスは完全なHIVウイルス
でもよい。一般的に感染性を、当感染性検査に用いられる指示体系によって検査
する。任意の指示体系を用いてよく、感染時に検出可能なシグナルを生じる指示
体系が好ましい。例えば当リポーターウイルスは、当ウイルスが標的細胞に感染
すると発現するリポーター分子、例えばルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼ
をコードする遺伝子を含んで成る。別の例として、当標的細胞は、LTRプロモー
ターの調節下にあるリポーター分子をコードする遺伝子を含むものでよく、従っ
てこの場合、標的細胞にHIVウイルスが感染すると当リポーター分子が発現する
。あるいは、感染細胞内のウイルス配列をPCRによって検出することによって、
ウイルス感染を検査し得る。
【００５９】 当細胞融合検査及びHIV感染性検査によって、多種類のCD4陽性細胞（組換え生
産したもの又は天然のもの）、例えば限定でなくNIH3T3(マウス)、BS-C-1(アフ
リカミドリザル)、HEK293(ヒト)、Mv1Lu(ミンク)、U-87 MGグリア芽腫、SCL1及
びQT6(ウズラ)にenv仲介性融合能を付与するAPJの機能活性を決定することがで
きる。当検査に用い得るHIV株、又は当検査に用いるenvタンパク質遺伝子の供給
源としてのHIV株には、M指向性、T指向性及び二重指向性株がある。例えば、89.
6二重指向性株、JRFL M指向性株、及びIIIB T指向性HIV-1株を用い得る(Matthew
s et al., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9709-9713;Collman et al., 1992
, J.Virol.66:7517-7521;Gartner et al., 1986, Science 233:215-219)。更に
、選択された初代単離体を用いてもよい。
【００６０】 種々の薬物スクリーニング法が当業者に周知である。従ってHIVに対して有効
である薬剤をスクリーニングするために、APJ受容体の特性を活用する種々の方
法において当細胞融合検査及びHIV感染検査を用いることができる。
【００６１】 本発明の別の態様は、APJを有する細胞のHIV感染を阻害する特異的且つ強力な
手法として、例えば細胞のAPJ発現量を減少させるために、アンチセンス技術を
使用することに関する。本発明におけるアンチセンスポリヌクレオチドには、通
常10〜50塩基から成るオリゴヌクレオチドとしての短いDNA配列、並びにAPJ遺伝
子配列自体の長さを超え得るより長いDNA配列の両方が含まれる。本発明に有用
であるアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する標的mRNAの特異的領域に相補
的なものである。アンチセンスポリヌクレオチドと標的転写産物とのハイブリダ
イゼーションは、相補的な塩基対の結果として非常に特異的に成り得る。アンチ
センスポリヌクレオチドのハイブリダイズ能力は、転写産物の長さ、化学修飾及
び二次構造など、ポリヌクレオチドの標的部位への接近性に影響し得るパラメー
ターによって変化する。Stein et al., Cancer Research 48:2659 (1988)参照
。当ポリヌクレオチドをコードするDNA断片を、それが細胞内で生産される様に
細胞に導入することによって、アンチセンスポリヌクレオチドを細胞に導入し得
る。あるいは細胞が当ポリヌクレオチドを取り込む様に、その細胞外環境に当ポ
リヌクレオチドを付加することによって、アンチセンスポリヌクレオチドを細胞
内に導入することもできる。後者の方法は、長さが約20塩基までの短いポリヌク
レオチドのために好ましい。
【００６２】 所定のポリヌクレオチドにおいて好ましい長さを選択する際に、最も好適な特
性を得るために、バランスを取る必要がある。10〜15量体などの短いポリヌクレ
オチドは、細胞通過性がより高いが、遺伝子特異性がより低い。対照的に20〜30
塩基のより長いポリヌクレオチドは、特異性がより高いが、細胞への取込み率が
低かった。Stein et al., Phosphorothioate Oligodeoxynucleotide Analogues
in Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitors of Gene Expression(Cohen,
ed., McMillan Press, London 1988)参照。標的mRNA配列への接近性も重要であ
り、標的mRNAのループ形成領域は有望な標的となる。
【００６３】 本文中、用語「ポリヌクレオチド」は、天然に存在する型のオリゴマー性核酸
部分、例えばDNA及びRNAのデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド構造
、並びに天然に存在する核酸に結合し得る人工的な類似物の両方を含んでいる。
本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結されたリボヌ
クレオチド又はデオキシリボヌクレオチドか、あるいはメチルホスホネート、ホ
スホロチオエート又はその他の結合によって連結された類似物に基づき得る。そ
れらはまた、改変された塩基構造又はその他の修飾を有するモノマー部分を含有
するが、それでもなお天然のDNA及びRNA構造に結合する能力を維持するものでよ
い。この様なポリヌクレオチドを、当業界に周知の方法、例えば、Perkin-Elmer
/Applied Biosystems (Foster City, CA)から入手できる市販の機器及び試薬を
用いて、調製することができる。
【００６４】 ホスホジエステル結合によるポリヌクレオチドは、血清中又は細胞内のヌクレ
アーゼの作用を特に受けやすい。従って好ましい態様では、本発明のポリヌクレ
オチドは、ヌクレアーゼ耐性であることが知られているホスホロチオエート又は
メチルホスホネート結合による類似物である。当業者は、本発明に用いるための
その他の結合様式を選択し得る。この様な修飾は、当ポリヌクレオチドの細胞取
り込み性及び安定性を改良する様に設計し得る。
【００６５】 本発明の別の態様では、当アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に発現
構成体を導入することによって生産されるRNA分子である。従ってAPJのmRNAにハ
イブリダイズすることができる様に、この生産されるRNA分子を選択する。この
様な能力を有する当該分子は、APJのmRNAの翻訳を阻害し、従って当RNAを有する
細胞へのHIVの感染能を阻害することができる。
【００６６】 標的mRNAとハイブリダイズする能力を有する当ポリヌクレオチドは、対応する
遺伝子産物の発現を、複数の作用機序を介して阻害することができる。「翻訳停
止」では、ポリヌクレオチドと標的mRNAとの相互作用により、リボゾーム複合体
の作用を妨害し、その結果mRNAからタンパク質への翻訳が抑制される。Haeuptle
et al., Nucl.Acids.Res. 14:1427 (1986)。ホスホジエステル又はホスホロチ
オエート結合性DNAポリヌクレオチドの場合、標的RNAが当DNAオリゴマーに一旦
ハイブリダイズすると、その標的RNA配列が細胞内のRNアーゼHによって消化され
る。Walder and Walder, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5011 (1988)。別の作用
機序である「転写停止」では、いくつかのポリヌクレオチドが、注目遺伝子を包
含する二重鎖ゲノムDNAと共に「三重体(triplex)」又は三重らせん構造を形成し
、その結果RNAポリメラーゼによる転写を妨害する。Giovannangeli et al., Pro
c,Natl.Acad.Sci. 90:10013 (1993)及びEbbinghaus et al., J.Clin.Invest. 92
:2433 (1933)。
【００６７】 １つの好ましい態様では、APJポリヌクレオチドを標準的な方法によって合成
する。ホスホロチオエート修飾DNAポリヌクレオチドを、典型的には、種々の製
造業者からの自動DNA合成機によって合成する。これらの機器は、100ヌクレオチ
ドまでのポリヌクレオチドをナノモル量で合成することができる。最新機器によ
って合成した短いポリヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は逆
相クロマトグラフィーによって精製し得る。Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, Vol.2, Chapter 11, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)参照。
