KR20220059924A - 신규 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도 - Google Patents

신규 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220059924A
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Abstract

본 발명은 신규한 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이들의 용도에 관한 것으로서, 본 발명은 X1-X2-X3-X4-X5-X6-Y-X7-M-H-W-X8의 아미노산 서열(상기 아미노산 서열에서, X1 내지 X8은 각각 독립적으로 임의의 아미노산임)을 갖는 CDR1-H를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N-X24-X25-X26-Y의 아미노산 서열(상기 아미노산 서열에서, X17 내지 X20 및 X22 내지 X26은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, X21은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나임)을 갖는 CDR1-L을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하여 이를 인산화시키는 활성을 가지는 한편, 항원에 대한 특이성이나 친화도의 측면에서도 기존의 리간드나 항체들에 비해 훨씬 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 완전 인간 항체이어서 거부 반응의 염려없이 인간을 대상으로 한 약학적 조성물의 유효성분으로 적용할 수 있으므로, 혈관신생 관련 질환의 치료나 예방에 유효하게 이용될 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도{A Novel anti-Tie2 antibody or its antigen-binding fragments, and the use thereof}
본 발명은 신규한 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이들의 용도에 관한 것이다.
Tie2 단백질은 혈관내피세포에 특이적으로 발현되는 수용체형 티로신 키나아제로서, 대표적으로 다량체형 당단백질인 Ang1(Angiopoietin-1)이라는 특이적 리간드에 의해 인산화되어 활성화되는 것으로 알려져 있는데, 다양한 생리·병리적 상황에 혈관신생, 혈관의 구조적·기능적 정상화 및 안정화에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 Ang1에 의한 Tie2 단백질의 활성화는 그 자체만으로도 구조적 기능적으로 성숙한 혈관을 유도할 수 있어, 특히 허혈성 질환 치료제로서 각광을 받고 있다. 또한, VEGF에 의해 유발되는 혈관누수, 혈관염증 및 혈관의 비정상화를 억제할 수 있는 기능을 가지고 있어, 최근에는 당뇨망막병증, 패혈증 및 종양의 치료 전략으로, VEGF 억제를 통한 비정상적인 혈관신생은 억제하고, Tie2 수용체의 활성화를 통해서는 기 발생한 비정상화된 혈관의 정상화 및 안정화를 유도하는 전략이 제시되면서 Ang1에 의한 Tie2 활성화가 더욱 각광받고 있다.
그러나 상기 Ang1은 생체 내에서 사량체의 형태로 합성되어 생리적 활성을 나타내는데, 이러한 Ang1 사량체는 재조합 단백질 형태이어서 생산하기가 매우 어렵고, 생체 내에서 짧은 반감기를 나타내기 때문에 치료제로서 활용하기 어려운 실정이다. 이러한 Ang1의 문제점을 해결하기 위하여 Ang1을 대체할 수 있는 다양한 Tie2 특이적 활성화제에 대한 연구가 진행되고 있지만, 낮은 생산성과 면역반응 유발의 우려와 같은 문제점이 있어 치료제로서 이용되는데는 한계가 있다. 이에, 상기와 같은 Ang1을 대체할 수 있는 Tie2 특이적 활성화제에 대한 연구·개발은 여전히 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자와, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 X1-X2-X3-X4-X5-X6-Y-X7-M-H-W-X8의 아미노산 서열(상기 아미노산 서열에서, X1 내지 X8은 각각 독립적으로 임의의 아미노산임)을 갖는 CDR1-H를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N-X24-X25-X26-Y의 아미노산 서열(상기 아미노산 서열에서, X17 내지 X20 및 X22 내지 X26은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, X21은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나임)을 갖는 CDR1-L을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 항원 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2단백질을 특이적으로 인산화시키는 것일 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자와, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 형질전환체를 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 신규 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 결합하여 이를 인산화시키는 활성을 가지는 한편, 항원에 대한 특이성이나 친화도의 측면에서도 기존의 리간드(Ang1, Ang2)나 항체들에 비해 훨씬 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 상기 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 완전 인간 항체이어서 거부 반응의 염려없이 인간을 대상으로 한 약학적 조성물의 유효성분으로 적용할 수 있으므로, 혈관신생이 부족하거나 비정상적 혈관이 과도하여 유발되는 혈관신생 관련 질환의 치료나 예방에 유효하게 이용될 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 Ang1mab4 기본 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR들에 대하여 알라닌 스캐닝 기법을 통해 주요 아미노산을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포에서 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)의 Tie2, AKT, ERK 단백질에 대한 인산화 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포에서 변이 항체들의 Tie2 단백질에 대한 인산화 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HUVEC에서 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들의 Tie2, AKT, ERK 단백질에 대한 인산화 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 기본 항체(Ang1mab4)가 HUVEC 및 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포에서 Tie2 단백질만을 특이적으로 인산화시킴을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들의 종간 교차 결합을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 항체의 항원 결정기를 확인하기 위하여 인간 Tie2 단백질에서 주요 도메인들을 하나씩 제거하여 설계한 변이체를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10a는 기본 항체(Ang1mab1)가 인간 Tie2 단백질의 어느 도메인에 결합하는지, 그리도 도 10b는 기본 항체(Ang1mab1)가 결합하는 도메인의 구체적인 아미노산 서열을 확인한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 11은 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들이 HUVEC의 혈관 형성을 촉진하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 기본 항체(Ang1mab4)가 HUVEC의 세포사(apoptosis)를 억제하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 구체적인 실시예에서 제조한 형질전환 마우스의 혈관 내에서 인간 Tie2 단백질이 제대로 발현되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 기본 항체들(Ang1mab1 및 Ang1mab4)이 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시킴으로써 혈관 발아(sprouting)를 촉진하는지 여부를 엑스 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15 및 도 16은 기본 항체(Ang1mab4)가 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시킴으로써 혈관신생의 촉진을 통해 상처 치유를 촉진하는지, 나아가 혈관주위세포(pericyte)를 잘 둘러쌈으로써 혈관을 안정화시키는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 기본 항체(Ang1mab4)가 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시킴으로써 혈관신생의 촉진을 통해 하지허혈을 개선할 수 있는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 기본 항체(Ang1mab4)가 HUVEC에서 VEGF(vascular endothelial growth factor)에 의해 유발되는 혈관 투과성 증가 현상, 이른바 누수 현상을 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 기본 항체(Ang1mab4)가 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시켜 혈관 누수를 억제함으로써 패혈증을 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20 및 도 21은 기본 항체(Ang1mab1)가 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시킴으로써 과도한 비정상적인 혈관신생에 의해 유발되는 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 기본 항체(Ang1mab1)가 형질전환 마우스에서 발현되는 인간 Tie2 단백질을 활성화시켜 비정상적인 종양 혈관을 정상화시킴으로써, 종양 성장을 억제하는 항종양 면역세포들의 종양 내로의 유입을 증가시킬 수 있는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 인간 Tie2 단백질을 활성화시키는 기본 항체(Ang1mab1)와 면역회피를 억제하는 면역관문억제 항체(Anti-PD-1)를 병용 투여를 했을 때, 종양의 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 기본 항체들을 이용하여 설계한 4가 항체의 구조(A)와, 상기와 같이 설계된 각 4가 항체들이 제대로 생성되었는지를 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 25는 상기와 같이 설계된 4가 항체들의 항원에 대한 친환도(A) 및 항원에 대한 활성화 효과를 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 '항체'는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄 각각에 하나씩의 경쇄가 이황화 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 면역글로불린 분자 및 이들의 다량체를 의미한다. 경쇄는 두 개의 영역, 즉 하나의 가변 영역(경쇄 가변 영역, VL)과 하나의 불변 영역(경쇄 불변 영역, CL)을 포함하고, 중쇄는 네 개의 영역, 즉 하나의 가변 영역(중쇄 가변 영역, VH)과 세 개의 불변 영역(중쇄 불변 영역, CH; CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 경쇄 및/또는 중쇄들 간의 결합, 분비, 보체 결합, Fc 수용체(FcR)와의 결합 등과 같은 생물학적 성질을 부여하는 역할을 하고, 경쇄와 중쇄의 가변 영역은 항원에 대한 인식 및 결합 특이성을 결정한다. 특히, 항체의 결합 특이성은 항체 결합 자리(antigen binding site) 및 항원 결정기(epitope) 사이의 구조적인 상보성에 의한 것인데, 상기와 같은 항체 결합 자리는 주로 중쇄와 경쇄의 가변 영역에 포함된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라고 불리는 3개의 초가변 영역에서 유래한 잔기들로 이루어지기 때문에, 상기와 같은 상보성 결정 영역을 항체의 결합 특이성을 정의하는 아미노산 서열들로 지칭한다. 상기와 같은 3개의 CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 불리는 4개의 비교적 잘 보존된 영역들 사이에 배치되는데, 이들은 N-말단에서 C-말단의 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배치되어 연결된다. 이때, 상기 중쇄 가변 영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H라고 하고, 상기 경쇄 가변 영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L이라고 한다.
본 발명에서 일컫는 '항원 결합 단편'은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 자리 또는 가변 영역을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 당단백질을 의미한다. 상기와 같은 항체 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의하거나, 온전한 항체를 효소적 또는 화학적으로 분해함으로써 생성될 수 있고, 상기 항체 결합 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디(diabodies) 등은 물론, 이들로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체들도 포함하며, 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서 일컫는 '단일클론 항체'는 "mAb"라고도 지칭되는 단일 아미노산 서열의 항체 분자를 지칭하는데, 이는 특정 항원을 대상으로 하며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예컨대, 단일클론 항체는 B 세포의 단일 클론 또는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있지만, 재조합될 수도 있다.
본 발명에서 일컫는 '키메라 항체'는 유전자 공학에 의해 제조된 항체를 지칭하는데, 이는 가장 광범위한 의미에서, 하나의 항체로부터의 하나 이상의 부위 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 부위를 함유한다. 예컨대, 키메라 항체는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 등의 비인간 동물로부터 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을, 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 함께 포함한다. 또한, 키메라 항체는 적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 특이성을 나타내는 다중특이적인 항체를 지칭할 수도 있다.
본 발명에서 일컫는 '인간화 항체'는 전체적으로 또는 부분적으로 비인간 동물에서 유래한 것이고, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위하여, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 프레임워크 영역의 특정 아미노산을 교체하도록 변형된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 영역은 대부분의 경우 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이다.
본 발명에서 일컫는 '인간 항체'는 인간 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면, CDR에서, 특히 CDR3에서 인간 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 일컫는 '인간 항체'는 마우스와 같은 다른 비인간 동물 유래의 배선로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하지 않는다.
본 발명에서 일컫는 '항원 결정기(epitope)'는 파라토프로서 공지되어 있는 항체의 항원 결합 자리에 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부위를 의미한다. 단일 항원은 1개 이상의 항원 결정기를 가질 수 있고, 동일한 항원에 결합하는 것이라도 항체가 결합하는 항원의 구체적인 부위가 다른 경우에 이들 항체는 항원 결정기가 다른 것이다. 상기 항원 결정기는 통상적으로 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 또한, 상기 항원 결정기는 입체적인 또는 비입체적인 구조를 갖는 것일 수도 있고, 입체적 항원 결정기와 비입체적 항원 결정기는 변성 용매의 존재 하에서 입체적 항원 결정기에 대한 결합은 소실되지만 비입체적 항원 결정기에 대한 결합은 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본 발명에서 일컫는 '보존적 치환'은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘과 같은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들 중에서 치환되는 것이 보존적인 치환에 해당한다. 그 밖에, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인과 같은 비대전성 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판과 같은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 트레오닌, 발린, 이소류신과 같은 β-분지 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘과 같은 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들 중에서의 치환도 마찬가지로 보존적인 치환에 해당한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편
본 발명의 일 측면은 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역과 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄 가변 영역은 X1-X2-X3-X4-X5-X6-Y-X7-M-H-W-X8(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-H을 포함하고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서 X1 내지 X8은 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X1은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X1은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X1은 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X2는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X2는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X2는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X2는 알라닌, 류신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X3는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X3는 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X3는 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X3는 트레오닌 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X4는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X4는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X4는 글리신, 알라닌, 발린, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X4는 글리신, 알라닌, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X4는 알라닌 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X5는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X5는 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X5는 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X5는 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X6는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X6는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X6는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X6는 세린, 아스파라긴 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X7은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X7은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X7은 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X7은 알라닌일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, 상기 X8은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X8은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X8은 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 GLTFSNYAMHWV(서열번호 10), ALTFSNYAMHWV(서열번호 21), GATFSNYAMHWV(서열번호 22), GLTFANYAMHWV(서열번호 23), GLTFSNYAMHWA(서열번호 24) 및 GFTFSSYAMHWV(서열번호 16)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄 가변 영역은, I-X9-Y-X10-X11-X12-N-K(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-H을 더 포함할 수 있고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열에서 X9 내지 X12은 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 5 아미노산 서열에서, 상기 X9은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X9은 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X9은 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X9은 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열에서, 상기 X10는 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X10는 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X10는 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X10는 아스파르트산 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열에서, 상기 X11은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X11은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X11은 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열에서, 상기 X12은 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X12은 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X12은 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X12은 글루탐산, 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 ISYDGENK(서열번호 11) 및 ISYDGSNK(서열번호 17)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄 가변 영역은, CDR3-H를 더 포함할 수 있다.
