JP6525951B2 - アペリン融合タンパク質およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/786,172号の利益を主張し、また米国特許法第119条(e)の下、2013年11月20日に出願された米国仮特許出願第61/906,567号の利益を主張するものであり、これらの出願は各々、参照によりそれらの全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル8050WO_ST25.txt(43,420バイト)として2014年3月13日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表を、参照により組み込む。
護も見られる(非特許文献18)。
「免疫グロブリン」(Ig)という用語は、1対の軽(L)鎖および1対の重(H)鎖の2対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連した糖タンパク質のクラスを指し、これら4つは、全てジスルフィド結合によって相互接続され得る。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))を参照のこと。各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(本明細書においてVHまたはVHと略される)および重鎖定常領域(CHまたはCH)を含む。重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含む。CH1およびCH2ドメインは、ヒンジによって連結される。Fc部分は、少なくともCH2およびCH3ドメインを含む。
アぺリンは、77アミノ酸のプレプロペプチドとして内在的に産生され、いくつかのより短い生物学的に活性な断片またはアぺリンペプチドを生じるように切断される。
受容体スクリーニングアッセイは、本発明のアぺリン融合タンパク質だけではなく、APLNRのアゴニストおよびアンタゴニストを含むいずれの試験化合物も供することができることを理解されたい。APLNRの活性化または不活性化を決定するための多くの受容体スクリーニングアッセイが当該技術分野で周知であり、以下の例は、本発明者が彼らの発明であると見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野で既知である。そのような1つの方法において、DNA発現ベクターが1つの連続した融合ポリペプチドを発現するように、Fcをコードする核酸配列にインフレームで連結されたアぺリンをコードする核酸配列を含有するようにDNA発現ベクターが操作される。アぺリンペプチドは、Fc含有ポリペプチドのC末端またはN末端に連結されてもよい。本発明のアぺリン融合タンパク質は、アぺリンペプチド単独よりも安定であることが予測される。血清安定性タンパク質は、分解に対する耐性を付与するか、または循環からのクリアランスの低下を有するタンパク質を含む。例示的な本発明の血清安定性アぺリン融合タンパク質は、配列番号2、配列番号4、配列番号39、配列番号40、および配列番号41を含む。
他の実施形態において、本発明のいずれのFc融合タンパク質の配列が、N連結グリコシル化のためのいずれのアクセプター部位も含まないように修飾されてもよい。さらに他の実施形態において、本発明のいずれのFc融合タンパク質の配列が、例えば、中性pHと比較して酸性pHで、FcRn受容体への抗体結合を増強するかまたは減少させるように修飾されてもよい。他の実施形態において、本発明のいずれのFc融合タンパク質の配列が、切断または分解に耐性であるように修飾されてもよい。そのため、アぺリン−Fc融合タンパク質のアぺリンペプチドに対する1つ以上のC末端アミノ酸の付加は、分解に対する耐性等の高い安定性を付与し得る。1つの理論に拘束されるものではないが、付加的なC末端アミノ酸は、ペプチドまたは融合タンパク質内の切断部位に対する感受性を排除し得る。安定性は、循環からのクリアランス(すなわち、腎排泄または腎クリアランス)の低下または減速に起因して付与され得る。アぺリンペプチドに対するそのような修飾は、それらがAPLNRを活性化させる能力を変化させない。例示的な修飾アぺリンペプチドは、表3および4に含まれ、例えば、配列番号38、配列番号42、配列番号43、および配列番号44である。本発明の例示的なアぺリン融合タンパク質は、配列番号39、配列番号40、および配列番号41を含む。
Chemotherapy and Biotherapy 655−686(2nd edition,Chafner and Longo,eds.,Lippincott Raven(1996))のJunghansら、および米国特許第4,681,581号、同第4,735,210号、同第5,101,827号、同第5,102,990(米国特許RE35,500)号、同第5,648,471号、および同第5,697,902を参照のこと。例えば、放射性同位元素は、クロラミンTによって結合されてもよい。さらなる実施形態において、検出可能なマーカーは、放射標識、酵素、発色段、または蛍光標識であってもよい。