【００６８】 あるいは、アンチセンスRNA形であるAPJポリヌクレオチドを、細胞内で標準的
なDNA発現ベクターから発現させることによって細胞に導入し得る。APJのDNAア
ンチセンス配列を、標準的なプラスミドから、その存在ポリヌクレオチドのレベ
ルを高める又はより効率的な発現を行わせることができる特性を有する発現ベク
ターにクローン化することができる。最低限、これらの構成体は、挿入されたDN
A配列の転写を開始する原核性又は真核性プロモーター配列を必要とする。好ま
しい発現ベクターは、高レベルの発現を誘導し得るものである。これは、適当な
宿主細胞内で下流配列の転写を増加させる調節領域を付加することによって達成
される。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3,
Chapter 16, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
(1989)参照。
【００６９】 例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、APJのcDNAが組み込まれたプラ
スミド、例えばpRc、の一本鎖cDNAから適当な断片を増幅することによって、APJ
アンチセンス発現ベクターを作成することができる。Fang et al., J.Biol.Chem
. 267:25889-25897 (1992)。ポリヌクレオチド合成及び精製方法は、各々Sambro
ok et al.及びAusubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biolog
y (Wiley Interscience 1987)(以下Ausubelと略す)に記載されている。PCRは周
知の方法によって行われる。例えばAusubel, 及びBangham, The Polymerase Cha
in Reaction: Getting Started, Protocols in Human Molecular Genetics (Hum
an Press 1991)参照。またPCRキットを、Stratagene Cloning Systems (La Joll
a, CA)やInvitrogen (San Diego, CA)などの会社から購入することができる。
【００７０】 前記のPCR産物をクローニングベクターにサブクローン化する。本文では「ク
ローニングベクター」とは、原核宿主細胞内で自律的に複製することができるDN
A分子、例えばプラスミド、コスミド又はバクテリオファージのことである。ク
ローニングベクターは典型的に、当ベクターの必須な生物学的機能を損なわずに
確定的に外来DNA配列を挿入することができる１又は少数の制限酵素認識部位、
並びに当ベクターによって形質転換された細胞の同定及び選択での使用に適する
マーカー遺伝子を含有する。適当なクローニングベクターは、Sambrook et al.,
Ausubel, 及びBrown(ed), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)
に記載されている。クローニングベクターは、例えばGIBCO/BRL(Gaitherburg, M
D), Clontech Laboratories, Inc.(Palo Alto, CA), Promega Corporation(Madi
son, WI), Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA), Invitrogen(San Diego
, CA), 及びthe American Type Culture Collection(Rockville, MD)から購入で
きる。
【００７１】 好ましくは、前記PCR産物をTAクローニングベクター内に連結する。チミジン
又はアデニンが突出したPCR産物を作成する方法は、当業者に周知である。例え
ばAusubel, 15.7.1-15.7.6参照。またこのTAクローニングを行うためのキットを
、Invitrogen (San Diego, CA)などの会社から購入できる。
【００７２】 当クローニングベクターによってコンピテントな細菌細胞を形質転換し、その
細菌宿主細胞を適当な抗生物質の存在下で増殖させることによって、クローン化
されたアンチセンス断片を増幅する。例えばSambrook et al.,及び Ausubel参照
。次にPCRによって、APJアンチセンス方向クローンを有する細菌宿主細胞をスク
リーニングする。 細菌宿主細胞におけるPCRの使用は、例えばHoffman et al.,
Sequencing DNA Amplified Directly from a Bacterial Colony, in PCR Protoc
ols:Methods And Applications, White(ed.), pages 205-210(Humana Press 199
3), 及びCooper et al., PCR-Based Full-Length cDNA Cloning Utilizing the
Universal-Adaptor/Specific DOS Primer-Pair Strategy, Id.pages 305-316に
記載されている。
【００７３】 当クローニングベクターから、クローン化されたアンチセンス断片を切り出し
、それを発現ベクターに挿入する。例えば、TAクローニングベクターpCRTM-II (
Invitrogen, San Diego, CA)から当アンチセンス断片を切り出すために、HindII
I及びXbaIを用いることができる。適当な発現ベクターは典型的に、(1)細菌宿主
における発現ベクターの複製及び選択のために、細菌の複製起点をコードする原
核DNA要素及び抗生物質耐性マーカー；(2)転写の開始を調節するDNA要素、例え
ばプロモーター；並びに(3)転写産物のプロセシングを調節するDNA要素、例えば
転写停止／ポリアデニル化配列、を含有する。
【００７４】 哺乳動物宿主を用いる場合、転写及び翻訳の調節シグナルは、好ましくはウイ
ルス、例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サルウイルスなどに由
来し、そして当調節シグナルは、ウイルスにおいて発現レベルが高い特定遺伝子
に連結されているものである。適当な転写及び翻訳調節配列を、哺乳動物の遺伝
子、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン及びメタロチオネイン遺伝子から得
ることもできる。
【００７５】 転写調節配列は、RNA合成の開始を指令するために十分なプロモーター領域を
含む。適当な真核細胞のプロモーターには、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子
のプロモーター(Hamer et al., J.Mol.Appl.Genes. 1:273 (1982))；ヘルペスウ
イルスのTKプロモーター(McKnight, Cell 31:355 (1982))；SV40の初期プロモー
ター(Benoist et al., Nature 290:304 (1981))；ラウス肉腫ウイルスのプロモ
ーター(Gorman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79:6777 (1982))；及びサイ
トメガロウイルスのプロモーター(Foecking et al., Gene 45:101 (1980))があ
る。
【００７６】 あるいは原核細胞のプロモーター、例えばバクテリオファージT3のRNAポリメ
ラーゼのプロモーターを、その原核細胞プロモーターが真核細胞プロモーターに
よって制御される場合には、融合遺伝子の発現を調節するために用いることがで
きる。Zhou et al., Mol.Cell.Biol. 10:4529 (1990)及びKaufman et al., Nucl
.Acids Res. 19:44-85 (1991)。
【００７７】 DNAからの発現を介して少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドを細
胞に導入するためのベクターは、ベクターpRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA
)である。当ベクターは、哺乳動物のエンハンサー−プロモーター配列から高レ
ベルの構成的な転写を可能にする。クローン化APJアンチセンスベクターを細菌
宿主細胞内で増幅し、その細胞から単離し、そして前記通り分析する。
【００７８】 アンチセンス配列を活用する別の可能な方法は、遺伝子治療におけるものであ
る。通常レトロウイルスに由来するウイルス様ベクターは、ヒト細胞においてア
ンチセンス構成体の導入及び発現のための媒体として有用であり得る。一般に、