상기 CDR3-H는 X13-T-P-K-G-X14-X15-L-E-X16(서열번호 6)의 아미노산 서열 또는 ARQYSGVFEY(서열번호 18)의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열에서 X13 내지 X16는 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 상기 X13는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X13는 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X13는 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X13는 알라닌일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 상기 X14은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X14은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X14은 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 상기 X15는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X15는 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X15는 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X15는 알라닌일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 상기 X16는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X16는 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X16는 알라닌 및 이소류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 ATPKGGALEI(서열번호 12)의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
한편, 상기 CDR3-H는 ARQYSGVFEY(서열번호 18)의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 18의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 상기 중쇄 가변 영역은 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAAS(서열번호 29)의 아미노산 서열 또는 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(서열번호 37)의 아미노산 서열을 갖는 FR1-H, RQAPGKGLEWVAV(서열번호 30)의 아미노산 서열을 갖는 FR2-H, YYADSVKGRFTISRDNSKNMLQLQMNRLRSEDTAVYYC(서열번호 31)의 아미노산 서열 또는 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(서열번호 38)의 아미노산 서열을 갖는 FR3-H, 및 WGQGTVITVSS(서열번호 32)의 아미노산 서열 또는 WGQGTLITVSS(서열번호 39)의 아미노산 서열을 갖는 FR4-H로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 프레임워크를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 43의 아미노산 서열 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 상기 경쇄 가변 영역은 X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N-X24-X25-X26-Y(서열번호 7)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-L을 포함하고, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서 X17 내지 X20 및 X22 내지 X26은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, X21은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X17은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X17은 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X17은 아스파라긴, 글루타민, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X17은 글루타민 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X18은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X18은 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X18은 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X18은 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X19은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X19은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X19은 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X20는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X20는 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X20는 알라닌 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X21은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X21은 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X22는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X22는 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X22는 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X22는 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X22는 아르기닌, 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X23은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X23은 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X23은 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X23은 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X24는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X24는 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X24는 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X24는 아스파라긴 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X25는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X25는 아르기닌, 리신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X25는 아르기닌, 리신, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X25는 아르기닌, 리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X25는 아르기닌, 리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 상기 X26은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X26은 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X26은 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X26은 아스파라긴 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 QSVLYSSNNKNY(서열번호 13), ASVLYSSNNKNY(서열번호 25), QSALYSSNNKNY(서열번호 26), QSVLYSANNKNY(서열번호 27), QSVLFSSNNKNY(서열번호 28) 및 QSVLYRSNNRNY(서열번호 19)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 경쇄 가변 영역은, W-X27-X28(서열번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2를 더 포함할 수 있고, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열에서 X27 및 X28은 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열에서, 상기 X27은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X27은 글리신, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X27은 글리신 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X27은 알라닌일 수 있다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열에서, 상기 X28은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X28은 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X28은 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X28은 세린 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열은 WAS(서열번호 14)의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 경쇄 가변 영역은, Q-Q-Y-X29-S-X30-P-X31-X32(서열번호 9)의 아미노산을 포함하는 CDR3-L를 더 포함할 수 있고, 상기 서열번호 9의 아미노산에서 X30 및 X32는 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있고, X29은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있으며, X31은 이소류신 및 티로신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 9의 아미노산 서열에서, 상기 X29은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X29은 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 9의 아미노산 서열에서, 상기 X30는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X30는 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X20는 알라닌 및 이소류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 9의 아미노산 서열에서, 상기 X31은 이소류신 및 티로신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 서열번호 9의 아미노산 서열에서, 상기 X32는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이와 보존적 치환이 가능한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 X32는 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X32는 세린, 트레오닌, 알라닌 및 발린으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X32는 트레오닌 및 알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 9의 아미노산 서열은 QQYYSAPIT(서열번호 15) 및 QQYFSIPYT(서열번호 20)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 상기 경쇄 가변 영역은 DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS(서열번호 33)의 아미노산 서열을 갖는 FR1-L, LAWYQQKPGQPPNLLMY(서열번호 34)의 아미노산 서열 또는 LAWYQQKLGQPPQLLIY(서열번호 40)의 아미노산 서열을 갖는 FR2-L, TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(서열번호 35)의 아미노산 서열 또는 TRESGVPDRFSGSGSGADFTLTISSLQAEDVAVYYC(서열번호 41)의 아미노산 서열을 갖는 FR3-L, 및 FGQGTRLEIK(서열번호 36)의 아미노산 서열 또는 FGQGTKLEIK(서열번호 42)의 아미노산 서열을 갖는 FR4-L로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 프레임워크를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 인간 항체 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있고, 특히 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 47의 아미노산 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
한편, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역 각각을 복수 개 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역을 각각 2개씩 포함하는 2가 항체이거나, 또는 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역을 각각 4개씩 포함하는 4가 항체일 수도 있다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 다시 말해서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열은, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결정기인 것이다. 따라서 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드나 단백질, 특히 상기 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드나 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 55의 아미노산 서열에도 특이적으로 결합할 수 있다. 다시 말해서, 상기 서열번호 55의 아미노산 서열 역시 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 또 다른 항원 결정기인 것이다. 따라서 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 상기 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드나 단백질에도 특이적으로 결합할 수 있다. 결국, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열; 또는 서열번호 55의 아미노산 서열;을 포함하는 폴리펩티드나 단백질에도 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열; 또는 상기 서열번호 55의 아미노산 서열;을 포함하는 폴리펩티드나 단백질로는 대표적으로 Tie2 단백질이나 그의 Ig2 도멘인을 들 수 있다. 상기 Tie2 단백질은 포유 동물, 예컨대 인간, 원숭이, 랫, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소 등에서 유래된 것일 수 있고, 이들 중에서도 특히 인간, 원숭이 등에서 유래한 것일 수 있다. 본 발명에서 비인간 종인 것으로 명시하지 않는 한 상기 Tie2 단백질은 인간에서 유래된 것을 의미하고, 특히 상기 인간 유래 Tie2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 이의 Ig2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 116번째 내지 135번째의 영역이고, 서열번호 54의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 131번째 내지 135번째의 영역이며, 상기 서열번호 55의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 194번재 내지 208번째의 영역이다. 따라서, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 단백질 또는 이의 Ig2 도메인, 특히 인간 Tie2 단백질 또는 이의 Ig2 도메인, 그 중에서도 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 55의 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열 또는 서열번호 55의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10nM 이하, 7nM 이하, 5nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 1.7nM 이하 또는 1.5nM 이하의 해리 상수(KD) 값을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1.4nM 이하, 1.3nM 이하, 1.2nM 이하, 1.1nM 이하, 1.0nM 이하, 0.97nM 이하, 0.95nM 이하, 0.93nM 이하, 0.90nM 이하, 0.87nM 이하, 0.85nM 이하, 0.83nM 이하, 0.80nM 이하, 0.77nM 이하, 0.75nM 이하, 0.73nM 이하, 0.70nM 이하, 0.67nM 이하, 0.65nM 이하, 0.63nM 이하, 0.60nM 이하, 0.57nM 이하, 0.55nM 이하, 0.53nM 이하, 0.50nM 이하, 0.47nM 이하, 0.45nM 이하, 0.43nM 이하, 0.40nM 이하, 0.37nM 이하, 0.35nM 이하, 0.33nM 이하, 0.30nM 이하, 0.27nM 이하, 0.25nM 이하, 0.23nM 이하, 0.20nM 이하, 0.17nM 이하, 0.15nM 이하, 0.13nM 이하, 0.10nM 이하, 0.07nM 이하, 0.05nM 이하, 0.03nM 이하, 0.02nM 이하 또는 0.01nM 이하의 해리 상수(KD)로 상기 서열번호 3의 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1×104M-1s-1 이상, 2×104M-1s-1 이상, 3×104M-1s-1 이상, 4×104M-1s-1 이상, 5×104M-1s-1 이상, 6×104M-1s-1 이상 또는 7×104M-1s-1 이상의 결합 속도 상수(Kon) 값을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 7.3×104M-1s-1 이상, 7.5×104M-1s-1 이상, 7.7×104M-1s-1 이상, 8.0×104M-1s-1 이상, 8.3×104M-1s-1 이상, 8.5×104M-1s-1 이상, 8.7×104M-1s-1 이상, 8.8×104M-1s-1 이상, 8.9×104M-1s-1 이상, 9.0×104M-1s-1 이상, 9.1×104M-1s-1 이상, 9.2×104M-1s-1 이상, 9.3×104M-1s-1 이상, 9.4×104M-1s-1 이상, 9.5×104M-1s-1 이상, 9.6×104M-1s-1 이상, 9.7×104M-1s-1 이상, 9.8×104M-1s-1 이상, 9.9×104M-1s-1 이상, 1.0×105M-1s-1 이상, 1.05×105M-1s-1 이상, 1.1×105M-1s-1 이상, 1.15×105M-1s-1 이상, 1.2×105M-1s-1 이상, 1.25×105M-1s-1 이상, 1.3×105M-1s-1 이상, 1.35×105M-1s-1 이상, 1.4×105M-1s-1 이상, 1.45×105M-1s-1 이상 또는 1.5×105M-1s-1 이상의 결합 속도 상수(Kon) 값으로 상기 서열번호 3의 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1×10-3s-1 이하, 7×10-4s-1 이하, 5×10-4s-1 이하, 3×10-4s-1 이하 또는 2×10-4s-1 이하의 해리 속도 상수(Koff) 값을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1.7×10-4s-1 이하, 1.5×10-4s-1 이하, 1.0×10-4s-1 이하, 9.7×10-5s-1 이하, 9.5×10-5s-1 이하, 9.3×10-5s-1 이하, 9.0×10-5s-1 이하, 8.7×10-5s-1 이하, 8.5×10-5s-1 이하, 8.3×10-5s-1 이하, 8.0×10-5s-1 이하, 7.7×10-5s-1 이하, 7.5×10-5s-1 이하, 7.3×10-5s-1 이하, 7.0×10-5s-1 이하, 6.7×10-5s-1 이하, 6.5×10-5s-1 이하, 6.3×10-5s-1 이하, 6.0×10-5s-1 이하, 5.7×10-5s-1 이하, 5.5×10-5s-1 이하, 5.3×10-5s-1 이하, 5.0×10-5s-1 이하, 4.7×10-5s-1 이하, 4.5×10-5s-1 이하, 4.3×10-5s-1 이하, 4.0×10-5s-1 이하, 3.7×10-5s-1 이하, 3.5×10-5s-1 이하, 3.3×10-5s-1 이하, 3.0×10-5s-1 이하, 2.7×10-5s-1 이하, 2.5×10-5s-1 이하, 2.3×10-5s-1 이하, 2.0×10-5s-1 이하, 1.7×10-5s-1 이하, 1.5×10-5s-1 이하, 1.3×10-5s-1 이하 또는 1.0×10-5s-1 이하의 해리 속도 상수(Koff) 값으로 상기 서열번호 3의 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 70℃ 이상, 73℃ 이상, 75℃ 이상, 77℃ 이상 또는 80℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 81℃ 이상, 82℃ 이상, 83℃ 이상, 84℃ 이상, 85℃ 이상, 86℃ 이상, 87℃ 이상, 88℃ 이상, 89℃ 이상, 90℃ 이상, 91℃ 이상, 92℃ 이상, 93℃ 이상, 94℃ 이상 또는 95℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 것일 수 있다.
