KR102455680B1 - 신규 항인간 Tie2 항체 - Google Patents

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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 인간 Tie2에 결합하여, 인간 Tie2를 활성화시킴으로써 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈을 예방 또는 치료하는 항인간 Tie2 항체를 제공하는 것에 있다.
[해결 수단] 본 발명자들은, 항인간 Tie2 항체에 대해 검토하여, 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체로서, 해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며, 1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항인간 Tie2 항체를 제공했다.

Description

신규 항인간 Tie2 항체{NOVEL ANTI-HUMAN TIE-2 ANTIBODY}
본 발명은, 신규 항인간 Tie2 항체에 관한 것이다.
Tie2(Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain 2)는 수용체형 티로신 키나제이다. Tie2는 주로 혈관 내피 세포에 발현하고 있다는 것이 알려져 있다. 그의 리간드로서는, 다량체형 분비 당단백질인 안지오포에틴 1(Angiopoietin-1; Ang-1) 및 안지오포에틴 2(Ang-2)가 알려져 있다.
Ang-1은 Tie2에 대해서 아고니스트로서 기능한다. Tie2는 Ang-1과 결합하면, 다량체를 형성하는 것에 의해 자기 인산화하고, 세포 내에 시그널을 전달하여, 혈관 내피 세포의 항아포토시스(apoptosis) 작용, 혈관의 투과성 저해 작용 등의 혈관 안정화, 성숙화 및 리모델링을 촉진한다는 것이 나타나 있다(Cell, 1996, Vol. 87, p. 1171-1180. Genes Dev., 1994, Vol. 8, p. 1897-1909. Science, 1999, Vol. 286, p. 2511-2514. Nat. Struct. Biol., 2003, Vol. 10, p. 38-44). 또한, Ang-1은 Tie2 활성화를 통하여 일산화질소 산생을 통한 혈관 확장 및 혈류 항진 작용을 발휘한다는 것도 알려져 있다(Pharmacol. Res., 2014, Vol. 80, p. 43-51). 더욱이, Ang-1은 Tie2 활성화를 통하여 혈관 내피 카드헤린의 인터널라이제이션을 억제함으로써 혈관의 안정화에 기여하고 있다고 생각되고 있다(Dev. Cell, 2008, Vol. 14, p. 25-36). 한편, Ang-2는 혈관 내피 세포 상에서 Tie2를 활성화할 수 있다고 여겨지고 있지만, 그 활성화는 Ang-1에 비해 부분적이라고 되어 있다(Mol. Cell Biol., 2009, Vol. 29, p. 2011-2022). Ang-2는 Ang-1과 Tie2의 동일 부위에 동일 정도의 친화성으로 결합하기 때문에, 결과적으로 Ang-1에 의한 Tie2의 활성화를 부분적인 활성으로 치환해 버리기 때문에 Ang-2는 내인성의 Tie2 안타고니스트로서 기능한다는 것이 시사되어 있다(Science, 1997, Vol. 277, p. 55-60).
혈중 Ang-2 농도의 상승이, 당뇨병, 당뇨병 망막증, 패혈증 및 급성 신부전 등의, 혈관의 취약성이 병인의 하나로서 생각되고 있는 질환으로 보고되어 있다(Atherosclerosis, 2005, Vol. 180, p. 113-118. Br. J. Ophthalmol., 2004, Vol. 88, p. 1543-1546. Critical Care, 2009, Vol. 13, p. 207. Intensive Care Med., 2010, Vol. 36, p. 462-470).
당뇨병 망막증 및 당뇨병 황반부종과의 관련으로서는, 환자의 혈장 중 또는 초자체액 중에서 Ang-2 농도가 상승하고 있다는 보고가 있다(Br. J. Ophthalmol., 2004, Vol. 88, p. 1543-1546. Br. J. Ophthalmol., 2005, Vol. 89, p. 480-483). 또한, 당뇨병 망막증 환자의 망막 혈관에 있어서는, Ang-1의 주된 산생 세포인 주피 세포(Cell, 1996, Vol. 87, p. 1161-1169)의 탈락이 특징적인 병변의 하나로서 알려져 있다(Retina, 2013, Fifth edition, p. 925-939). 병태의 하나로서 황반부가 비후되는 당뇨병 황반부종이 알려져 있지만, 초자체 제거의 수술에 의해 안내 Ang-1 농도가 상승한 환자에서는 황반부의 비후가 감소하고 있다는 보고도 있다(Br. J. Ophthalmol., 2005, Vol. 89, p. 480-483). 더욱이, 망막 혈관의 주피 세포를 탈락시킨 망막 부종 마우스 모델에 있어서, 망막의 부종이나 출혈이 관찰되고 Ang-1의 초자체내 투여로 병태 발증이 저해된 것(J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, p. 1619-1628), 및 마우스 당뇨병 망막증 모델을 이용한 시험에 있어서, Ang-1을 인코딩하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 투여하면 망막에 있어서의 혈관 내피 세포 장애가 억제된 것(Am. J. Pathol., 2002, Vol. 160, p. 1683-1693)으로부터, Ang-1의 병태 개선 작용이 시사되고 있다. 한편, Ang-2를 망막에 특이적으로 과잉 발현시킨 유전자 개변 마우스에서는 망막의 세포 장애가 항진되는 것이 보고되고 있다(Acta. Diabetol. 2010, Vol. 47, p. 59-64).
중증 하지허혈과의 관련으로서는, 말초 동맥 질환에 있어서 혈장중 Ang-2가 증가하고 있는 것이나, 중증 하지허혈 환자의 허혈 지근 또는 피부 조직에 있어서 Ang-2 발현량이 많다는 것이 보고되어 있다(J. Am. Coll Cardial., 2008, Vol. 52, p. 387-393. Int Angiol., 2011, Vol. 30, p. 25-34). 또한, 래트 후지 허혈 모델을 이용한 시험에 있어서, Ang-1을 인코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터의 투여에 의해, 허혈지의 혈류 회복이 촉진되어 항아포토시스 효과가 유도된다는 것이 나타나고 있다(Angiogenesis, 2009, Vol. 12, p. 243-249). 2형 당뇨병 모델 동물인 db/db 마우스의 관동맥 결찰 모델에서는, Ang-1을 인코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 투여에 의해, 경색 경계역에 있어서 평활근 세포에 덮인 성숙 혈관이 증가한다는 것이 보고되고 있으므로(Diabetes, 2008, Vol. 57, p. 3335-3343), Tie2 시그널의 활성화에 의해, 불안정한 신생 혈관의 성숙을 촉진하는 효과를 기대할 수 있다.
인간 Tie2에 대해서 아고니스트 작용을 나타내는 항체로서는, 마우스 모노클로널 항체 15B8(특허문헌 1)이 보고되어 있다. 15B8은 인간 Tie2에 결합하여, 인간 혈관 내피 세포 HUVEC의 항아포토시스 작용을 유도한다는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).
국제공개 제2000/018804호
본 발명의 과제는, 인간 Tie2에 결합하여, 인간 Tie2를 활성화시킴으로써 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈을 예방 또는 치료하는 항인간 Tie2 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 항인간 Tie2 항체의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 4가의 항인간 Tie2 항체를 제작하여(실시예 1∼8), 당해 항인간 Tie2 항체가 인간 Tie2에 결합한다는 것(실시예 12), 인간 Tie2 발현 BaF3 세포의 항아포토시스 작용을 유도한다는 것(실시예 9 및 11), 및 래트 혈관 투과성 항진 모델에 있어서 혈관 투과성 항진을 저해한다는 것(실시예 10 및 13)을 발견했다. 이들의 결과, 상기 항인간 Tie2 항체를 제공하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은, 의학상 또는 산업상 유용한 물질 또는 방법으로서 이하의 발명을 포함해도 된다.
[1] 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
해당 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
해당 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하며,
1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[2] 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, [1]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트:
(1) 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며,
1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트; 및
(2) (1)의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[3] [1]에 기재된 항인간 Tie2 항체로서, 해당 항체는 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 카복시 말단(C말단)이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 아미노 말단(N말단)과 연결되어 있고,
각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
항인간 Tie2 항체.
[4] 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, [3]에 기재된 항인간 Tie2 항체:
(1) 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있고,
각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
항인간 Tie2 항체; 및
(2) (1)의 항인간 Tie2 항체의 번역후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 Tie2 항체.
[5] [4]에 기재된 항인간 Tie2 항체로서, 해당 항인간 Tie2 항체는 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있고,
각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
항인간 Tie2 항체.
[6] [5]에 기재된 항인간 Tie2 항체의 번역후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 Tie2 항체.
[7] 번역후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 리신 결실인, [6]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[8] 인간 Igγ1 정상 영역 또는 인간 Igγ4 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는, [3]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[9] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역, 또는 L234A, L235A, P331S, 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [8]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[10] 인간 Igγ4 정상 영역이 S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ4 정상 영역인, [8]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[11] 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [3]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[12] 인간 Igγ1 정상 영역 또는 인간 Igγ4 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하고, 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [3]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[13] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역, 또는 L234A, L235A, P331S, 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [12]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[14] 인간 Igγ4 정상 영역이 S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ4 정상 영역인, [12]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[15] 링커가 5∼70 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 링커인, [3]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[16] 링커가 힌지 영역 또는 그 일부분의 아미노산 서열을 포함하는, [15]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[17] 링커가 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는, [16]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[18] 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, [4]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[19] 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, [4]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[20] 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, [4]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[21] [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 번역후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 Tie2 항체.
[22] 번역후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 리신 결실인, [21]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[23] 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, [21]에 기재된 항인간 Tie2 항체.
[24] [18] 또는 [23]에 기재된 항인간 Tie2 항체와 동일한 인간 Tie2 에피토프에 결합하는, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[25] 인간 Tie2 에피토프가, Accession No. NP_000450.2의 아미노산 번호 192, 195 및 197의 아미노산을 포함하는 인간 Tie2 에피토프인, [24]에 기재된 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[26] [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
[27] [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
[28] [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
[29] [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
[30] [26] 및/또는 [27]에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[31] [28] 및/또는 [29]에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[32] 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [30]에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[33] 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [31]에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[34] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법:
(a) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [2]에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[35] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 Tie2 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법:
(a) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [18]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[36] [34]에 기재된 방법으로 생산된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[37] [35]에 기재된 방법으로 생산된 항인간 Tie2 항체.
[38] [1]∼[23], [36] 및 [37] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[39] [5]에 기재된 항인간 Tie2 항체, [6]에 기재된 항인간 Tie2 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[40] [18]에 기재된 항인간 Tie2 항체, [23]에 기재된 항인간 Tie2 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[41] 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [38]∼[40] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[42] [1]∼[23], [36] 및 [37] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈을 예방 또는 치료하는 방법.
[43] 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [1]∼[23], [36] 및 [37] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[44] 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, [1]∼[23], [36] 및 [37] 중 어느 하나에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 사용.
상기 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 다른 펩타이드 및 단백질과의 융합 항체나, 수식제를 결합시킨 수식 항체도 포함된다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 인간 Tie2에 결합하여, 인간 Tie2를 활성화시킴으로써 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 4가의 항인간 Tie2 항체의 포맷의 일례를 나타낸다.
도 2는 완전 인간형 2-16A2 및 TIE-1-Igγ1-WT의, 래트 혈관 투과성 모델에 있어서의 혈관 투과성 저해 작용을 나타낸다. 세로축은 에반스 블루 색소 누출량을 나타낸다. (****: p＜0.0001 vs Vehicle군).
도 3은 TIE-1-Igγ1-LALA의 래트 혈관 투과성 모델에 있어서의 혈관 투과성 저해 작용을 나타낸다. 세로축은 에반스 블루 색소 누출량을 나타낸다. (****: p＜0.0001 vs Vehicle군).