この様なベクターはインビボで複製せず、そのため標的以外の細胞への意図しな
い感染が起こらない。この様な場合、欠失したインビボでの複製機能を補充する
ヘルパー細胞系を用いることによって、当アンチセンスベクターの増幅及びパッ
ケージングが可能になる。標的以外の細胞への偶発的感染を更に防止するために
、標的細胞特異的な調節配列を用いる。当配列の支配下にある場合、アンチセン
ス構成体は、正常組織において発現されないだろう。
【００７９】 ヘパリン結合性増殖因子の発現を阻害するためにアンチセンスポリヌクレオチ
ドを用いる可能性が、２つの以前の研究で調べられている。Kouhara et al., On
cogene 9:455-462 (1994)及びMorrision, J.Biol.Chem. 266:728 (1991)。Kouha
ra et al.は、マウス乳房カルシノーマ細胞(SC-3)のアンドロゲン依存性増殖が
、アンドロゲン誘導性のヘパリン結合性増殖因子(AIGF)の誘導を介して起こるこ
とを示した。AIGFの翻訳開始部位に相当する15量体アンチセンスを、SC-3細胞の
アンドロゲン誘導の妨害能に関して調べた。このアンチセンスポリヌクレオチド
は、５μMの濃度でDNA合成を有効に阻害した。Morrisionは、塩基性線維芽細胞
増殖因子に対するアンチセンスポリヌクレオチドが培養星状細胞の増殖を阻害す
ることを示した。従って、哺乳動物細胞において個々の遺伝子産物を標的にする
一般的な方法が確立されている。
【００８０】 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、APJのcDNAの読み枠内の任意の部
分に由来する。好ましくは、(i)翻訳開始部位の周囲に存在し、且つ(ii)ループ
構造を形成するmRNA配列を標的にする。ヒトゲノムの大きさに基づき、統計的な
研究から、約14〜15塩基対の長さのDNA領域は、当ゲノムにおいて特有の配列を
有することが示されている。従ってAPJのRNAを確実に特異的に標的にするために
、当アンチセンスポリヌクレオチドの長さは、少なくとも15ヌクレオチドである
ことが望ましい。従って本発明で考えられる最も短いポリヌクレオチドは、APJ
のcDNA配列の位置1〜14、1〜15、1〜16、1〜17、1〜18、1〜19、2〜16、3〜17な
どに相当するヌクレオチドである。この場合の位置１は、APJコード領域の最初
のヌクレオチドを指す。
【００８１】 全てのアンチセンスポリヌクレオチドが、十分な阻害を達成し、又は標的APJ
に対して十分なレベルの特異性を有することはない。従ってどれが適当なアンチ
センス特性を有するのかを決定するために、ポリヌクレオチドを選択する必要が
あるだろう。有用なアンチセンスポリヌクレオチドを検査するための好ましい方
法は、(1)CD4及びAPJを有する細胞と、(2)envを有する細胞との細胞融合の阻害
を検査することによる。
【００８２】 アンチセンスポリヌクレオチドを、裸の合成ポリヌクレオチドとして又は発現
ベクターの部分として、任意の通常の経路（経口、経鼻、経直腸、経膣又は局所
）によって、あるいは皮下、筋内、腹膜間又は静脈内への注射によって患者に投
与することができる。しかし本発明の医薬組成物を、注射できる組成物の形で投
与することが有益である。このための典型的な組成物は、医薬上容認される溶剤
又は希釈剤、及びその他の適当な生理学的化合物を含有する。例えば、当組成物
は、ポリヌクレオチド及び約10mgヒト血清アルブミン／ml NaCl含有リン酸緩衝
液を含有し得る。
【００８３】 毒性の徴候を示すこと無しに10日間に渡って、700mgほどのアンチセンスポリ
ヌクレオチドを患者に静脈注射した(すなわち0.05 mg/kg/時間)。Sterling, "Sy
stemic Antisence Treatment Reported", Genetic Engineering News 12:1, 28
(1992)。
【００８４】 その他の医薬上容認される賦形剤には、非水性又は水性溶液、及び非毒性組成
物、例えば塩、保存剤、緩衝剤などが含まれる。非水性溶液の例は、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、植物油及び注射可能有機エステル、例え
ばエチルオレエートである。水性溶液には、水、アルコール／水性溶液、塩溶液
、腸管外用媒体、例えば塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなどが含まれ
る。静脈用媒体は、液体及び栄養補充物を含有する。保存剤には、抗微生物剤、
酸化防止剤、キレート化剤及び不活性ガスが含まれる。本組成物のpH及び種々の
成分の正確な濃度を、当分野の通常技術に従って調整する。局所投与のための好
ましい医薬組成物は、皮膚用クリーム又は経皮パッチである。
【００８５】 アンチセンスポリヌクレオチド又はその発現ベクターを、油性縣濁液として注
射し得る。適当な親脂性溶媒又は媒体には、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂
肪酸エステル、例えばエチルオレエート若はトリグリセリドが含まれる。更にア
ンチセンスポリヌクレオチド又はベクターを、親脂性担体、例えば多数のステロ
ールのいずれか、例えばコレステロール、コール酸塩又はデオキシコール酸、と
組み合わせ得る。好ましいステロールはコレステロールである。水性注射縣濁液
は、当液の粘性を増加させるための物質、例えばカルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含有し得る。場合により当
縣濁液は安定化剤も含有する。
【００８６】 アンチセンスAPJポリヌクレオチド投与のための代わりの形は、リポソームで
ある。リポソームへの封入によって、アンチセンスAPJポリヌクレオチド及びそ
の発現ベクターの投与のための代わりの剤形が得られる。リポソームは、水性区
分を囲む１又は複数の脂質二重層から成る顕微鏡的小胞である。一般的には、Ba
kker-Woudenberg et al., Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 12(Suppl.1): S6
1 (1993)及びKim, Drugs 46:618 (1993)参照。リポソームは組成上細胞膜に類似
しており、従ってリポソームを安全に投与することができ、しかもこれは生物分
解性である。その調製方法に応じてリポソームは単層又は多層となり、そのサイ
ズは直径0.01μmから10μm超まで変化する。種々の薬剤をリポソーム内に封入し
得る。その二重層間に疎水性薬剤部分が、そして内部水性区分内に親水性薬剤部
分が分配される。例えばMachy et al., Liposomes in Cell Biology And Pharma
cology(John Libby 1987), 及びOstro et al., American J.Hosp.Pharm.46:1576
(1989)参照。更に、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、並びに荷電及
び表面特性を変えることによって、封入される薬剤の治療上の利用度を調節する
ことが可能である。
【００８７】 リポソームは、事実上どの種類の細胞にも吸着することができ、そして封入薬
剤を徐々に放出する。あるいは吸着したリポソームは、貪食性の細胞によってエ
ンドサイトーシス的に取り込まれる。エンドサイトーシス後に、リポソーム脂質
のリソゾーム内分解、そして封入薬剤の放出が続く。Scherphof et al., Ann. N
.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)。
【００８８】 静脈内投与後に、通常のリポソームは、細網内皮系内に優先的に貪食される。
しかし細網内皮系を、いくつかの方法、例えば大投与量のリポソーム粒子による
飽和、又は薬理学的手法による選択的なマクロファージの不活性化によって回避
することができる。Claassen et al., Biochem.Biophys.Acta 802:428 (1984)。
更に、糖脂質−又はポリエチレングリコール−誘導化リン脂質をリポソームに組
み込むことによって、細網内皮系による取り込みが有意に低下することが示され
た。Allen et al., Biochem.Biophys.Acta 1068:133 (1991)及びAllen et al.,
Biochem.Biophys.Acta 1150:9 (1993)。この様なStealth(登録商標)リポソーム
は、動物内でより長い循環時間及び腫瘍へのより高い標的性を有する。Woodle e
t al., Proc.Ameri.Assoc.Cancer Res. 33:2672 (1992)及びGregoriadis et al.