한편, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 Tie2 단백질에 결합하는 경우, 상기 Tie2 단백질은 그의 리간드인 Ang1, Ang2 등과의 결합 여부에 상관없이 자기-인산화될 수 있고, 그로 인해 세포 내에서의 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편은 Tie2 단백질의 리간드를 대체하여, 상기 Tie2 단백질을 활성화시키는 역할을 할 수 있다.
2. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 관련 유전자, 및 이를 포함하는 벡터 및 형질전환체
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 유전자와 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 유전자를 각각 제공할 수 있다. 상기 중쇄 가변 영역을 암호화하는 유전자는 예컨대 서열번호 43의 아미노산 서열 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역을 암호화하는 유전자는 예컨대 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 가변 영역들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 가변 영역들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자를 제공한다. 구체적으로, CDR1-H를 암호화하는 유전자, CDR2-H를 암호화하는 유전자 및 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다. 특히, 상기 CDR1-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 예컨대 상기 CDR1-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열, 서열번호 21의 아미노산 서열, 서열번호 22의 아미노산 서열, 서열번호 23의 아미노산 서열, 서열번호 24 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CDR2-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 예컨대 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CDR3-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열, 특히 서열번호 12의 아미노산 서열을 암호화하는 것이거나, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자를 제공한다. 구체적으로, CDR1-L를 암호화하는 유전자, CDR2-L를 암호화하는 유전자 및 CDR3-L를 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다. 특히, 상기 CDR1-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 예컨대 상기 CDR1-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 13의 아미노산 서열, 서열번호 25의 아미노산 서열, 서열번호 26의 아미노산 서열, 서열번호 27의 아미노산 서열, 서열번호 28의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CDR2-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열, 특히 서열번호 14의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 CDR3-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열, 특히 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다.
상기 CDR들을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 CDR들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 CDR들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다. 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.
3. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도
본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 혈관신생 관련 질환은 기존에 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되거나 성장하는 것을 의미하고, 상기 혈관신생 관련 질환은 혈관신생의 발생이나 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 본 발명의 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 예방 또는 치료될 수 있다면, 그 질환은 제한없이 상기 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 Tie2 단백질에 결합하여 상기 Tie2 단백질을 자기-인산화시킬 수 있고, 그로 인해 세포 내에서의 혈관신생에 관여하는 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 상기와 같이 Tie2 단백질의 인산화로 인해 혈관신생 관련 신호 전달 경로가 활성화되면, 필요한 혈관신생이 촉진되는 한편(Fukuhara et al., Histol. Histopathol., 25, 387-396 (2010)), 비정상적적으로 생성되었던 혈관은 성숙 및 안정화된다(Koh, Trends Mol. Med., 19(1), 31-39 (2013); Anisimov et al., Circulation, 127, 424-434 (2013); Park et al., Cancer Cell, 30, 953-967 (2016)., Lee et al., Science Translational Medicine, 5(203), 203ra127 (2013); Cahoon et al., Diabetes, 64(12), 4247-4259 (2015); Han et al., Science Translational Medicine, 8(335), 335ra55 (2016)). 따라서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈관신생이 부족하여 발생하는 질환의 예방 또는 치료나, 혈관의 비정상화에 의해 발생하는 질환의 예방 또는 치료에 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 혈관신생 관련 질환은 혈관신생이 부족하여 발생하는 질환일 수 있다. 상기와 같이 혈관신생이 부족하여 발생하는 질환은 예컨대 뇌, 심장, 말초조직 등에 발생하는 허혈을 비롯하여, 이로부터 유발되는 뇌경색, 심근경색, 하지허혈, 상처지연, 족부궤양, 미숙아망막병증, 발기부전, 장기 이식 등일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 혈관신생 관련 질환은 혈관이 비정상화되어 발생되거나, 비정상적인 혈관신생이 과도하여 발생하는 질환일 수 있다. 상기와 같이 혈관이 비정상화되거나 비정상적인 혈관신생이 과도하여 발생하는 질환은 혈관의 누수, 염증, 국소적 허혈에 의해 유발되는 것일 수 있고, 예컨대 암, 전이암, 당뇨망막병증, 황반변성, 패혈증, 혈관신생성녹내장, 건선(psoriasis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 당뇨병성 족부궤양(diabetic Foot Ulcers), 혈관 유착(vascular adhesion), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 동맥경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 급성 간장애, 급성 신장장애, 급성 폐장애, 전신성 염증반응 증후군 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 예방은 질환의 시작을 억제 또는 지연되도록 하는 모든 조치를 의미한다. 또한, 상기 치료는 발현된 질환의 증상이 개선되거나 호전되도록 하는 모든 조치를 의미하며, 상기 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후 등을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 외에, 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 담체는 세포 또는 조직 내로의 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하고, 상기 첨가제는 약학적 조성물을 필요한 제형으로 제조하기 위해 필요한 임의의 성분들, 예컨대 부형제, 붕해제, 결합제, 착향제, 방부제, 활택제, 안정화제, 점성화제 등을 의미한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 해당 질환별 치료제들과 병용 투여되는 것일 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 더하여, 적어도 하나의 해당 질환별 치료제를 더 포함할 수 있다. 상기 다른 해당 질환별 치료제는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유 동물일 수 있고, 예컨대 인간일 수 있으며, 특히 환자일 수 있다. 또한, 상기 '필요한 개체'는 혈관신생 관련 질환을 앓고 있거나, 앓을 가능성이 있는 개체를 의미한다.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 '약학적으로 유효한 양'은 모든 의학적 치료에 적용 가능한 합당한 이익/위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분히 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 양을 의미한다. 또한, 상기 '약학적으로 유효한 양'은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 상기 약학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여 시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 특히, 상기 약학적 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 인간을 포함하는 포유 동물 내로 전형적으로 허용된 경로, 예컨대, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물은, 다른 혈관신생 관련 질환 치료제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 이때, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물은 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물 등과 같은 다른 치료제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물 등과 같은 다른 치료제를 개체에 먼저 투여한 후, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 상기 개체에 추가로 투여하거나, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 먼저 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물 등과 같은 다른 치료제를 개체에 추가로 투여할 수 있다. 또한, 경우에 따라서, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물과 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물 등과 같은 다른 치료제를 동시에 개체에 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
인간 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 설계
[1-1] 항체의 설계 및 제작
[1-1-1] 제1 기본 항체의 설계
CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H의 아미노산 서열을 하기 표 1과 같이 설계하고, 이들 각각을 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 FR1-H, 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 FR2-H, 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 FR3-H 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 FR4-H의 사이에 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 개재하여 제1 기본 항체인 Ang1mab1 및 Ang1mab4의 중쇄 가변 영역을 설계하였다.
CDR1-H CDR2-H CDR3-H
GLTFSNYAMHWV ISYDGENK ATPKGGALEI
서열번호 10 서열번호 11 서열번호 12
마찬가지로, CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L의 아미노산 서열을 하기 표 2와 같이 설계하고, 이들 각각을 서열번호 33의 아미노산서열을 갖는 FR1-L, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 FR2-L, 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 FR3-L 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 FR4-L의 사이에 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 개재하여 제1 기본 항체인 Ang1mab1 및 Ang1mab4의 경쇄 가변 영역을 설계하였다.
CDR1-L CDR2-L CDR3-L
QSVLYSSNNKNY WAS QQYYSAPIT
서열번호 13 서열번호 14 서열번호 15
상기와 같이 설계된 중쇄 가변 영역을, 세 개의 불변 영역이 CH1-힌지(hinge)-CH2-CH3의 순서로 배열된 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역의 N-말단에 배치하여 기본 항체 Ang1mab1의 중쇄를, 그리고 상기와 같이 설계된 중쇄 가변 영역을, IgG 이소타입의 하위분류인 IgG4 중쇄 불변 영역인 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역의 N-말단에 배치하여 기본 항체 Ang1mab4의 중쇄를 각각 설계하였다. 그리고, 상기와 같이 설계된 경쇄 가변 영역을, 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL)의 N-말단에 배치하여 제1 기본 항체 Ang1mab1와 Ang1mab4의 경쇄를 설계하였다.
[1-1-2] 제2 기본 항체 Ang1mab2-1의 설계
CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H의 아미노산 서열을 하기 표 3과 같이 설계하고, 이들 각각을 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 FR1-H, 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 FR2-H, 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 FR3-H 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 FR4-H의 사이에 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 개재하여 Ang1mab2-1 항체의 중쇄 가변 영역을 제작하였다.
CDR1-H CDR2-H CDR3-H
GFTFSSYAMHWV ISYDGSNK ARQYSGVFEY
서열번호 16 서열번호 17 서열번호 18
마찬가지로, CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L의 아미노산 서열을 하기 표 4와 같이 설계하고, 이들 각각을 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 FR1-L, 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 FR2-L, 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 FR3-L 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 FR4-L의 사이에 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 개재하여 제2 기본 항체인 Ang1mab2-1의 경쇄 가변 영역을 제작하였다.
CDR1-L CDR2-L CDR3-L
QSVLYRSNNRNY WAS QQYFSIPYT
서열번호 19 서열번호 14 서열번호 20
상기와 같이 설계된 중쇄 가변 영역을, 세 개의 불변 영역이 CH1-힌지(hinge)-CH2-CH3의 순서로 배열된 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역의 N-말단에 배치하여 제2 기본 항체 Ang1mab2-1의 중쇄를 설계하였다. 그리고, 상기와 같이 설계된 경쇄 가변 영역을, 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL)의 N-말단에 배치하여 제2 기본 항체 Ang1mab2-1의 경쇄를 설계하였다.
[1-1-3] 항체의 생산
상기 실시예 [1-1-1] 및 [1-1-2]에서 설계된 3종의 항체(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)의 중쇄와 경쇄를 각각 암호화하는 염기 서열을 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 5종의 발현 벡터를 제작하였다.
그리고 중쇄와 경쇄의 발현 벡터 각 50ug씩 총 100ug을 Opti-MEM 배지 6ml에 희석하고, ExpiFectamineTM 293 Transfection Kit의 시약(ExpiFectamineTM 293 Reagent) 320ul를 Opti-MEM 배지 6ml에 희석하여 각각 5분간 정치하였다. 상기 벡터를 첨가한 배지와 상기 시약을 첨가한 배지를 섞어 10분 간 더 정치한 후, Expi293FTM 세포 100ml(2.0x106cells/ml)에 첨가하여 24시간 동안 부유 배양하였다. 상기와 같이 배양된 세포에 ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer를 첨가하여 4일 동안 추가 배양한 다음, 10,000xg로 30분 동안 원심분리하고 0.2um 필터로 여과하여 상층액을 회수하였다. 그리고 상층액 내로 발현된 단백질을 AKTA purifier100 기기를 이용하여 친화성 컬럼(MabSelect prismA)에 결합시킨 후 산성 용출액(50mM의 아세트산 완충용액, pH 4.0)으로 용출시켰다. 상기와 같이 용출시킨 단백질을 제염 컬럼(desalting column, Hiprep 26/10)을 사용하여 PBS 완충용액으로 최종 정제하였다. 상기와 같이 정제된 단백질은 비환원(non-reducing) 및 환원(reducing) 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석을 통해, 중쇄(약 50 kDa) 및 경쇄(약 25 kDa)를 갖는 총 분자량 약 150 kDa의 항체임을 확인하였다.