도 4는 TIE-1-Igγ1-LALA의 마우스 망막 혈관 주피 세포 탈락 모델에 있어서의 망막 부종 저해 작용을 나타낸다. 세로축은 망막 신경 섬유층 및 망막 신경절 세포층의 면적의 합을 나타낸다. (##: p＜0.005 vs Cont.군, *: p＜0.05 vs Veh.군).
도 5는 TIE-1-Igγ1-LALA의 후지 허혈 마우스 모델에 있어서의 혈류 개선 작용을 나타낸다. 세로축은 혈류량을 나타낸다. (*: p＜0.05 vs 대조군, **: p＜0.01 vs 대조군).
도 6은 TIE-1-Igγ1-LALA의 에피토프 해석의 일환으로서, 표면 플라즈몬 공명 현상의 결과의 대표예를 나타낸다. 세로축은 결합 응답성(Resonance Unit: RU)을, 가로축은 시간(초)을 나타낸다.
도 7은 TIE-1-Igγ1-LALA의 에피토프 해석의 일환으로서, ELISA의 결과를 나타낸다. 세로축은 발광 강도를, 가로축은 TIE-1-Igγ1-LALA의 농도(ng/mL)를 나타낸다.
이하에, 본 발명에 대해 상술한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재하고, 그 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만∼7만의 중쇄와 2만∼3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라고 불린다. 또한 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4로 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, L형과 K형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩타이드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 다이설파이드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만∼19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 짝을 이룰 수 있다.
쇄내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100∼110잔기마다 하나의 루프를 이루며, 이 입체 구조는 각 루프간에 유사하여, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 아미노 말단(N말단)에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이어도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이라고 불리고 있다. 가변 영역보다 카복시 말단(C말단) 측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있다.
항체의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 달려 있다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쪽의 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역으로 거의 한정되는 것을 알 수 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부르고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
정상 영역에 관해서, 중쇄 정상 영역은 3개의 영역으로 구성되어 있고, 가변 영역측으로부터 순서대로, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역이라고 불리고 있다. 경쇄 정상 영역은 1개의 영역으로 구성되어 있다. CH1 영역 및 CH2 영역 사이에는 힌지 영역으로 불리는 펩타이드 서열이 존재한다. 힌지 영역은, 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조의 가동성에 관여하고 있다.
항체의 VH 및 VL을 포함하는 각종 항원 결합 프래그먼트도 항원 결합 활성을 가지며, 이와 같은 대표적인 항원 결합 프래그먼트로서 1본 쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab, Fab', F(ab')2를 들 수 있다. Fab는, 경쇄와 VH, CH1 영역과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab'는, 경쇄와 VH, CH1 영역과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab')2 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄간 S-S 결합으로 결합한 2가의 항체 프래그먼트이다. scFv는, 링커로 연결된 VH와 VL로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다.
2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항체를 다가 항체라고 한다. 그 중, 항원 결합 부위를 4개 갖는 항체를 4가 항체라고 한다. 4가 항체에는 여러 가지 포맷(구조)이 보고되어 있다(Nat. Rev. Immunol. 2010, Vol. 10, p. 301-316. J. Immunol., 2003, Vol. 170, p. 4854-4861. Mol. Immunol., 2000, Vol. 37, p. 1067-1077. Biochem. J., 2007, Vol. 406, p. 237-246. J. Immunol. Methods, 2003, Vol. 279, p. 219-232). 예를 들어, 2가 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 N말단에 링커를 통하여 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 C말단이 각각 연결된 4가 항체, 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고, 각 중쇄가 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개 포함하는 4가 항체, 4량체 스트렙트아비딘의 각 스트렙트아비딘에 scFv의 C말단이 1개씩 결합한 4가 항체, 4량체 p53의 각 p53에 scFv의 C말단이 1개씩 결합한 4가 항체, 및 2량체 scFv의 C말단에 링커를 통하여 CH3 영역의 N말단이 연결된 4가 항체 등이 보고되어 있다.
＜본 발명의 항인간 Tie2 항체＞
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 포함된다.
4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며,
1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 4가 항체인 한, 항체의 포맷은 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에 있어서, 예를 들어, Nat. Rev. Immunol. 2010, Vol. 10, p. 301-316, J. Immunol., 2003, Vol. 170, p. 4854-4861, Mol. Immunol., 2000, Vol. 37, p. 1067-1077, Biochem. J., 2007, Vol. 406, p. 237-246, J. Immunol. Methods, 2003, Vol. 279, p. 219-232 등에 기재된 것과 같은, 여러 가지 4가 항체의 포맷을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있고,
각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
항인간 Tie2 항체이다.
이하, 당해 포맷의 4가 항체를 탠덤 항체라고도 칭하고, 그 일례를 도 1에 나타낸다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체가 탠덤 항체인 경우, 정상 영역으로서는, 어떠한 서브클래스의 정상 영역(예를 들어, 중쇄 정상 영역으로서 Igγ1, Igγ2, Igγ3또는 Igγ4의 정상 영역, 경쇄 정상 영역으로서 Igλ 또는 Igκ의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 정상 영역(CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다)은, 인간 Igγ1 정상 영역 또는 인간 Igγ4 정상 영역이다. 바람직하게는, 경쇄 정상 영역은, 인간 Igκ 정상 영역이다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역을 이용하는 경우, 인간 Igγ1 정상 영역의 CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 8의 아미노산 번호 350에서 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH1 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 463에서 572까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH2 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 573에서 679까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH3 영역을 들 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역을 이용하는 경우, 항체의 항체 의존 세포 상해 활성이나 보체 의존 상해 활성을 저하시키기 위해서 L234A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 234번 위치의 류신의 알라닌으로의 치환), L235A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 235번 위치의 류신의 알라닌으로의 치환) 및 P331S(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 331번 위치의 프롤린의 세린으로의 치환) 등의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ1 정상 영역을 이용할 수도 있다(Mol. Immunol., 1992, Vol. 29, No. 5, p. 633-639). 또한, 체내 동태의 관점에서, 혈액 중으로부터 신속하게 소실시키기 위해서 I253A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 253번 위치의 이소류신의 알라닌으로의 치환) 등의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ1 정상 영역을 이용할 수도 있다(J. Immunol., 1997, Vol. 158, p. 2211-2217). 본 명세서 중에서 사용되는 항체의 정상 영역에 있어서의 아미노산 변이 도입에 관한 잔기 번호에 대해서는, EU 인덱스(Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda)에 따른다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역을 이용하는 경우, 바람직하게는, 해당 인간 Igγ1 정상 영역은, L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역, 또는 L234A, L235A, P331S 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역이다. L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역의 CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 번호 350에서 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH1 영역, 서열 번호 2의 아미노산 번호 463에서 572까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH2 영역, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 573에서 679까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH3 영역을 들 수 있다. L234A, L235A, P331S 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역의 CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 6의 아미노산 번호 350에서 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH1 영역, 서열 번호 6의 아미노산 번호 463에서 572까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH2 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 573에서 679까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH3 영역을 들 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ4 정상 영역을 이용하는 경우, Fab 암(arm) 교환을 억제하기 위해서 S228P(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 228번 위치의 세린의 프롤린으로의 치환) 및 L235E(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 235번 위치의 류신의 글루탐산으로의 치환) 등의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ4 정상 영역을 이용할 수도 있다(Drug Metab. Dispos., 2010, Vol. 38, No. 1, p. 84-91).
본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ4 정상 영역을 이용하는 경우, 바람직하게는, 해당 인간 Igγ4 정상 영역은, S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ4 정상 영역이다. S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ4 정상 영역의 CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 10의 아미노산 번호 350에서 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH1 영역, 서열 번호 10의 아미노산 번호 460에서 569까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH2 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 570에서 676까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CH3 영역을 들 수 있다.
인간 Igκ 정상 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 4의 아미노산 번호 114에서 219까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igκ 정상 영역을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체가 탠덤 항체인 경우, 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역 또는 인간 Igγ4 정상 영역이며, 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역이다. 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역인 경우, 바람직하게는, 해당 인간 Igγ1 정상 영역이, L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역, 또는 L234A, L235A, P331S 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역이다. 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ4 정상 영역인 경우, 바람직하게는, 해당 인간 Igγ4 정상 영역이, S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ4 정상 영역이다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체가 탠덤 항체인 경우, 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조끼리를 연결하는 링커로서는, 항체가 그 기능을 갖는 한, 임의의 펩타이드(펩타이드 링커)를 사용할 수 있다. 펩타이드 링커의 길이 및 아미노산 서열은 당업자에게 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드 링커의 길이는 5∼70 아미노산이다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는, 힌지 영역 또는 그 일부분의 아미노산 서열을 포함한다. 힌지 영역이란, 항체의 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 존재하는 영역을 의미하고, 사용하는 힌지 영역으로서는, 예를 들어, IgG1 또는 IgG3의 힌지 영역을 들 수 있다. 힌지 영역의 일부분이란, 힌지 영역 중의 적어도 5 아미노산 연속하는 영역을 의미하고, 바람직하게는 힌지 영역의 N말단으로부터 적어도 5 아미노산 연속하는 영역을 의미한다. 힌지 영역의 일부분으로서는, 예를 들어, IgG1의 힌지 영역의 경우, N말단으로부터 5 아미노산 연속하는 영역(서열 번호 13의 아미노산 번호 1에서 5까지의 아미노산 서열로 이루어진다), 및, IgG3의 힌지 영역의 경우, N말단으로부터 12 아미노산 연속하는 영역(서열 번호 14의 아미노산 번호 1에서 12까지의 아미노산 서열로 이루어진다)을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 링커는, 힌지 영역의 N말단으로부터 적어도 5 아미노산 연속하는 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 해당 링커의 C말단에 아미노산 서열 GlySer를 포함한다. 이와 같은 링커로서는, 서열 번호 13∼20 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 링커를 들 수 있고, 바람직하게는, 링커는, 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어진다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 이하의 i)∼iv) 중 어느 하나의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체이다.
i) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
ii) 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
iii) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
iv) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는다는 것이 알려져 있다. 번역후 수식의 예로서는, 중쇄 C말단의 리신의 카복시펩티다제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아마이드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러 가지 항체에 있어서, 이와 같은 번역후 수식이 생긴다는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 번역후 수식을 받은 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 번역후 수식을 받은 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 리신 결실을 받은 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 들 수 있다. 이와 같은 N말단의 파이로글루타밀화 또는 C말단 리신 결실에 의한 번역후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아니라는 것은 당해 분야에서 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 이하의 (1)∼(4) 중 어느 하나의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체이다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식되는 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 679의 리신을 결여하는 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(2) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산에 수식되는 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 679의 리신을 결여하는 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(3) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산에 수식되는 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 679의 리신을 결여하는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(4) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산에 수식되는 및/또는 서열 번호 10의 아미노산 번호 676의 리신을 결여하는 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 하기의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
본 발명에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
해당 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
해당 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하며,
1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
또한, 본 발명에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 Tie2 항체도 포함된다.
2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 카복시 말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 아미노 말단과 연결되어 있고,
각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
항인간 Tie2 항체.
