TW201617366A - 新穎抗人類Ｔｉｅ２抗體 - Google Patents

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Abstract

提供藉由結合於人類Tie2，使人類Tie2活性化而預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之抗人類Tie2抗體。 本發明者等人對於抗人類Tie2抗體進行探討，來提供一種抗人類Tie2抗體，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體，其中該重鏈可變區域係由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成、該輕鏈可變區域係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體包含4個抗原結合部位。

Description

新穎抗人類Tie2抗體
本發明係關於新穎之抗人類Tie2抗體。
Tie2(Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain 2)為受體型酪胺酸激酶。已知Tie2主要表現於血管內皮細胞。其配位子已知有多聚體型分泌糖蛋白質之血管生長素-1(Angiopoietin-1；Ang-1)及血管生長素-2(Ang-2)。
Ang-1對Tie2係有作為促效劑之功能。Tie2與Ang-1結合時，藉由形成多聚體而自我磷酸化，對細胞內傳達訊息，而顯示了促進血管內皮細胞之抗細胞凋亡作用、血管之透過性阻礙作用等之血管安定化、成熟化及重塑(remodeling)(Cell、1996、Vol.87、p.1171-1180。Genes Dev.、1994、Vol.8、p.1897-1909。Science、1999、Vol.286、p.2511-2514。Nat.Struct.Biol.、2003、Vol.10、p.38-44)。又，亦已知Ang-1係透過Tie2活性化，來透過產生一氧化氮而發揮血管擴張及血流亢進作用 (Pharmacol.Res.、2014、Vol.80、p.43-51)。進一步地，可認為Ang-1係透過Tie2活性化而抑制血管內皮鈣黏蛋白之內在化，來對血管之安定化做出貢獻(Dev.Cell、2008、Vol.14、p.25-36)。另一方面，Ang-2被認為可於血管內皮細胞上使Tie2活性化，但其活性化被認為相較於Ang-1而言，係部分的(Mol.Cell Biol.、2009、Vol.29、p.2011-2022)。因為Ang-2係與Ang-1對Tie2之相同部位以相同程度之親和性結合，故由Ang-2結果會將Ang-1所致之Tie2活性化取代為部分活性來看，暗示了Ang-2會發揮作為內因性之Tie2拮抗劑的功能(Science、1997、Vol.277、p.55-60)。
血中Ang-2濃度之上昇，係於糖尿病、糖尿病網膜症、敗血症及急性腎衰竭等之血管的脆弱性被認為是病因之一的疾病中有被報告(Atherosclerosis、2005、Vol.180、p.113-118。Br.J.Ophthalmol.、2004、Vol.88、p.1543-1546。Critical Care、2009、Vol.13、p.207。Intensive Care Med.、2010、Vol.36、p.462-470)。
作為與糖尿病網膜症及糖尿病黃斑部水腫之關聯，係有於患者之血漿中或玻璃體液中Ang-2濃度上昇的報告(Br.J.Ophthalmol.、2004、Vol.88、p.1543-1546。Br.J.Ophthalmol.、2005、Vol.89、p.480-483)。又，於糖尿病網膜症患者之網膜血管中，作為特徵性病變之一，已知有Ang-1之主要產生細胞之外被細胞(Cell、1996、Vol.87、p.1161-1169)的脫落(Retina、2013、Fifth edition、p.925-939)。作為病態之一，已知有黃斑部肥厚的糖尿病黃斑部水腫，但亦有於藉由玻璃體去除手術，使眼內Ang-1濃度上昇之患者中，黃斑部之肥厚減少的報告(Br.J.Ophthalmol.、2005、Vol.89、p.480-483)。進一步地，由於使網膜血管之外被細胞脫落的網膜水腫小鼠模式中，觀察到網膜之水腫或出血，以Ang-1之玻璃體內投與而阻礙了病態發病(J.Clin.Invest.、2002、Vol.110、p.1619-1628)、及於使用了小鼠糖尿病網膜症模式的試驗中，投與含有編碼Ang-1之基因的腺病毒時，網膜中之血管內皮細胞障礙受到抑制(Am.J.Pathol.、2002、Vol.160、p.1683-1693)來看，暗示了Ang-1之病態改善作用。另一方面，於網膜特異性地過剩表現Ang-2的基因改造小鼠中，被報告了網膜之細胞障礙有亢進(Acta.Diabetol.2010、Vol.47、p.59-64)。
作為與重症下肢缺血之關聯，報告了於末梢動脈疾病中，血漿中Ang-2有增加、或於重症下肢缺血患者之缺血肢肌肉或皮膚組織中，Ang-2表現量高(J.Am.Coll Cardial.、2008、Vol.52、p.387-393。Int Angiol.、2011、Vol.30、p.25-34)。又，於使用了大鼠後肢缺血模式之試驗中，藉由投與含有編碼Ang-1之基因的病毒載體，顯示了促進缺血肢之血流回復，誘導抗細胞凋亡效果(Angiogenesis、2009、Vol.12、p.243-249)。由在第2型糖尿病模式動物之db/db小鼠的冠狀動脈結紮模式中，被報告藉由投與含有編碼Ang-1之基因的病毒，於 梗塞邊界區域被平滑肌細胞所被覆之成熟血管有增加(Diabetes、2008、Vol.57、p.3335-3343)來看，可期待藉由Tie2訊息之活性化，來促進不安定之新生血管的成熟之效果。
作為對人類Tie2顯示促效劑作用之抗體，有報告了小鼠單株抗體15B8(專利文獻1)。15B8係被報告與人類Tie2結合，而誘導人類血管內皮細胞HUVEC之抗細胞凋亡作用(專利文獻1)。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕國際公開第2000/018804號
本發明之課題，係提供結合於人類Tie2，使人類Tie2活性化，藉以預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之抗人類Tie2抗體。
本發明者等人於抗人類Tie2抗體之製作上重複相當的創意探討，結果發現了製作包含由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域、及由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列 所構成之輕鏈可變區域的4價之抗人類Tie2抗體(實施例1~8)，該抗人類Tie2抗體會結合於人類Tie2(實施例12)、誘導人類Tie2表現BaF3細胞之抗細胞凋亡作用(實施例9及11)、以及於大鼠血管透過性亢進模式中會阻礙血管透過性亢進(實施例10及13)。此等之結果，會提供前述抗人類Tie2抗體，而完成了本發明。
亦即，本發明，可包含以下之發明作為醫學上或產業上有用的物質或方法。
〔1〕一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區域，係包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3，該輕鏈可變區域，係包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3，1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位。
〔2〕如〔1〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，且該重鏈可變區域係由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位；以及(2)一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係藉由(1)之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段的轉譯後修飾所產生之抗體或其抗原結合片段。
〔3〕一種抗人類Tie2抗體，其係如〔1〕之抗人類Tie2抗體，且該抗體係含有2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的羧基末端(C末端)係透過連結子(linker)與另一方之該構造 的胺基末端(N末端)連結，各輕鏈係含有包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
〔4〕如〔3〕之抗人類Tie2抗體，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)一種抗人類Tie2抗體，其係包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域；以及(2)一種抗人類Tie2抗體，其係藉由(1)之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾所產生之抗體。
〔5〕一種抗人類Tie2抗體，其係如〔4〕之抗人類Tie2抗體，該抗人類Tie2抗體係包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構 成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
〔6〕一種抗人類Tie2抗體，其係藉由如〔5〕之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾所產生之抗體。
〔7〕如〔6〕之抗人類Tie2抗體，其中轉譯後修飾，係重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯基化(pyroglutamylation)及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
〔8〕如〔3〕~〔7〕中任一項之抗人類Tie2抗體，其係包含人類Igγ1恆定區域或人類Igγ4恆定區域的重鏈恆定區域。
〔9〕如〔8〕之抗人類Tie2抗體，其中人類Igγ1恆定區域為具有L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域；或為具有L234A、L235A、P331S、及I253A之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域。
〔10〕如〔8〕之抗人類Tie2抗體，其中人類Igγ4恆定區域為具有S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域。
〔11〕如〔3〕~〔7〕中任一項之抗人類Tie2抗體，其係包含人類Igκ恆定區域的輕鏈恆定區域。
〔12〕如〔3〕~〔7〕中任一項之抗人類Tie2抗體，其係包含人類Igγ1恆定區域或人類Igγ4恆定區域的重 鏈恆定區域、且包含人類Igκ恆定區域的輕鏈恆定區域。
〔13〕如〔12〕之抗人類Tie2抗體，其中人類Igγ1恆定區域為具有L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域；或為具有L234A、L235A、P331S、及I253A之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域。
〔14〕如〔12〕之抗人類Tie2抗體，其中人類Igγ4恆定區域為具有S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域。
〔15〕如〔3〕~〔7〕中任一項之抗人類Tie2抗體，其中連結子為由5~70個胺基酸所構成之胜肽連結子。
〔16〕如〔15〕之抗人類Tie2抗體，其中連結子係包含絞鏈(hinge)區域或其一部分之胺基酸序列。
〔17〕如〔16〕之抗人類Tie2抗體，其中連結子係由序列編號13表示之胺基酸序列所構成。
〔18〕如〔4〕之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
〔19〕如〔4〕之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
〔20〕如〔4〕之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
〔21〕一種抗人類Tie2抗體，其係藉由如〔18〕~〔 20〕中任一項之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾所產生之抗體。
〔22〕如〔21〕之抗人類Tie2抗體，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
〔23〕如〔21〕之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
〔24〕一種4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係結合於與如〔18〕或〔23〕之抗人類Tie2抗體相同的人類Tie2抗原決定位。
〔25〕如〔24〕之4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中人類Tie2抗原決定位，為包含Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號192、195及197之胺基酸的人類Tie2抗原決定位。
〔26〕一種聚核苷酸，其係包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列。
〔27〕一種聚核苷酸，其係包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列。
〔28〕一種聚核苷酸，其係包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列。
〔29〕一種聚核苷酸，其係包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列。
〔30〕一種表現載體，其係包含如〔26〕及/或〔27〕之聚核苷酸。
〔31〕一種表現載體，其係包含如〔28〕及/或〔29〕之聚核苷酸。
〔32〕一種經如〔30〕之表現載體轉形之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所成之群：(a)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
〔33〕一種經如〔31〕之表現載體轉形之宿主細胞， 其係選自由以下之(a)~(d)所成之群：(a)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
〔34〕一種生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段表現之步驟：(a)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼如該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或 其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如〔2〕之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
〔35〕一種生產抗人類Tie2抗體之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使抗人類Tie2抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如〔18〕~〔20〕中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細 胞。
〔36〕一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係以如〔34〕之方法生產。
〔37〕一種抗人類Tie2抗體，其係以如〔35〕之方法生產。
〔38〕一種醫藥組成物，其係含有如〔1〕~〔23〕、〔36〕及〔37〕中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段及藥學上容許之賦形劑。