本発明は、ポリペプチド、例えば、本発明のアぺリンFc融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。そのような発現ベクターは、本発明のポリペプチドの組換え産生のために使用されてもよい。
iophys.Res.Commun.237:752−757)。tetO配列が、強力なCMV−MIEプロモーターの下流かつ近位に配置される場合、CMV−MIE/tetOプロモーターからの対象となるヌクレオチド配列の転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、タモキシフェンの除去によってブロック解除される。別の例において、15アミノ酸リンカーによって接続された2つのArcタンパク質と、ERLBDT2(上記参照)とからなる単鎖二量体からなる融合タンパク質である融合タンパク質Arc2−ERLBDT2の使用は、Arcオペレーター(AO)、より具体的には、CMV−MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流の2つのタンデムarcオペレーターに関与する。細胞株は、Arc2−ERLBDT2によって調節することができ、対象となるタンパク質を発現する細胞は、CMV−MIE/ArcO2プロモーターによって駆動され、タモキシフェンの除去により誘導可能である。(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20090162901A1号を参照のこと。)
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるアぺリン融合ポリペプチドまたはタンパク質を含む組成物に関する。
検査等を含む。
本発明のアぺリンFc融合タンパク質は、血清半減期を延長する一方で、APLNRに関連する実質的な活性を維持する。APLNRシグナル伝達は、アぺリンFc融合タンパク質と、アぺリンの既知の治療効果および生物学的効果との間に関連性を提供する。したがって、アぺリンFc融合タンパク質がin vitro、ex vivo、またはin vivoでAPLNR活性に及ぼす影響のいずれの証明も、患者または動物におけるアぺリンFc融合タンパク質のin vivoでの生物学的または医学的効果の妥当な証拠を提供する。他の研究においても、アぺリン/APLNRが、心筋虚血/再灌流(I/R)障害に対する内因性保護システムであり、アぺリン/APLNR活性化の抗アポトーシス効果、特にpERKが、そのような障害から保護することが証明されている(Zeng,et al.2009,Peptides,30(6):1144−52,epub Feb 24,2009)。
実施例1−発現構築物のクローニング
合成遺伝子断片を使用して、アぺリン−13を有するN末端およびC末端のhFc融合物を作製した。得られた融合物、hFc−アぺリン13(配列番号1)およびアぺリン13−hFc(配列番号3)をコードするDNAを、標準的な分子クローニング技術を使用してCMVプロモーターの下流の発現ベクターに挿入した。CHO安定細胞株を作製し、融合タンパク質の生成に使用し、次いで、それをアフィニティー法によって精製した。N末端hFc−アぺリン13およびC末端アぺリン13−hFc融合タンパク質は、それらの予測質量と一致してSDS−PAGEゲル上で泳動する。(図3Aを参照のこと。)抗アぺリン抗体(Abcam、ab59469番)を用いて行ったウエスタンブロット分析を使用して、hFc−アぺリン13およびアぺリン13−hFc上にアぺリンの存在を確認した。(図3Bを参照のこと。)
hAPLNRの活性化を検出するために開発されたバイオアッセイを使用して、非修飾アぺリンペプチド(Bachem、H−4568.0001番)および本発明のアぺリン13融合タンパク質による細胞内cAMPレベルの調節を評価した。ルシフェラーゼレポーター[cAMP応答要素(CRE,4X)−ルシフェラーゼ]とともに、全長ヒトhAPLNR(受入番号NP_005152.1のアミノ酸1〜380)を安定に発現するようにHEK293細胞株をトランスフェクトした。得られた細胞株HEK293/CRE−luc/hAPLNRを、10% FBS、NEAA、ペニシリン/ストレプトマイシン、および100μg/mLハイグロマイシンBを含有するDMEM中に維持した。バイオアッセイのために、0.1% FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシン/L−グルタミンを補充した80μLのOPTIMEM中の96ウェルアッセイプレートに、HEK293/CRE−luc/hAPLNR細胞を20,000細胞/ウェルで播種し、5%CO2中、37℃で16時間インキュベートした。翌朝、hAPLNRの活性化を介してフォルスコリンによって誘発されたcAMPの生成を測定するために、非修飾アぺリンペプチドおよびアぺリン13融合タンパク質を段階稀釈し(1:3)、次いで、アッセイ緩衝液(5μMの最終フォルスコリン濃度)中でフォルスコリン(Sigma、F6886番)と混合し、細胞に加えた。5%CO2中、37℃で5時間のインキュベーション後、Victor X機器(Perkin Elmer)を使用して、One Glo試薬(Promega、E6051番)の添加後に発光を測定した。Prism 5ソフトウェア(GraphPad)を用いて、非線形回帰により、データを4パラメータのロジスティック方程式に適合させた。