본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 인간 Tie2에 결합하는 항체이다. 항체가 인간 Tie2(Accession No. NP_000450.2)에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA) 등의 방법을 들 수 있다. ELISA를 이용하는 경우, 예시적인 방법에 있어서, 인간 Tie2 및 인간 Fc를 융합시킨 단백질을 ELISA 플레이트에 고상화하고, 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨다. 비오틴 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 알칼리포스파타제 등의 효소가 결합한 스트렙트아비딘을 반응시킨다. 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, 알칼리포스파타제의 경우, Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)(BioFX사, APU4-0100-01) 등)를 이용한 활성 측정을 행하는 것에 의해, 피험 항체가 인간 Tie2에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 활성의 구체적인 평가 방법으로서는, 예를 들어, 후기 실시예 12에 기재되는 것과 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체에는, 인간 Tie2에 결합하는 항체이면, 인간 Tie2에의 결합에 더하여, 다른 동물 유래의 Tie2(예를 들어, 원숭이 Tie2)에도 결합하는 항체도 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 인간 Tie2에 결합하고, 또한 인간 Tie2 발현 세포에 대해서 항아포토시스 활성을 갖는다. 항체가 인간 Tie2 발현 세포에 대한 항아포토시스 활성을 갖는 것을 평가하기 위한 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, 후기 실시예 4에 기재되는 것과 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체와 같은 인간 Tie2 에피토프에 결합하는, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 여기에서 에피토프란 항체가 인식하는 항원 부위를 말한다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 인간 Tie2(Accession No. NP_000450.2)의 아미노산 번호 192, 195 및 197의 아미노산 중, 적어도 1개의 아미노산을 포함하는 인간 Tie2 에피토프에 결합하는, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
또한, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 인간 Tie2(Accession No. NP_000450.2)의 아미노산 번호 192, 195 및 197을 포함하는 인간 Tie2 에피토프에 결합하는, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체와 동일한 인간 Tie2 에피토프에 결합하는, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 공지의 에피토프 결정 방법을 이용하여 취득할 수 있다. 에피토프를 결정하는 방법으로서는, 예를 들어, 수소 중수소 교환 질량분석법, X선 결정 구조 해석, 및 인간 Tie2의 아미노산 치환 변이체 또는 인간 Tie2 부분 펩타이드 등을 이용한 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명 현상 등의 방법을 들 수 있다.
피험 항체가 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체와 동일한 인간 Tie2 에피토프에 결합하는지 여부는, 상기의 공지 에피토프 결정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 수소 중수소 교환 질량분석법을 이용하는 경우, 피험 항체 비존재하에서 중수소 치환한 인간 Tie2와 피험 항체 존재하에서 중수소 치환한 인간 Tie2를 각각 펩타이드로 분해하고, 각 펩타이드의 분자량을 측정함으로써 중수소 치환의 비율을 산출한다. 피험 항체의 유무에 의한 인간 Tie2의 중수소 치환의 비율의 차이로부터 피험 항체의 인간 Tie2 에피토프를 결정할 수 있다. ELISA를 이용하는 경우, 인간 Tie2의 점변이체를 제작한다. 변이체 인간 Tie2를 고상화하고, 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨다. 반응 후, 비오틴 표지 항인간 카파 경쇄 항체 등의 2차 항체를 반응시키고, 세정한다. 그 후, 알칼리포스파타제 표지 스트렙트아비딘(Thermo Fisher Scientific사, 21324)을 반응시키고, 세정한다. 그리고, Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm) 등을 이용한 활성 측정을 행하는 것에 의해, 피험 항체가 당해 변이체 인간 Tie2에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 여러 가지 변이체 인간 Tie2에 대한 결합 활성을 평가하는 것에 의해, 피험 항체의 에피토프를 결정할 수 있다. 피험 항체의 에피토프가, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체의 에피토프 중의 1 아미노산을 적어도 1개 포함하는 경우, 피험 항체가, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 Tie2 항체와 동일한 인간 Tie2 에피토프에 결합한다고 판단할 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지의 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 후술하는 ＜본 발명의 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산된 항인간 Tie2 항체＞에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 필요에 따라 더 정제된 후, 통상적 방법에 따라 제제화되어 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반부종, 패혈증, 급성 간장애, 급성 신장장애, 급성 폐장애, 전신성 염증반응 증후군, 말초 동맥 폐색증 또는 중증 하지허혈 등의 혈관 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞
본 발명의 폴리뉴클레오타이드에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열에 나타나는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1의 염기번호 1에서 366까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열에 나타나는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3의 염기번호 1에서 339까지 의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 그의 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지의 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 당해 분야에서 공지의 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이와 같은 유전자 합성 방법으로서는, WO 90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지의 여러 가지 방법이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 일단 취득하면, 이 폴리뉴클레오타이드의 소정의 부위에 변이를 도입하는 것에 의해, 본 발명의 다른 폴리뉴클레오타이드를 취득하는 것도 가능하다. 이와 같은 변이 도입 방법으로서는, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit., 1987, John Wiley ＆ Sons Section 8.1-8.5) 등의 당업자에게 공지의 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
＜본 발명의 발현 벡터＞
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다. 당해 분야에 있어서 여러 가지 포맷의 4가 항체 및 그 생산 방법이 공지이며, 본 발명의 발현 벡터는, 이들 생산 방법에 따라, 발현시키는 4가 항체의 포맷에 응하여 당업자에게 용이하게 구축될 수 있다.
바람직한 본 발명의 발현 벡터로서는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 또는 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터로서는, 진핵세포(예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵세포(예를 들어, 대장균)의 각종 숙주 세포 중에서 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하여, 이들에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스, 센다이바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는, pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다. 또한, AG-γ1이나 AG-κ(예를 들어, WO 94/20632를 참조) 등의 미리 인간 Ig 정상 영역 유전자를 갖는 발현 벡터를 이용하여 항체 유전자를 발현할 수도 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 세균(예를 들어, 에시리키아속균)에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 효모에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서 동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 인핸서 서열, 본 발명의 항체 또는 그의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 다이하이드로엽산 환원효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
＜본 발명의 형질 전환된 숙주 세포＞
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
(a) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포로서는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환하는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어, 항체를 발현할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 형질 전환하는 숙주 세포로서는, 예를 들어, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 동물 세포(예를 들어, CHO-K1SV 세포), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 세균(에시리키아속균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있고, 바람직하게는, CHO 세포(CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포 등), 293 세포, NS0 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.
＜본 발명의 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산된 항인간 Tie2 항체＞
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 Tie2 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 Tie2 항체를 발현시키는 공정을 포함하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 해당 방법에서 사용되는 바람직한 숙주 세포로서는, 전술한 바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은, 적절히 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 약 5∼20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1959, Vol. 130, No. 3373, p. 432-7), DMEM 배지(Virology, 1959, Vol. 8, p. 396), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519), 199 배지(Exp. Biol. Med., 1950, Vol. 73, p. 1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼72시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol. 82, p. 8404) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등을, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들어, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프 리커, 펩톤, 카제인, 고기 추출물, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 포함하고 있어도 된다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 바람직한 배지로서는, 예를 들어, LB 배지, M9 배지(Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2. 2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 14∼39℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, Vol. 77, p. 4505) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술과 같은 배양에 의해, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정에 더하여, 추가로, 해당 형질 전환된 숙주 세포로부터 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 배양 상청 중에 축적된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예를 들어, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법으로 생산된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
＜본 발명의 의약 조성물＞
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 따라 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어, 주사제, 링거용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 안내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 임해서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수종의 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역후 수식을 받고 있지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재하는 의약 조성물도 포함된다.
4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서, 해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며, 1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재하는 의약 조성물도 포함된다.
2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고, 각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있고, 각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는, 항인간 Tie2 항체, 및 해당 항체의 번역후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 의약 조성물.
본 발명의 의약 조성물에는, 중쇄 C말단 리신의 결실 항체, N말단 번역후 수식을 받은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 중쇄 C말단 리신을 결실하고 N말단 번역후 수식을 받은 항체, 및/또는 중쇄 C말단 리신을 갖고 N말단 번역후 수식을 받고 있지 않은 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)∼(4) 중 2종 이상의 항인간 Tie2 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(2) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(3) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(4) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)∼(4) 중 2종 이상의 항인간 Tie2 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
(1) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(2) 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(3) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(4) 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)∼(4) 중 2종 이상의 항인간 Tie2 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
(1) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(2) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(3) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(4) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)∼(4) 중 2종 이상의 항인간 Tie2 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
(1) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1에서 675까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(2) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(3) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1에서 675까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식된 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
(4) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재하는 의약 조성물도 포함된다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
제제화에 있어서의 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 항체의 결합 역가 등에 따라 다르지만, 예를 들어, 0.001mg/kg∼100mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 혈관 관련 질환, 예를 들어, 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반부종, 패혈증, 급성 간장애, 급성 신장장애, 급성 폐장애, 전신성 염증반응 증후군, 말초 동맥 폐색증 또는 중증 하지허혈 등의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체를 포함하는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 항인간 Tie2 항체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의, 본 발명의 항인간 Tie2 항체의 사용이 포함된다.
＜융합 항체 및 수식 항체＞
당업자이면, 당해 분야에서 공지의 방법을 이용하여, 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를, 다른 펩타이드 또는 단백질을 융합한 융합 항체로서 제작하는 것이나, 수식제를 결합시킨 수식 항체로서 제작하는 것도 가능하다. 본 발명의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 이와 같은 융합체나 수식체의 형태의 항체 또는 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 예를 들어, 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서, 해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며, 1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 다른 펩타이드 또는 단백질과 융합한 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 또는 수식제를 결합시킨 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 융합 항체로서 인간 Tie2와의 결합 활성을 갖고 있는 한, 융합에 이용되는 다른 펩타이드 또는 단백질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩타이드, 인공 헬릭스 모티프 펩타이드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스퍼라제, 각종 독소, 그 외 다량체화를 촉진할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 수식 항체로서 인간 Tie2와의 결합 활성을 갖고 있는 한, 수식에 이용되는 수식제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에 대해 전반적으로 기재했으나, 추가로 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
시판의 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 대해서는, 특별히 예고가 없는 한 첨부된 프로토콜에 따라 실험을 행했다. 또한, 편의상, 농도 mol/L를 M으로서 나타낸다. 예를 들어, 1M 수산화나트륨 수용액은 1mol/L의 수산화나트륨 수용액이라는 것을 의미한다.
(실시예 1: 항인간 Tie2 항체 산생 하이브리도마의 제작)
인간 모노클로널 항체 개발 기술 「벨로시뮨」(VelocImmune antibody technology: Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항체를 제작했다. 벨로시뮨 마우스에, 면역 반응을 야기하는 아주반트와 함께, 재조합 인간 Tie2-Fc 키메라 단백질(R＆D사, 313-TI-100)을 면역했다. 통상적 방법에 따라, 면역한 마우스의 림프절을 적출하여 임파구를 회수하고, 이것을 마우스 유래 골수종 세포 SP2/0(ATCC: CRL-1581)와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작했다. 하이브리도마의 모노클론화를 행하고, 각 클론에 대해, 무혈청 배지인 CD 하이브리도마 미디엄(Invitrogen사)에서 배양했다. 얻어진 배양 상청으로부터 프로틴 G 컬럼(GE 헬스케어사)을 이용하여 항체를 정제했다. 벨로시뮨 기술에 의해 얻어진 항체는, 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체(키메라 항체라고도 칭한다)이다.
(실시예 2: 세포 ELISA 어세이)
항체의 항원 결합 활성을 측정하기 위해서, 인간 Tie2 발현 CHO 세포, 원숭이 Tie2 발현 CHO 세포, 래트 Tie2 발현 CHO 세포 및 마우스 Tie2 발현 CHO 세포를 이용한 세포 ELISA 어세이에 의해, 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 Tie2에 대한 항체의 결합을 평가했다.
(실시예 3: Ang-1 개변체를 이용한 길항 활성 평가)
항체의 Ang-2 길항 활성을 평가하기 위해서, Ang-1 개변체(Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, Vol. 101, p. 5547-5552. COMP-Ang1이라고도 칭한다.)와 Tie2의 결합 저해를 평가했다. COMP-Ang1은 Tie2로의 결합에 관여하지 않는 부위를 개변한 Ang-1 개변체이며, Tie2로의 결합능을 유지하고 있는 것(Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, Vol. 101, p. 5547-5552) 및 Ang-1과 Ang-2는 Tie2의 동일한 부위에 같은 정도의 친화성으로 결합하는 것(Science, 1997, Vol. 277, p. 55-60)으로부터, COMP-Ang1로의 길항 작용을 평가함으로써, Ang-2로의 길항 작용을 평가할 수 있다.