[1-2] CDR들의 주요 잔기 확인
단백질의 안정성 및 기능에 대한 특정 잔기의 기여도를 확인하는 대표적인 기법으로 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 기법이 있다. 알라닌은 크기가 크지 않고 화학적으로 불활성이며 다른 아미노산들이 가지고 있는 이차 구조 선호도를 모방하는 메틸 작용기를 가지고 있는데, 알라닌 스캐닝 기법은 이러한 알라닌의 특성에 기초하여 단백질의 특정 아미노산을 알라닌으로 치환하여 단백질의 안정성이나 기능이 어떻게 변하는지 확인함으로써 해당 특정 아미노산의 기여도를 확인하는 기법이다. 예컨대, 특정 아미노산이 알라닌으로 치환되었음에도 불구하고 단백질의 안정성이나 기능에 유의미한 변화가 없다면 그 특정 아미노산은 단백질의 안정성이나 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산일 가능성이 높고, 반대로 특정 아미노산이 알라닌으로 치환된 경우에 단백질의 안정성이나 기능에 유의미한 변화가 있다면 그 특정 아미노산은 단백질의 안정성이나 기능에 영향을 미치는 아미노산일 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다(Morrison et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 5(3):302-307 (2001)). 본 발명에서는 위와 같은 알라닌 스캐닝 기법에 따라, 상기 실시예 [1-1]에서 설계한 CDR들에서 주요 아미노산이 무엇인지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [1-1-3]에서 실계한 제1 기본 항체 중 하나인 Ang1mab1의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 구성하는 상기 표 1 및 표 2의 CDR들에서 각각의 아미노산을 하기 표 5와 같이 알라닌으로 치환한 예비 변이 항체들을 설계하였다. 그리고 점 돌연변이법(point mutagenesis)으로, 각 위치의 아미노산을 암호화하는 DNA 코돈을 알라닌을 코딩하는 DNA 코돈으로 변환하여, 상기 예비 변이 항체들의 중쇄와 경쇄의 발현 벡터들을 제작하였다. 상기와 같이 제작된 예비 변이 항체들을 상기 실시예 [1-1-3]에서와 동일한 방법으로 발현 및 분리/정제하였다.
중쇄 가변 영역의 CDR 경쇄 가변 영역의 CDR
1 CDR1-H HC1-G01A 1 CDR1-L LC1-Q01A
2 CDR1-H HC1-L02A 2 CDR1-L LC1-S02A
3 CDR1-H HC1-T03A 3 CDR1-L LC1-V03A
4 CDR1-H HC1-F04A 4 CDR1-L LC1-L04A
5 CDR1-H HC1-S05A 5 CDR1-L LC1-Y05A
6 CDR1-H HC1-N06A 6 CDR1-L LC1-S06A
7 CDR1-H HC1-Y07A 7 CDR1-L LC1-S07A
8 CDR1-H HC1-M09A 8 CDR1-L LC1-N08A
9 CDR1-H HC1-H10A 9 CDR1-L LC1-N09A
10 CDR1-H HC1-W11A 10 CDR1-L LC1-K10A
11 CDR1-H HC1-V12A 11 CDR1-L LC1-N11A
12 CDR2-H HC2-I01A 12 CDR1-L LC1-Y12A
13 CDR2-H HC2-S02A 13 CDR2-L LC2-W01A
14 CDR2-H HC2-Y03A 14 CDR2-L LC2-S03A
15 CDR2-H HC2-D04A 15 CDR3-L LC3-Q01A
16 CDR2-H HC2-G05A 16 CDR3-L LC3-Q02A
17 CDR2-H HC2-E06A 17 CDR3-L LC3-Y03A
18 CDR2-H HC2-N07A 18 CDR3-L LC3-Y04A
19 CDR2-H HC2-K08A 19 CDR3-L LC3-S05A
20 CDR3-H HC3-T02A 20 CDR3-L LC3-P07A
21 CDR3-H HC3-P03A 21 CDR3-L LC3-I08A
22 CDR3-H HC3-K04A 22 CDR3-L LC3-T09A
23 CDR3-H HC3-G05A
24 CDR3-H HC3-G06A
25 CDR3-H HC3-L08A
26 CDR3-H HC3-E09A
27 CDR3-H HC3-I10A
상기와 같이 얻어진 49개의 예비 변이 항체들에 대하여, ELISA 분석법을 통해 인간 Tie2 단백질에 대한 결합력을 확인하였다.
구체적으로, 1ug/ml 농도의 인간 Tie2-Fc 재조합 단백질(항원)을 96 웰 ELISA 플레이트(Maxisorp)에 100ul씩 분주하고 4℃에서 16시간 정치하여 상기 항원을 각 웰의 표면에 고정하였다. 그리고, 3% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 차단 완충용액(blocking buffer)을 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 상기와 같이 얻어진 49개의 예비 변이 항체들을 각의 웰에 0.5ug/ml의 농도로 100ul씩 처리하여 1시간 동안 더 반응시켰다. 각각의 웰을 0.1% TBS-Tween20(TBST)을 이용하여 2회 세척한 다음, 염소 항-인간 IgG-HRP(HRP-conjugated goat anti-human IgG)를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 다시 각각의 웰을 TBST로 3회 세척한 다음, 기질인 o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)을 50ul씩 처리하여 5분 동안 반응시켰다. 그리고 각 웰에 반응 정지 용액(2.5M H2SO4)을 50ul씩 처리하여 반응을 종료시킨 후 ELISA 리더기(ELISA reader)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 상기 예비 변이 항체들의 항원 결합력을 비교하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, CDR1-H의 1 번째 내지 6 번째 및 12 번째 아미노산의 경우, CDR2-H의 2 번째 및 4 번째 내지 6 번째 아미노산의 경우, 그리고 CDR3-H의 6 번째 및 10 번째 아미노산의 경우에 알라닌으로의 치환에도 불구하고 인간 Tie2 단백질에 대한 결합력이 저하되지 않았고, CDR1-L의 1 번째 내지 4 번째, 6 번째, 7 번째 및 9 번째 내지 11 번째 아미노산의 경우, CDR2-L의 3 번째 아미노산의 경우, 그리고 CDR3-L의 9 번째 아미노산의 경우에 알라닌으로의 치환에도 불구하고 인간 Tie2 단백질에 대한 결합력이 기본 항체에 대비 75% 미만으로 저하되지 않은 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 중쇄 가변 영역의 CDR1-H를 구성하는 12개의 아미노산들 중 상기에서 확인된 7개의 아미노산(1 번째 내지 6 번째 및 12 번째 아미노산)과 원래 알라닌인 8 번째 아미노산을 제외한 총 4개의 아미노산이, 중쇄 가변 영역의 CDR2-H를 구성하는 8개의 아미노산들 중 상기 확인된 4개의 아미노산(2 번째 및 4 번째 내지 6 번째 아미노산)을 제외한 총 4개의 아미노산이, 그리고 중쇄 가변 영역의 CDR3-H를 구성하는 10개의 아미노산 중 상기에서 확인된 2개의 아미노산(6 번째 및 10 번째 아미노산)과 원래 알라닌인 1 번째 및 7 번째 아미노산을 제외한 총 6개의 아미노산이, 상기 기본 항체 Ang1mab1이 인간 Tie2 단백질에 결합하는데 관여하는 필수 아미노산임을 알 수 있었다. 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR1-L을 구성하는 12개의 아미노산들 중 상기에서 확인된 9개의 아미노산(1 번째 내지 4 번째, 6 번째, 7 번째 및 9 번째 내지 11 번째 아미노산)을 제외한 총 3개의 아미노산이, 경쇄 가변 영역의 CDR2-L을 구성하는 3개의 아미노산들 중 상기에서 확인된 1개의 아미노산(3 번째 아미노산)과 원래 알라닌인 2번째 아미노산을 제외한 총 1개의 아미노산이, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR3-L을 구성하는 9개의 아미노산 중 상기에서 확인된 1개의 아미노산(9 번째 아미노산)과 원래 알라인인 6 번째 아미노산을 제외한 총 7개의 아미노산이, 상기 기본 항체 Ang1mab1이 인간 Tie2 단백질에 대한 결합력을 유지하는데 관여하는 필수 아미노산임을 알 수 있었다.
[1-3] 변이 항체의 설계 및 제작
상기 실시예 [1-2]의 결과를 바탕으로, 기본 항체 Ang1mab4의 중쇄 가변 영역의 CDR1의 1 번째, 2 번째, 5 번째 및 12 번째 아미노산을 알라닌으로 치환한 변이 항체와, 경쇄 가변 영역의 CDR1의 1 번째, 3 번째 및 7 번째 아미노산을 알라닌으로 치환한 변이 항체를 상기 실시예 [1-1-3]에서와 동일한 방법으로 생산 및 분리/정제하였고, 추가적으로 기본 항체 Ang1mab4의 경쇄 가변 영역의 CDR1의 5 번째 아미노산을 페닐알라닌으로 치환한 변이 항체를 추가적으로 설계하고 상기 실시예 [1-1-3]에서와 동일한 방법으로 생산 및 분리/정제하여, 하기 표 6과 같은 CDR들을 갖는 총 8개의 변이 항체를 준비하였다.
변이항체 CDR1-H CDR2-H CDR3-H CDR1-L CDR2-L CDR3-L
H1
G01A 		A LTFSNYAMHWV
(서열번호 21)		 ISYDGENK
(서열번호 11)		 ATPKGGALEI
(서열번호 12)		 QSVLYSSNNKNY
(서열번호 13)		 WAS
(서열번호 14)		 QQYYSAPIT
(서열번호 15)
H1
L02A 		G A TFSNYAMHWV
(서열번호 22)		 상동 상동 상동 상동 상동
H1
S05A 		GLTF A NYAMHWV
(서열번호 23)		 상동 상동 상동 상동 상동
H1
V12A 		GLTFSNYAMHW A
(서열번호 24)		 상동 상동 상동 상동 상동
L1
Q01A 		GLTFSNYAMHWV
(서열번호 10)		 상동 상동 A SVLYSSNNKNY
(서열번호 25)		 상동 상동
L1
V03A 		상동 상동 상동 QS A LYSSNNKNY
(서열번호 26)		 상동 상동
L1
S07A 		상동 상동 상동 QSVLYS A NNKNY
(서열번호 27)		 상동 상동
L1
Y05F 		상동 상동 상동 QSVL F SSNNKNY
(서열번호 28)		 상동 상동
[1-4] 대조군 항체의 설계 및 제작
상기 제1 기본 항체들인 Ang1mab1 및 Ang1mab4에서, 중쇄 가변 영역의 CDR3-H를 서열번호 53의 아미노산 서열로 변경하여 설계하고, 상기 실시예 [1-1-3]에서와 동일한 방법으로 생산 및 분리/정제하여, 인간 Tie2 단백질에 결합하지 않는 두 대조군 항체(IgG1 control 및 IgG4 control)를 각각 준비하였다.
기본 및 변이 항체들의 항원에 대한 친화도 확인
상기 실시예 [1-1]에서 준비한 3개의 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 상기 실시예 [1-3]에서 준비한 8개의 변이 항체들에 대하여, 항원인 인간 Tie2 단백질에 대한 결합력을 확인하였다.
BLI(Biolayer Interferometry) 기법에 기반하여 Octet K2(ForteBio) 기기로 항체들의 친화도를 측정하였는데, 구체적으로 AR2G 바이오센서 팁을 3차 증류수로 10분간 수화(hydration)시킨 후 20mM EDC, 10mM Sulfo-NHS을 포함하는 버퍼를 이용하여 활성화시켰다. 그런 다음, 45nM의 인간 Tie2-Fc 단백질(항원)을 고정화 버퍼(10mM sodium acetate; pH 6.0)에 희석하여, 상기 활성화된 AR2G 팁과 10분 동안 반응시켜 항원을 상기 AR2G 팁에 고정화(immobilization)시켰다. 이후 1M의 에탄올아민(ethanolamine, pH 8.5) 용액을 처리하여 항원 고정화 반응을 종료시키고, 항원-항체 결합의 기준선(baseline)을 잡기 위해 상기 AR2G 팁을 PBS 완충용액에서 60초 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 제1 및 제2 기본 항체들 또는 상기 8종의 변이 항체를 30, 15, 7.5, 3.75 및 1.63nM의 농도로 PBS 내에 희석하고, 상기 항원이 고정된 AR2G 팁과 1,000초 동안 결합(association)시킨 후 1,800초 동안 해리(dissociation)시켰다. 결합 및 해리 반응 분석을 통해 확인된 반응곡선을 기반으로, Data Analysis HT 12.0 프로그램의 global fitting 분석을 통해 Kon, Koff, 및 KD 값을 산출하여 각 항체들의 친화도를 측정하였다.