〔39〕一種醫藥組成物，其係含有如〔5〕之抗人類Tie2抗體、如〔6〕之抗人類Tie2抗體、及藥學上容許之賦形劑。
〔40〕一種醫藥組成物，其係含有如〔18〕之抗人類Tie2抗體、如〔23〕之抗人類Tie2抗體、及藥學上容許之賦形劑。
〔41〕如〔38〕~〔40〕中任一項之醫藥組成物，其係糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。
〔42〕一種預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之方法，其係包含投與如〔1〕~〔23〕、〔36〕及〔37〕中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之治療有效量的步驟。
〔43〕如〔1〕~〔23〕、〔36〕及〔37〕中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係使用於糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治 療。
〔44〕一種如〔1〕~〔23〕、〔36〕及〔37〕中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之使用，其係用於製造糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。
前述抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含與其他胜肽及蛋白質之融合抗體、或結合有修飾劑之修飾抗體。
本發明之抗人類Tie2抗體，藉由與人類Tie2結合，使人類Tie2活性化，可使用作為糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療劑。
〔圖1〕表示本發明之4價之抗人類Tie2抗體的形式之一例。
〔圖2〕表示完全人類型2-16A2及TIE-1-Igγ1-WT於大鼠血管透過性模式中的血管透過性阻礙作用。縱軸表示伊凡氏藍色素漏出量。(****：p<0.0001 vs Vehicle群)。
〔圖3〕表示TIE-1-Igγ1-LALA於大鼠血管透過性模式中的血管透過性阻礙作用。縱軸表示伊凡氏藍色素漏出量。(****：p<0.0001 vs Vehicle群)。
〔圖4〕表示TIE-1-Igγ1-LALA於小鼠網膜血管外被細胞脫落模式中的網膜水腫阻礙作用。縱軸表示網膜神經纖維層及網膜神經節細胞層之面積和。(##：p<0.005 vs Cont.群、*：p<0.05 vs Veh.群)。
〔圖5〕表示TIE-1-Igγ1-LALA於後肢缺血小鼠模式中的血流改善作用。縱軸表示血流量。(*：p<0.05 vs對照群、**：p<0.01 vs對照群)。
〔圖6〕作為TIE-1-Igγ1-LALA之抗原決定位解析的一環，表示表面電漿共振現象之結果的代表例子。縱軸表示結合感應性(Resonance Unit：RU)、橫軸表示時間(秒)。
〔圖7〕作為TIE-1-Igγ1-LALA之抗原決定位解析的一環，表示ELISA之結果。縱軸表示發光強度、橫軸表示TIE-1-Igγ1-LALA之濃度(ng/mL)。
以下詳述本發明。
抗體係存在有IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之5個類型(class)。該抗體分子之基本構造，係各類型共通地由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常由包含約440個胺基酸之多肽鏈所構成，各類型係具有特徵性構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而稱作Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。進一步地，於IgG係存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之次類型(subclass)，各 自所對應之重鏈係稱為Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。輕鏈通常由包含約220個胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型與K型2種，各自稱作Igλ、Igκ。抗體分子之基本構造的胜肽構成，係由分別相同的2條重鏈及2條輕鏈，藉由雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵而結合，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈不管與何種重鏈均可成對。
鏈內S-S鍵，於重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)、於輕鏈有二個，每100~110個胺基酸殘基係成為一個環狀域(loop)，在各環狀域間該立體構造類似，稱為構造單位或結構域(domain)。不管重鏈、輕鏈的位於胺基末端(N末端)之結構域，均為即使來自同種動物之同一類型(次類型)的標本，其胺基酸序列亦並非一定，稱作可變區域，各結構域分別稱為重鏈可變區域及輕鏈可變區域。較可變區域靠近羧基末端(C末端)側之胺基酸序列，於各個類型或次類型係大致恆定，而稱為恆定區域。
抗體之抗原結合部位係由重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(VL)構成，結合之特異性係依該部位之胺基酸序列而定。另一方面，與補體或各種細胞之結合等的生物學活性，係反映了各類型Ig之恆定區域構造的差別。輕鏈與重鏈之可變區域的可變性，可知大致限定於不管於何種鏈均存在的3個小的超可變區域，此等區域稱為互補性決定區域(CDR；由N末端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域之剩餘部分稱為框架區域(FR)，較為恆定。
關於恆定區域，重鏈恆定區域係由3個區域所構成，自可變區域側起依序稱為CH1區域、CH2區域及CH3區域。輕鏈恆定區域係由1個區域所構成。CH1區域及CH2區域之間存在有稱為絞鏈區域之胜肽序列。絞鏈區域係與由重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造的可動性相關。
包含抗體之VH及VL的各種抗原結合片段亦具有抗原結合活性，作為如此之代表性的抗原結合片段，可列舉單鏈可變區域片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2。Fab係由包含輕鏈、VH、CH1區域與絞鏈區域之一部分的重鏈片段所構成之一價抗體片段。Fab’係由包含輕鏈、VH、CH1區域與絞鏈區域之一部分的重鏈片段所構成之一價抗體片段，該絞鏈區域之部分係包含構成重鏈間S-S鍵之半胱胺酸殘基。F(ab’)2片段，係2個Fab’片段以絞鏈區域中之重鏈間S-S鍵結合而得的二價抗體片段。scFv係由經連結子(linker)連結之VH與VL所構成之一價抗體片段。
具有2個以上之抗原結合部位的抗體稱為多價抗體。其中，具有4個抗原結合部位之抗體稱為4價抗體。4價抗體中被報告有各種形式(構造)(Nat.Rev.Immunol.2010、Vol.10、p.301-316。J.Immunol.、2003、Vol.170、p.4854-4861。Mol.Immunol.、2000、Vol.37、p.1067-1077。Biochem.J.、2007、Vol.406、p.237-246。J.Immunol.Methods、2003、Vol.279、p.219-232)。例 如，被報告有對2價抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之N末端，透過連結子進一步分別連結有重鏈可變區域及輕鏈可變區域之C末端的4價抗體；包含2個重鏈及4個輕鏈，且含有2個之各重鏈係由重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造的4價抗體；對4聚體鏈親和素之各個鏈親和素(streptavidin)分別各結合有1個scFv之C末端的4價抗體；對4聚體p53之各個p53分別各結合有1個scFv之C末端的4價抗體；及對2聚體scFv之C末端，透過連結子而連結有CH3區域之N末端的4價抗體等。
<本發明之抗人類Tie2抗體>
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，係包含具有以下特徵之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。
一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區域係由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，且1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段 只要係4價抗體，則抗體形式並無特殊限定，於本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段中，例如可使用如Nat.Rev.Immunol.2010、Vol.10、p.301-316、J.Immunol.、2003、Vol.170、p.4854-4861、Mol.Immunol.、2000、Vol.37、p.1067-1077、Biochem.J.、2007、Vol.406、p.237-246、J.Immunol.Methods、2003、Vol.279、p.219-232等所記載之各種4價抗體的形式。
較佳為，本發明之抗人類Tie2抗體，係一種抗人類Tie2抗體，其係包含2個重鏈及4個輕鏈，且各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
以下，將該形式之4價抗體亦稱為串列(tandem)抗體，其一例示於圖1。
本發明之抗人類Tie2抗體為串列抗體時，作為恆定區域者，不管何種次類型之恆定區域(例如，重鏈恆定區域為Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4之恆定區域；輕鏈恆定區域為Igλ或Igκ之恆定區域)均能夠選擇。較佳為重鏈恆定區域(包含CH1區域、CH2區域及CH3區域)係人類Igγ1恆定區域或人類Igγ4恆定區域。較佳為輕鏈 恆定區域係人類Igκ恆定區域。
本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈恆定區域使用人類Igγ1恆定區域時，人類Igγ1恆定區域之CH1區域、CH2區域及CH3區域，可列舉例如由序列編號8之胺基酸編號350至447之胺基酸序列所構成之CH1區域、由序列編號8之胺基酸編號463至572之胺基酸序列所構成之CH2區域、及由序列編號8之胺基酸編號573至679之胺基酸序列所構成之CH3區域。
本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈恆定區域使用人類Igγ1恆定區域時，為了降低抗體之抗體依賴型細胞傷害活性或補體依賴型傷害活性，亦可使用導入了L234A(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸234位之白胺酸以丙胺酸取代)、L235A(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸235位之白胺酸以丙胺酸取代)及P331S(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸331位之脯胺酸以絲胺酸取代)等之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域(Mol.Immunol.、1992、Vol.29、No.5、p.633-639)。進一步地，由體內動態之觀點而言，為了使其由血液中快速消失，亦可使用導入了I253A(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸253位之異白胺酸以丙胺酸取代)等之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域(J.Immunol.、1997、Vol.158、p.2211-2217)。關於本說明書中使用之抗體的恆定區域中之胺基酸變異導入的相關殘基編號，係依照EU索引編號(Kabat等，1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda)。
本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈恆定區域使用人類Igγ1恆定區域時，較佳為，該人類Igγ1恆定區域係具有L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域，或具有L234A、L235A、P331S及I253A之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域。具有L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域之CH1區域、CH2區域及CH3區域，可列舉例如由序列編號2之胺基酸編號350至447之胺基酸序列所構成之CH1區域、由序列編號2之胺基酸編號463至572之胺基酸序列所構成之CH2區域、及由序列編號2之胺基酸編號573至679之胺基酸序列所構成之CH3區域。具有L234A、L235A、P331S及I253A之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域之CH1區域、CH2區域及CH3區域，可列舉例如由序列編號6之胺基酸編號350至447之胺基酸序列所構成之CH1區域、由序列編號6之胺基酸編號463至572之胺基酸序列所構成之CH2區域、及由序列編號6之胺基酸編號573至679之胺基酸序列所構成之CH3區域。
本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈恆定區域使用人類Igγ4恆定區域時，為了抑制Fab臂交換(Fab arm exchange)，亦可使用導入了S228P(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸228位之絲胺酸以脯胺酸取代)及L235E(依Kabat等之EU索引編號，將胺基酸235位之 白胺酸以麩胺酸取代)等之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域(Drug Metab.Dispos.、2010、Vol.38、No.1、p.84-91)。
本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈恆定區域使用人類Igγ4恆定區域時，較佳為，該人類Igγ4恆定區域係具有S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域。具有S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域之CH1區域、CH2區域及CH3區域，可列舉例如由序列編號10之胺基酸編號350至447之胺基酸序列所構成之CH1區域、由序列編號10之胺基酸編號460至569之胺基酸序列所構成之CH2區域、及由序列編號10之胺基酸編號570至676之胺基酸序列所構成之CH3區域。
人類Igκ恆定區域，可列舉例如由序列編號4之胺基酸編號114至219之胺基酸序列所構成之人類Igκ恆定區域。
較佳為，本發明之抗人類Tie2抗體為串列抗體時，重鏈恆定區域係人類Igγ1恆定區域或人類Igγ4恆定區域、輕鏈恆定區域係人類Igκ恆定區域。重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域時，較佳為，該人類Igγ1恆定區域係具有L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域，或具有L234A、L235A、P331S及I253A之胺基酸變異的人類Igγ1恆定區域。重鏈恆定區域為人類Igγ4恆定區域時，較佳為，該人類Igγ4恆定區域係具有S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域。