COMP-Ang1의 발현 벡터를 HEK293 세포에 도입했다. 당해 HEK293 세포의 배양 상청으로부터 COMP-Ang1을 정제하고, 비오틴 표지했다. 재조합 인간 Tie2-Fc 키메라 단백질로 고상화한 플레이트에, 상기의 비오틴 표지한 COMP-Ang1과 실시예 1에서 얻은 정제 항체를 혼화하여 첨가했다. 결합한 비오틴 표지 COMP-Ang1의 검출에는 스트렙트아비딘 표지 HRP를 이용했다. TMB 발색 시약(Dako사, S1599)을 첨가하여 정치한 후, 2M 황산을 가하여 반응을 정지시켜, 450nm의 흡광도를 측정했다. 이것에 의해, 항체의 COMP-Ang1로의 길항 작용을 평가했다.
(실시예 4: 인간 Tie2 발현 BaF3 세포를 이용한 항아포토시스 활성 평가)
인간 Tie2를 안정적으로 발현하는 마우스 프로 B 세포주 BaF3 세포(이하, 인간 Tie2 발현 BaF3 세포라고 칭한다)는, Immunity, 1998, Vol. 9, p. 677-686에 기재된 방법에 따라, 서열 번호 21에서 나타나는 인간 Tie2 유전자를 포함하는 플라스미드를 당해 세포에 일렉트로포레이션으로 도입함으로써 제작했다. 이후, 동 세포를 이용하여, 항체의 항아포토시스 활성을 평가했다.
인간 Tie2 발현 BaF3 세포를 0.05% 소 태아 혈청 함유 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지즈사)에서 2x105cells/mL로 현탁하여, 부유 세포용 96웰 플레이트(스미토모베이클라이트사, MS-8096R)에 1웰당 80μL 파종했다. 그 후, 실시예 1에서 얻은 정제 항체 또는 Ang-1을 20μL 첨가했다. 37℃로 설정한 CO2 인큐베이터에서 72시간 배양한 후, 백색 96웰 플레이트(Nunc사, 236108)에 세포 현탁액 50μL를 옮겼다. 세포내 ATP 정량 키트 CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega사)에 따라, 첨부된 완충액으로 희석한 기질 용액 50μL를 세포 현탁액에 첨가함으로써, 세포의 생존능을 측정했다. 생존능을 측정함으로써 항아포토시스 활성을 평가했다.
실시예 2∼4의 결과, 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 Tie2에 대한 결합 활성, COMP-Ang1 길항 활성, 및 항아포토시스 활성을 갖는 항체를 복수 발견했다. 후술하는 2-16이라고 명명한 항인간 Tie2 항체를 포함하는 정제 항체 용액은, 실시예 4에 있어서, Ang-1과 같은 정도의 항아포토시스 활성을 나타내고 있었지만, 마우스 항인간 Tie2 항체 15B8(특허문헌 1)을 포함하는 정제 항체 용액은 Ang-1의 60% 정도의 최대 활성밖에 나타내지 않았다.
(실시예 5: 사이즈 배제 크로마토그래피 및 전기영동을 이용한 정제 항체 용액의 해석)
전술한 실시예 2∼4에서 동정한 정제 항체 용액을 사이즈 배제 크로마토그래피로 해석했다. 그 결과, 각 정제 항체 용액으로부터 3개의 프랙션이 검출되었다. 각 프랙션 용액을 전기영동으로 해석한 결과, 각 프랙션에는 항체의 단량체, 2량체, 및 3량체 이상의 다량체가 각각 포함되어 있다는 것이 분명해졌다.
다음에 각 프랙션 용액에 대해 실시예 4에 나타내는 방법으로 항아포토시스 활성을 평가했다. 그 결과, 2량체를 포함하는 프랙션 및 3량체 이상의 다량체를 포함하는 프랙션에 있어서, 강력한 항아포토시스 활성이 인정되었다. 한편, 단량체를 포함하는 프랙션에는 항아포토시스 활성은 거의 인정되지 않았다. 15B8도 상기와 마찬가지로 사이즈 배제 크로마토그래피로 해석한 결과, 2량체 이상의 다량체를 나타내는 프랙션이 검출되었지만, 단량체의 프랙션은 거의 검출되지 않았다.
이상으로부터, 실시예 2∼4에서 동정한 어떤 항체에 대해서도, 2량체 이상의 다량체화한 항체를 포함하는 프랙션에 강력한 항아포토시스 활성이 포함되어 있다는 것이 분명해졌다. 2량체를 형성한 항체는 4가 항체가 되므로, 4가 이상의 가수를 갖는 항체가 인간 Tie2 활성화를 통한 강력한 항아포토시스 활성을 갖는다는 것이 시사되었다.
(실시예 6: 가교 항체에 의한 항아포토시스 활성 평가)
실시예 5의 검토로부터, 항인간 Tie2 항체의 가수가 4가 이상인 것이 Tie2를 통한 항아포토시스 활성을 유도하는데 중요하다고 생각되었다. 그래서, 항마우스 IgG 항체로 가교함으로써 다량화한 항인간 Tie2 항체의 항아포토시스 활성을 평가했다. 세포로서 인간 Tie2 발현 BaF3 세포 및 내재적으로 인간 Tie2를 발현하고 있는 인간 혈관 내피 세포 HUVEC를 이용했다.
인간 Tie2 발현 BaF3 세포는 RPMI1640 배지에서, HUVEC는 EBM-2 무혈청 배지(론더사)에서 각각 배양하여, 실시예 2∼4에서 동정한 항인간 Tie2 항체를 포함하는 정제 항체 용액을 첨가했다. 추가로 항마우스 IgG 항체를 첨가하여, 항체를 가교시켰다. CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay를 이용하여 세포의 생존능을 측정했다. 생존능을 측정함으로써 항아포토시스 활성을 평가했다.
그 결과, 2-16이라고 명명한 항인간 Tie2 항체(키메라 항체)의 가교 항체가, 인간 Tie2에 대해서 강력한 항아포토시스 활성을 갖는다는 것을 발견했다.
(실시예 7: 2가의 항인간 Tie2 항체의 서열 결정)
항인간 Tie2 항체 2-16을 산생하는 하이브리도마로부터 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자를 클로닝하여, 서열 결정했다.
항체의 서열 결정 후, 항체의 물성 및 안정성 향상을 위해, 2-16의 경쇄 및 중쇄의 프레임 워크 영역(FR)을 다른 인간 항체의 FR로 치환하여, 개변형의 항인간 Tie2 항체 2-16A2의 가변 영역을 제작했다.
2-16A2의 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505)을 인코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igγ1 정상 영역 유전자(서열 번호 11의 염기번호 367에서 1356까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결하고, 이 중쇄 유전자를 GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 또한 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에는 시그널 서열(Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505)을 인코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자(서열 번호 3의 염기번호 340에서 657까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결하고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4에 삽입했다. 제작한 항체의 중쇄 유전자 서열 및 경쇄 유전자 서열을 시퀀서로 해석했다.
제작한 2-16A2의 완전 인간형 항체(완전 인간형 2-16A2)의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 11에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 12에, 해당 항체의 경쇄의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. 서열 번호 12에 나타나는 중쇄의 가변 영역은, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 서열 번호 4에 나타나는 경쇄의 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
완전 인간형 2-16A2의 중쇄와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 GS 벡터를 이용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항체 발현을 행했다. 일과성 발현에 대해서는, FreeStyle 293 Expression medium(Invitrogen사)에서 약 100만 cells/mL로 배양된 FreeStyle 293 세포(Invitrogen사)에 대해, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양 발현 벡터를 유전자 도입 시약 293 펙틴(Invitrogen사)을 이용하여 트랜스펙트하고, 5일간 배양했다. 또는, Expi 293 Expression medium(Invitrogen사)에서 약 300만 cells/mL로 배양된 Expi 293 세포(Invitrogen사)에 대해, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양 발현 벡터를 유전자 도입 키트 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Invitrogen사)를 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 또는, CD-CHO medium(Invitrogen사)에서 약 1000만 cells/mL로 배양된 CHO-K1SV 세포(Lonza사)에 대해서, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양 발현 벡터를 일렉트로포레이션법을 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 각 배양 상청을 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼(GE 헬스케어사)을 이용하여 정제하여, 완전 인간형 항체의 정제 항체를 얻었다. 항상적 발현에 대해서는, 항체의 중쇄와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 GS 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, 라이게이션용 키트 Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE사) 또는 라이게이션 시약 Ligation high Ver. 2(TOYOBO사)를 이용하여 라이게이션을 행하여, 중쇄와 경쇄의 양 유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축했다. 이 발현 벡터의 CHO-K1SV 세포로의 트랜스펙션에 의해 항체를 발현시켰다. 배양 상청을 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼 또는 MabSelect SuRe(GE 헬스케어사, 17-5438-02)로 정제하여, 완전 인간형 항체의 정제 항체를 얻었다.
(실시예 8: 4가의 항인간 Tie2 항체의 제작)
4가의 항인간 Tie2 항체를 제작했다. 본 실시예에서 제작한 4가 항체는, 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는, 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있다. 각 경쇄는, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함한다. 본 4가 항체의 포맷을 도 1에 나타낸다.
완전 인간형 2-16A2의 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조(서열 번호 12의 아미노산 번호 1에서 220까지의 아미노산 서열로 이루어지는)의 C말단에 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 통하여 완전 인간형 2-16A2 중쇄의 N말단과 연결한 4가의 항인간 Tie2 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자를 제작했다. 당해 중쇄 유전자의 5'측에 시그널 서열(Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505)을 인코딩하는 유전자를 연결하고, GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 당해 중쇄 벡터와 실시예 7에서 제작한 완전 인간형 2-16A2의 경쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE12.4를 조합하고, 실시예 7에 기재된 항체의 발현 및 정제법과 마찬가지의 방법을 이용하여, 4가의 항인간 Tie2 항체를 제작했다. 당해 항인간 Tie2 항체를 TIE-1-Igγ1-WT라고 칭한다.
TIE-1-Igγ1-WT의 중쇄에 있어서의 정상 영역을, S228P 및 L235E의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ4 정상 영역(서열 번호 10의 아미노산 번호 123에서 220까지의 아미노산 서열, 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 350에서 676까지의 아미노산 서열로 이루어진다.)으로 치환한 4가의 항인간 Tie2 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자를 제작했다. 당해 중쇄 유전자의 5'측에 시그널 서열(ProteinEngineering, 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505)을 인코딩하는 유전자를 연결하고, GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 당해 중쇄 벡터와 실시예 7에서 제작한 완전 인간형 2-16A2의 경쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE12.4를 조합하고, 실시예 7에 기재된 항체의 발현 및 정제법과 마찬가지의 방법을 이용하여, 4가의 항인간 Tie2 항체를 제작했다. 당해 항인간 Tie2 항체를 TIE-1-Igγ4-PE라고 칭한다.
TIE-1-Igγ1-WT의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 7에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 8에 각각 나타낸다. TIE-1-Igγ4―PE의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 9에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 10에 각각 나타낸다. 양 항체의 경쇄는 완전 인간형 2-16A2의 경쇄와 동일하고, 해당 항체의 경쇄의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다.
마찬가지의 방법을 이용하여, TIE-1-Igγ1-WT의 중쇄의 정상 영역에 L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 도입한 4가의 항인간 Tie2 항체(TIE-1-Igγ1-LALA라고 칭한다), 및 TIE-1-Igγ1-WT의 중쇄의 정상 영역에 L234A, L235A, P331S, 및 I253A의 아미노산 변이를 도입한 4가의 항인간 Tie2 항체(TIE-1-Igγ1-I253A라고 칭한다)를 제작했다.
TIE-1-Igγ1-LALA의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에 각각 나타낸다. TIE-1-Igγ1-I253A의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 5에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 6에 각각 나타낸다. 양 항체의 경쇄는 완전 인간형 2-16A2의 경쇄와 동일하고, 해당 항체의 경쇄의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다.