항체 K on (1/Ms) K off (1/s) K D (M)
Ang1mab1 9.70×104 4.62×10-5 4.76×10-10
Ang1mab4 8.70×104 4.60×10-5 5.29×10-10
Ang1mab4(H1G01A) 9.38×104 7.12×10-5 7.61×10-10
Ang1mab4(H1L02A) 9.71×104 4.56×10-5 4.71×10-10
Ang1mab4(H1S05A) 8.89×104 8.31×10-5 9.34×10-10
Ang1mab4(H1V12A) 7.67×104 7.62×10-5 9.97×10-10
Ang1mab4(L1Q01A) 1.09×105 1.48×10-4 1.36×10-9
Ang1mab4(L1V03A) 8.77×104 4.72×10-5 5.38×10-10
Ang1mab4(L1S07A) 1.11×105 7.54×10-5 6.82×10-10
Ang1mab4(L1Y05F) 1.01×105 4.80×10-5 4.74×10-10
Ang1mab2-1 8.42×105 1.14×10-5 1.35×10-10
그 결과, 상기 표 7과 같이, 상기 제1 및 제2 기본 항체와 변이 항체들 모두 KD 값이 1.4 nM 이하, 대부분 수백 pM 수준으로, 항원인 인간 Tie2 단백질에 대하여 우수한 친화력을 나타내는 것으로 확인되었다.
기본 및 변이 항체들에 의한 항원의 활성화 여부 확인
상기 실시예 [1-1]에서 준비한 3개의 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 상기 실시예 [1-3]에서 준비한 8개의 변이 항체들에 대하여, 이들 항체가 인간 Tie2 단백질 및 상기 Tie2 단백질이 관여하는 신호 전달 경로 상의 하부 신호 전달 인자들(AKT, ERK)의 인산화(P-Tie2, P-AKT, P-ERK)를 유도하는 여부를 확인하였다.
구체적으로, 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포(1x106 cells)를 60 mm 배양 접시 내에서 DMEM 배지를 이용하여 37℃의 온도로 배양하였다. 상기와 같이 배양된 세포를 무혈청 DMEM 배지에서 6시간 동안 유지하여 혈청 기아 상태로 만든 다음, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1) 및 변이 항체들(10ug/ml)과 양성 대조군인 Ang1(300ng/ml)을 시간별로 또는 30분 동안 처리한 후, 용해 버퍼로 세포를 용해하여 세포 용해물을 획득하였다. 상기와 같이 얻어진 세포 용해물을 대상으로 SDS-PAGE를 수행한 다음, 이를 PVDF 멤브레인에 옮겨 3% BSA가 희석된 0.1% Tween20 TBST 완충용액으로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 1:1000으로 희석된 1차 항체(P-Tie2, Tie2, P-AKT, AKT, P-ERK 또는 ERK)들을 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고, 1:5000으로 희석된 과산화효소-결합(peroxidase-conjugated) 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, ECL 용액을 처리하여 인간 Tie2 단백질 및 상기 Tie2 단백질이 관여하는 신호 전달 경로 상의 하부 신호 전달 인자들(AKT, ERK)의 인산화 유도 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1) 및 변이 항체들이 Tie2, AKT, ERK 단백질의 인산화를 유도하는 것으로 확인되었고, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1) 모두 양성 대조군인 Ang1에 비해 동등 이상의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 2). 또한, 상기 변이 항체들 역시, 제1 기본 항체들(Ang1mab1 및 Ang1mab4)과 유사하게 인간 Tie2 단백질의 인산화를 유도하는 것으로 확인되었다(도 3).
나아가, HEK293 세포 대신 인간 탯줄 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 및 배지로 M199를 이용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들이 실제로 인간 Tie2가 발현되는 HUVEC에서 인간 Tie2 단백질과 상기 Tie2 단백질이 관여하는 신호 전달 경로 상의 하부 신호 전달 인자들(AKT, ERK)의 인산화(P-Tie2, P-AKT, P-ERK)를 유도하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, HEK293 세포에서와 동일하게, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들이 HUVEC에서도 Tie2, AKT, ERK 단백질의 인산화를 유도하는 것으로 확인되었다(도 4).
기본 항체의 항원 수용체에 대한 특이성 확인
상기 실시예 [1-1]에서 수득한 제1 기본 항체 중 하나인 Ang1mab4가 HUVEC 및 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포에서 Tie2 단백질 수용체만을 특이적으로 인산화시키는지, 아니면 상기 Tie2 단백질 이외에 다른 단백질 수용체도 인산화시키는지 확인하였다.
구체적으로, HUVEC(3x106 cells) 및 HEK293 세포(1x107 cells)를 100mm 배양 접시에서 각각 M199 및 DMEM 배지를 이용하여 37℃의 온도로 배양하였다. 상기와 같이 배양된 HUVEC 및 HEK293 세포를 각각 1%의 혈청이 포함된 M199 및 DMEM 배지에서 6시간 동안 유지하여 혈청 기아 상태로 만들고, Ang1mab4을 시간별(10분 혹은 30분)로 처리한 후, 용해 완충용액으로 세포를 용해하여 세포 용해물을 수득하였다. 상기와 같이 얻어진 세포 용해물을 BCA 단백질 정량법으로 정량한 후, 49개의 인간 단백질 수용체들에 대한 특이적 인산화 항체들이 포함되어 있는 멤브레인에 반응시켰다. 그런 다음, 웨스턴 블롯팅을 통해 Ang1mab4에 의해 인산화가 유도되는 단백질 수용체를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 상기 기본 항체 Ang1mab4는 HUVEC(A) 및 인간 Tie2 단백질을 발현하는 HEK293 세포(B)에서 Tie2 단백질 수용체만을 선택적으로 인산화시키는 것으로 확인되었다.
기본 항체들 및 변이 항체들의 종간 Tie2 단백질에 대한 교차 결합 확인
인간 Tie2 단백질에 결합하는 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들이 다른 종(species) 유래의 Tie2 단백질에 대해서도 교차결합(cross-species binding)을 할 수 있는지 확인하였다. 이를 위해, 마우스, 랫, 개, 돼지, 원숭이의 Tie2 유전자를 합성하였고, pcDNA3.4 벡터에 클로닝하여 각 종별 Tie2 발현 벡터를 제작하였다. Tie2 발현 벡터 각 10ug 및 Lipofectamine 2000 (invitrogen) 20ul를 Opti-MEM 배지 1ml에 희석하여 HEK293T 세포(2.0x106 cells)에 처리하고, 2일간 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 원심분리(300xg, 5분)하여 상층액을 분리하여 제거하고, 세포를 FACS 완충용액으로 세척하였다. 상기와 같이 얻어진 종별 Tie2 발현 세포에 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들을 5ug/ml의 농도로 처리하고 실온에서 1시간 반응 후 FACS 완충용액으로 2회 세척하였다. 그리고 1:200으로 희석된 염소 항-인간 IgG-FITC(FITC-conjugated goat anti-human IgG; invitrogen)를 100ul 씩 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, FACS 완충용액으로 다시 2회 세척한 후 FACS calibur 기기(BD Bioscience)를 이용하여 항체 결합 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6 내지 도 8에 도시된 바와 같이, 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들은 인간(도 6) 및 원숭이(도 7) 유래의 Tie2 단백질에는 결합하였지만, 다른 종(도 8) 유래의 Tie2 단백질에는 결합하지 못함을 확인하였다.
기본 항체의 항원 결정기(epitope) 확인
[6-1] 항원 결정기의 도메인 확인
상기 기본 항체가 인간 Tie2 단백질 중 어느 부분에 결합하는지, 다시 말해 상기 항체들의 항원 결정기(epitope)가 어디인지 분석하였다.
이를 위해, 도 9에 도시된 바와 같이 인간 Tie2 단백질의 전장 또는 세포외 도메인(extracellula domain) 일부가 제거된 변이체들(Tie2△Ig1; Tie2△Ig1-2; Tie2△Ig1-2,EGF; Tie2△Ig1-2,EGF,Ig3)에 대해 상기 기본 항체의 결합 여부를 확인하였다. 구체적으로, 인간 Tie2 단백질을 암호화하는 염기 서열에서 재조합-PCR 방법으로 Ig1, Ig2, EGF 또는 IgG3 도메인을 암호화하는 부분을 제거한 다음, 이를 pcDNA3 벡터에 클로닝하였다. 상기 인간 Tie2 단백질의 전장 또는 일부를 암호화하는 염기 서열이 삽입된 벡터 10ug 및 Lipofectamine 2000 (invitrogen) 20ul을 1ml의 Opti-MEM 배지에 희석하고, 이를 HEK293T 세포(2.0x106 cells)에 처리하여 2일간 배양하였다. 상기 배양물을 원심분리(300xg, 5분)하여 상층액을 분리 및 제거하고, 세포를 FACS 완충용액으로 세척하였다. 상기와 같이 얻어진 인간 Tie2 단백질의 전장 또는 일부가 발현되는 세포에, 상기 기본 항체 Ang1mab1를 10ug/ml의 농도로 처리하고 실온에서 1시간동안 반응시킨 후 FACS 완충용액으로 2회 세척하였다. 그리고 1:200으로 희석된 염소 항-인간 IgG-FITC(FITC-conjugated goat anti-human IgG; invitrogen)를 100ul 씩 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, FACS 완충용액으로 다시 2회 세척한 후 Image FACS 기기인 FlowSight(Amnis)를 이용하여 항체 결합 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 10a에 도시된 바와 같이, 상기 Ang1mab1 기본 항체는 Tie2 Full 및 Ig1이 제거된 변이체 Tie2△Ig1에는 결합하였지만, Ig2가 제거된 Tie2 변이체들(Tie2△Ig1-2; Tie2△Ig1-2,EGF; Tie2△Ig1-2,EGF,Ig3)에는 모두 결합하지 않는 것으로 확인되었다(도 10a).
상기와 같은 결과로부터, 상기 기본 및 변이 항체들이 인간 Tie2 단백질의 Ig2 도메인에 결합하는 것이고, 따라서 인간 Tie2 단백질의 Ig2 도메인이 상기 기본 및 변이 항체들의 항원 결정기임을 알 수 있다.
[6-2] 항원 결정기의 구체적인 아미노산 서열 확인
상기 실시예 [6-1]에서 확인된 도메인 중에서 보다 구체적으로 상기 기본 항체의 항원 결정기의 아미노산 서열을 확인하기 위하여, 인간 Tie2 단백질의 세포외 부위 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 어레이를 제작하여 항원 결정기 매핑(epitope mapping) 분석을 실시하였다. 특히, 상기 실시예 [6-1]에서 상기 기본 항체가 인간 Tie2 단백질의 Ig2 도메인에 결합한다는 것을 확인하였기 때문에, 상기 도메인을 포함하여 인간 Tie2 단백질의 아미노산 서열 중 113번째 아미노산부터 342번째 아미노산까지를 지정하였고, JPT Peptide Technologies社에 의뢰하여 상기와 같이 지정된 부위에 대해 15개의 아미노산 길이를 기준으로 12개의 아미노산이 겹쳐지도록 다수의 펩티드들을 합성하였다. 그리고 상기와 같이 합성된 펩티드들을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane) 및 ELISA 플레이트에 고정시켜 항원 결정기 분석에 사용하였다.
먼저, 상기 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이용한 항원 결정기 분석을 위해, 30ug/ml 농도의 기본 항체 Ang1mab1를 상기 니트로셀룰로오스 멤브레인에 16시간 동안 처리하여 결합시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)가 표지된 항-인간 2차 항체를 처리하여 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween)를 이용하여 상기 멤브레인을 10분씩 3회 세척하고, 발색을 위해 AmershamTM ECL(GE Healthcare)을 처리하여 10분 또는 20분 동안 반응시킨 다음, 감광하여 반응 부위를 확인하였다.
그 결과, 도 10b의 (A)에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 20번 펩티드 부위에서 기본 항체 Ang1mab1의 결합이 확인되었다(도 10b의 (A)).
추가적으로, 상기와 같이 합성된 펩티드들이 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 기본 항체 Ang1mab1의 결합 부위를 재검정하였다. 이를 위해, 10ug/ml 농도의 기본 항체 Ang1mab1을 ELISA 플레이트에 1시간 동안 처리한 후, HRP가 표지된 항-인간 2차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST를 이용하여 상기 플레이트를 10분씩 3회씩 세척하고, 효소 반응을 위해 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질(BD Biosciences)을 20분 동안 처리하였다. 그런 다음, 2N 농도의 황산을 처리하여 상기 효소 반응을 종료시키고, OD450에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10b의 (B)에 도시된 바와 같이, 1, 2, 7, 8, 9, 10, 28 번 펩티드 부위에서 기본 항체 Ang1mab1의 결합이 확인되었다(도 10b의 (B)).