, Drugs 45:15 (1993)。
【００８９】 アンチセンスポリヌクレオチド及びその発現ベクターを標準的な方法によって
リポソーム内に封入することができる。種々の異なったリポソーム組成物及びそ
の合成方法が当業者に知られている。例えば米国特許4,844,904; 5,000,959; 4,
863,740; 及び4,975,282参照。
【００９０】 リン脂質の組成を変えることによって、又はリポソームに受容体又はリガンド
を挿入することによって、特定の細胞又は臓器を標的にするリポソームを調製す
ることができる。例えば、リポソームが腫瘍細胞をより効率的に標的にするため
には、腫瘍に関連する抗原に特異的な抗体を、アンチセンスポリヌクレオチド又
は発現ベクターと共にリポソームに組み込み得る。例えばZelphati et al., Ant
isence Research and Development 3:323-338 (1993)参照。これには、人間の治
療のためにアンチセンスポリヌクレオチドを含有する「免疫リポソーム」の使用
が記載されている。
【００９１】 一般に、投与されるリポソーム内に封入されるアンチセンスポリヌクレオチド
又は発現ベクターの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的な病症状及
び病歴などの因子に依存して変化する。特定の剤形における投与量の範囲を、適
当な動物モデルを用いて決定することができる。
【００９２】 特定のAPJ mRNAの転写又は翻訳を妨害するために、アンチセンス核酸だけでな
く、リボザイムや三重化剤(triplex agents)を用いて前記の方法を行うこともで
きる。これらは、アンチセンス核酸又は三重化剤によってmRNAを隠すか、あるい
はリボザイムによってmRNAを切断することによる。
【００９３】 三重化の方法として、転写を停止させるためのオリゴヌクレオチドを用いるこ
とが知られている。この様なオリゴヌクレオチドは二重らせんDNAの周囲に巻き
付き、三重らせんを形成するからである。従ってこの様な三重化化合物を、選択
した遺伝子上の特有の部位を認識する様に設計することができる(Maher et al.,
Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug De
sign, 6(6):569, 1991)。
【００９４】 リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似の様式で、他の一本鎖RNAを
特異的に切断する能力を有するRNA分子である。その様なRNAをコードする核酸配
列の修飾を介して、あるRNA分子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、且つ切断
する分子を工学的に作成することが可能である(Cech, J.Amer.Med.Assn., 260:3
030, 1988)。この方法の主な利点は、それらが配列特異性を有するので、特定の
配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。
【００９５】 リボザイムには２つの基本的な型、すなわちテトラヒメナ型(Hassellhoff, Na
ture 334:585, 1988)及び「ハンマー頭」型がある。テトラヒメナ型リボザイム
は、長さが４塩基の配列を認識し、一方「ハンマー頭」型リボザイムは、長さが
11〜18塩基の配列を認識する。認識配列が長いほど、その配列が標的mRNA内に独
占的に存在する可能性が高くなる。従って特異的mRNAを不活性化するために、テ
トラヒメナ型よりもハンマー頭型のリボザイムが好ましく、そしてより短い認識
配列よりも18塩基の認識配列が好ましい。
【００９６】 前記説明によって当業者は、十分に本発明を利用することができるだろう。以
下の実施例は、説明のためのものである。
【００９７】実施例 実施例１ ：APJが、HIV-1又はSIVのための補助受容体として機能するかどうかを
決定するための細胞間融合検査 APJが、HIV-1又はSIVのための補助受容体として機能するかどうかを決定する
ために、細胞間融合検査を行った。この検査は、Nussbaum et al., 1994, J.Vir
ol., 68:5411-5422及びRucker et al., 1997, Meth.Enzymol., 288:118-133に詳
細に記載されている。ウズラQT6細胞に、T7ポリメラーをコードする組換えワク
シニアウイルス(vTF1.1)を感染させ、次に、T7プロモーター調節下に注目の外皮
遺伝子を有するプラスミドを前記細胞にトランスフェクトするか、又は組換えワ
クシニアウイルスを介してenv構成体を導入することによって、効果器細胞を調
製した。トランスフェクションよりもむしろ組換えワクシニアウイルスを介して
、Env構成体であるSIVmac251, SIVmac239, SIVmac316, SIVmac316mut, DH12, RF
, BK132, ADA, JR-FL, IIIB及びHIV-2 STを効果器細胞に導入した。CD4、CMVプ
ロモーター調節下の注目の補助受容体、及びT7プロモーター調節下のルシフェラ
ーゼをコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトすることによって、QT
6標的細胞を調製した。トランスフェクション後に効果器細胞と標的細胞とを混
合し、そして混合後７〜８時間で細胞融解物におけるルシフェラーゼ活性を測定
することによって、細胞間融合を定量した。
【００９８】 この検査では、細胞間融合の結果、細胞質が混合され、そしてルシフェラーゼ
が生産され、それを容易に定量することができる。図１の示す通り、CD4と共にC
CR5又はCXCR4補助受容体のいずれかを共発現させた場合、各々R5及びX4のEnvタ
ンパク質によって効率的に融合が起きた。R5-X4 envタンパク質、例えばHIV-1 8
9.6は、CCR5又はCXCR4補助受容体のいずれかを有する細胞との融合を仲介した。
CD4のみを発現させた場合には融合は認められなかった。QT6細胞にCD4と共にAPJ
を同時に発現させた場合、R5-X4 envタンパク質89.6、及びいくつかのX4 envタ
ンパク質によって、CXCR4の場合に観察されたレベルの70％以上のレベルで、細
胞間融合が仲介された（図１）。１つの主要なX4 envタンパク質ZR001.3の場合
、APJを発現する細胞との融合は、CXCR4の場合に比べてより効率的であった。R5
envタンパク質の大部分は、APJ発現細胞との融合を仲介したが、CCR5の場合と
比べて非常に低レベルの融合であった（図１及び表１）。しかしADA及び主要単
離体TH22-4は、ウイルス補助受容体としてCCR5が機能した場合に観察されたレベ
ルのほぼ半分のレベルで、APJによる融合を仲介した。またHIV-2 STのenvタンパ
ク質は、CD4及びAPJの両方を発現する細胞との融合を非常に非効率的に仲介した
。いくつかのX4及びR5-X4ウイルスのenvタンパク質による融合を支援するAPJの
能力は、主要な補助受容体の場合とほぼ同程度の効率であったことは注目に値す
る。なぜなら、大部分の他の代わりのHIV-1補助受容体は、典型的には、CCR5又
はCXCR4よりもかなり低い効率で細胞間融合を支援するからである。
【００９９】 更に、種々のSIV外皮タンパク質による融合を支援するAPJの能力を調べた。HI
V-1とは異なり、M-及びT-指向性の両SIV株は、補助受容体としてCCR5を使用する
が、SIVはCXCR4を全く又はほとんど使用しない(Chen et al., 1997, J.Virol.,
71:2705-2714;Edinger et al., 1997, Proceedings of the National Academy o
f Sciences, USA, 94:4005-4010;及びMarcon et al., 1997, J.Virol., 71:2522