서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10에 나타나는 상기 4종의 4가 항인간 Tie2 항체 중쇄의 가변 영역은 공통이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35, 50에서 66, 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열 번호 4에 나타나는 상기 4종의 4가 항인간 Tie2 항체의 경쇄의 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39, 55에서 61, 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
정제한 TIE-1-Igγ1-LALA의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제 항체의 대부분에 있어서, 중쇄 C말단의 리신 결실이 생기고 있었다.
추가로, 마찬가지의 방법을 이용하여, TIE-1-Igγ1-WT 및 TIE-1-Igγ4-PE에 관해서, 링커(서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는)를 다른 링커(TIE-1-Igγ1-WT에 관해서는 서열 번호 17∼20에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 4종의 링커, TIE-1-Igγ4-PE에 관해서는 서열 번호 14∼20에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 7종의 링커)로 각각 치환한 4가의 항인간 Tie2 항체(합계 11종)를 제작했다. 7 아미노산(서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 링커)에서 64 아미노산(서열 번호 20에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 링커)까지의 길이를 가지는 링커를 검토했다.
실시예 4의 방법에 따라 TIE-1-Igγ1-WT, TIE-1-Igγ4-PE, 및 링커를 치환한 11종의 항체를 평가한 결과, 어느 항인간 Tie2 항체도 같은 정도의 항아포토시스 활성을 나타낸다는 것이 분명해졌다.
(실시예 9: 2가의 항인간 Tie2 항체 및 4가의 항인간 Tie2 항체의 항아포토시스 작용 평가)
실시예 5의 결과로부터, 4가 이상의 가수를 갖는 항체가 인간 Tie2 활성화를 통한 강력한 항아포토시스 활성을 갖는다는 것이 시사되었다. 그래서, 인간 Tie2 발현 BaF3 세포에 대한 항아포토시스 작용을 지표로 하여 2가의 항인간 Tie2 항체 및 4가의 항인간 Tie2 항체의 약효를 비교했다.
실시예 4의 방법에 따라, 2가 항체인 완전 인간형 2-16A2 및 4가 항체인 TIE-1-Igγ1-WT를 이용하여, 인간 Tie2 발현 BaF3 세포에 대한 항아포토시스 작용을 평가했다. 피험 항체인 완전 인간형 2-16A2 및 TIE-1-Igγ1-WT는, MabSelect SuRe로 정제 후, 사이즈 배제 크로마토그래피로 단량체 획분으로 분획하여, 각각 99.98% 및 99.74%의 단량체 순도로서 취득했다. 각 항체를 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 5ng/mL로부터 5000ng/mL까지 약 3배 공비로 7단계 희석하여, 1웰당 20μL 첨가했다. 컨트롤로서 피험 항체 대신에 PBS, 또는 PBS로 희석한 Ang-1(R＆D사, 923-AN-025/CF. 최종 농도 1ng/mL로부터 1000ng/mL까지의 약 3배 공비로 7단계 희석)을 첨가한 웰을 각각 준비했다. 피험 항체의 각 농도에 있어서의 항아포토시스 활성을 산출함에 있어서, 피험 항체 대신에 PBS를 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 피험 항체 대신에 Ang-1을 300ng/mL 및 1000ng/mL를 각각 첨가한 웰의 측정치의 평균치를 100%로 설정했다. 산출된 항아포토시스 활성을 해석하여, Sigmoid-Emax 모델 비선형 회귀 분석에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출했다.
표 1: 2가의 항인간 Tie2 항체 및 4가의 항인간 Tie2 항체의 항아포토시스 활성
Figure 112017003931413-pct00001
그 결과, 4가 항체인 TIE-1-Igγ1-WT가 강력한 항아포토시스 작용을 가지고 있는 것이 분명해졌다. 이상으로부터, 4가 항체가 2가 항체보다 우수난 항아포토시스 활성을 갖는다는 것이 분명해졌다.
(실시예 10: 2가의 항인간 Tie2 항체 및 4가의 항인간 Tie2 항체의 래트 혈관 투과성 저해 작용 평가)
머스타드 오일 유발 혈관 투과성 모델은, 혈장 누출 평가계로서 널리 사용되고 있는 Miles assay(J. Physiol., 1952, Vol. 118, p. 228-257)에 변경을 가한 것으로, 본 모델에 있어서 Ang-1이 혈관 투과성 항진을 저해한다는 것이 보고되어 있다(Nature Medicine, 2000, Vol. 6, p. 460-463). 그래서, 2가의 항인간 Tie2 항체 및 4가의 항인간 Tie2 항체의 혈관 투과성 저해 작용을 비교하기 위해서, 본 모델을 이용하여, 완전 인간형 2-16A2 및 TIE-1-Igγ1-WT를 평가했다.
SD 래트(수컷, 4-5주령, 닛폰 찰스 리버사)에게 PBS로 희석한 완전 인간형 2-16A2 또는 TIE-1-Igγ1-WT를 피하 투여했다. 처치군을 이하와 같이 설정했다.
[처치군(각 군 6마리)]
Vehicle군:
항체 대신에 PBS를 투여한 군
완전 인간형 2-16A2 투여군:
완전 인간형 2-16A2를 투여한 군(0.3mg/kg)
TIE-1-Igγ1-WT 투여군:
TIE-1-Igγ1-WT를 투여한 군(0.3mg/kg)
항체 투여 48시간 후에, 생리 식염수에 용해한 에반스 블루 색소(45mg/kg, 시그마 알드리치사, E2129)를 정맥내 투여하고, 직후에 미네랄 오일(시그마 알드리치사, M8410)로 5%로 희석한 아이소싸이오사이안산 알릴(머스타드 오일이라고도 칭한다. 나카라이테스크사, 01415-92)을 한쪽 귀에, 반대쪽 귀에는 미네랄 오일을 각 20μL 도포했다. 30분 후에 양 귀를 채재(採材)하여, 중량을 측정 후, 1mL의 폼아마이드에 침지하고, 70℃에서 하룻밤 인큐베이트하는 것에 의해, 귀 조직 중의 에반스 블루 색소를 추출했다. 추출액의 흡광도(측정 파장 620nm, 대조 파장 740nm)로부터 에반스 블루 색소 농도를 구하여 추출액 중의 에반 블루 색소량을 산출했다. 그 후, 에반스 블루 색소량을 귀 중량으로 나누는 것에 의해 귀 중량당의 색소 누출량을 산출했다. 동일 개체의 머스타드 오일 도포 귀의 에반스 블루 색소 누출량으로부터 미네랄 오일 도포 귀의 에반스 블루 색소 누출량을 뺀 값을 최종적인 각 개체의 에반스 블루 색소 누출량으로서 산출했다. 당해 에반스 블루 색소 누출량을 혈관 투과성의 지표로서 사용했다. 결과를 도 2에 나타낸다.
각 군의 평균치 및 표준 오차를 구했다. Vehicle군과 각 항체 투여군 사이의 유의차 검정에는 Student의 t 검정을 이용했다. p＜0.05인 경우를 유의차 있음으로 했다.
도 2에서 나타내는 바와 같이, Vehicle군과 비교하여, 2가 항체인 완전 인간형 2-16A2는 색소 누출을 저해하지 않았지만, 4가 항체인 TIE-1-Igγ1-WT는 색소 누출을 유의하게 저해했다. 4가 항체인 TIE-1-Igγ1-WT가 혈관 투과성 항진을 저해한다는 것이 분명해졌다. 이상으로부터, 4가 항체가 2가 항체보다 우수한 혈관 투과성 항진 저해 작용을 갖는다는 것이 분명해졌다.
실시예 9 및 10의 결과로부터, 4가의 항Tie2 항체가 Tie2를 통한 작용을 강력하게 유도한다는 것이 분명해졌다.
(실시예 11: 4가의 항인간 Tie2 항체의 항아포토시스 작용 평가(2))
TIE-1-Igγ1-LALA 및 TIE-1-Igγ1-I253A에 대해, 실시예 9의 방법에 따라, 인간 Tie2 발현 BaF3 세포에 대한 항체의 항아포토시스 활성을 평가했다. 실시예 9와 동일한 항체 농도 범위에서 각 4가 항인간 Tie2 항체의 평가를 행했다. 단, Ang-1의 100, 300 및 1000ng/mL를 각각 첨가한 웰의 측정치의 평균치를 100%로 하여 각 항체의 EC50치 및 항아포토시스 활성의 최대 활성을 평가했다.
표 2: 각 4가 항인간 Tie2 항체의 항아포토시스 활성
Figure 112017003931413-pct00002
그 결과, TIE-1-Igγ1-LALA 및 TIE-1-Igγ1-I253A 모두 Ang-1과 같은 정도의 항아포토시스 활성을 나타낸다는 것이 분명해졌다.
(참고예 1: 15B8의 항아포토시스 작용 평가)
15B8에 대해, 실시예 9의 방법에 따라, 인간 Tie2 발현 BaF3 세포에 대한 항아포토시스 활성을 평가했다. 실시예 9와 동일한 항체 농도 범위에서 15B8(특허문헌 1)의 평가를 행했다. Ang-2(R＆D사, 623-AN-025)는 Ang-1과 마찬가지로 평가를 행했다. 단, Ang-1의 1000ng/mL를 첨가한 웰의 측정치의 평균치를 100%로 하여 EC50치 및 항아포토시스 활성의 최대 활성을 평가했다.
표 3: 15B8의 항아포토시스 활성
Figure 112017003931413-pct00003
그 결과, 15B8의 항아포토시스 활성은 Ang-1의 64% 정도로, Ang-2와 같은 정도의 활성이라는 것이 분명해졌다.
실시예 11의 결과와 합하면, TIE-1-Igγ1-LALA는 Ang-1과 같은 정도의 항아포토시스 활성을 나타내는데 반해, 15B8은 Ang-2와 같은 정도의 부분적인 항아포토시스 활성밖에 나타내지 않는다는 것이 분명해졌다.
(실시예 12: TIE-1-Igγ1-LALA의 Tie2에 대한 결합 활성 평가)
TIE-1-Igγ1-LALA에 대해, 각종 Tie2 단백질에 대한 결합 활성을 평가했다. 재조합 인간 Tie2-Fc 키메라 단백질(R＆D사, 313-TI-100), 재조합 원숭이 Tie2-Fc 키메라 단백질(Sino Biological사, 90292-C02H), 재조합 래트 Tie2-Fc 키메라 단백질(R＆D사, 3874-T2-100) 또는 재조합 마우스 Tie2-Fc 키메라 단백질(R＆D사, 762-T2-100)을 PBS로 1μg/mL로 조제하여, 백색 맥시소프 384웰 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 20μL 첨가하고, 하룻밤 4℃에서 인큐베이트함으로써 고상화했다. 다음날 고상액을 제거하고, 20%의 Blocking One(나카라이테스크사, 03953-95)을 포함하는 트리스 완충 생리 식염수(TBS)-0.05% Tween(Wako사, 310-7375)(이하, TBS-T 용액이라고 칭한다)을 1웰당 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 정치했다. 피험 항체로서 TIE-1-Igγ1-LALA를, 5%의 Blocking One을 포함하는 TBS-T 용액을 이용하여 0.03ng/mL로부터 100ng/mL까지 약 3배 공비로 8단계 희석하여, 1웰당 20μL 첨가했다. 컨트롤로서 피험 항체 대신에 TBS-T 용액을 첨가한 웰을 준비했다. 실온에서 1.5시간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 세정했다. 2차 항체로서 비오틴 표지한 항인간 카파 경쇄 항체(면역생물연구소, 17249)를 5%의 Blocking One을 포함하는 TBS-T 용액으로 0.1μg/mL로 희석하여, 1웰당 20μL 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 세정하고, 5%의 Blocking One을 포함하는 TBS-T 용액으로 0.1μg/mL로 희석한 알칼리포스파타제 표지 스트렙트아비딘(Thermo Fisher Scientific사, 21324)을 검출 시약으로서 1웰당 20μL 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 세정하고, 1mM MgCl2 함유 20mM TBS(pH 9.8)로 5배 희석한 Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)(BioFX사, APU4-0100-01)를 기질로서 20μL 첨가했다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, EnVisionTM 멀티 라벨 카운터(PerkinElmer사)로 발광 강도를 측정했다. 산출된 결합 활성을 해석하여, Sigmoid-Emax 모델 비선형 회귀 분석에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출했다.