상기와 같은 결과들을 종합적으로 고려해 볼 때, 상기 기본 및 변이 항체들이 인간 Tie2 단백질의 Ig2 도메인의 N-말단 부위에 존재하는 서열번호 3의 아미노산 서열, 그 중에도 특히 서열번호 54의 아미노산 서열이나, 또는 서열번호 55의 아미노산 서열에 결합하여 인간 Tie2 단백질의 활성을 촉진함을 알 수 있다.
기본 및 변이 항체들의 인간 Tie2 단백질 활성화에 따른 효과 확인 - 혈관신생 촉진 관련 효과
[7-1] 인 비트로( in vitro ) - 혈관 형성 촉진 효과
상기 기본 및 변이 항체들이 HUVEC의 혈관 형성을 촉진하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 1%의 혈청이 포함된 M199 배지에서 6시간 동안 유지하여 혈청 기아 상태가 된 HUVEC(1x105 cells)을 GFR-Matrigel이 코팅된 24 웰 배양 접시에 분주하고, 상기 HEVEC에 상기 실시예 1에서 준비한 기본 및 변이 항체들(20ug/ml)과 대조군 항체(IgG4 control; 20ug/ml)를 처리하여 18시간 동안 배양하면서 혈관 형성 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 상기 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1, Ang1mab4 및 Ang1mab2-1)과 변이 항체들 모두 대조군 항체와 비교했을 때, 혈관 형성을 증가시키고 장기간 유지시키는 것으로 확인되었다(도 11).
[7-2] 인 비트로( in vitro ) - 혈관세포의 세포사(apoptosis) 억제 효과
상기 기본 항체가 HUVEC의 세포사(apoptosis)를 억제하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, HUVEC(3x106 cells)를 100mm 배양 접시에서 M199 배지를 이용하여 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 다음 날 무혈청 M199 배지에서 HUVEC에 기본 항체 Ang1mab4(20ug/ml)와 양성 대조군인 Ang1(300ng/ml)을 처리하여 36시간 동안 배양하고, 상대적으로 살아남은 세포를 확인한 후, 용해 완충용액으로 세포를 용해하여 세포 용해물을 수득하였다. 상기와 같이 얻어진 세포 용해물을 BCA 단백질 정량법으로 정량한 후 SDS-PAGE를 수행하였고, 이를 PVDF 멤브레인에 옮겨 3% BSA가 희석된 0.1% Tween20 TBST 완충용액으로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 1:1000으로 희석된 1차 항체들(caspase-3, caspase-8 또는 actin)을 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고, 1:5000으로 희석된 과산화효소-결합된(peroxidase-conjugated) 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 ECL 용액을 처리하여 상기 caspase-3, caspase-8 및 actin 단백질의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 상기 기본 항체가 양성 대조군인 Ang1과 유사한 수준으로 기아 상태에서 유발되는 HUVEC의 세포사를 억제하는 것으로 확인되었다(도 12의 (A)). 그리고, 이러한 세포사의 억제 효과는, 세포사를 유도하는 단백질인 cleaved Cas-3 및 Cas-8의 활성이 억제되어 있음을 확인함으로써 검증 할 수 있었다(도 12의 (B)).
[7-3] 인 비보( in vivo ) 효과 확인을 위한 형질전화 마우스의 제작
상기 기본 및 변이 항체가 인간 Tie2 단백질만을 활성화시킴에 따라 달성되는 효과를 인 비보에서 확인하기 위하여, 인간 Tie2 단백질이 마우스 혈관내피세포에 특이적으로 발현되는 형질전환 마우스(EC-hTie2 Tg)를 제작하였다.
구체적으로, 마우스 Tie2 프로모터(promoter) 유전자, 인간 Tie2 유전자, poly A 유전자 및마우스 Tie2 인핸서(enhancer) 유전자 순으로 이루어진 선형의 염기 서열을 제작하였다.
C57BL/6N 암컷쥐에게 임신말 혈청성 성선 자극 호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)와 사람 융모막성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin)을 주입하여 과배란을 유도하였다. 상기와 같이 과배란이 유도된 C57BL/6N 암컷쥐를 C57BL/6N 수컷쥐와 교배시키고, 임신이 확인된 C57BL/6N 암컷쥐로부터 수정란을 확보하였다. 상기와 같이 확보된 수정란 중 남성 전핵(male pronucleus of zygote)에, 마우스 Tie2 프로모터(promoter) 유전자, 인간 Tie2 유전자, poly A 유전자 및 마우스 Tie2 인핸서(enhancer) 유전자 순으로 이루어진 선형의 염기 서열을 제작하여 주입하였다. 상기와 같이 선형의 염기 서열이 주입된 수정란을 다시 ICR 대리모에 이식시킨 후, 유전자형분석(genotyping)을 통해 인간 Tie2 유전자(서열번호 1)를 가지고 있는 마우스를 확보하였다. 이후, 인간 Tie2 단백질이 마우스 혈관에 정상적으로 발현하는지 확인하기 위해서, 상기와 같이 확보된 마우스로부터 뇌 조직를 분리하고, 포르말린(formalin)(Sigma)으로 1일간 고정한 다음, 30%의 수크로오스(sucrose)가 첨가된 PBS를 3일간 처리한 뒤 냉동 블록(frozen block)으로 만들었다. 그리고 상기 냉동 블록을 냉동절단(cryosection)하여 조직 슬라이드를 제작하였고, 혈관 특이적 마커인 CD31의 항체(Millipore, 1:200)와 인간 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 Tie2 항체(Biolegend 1:200)를 이용하여 마우스 뇌 혈관을 면역염색을 하였다. 각각의 항체는 4℃에서 16시간 동안 처리되었고, Cy3 혹은 Alexa Fluor 488 혈관이 붙어있는 2차 항체로 상온에서 2시간 동안 더 처리된 다음, Mounting Medium With DAPI(Vector)를 이용하여 상기 조직 슬라이드를 면역 염색한 후 형광현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 13에 도시된 바와 같이, 인간 Tie2 단백질이 형질전환 마우스(EC-hTie2 Tg)의 혈관에만 특이적으로 발현되고 있음을 확인하였다(도 13).
[7-4] 엑스 비보( ex vivo ) - 혈관 발아(sprouting) 촉진 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체들(Ang1mab1 및 Ang1mab4)이 동맥 조직에서 혈관내피세포의 발아(sprouting)를 유도하는 효능을 나타내는지 여부를 엑스 비보에서 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 마우스로부터 대동맥 혈관을 분리하여 일정한 크기(1 mm)로 절단한 후, 마트리젤이 코팅된 플레이트에 씨딩(seeding)하였다. 그런 다음, 상기 기본 항체들인 Ang1mab1(50μg/ml) 및 Ang1mab4(10, 50μg/ml)와 대조군 항체(IgG4 control; 50μg/ml), 그리고 양성 대조군인 VEGF(100ng/ml) 및 Ang1(200ng/ml)을 각각 2일 간격으로 6일 동안 첨가하면서 배양한 뒤, 동맥 조직으로부터 혈관내피세포가 발아되는 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 상기 두 기본 항체(Ang1mab1, Ang1mab4) 모두 대조군 항체에 비해 동맥혈관내피세포의 발아를 현저하게 증가시키는 것으로 확인되었고, 또한 양성 대조군(VEGF, Ang1)에 비해서도 두드러지게 동맥혈관내피세포의 발아를 증가시키는 것으로 확인되었다(도 14).
[7-5] 인 비보( in vivo ) - 상처 치유 촉진 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체가 혈관신생의 유도를 통해 상처 치유를 얼마나 촉진할 수 있는지를 인 비보에서 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스의 피하를 제모한 뒤 직경 4mm 크기의 원형 상처를 유도하고, 상처 부위에 기본 항체인 Ang1mab4와 대조군 항체(IgG4 control)를 7.5 mg/kg의 투여량으로 2일 간격으로 3회 복강 내 주입한 다음, 6일 동안 상처 치유 정도를 비교 분석하였다.
그 결과, 도 15에 도시된 바와 같이, 기본 항체 Ang1mab4를 처리한 군에서, 대조군 항체를 처리한 군보다 훨씬 빨리 상처가 치유되는 것으로 확인되었다(도 15).
나아가, 상기와 같은 상처 치유 촉진 효능을 다시 한번 검증하기 위하여, 상기 마우스에서 회복 중인 상처 조직을 분리한 후 상기 실시예 [7-3]에서와 동일한 방법으로 조직 슬라이드를 제작하여 면역염색을 하였다. 상기 조직 슬라이드에, 혈관 특이적 마커인 CD31의 항체(Millipore, 1:200)와 혈관의 안정화를 유지하는 혈관주위세포의 마커인 αSMC의 항체(Abcam, 1:100)를 4℃에서 16시간 동안 처리하고, 2차 항체인 Cy3 anti-Hamster(Thermo, 1:500)와 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit(Invitrogen, 1:500)을 상온에서 2시간 동안 처리한 다음, Mounting Medium With DAPI(Vector)를 이용하여 상기 조직 슬라이드를 면역 염색한 후 형광현미경을 통해혈관의 형성과 안정화가 향상되었는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 16에 도시된 바와 같이, 상기 Ang1mab4를 처리한 조직에서 혈관신생이 증가할 뿐만 아니라, 그 혈관이 혈관 주위의 세포들에 의해 잘 둘러싸여 있는 것으로 확인되었다(도 16).
[7-6] 인 비보( in vivo ) - 하지허혈 개선 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체가 혈관신생의 촉진을 통해 하지허혈을 얼마나 개선할 수 있는지를 인 비보에서 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 호흡 마취 시스템을 이용하여 마취시킨 후 마우스 다리를 테이프로 고정시켰다. 제모 크림으로 수술 부위의 털을 제거한 뒤, 알코올 솜으로 소독하고 포셉과 가위를 사용하여 무릎에서 대퇴부 중간 방향으로 1cm 가량 피부를 절개하고 리트랙터로 수술 부위 시야를 확보한 후, 해부현미경 하에서 PBS를 묻힌 얇은 면봉과 미세포셉 및 미세가위로 대퇴부 근육 주위의 피하지방을 제거하였다. 그런 다음, 서혜부 부위의 대퇴동맥과 정맥을 신경으로부터 분리하고 7-0 실크 두 개를 대퇴동맥/정맥 기부 끝 쪽 아래 부위로 통과시켜, 일정 간격을 두고 대퇴부 동맥/정맥을 묶어 폐색시켰다. 그리고 대퇴동맥/정맥의 원위 부위 아래에도 7-0 실크 두 개를 통과시켜 일정 간격을 두고 묶어 폐색시키고, 기부와 원위 부위 각각 두 개의 실 묶음 사이를 미세가위로 자른 후 안쪽 혈관을 잘라낸 후, 리트랙터를 제거하고 5-0 비크릴 봉합사로 봉합하여 온열 매트에서 마우스를 회복시켰다. 하지 내의 동맥과 정맥을 절단하여 혈류의 흐름을 차단함으로써 하지 허혈을 유도한 마우스의 하지 허혈 주변 조직 내로, 기본 항체인 Ang1mab4를 주입하였다. 그러 다음 혈관 형성 및 혈류의 흐름을 비교하기 위하여, 레이저 도플러 이미지 시스템을 이용하여 마우스 하지의 혈류 흐름을 측정하였다. 마우스는 수술 전, 수술 후 1일, 3일 및 7일째에 레이저 도플러 이미지를 측정하였고, 하지 허혈 수술 후 마우스를 7마리씩 두 그룹으로 나누어 하지 허혈 수술 후 1일과 3일에 10mg/kg의 투여량으로 기본 항체인 Ang1mab4와 대조군 항체(IgG4 control)를 각 군의 마우스의 수술 주변 조직에 나누어 주입하였다. 그리고 도플러 이미지를 촬영하여 수술하지 않은 다리와 수술한 다리의 혈류 흐름을 비교하여 하지 허혈 개선 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 도시된 바와 같이, 상기 Ang1mab4를 처리한 군에서, 대조군 항체를 처리한 군보다, 하지 조직 내의 혈관신생이 증가되는 것으로 확인되었을 뿐만 아니라(도 17의 (A)), 혈류의 흐름도 현저히 개선된 것으로 확인되었다(도 17의 (B)).