-2527)。更に、M-及びT-指向性の両SIV株は、補助受容体として孤児受容体STRL3
3, GPR15及びGPR1を使用し得る(Deng et al., 1997, Nature 388:296-300及びFa
rzan et al., 1997, J.Exp.Med., 186:405-411)。本実験では、APJは、いくつか
のM-及びT-指向性SIVのenvタンパク質による融合を、CCR5の場合よりも低い効率
レベルで支援することが決定された。ただし例外としてM-指向性SIVmac316及び
このenvタンパク質の変異体(316mut)は、細胞間融合検査において補助受容体と
してAPJを効率的に使用した（図２及び表１）。更に、APJは典型的には、孤児受
容体GPR1, GPR15/BOB及びSTRL33/Bonzoの場合よりも低い効率で融合を支援した
。最後に、多数のSIV株が、CD4非依存的且つCCR5依存的な様式で細胞に感染し得
ることが以前に決定されているので(Edinger et al., 1997, Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA, 94:14742-14747)、APJのみを発現する細胞との融合を仲介する能力に関
してHIV-1, HIV-2及びSIVのenvタンパク質を検査した。その結果、APJのみを発
現する細胞は、検査したいずれのenvタンパク質による細胞間融合も支援しなか
ったので、APJ補助受容体の活性は厳密にCD4依存的であることが示された。
【０１００】
【表１】
【０１０１】実施例２ ：ウイルス感染を支援するAPJ活性の決定 APJが補助受容体として機能する能力をより厳密に評価するために、APJがウイ
ルス感染を支援する能力を決定した。１つ目の検査系では、ルシフェラーゼリポ
ーターウイルス検査を行った。この場合、このルシフェラーゼリポーターウイル
ス骨格上に種々のenvタンパク質を擬似型化(pseudotyped)した。ヒトHEK293細胞
に、CMV又はSV40プロモーターの調節下にenvを発現するプラスミドと、不活性な
env遺伝子及びnefの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を有するプロウイルスゲノム
を含有するプラスミド(例えばNL4-3ルシフェラーゼウイルス骨格(pNL-Luc-E-R-)
)とをトランスフェクトすることによって、ルシフェラーゼリポーターウイルス
を調製した(Chen et al., 1994, J.Virol., 68:654-660及びConnor et al., 199
5, Virology 206:935-944)。感染標的細胞は、リン酸カルシウム法によるトラン
スフェクションによって導入されたCD4及び補助受容体を有するHEK293又はCCCS
細胞であった。DEAEデキストラン８μg/mlを含有する培地中で感染を行った。感
染３〜４日後に、0.5% NP-40中に縣濁することによって細胞を溶解し、そしてル
シフェラーゼ活性を検査した。
【０１０２】 残念ながら、CD4及びAPJを発現する細胞との融合を効率的に触媒するほとんど
のenvタンパク質(例えばHIV-1 89.6)を上手く擬似型化できなかった。擬似型化
することができたウイルスenvタンパク質は、CCR5又はCXCR4陽性細胞の感染から
判定した通り、CD4及びAPJ補助受容体を発現する細胞に感染できなかったか、又
は非効率的にしか感染しなかった。いくつかの場合では、APJ発現細胞との融合
を中間レベルで仲介するenvタンパク質は、ウイルス感染を支援できなかった。
例えば、ADA envタンパク質を発現する細胞は、CCR5陽性細胞の場合の半分の効
率で、APJ陽性細胞との融合を仲介したにも関わらず、ADA envタンパク質を有す
る擬似型ウイルスは、APJ陽性細胞に感染しなかった。この様な検査に依存した
矛盾の理由は明らかではないが、種々のenvタンパク質が擬似型化される効率を
反映しているのかもしれない。
【０１０３】 APJ発現細胞との細胞間融合を効率的に仲介することができたが、擬似型化す
ることができなかった外皮タンパク質を検査するために、別の検査系を用いた。
CD4、希望の補助受容体、及びウイルスLTRの調節下にあるルシフェラーゼを発現
するプラスミドをトランスフェクトした標的HEK293細胞に、完全なHIV-1 89.6又
はHIV-1 IIIBを感染させた（図４）。感染２日後にルシフェラーゼ活性を測定を
測定した。これらの結果から、HIV-1 89.6は、CXCR4発現細胞の場合とほぼ同じ
効率で、APJ陽性細胞に感染することが示された。またHIV-1 IIIB (HxB3)は、背
景レベルを十分に超えるレベルでAPJ陽性細胞に感染した。
【０１０４】 最後に、APJがHIV-1 89.6及びIIIBによる感染を支援することができるかどう
かを決定するために、PCRによる進入検査を行った。ヒトCD4を安定に発現し、且
つ希望の補助受容体を一過性に発現するQT6細胞に、50ngのDNAアーゼで処理した
細胞を含有しないウイルスp24を感染させた。２日後にこの細胞を洗浄し、そし
て溶解し、そしてプライマーLTR-プラス/LTR-マイナス(5'-ACAAGCTAGTACCCAGTTG
AGCC-3'(配列番号4), 5'-CACACACTACTTGAAGCACTCA-3'(配列番号5))を用いたPCR
によって、HIV-1特異的LTRのDNA配列を検出した。この生産物を２％アガロース
ゲル上の電気泳動によって分離し、Hybond N+ (Amersham)に転写し、そして3'末
端標識ビオチンキット(DuPont; プローブ5'-ATCTACAAGGGACTTTCCCGC-3'(配列番
号6))によって検出し、そして露光を行った。図５に示した通り、主要なHIV-1補
助受容体の場合に比べてより低い効率であったが、HIV-1 IIIB及び89.6は両方共
、CD4及びAPJの両方を発現しているQT6細胞に進入することができた。
【０１０５】実施例３ ：ノーザンブロット分析によるヒト脳内のAPJ分布の調査 APJを初めにヒトゲノムDNAからクローン化し、そのラット相同体に基づくプロ
ーブを用いてラット組織が分析されたところ、APJが脳に広く発現していること
が判明した(O'Dowd et al., 1993, Gene, 136:355-360)。またAPJは、ヒト脳の
いくつかの領域に発現していることも示されている(Matsumoto et al., 1996, N
eurosci.Lett., 219:119-122)。いくつかのウイルスは、APJを補助受容体として
有効に使用するので、ヒト脳におけるAPJ分布を、ノーザンブロット分析によっ
て更に調べた。
【０１０６】 種々のヒト脳の領域に由来するポリA+RNAを含有するブロット膜をClontechか
ら入手した。Prime-Itランダムプライマー標識キット(Stratagene, La Jolla, C
A)を用いて、クレノウ酵素及びα-32P-dATP (3000Ci/mmol)によって当cDNAプロ
ーブを標識した。このα-32P-標識プローブを、Quick Spinカラム(Boehringer M
annheim, Indianapolis, IN)によって精製した。前記膜を、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液(25mM Na/Na2PO4, 50mM Tris pH7.4, 6X SSPE, 0.1% SDS, 100μg/ml
一本鎖DNA及び1Xデンハルト溶液)中で107cpmの前記標識プローブと一晩ハイブリ
ダイズさせた。この膜を1X SSPE, 0.1% SDSによって42℃で10分間２回洗浄し、
それから0.2X SSPE, 0.1% SDSの高ストリンジェント洗浄溶液によって42℃で10
分間洗浄した。次にこの膜をFujiイメージングプレートに４時間露光した。その
プレート上の画像を、BAS1000Mac Bio-Imaging Analyzer (Fuji)で捕捉し、そし