표 4: TIE-1-Igγ1-LALA의 결합 활성
Figure 112017003931413-pct00004
그 결과, TIE-1-Igγ1-LALA는 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 Tie2에 대해서 같은 정도의 높은 결합 활성을 갖는다는 것이 분명해졌다.
(참고예 2: 15B8의 Tie2에 대한 결합 활성 평가)
실시예 12의 방법에 따라, 15B8의 각종 Tie2 단백질에 대한 결합 활성을 평가했다. 단, 2차 항체로서 HRP 표지 항마우스 카파 경쇄 항체(SouthernBiotech사, 1050-05)를 사용하고, 기질로서 TMB 발색 시약을 사용하고, 측정기로서 ARVO 멀티 라벨 리더(PerkinElmer사)를 이용하여 450nm의 흡광도를 측정했다. 또한, 피험 항체로서 15B8을 사용하고, 항체 농도는 1000ng/mL로부터 0.3ng/mL까지 약 3배 공비(8단계 희석)로 실시했다. 산출된 결합 활성을 해석하여, Sigmoid-Emax 모델 비선형 회귀 분석에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출했다(표 5).
표 5: 15B8의 결합 활성
Figure 112017003931413-pct00005
그 결과, 15B8은 인간 및 원숭이 Tie2에 대한 결합 활성이 인정되었지만, 래트 및 마우스 Tie2에 대한 결합 활성은 극히 약하다는 것이 분명해졌다.
실시예 12의 결과로부터, TIE-1-Igγ1-LALA는 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 Tie2에 대해서, 종차 없이 높은 결합 활성이 인정되었다. 한편, 15B8은 결합 활성에 대해 종차가 인정되었다. 이상으로부터, TIE-1-Igγ1-LALA의 인간 Tie2 에피토프는 15B8의 에피토프와는 상이하다는 것이 시사되었다.
(실시예 13: TIE-1-Igγ1-LALA의 래트 혈관 투과성 저해 작용 평가)
실시예 10의 방법에 따라, TIE-1-Igγ1-LALA의 래트 혈관 투과성 저해 작용을 평가했다. 단, 피험 항체로서 TIE-1-Igγ1-LALA를 사용하고, 항체 투여 용량을 0.1 및 0.3mg/kg으로 실시했다. 결과를 도 3에 나타낸다.
각 군의 평균치 및 표준 오차를 구했다. Vehicle군과 각 항체 투여군 사이의 유의차 검정에는 Dunnett의 다중 비교 검정을 이용했다. p＜0.05인 경우를 유의차 있음으로 했다.
도 3에서 나타내는 바와 같이, Vehicle군과 비교하여, TIE-1-Igγ1-LALA는 색소 누출을 유의하게 저해했다. 이상으로부터, TIE-1-Igγ1-LALA는 혈관 투과성 항진을 저해한다는 것이 분명해졌다.
(실시예 14: 주피세포 탈락 마우스 망막 부종에 대한 저해 작용)
당뇨병성 망막증 환자의 망막 혈관에 있어서, 주피세포의 탈락은 특징적인 병변의 하나이다(Retina, 2013, Fifth edition, p. 925-939). 당뇨병 망막증 연구 에 있어서는, 스트렙토조토신 유발 당뇨병 래트 모델이 널리 사용되고 있지만, 주피세포의 탈락이 관찰될 때까지는 수개월의 기간을 필요로 하는 것이나, 주피세포의 탈락이 그 성인의 하나로 되어 있는 미세혈관류는 관찰되지 않는 것, 주피세포와 내피세포의 비율이 인간과는 다른 것(Retina, 2013, Fifth edition, p. 925-939), 및 분명한 망막 부종이 관찰되지 않는 것 등에서, 이 모델의 유용성에는 일정한 한계가 있다(Diabetes Metab. J., 2013, Vol. 37, p. 217-224). 한편, 항PDGF 수용체β(PDGFRβ) 항체 투여에 의해 주피세포를 탈락한 망막 혈관을 갖는 마우스에서는, 고혈당은 아니지만 망막 혈관의 확장이나 망막의 부종, 출혈 등, 당뇨병 망막증 및 당뇨병 황반부종과 유사한 병변이 관찰된 것으로부터, 주피세포의 탈락과 당뇨병 망막증 및 당뇨병 황반부종에 있어서의 혈관 취약화의 관련이 보고되고 있다(J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, p. 1619-1628). 따라서, 당뇨병 망막증 환자에게 특징적인 병변인 주피세포의 탈락을 나타내는 병태 모델을 이용하여 망막 부종에 대한 저해 작용을 평가하는 것은, 당뇨병 망막증 및 당뇨병 황반부종에 대한 유효성을 평가하기 위해서 유용하다.
주피세포 탈락 유발 망막 부종은, J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, p. 1619-1628에서 보고된 방법을 일부 개변하여 유도했다. 즉, 생후 2일령 C57BL/6J 마우스(닛폰 찰스 리버사)에 PBS로 희석한 항PDGFRβ 모노클로널 항체 1B3(국제 공개 제2008/130704호)을 25mg/kg 피하 투여하여, 망막 혈관 주피세포의 탈락을 야기했다.
[처치군]
Control군(Cont.군이라고도 칭한다): 17마리
항PDGFRβ 항체를 투여하지 않고, PBS를 투여한 군
Vehicle군(Veh.군이라고도 칭한다): 24마리
항PDGFRβ 항체를 투여하고, TIE-1-Igγ1-LALA 대신에 PBS를 투여한 군
TIE-1-Igγ1-LALA군(0.1, 0.3 및 1mg/kg): 각각 23, 21 및 21마리
항PDGFRβ 항체를 투여하고, TIE-1-Igγ1-LALA를 각 용량 투여한 군
항PDGFRβ 항체 투여 90분 전에, PBS로 희석한 TIE-1-Igγ1-LALA를 0.1, 0.3 및 1mg/kg 피하 투여했다. 항체 투여 1주일 후에 망막 부종을 평가했다. 구체적으로는, 안구를 적출하여, 1% 글루타르알데하이드 및 2.5% 폼알린 함유 용액으로 고정 후, 파라핀 포매 박절 절편을 제작했다. 헤마톡실린 에오신 염색한 표본을 버추얼 슬라이드 스캐너(NanoZoomer XR, Hamamatsu Photonics사)로 화상 데이터로 변환했다. 본 병태 모델에서는 망막 신경 섬유층(NFL)에 있어서의 망막 부종이 보고되어 있으므로(J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, p. 1619-1628), NFL 및 그것에 인접하는 망막 신경절 세포층의 면적을 NPD view2(Hamamatsu Photonics사)로 측정함으로써, 망막 부종으로서 정량화했다. 결과를 도 4에 나타낸다.
각 군의 평균치 및 표준 오차를 구했다. Veh.군과 TIE-1-Igγ1-LALA군 사이의 유의차 검정에는 Dunnett의 다중 비교 검정을 이용했다. Cont.군과 Veh.군 사이의 유의차 검정에는 Student의 t 검정을 이용했다. 어느 경우에도, p＜0.05인 경우를 유의차 있음으로 했다.
도 4에서 나타내는 바와 같이, Veh.군과 비교하여, TIE-1-Igγ1-LALA군(1mg/kg)은 주피세포가 탈락한 망막 혈관을 갖는 망막 부종을 유의하게 저해한다는 것이 분명해졌다. TIE-1-Igγ1-LALA는, 주피세포가 탈락한 망막 혈관에 의해 생기는 망막 부종을 저해하므로, 당뇨병 황반부종 및 당뇨병 망막증에 대해서 유효하다고 하는 것이 시사되었다.
(실시예 15: 후지 허혈 마우스 허혈지 혈류 개선 작용)
후지 허혈 모델은, 편측 후지의 혈관을 결찰 및 적출하는 것에 의해 후지 조직의 허혈을 야기시키는 모델이며, 허혈 증상의 개선을 평가하는 대표적인 모델이다(J. Vasc. Surg., 2012, Vol. 56, p. 1669-1679).
10주령 C57BL/6J 마우스(닛폰 클레어사)에 왼쪽 후지의 대퇴 동정맥의 서경부 및 복재 동정맥을 결찰했다. 또한, 그 사이의 분지 혈관을 결찰한 후, 결찰부 사이의 혈관을 적출했다. 수술은 펜토바르비탈 나트륨(60mg/kg, 도쿄화성공업) 마취하에서 실시했다. 혈관 적출 1주일 후에, 펜토바르비탈 마취하에서 레이저 도플러 혈류 화상화 장치 MoorLDI2(Moor Instruments사)를 이용하여, 후지의 혈류를 측정했다. 시술지의 혈류 저하를 확인한 후, 처치군을 이하와 같이 설정했다.
[처치군(각 군 10마리)]
대조군:
항체 대신에 PBS를 투여한 군
TIE-1-Igγ1-LALA군(1mg/kg):
TIE-1-Igγ1-LALA를 투여한 군
PBS로 희석한 TIE-1-Igγ1-LALA를 1mg/kg 피하 투여하고, 항체 투여 1주일 후의 정상지 및 허혈지의 피부 혈류량을 측정했다. 구체적으로는, 펜토바르비탈 나트륨(60mg/kg)을 복강내 투여하고, 보온대에 놓고, 마취 투여 15분 후에 발의 피부 혈류를 측정했다. 족저부를 관심 영역(Region of interest: ROI)으로 하여 혈류량을 계측한 결과를 도 5에 나타낸다.
각 군의 평균치 및 표준 오차를 구했다. 대조군과 TIE-1-Igγ1-LALA군 사이의 유의차 검정에는 Student의 t 검정을 이용했다. p＜0.05인 경우를 유의차 있음으로 했다.
도 5에서 나타내는 바와 같이, 대조군과 비교하여, TIE-1-Igγ1-LALA군은 정상지 및 허혈지의 혈류량을 유의하게 개선한다는 것이 분명해졌다. 따라서, TIE-1-Igγ1-LALA의 중증 하지허혈 등의 말초 동맥 질환에 대한 유효성이 시사되었다.
(실시예 16: TIE-1-Igγ1-LALA의 에피토프 평가: 수소 중수소 교환 질량분석)
TIE-1-Igγ1-LALA의 인식 에피토프를 동정하기 위해서, 실시예 7에서 제작한 완전 인간형 2-16A2의 Fab(이하, 완전 인간형 2-16A2-Fab라고 칭한다)를 제작했다. 완전 인간형 2-16A2-Fab는 TIE-1-Igγ1-LALA와 동일한 가변 영역을 갖기 때문에, 이들 항체는 동일한 에피토프를 인식한다. 항원으로서, Accession No. NP_000450.2의 아미노산 번호 1에서 452로 이루어지는 인간 Tie2 단백질(이하, 인간 Tie2(1-452)로 칭한다)을 제작했다. 당해 아미노산 서열은 Ang-2의 Tie2 결합 부위를 동정할 때에 이용된 부위이다(Nat. Struct. Mol. Biol., Vol. 13, p. 524-532).
구체적으로는, 완전 인간형 2-16A2-Fab의 제작은, 완전 인간형 2-16A2의 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조(서열 번호 12의 아미노산 번호 1에서 221의 아미노산 서열로 이루어지는)를 인코딩하는 중쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE6.4와 완전 인간형 2-16A2의 경쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE12.4를 조합하고, 실시예 7에 기재된 항체의 발현 방법 및 정제 방법과 마찬가지의 방법을 이용하여, 완전 인간형 2-16A2-Fab를 제작했다.