本發明之抗人類Tie2抗體為串列抗體時，作為連結由重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造彼此的連結子，只要抗體具有其功能，則可使用任意之胜肽(胜肽連結子)。胜肽連結子之長度及胺基酸序列可由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇。較佳為，胜肽連結子之長度為5~70胺基酸。較佳為，胜肽連結子包含絞鏈區域或其一部分之胺基酸序列。絞鏈區域意指存在於抗體之CH1區域與CH2區域之間的區域，所使用之絞鏈區域，可列舉例如IgG1或IgG3之絞鏈區域。絞鏈區域之一部分，意指絞鏈區域中之至少連續5胺基酸的區域，較佳為意指自絞鏈區域之N末端起至少連續5胺基酸的區域。絞鏈區域之一部分，例如為IgG1之絞鏈區域的情況時，可列舉自N末端起連續5胺基酸的區域(由序列編號13之胺基酸編號1至5之胺基酸序列所構成)、及為IgG3之絞鏈區域的情況時，可列舉自N末端起連續12胺基酸的區域(由序列編號14之胺基酸編號1至12之胺基酸序列所構成)。於1個實施形態中，連結子係包含自絞鏈區域之N末端起至少連續5胺基酸的區域之胺基酸序列，且該連結子之C末端包含胺基酸序列GlySer。如此之連結子，可列舉由序列編號13~20中任一者表示之胺基酸序列所構成之胜肽連結子，較佳為，連結子係由序列編號13表示之胺基酸序列構成。
於1個實施形態中，本發明之抗人類Tie2抗體，係具有以下之i)~iv)的任一特徵之抗人類Tie2抗 體。
i)包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
ii)包含2個之由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
iii)包含2個之由序列編號8表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
iv)包含2個之由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
將抗體於細胞表現時，已知抗體於轉譯後會受到修飾。轉譯後修飾之例子，可列舉將重鏈C末端之離胺酸以羧肽酶切斷、重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸之焦麩胺醯基化所致的修飾為焦麩胺酸、醣苷化、氧化、脫醯胺化、糖化等，於各種抗體中，已知會產生如此的轉譯後修飾(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426-2447)。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含受到轉譯後修飾之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。受到轉譯後修飾之本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段的例子可列舉受到重鏈可變區域N末端 之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失的抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。於該領域中已知如此之N末端之焦麩胺醯基化或C末端離胺酸缺失的轉譯後修飾不會對抗體活性造成影響(Analytical Biochemistry、2006、Vol.348、p.24-39)。
於1個實施形態中，本發明之抗人類Tie2抗體，為具有以下(1)~(4)的任一特徵抗人類Tie2抗體。
(1)包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸及/或序列編號2之胺基酸編號679之離胺酸缺失的胺基酸序列所構成之重鏈、以及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(2)包含2個之由序列編號6之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸及/或序列編號6之胺基酸編號679之離胺酸缺失的胺基酸序列所構成之重鏈、以及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(3)包含2個之由序列編號8之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸及/或序列編號8之胺基酸編號679之離胺酸缺失的胺基酸序列所構成之重鏈、以及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(4)包含2個之由序列編號10之胺基酸編號1之麩 胺酸被修飾為焦麩胺酸及/或序列編號10之胺基酸編號676之離胺酸缺失的胺基酸序列所構成之重鏈、以及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
於1個實施形態中，本發明之抗人類Tie2抗體，為具有下述特徵之抗人類Tie2抗體。
包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
本發明中，亦包含具有以下特徵之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。
一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區域，包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3，該輕鏈可變區域，包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3，且 1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位。
又，本發明中，亦包含具有以下特徵之抗人類Tie2抗體。
一種抗人類Tie2抗體，其包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造，以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的羧基末端係透過連結子與另一方之該構造的胺基末端連結，各輕鏈係含有包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
本發明之抗人類Tie2抗體，係結合於人類Tie2之抗體。抗體是否結合於人類Tie2(Accession No.NP_000450.2)，可使用公知之結合活性測定方法來確認。測定結合活性之方法，可列舉例如Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)等方法。使用ELISA 時，於例示的方法中，係將融合了人類Tie2及人類Fc的蛋白質固相化於ELISA測定盤，對其添加被驗抗體進行反應。使生物素標識之抗IgG抗體等2次抗體進行反應，洗淨後，使結合有鹼性磷酸酶等酵素之鏈親和素進行反應。洗淨後，藉由使用檢測該活性之試藥(例如鹼性磷酸酶的情況時，係Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)(BioFX公司、APU4-0100-01)等)進行活性測定，可確認被驗抗體是否與人類Tie2結合。活性之具體的評估方法，例如可使用如後述實施例12記載之方法。
本發明之抗人類Tie2抗體，只要係結合於人類Tie2之抗體，則亦包含除了結合於人類Tie2以外，亦結合其他動物由來的Tie2(例如猴子Tie2)之抗體。
較佳為，本發明之抗人類Tie2抗體係結合於人類Tie2，且對人類Tie2表現細胞具有抗細胞凋亡活性。用以評估抗體對人類Tie2表現細胞具有抗細胞凋亡活性之具體的方法，例如可使用如後述實施例4記載之方法。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係結合於與包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體或包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及4個 之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體相同的人類Tie2抗原決定位。此處，抗原決定位(epitope)係指抗體所認識之抗原部位。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含與包含人類Tie2(Accession No.NP_000450.2)之胺基酸編號192、195及197的胺基酸當中之至少1個胺基酸的人類Tie2抗原決定位結合之4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。
又，本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含與包含人類Tie2(Accession No.NP_000450.2)之胺基酸編號192、195及197的人類Tie2抗原決定位結合之4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。
結合於與包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體或包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體相同的人類Tie2抗原決定位之4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，可使用公知之抗原決定位決定方法來取得。決定抗原決定位之方法，可列舉例如氫氘交換質譜分析法、X射線結晶構造解析、以及使用人類Tie2之胺基酸取代變異體或人類Tie2部分胜肽等的ELISA及表面電漿共振現象等之方法。
被驗抗體是否結合於與包含2個之由序列編 號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體或包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體相同的人類Tie2抗原決定位，可使用上述之公知抗原決定位決定方法來確認。使用氫氘交換質譜分析法時，係將於被驗抗體非存在下經氘取代之人類Tie2與於被驗抗體存在下經氘取代之人類Tie2分別分解為胜肽，測定各胜肽之分子量藉以算出氘取代之比例。由被驗抗體之有無所致之人類Tie2之氘取代的比例之差，可決定被驗抗體之人類Tie2抗原決定位。使用ELISA時，係製作人類Tie2之點突變體。將變異體人類Tie2固相化，對其添加被驗抗體進行反應。反應後，使生物素標識抗人類kappa輕鏈抗體等之二次抗體進行反應後洗淨。之後，使鹼性磷酸酶標識鏈親和素(Thermo Fisher Scientific公司、21324)進行反應後洗淨。然後藉由使用Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)等進行活性測定，可確認被驗抗體是否結合於該變異體人類Tie2。藉由評估對各種變異體人類Tie2之結合活性，可決定被驗抗體之抗原決定位。當被驗抗體之抗原決定位，包含至少1個之包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體或包含2個之由序列編號2之 胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體之抗原決定位中的1個胺基酸的情況時，可判斷被驗抗體，會結合於與包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體或包含由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體相同之人類Tie2抗原決定位。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，可基於本說明書揭示的本發明之抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域的序列資訊，使用該領域公知之方法由所屬技術領域中具有通常知識者容易地製作。本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，並無特殊限定，例如可遵照後述之<本發明之生產抗人類Tie2抗體之方法及由該方法所生產之抗人類Tie2抗體>中記載的方法來製造。
本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，可依需要進一步純化後，遵照一般方法予以製劑化，而使用於糖尿病網膜症、糖尿病黃斑部水腫、敗血症、急性肝障礙、急性腎障礙、急性肺障礙、全身性發炎反應症候群、末梢動脈阻塞症或重症下肢缺血等之血管關聯疾病的預防或治療。
<本發明之聚核苷酸>
本發明之聚核苷酸，係包含了包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸、及包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸。
於1個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸。
包含編碼序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所示之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號1之鹼基編號1至366之鹼基序列的聚核苷酸。
於較佳之實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號8表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸、或包含編碼由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸。
包含編碼由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列 編號1表示之鹼基序列的聚核苷酸。包含編碼由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號5表示之鹼基序列的聚核苷酸。包含編碼由序列編號8表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號7表示之鹼基序列的聚核苷酸。包含編碼由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號9表示之鹼基序列得聚核苷酸。
於1個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸。
包含編碼序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列表示之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號3之鹼基編號1至339之鹼基序列的聚核苷酸。
於較佳之實施形態中，包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸。
包含編碼由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可列舉例如包含序列編號3表示之鹼基序列的聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸，可基於其鹼基序列，使用該領域公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者容易地製作。例如，本發明之聚核苷酸，可利用該領域公知之基因合成方法來合成。如此之基因合成方法，可使用WO90/07861記載之抗體基因的合成方法等之所屬技術領域中具有通常知識者公知之各種方法。又，一旦取得本發明之聚核苷酸，則藉由於此聚核苷酸之特定部位導入變異，亦可取得本發明之其他聚核苷酸。如此之變異導入方法，可使用部位特異性變異誘發法(Current Protocols in Molecular Biology edit.、1987、John Wiley & Sons Section 8.1-8.5)等之所屬技術領域中具有通常知識者公知的各種方法。
<本發明之表現載體>
本發明之表現載體，包含一種表現載體，其係含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸。於該領域，各種形式之4價抗體及其生產方法係為公知，本發明之表現載體，可遵照此等之生產方法，依照所表現之4價抗體的形式，由所屬技術領域中具有通常知識者容易地構築。