DiscoverX PathHunter(登録商標)プラットフォームは、関連リガンドを用いた処理に応じたβ−アレスチンのGPCRへの動員に基づいている。このアッセイ形式では、β−アレスチンがβガラクトシダーゼ(β−gal)のN末端欠失変異体に融合されて細胞内で安定に発現される一方で、GPCRがより小さな(42アミノ酸)、弱い競合性β−gal断片に融合される。このアッセイにおけるGPCRのリガンド刺激は、β−アレスチンのGPCRへの動員をもたらし、2つのβ−gal断片の相補性を強制し、基質を検出可能なシグナルに変換する機能的酵素の形成をもたらす(DiscoverX Corporation、Fremont,CA,USA)。
本発明のアぺリン−13融合タンパク質がAPLNRシグナル伝達経路に与える影響を測定するために、アッセイを使用してAPLNR発現細胞株由来のリン酸化ERK1/2(pERK1/2)および全ERKの量を定量化した。ドキシサイクリン誘導性CMVプロモーターの制御下で全長ヒトAPLNR(hAPLNR;受入番号NP_005152.1のアミノ酸1〜380)を安定に発現するように、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞株をトランスフェクトした。得られた細胞株CHO/hAPLNRを、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミン、および250ug/mLハイグロマイシンBを含有するHam’s F12培地中に維持した。
C57/Bl6マウス(群当たりn=3)にhFc(2.5mg/kg)またはアぺリン13−hFc(2.8mg/kg)を皮下(s.c.)投与し(図7A)、1、4、24、および48時間目に血漿を採取した。別個の実験において、C57/Bl6マウス(群当たりn=3)に5mg/kgでhFc−Apein13をs.c.投与し、0、1、2、4、5、6、24時間、および2、3、7、14、21日目に血清を採取した(図7B)。
上の実施例2から6に見られるように、そのN末端にFcが繋ぎ止められたアぺリン−13(hFc−アぺリン13)は、そのC末端にFcが繋ぎ止められたアぺリン−13(アぺリン−hFc)よりも良好な効力を示す。1つ以上のアミノ酸(複数可)がN末端またはC末端から欠失しているかまたはそこに付加されたアぺリン−13ペプチド等の修飾アぺリン−13ペプチドを、APLNRの活性化に関連するそれらの相対的な効力について調べた。
hFcに融合された配列番号42、配列番号43、および配列番号44等の修飾されたアぺリンペプチドを有することを除いて、実施例1と同様に、種々のアぺリン−Fc融合タンパク質を作製した。そのようなhFc−アぺリン13融合タンパク質は、アぺリンペプチド成分のC末端にさらなるC末端アミノ酸を有する。実施例2および実施例7の方法と同様にCREバイオアッセイを使用して、各ペプチドのN末端に繋がれたhFcを有する修飾アぺリン−13ペプチド(hFc−アぺリン13+)と比較して、アぺリン−13ペプチドによるcAMPレベルの調節を評価した(上記参照)。Prism 5ソフトウェア(GraphPad)を用いて、非線形回帰(4パラメータロジスティック)を使用してその結果を分析した。
麻酔下のマウスおよびラットにおける心電図検査によって、本発明のアぺリンFc融合タンパク質の影響、特に、RR間隔(心拍数の指標)、およびイオンチャネル活性の指標としてのQT間隔に与える影響を評価した。
Claims (18)
- Fcドメインに融合したアぺリンペプチドを含む、ポリペプチドであって、前記アぺリンペプチドのN末端は、前記FcドメインのC末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して、融合され、
前記アぺリンペプチドは、アぺリン42〜77(アぺリン−36)、アぺリン61〜77(アぺリン−17)、アぺリン63〜77(アぺリン−15)、アぺリン64〜77(アぺリン−14)、アぺリン65〜77(アぺリン−13)、アぺリン66〜77(アぺリン−12)、アぺリン67〜77(アぺリン−11)、アぺリン68〜77(アぺリン−10)、アぺリン73〜77(アぺリン−5)、アぺリン61〜76(アぺリン−K16P)、アぺリン61〜75(アぺリン−K15M)、アぺリン61〜74(アぺリン−K14P)、アぺリン−F13A、アぺリン65〜76、アぺリン65〜75、アぺリン66〜76、アぺリン67〜76、アぺリン66〜75、アぺリン67〜75、[Pyr1]アぺリン−13、配列番号38(アペリン−13+5G)、配列番号42(アペリン−13+R)、配列番号43(アペリン−13+S)、および配列番号44(アペリン−13+H)からなる群から選択される、前記ポリペプチド。 - 前記アぺリンペプチドは、アぺリン42〜77(アぺリン−36)、アぺリン61〜77(アぺリン−17)、アぺリン63〜77(アぺリン−15)、アぺリン64〜77(アぺリン−14)、アぺリン65〜77(アぺリン−13)、アぺリン66〜77(アぺリン−12)、アぺリン67〜77(アぺリン−11)、アぺリン68〜77(アぺリン−10)、アぺリン73〜77(アぺリン−5)、[Pyr1]アぺリン−13、配列番号38(アペリン−13+5G)、配列番号42(アペリン−13+R)、配列番号43(アペリン−13+S)、および配列番号44(アペリン−13+H)からなる群から選択される、