てMac BASプログラムによって処理した。画像をPictography 3000 (Fuji)デジタ
ルプリンターで印刷した。
【０１０７】 その結果、脳梁、脊髄及び髄質に高レベルのAPJ転写物が存在することが示さ
れた。より低レベルのAPJ転写物が、ヒト脳のその他の領域に検出された（図６
）。末梢組織では、APJ転写物は脾臓に容易に検出されたが、PBLには存在しなか
った。より低レベルの転写物が、その他の末梢組織に検出された。
【０１０８】 HIV-1を増殖するために一般的に用いられる細胞においてAPJ分布を調べるため
に、多くの細胞株及びいくつかの初代細胞に対してRT-PCR分析を行った。APJを
安定に発現したU87細胞株を作成し、これをポジティブコントロールとして用い
た。
【０１０９】 初代細胞を以下の様に単離した。ヒト血液単核細胞(PBMC)を、正常被験者の血
液からFicoll-Hypaqueを用いて単離し、プラスチックへの連続的な接着によって
単球を除き、そしてフィトヘマグルニチン(PHA-L, 5μg/ml; Sigma)によって３
日間刺激してから、インターロイキン２(20U/ml, Boehringer Mannheim Biochem
icals)の存在下で再縣濁した。PHA刺激の３日後に、そしてまたIL-2処理１週間
後にRNAを抽出した。単球を、ゼラチンへ、次にプラスチックへの選択的接着に
よってPBMCから精製し、そして単球由来のマクロファージ(MDM)に分化させるた
めに培養を続けた(Collman et al., 1989, J.Exp.Med., 170:1149-1163)。精製
後直ぐに未分化単球から、そして培養１週間後にMDMからRNAを抽出した。
【０１１０】 5-10 x 106個の細胞をTrizol(GIBCO-BRL) 1ml中に再縣濁し、取扱説明書通り
に処理して、RT-PCRのための細胞内総RNAを単離した。次に総RNAを、5mM MgCl2
の存在下で10μg RNA当たり1μl (10-50単位)のDNアーゼ(RNアーゼ非含有)(Boeh
ringer Mannheim)によって37℃で30分間処理し、そして5mM EDTAの存在下で65℃
で10分間不活性化した。RNA濃度をOD260に基づいて計算した。Titan RT-PCRシス
テム(Boehringer Mannheim)によってRNAの発現パターンを調べた。481塩基対の
増幅産物を生じる特異的な内部上流及び下流プライマーを用いた。用いたプライ
マーは、順方向5'-TACACAGACTGGAAATCCTCG-3'(配列番号7)及び逆方向5'-TGCACCT
TAGTGGTGTTCTCC-3'(配列番号8)であった。DNアーゼで処理しているが、当RNA試
料へのゲノムDNAの混入を検査するために、95℃10分間の熱処理によってPCR活性
を破壊したRTを含有するTitan酵素混合液を用いて、全てのRNA試料を増幅した（
この不活性化によって、RNA増幅能は排除されるが、DNA増幅能は排除されない）
。各RT-PCR反応において、APJが安定にトランスフェクトされたU87細胞から単離
したRNAを、ポジティブコントロールとして、そしてプラスミドDNAを別のポジテ
ィブコントロールとして用いた。
【０１１１】 種々の細胞株及び細胞種におけるAPJの分布を調べた結果、APJはC8166細胞に
発現していたが、他の検査した細胞株、例えばJurkat, Hut78, CEMx174及びPM1
細胞では、APJ特異的な反応産物を検出できなかった。更に、PHA、PHAとIL-2、
又は抗CD3とIL-2によって刺激したPBMC、あるいは単球又は単球由来マクロファ
ージにおいて、APJの発現は検出されなかった（図８）。
【０１１２】 前記の核酸、ポリペプチド、抗体などのその他の側面に関して、分子生物学、
タンパク質科学及び免疫学の標準的な参考書を参照すること。例えばDavis et a
l.(1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishin
g, Inc., New York;Hames et al.(1985), Nucleic Acid Hybridization, IL Pre
ss, Molecular Cloning, Sambrook et al.;Current Protocols in Molecular Bi
ology, Edited by F.M.Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc;Current Prot
ocols in Human Genetics, Edited by Nicholas C.Dracopoli et al., John Wil
ey & Sons, Inc.;Current Protocols in Protein Science;Edited by John E.Co
ligan et al., John Wiley & Sons, Inc.; Current Protocols in Immunology;E
dited by John E.Coligan et al.,John Wiley & Sons, Inc.参照。
【０１１３】 参照した特許出願、特許及び文献の全ての内容を本文に引用する。 本文記載から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に把握でき、本発明の意図
及び範囲から外れることなく、種々の使用法及び条件に合う様に種々の改変及び
修飾を行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、HIV-1又はHIV-2のenvタンパク質によって仲介された細胞間融合を示
す。HIV-2/STがHIV-2に由来する以外、他の全ての表示したenvタンパク質はHIV-
1に由来する。CD4、表示した補助受容体、及びT7プロモーター調節下にあるルシ
フェラーゼを発現するQT6細胞を、T7ポリメラーゼ及び表示したHIV-1又はHIV-2
のenvタンパク質を発現する細胞と混合した。これらの細胞間融合の程度を、混
合８時間後にルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。CD4及び、C
CR5(R5 envタンパク質の場合)又はCXCR4(X4 envタンパク質の場合)のいずれかを
共発現させた場合に得られた融合の程度を100％に設定して、これらの結果を標
準化した。ほとんどのHIV-1補助受容体によって得られた融合の程度は、概ね背
景基準の40〜100倍であった。本図及び以下の図の誤差棒は、複数の独立の実験
から得た平均値の標準誤差を表す。
【図２】 SIVのenvタンパク質によって仲介された細胞間融合を示す。図１の記載通りに
、しかしHIVのenvタンパク質の代わりにSIVのenvタンパク質を用いて細胞間融合
を決定した。CD4及びCCR5を共発現させた場合に得られた融合の程度を100％に設
定して、これらの結果を標準化した。種々のenvタンパク質によって得られた融
合の程度は、概ね背景基準(CD4単独の場合)の40〜100倍であった。
【図３】 図３は、擬似型ウイルスの感染を示す。CD4及び表示した補助受容体を発現す
るHEK293細胞に、表示したHIV又はSIVのenvタンパク質と共にルシフェラーゼを
有する擬似型ウイルスを感染させ、感染２〜３日後にルシフェラーゼ活性を測定
した。
【図４】 図４は、CD4及び表示した補助受容体を発現し、且つHIV-1のLTRの調節下にル
シフェラーゼをコードするプラスミドを含有するHEK293細胞のウイルス感染を示
す。この細胞に、生きたHIV-1 IIIB (HxB)又はHIV-1 89.6を感染させた。CCR5(R
5 envタンパク質の場合)又はCXCR4(X4 envタンパク質の場合)のいずれかの場合
に得られた融合の程度を100％に設定して、測定値を標準化した。