較佳之本發明之表現載體，可列舉含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核 苷酸的表現載體、含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體、或含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體。
用以表現本發明之聚核苷酸的表現載體，只要係可於真核細胞(例如動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)及/或原核細胞(例如大腸菌)之各種宿主細胞中表現包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸，且藉此產生所編碼之多肽者，則無特殊限制。如此之表現載體，可列舉例如質體載體、病毒載體(例如腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、仙台病毒)等，較佳可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。又，亦可使用AG-γ1或AG-κ(例如參照WO94/20632)等之預先具有人類Ig恆定區域基因之表現載體來表現抗體基因。
本發明之表現載體，可含有與本發明之聚核苷酸以可作用之方式連結的啟動子。作為用以於動物細胞表現本發明之聚核苷酸的啟動子，可列舉例如CMV、RSV、SV40等之病毒來源的啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。作為用以於細菌(例如大腸菌屬菌)表現之啟動子，可列舉 例如trp啟動子、lac啟動子、λPL啟動子、tac啟動子等。又，作為用以於酵母表現之啟動子，可列舉例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
宿主細胞使用動物細胞、昆蟲細胞、或酵母時，本發明之表現載體可含有開始密碼子及終止密碼子。此時，本發明之表現載體，亦可含有增強子序列、編碼本發明之抗體或其重鏈可變區域或輕鏈可變區域的基因之5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊息序列、剪接(splicing)接合部、多腺苷酸化(polyadenylation)部位、或可複製之單位等。宿主細胞使用大腸菌時，本發明之表現載體可含有開始密碼子、終止密碼子、終止子區域、及可複製之單位。此時，本發明之表現載體，亦可依目的而含有通常使用之選擇標記(例如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、康黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。
<本發明之經轉形的宿主細胞>
本發明之經轉形的宿主細胞，係包含選自由以下之(a)~(d)所成之群的經本發明之表現載體轉形之宿主細胞。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序 列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，係選自由以下之(a)~(d)所成之群的經本發明之表現載體轉形的宿主細胞。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；及 (d)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
較佳之本發明之經轉形之宿主細胞，可列舉經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、以及經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
所轉形之宿主細胞，只要係適合於所使用之表現載體，經該表現載體轉形而可表現抗體者，則無特殊限定。所轉形之宿主細胞，可列舉例如於本發明之技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立之細胞等各種細胞(例如動物細胞(例如CHO-K1SV細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9)、細菌(大腸菌屬菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)，較佳可使用CHO細胞(CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞等)、293細胞、NS0細胞等之培養細胞。
將宿主細胞轉形之方法並無特殊限定，例如可使用磷酸鈣法、電穿孔法等。
<本發明之生產抗人類Tie2抗體之方法及由該方法所生產之抗人類Tie2抗體>
本發明之生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之 方法，係包含一種生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段表現之步驟。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
於1個實施形態中，本發明之生產抗人類Tie2抗體之方法，係包含一種生產抗人類Tie2抗體之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使抗人類Tie2抗體表現之步驟。
(a)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基 序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼本發明之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
本發明之生產抗人類Tie2抗體之方法，只要係包含培養本發明之經轉形之宿主細胞，使抗人類Tie2抗體表現之步驟，則無特殊限定。該方法中所使用之較佳宿主細胞，可列舉前述之較佳的本發明之經轉形之宿主細胞。
經轉形之宿主細胞的培養可藉由公知之方法進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間，係適當選擇。宿主細胞為動物細胞時，培養基例如可使用含有約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science、1959、Vol.130、No.3373、p.432-7)、DMEM培養基(Virology、1959、Vol.8、p.396)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol.199、p.519)、199培養基(Exp.Biol.Med.、1950、Vol.73、p.1-8)等。培養基之pH較佳為約6~8，培養係依需要在一邊通氣或攪拌下，一邊通常於約30~40℃進行約15~72小時。宿主細胞 為昆蟲細胞時，培養基例如可使用含有胎牛血清之Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1985、Vol.82、p.8404)等。培養基之pH較佳為約5~8，培養係依需要在一邊通氣或攪拌下，一邊通常於約20~40℃進行約15~100小時。宿主細胞為大腸菌或酵母時，培養基例如以含有營養源之液體培養基為適當。營養培養基較佳為含有經轉形之宿主細胞的生長所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。碳源可列舉例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源可列舉例如銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。亦可依期望含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如四環黴素、新黴素、安比西林、康黴素等)等)。培養基之pH較佳為約5~8。宿主細胞為大腸菌時，較佳之培養基例如可使用LB培養基、M9培養基(Mol.Clo.、Cold Spring Harbor Laboratory、Vol.3、A2.2)等。培養係依需要在一邊通氣或攪拌下，一邊通常於約14~39℃進行約3~24小時。宿主細胞為酵母時，培養基例如可使用Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1980、Vol.77、p.4505)等。培養係依需要在一邊通氣或攪拌下，一邊通常於約20~35℃進行約14~144小時。藉由如上述之培養，可使本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段表現。
本發明之生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合 片段之方法，除了培養本發明之經轉形之宿主細胞，使抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段表現之步驟以外，可進一步包含由該經轉形之宿主細胞回收，較佳為單離或純化抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之步驟。單離或純化方法可列舉例如鹽析、溶劑沈澱法等利用溶解度之方法；透析、超微過濾、凝膠過濾等利用分子量之差的方法；離子交換層析、羥基磷灰石層析等利用電荷之方法；親和性層析等之利用特異親和性之方法；逆相高速液體層析等利用疏水性之差的方法；等電點電泳等之利用等電點之差的方法等。較佳為，培養上清液中所累積之抗體，可藉由各種層析，例如使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱層析來純化。
本發明之抗人類Tie2抗體，亦包含以本發明之生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之方法所生產之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。
<本發明之醫藥組成物>
本發明之醫藥組成物，係包含含有本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段及藥學上容許之賦形劑的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物，可使用該領域中通常使用之賦形劑，亦即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，藉由通常使用之方法來配製。此等醫藥組成物之劑型的例子，可列舉例如注射劑、點滴用劑等之非經口劑，可藉由靜脈內投與、皮下投與、眼內投與等來投與。製劑化時，可於藥學 上容許之範圍，使用因應此等劑型之賦形劑、載體、添加劑等。
本發明之醫藥組成物，可含有複數種之本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。例如，含有未受到轉譯後修飾之抗體或其抗原結合片段、及藉由該抗體或其抗原結合片段的轉譯後修飾所產生之抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物亦包含在本發明中。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之本發明之醫藥組成物，亦包含下述記載之醫藥組成物。
一種醫藥組成物，其係含有抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，該抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，且係該重鏈可變區域由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成、該輕鏈可變區域由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段、以及，藉由該抗體或其抗原結合片段的轉譯後修飾所產生之抗體或其抗原結合片段。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體之本發明之醫藥組成物，亦包含下述記載之醫藥組成物。
一種醫藥組成物，其係含有抗人類Tie2抗體，該抗 人類Tie2抗體係包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，且各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域的抗人類Tie2抗體、以及，藉由該抗體的轉譯後修飾所產生之抗體。
本發明之醫藥組成物，亦包含含有重鏈C末端離胺酸之缺失抗體、受到N末端轉譯後修飾之抗體或其抗原結合片段、重鏈C末端離胺酸缺失且受到N末端轉譯後修飾之抗體、及/或具有重鏈C末端離胺酸且未受到N末端轉譯後修飾之抗體之醫藥組成物。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體之本發明之醫藥組成物，亦包含含有下述(1)~(4)當中之2種以上之抗人類Tie2抗體的醫藥組成物。
(1)包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(2)包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(3)包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至 678的胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(4)包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體之本發明之醫藥組成物，亦包含含有下述(1)~(4)當中之2種以上之抗人類Tie2抗體的醫藥組成物。
(1)包含2個之由序列編號6之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(2)包含2個之由序列編號6表示之胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(3)包含2個之由序列編號6之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(4)包含2個之由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體之 本發明之醫藥組成物，亦包含含有下述(1)~(4)當中之2種以上之抗人類Tie2抗體的醫藥組成物。
(1)包含2個之由序列編號8之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(2)包含2個之由序列編號8表示之胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(3)包含2個之由序列編號8之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(4)包含2個之由序列編號8表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體之本發明之醫藥組成物，亦包含含有下述(1)~(4)當中之2種以上之抗人類Tie2抗體的醫藥組成物。
(1)包含2個之由序列編號10之胺基酸編號1至675的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(2)包含2個之由序列編號10表示之胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重 鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(3)包含2個之由序列編號10之胺基酸編號1至675的胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
(4)包含2個之由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體。
於1個實施形態中，含有抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之本發明之醫藥組成物，亦包含下述記載之醫藥組成物。