기본 및 변이 항체들의 인간 Tie2 단백질 활성화에 따른 효과 확인 - 혈관의 비정상화 억제 및 안정화 관련 효과
[8-1] 인 비트로( in vitro ) - 혈관 투과 억제(누수 억제) 효과 확인
상기 기본 항체들이 혈관의 비정상화로 인해 유발되는 혈관 투과성 증가 현상, 이른바 누수 현상을 얼마나 효과적으로 억제할 수 있는지 분석하였다.
구체적으로 12 웰의 트랜스웰 플레이트(Transwell plate)(0.4μm pore)의 상부 챔버(upper chamber)에 HUVEC(1X105 cells)를 씨딩하여 3일 동안 배양한 후 6시간 동안 혈청 기아 상태로 유지하였다. 그런 다음, 혈관 투과성을 인위적으로 증가시키기 위해 음성 대조군, 양성 대조군 및 실험군 모두에 50ng/ml의 VEGF를 처리하는 한편, 양성 대조군에는 100ng/ml의 Ang1을, 그리고 실험군에는 기본 항체인 Ang1mab4를 각각 10, 25, 50μg/ml의 농도로 5시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 형광이 표지된 덱스트란(FITC-Dextran, 70 kDa)을 배양액에 첨가하고 30분 후에 HUVEC 사이로 투과된 덱스트란을 형광분석기(SpectraMAx i3x)로 비교 분석하였다.
그 결과, 도 18의 (A)에 도시된 바와 같이, VEGF만을 단독으로 처리한 음성 대조군의 세포에서는 혈관의 투과성이 증가된 반면, 상기 기본 항체 Ang1mab4를 처리한 실험군의 세포에서는 Ang1을 처리한 양성 대조군의 세포에서와 유사하게 혈관 투과 현상이 완전히 억제된 것으로 확인되었다(도 18의 (A)).
또한 35mm Confocal Dish(SPL)에 HUVEC(1X105 cells)를 씨딩(seeding)하고 2일 동안 배양한 후 6시간 동안 혈청 기아 상태로 유지하였다. 그런 다음, 음성 대조군으로 50ng/ml의 VEGF를 처리하는 한편, 양성 대조군에는 100ng/ml의 Ang1을, 그리고 실험군에는 기본 항체인 Ang1mab4를 25μg/ml의 농도로 5시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 고정하고, 0.2% Triton X-100이 첨가된 PBS를 이용하여 10분 동안 세포막을 투과시킨 뒤, 1% BSA가 첨가된 PBS로 1시간동안 상온에서 차단(blocking)시켰다. VE-cadherin 항체(Santacruz)을 1:50으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 처리한 뒤, 형광이 표지된 2차 항체(Alexa Fluor 488 donkey anti-goat, Invitrogen)를 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고 1:1000으로 희석된 DAPI로 3분간 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
세포면역화학염색 분석을 통해 HUVEC 간의 이음접합부 형성에 관여하는 VE-cadherin의 위치 변화를 확인한 결과, 도 18의 (B)에 도시된 바와 같이, VEGF만을 단독으로 처리한 음성 대조군에서는 세포들간의 세포연접이 현저히 약하게 형성되어 있으나, 상기 기본 항체 Ang1mab4를 처리한 실험군의 세포에서는 Ang1을 처리한 양성 대조군의 세포에서와 동등 이상으로 세포들간의 세포연접이 잘 형성되고, 세포들간의 경계면이 강하게 발달되는 것으로 확인되었다(도 18의 (B)).
[8-2] 인 비보( in vivo ) - 패혈증 개선 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체(Ang1mab4)가 혈관 누수 억제 및 혈관내피보전성(vascular endothelial integrity)을 강화하여 패혈증을 얼마나 억제할 수 있는지를 인 비보에서 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 호흡 마취 시스템을 이용하여 마취시키고, 복부 털을 제거하고 멸균된 알코올 솜으로 닦아 낸 후, 복부 중앙 부분에 1cm 크기로 외피를 절개하였다. 그런 다음, 추가로 내피를 절개하고 마우스의 맹장을 꺼내어 맹장의 75% 위치를 4-0 검정 실크 봉합사로 묶었다. 그리고, 21-게이지 크기의 바늘을 이용하여 상기 검정 실크 봉합사로 묶은 부위 근처 아래 부위에 천공(맹장 앞뒤로 총 2개 천공)을 유발하고, 맹장 안 내용물이 빠져나올 수 있게 눌러 준 후, 맹장을 복강에 넣고 절개 부위를 봉합한 후 온열 매트 위에서 마우스를 회복시킴으로써, 맹장 결찰 및 천자(Cecal Ligation and Puncture, CLP)에 의한 패혈증 모델을 제조하였다, 상기와 같이 CLP 마우스 모델을 제작하고 6시간이 경과한 후에, 10mg/kg의 투여량으로 기본 항체 Ang1mab4와 대조군 항체(IgG4 control)를 마우스 꼬리 정맥으로 주입하여, 7일 동안 마우스의 생존 여부를 추적 조사하였다.
그 결과, 도 19에 도시된 바와 같이, 대조군 항체를 처리한 군에서는 시간이 지남에 따라 사망률이 증가하여 CLP 유발 후 3.5일째(84시간)에 생존율이 0%를 보인 반면, 기본 항체 Ang1mab4를 처리한 군에서는 CLP 유발 후 3.5일째(84시간)까지도 모든 마우스가 생존(100%)하였으며, 7일째까지도 40%의 생존율을 유지하는 것으로 확인되었다(도 19).
[8-3] 인 비보( in vivo ) - 종양 성장 억제 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체가 비정상적인 혈관신생에 의해 유발되는 종양의 성장을 얼마나 효과적으로 억제할 수 있는지를 인 비보에서 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스의 피하에 마우스 교모세포종인 GL261 세포(5x103 cells/μL)를 주입하였다. 종양의 크기 변화는 종양의 장축, 단축을 버어니어켈리퍼스를 이용하여, 종양 주입 후 2일 간격으로 측정하였다. 이렇게 측정된 종양의 크기를 (장축x단축x 단축)/2로 계산하여 크기가 평균 30mm3 정도로 성장했을 때 대조군에는 대조군 항체(IgG1 control; 7.5 mg/kg)을, 그리고 실험군에는 기본 항체인 Ang1mab1(7.5 mg/kg)을 3일 간격으로 5회에 걸쳐 꼬리 정맥에 투여하였다. 종양 주입 23일째 모든 개체들에 대해서 CO2 gas를 이용하여 치사시킨 후 개복하여 장기의 이상 유무를 육안으로 확인하고 종양의 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 20에 도시된 바와 같이, 상기 기본 항체인 Ang1mab1를 처리한 마우스에서 종양의 크기가 대조군(IgG1 control)에 비해 약 50% 이상 억제되는 것으로 확인되었고(도 20의 (A)), 종양의 무게 역시 70% 이상 감소되는 것으로 확인되었다(도 20의 (B)).
나아가, 상기와 같은 종양의 성장억제 효능이 비정상적인 종양혈관의 정상화를 통해 유도되었는지를 확인하기 위하여, 상기 마우스에서 종양 조직을 분리한 후, 상기 실시예 [7-3]에서와 동일한 방법으로 조직 슬라이드를 제작하여 면역염색을 하였다. 상기 종양 조직에서 혈관 특이적 마커인 CD31의 항체(Millipore, 1:200)와 혈관의 안정화를 유지하는 혈관주위세포의 마커인 αSMC의 항체(Abcam, 1:100)를 4℃에서 16시간동안 처리한 뒤, 2차 항체인 Cy3 anti-Hamster(Thermo, 1:500)와 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit(Invitrogen, 1:500)을 상온에서 2시간 동안 처리하고, Mounting Medium With DAPI (Vector)로 상기 조직 슬라이드를 면역염색한 후 형광현미경으로 안정적인 혈관 발달의 향상 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 21에 도시된 바와 같이, 상기 기본 항체 Ang1mab1를 처리한 종양 조직내 혈관들이 혈관주위세포들에 의해 잘 둘러싸여 안정화되어 있는 것을 확인하였다(도 21).
[8-4] 인 비보( in vivo ) - 종양 내 항종양 면역세포 유입 증가 효과
상기 실시예 [8-3]에서 확인된 기본 항체가 비정상적인 종양 혈관의 정상화 및 안정화 유도 효과로 인해, 종양 내 항종양 면역세포들의 유입이 증가되어 종양 성장이 억제되었는지를 확인하였다.
상기 실시예 [8-3] 종양을 적출한 뒤 잘게 절단하여, 콜라게나아제(collagenase)(2μg/mL)가 첨가된 3ml의 RPMI1640 배양액에 넣어 37℃에서 1시간 동안 유지하였다. 그런 다음, 상기 조직을 70μm 셀 스트레이너(cell strainer)에 넣고 잘게 분쇄한 후 3ml의 PBS로 2회 세정하였다. 유세포분석기를 이용한 종양 내 면역세포 유입의 변화 관찰을 위해 조혈세포 계열 마커인 CD45, NK 세포 마커인 NK1.1, T 세포 마커인 CD3, CD4, CD8, 대식세포 마커인 CD11b, F4/80에 대한 항체들을 1μg/ml의 농도로 30분간 염색하고 1x PBS로 2회 세정하였다. 그리고 침윤된 면역세포의 수를 정확히 확인하기 위해 50μl의 CountBright Absolute count beads(Invitrogen)를 첨가하여 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 22에 도시된 바와 같이, NK 세포(도 22의 (A)), CD8, CD4 T 세포(도 22의 (B)), 대식세포(macrophage)(도 22의 (C))들의 종양 내 유입이 증가됨을 확인하였으며, 이를 통해 상기 기본 항체 Ang1mab1가 비정상적인 종양혈관의 정상화 및 안정화를 통해 항종양 면역세포들의 유입을 증가시킴으로써 종양 성장을 억제한다는 것을 확인하였다.
[8-5] 인 비보( in vivo ) - 기본 항체와 다른 항암제와 병행 투여 효과
상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 준비된 기본 항체와 다른 항암제의 하나인 면역관문억제 항체(Anti-PD-1)를 병행 시, 각각을 단독으로 처리했을 때 보다 종양의 성장을 더 효과적으로 억제할 수 있는지를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [7-3]에서 제조된 형질전환 마우스의 피하에 마우스 폐종양세포인 LLC 세포(5x103 cells/μl)를 주입하였다. 종양의 크기 변화는 종양의 장축, 단축을 버어니어켈리퍼스를 이용하여, 종양 주입 후 2일 간격으로 측정하였다. 이렇게 측정된 종양의 크기를 (장축x단축x단축)/2로 계산하여 크기가 평균 30mm3 정도로 성장했을 때, 대조군 항체(IgG1 control; 7.5mg/kg), 기본 항체 Ang1mab1(7.5mg/kg) 및 Anti-PD-1 항체(20mg/kg)을 각각 단독으로 처리하거나 기본 항체인 Ang1mab1과 Anti-PD-1 항체를 병용 투여 하였다. 각 항체들은 3일 간격으로 총 5회에 걸쳐 꼬리 정맥에 투여되었고, 종양 주입 23일째 모든 개체들에 대해서 CO2 gas를 이용하여 치사시킨 후 개복하여 장기의 이상 유무를 육안으로 확인하고 종양의 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 23에 도시된 바와 같이, 상기 기본 항체 Ang1mab1와 Anti-PD1 항체를 병용 투여한 마우스군에서 종양의 크기가 약 85% 정도 억제되는 것으로 확인되었고(도 23의 (A)), 종양의 무게 역시 87% 이상 감소되는 것으로 확인되었다(도 23의 (B)).
기본 및 변이 항체들의 4가 항체로의 확장성
[9-1] 4가 항체의 설계 및 제작
본 발명의 상기 기본 및 변이 항체들의 4가 항체로의 확장성을 확인하기 위하여, 상기 제1 기본 항체 Ang1mab1을 기반으로 한 4가 항체를 제작하였다.