【図５】 図５は、CD4及びAPJを発現している細胞へのウイルスの進入を示すサザンブロ
ット像である。CD4を安定に発現し、且つ希望の補助受容体を一過性に発現して
いるQT6細胞に、DNAアーゼ処理した細胞非含有ウイルスを感染させた。感染２日
後にPCR増幅を行い、その産物を２％アガロースゲル上で分離し、そして標識プ
ローブを用いて、ウイルス特異的LTRのDNA配列を検出した。
【図６】 図６は、ヒト脳組織におけるAPJ発現を示すノーザンブロット像である。種々
のヒト脳の領域に由来するポリA+RNAを含有するブロット膜をClontechから入手
し、そしてAPJ特異的な標識cDNAプローブと共に一晩インキュベーションした。
次にこの膜をFujiイメージングプレートに４時間露光した。以下の組織を検査し
た。パネルＡ：(1)扁桃；(2)尾上核；(3)脳梁；(4)海馬；(5)全脳；(6)黒質；(7
)視床下核；(8)視床。パネルＢ：(1)小脳；(2)大脳皮質；(3)髄質；(4)脊髄；(5
)後頭葉；(6)前頭葉；(7)側頭葉；(8)被殻。
【図７】 図６は、ヒト末梢組織におけるAPJ発現を示すノーザンブロット像である。種
々のヒト組織に由来するポリA+RNAを含有するブロット膜をClontechから入手し
、そしてAPJ特異的な標識cDNAプローブと共に一晩インキュベーションした。次
にこの膜をFujiイメージングプレートに４時間露光した。以下の組織を検査した
。(1)脾臓；(2)胸腺；(3)前立腺；(4)精巣；(5)卵巣；(6)小腸；(7)結腸粘膜；(
8)総末梢血リンパ球。
【図８】 図８は、初代細胞及びＴ細胞株におけるAPJ発現を示すアガロースゲル染色像
である。表示した細胞に由来するRNAを用いて、１チューブ式RT-PCR反応を行っ
た。各反応液25μl中10μlを２％アガロースゲル上で泳動した。予想されるAPJ
バンドの大きさは481塩基対である。プラスミドDNA及びAPJが安定にトランスフ
ェクトされたU87細胞から単離された両方のRNAをポジティブコントロールとして
用いた。水をネガティブコントロールのための鋳型として用いた。
【図９】 図９は、ヒトAPJの核酸配列とアミノ酸配列である(O'Dowd et al., 1993, Gen
e, 136:355-360)(配列番号１)。７個の膜貫通領域の位置は次の通りである。膜
貫通領域１(TM1)はアミノ酸26〜54に相当する；膜貫通領域２(TM2)はアミノ酸66
〜90に相当する；膜貫通領域３(TM3)はアミノ酸104〜125に相当する；膜貫通領
域４(TM4)はアミノ酸144〜167に相当する；膜貫通領域５(TM5)はアミノ酸199〜2
25に相当する；膜貫通領域６(TM6)はアミノ酸246〜271に相当する；膜貫通領域
７(TM7)はアミノ酸285〜312に相当する。当APJポリペプチドの細胞外部分は、膜
貫通ドメインの前のアミノ末端領域(例えばアミノ酸1〜25)に、膜貫通ドメイン
２及び３の間(例えばアミノ酸91〜103)に、膜貫通ドメイン４及び５の間(例えば
アミノ酸168〜198)に、そして膜貫通ドメイン６及び７の間(例えばアミノ酸272
〜284)に位置する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８４ 45/00 48/00 ４Ｃ０８５ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/18 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 31/18 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 ４Ｈ０４５ 16/28 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 33/569 Ｈ 33/566 33/577 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ヘゼルゲゼッサー，ジョゼフ イー． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131， サンフランシスコ，バーネット アベニュ 445 ＃103 (72)発明者 ホルク，リチャード アメリカ合衆国，カリフォルニア 94549， ラファイエット，シルバー スプリングス コート 3410 (72)発明者 ミトロビク，ブランスラバ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94598， ウォルナット クリーク，コルト ドゥ ラ レーナ 253 (72)発明者 ツォウ，イーキン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94549， ラファイエット，カミノ バレシート 1153 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA29 AA40 BB20 CB01 CB21 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 FB07 FB08 FB12 FB13 4B024 AA01 AA11 BA63 CA01 CA03 CA09 CA11 DA02 DA03 EA02 FA02 FA10 GA04 GA11 GA18 4B063 QA01 QA18 QQ61 QR48 QR60 QR77 QR80 QS05 QS36 QS38 QX02 4B064 AG20 AG26 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93X AA94Y AA95X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 AA17 BA35 NA14 ZB332 ZC552 4C085 AA13 BA69 CC04 CC22 DD32 DD61 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZC55 4C087 AA01 AA02 BB64 BB65 BC83 CA20 NA14 ZB33 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA13 DA50 DA75 DA76 EA29 EA50 FA74

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 APJポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はCD4ポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチドによって形質転換された組換え真核細胞
    であって、APJ及びCD4ポリペプチドを共発現する前記細胞。
  2. 【請求項２】 APJポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びCD4ポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチドによって形質転換された組換え真核細胞
    であって、APJ及びCD4ポリペプチドを共発現する前記細胞。
  3. 【請求項３】 前記細胞が安定に形質転換されている、請求項１に記載の組
    換え真核細胞。
  4. 【請求項４】 前記細胞が、前記の両ポリヌクレオチドによって安定に形質
    転換されている、請求項２に記載の組換え真核細胞。
  5. 【請求項５】 前記細胞が人間の細胞である、請求項１〜４のいずれかに記
    載の細胞。
  6. 【請求項６】 細胞細胞が人間以外の細胞である、請求項１〜４のいずれか
    に記載の細胞。
  7. 【請求項７】 APJの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、APJ