一種醫藥組成物，其係含有：包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體、包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類Tie2抗體、以及藥學上容許之賦形劑。
製劑化時本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段的添加量，雖依患者之症狀程度或年齡、所使用之製劑劑型、或抗體之結合力價等而異，但例如可使用0.001mg/kg~100mg/kg左右。
本發明之醫藥組成物，可使用作為血管關聯 疾病，例如糖尿病網膜症、糖尿病黃斑部水腫、敗血症、急性肝障礙、急性腎障礙、急性肺障礙、全身性發炎反應症候群、末梢動脈阻塞症或重症下肢缺血等之預防或治療劑。
本發明係包含含有本發明之抗人類Tie2抗體的糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。又，本發明包含預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之方法，其係包含投與本發明之抗人類Tie2抗體之治療有效量的步驟。又，本發明包含本發明之抗人類Tie2抗體，其係使用於預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血。進一步地，本發明包含本發明之抗人類Tie2抗體之使用，其係用於製造糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。
<融合抗體及修飾抗體>
若為所屬技術領域中具有通常知識者，可使用該領域公知之方法，以融合有其他胜肽或蛋白質之融合抗體的形式來製作抗體或其抗原結合片段、或亦可以結合有修飾劑之修飾抗體的形式來製作抗體或其抗原結合片段。本發明之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，亦包含如此之融合體或修飾體形態之抗體或抗原結合片段。例如，包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區域係由序列編號2之胺 基酸編號1至122的胺基酸序列所構成、該輕鏈可變區域係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位的抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段中，亦包含與其他胜肽或蛋白質融合之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段、或結合有修飾劑之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段。本發明之抗體或其抗原結合片段，只要係以融合抗體的形式具有與人類Tie2之結合活性，則融合所用之其他胜肽或蛋白質並無特殊限定，可列舉例如人類血清白蛋白、各種標籤胜肽、人工螺旋基序胜肽、麥芽糖結合蛋白質、麩胱甘肽S轉移酶、各種毒素、其他可促進多聚體化之胜肽或蛋白質等。本發明之抗體或其抗原結合片段只要係以修飾抗體的形式具有與人類Tie2之結合活性，則修飾所用之修飾劑並無特殊限定，可列舉例如聚乙二醇、糖鏈、磷脂質、微脂體、低分子化合物等。
以上已綜合記載了本發明，此處提供為了更進一步得到理解而參照之特定的實施例，但此等係為例示目的者，並非限定本發明者。
〔實施例〕
關於使用了市售之套組或試藥等的部分，若無特別指明，係遵照添附之實驗指南(protocol)進行實驗。又，為了方便，將濃度mol/L以M表示。例如，1M 氫氧化鈉水溶液意指1mol/L之氫氧化鈉水溶液。
(實施例1：抗人類Tie2抗體產生融合瘤之製作)
使用人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune antibody technology：Regeneron公司(美國專利6596541號))小鼠來製作抗體。對VelocImmune小鼠，以引起免疫反應之佐劑與重組人類Tie2-Fc嵌合體蛋白質(R&D公司、313-TI-100)誘發免疫。遵照一般方法，摘出經誘發免疫之小鼠淋巴節，回收淋巴球，將之與小鼠由來骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC：CRL-1581)進行細胞融合，藉以製作融合瘤。進行融合瘤之單株化，對於各殖株，以無血清培養基之CD融合瘤培養基(Invitrogen公司)培養。由所得之培養上清液中使用蛋白質G管柱(GE Healthcare公司)純化抗體。藉由VelocImmune技術所得到之抗體，係具有人類抗體之可變區域與小鼠抗體之恆定區域的抗體(亦稱為嵌合體抗體)。
(實施例2：細胞ELISA分析)
為了測定抗體之抗原結合活性，係藉由使用了人類Tie2表現CHO細胞、猴子Tie2表現CHO細胞、大鼠Tie2表現CHO細胞及小鼠Tie2表現CHO細胞的細胞ELISA分析，來評估對人類、猴子、大鼠及小鼠Tie2之抗體的結合。
(實施例3：使用Ang-1改變體之拮抗活性評估)
為了評估抗體之Ang-2拮抗活性，係評估Ang-1改變體(Proc.Natl.Acad.Sci.、2004、Vol.101、p.5547-5552。亦稱為COMP-Ang1)與Tie2之結合阻礙。COMP-Ang1係改變了與對Tie2之結合無關之部位的Ang-1改變體，由對Tie2之結合能力得到保持(Proc.Natl.Acad.Sci.、2004、Vol.101、p.5547-5552)及Ang-1與Ang-2係對Tie2之相同部位以相同程度之親和性結合(Science、1997、Vol.277、p.55-60)來看，藉由評估對COMP-Ang1之拮抗作用，可評估對Ang-2之拮抗作用。
將COMP-Ang1之表現載體導入HEK293細胞。由該HEK293細胞之培養上清液中純化COMP-Ang1，以生物素標識。於以重組人類Tie2-Fc嵌合體蛋白質固相化之試驗盤上，混合並添加上述經生物素標識之COMP-Ang1與實施例1中得到之純化抗體。使用鏈親和素標識HRP來檢測結合之生物素標識COMP-Ang1。添加TMB顯色試藥(Dako公司、S1599)並靜置後，添加2M硫酸使反應停止，測定450nm之吸光度。藉此，評估抗體之對COMP-Ang1之拮抗作用。
(實施例4：使用人類Tie2表現BaF3細胞之抗細胞凋亡活性評估)
遵照Immunity、1998、Vol.9、p.677-686記載之方法，藉由將含有序列編號21表示之人類Tie2基因的質體 以電穿孔導入該細胞，來製作穩定表現人類Tie2之mouse pro B細胞株BaF3細胞(以下稱為人類Tie2表現BaF3細胞)。以後，使用同細胞，評估抗體之抗細胞凋亡活性。
將人類Tie2表現BaF3細胞以2x105cells/mL懸浮於含有0.05%胎牛血清之RPMI1640培養基(Life Technologies公司)，於浮游細胞用96孔盤(住友Bakelite公司、MS-8096R)每1孔播種80μL。之後，添加20μL實施例1中得到之純化抗體或Ang-1。於設定為37℃之CO2培養箱中培養72小時後，將細胞懸浮液50μL移至白色96孔盤(Nunc公司、236108)。遵照細胞內ATP定量套組CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司)，於細胞懸浮液中添加以添附之緩衝液稀釋的基質溶液50μL，藉以測定細胞之生存能力。藉由測定生存能力來評估抗細胞凋亡活性。
實施例2~4之結果，發現複數個具有對人類、猴子、大鼠及小鼠Tie2之結合活性、COMP-Ang1拮抗活性、以及抗細胞凋亡活性的抗體。含有後述之命名為2-16之抗人類Tie2抗體的純化抗體溶液，於實施例4中，雖顯示與Ang-1相同程度之抗細胞凋亡活性，但含有小鼠抗人類Tie2抗體15B8(專利文獻1)的純化抗體溶液，僅顯示了Ang-1之60%左右的最大活性。
(實施例5：使用尺寸篩除層析及電泳之純化抗體溶液的 解析)
以尺寸篩除層析解析於前述實施例2~4中鑑定之純化抗體溶液。其結果，由各純化抗體溶液中檢測出3個區分(fraction)。以電泳來解析各區分溶液的結果，明顯可知各區分中分別含有抗體之單體、2聚體、及3聚體以上之多聚體。
接著對於各區分溶液，以實施例4所示之方法評估抗細胞凋亡活性。其結果，於含有2聚體之區分及含有3聚體以上之多聚體的區分當中，觀察到強力的抗細胞凋亡活性。另一方面，於含有單體的區分當中，幾乎觀察不到抗細胞凋亡活性。15B8亦與上述相同地經尺寸篩除層析解析之結果，雖檢測出顯示2聚體以上之多聚體的區分，但幾乎檢測不到單體之區分。
由以上明顯可知，於實施例2~4鑑定之所有抗體，均於含有2聚體以上之多聚體化抗體的區分當中包含強力的抗細胞凋亡活性。形成2聚體之抗體係成為4價抗體，因而其暗示了具有4價以上之價數的抗體係具有透過人類Tie2活性化之強力的抗細胞凋亡活性。
(實施例6：交聯抗體所致之抗細胞凋亡活性評估)
由實施例5之探討，可認為抗人類Tie2抗體之價數為4價以上，就透過Tie2來誘導抗細胞凋亡活性而言係重要的。因而，藉由以抗小鼠IgG抗體交聯，來評估多聚化之抗人類Tie2抗體之抗細胞凋亡活性。細胞係使用人 類Tie2表現BaF3細胞及內在性表現人類Tie2之人類血管內皮細胞HUVEC。
人類Tie2表現BaF3細胞係於RPMI1640培養基培養、HUVEC係於EBM-2無血清培養基(Lonza公司)培養，添加含有於實施例2~4鑑定之抗人類Tie2抗體的純化抗體溶液。進一步地，添加抗小鼠IgG抗體，使抗體交聯。使用CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay測定細胞之生存能力。藉由測定生存能力來評估抗細胞凋亡活性。
其結果，發現了命名為2-16之抗人類Tie2抗體(嵌合體抗體)的交聯抗體，對人類Tie2具有強力的抗細胞凋亡活性。
(實施例7：2價抗人類Tie2抗體之序列決定)
由產生抗人類Tie2抗體2-16之融合瘤中選殖編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因，決定序列。
抗體之序列決定後，為了提高抗體之物性及安定性，係將2-16之輕鏈及重鏈的框架區域(FR)與其他人類抗體之FR取代，製作改變型之抗人類Tie2抗體2-16A2的可變區域。
於2-16A2之重鏈可變區域基因的5’側連接編碼訊息序列(Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499-505)之基因、且於3’側連接人類Igγ1恆定區域基因(由序列編號11之鹼基編號367至1356之鹼基序列所 構成)，將該重鏈基因插入GS載體pEE6.4。又，於輕鏈可變區域基因之5’側連接編碼訊息序列(Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499-505)之基因、且於3’側連接人類κ鏈之恆定區域基因(由序列編號3之鹼基編號340至657之鹼基序列所構成)，將該輕鏈基因插入GS載體pEE12.4。將所製作之抗體之重鏈基因序列及輕鏈基因序列以定序器解析。
所製作之2-16A2的完全人類型抗體(完全人類型2-16A2)之重鏈鹼基序列示於序列編號11、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號12、該抗體之輕鏈的鹼基序列示於序列編號3、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號4。序列編號12表示之重鏈可變區域，係由序列編號12之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成、序列編號4表示之輕鏈可變區域，係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成。
使用分別插入有完全人類型2-16A2之重鏈與輕鏈之基因的前述GS載體，以短暫性(transient)表現及恆常性表現之2種方法進行抗體表現。關於短暫性表現，係對以FreeStyle 293 Expression medium(Invitrogen公司)培養至約100萬cells/mL的FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)，使用基因導入試藥293 fectin(Invitrogen公司)轉染前述之重鏈及輕鏈之兩表現載體，培養5日。或者，對以Expi293 Expression medium(Invitrogen公司)培養至約300萬cells/mL之Expi293細胞 (Invitrogen公司)，使用基因導入套組ExpiFectamine293 Transfection Kit(Invitrogen公司)轉染前述之重鏈及輕鏈之兩表現載體，培養7日。或者，對以CD-CHO medium(Invitrogen公司)培養至約1000萬cells/mL之CHO-K1SV細胞(Lonza公司)，使用電穿孔法轉染前述之重鏈及輕鏈之兩表現載體，培養7日。將各培養上清液使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱(GE Healthcare公司)純化，得到完全人類型抗體之純化抗體。關於恆常性表現，係將分別插入有抗體之重鏈與輕鏈之基因的前述GS載體以NotI與PvuI進行限制酵素切斷，使用接合(ligation)用套組Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE公司)或接合試藥Ligation high Ver.2(TOYOBO公司)進行接合，構築插入有重鏈與輕鏈之兩基因的GS載體。藉由將該表現載體對CHO-K1SV細胞轉染，使抗體表現。將培養上清液以蛋白質A管柱、蛋白質G管柱或MabSelect SuRe(GE Healthcare公司、17-5438-02)純化，得到完全人類型抗體之純化抗體。
(實施例8：4價之抗人類Tie2抗體之製作)
製作4價之抗人類Tie2抗體。本實施例中製作之4價抗體，係包含2個重鏈及4個輕鏈。各重鏈係包含2個之由重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之由該重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造的C末端係透過連結子與另一方之該構 造的N末端連結。各輕鏈係包含輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。本4價抗體的形式係如圖1所示。
製作編碼由完全人類型2-16A2之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造(由序列編號12之胺基酸編號1至220之胺基酸序列所構成)的C末端，透過由序列編號13表示之胺基酸序列所構成之連結子，與完全人類型2-16A2重鏈之N末端連結的4價抗人類Tie2抗體重鏈之基因。於該重鏈基因之5’側連接編碼訊息序列(Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499-505)之基因，插入GS載體pEE6.4。組合該重鏈載體與實施例7中製作之插入有完全人類型2-16A2之輕鏈基因的GS載體pEE12.4，使用與實施例7記載之抗體的表現及純化法相同之方法，製作4價之抗人類Tie2抗體。該抗人類Tie2抗體稱為TIE-1-Igγ1-WT。
製作編碼將TIE-1-Igγ1-WT之重鏈的恆定區域，取代為導入了S228P及L235E之胺基酸變異的人類Igγ4恆定區域(由序列編號10之胺基酸編號123至220之胺基酸序列、及序列編號10之胺基酸編號350至676之胺基酸序列所構成)之4價之抗人類Tie2抗體重鏈的基因。於該重鏈基因之5’側連接編碼訊息序列(Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499-505)之基因，插入GS載體pEE6.4。組合該重鏈載體與實施例7中製作之插入有完全人類型2-16A2之輕鏈基因的GS載體pEE12.4，使用與實施例7記載之抗體的表現及純化法相 同之方法，製作4價之抗人類Tie2抗體。該抗人類Tie2抗體稱為TIE-1-Igγ4-PE。
TIE-1-Igγ1-WT之重鏈之鹼基序列示於序列編號7、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號8。TIE-1-Igγ4-PE之重鏈的鹼基序列示於序列編號9、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號10。兩抗體之輕鏈係與完全人類型2-16A2之輕鏈相同，該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號3、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號4。