인간 Tie2(1-452)를 얻기 위해서, 우선, 인간 Tie2(1-452)에 트롬빈 인식 서열(서열 번호 22에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는)을 링커로 하여 인간 Fc(서열 번호 23에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는)와 융합시킨 단백질(이하, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질이라고 칭한다)을 제작했다. 구체적으로는, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질을 인코딩하는 유전자를 GS 벡터 pEE12.4에 삽입하고, 실시예 7에 기재된 발현 방법 및 정제 방법과 마찬가지의 방법을 이용하여, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질을 제작했다. 다음에, 제작한 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질을, 22℃에서 트롬빈(GE 헬스케어사, 27-0846-01)과 16시간 인큐베이션하고, Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow(highsub)(GE 헬스케어사) 및 MabSelect SuRe에 의해 트롬빈 및 인간 Fc를 제거하고 Fc 부분을 절단함으로써, 인간 Tie2(1-452)를 제작했다.
에피토프 부위를 동정할 목적으로, NanoAQUITY UPLC HDX 시스템(Waters사)을 이용하여, 수소 중수소 교환 질량 분석(이하, H/D 교환 질량 분석이라고 칭한다. Anal. Bional. Chem., 2010, Vol. 397, p. 967-979)을 실시했다.
구체적으로는, 120mM 염화나트륨 함유 20mM 시트르산 완충액(pH 6)을 이용하여 완전 인간형 2-16A2-Fab 및 인간 Tie2(1-452) 혼합액(최종 농도는 각각 50μM 및 25μM)을 조제하여, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 대조로서 인간 Tie2(1-452)만을 120mM 염화나트륨 함유 20mM 시트르산 완충액(pH 6)으로 조제한 용액을 준비했다. 그 후, 중수(간토화학)로 조제한 PBS 완충 용액에 첨가하고, 20초간, 1분간, 10분간, 60분간 및 120분간 각각 정치함으로써, 중수소화를 실시했다. 계속해서 0℃에서 100mM 다이싸이오트레이톨(나카라이) 및 4M 구아니딘염산염(와코준야쿠) 함유 수용액(pH 2.5)을 가한 후에, 펩신 컬럼(Proszyme(등록상표) Immobilized Pepsin Cartridge, Applied Biosystems사)을 이용하여 소화를 실시하고, 트랩 컬럼(ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm VanGuard Pre-Column, Waters사)으로 소화된 펩타이드를 포착했다. 계속해서 C18 컬럼(AQUITY UPLC BEH C18 1.7μm, Waters사)을 이용한 역상 크로마토그래피로 분리하고, 질량분석기(SynaptG2-Si, Waters사)로 분자량을 측정했다. 검출된 모든 펩타이드의 중심치를 산출하고, 중수소 치환을 행한 인간 Tie2(1-452)만의 중심치와 비교하여, 중수소 치환이 일어나고 있는 변화량을 각각의 중수소화 시간으로 산출했다.
H/D 교환 질량 분석의 결과, Accession No. NP_000450.2의 아미노산 번호 27∼37, 29∼37, 29∼38, 43∼60, 82∼100, 98∼107, 111∼124, 116∼125, 116∼129, 119∼129, 189∼198 및 190∼198의 펩타이드가 항체 공존하에 있어서 중수소화가 억제되고 있다는 것이 나타났다. 이들 펩타이드의 중복된 영역을 정리하고, 또한 중수소화가 억제되어 있지 않은 펩타이드의 정보도 더하며, 추가로 N말단측의 2개의 아미노산은 측정 중에 용이하게 역교환이 일어나 버린다는(Proteins, 1993, Vol. 17, 75-86) 것을 고려하여, 중수소 치환이 억제된 영역, 즉 에피토프 후보 부위로서 Accession No. NP_000450.2의 아미노산 번호 29∼38, 84∼102, 113∼120, 126∼129 및 191∼198의 5개를 발견했다. 한편, H/D 교환 질량 분석의 결과는, TIE-1-Igγ1-LALA가 이들 5개의 아미노산 세그먼트로 이루어지는 영역과 상호작용한다는 것, 또는 항체 결합에 의한 입체 구조 변화 또는 알로스테릭 효과가 생기는 것에 의해 이들 잔기를 수소/중수소 교환으로부터 보호한다는 것을 보여주고 있다.
(실시예 17: TIE-1-Igγ1-LALA의 에피토프 평가: 표면 플라즈몬 공명 현상 해석 및 ELISA)
실시예 16의 H/D 교환 질량 분석으로부터 TIE-1-Igγ1-LALA의 인간 Tie2에 대한 에피토프 후보가 동정되었다. 더 상세하게 에피토프 부분을 추정하기 위해, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질의 아미노산 변이체를 제작하여, 표면 플라즈몬 공명 현상 해석(surface plasmon resonance: SPR 해석) 및 ELISA를 이용한 결합 활성을 평가했다.
H/D 교환 질량 분석의 결과, 및 Ang-1 및 Ang-2가 Tie2에 결합하는 영역의 보고(Nat. Struct. Mol. Biol., 2006, Vol. 13, p. 524-532. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, Vol. 110, 7205-7210)에 기초하여, 인간 Tie2(1-452)의 아미노산 변이체로서 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 중, 인간 Tie2(1-452)의 1개 내지 4개의 아미노산을 알라닌(일부 글루탐산)으로 치환한 아미노산 변이체를 23종류 제작했다(표 6). 각종 변이체는, 실시예 16에서 제작한 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질을 제작한 방법과 마찬가지의 방법으로 제작했다.
표 6: 변이체 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질
Figure 112017003931413-pct00006
제작한 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 변이체와 완전 인간형 2-16A2-Fab의 결합 활성을 평가하기 위해서, SPR 해석을 실시했다.
SPR 해석은, Biacore T200(GE 헬스케어사)을 이용했다. CM5 센서 팁에 Anti-human IgG(Fc) antibody(Human Antibody Capture Kit, GE 헬스케어사)를 고정했다. HBS-EP+ 버퍼(GE 헬스케어사)로 5μg/mL로 희석한 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 그 변이체를 각각 고상화하여, 캡처량을 계측했다. 그 후, HBS-EP+ 버퍼로 50nM로 희석한 완전 인간형 2-16A2-Fab를 첨가하여, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 변이체와의 결합량을 측정했다. 그리고, 결합량을 캡처량으로 나눔으로써, 단위 고상화 항원당의 항체의 결합량(이하, 결합 비율이라고 칭한다)을 산출했다. 3 시행의 산술 평균 및 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질의 결합 비율을 100%로 했을 때의 각 변이체의 결합 비율의 상대치를 표 7에 나타낸다. 또한, 대표적인 측정 데이터를 도 6에 나타낸다. Biacore에 있어서 결합량을 상대 비교하는 방법은, 예를 들어, Analytical Biochemistry, 2003, Vol. 312, p. 113-124에 기재되어 있다.
그 결과, 완전 인간형 2-16A2-Fab는 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질과 비교하여 인간 Tie2(1-452)g1-Fc, 인간 Tie2(1-452)g2-Fc, 인간 Tie2(1-452)g3-Fc, 인간 Tie2(1-452)g4-Fc, 인간 Tie2(1-452)g5-Fc, 인간 Tie2(1-452)m3-Fc, 인간 Tie2(1-452)A1-Fc, 인간 Tie2(1-452)A2-Fc, 인간 Tie2(1-452)A3-Fc 및 인간 Tie2(1-452)A4-Fc에 있어서 결합이 저하되었다는 것이 분명해졌다.
표 7: SPR 해석 결과
Figure 112017003931413-pct00007
TIE-1-Igγ1-LALA와 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 변이체와의 결합 활성을 평가하기 위해서, 실시예 12와 마찬가지의 방법으로 ELISA를 행했다.
인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 변이체를 PBS로 1μg/mL가 되도록 희석하여, 백색 맥시소프 384웰 플레이트에, 1웰당 20μL를 첨가하고, 하룻밤 4℃에서 인큐베이트함으로써 고상화했다. 다음날 고상액을 제거하고, TBS-T 용액으로 세정하고, BlockerTM Casein in TBS(Thermo Fisher Scientific사, 37532)를 50μL 첨가하고, 60분간 인큐베이트함으로써 블로킹을 행했다. TBS-T 용액으로 세정하고, 0.05% Tween20(나카라이테스크사, 28353-85) 함유 BlockerTM Casein in TBS를 이용하여 0.03ng/mL로부터 100ng/mL까지의 8단계로 희석한 TIE-1-Igγ1-LALA를 1웰당 20μL 첨가했다. 실온에서 90분간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 3회 세정하고, 0.05% Tween20 함유 BlockerTM Casein in TBS를 이용하여 0.1μg/mL로 희석한 비오틴 표지 항인간 카파 경쇄 항체를 20μL 첨가했다. 실온에서 60분간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 3회 세정하고, 0.05% Tween20 함유 BlockerTM Casein in TBS를 이용하여 0.1μg/mL로 희석한 알칼리포스파타제 표지 스트렙트아비딘을 20μL 첨가했다. 실온에서 60분간 인큐베이트한 후, TBS-T 용액으로 3회 세정하고, 1mM MgCl2 함유 20mM TBS(pH 9.8)로 5배 희석한 Chemiluminescent Ultra Sensitive AP Microwell and/or Membrane Substrate(450nm)를 기질로서 50μL 첨가했다. 차광 실온에서 40분간 인큐베이트한 후, EnVisionTM 멀티라벨 카운터로 발광 강도를 측정했다. 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 변이체에 대한 TIE-1-Igγ1-LALA의 EC50치를 산출했다. 또한, TIE-1-Igγ1-LALA가 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질에 결합했을 때의 수속치를 100%로 했을 때에, 최대 적용 농도인 100ng/mL TIE-1-Igγ1-LALA가 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질 및 23종의 각 변이체에 결합했을 때의 발광 강도의 상대치를 산출했다(표 8 및 표 9). 한편, EC50치 및 수속치는 Sigmoid-Emax 모델 비선형 회귀 분석에 의해 산출했다. 그래프를 도 7에 나타낸다.
그 결과, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질과 비교하여, 변이체인 Tie2(1-452)g1-Fc, Tie2(1-452)g2-Fc 및 Tie2(1-452)g4-Fc에 있어서 발광 강도의 상대치의 대폭적인 저하가 인정되었다. 또한, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질과 비교하여, Tie2(1-452)g5-Fc에 있어서, 발광 강도의 상대치의 저하 및 EC50치의 증대가 인정되었다. 이상으로부터, TIE-1-Igγ1-LALA는, 인간 Tie2(1-452)-Fc 키메라 단백질과 비교하여, Tie2(1-452)g1-Fc, Tie2(1-452)g2-Fc, Tie2(1-452)g4-Fc 및 Tie2(1-452)g5-Fc에 대한 결합 활성이 저하되었다는 것이 분명해졌다. 한편, Tie2(1-452)A1-Fc에 대해서는, 발광 강도의 상대치의 저하가 인정되었지만, EC50치에 차이가 인정되지 않았으므로, 결합 활성에 변화가 없다고 판단했다.
표 8: ELISA 결과
Figure 112017003931413-pct00008
표 9: ELISA 결과
Figure 112017003931413-pct00009
ELISA법과 SPR 해석법이라고 하는 독립한 2종류의 평가를 실시한 결과, 양방의 실험에서 모두 결합 활성이 저하된 변이체로서 Tie2(1-452)g1-Fc, Tie2(1-452)g2-Fc, Tie2(1-452)g4-Fc 및 Tie2(1-452)g5-Fc가 동정되었다. 따라서, 이들 변이체에 변이를 도입한 아미노산, 즉 아미노산 번호 192, 194, 195, 197 및 198이 TIE-1-Igγ1-LALA의 결합에 매우 중요한 에피토프 후보라고 생각되었다. 이 중, I194A, N197A 및 L198A의 아미노산 변이를 갖는 Tie2(1-452)g1-Fc는 ELISA법으로 결합 저하가 인정되었지만, I194A의 아미노산 변이를 갖는 Tie2(1-452)g3-Fc는 ELISA법에 있어서 결합 저하가 보이지 않았다. 또한, L198A의 아미노산 변이를 갖는 Tie2(1-452)g6-Fc는 ELISA법과 SPR 해석법의 양방에 있어서 결합 저하가 보이지 않았다. 이들 결과로부터, Tie2(1-452)g1-Fc의 결합 저하에 기여하는 것은 아미노산 번호 197이라고 생각되었다. 이상으로부터, TIE-1-Igγ1-LALA는, Accession No. NP_000450.2의 아미노산 번호 192, 195 및 197의 아미노산을 에피토프로서 결합하고 있다는 것이 분명해졌다.