    及びCD4ポリペプチドを共発現する標的細胞へのHIV感染を阻害する前記抗体。
  8. 【請求項８】 APJの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、APJ
    及びCD4ポリペプチドを共発現する１番目の細胞とHIVのenvタンパク質を発現す
    る２番目の細胞との膜融合を阻害する前記抗体。
  9. 【請求項９】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７又は８に記
    載の抗体。
  10. 【請求項１０】 前記抗体が、APJの第１細胞外ドメインの一部分に相当す
    るアミノ酸配列を包含するエピトープを認識する、請求項９に記載の抗体。
  11. 【請求項１１】 APJの第１細胞外ドメインの一部分に相当する前記アミノ
    酸配列がアミノ酸配列Asn-Tyr-Tyr-Gly(配列番号３)を包含する、請求項１０に
    記載の抗体。
  12. 【請求項１２】 前記抗体が、APJの第２細胞外ドメインの一部分に相当す
    るアミノ酸配列を包含するエピトープを認識する、請求項９に記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 実質的に精製されたAPJのペプチド断片であって、APJ及び
    CD4ポリペプチドを共発現する標的細胞へのHIV感染を阻害する前記ペプチド。
  14. 【請求項１４】 実質的に精製されたAPJのペプチド断片であって、APJ及び
    CD4ポリペプチドを共発現する１番目の細胞とHIVのenvタンパク質を発現する２
    番目の細胞との細胞融合を阻害する前記ペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記ペプチド断片が、APJの第１細胞外ドメインの一部分
    に相当するアミノ酸配列を包含する、請求項１３又は１４に記載の実質的に精製
    されたAPJのペプチド断片。
  16. 【請求項１６】 APJの第１細胞外ドメインの一部分に相当する前記アミノ
    酸配列がアミノ酸配列Asn-Tyr-Tyr-Gly(配列番号３)を包含する、請求項１５に
    記載の実質的に精製されたAPJのペプチド断片。
  17. 【請求項１７】 前記ペプチド断片が、APJの第２細胞外ドメインの一部分
    に相当するアミノ酸配列を包含する、請求項１３又は１４に記載の実質的に精製
    されたAPJのペプチド断片。
  18. 【請求項１８】 HIVウイルスとAPJ受容体との相互作用を調節する化合物を
    同定するための方法であって、細胞融合を促進する条件下で、試験化合物の存在
    下及び非存在下に、CD4及びAPJポリペプチドを共発現する１番目の細胞株を、en
    vタンパク質を発現する２番目の細胞株とインキュベーションすること、そして
    前記試験化合物の存在が１番目の細胞株と２番目の細胞株との細胞融合を阻害す
    るかどうかを決定すること、を含んで成る、前記方法。
  19. 【請求項１９】 リポーター分子の検出によって細胞融合を決定する、請求
    項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記リポーター分子が、放射性同位元素、蛍光化合物、生
    物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター及び酵素から成る群から選択さ
    れる、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記リポーター分子が、βガラクトシダーゼ又はルシフェ
    ラーゼである、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 HIVウイルスとAPJ受容体との相互作用を調節する化合物を
    同定するための方法であって、試験化合物の存在下及び非存在下に、CD4及びAPJ
    ポリペプチドを発現する細胞株を、envタンパク質を有する試験ウイルスとイン
    キュベーションすること、そして前記試験化合物の存在が、前記試験ウイルスに
    よる前記細胞株への感染を阻害するかどうかを決定すること、を含んで成る、前
    記方法。
  23. 【請求項２３】 リポーター分子の検出によって細胞融合を決定する、請求
    項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記リポーター分子が、放射性同位元素、蛍光化合物、生
    物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター及び酵素から成る群から選択さ
    れる、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記リポーター分子が、βガラクトシダーゼ又はルシフェ
    ラーゼである、請求項２３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 APJ及びCD4ポリペプチドを発現する標的細胞へのHIV感染
    を阻害する方法であって、前記標的細胞を、有効量のAPJ結合剤又は遮断剤と接
    触させることを含んで成る、前記方法。
  27. 【請求項２７】 前記薬剤が、抗APJ抗体又はそれのエピトープ結合断片で
    ある、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体で
    ある、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記の接触を、被験者へのインビボ投与により達成する、
    請求項２６に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記薬剤が、APJのペプチド断片である、請求項２６に記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】 APJの発現に関係したHIV関連疾患を有する患者を治療する
    方法であって、APJを抑制する薬剤を前記患者に投与することを含んで成る、前
    記方法。
  32. 【請求項３２】 前記薬剤が抗APJ抗体である、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記薬剤が、APJポリヌクレオチドにハイブリダイズする
    アンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記薬剤を、担体を使用して細胞内に導入する、請求項３
    １に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記担体がベクターである、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 HIV感染又は関連疾患を有する、又はそれを有する危険性
    のある患者を治療するために投与される薬剤を製造するための、治療上有効な量
    の抗APJ抗体又はペプチド断片の使用。
  37. 【請求項３７】 前記患者が胎児である、請求項３６に記載の使用。
  38. 【請求項３８】 天然においては存在しないAPJポリペプチド及びCD4ポリペ
    プチドの発現によって特徴づけられる表現型を有する人間以外のトランスジェニ
    ック動物であって、前記表現型が、前記動物の体細胞及び生殖細胞内に含まれる
    トランス遺伝子によって付与され、そして前記トランス遺伝子が、APJポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチド及びCD4ポリペプチドをコードするポリヌク
    レオチドを含んで成る、前記トランスジェニック動物。
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