使用同樣之方法，製作於TIE-1-Igγ1-WT之重鏈恆定區域導入了L234A、L235A、及P331S之胺基酸變異的4價之抗人類Tie2抗體(稱為TIE-1-Igγ1-LALA)、以及於TIE-1-Igγ1-WT之重鏈恆定區域導入了L234A、L235A、P331S、及I253A之胺基酸變異的4價之抗人類Tie2抗體(稱為TIE-1-Igγ1-I253A)。
TIE-1-Igγ1-LALA之重鏈之鹼基序列示於序列編號1、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號2。TIE-1-Igγ1-I253A之重鏈鹼基序列示於序列編號5、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號6。兩抗體之輕鏈係與完全人類型2-16A2之輕鏈相同，該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號3、由其所編碼之胺基酸序列示於序列編號4。
序列編號2、序列編號6、序列編號8及序列編號10表示之前述4種之4價抗人類Tie2抗體重鏈的可 變區域係共通的，由序列編號2之胺基酸編號1至120之胺基酸序列所構成，該重鏈可變區域之CDR1、CDR2、CDR3，分別由序列編號2之胺基酸編號31至35、50至66、99至111之胺基酸序列所構成。
序列編號4表示之前述4種4價抗人類Tie2抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域之CDR1、CDR2、CDR3，係分別由序列編號4之胺基酸編號24至39、55至61、94至102之胺基酸序列所構成。
分析經純化之TIE-1-Igγ1-LALA之胺基酸修飾的結果，純化抗體之大部分，產生重鏈C末端之離胺酸缺失。
進一步地，使用相同之方法，關於TIE-1-Igγ1-WT及TIE-1-Igγ4-PE，製作將連結子(由序列編號13表示之胺基酸序列所構成)分別取代為其他連結子(關於TIE-1-Igγ1-WT係由序列編號17~20表示之胺基酸序列所構成之4種連結子、關於TIE-1-Igγ4-PE係由序列編號14~20表示之胺基酸序列所構成之7種連結子)的4價之抗人類Tie2抗體(合計11種)。探討具有7個胺基酸(由序列編號13表示之胺基酸序列所構成之連結子)至64胺基酸(由序列編號20表示之胺基酸序列所構成之連結子)的長度之連結子。
遵照實施例4之方法，評估TIE-1-Igγ1-WT、TIE-1-Igγ4-PE、及取代了連結子之11種抗體的結果，明 顯可知所有的抗人類Tie2抗體均顯示同程度之抗細胞凋亡活性。
(實施例9：2價之抗人類Tie2抗體及4價之抗人類Tie2抗體的抗細胞凋亡作用評估)
由實施例5之結果，暗示了具有4價以上之價數的抗體係具有透過人類Tie2活性化之強力的抗細胞凋亡活性。因而，以對人類Tie2表現BaF3細胞之抗細胞凋亡作用為指標，比較了2價之抗人類Tie2抗體及4價之抗人類Tie2抗體之藥效。
遵照實施例4之方法，使用2價抗體之完全人類型2-16A2及4價抗體之TIE-1-Igγ1-WT，評估對人類Tie2表現BaF3細胞之抗細胞凋亡作用。被驗抗體之完全人類型2-16A2及TIE-1-Igγ1-WT，係以MabSelect SuRe純化後，以尺寸篩除層析區分為單體區分，分別取得為99.98%及99.74%之單體純度。將各抗體以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)由5ng/mL至5000ng/mL以約3倍公比進行7階段稀釋，每1孔添加20μL。作為控制組，分別準備添加了PBS、或以PBS稀釋之Ang-1(R&D公司、923-AN-025/CF。最終濃度由1ng/mL至1000ng/mL以約3倍公比進行7階段稀釋)之孔，以取代被驗抗體。算出被驗抗體於各濃度之抗細胞凋亡活性時，係以添加了PBS以取代被驗抗體之孔的測定值設定為0%，分別添加了300ng/mL及1000ng/mL之Ang-1以取代被驗抗體之孔 的測定值之平均值設定為100%。解析所算出之抗細胞凋亡活性，藉由Sigmoid-Emax模式非線形回歸分析，算出被驗抗體之EC50值。
其結果，明顯可知4價抗體之TIE-1-Igγ1-WT具有強力的抗細胞凋亡作用。由以上明顯可知，4價抗體相較於2價抗體而言，具有更優良之抗細胞凋亡活性。
(實施例10：2價之抗人類Tie2抗體及4價之抗人類Tie2抗體的大鼠血管透過性阻礙作用評估)
芥子油誘發之血管透過性模式，係對廣泛使用作為血漿漏出評估系統的Miles assay(J.Physiol.、1952、Vol.118、p.228-257)施加變更者，於本模式中被報告了Ang-1會阻礙血管透過性亢進(Nature Medicine、2000、Vol.6、p.460-463)。因而，為了比較2價之抗人類Tie2抗體及4價之抗人類Tie2抗體的血管透過性阻礙作用，係使用本模式，評估完全人類型2-16A2及TIE-1-Igγ1-WT。
對SD大鼠(雄、4-5週齡、日本Charles River公司)皮下投與經PBS稀釋之完全人類型2-16A2或TIE-1-Igγ1-WT。處置群係如以下般設定。
〔處置群(各群6隻)〕
Vehicle群： 投與PBS以取代抗體之群
完全人類型2-16A2投與群： 投與完全人類型2-16A2之群(0.3mg/kg)
TIE-1-Igγ1-WT投與群： 投與TIE-1-Igγ1-WT之群(0.3mg/kg)
於抗體投與48小時後，靜脈內投與溶解於生理食鹽水之伊凡氏藍色素(45mg/kg、Sigma-Aldrich公司、E2129)，之後立即於單耳塗佈經礦物油(Sigma-Aldrich公司、M8410)稀釋為5%之異硫氰酸烯丙酯(亦稱為芥子油。Nacalai Tesque公司、01415-92)20μL、於對側耳塗佈礦物油20μL。30分鐘後採集兩耳，測定重量後，浸漬於1mL之甲醯胺，於70℃培置(incubate)一晚，藉以萃取耳組織中之伊凡氏藍色素。由萃取液之吸光度(測定波長620nm、對照波長740nm)求得伊凡氏藍色素濃度，算出萃取液中之伊凡氏藍色素量。之後，藉由將伊凡氏藍色素量除以耳重量，算出單位耳重量之色素漏出量。將同一個體之芥子油塗佈耳的伊凡氏藍色素漏出量減去礦物油塗佈耳之伊凡氏藍色素漏出量的值，作為最終之各個體的伊凡氏藍色素漏出量而算出。使用該伊凡氏藍色素漏出量作為血管透過性之指標。結果如圖2所示。
求出各群之平均值及標準誤差。Vehicle群與 各抗體投與群之間的顯著性檢定係使用Student之t檢定。p<0.05時視為有顯著差異。
如圖2所示，相較於Vehicle群，2價抗體之完全人類型2-16A2未阻礙色素漏出，但4價抗體之TIE-1-Igγ1-WT顯著地阻礙了色素漏出。明顯可知4價抗體之TIE-1-Igγ1-WT會阻礙血管透過性亢進。由以上明顯可知4價抗體相較於2價抗體而言，具有更優良之血管透過性亢進阻礙作用。
由實施例9及10之結果，明顯可知4價之抗Tie2抗體會強力誘導透過Tie2之作用。
(實施例11：4價之抗人類Tie2抗體之抗細胞凋亡作用評估(2))
對於TIE-1-Igγ1-LALA及TIE-1-Igγ1-I253A，遵照實施例9之方法，評估對人類Tie2表現BaF3細胞之抗體的抗細胞凋亡活性。於與實施例9相同之抗體濃度範圍來進行各4價抗人類Tie2抗體之評估。惟係以分別添加Ang-1之100、300及1000ng/mL之孔的測定值之平均值作為100%，來評估各抗體之EC50值及抗細胞凋亡活性之最大活性。
其結果明顯可知，TIE-1-Igγ1-LALA及TIE-1-Igγ1-I253A均顯示與Ang-1相同程度之抗細胞凋亡活性。
(參考例1：15B8之抗細胞凋亡作用評估)
對於15B8，遵照實施例9之方法，評估對人類Tie2表現BaF3細胞之抗細胞凋亡活性。於與實施例9相同之抗體濃度範圍來進行15B8(專利文獻1)之評估。Ang-2(R&D公司、623-AN-025)係與Ang-1相同地進行評估。惟係以添加Ang-1之1000ng/mL的孔之測定值的平均值作為100%，來評估EC50值及抗細胞凋亡活性之最大活性。
其結果明顯可知15B8之抗細胞凋亡活性為Ang-1之64%左右，係與Ang-2相同程度之活性。
配合實施例11之結果時，明顯可知TIE-1-Igγ1-LALA係顯示與Ang-1相同程度之抗細胞凋亡活性，相對於此，15B8僅顯示與Ang-2相同程度之部分的抗細胞凋亡活性。
(實施例12：TIE-1-Igγ1-LALA對Tie2之結合活性評估)
對於TIE-1-Igγ1-LALA，評估對各種Tie2蛋白質之結合活性。將重組人類Tie2-Fc嵌合體蛋白質(R&D公司、313-TI-100)、重組猴子Tie2-Fc嵌合體蛋白質(Sino Biological公司、90292-C02H)、重組大鼠Tie2-Fc嵌合體蛋白質(R&D公司、3874-T2-100)或重組小鼠Tie2-Fc嵌合體蛋白質(R&D公司、762-T2-100)，以PBS配製為1μg/mL，對白色Maxisorp 384孔盤(Nunc公司、460372)每1孔添加20μL，藉由於4℃培置一晚來進行固相化。翌日去除固相液，每1孔添加50μL之含有20%之BlockingOne(Nacalai Tesque公司、03953-95)的Tris緩衝生理食鹽水(TBS)-0.05%Tween(Wako公司、310-7375)(以下稱為TBS-T溶液)，於室溫靜置1小時。作為被驗抗體，係將TIE-1-Igγ1-LALA使用含5%之BlockingOne的TBS-T溶液由0.03ng/mL至100ng/mL以約3倍公比進行8階段稀釋，每1孔添加20μL。作為控制組，係準備添加TBS-T溶液以取代被驗抗體之孔。於室溫培置1.5小時後，以TBS-T溶液洗淨。作為2次抗體，係將經生物素標識之抗人類kappa輕鏈抗體(免疫生物研究所、17249)以含5%之BlockingOne的TBS-T溶液稀釋為0.1μg/mL，每1孔添加20μL。於室溫培置1小時後，以TBS-T溶液洗淨，以由含5%之BlockingOne的TBS-T溶液稀釋為0.1μg/mL之鹼性磷酸酶標識鏈親和素(Thermo Fisher Scientific公司、21324)作為檢測試藥，每1孔添加20μL。於室溫培置1小時後，以TBS-T溶液 洗淨，以經含有1mM MgCl2之20mM TBS(pH9.8)稀釋5倍之Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)(BioFX公司、APU4-0100-01)作為基質，添加20μL。於室溫培置30分鐘後，以EnVisionTM Multilabel Counter(PerkinElmer公司)測定發光強度。解析所算出之結合活性，藉由Sigmoid-Emax模式非線形回歸分析來算出被驗抗體之EC50值。
其結果明顯可知，TIE-1-Igγ1-LALA對人類、猴子、大鼠及小鼠Tie2具有相同程度之高的結合活性。
(參考例2：15B8對Tie2之結合活性評估)
遵照實施例12之方法，評估15B8對各種Tie2蛋白質之結合活性。惟，作為2次抗體係使用HRP標識抗小鼠kappa輕鏈抗體(SouthernBiotech公司、1050-05)、作為基質係使用TMB顯色試藥、作為測定器係使用ARVO Multilabel Reader(PerkinElmer公司)，來測定450nm之吸光度。又，作為被驗抗體係使用15B8，抗體濃度係由1000ng/mL至0.3ng/mL以約3倍公比(8階段稀釋)來實施。解析所算出之結合活性，藉由Sigmoid- Emax模式非線形回歸分析來算出被驗抗體之EC50值(表5)。
其結果明顯可知，15B8雖觀察到對人類及猴子Tie2之結合活性，但對大鼠及小鼠Tie2之結合活性極弱。
由實施例12之結果，TIE-1-Igγ1-LALA對人類、猴子、大鼠及小鼠Tie2，觀察到無物種差之高的結合活性。另一方面，15B8於結合活性觀察到物種差。由以上，暗示了TIE-1-Igγ1-LALA之人類Tie2抗原決定位與15B8之抗原決定位相異。
(實施例13：TIE-1-Igγ1-LALA之大鼠血管透過性阻礙作用評估)
遵照實施例10之方法，評估TIE-1-Igγ1-LALA之大鼠血管透過性阻礙作用。惟作為被驗抗體係使用TIE-1-Igγ1-LALA，且抗體投與用量係以0.1及0.3mg/kg來實施。結果如圖3所示。
求出各群之平均值及標準誤差。Vehicle群與各抗體投與群之間的顯著性檢定係使用Dunnett之多重比較檢定。p<0.05時視為有顯著差異。
如圖3所示，相較於Vehicle群，TIE-1-Igγ1-LALA顯著地阻礙了色素漏出。由以上明顯可知TIE-1-Igγ1-LALA會阻礙血管透過性亢進。
(實施例14：對外被細胞脫落小鼠網膜水腫之阻礙作用)
於糖尿病性網膜症患者之網膜血管，外被細胞之脫落係特徵性病變之一(Retina、2013、Fifth edition、p.925-939)。於糖尿病網膜症研究上，廣泛使用鏈佐黴素誘發糖尿病大鼠模式，但由於至觀察到外被細胞脫落為止需要數個月期間、或未觀察到外被細胞之脫落被視為其成因之一的毛細血管瘤、外被細胞與內皮細胞之比例與人類相異(Retina、2013、Fifth edition、p.925-939)、及未觀察到明顯的網膜水腫等，可知此模式之有用性有一定的極限(Diabetes Metab.J.、2013、Vol.37、p.217-224)。另一方面，於具有藉由抗PDGF受體β(PDGFRβ)抗體投與而使外被細胞脫落之網膜血管的小鼠中，雖非高血糖，但觀察到網膜血管之擴張或網膜之水腫、出血等與糖尿病網膜症及糖尿病黃斑部水腫類似的病變，因此被報告了外被細胞之脫落與糖尿病網膜症及糖尿病黃斑部水腫中之血管脆弱化的關聯(J.Clin.Invest.、2002、Vol.110、p.1619-1628)。因此，為了評估對糖尿病網膜症及糖尿病黃斑部水腫之有效性，使用呈現了糖尿病網膜症患者的特徵性病變即外被細胞脫落之病態模式，來評估對網膜水腫之阻礙 作用，係有用的。
外被細胞脫落誘發網膜水腫，係將J.Clin.Invest.、2002、Vol.110、p.1619-1628所報告之方法一部分改變來誘導。亦即，對生後2日齡C57BL/6J小鼠(日本Charles River公司)皮下投與經PBS稀釋之抗PDGFRβ單株抗體1B3(國際公開第2008/130704號)25mg/kg，誘發網膜血管外被細胞之脫落。
〔處置群〕
Control群(亦稱為Cont.群)：17隻
未投與抗PDGFRβ抗體，且投與PBS之群
Vehicle群(亦稱為Veh.群)：24隻
投與抗PDGFRβ抗體，且投與PBS以取代TIE-1-Igγ1-LALA之群
TIE-1-Igγ1-LALA群(0.1、0.3及1mg/kg)：分別為23、21及21隻
投與抗PDGFRβ抗體，且投與各用量之TIE-1-Igγ1-LALA之群
於抗PDGFRβ抗體投與90分鐘前，皮下投與0.1、0.3及1mg/kg之經PBS稀釋之TIE-1-Igγ1-LALA。抗體投與1週後評估網膜水腫。具體而言，係摘出眼球，以含有1%戊二醛及2.5%甲醛之溶液固定後，製作石蠟包埋薄切切片。將經蘇木素/曙紅染色之標本以virtual slide scanner(NanoZoomer XR、Hamamatsu Photonics公司) 轉換為影像數據。由於本病態模式中報告了於網膜神經纖維層(NFL)之網膜水腫(J.Clin.Invest.、2002、Vol.110、p.1619-1628)，故藉由以NPD view 2(Hamamatsu Photonics公司)測定NFL及鄰接於其之網膜神經節細胞層之面積，而作為網膜水腫來定量化。結果如圖4所示。
求出各群之平均值及標準誤差。Veh.群與TIE-1-Igγ1-LALA群之間的顯著性檢定係使用Dunnett之多重比較檢定。Cont.群與Veh.群之間的顯著性檢定係使用Student之t檢定。不管何種情況均以p<0.05時視為有顯著差異。
如圖4所示，明顯可知相較於Veh.群，TIE-1-Igγ1-LALA群(1mg/kg)係顯著地阻礙了具有外被細胞脫落之網膜血管的網膜水腫。TIE-1-Igγ1-LALA會阻礙由外被細胞脫落之網膜血管所產生之網膜水腫，故暗示了對糖尿病黃斑部水腫及糖尿病網膜症為有效。
(實施例15：後肢缺血小鼠缺血肢血流改善作用)
後肢缺血模式係藉由將單側後肢之血管予以結紮及摘出，來引起後肢組織之缺血的模式，其係評估缺血症狀之改善的代表模式(J.Vasc.Surg.、2012、Vol.56、p.1669-1679)。
對10週齡C57BL/6J小鼠(日本CLEA公司)結紮左後肢之大腿動靜脈之鼠蹊部及隱動靜脈。進一 步地，將其間之分枝血管結紮後，摘出結紮部間之血管。手術係於戊巴比妥鈉(60mg/kg、東京化成工業)麻醉下實施。血管摘出1週後，於戊巴比妥麻醉下，使用雷射都卜勒血流影像化裝置MoorLDI2(Moor Instruments公司)，測定後肢之血流。確認施術肢之血流降低後，如以下方式來設定處置群。