請求項1に記載のポリペプチド。 - 前記アぺリンペプチドは、アぺリン−13である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記アぺリンペプチドは、配列番号42、配列番号43、および配列番号44からなる
群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド。 - 前記アぺリンペプチドは、1つ以上のGly−Serリンカーを介して、前記Fcドメインに融合される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインは、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメイン;IgG4 CH2ドメインおよびIgG4 CH3ドメイン;IgG1 CH2ドメインおよびIgG4 CH3ドメイン;ならびにIgG4 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインからなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインは、配列番号14、配列番号17、配列番号18、配列番号21、または配列番号22を含むIgGヒンジドメインを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、二量体を形成することができる単量体融合ポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2を含む前記アミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号39、配列番号40または配列番号41のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインは、ヒトIgG Fcドメインである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- アぺリンペプチドに対して血清安定性が増強されており、そして、in vitroのAPLNR活性化アッセイで測定した場合、1nM未満のEC50を示す、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子を含む、ベクターであって、
任意選択的に、前記核酸分子は、宿主細胞における発現に適した発現制御配列に作動可能に連結されている、前記ベクター。 - 請求項13に記載の核酸分子または請求項14に記載のベクターを含む、細胞であって、
任意選択的に、前記細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、CHO、CHO−K1、COS、網膜細胞、Vero、CV1、293、MDCK、HaK、BHK、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL−60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV−1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS−0、MMT細胞、腫瘍細胞、およびPER.C6(登録商標)細胞からなる群から選択される、前記細胞。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の単離された融合ポリペプチドを作製する方法であって、
a.宿主細胞を、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子でトランスフェクトすることであって、前記核酸分子は、前記アぺリンペプチドのN末端でヒトIgGのFcドメインがアぺリンペプチドに連結された前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に融合された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、および、
b.前記宿主細胞において(a)の核酸分子を発現させることによって前記融合タンパ
ク質を作製することを含む、前記方法。 - それを必要とする対象のアぺリンに関連する疾患または状態の治療のための医薬の製造における、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 前記疾患または状態は、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血/再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、肥満、癌、転移性疾患、体液ホメオスタシス、のぼせ症、病的血管新生、網膜症、線維症、およびHIV感染からなる群から選択される、請求項17に記載の使用。
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