이를 위해, 도 24의 (A)에 도시된 Ang1mab1 HCX2 및 Ang1mab1 LCX2와 같은 2 가지 형태의 4가 항체를 설계하고, 각각의 중쇄 및 경쇄의 발현 벡터를 제작하였다. 그리고 상기와 같이 제작된 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 4가 항체를 생산 및 정제한 후, SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 24의 (B)에 도시된 바와 같이, 비환원 조건에서 각각의 예상 크기(중쇄 4가 항체: ~ 260 kDa, 경쇄 4가 항체: ~ 270 kDa)에 해당하는 밴드가 확인되었고, 환원 조건에서는 설계된 2종의 4가 항체 각각의 중쇄 및 경쇄에 해당하는 크기의 밴드가 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 상기와 같이 생산 및 정제된 4가 항체가 그 구조를 잘 유지하고 있음을 알 수 있다.
[9-2] 4가 항체의 항원에 대한 친화도 확인
상기 실시예 [9-1]에서 제작된 2종의 4가 항체들을 대상으로, 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 항원에 대한 친화도를 분석하였고, 이를 대조군 항체(16A2X2) 및 기본 항체 Ang1mab1와 비교하였다.
그 결과, 도 25의 (A)에 도시된 바와 같이, 4가 항체 Ang1mab1 LCX2의 친화도는 41.3pM로, 2가 항체인 기본 항체 Ang1mab1에 비해 약 7.5배 이상 증가된 것으로 확인되었고, 4가 항체 Ang1mab1 HCX2의 친화도는 최소 측정치인 1 pM 보다 낮게 측정되어, 2가 항체인 기본 항체 Ang1mab1에 비해 최소 18배 이상 증가된 것으로 확인되었다(도 25의 (A)).
[9-3] 4가 항체에 의한 항원의 활성화 여부 및 활성화 향상 효과 확인
상기 실시예 [9-1]에서 제작된 2종의 4가 항체들에 대하여, 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로, 이들 항체가 인간 Tie2 단백질 및 상기 Tie2 단백질이 관여하는 신호 전달 경로 상의 하부 신호 전달 인자들(AKT, ERK)의 인산화(P-Tie2, P-AKT, P-ERK)를 유도하는지를 확인하였다.
그 결과, 도 25의 (B)에 도시된 바와 같이, 상기 4가 항체들(Ang1mab1 HCX2 및 Ang1mab1 LCX2)이 Tie2, AKT, ERK 단백질의 인산화를 유도하는 것으로 확인되었고, 나아가 본 발명의 제1 및 제2 기본 항체들(Ang1mab1 및 Ang1mab4)이나 양성 대조군인 Ang1에 비하여 상기 단백질들을 훨씬 높은 수준으로 인산화시키는 것으로 확인되었다(도 25의 (B)).
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> A Novel anti-Tie2 antibody or its antigen-binding fragments, and the use thereof <130> 2021DPA4507 <150> KR 10-2020-0144961 <151> 2020-11-03 <150> KR 10-2021-0050134 <151> 2021-04-16 <160> 55 <170> PatentIn 3.5 <210> 1 <211> 1124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu 20 25 30 Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly 35 40 45 Trp Arg Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu 50 55 60 Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg 65 70 75 80 Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 85 90 95 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg 100 105 110 Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 115 120 125 Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys 130 135 140 Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser 145 150 155 160 Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val 165 170 175 His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg 180 185 190 Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val 195 200 205 Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys 210 215 220 Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys 225 230 235 240 Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu 245 250 255 Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu 260 265 270 Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser 275 280 285 Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro 290 295 300 Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly 305 310 315 320 Glu Met Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln 325 330 335 Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile 340 345 350 Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro 355 360 365 Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr 370 375 380 Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His 385 390 395 400 Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro 405 410 415 Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met 420 425 430 Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu 435 440 445 Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn 450 455 460 Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys 465 470 475 480 Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln 485 490 495 Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu 500 505 510 Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly 515 520 525 His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro 530 535 540 Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn 545 550 555 560 Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val 565 570 575 Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys 580 585 590 Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg 595 600 605 Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu 610 615 620 Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro 625 630 635 640 Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val 645 650 655 Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile 660 665 670 Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys 675 680 685 Ile Lys Asn Ala Thr Ile Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro 690 695 700 Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser 705 710 715 720 Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln 725 730 735 Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu 740 745 750 Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile 755 760 765 Ile Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala 770 775 780 Phe Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr 785 790 795 800 Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr 805 810 815 Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu 820 825 830 Gly Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu 835 840 845 Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp 850 855 860 Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly 865 870 875 880 His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly 885 890 895 Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp 900 905 910 Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile 915 920 925 Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe 930 935 940 Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe 945 950 955 960 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr 965 970 975 Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr 980 985 990 Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu 995 1000 1005 Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser Tyr 1010 1015 1020 Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Cys 1025 1030 1035 1040 Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln Gly Tyr Arg 1045 1050 1055 Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr Asp Leu Met Arg 1060 1065 1070 Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro Ser Phe Ala Gln Ile 1075 1080 1085 Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu Arg Lys Thr Tyr Val Asn 1090 1095 1100 Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala 1105 1110 1115 1120 Glu Glu Ala Ala <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(94) <223> Ig2 domain of Tie2 Protein <400> 2 Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr Val Asp Lys 1 5 10 15 Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu 20 25 30 Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro Arg 35 40 45 His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln Pro 50 55 60 Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe 65 70 75 80 Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala 85 90 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(39) <223> Epitope for the anti-hTie2 antibody <400> 3 Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met 1 5 10 15 Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu 20 25 30 Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val 35 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR1-H in the 1st and 2nd basic anti-hTie2 antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa can be any amino acid <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Met His Trp Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR2-H in the 1st and 2nd basic anti-hTie2 antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any amino acid <400> 5 Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Asn Lys 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR3-H in the 1st basic anti-hTie2 antibody <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa can be any amino acid <400> 6 Xaa Thr Pro Lys Gly Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR1-L in the 1st and 2nd basic anti-hTie2 antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa can be any amino acid <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR2-L in the 1st and 2nd basic anti-hTie2 antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be any amino acid <400> 8 Trp Xaa Xaa 1 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of CDR3-L in the 1st and 2nd basic anti-hTie2 antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa can be any amino acid <400> 9 Gln Gln Tyr Xaa Ser Xaa Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 10 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR2-H in the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 11 Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Lys 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3-H in the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 12 Ala Thr Pro Lys Gly Gly Ala Leu Glu Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 13 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR2-L in the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 14 Trp Ala Ser 1 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3-L in the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 15 Gln Gln Tyr Tyr Ser Ala Pro Ile Thr 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 16 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR2-H in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 17 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3-H in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 18 Ala Arg Gln Tyr Ser Gly Val Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 19 Gln Ser Val Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Arg Asn Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3-L in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 20 Gln Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the mutated anti-hTie2 antibody H1G01A <400> 21 Ala Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the mutated anti-hTie2 antibody H1L02A <400> 22 Gly Ala Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the mutated anti-hTie2 antibody H1S05A <400> 23 Gly Leu Thr Phe Ala Asn Tyr Ala Met His Trp Val 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-H in the mutated anti-hTie2 antibody H1V12A <400> 24 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in the mutated anti-hTie2 antibody L1Q01A <400> 25 Ala Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in the mutated anti-hTie2 antibody L1V03A <400> 26 Gln Ser Ala Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in the mutated anti-hTie2 antibody L1S07A <400> 27 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ala Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR1-L in the mutated anti-hTie2 antibody L1Y05F <400> 28 Gln Ser Val Leu Phe Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR1 in the heavy chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR2 in the heavy chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val 1 5 10 <210> 31 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR3 in the heavy chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 31 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Met Leu Gln Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR4 in the heavy chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 32 Trp Gly Gln Gly Thr Val Ile Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR1 in the light chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser 20 25 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR2 in the light chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 34 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Met 1 5 10 15 Tyr <210> 35 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR3 in the light chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 35 Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR4 in the light chain variable region of the 1st basic anti-hTie2 antibody <400> 36 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR1 in the heavy chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 38 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR3 in the heavy chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 38 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR4 in the heavy chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 39 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR2 in the light chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 40 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 41 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR3 in the light chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 41 Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FR4 in the light chain variable region of the 2nd basic anti-hTie2 antibody <400> 42 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of the heavy chain variable region in the 1st basic anti-hTie2 antibody <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106) <223> Xaa can be any amino acid <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Met His Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Gln 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Xaa Thr Pro Lys Gly Xaa Xaa Leu Glu Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Val 100 105 110 Ile Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of the heavy chain variable region in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) <223> Xaa can be any amino acid <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Met His Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Tyr Ser Gly Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Ile Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of the light chain variable region in the 1st basic anti-hTie2 antibody <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102) <223> Xaa can be Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103) <223> Xaa can be any amino acid <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Asn Leu Leu Met Tyr Trp Xaa Xaa Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Xaa Ser Xaa Pro Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General amino acid sequence of the light chain variable region in the 2nd basic anti-hTie2 antibody <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98) <223> Xaa can be Tyr, Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102) <223> Xaa can be Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103) <223> Xaa can be any amino acid <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Xaa Xaa Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Xaa Ser Xaa Pro Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 47 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain constant region in the Ang1mab1 <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 48 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the heavy chain constant region in the Ang1mab1 <400> 48 ccctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggt 987 <210> 49 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain constant region in the Ang1mab4 <400> 49 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 50 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the heavy chain constant region in the Ang1mab4 <400> 50 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccct gcagccggag caccagcgag 60 agcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120 tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 240 tacacctgca acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagagc 300 aagtacggcc ccccctgccc cccctgcccc gcccccgagt tcctgggcgg ccccagcgtg 360 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggac 480 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacctac 540 cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtga gcaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga agaccatcag caaggccaag 660 ggccagcccc gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 840 gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggagggc 900 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 960 ctgagcctga gcctgggcaa g 981 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain constant region in the Ang1mab1 and Ang1mab4 <400> 51 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 52 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the light chain constant region in the Ang1mab1 and Ang1mab4 <400> 52 ggtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagttcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3-H in the control antibodies <400> 53 Ala Thr Gln Lys Gly Gly Ala Leu Glu Ile 1 5 10 <210> 54 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val 1 5 10 15 Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val 20 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val 1 5 10 15

Claims (20)

  1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-Y-X7-M-H-W-X8(서열번호 4)의 아미노산 서열(상기 서열번호 4의 아미노산 서열에서, X1 내지 X8은 각각 독립적으로 임의의 아미노산임)을 갖는 CDR1-H를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역; 및
    X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N-X24-X25-X26-Y(서열번호 7)의 아미노산 서열(상기 서열번호 7의 아미노산 서열에서, X17 내지 X20 및 X22 내지 X26은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, X21은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나임)을 갖는 CDR1-L을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 X1, X7, X8, X19 및 X20는 각각 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X2 및 X4는 각각 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X3, X5, X6, X17, X18, X23, X24 및 X26은 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X21은 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X22은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나; 또는
    상기 X25는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나;
    인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1 및 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 I-X9-Y-X10-X11-X12-N-K(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-H, 및 X13-T-P-K-G-X14-X15-L-E-X16(서열번호 6)의 아미노산 서열 또는 ARQYSGVFEY(서열번호 18)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-H로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하거나; 또는
    상기 경쇄 가변 영역은 W-X27-X28(서열번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-L 및 Q-Q-Y-X29-S-X30-P-X31-X32(서열번호 9)의 아미노산을 포함하는 CDR3-L로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
    (상기 아미노산 서열들에서, X9 내지 X16, X27, X28, X30 및 X32는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, X29은 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이며, X31은 이소류신 및 티로신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나임)
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 X9, X28 및 X32는 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X10는 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X11, X13 내지 X16, X27 및 X30는 각각 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    상기 X12은 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나;
    X29은 티로신 및 페닐알라닌으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나이거나; 또는
    X31은 이소류신 및 티로신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나;
    인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1에 있어서
    상기 항체는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역을 각각 2개씩 또는 4개씩 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 1에 있어서
    상기 항체는 완전 인간 항체인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질의 Ig2 도메인에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 청구항 8에 있어서
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 55의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 청구항 9에 있어서
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1.4 nM 이하의 KD 값으로 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 청구항 7 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질을 특이적으로 인산화시키는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자.
  14. 청구항 13의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  15. 청구항 14의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  16. 청구항 15의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 인간 또는 원숭이의 Tie2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  17. 청구항 1의 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 혈관신생 관련 질환은 혈관신생이 감소하거나 결핍되어 유발되는 것인, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 혈관신생 관련 질환은 혈관이 비정상화되거나, 또는 비정상적 혈관신생이 과도하여 유발되는 것인, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 적어도 하나의 질환 치료제; 및
    청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    을 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 병용투여용 약학적 조성물.
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