〔處置群(各群10隻)〕
對照群：投與PBS以取代抗體之群
TIE-1-Igγ1-LALA群(1mg/kg)：投與TIE-1-Igγ1-LALA之群
將經PBS稀釋之TIE-1-Igγ1-LALA皮下投與1mg/kg，測定抗體投與1週後之正常肢及缺血肢之皮膚血流量。具體而言，係將戊巴比妥鈉(60mg/kg)予以腹腔內投與，置於保溫台上，於麻醉投與15分鐘後測定足部的皮膚血流。將以足底部為注意區域(Region of interest：ROI)計測血流量之結果示於圖5。
求出各群之平均值及標準誤差。對照群與TIE-1-Igγ1-LALA群之間的顯著性檢定係使用Student之t檢定。p<0.05時視為有顯著差異。
如圖5所示，明顯可知相較於對照群，TIE-1-Igγ1-LALA群顯著改善了正常肢及缺血肢之血流量。因此，暗示了TIE-1-Igγ1-LALA對重症下肢缺血等之末梢動 脈疾病的有效性。
(實施例16：TIE-1-Igγ1-LALA之抗原決定位評估：氫氘交換質譜分析)
為了鑑定TIE-1-Igγ1-LALA之認識抗原決定位，係製作實施例7中製作之完全人類型2-16A2之Fab(以下稱為完全人類型2-16A2-Fab)。完全人類型2-16A2-Fab因具有與TIE-1-Igγ1-LALA相同之可變區域，因此此等之抗體係認識相同之抗原決定位。製作由Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號1至452所構成之人類Tie2蛋白質(以下稱為人類Tie2(1-452))，作為抗原。該胺基酸序列係鑑定Ang-2之Tie2結合部位時所用的部位(Nat.Struct.Mol.Biol.、Vol.13、p.524-532)。
具體而言，完全人類型2-16A2-Fab之製作，係組合插入有編碼由完全人類型2-16A2之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造(由序列編號12之胺基酸編號1至221之胺基酸序列所構成)的重鏈基因之GS載體pEE6.4、與插入有完全人類型2-16A2之輕鏈基因的GS載體pEE12.4，使用與實施例7記載之抗體表現方法及純化方法相同的方法，製作完全人類型2-16A2-Fab。
為了得到人類Tie2(1-452)，首先製作以凝血酶認識序列(由序列編號22表示之胺基酸序列所構成)為連結子，使人類Tie2(1-452)與人類Fc(由序列編號23表示之胺基酸序列所構成)融合的蛋白質(以下稱為人類 Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質)。具體而言，將編碼人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質之基因插入GS載體pEE12.4，使用與實施例7記載之表現方法及純化方法相同的方法，製作人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質。接著，將所製作之人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質，於22℃與凝血酶(GE Healthcare公司、27-0846-01)培置16小時，藉由Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow(high sub)(GE Healthcare公司)及MabSelect SuRe，去除凝血酶及人類Fc，切斷Fc部分，藉以製作人類Tie2(1-452)。
以鑑定抗原決定位部位為目的，使用NanoAQUITY UPLC HDX系統(Waters公司)，實施氫氘交換質譜分析(以下稱為H/D交換質譜分析。Anal.Bional.Chem.、2010、Vol.397、p.967-979)。
具體而言，使用含有120mM氯化鈉之20mM檸檬酸緩衝液(pH6)來配製完全人類型2-16A2-Fab及人類Tie2(1-452)混合液(終濃度分別為50μM及25μM)，於37℃靜置一晚。準備以含有120mM氯化鈉之20mM檸檬酸緩衝液(pH6)配製僅有人類Tie2(1-452)而得的溶液，作為對照。之後，添加於以重水(關東化學)配製之PBS緩衝溶液，分別靜置20秒、1分鐘、10分鐘、60分鐘及120分鐘，藉以實施氘化。接著於0℃添加含有100mM二硫蘇糖醇(Nacalai)及4M胍鹽酸鹽(和光純藥)之水溶液(pH2.5)後，使用胃蛋白酶管柱 (Proszyme(註冊商標)Immobilized Pepsin Cartridge、Applied Biosystems公司)實施消化，以捕捉管柱(ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm VanGuard Pre-Column、Waters公司)捕捉消化之胜肽。接著以使用了C18管柱(AQUITY UPLC BEH C18 1.7μm、Waters公司)之逆相層析進行分離，以質譜分析器(SynaptG2-Si、Waters公司)測定分子量。算出所檢測之全部的胜肽之重心值，與進行過氘取代之僅有人類Tie2(1-452)之重心值比較，以各自之氘化時間的形式算出發生氘取代之變化量。
H/D交換質譜分析之結果，顯示Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號27~37、29~37、29~38、43~60、82~100、98~107、111~124、116~125、116~129、119~129、189~198及190~198之胜肽，於抗體共存下，氘化被抑制。整理此等之胜肽的重複區域，又，亦加上氘化未被抑制之胜肽的資訊，進一步地，考慮到N末端側之2個胺基酸於測定中容易發生逆交換(Proteins、1993、Vol.17、75-86)，則作為氘取代被抑制之區域、亦即抗原決定位候選者部位，係發現了Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號29~38、84~102、113~120、126~129及191~198的5個。再者，H/D交換質譜分析之結果，顯示TIE-1-Igγ1-LALA會與由此等5個胺基酸區段所構成之區域相互作用、或藉由抗體結合所致之立體構造變化或異位效應的產生，會保護此等之殘基免於氫/氘交換。
(實施例17：TIE-1-Igγ1-LALA之抗原決定位評估：表面電漿共振現象解析及ELISA)
由實施例16之H/D交換質譜分析，鑑定TIE-1-Igγ1-LALA對人類Tie2之抗原決定位候選者。為了更詳細地推測抗原決定位部分，係製作人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質之胺基酸變異體，使用表面電漿共振現象解析(surface plasmon resonance：SPR解析)及ELISA來評估結合活性。
基於H/D交換質譜分析之結果、以及Ang-1及Ang-2與Tie2結合之區域的報告(Nat.Struct.Mol.Biol.、2006、Vol.13、p.524-532。Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2013、Vol.110、7205-7210)，作為人類Tie2(1-452)之胺基酸變異體，係製作人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質當中，人類Tie2(1-452)之1個至4個胺基酸取代為丙胺酸(一部分為麩胺酸)之胺基酸變異體23種(表6)。各種變異體係以與製作實施例16中製作之人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質之方法相同的方法製作。
為了評估所製作之人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種變異體與完全人類型2-16A2-Fab之結合活性，係實施SPR解析。
SPR解析係使用Biacore T200(GE Healthcare公司)。於CM5感測晶片上固定Anti-human IgG(Fc)antibody(Human Antibody Capture Kit、GE Healthcare公司)。將經HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare公司)稀釋為5μg/mL之人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及其變異 體分別固相化，計測捕捉量。之後，添加經HBS-EP+緩衝液稀釋為50nM之完全人類型2-16A2-Fab，測定與人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種變異體之結合量。而藉由將結合量除以捕捉量，算出每單位固相化抗原之抗體結合量(以下稱為結合比率)。將3次試行之算術平均及以人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質之結合比率為100%時，各變異體之結合比率的相對值示於表7。又，代表性的測定數據如圖6所示。Biacore中，相對比較結合量之方法，例如記載於Analytical Biochemistry、2003、Vol.312、p.113-124。
其結果，完全人類型2-16A2-Fab，明顯可知相較於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質而言，於人類Tie2(1-452)g1-Fc、人類Tie2(1-452)g2-Fc、人類Tie2(1-452)g3-Fc、人類Tie2(1-452)g4-Fc、人類Tie2(1-452)g5-Fc、人類Tie2(1-452)m3-Fc、人類Tie2(1-452)A1-Fc、人類Tie2(1-452)A2-Fc、人類Tie2(1-452)A3-Fc及人類Tie2(1-452)A4-Fc結合降低。
為了評估TIE-1-Igγ1-LALA與人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種變異體的結合活性，以與實施例12相同之方法進行ELISA。
將人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種變異體以PBS稀釋為1μg/mL，於白色Maxisorp 384孔盤中，每1孔添加20μL，藉由於4℃培置一晚進行固相化。翌日去除固相液，以TBS-T溶液洗淨，添加BlockerTM Casein in TBS(Thermo Fisher Scientific公司、37532)50μL，藉由培置60分鐘進行阻隔(blocking)。以TBS-T溶液洗淨，每1孔添加20μL之使用含有0.05%Tween20(Nacalai Tesque公司、28353-85)之BlockerTM Casein in TBS由0.03ng/mL至100ng/mL之8階段稀釋的TIE-1-Igγ1-LALA。於室溫培置90分鐘後，以TBS-T溶液洗淨3次，添加20μL之使用含有0.05%Tween20之BlockerTM Casein in TBS稀釋為0.1μg/mL的生物素標識抗人類kappa輕鏈抗體。於室溫培置60分鐘後，以TBS-T溶液洗淨3次，添加20μL之使用含有0.05%Tween20之BlockerTM Casein in TBS稀釋為0.1μg/mL的鹼性磷酸酶標識鏈親和素。於室溫培置60分鐘後，以TBS-T溶液洗淨3次，添加50μL之經含有1mM MgCl2之20mM TBS(pH9.8)稀釋5倍之Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)作為基質。於遮光室溫下培置40分鐘後，以EnVisionTM Multilabel Counter測定發光強度。算出對人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種變異體之TIE-1-Igγ1-LALA的EC50值。又，算出以TIE-1-Igγ1-LALA結合於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質時的收斂值為100%時，最大適用濃度之100ng/mL TIE-1-Igγ1-LALA結合於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質及23種之各變異體時的發光強度之相對值(表8及表9)。再者，EC50值及收斂值係藉由Sigmoid-Emax模式非線形回歸分析算出。圖示於圖 7。
其結果，相較於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質，變異體之Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc及Tie2(1-452)g4-Fc中，觀察到發光強度之相對值的大幅降低。又，相較於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質，於Tie2(1-452)g5-Fc，觀察到發光強度之相對值降低及EC50值之增大。由以上明顯可知，TIE-1-Igγ1-LALA相較於人類Tie2(1-452)-Fc嵌合體蛋白質，其對Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc、Tie2(1-452)g4-Fc及Tie2(1-452)g5-Fc之結合活性降低。再者，對於Tie2(1-452)A1-Fc，雖觀察到發光強度之相對值的降低，但於EC50值未觀察到差異，因而判斷結合活性無變化。
實施ELISA法與SPR解析法之獨立的2種評估的結果，於兩方之實驗均鑑定到Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc、Tie2(1-452)g4-Fc及Tie2(1-452)g5-Fc，作為結合活性降低之變異體。因此，可認為於此等之 變異體導入變異之胺基酸，亦即胺基酸編號192、194、195、197及198，對TIE-1-Igγ1-LALA之結合係非常重要的抗原決定位候選者。其中，具有I194A、N197A及L198A之胺基酸變異的Tie2(1-452)g1-Fc，於ELISA法觀察到結合降低，但具有I194A之胺基酸變異的Tie2(1-452)g3-Fc，於ELISA法未見到結合降低。又，具有L198A之胺基酸變異的Tie2(1-452)g6-Fc，於ELISA法與SPR解析法兩方，未見到結合降低。由此等之結果，可認為對Tie2(1-452)g1-Fc之結合降低做出貢獻的是胺基酸編號197。由以上明顯可知，TIE-1-Igγ1-LALA係結合Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號192、195及197之胺基酸，作為抗原決定位。
〔產業上之可利用性〕
本發明之抗人類Tie2抗體，係有用於各種血管關聯疾病之預防或治療。又，本發明之聚核苷酸、表現載體、經轉形之宿主細胞及生產抗體之方法，係有用於生產前述抗人類Tie2抗體。
〔序列表自由文本〕
以下之序列表的數字標題<223>，係記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號1表示之鹼基序列，係TIE-1-Igγ1-LALA之重鏈的鹼基序列，序列編號2表示之胺基酸序列，係由序列編號1 所編碼之重鏈的胺基酸序列。序列表之序列編號3表示之鹼基序列，係TIE-1-Igγ1-LALA、TIE-1-Igγ1-I253A、TIE-1-Igγ1-WT、TIE-1-Igγ4-PE、及完全人類型2-16A2之輕鏈的鹼基序列，序列編號4表示之胺基酸序列，係由序列編號3所編碼之輕鏈的胺基酸序列。序列表之序列編號5表示之鹼基序列，係TIE-1-Igγ1-I253A之重鏈的鹼基序列，序列編號6表示之胺基酸序列，係由序列編號5所編碼之重鏈的胺基酸序列。序列表之序列編號7表示之鹼基序列，係TIE-1-Igγ1-WT之重鏈的鹼基序列，序列編號8表示之胺基酸序列，係由序列編號7所編碼之重鏈的胺基酸序列。序列表之序列編號9表示之鹼基序列，係TIE-1-Igγ4-PE之重鏈的鹼基序列，序列編號10表示之胺基酸序列，係由序列編號9所編碼之重鏈的胺基酸序列。序列表之序列編號11表示之鹼基序列，係完全人類型2-16A2之重鏈的鹼基序列，序列編號12表示之胺基酸序列，係分別由序列編號11所編碼之重鏈的胺基酸序列。序列編號13~20表示之胺基酸序列，係連結子的胺基酸序列。序列編號22表示之胺基酸序列，係凝血酶認識部位。
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> 新穎抗人類Tie2抗體
<130> A15017A00
<150> JP2014-145135
<151> 2014-07-15
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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Claims (34)

  1. 一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區域，係包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3，該輕鏈可變區域，係包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3，且1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位。
  2. 如請求項1之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係包含4個重鏈可變區域及4個輕鏈可變區域之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區域係由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成， 該輕鏈可變區域係由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成，且1個該重鏈可變區域與1個該輕鏈可變區域構成1個抗原結合部位，該抗體或其抗原結合片段包含4個抗原結合部位；以及(2)抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係藉由如(1)之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段的轉譯後修飾而產生之抗體或其抗原結合片段。
  3. 一種抗人類Tie2抗體，其係如請求項1記載之抗人類Tie2抗體，且該抗體係含有2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由包含由序列編號2之胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號2之胺基酸編號50至66的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號2之胺基酸編號99至111的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的羧基末端(C末端)係透過連結子與另一方之該構造的胺基末端(N末端)連結，各輕鏈係包含：包含由序列編號4之胺基酸編號24至39的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號55至61的胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之胺基酸編號94至102的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
  4. 如請求項3之抗人類Tie2抗體，其係由以下之 (1)或(2)中選擇：(1)抗人類Tie2抗體，其係包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域；以及(2)抗人類Tie2抗體，其係藉由如(1)之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾而產生之抗體。
  5. 一種抗人類Tie2抗體，其係如請求項4記載之抗人類Tie2抗體，且該抗人類Tie2抗體係包含2個重鏈及4個輕鏈，各重鏈係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至122的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域及CH1區域所構成之構造、以及包含CH2區域及CH3區域，一方之該構造的C末端係透過連結子與另一方之該構造的N末端連結，各輕鏈係包含由序列編號4之胺基酸編號1至113的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域。
  6. 一種抗人類Tie2抗體，其係藉由如請求項5之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾而產生之抗體。
  7. 如請求項6之抗人類Tie2抗體，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
  8. 如請求項4之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號2表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  9. 如請求項4之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號6表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  10. 如請求項4之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號10表示之胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  11. 一種抗人類Tie2抗體，其係藉由如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體的轉譯後修飾而產生之抗體。
  12. 如請求項11之抗人類Tie2抗體，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯基化及/或重鏈C末端之離胺酸缺失。
  13. 如請求項11之抗人類Tie2抗體，其係包含2個之由序列編號2之胺基酸編號1至678的胺基酸序列所構成之重鏈、及4個之由序列編號4表示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  14. 一種4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係結合於與如請求項8或13之抗人類Tie2抗體相 同之人類Tie2抗原決定位。
  15. 如請求項14之4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其中人類Tie2抗原決定位，為包含Accession No.NP_000450.2之胺基酸編號192、195及197之胺基酸的人類Tie2抗原決定位。
  16. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列。
  17. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列。
  18. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列。
  19. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列。
  20. 一種表現載體，其係含有如請求項16及/或17之聚核苷酸。
  21. 一種表現載體，其係含有如請求項18及/或19之聚核苷酸。
  22. 一種經如請求項20之表現載體轉形之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所成之群：(a)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼 基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
  23. 一種經如請求項21之表現載體轉形之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所成之群：(a)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(c)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉 形之宿主細胞；及(d)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
  24. 一種生產抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使4價之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段表現之步驟：(a)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如請求項2之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
  25. 一種生產抗人類Tie2抗體之方法，其係包含培養選自由以下之(a)~(c)所成之群的宿主細胞，使抗 人類Tie2抗體表現之步驟：(a)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；(b)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；以及(c)經含有包含編碼如請求項8~10中任一項之抗人類Tie2抗體之重鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞、及經含有包含編碼該抗人類Tie2抗體之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
  26. 一種抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係以如請求項24之方法生產。
  27. 一種抗人類Tie2抗體，其係以如請求項25之方法生產。
  28. 一種醫藥組成物，其係含有如請求項1~13、26及27中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段及藥學上容許之賦形劑。
  29. 一種醫藥組成物，其係含有如請求項5之抗人類Tie2抗體、如請求項6之抗人類Tie2抗體、及藥學上容許之賦形劑。
  30. 一種醫藥組成物，其係含有如請求項8之抗人類 Tie2抗體、如請求項13之抗人類Tie2抗體、及藥學上容許之賦形劑。
  31. 如請求項28~30中任一項之醫藥組成物，其係糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。
  32. 一種預防或治療糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之方法，其係包含投與如請求項1~13、26及27中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段的治療有效量之步驟。
  33. 如請求項1~13、26及27中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段，其係使用於糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療。
  34. 一種如請求項1~13、26及27中任一項之抗人類Tie2抗體或其抗原結合片段之使用，其係用於製造糖尿病黃斑部水腫、糖尿病網膜症或重症下肢缺血之預防或治療用醫藥組成物。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3634466A4 (en) * 2017-06-06 2021-03-24 Relinia, Inc. MONOCATENARY TNF RECEPTOR 2 AGONIST FUSION PROTEINS
JP2021516961A (ja) * 2018-03-05 2021-07-15 エタブリスモン フランセ ドュ サンＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ Ｄｕ Ｓａｎｇ 遺伝子組換え単鎖免疫グロブリン
WO2019235856A1 (ko) * 2018-06-07 2019-12-12 기초과학연구원 Tie2에 결합하는 항체 및 이의 용도
AU2019343952A1 (en) 2018-09-21 2021-04-22 Mucommune, Llc Synthetic binding agents for limiting permeation through mucus
MX2021012869A (es) * 2019-08-14 2021-12-10 Pharmabcine Inc Anticuerpo anti-tie2 y uso del mismo.
CN114901700A (zh) * 2019-11-21 2022-08-12 尤尼蒂生物技术公司 针对tie-2的抗体及其使用方法
WO2021194913A1 (en) * 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Tie2-binding agents and methods of use
KR20220059924A (ko) * 2020-11-03 2022-05-10 한국생명공학연구원 신규 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도
JP2024517856A (ja) * 2021-05-06 2024-04-23 インスティチュート フォー ベーシック サイエンス Ｔｉｅ２アゴニスト抗体及びその用途

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5879672A (en) * 1994-10-07 1999-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 1
AUPM379494A0 (en) 1994-02-10 1994-03-03 Ludwig Institute For Cancer Research Immunointeractive molecules - ii
US6365154B1 (en) 1998-09-28 2002-04-02 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
SI2857516T1 (sl) * 2000-04-11 2017-09-29 Genentech, Inc. Multivalentna protitelesa in njihove uporabe
US7485297B2 (en) 2003-08-12 2009-02-03 Dyax Corp. Method of inhibition of vascular development using an antibody
US8298532B2 (en) * 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
ES2828627T3 (es) * 2008-04-25 2021-05-27 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo multivalente estable
US20120129847A1 (en) * 2010-10-07 2012-05-24 Kevin Gene Peters Compositions and methods for treating ocular edema, neovascularization and related diseases
ES2694411T3 (es) * 2011-08-19 2018-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-Tie2 y usos de los mismos
CA2876099A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof

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