본 발명의 항인간 Tie2 항체는, 각종 혈관 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포 및 항체를 생산하는 방법은, 상기 항인간 Tie2 항체를 생산하는데 유용하다.
이하의 서열목록의 숫자 표제＜223＞에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열목록의 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열은, TIE-1-Igγ1-LALA의 중쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 인코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열은, TIE-1-Igγ1-LALA, TIE-1-Igγ1-I253A, TIE-1-Igγ1-WT, TIE-1-Igγ4-PE, 및 완전 인간형 2-16A2의 경쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 3에 의해 인코딩되는 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열은, TIE-1-Igγ1-I253A의 중쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 5에 의해 인코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열은, TIE-1-Igγ1-WT의 중쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7에 의해 인코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열은, TIE-1-Igγ4-PE의 중쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 9에 의해 인코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열은, 완전 인간형 2-16A2의 중쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 11에 의해 인코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 13∼20에 나타나는 아미노산 서열은, 링커의 아미노산 서열이다. 서열 번호 22에 나타나는 아미노산 서열은, 트롬빈 인식 부위이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Novel anti-human Tie2 antibody <130> A15017A00 <150> JP2014-145135 <151> 2014-07-15 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2037 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of anti-human Tie2 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(2037) <400> 1 gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc gac gac tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc ggc atc tcc tgg aac tcc ggc tct atc gtg tac gcc gac tcc gtg 192 Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aac tcc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aag gac atc cgg gaa cag ctg gtg gaa gat gcc ttc gac atc tgg 336 Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg tcc tct gct tct acc aag ggc ccc 384 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 tcc gtg ttc cct ctg gcc cct tcc agc aag tct acc tct ggc ggc aca 432 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 gcc gct ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg aca 480 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 gtg tct tgg aac tct ggc gcc ctg aca tct ggc gtg cac acc ttc cct 528 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 gct gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tcc ctg tcc tcc gtc gtg act 576 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 gtg ccc tcc agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac 624 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 cac aag ccc tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc 672 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 tgc ggc agc gag gtg cag ctg gtg gaa agt ggg gga ggc ctg gtg cag 720 Cys Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 225 230 235 240 cca ggt gga agc ctg aga ctg agc tgc gcc gct tct ggc ttt acc ttt 768 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 245 250 255 gat gat tat gcc atg cat tgg gtg cgc cag gct cca ggg aaa ggc ctg 816 Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 260 265 270 gaa tgg gtg gca ggg atc agc tgg aac agc ggc agc atc gtg tat gct 864 Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala 275 280 285 gat agc gtg aag ggg cgc ttt aca atc agc aga gac aac agc aag aat 912 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 290 295 300 act ctg tac ctg cag atg aat agc ctg cgc gct gag gat aca gct gtg 960 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 305 310 315 320 tat tac tgt gcc aag gat att cgc gag cag ctg gtg gaa gat gct ttt 1008 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe 325 330 335 gat att tgg ggg cag ggt aca ctc gtg aca gtg tct agc gcc tcc acc 1056 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 340 345 350 aag ggc cca agc gtg ttc cca ctg gct ccc agc tcc aag agc acc tcc 1104 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 355 360 365 ggt gga act gct gcc ctg ggc tgt ctc gtg aaa gat tat ttt cct gag 1152 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 370 375 380 cct gtg act gtg tcc tgg aat agc ggc gct ctg acc agc gga gtg cat 1200 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 385 390 395 400 acc ttt cca gcc gtg ctg cag agc agc ggc ctg tat agc ctg tcc agc 1248 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 405 410 415 gtc gtg acc gtg cct tcc tct agc ctg gga aca cag aca tat atc tgt 1296 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 420 425 430 aat gtg aat cat aag ccc agt aat acc aaa gtg gat aag aaa gtg gaa 1344 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 435 440 445 cct aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt cct gcc cct 1392 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 450 455 460 gaa gct gct ggc ggc cct tct gtg ttt ctg ttc ccc cca aag cct aag 1440 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 465 470 475 480 gac acc ctg atg atc tcc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg 1488 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 485 490 495 gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac 1536 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 500 505 510 ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac 1584 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 515 520 525 aac tcc acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg aca gtg ctg cat cag gac 1632 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 530 535 540 tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg 1680 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 545 550 555 560 ccc gcc tcc atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag ccc cgg 1728 Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 565 570 575 gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc agg gac gag ctg acc aag 1776 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 580 585 590 aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat 1824 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 595 600 605 atc gcc gtg gaa tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac aac tat aag 1872 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 610 615 620 acc acc ccc cct gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttt ctg tac tcc 1920 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 625 630 635 640 aag ctg acc gtg gac aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc 1968 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 645 650 655 tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc 2016 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 660 665 670 ctg tcc ctg agc ccc ggc aaa 2037 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 675 <210> 2 <211> 679 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 245 250 255 Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 260 265 270 Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala 275 280 285 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 290 295 300 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 305 310 315 320 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe 325 330 335 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 340 345 350 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 355 360 365 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 370 375 380 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 385 390 395 400 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 405 410 415 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 420 425 430 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 435 440 445 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 450 455 460 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 465 470 475 480 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 485 490 495 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 500 505 510 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 515 520 525 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 530 535 540 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 545 550 555 560 Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 565 570 575 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 580 585 590 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 595 600 605 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 610 615 620 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 625 630 635 640 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 645 650 655 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 660 665 670 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 675 <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of anti-human Tie2 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 3 gac ata caa atg acc cag tct cca tcc tca ctt agt gcc tct gtt ggc 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gat aga gta act atc aca tgc cgg tcc tcc caa tct ctg ctg cat tcc 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 cac cgc tac aac tac ctg gac tgg tat cag cag aaa ccc ggc aaa gct 144 His Arg Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 ccc aag ctc ttg att tac ctg ggg tct aat agg gca agc ggt gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 agt cga ttc agc gga agc ggg agc ggc aca gat ttt aca ctc act atc 240 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 agt tca gtg cag cct gag gac ttc gcc acc tat tat tgt atg cag act 288 Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Thr 85 90 95 ctg cag acc cct ctg acc ttt ggt cag gga acc aag gtg gaa atc aag 336 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 384 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 432 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 480 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 528 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 acc tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 576 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 624 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 657 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 His Arg Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Thr 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser 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Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aag gac atc cgg gaa cag ctg gtg gaa gat gcc ttc gac atc tgg 336 Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg tcc tct gct tct acc aag ggc ccc 384 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 tcc gtg ttc cct ctg gcc cct tcc agc aag tct acc tct ggc ggc aca 432 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 gcc gct ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg aca 480 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 gtg tct tgg aac tct ggc gcc ctg aca tct ggc gtg cac acc ttc cct 528 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 gct gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tcc ctg tcc tcc gtc gtg act 576 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 gtg ccc tcc agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac 624 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 305 310 315 320 tat tac tgt gcc aag gat att cgc gag cag ctg gtg gaa gat gct ttt 1008 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Glu Gln Leu Val Glu Asp Ala Phe 325 330 335 gat att tgg ggg cag ggt aca ctc gtg aca gtg tct agc gcc tcc acc 1056 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 340 345 350 aag ggc cca agc gtg ttc cca ctg gct ccc agc tcc aag agc acc tcc 1104 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 355 360 365 ggt gga act gct gcc ctg ggc tgt ctc gtg aaa gat tat ttt cct gag 1152 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 370 375 380 cct gtg act gtg tcc tgg aat agc ggc gct ctg acc agc gga gtg cat 1200 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 385 390 395 400 acc ttt cca gcc gtg ctg cag agc agc ggc ctg tat agc ctg tcc agc 1248 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 405 410 415 gtc gtg acc gtg cct tcc tct agc ctg gga aca cag aca tat atc tgt 1296 Val 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60 <210> 20 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 20 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Pro Arg Ser 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Ser Asp Thr Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Thr Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ser Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Ser Asp Thr Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser 50 55 60 <210> 21 <211> 3369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atggactctt tagccagctt agttctctgt ggagtcagct tgctcctttc tggaactgtg 60 gaaggtgcca tggacttgat cttgatcaat tccctacctc ttgtatctga tgctgaaaca 120 tctctcacct gcattgcctc tgggtggcgc ccccatgagc ccatcaccat aggaagggac 180 tttgaagcct taatgaacca gcaccaggat ccgctggaag ttactcaaga tgtgaccaga 240 gaatgggcta aaaaagttgt ttggaagaga gaaaaggcta gtaagatcaa tggtgcttat 300 ttctgtgaag ggcgagttcg aggagaggca atcaggatac gaaccatgaa gatgcgtcaa 360 caagcttcct tcctaccagc tactttaact atgactgtgg acaagggaga taacgtgaac 420 atatctttca aaaaggtatt gactaaagaa gaagatgcag tgatttacaa aaatggttcc 480 ttcatccatt cagtgccccg gcatgaagta cctgatattc tagaagtaca cctgcctcat 540 gctcagcccc aggatgctgg agtgtactcg gccaggtata taggaggaaa cctcttcacc 600 tcggccttca ccaggctgat agtccggaga tgtgaagccc agaagtgggg acctgaatgc 660 aaccatctct gtactgcttg tatgaacaat ggtgtctgcc atgaagatac tggagaatgc 720 atttgccctc ctgggtttat gggaaggacg tgtgagaagg cttgtgaact gcacacgttt 780 ggcagaactt gtaaagaaag gtgcagtgga caagagggat gcaagtctta tgtgttctgt 840 ctccctgacc cctatgggtg ttcctgtgcc acaggctgga agggtctgca gtgcaatgaa 900 gcatgccacc ctggttttta cgggccagat tgtaagctta ggtgcagctg caacaatggg 960 gagatgtgtg atcgcttcca aggatgtctc tgctctccag gatggcaggg gctccagtgt 1020 gagagagaag gcataccgag gatgacccca aagatagtgg atttgccaga tcatatagaa 1080 gtaaacagtg gtaaatttaa tcccatttgc aaagcttctg gctggccgct acctactaat 1140 gaagaaatga ccctggtgaa gccggatggg acagtgctcc atccaaaaga ctttaaccat 1200 acggatcatt tctcagtagc catattcacc atccaccgga tcctcccccc tgactcagga 1260 gtttgggtct gcagtgtgaa cacagtggct gggatggtgg aaaagccctt caacatttct 1320 gttaaagttc ttccaaagcc cctgaatgcc ccaaacgtga ttgacactgg acataacttt 1380 gctgtcatca acatcagctc tgagccttac tttggggatg gaccaatcaa atccaagaag 1440 cttctataca aacccgttaa tcactatgag gcttggcaac atattcaagt gacaaatgag 1500 attgttacac tcaactattt ggaacctcgg acagaatatg aactctgtgt gcaactggtc 1560 cgtcgtggag agggtgggga agggcatcct ggacctgtga gacgcttcac aacagcttct 1620 atcggactcc ctcctccaag aggtctaaat ctcctgccta aaagtcagac cactctaaat 1680 ttgacctggc aaccaatatt tccaagctcg gaagatgact tttatgttga agtggagaga 1740 aggtctgtgc aaaaaagtga tcagcagaat attaaagttc caggcaactt gacttcggtg 1800 ctacttaaca acttacatcc cagggagcag tacgtggtcc gagctagagt caacaccaag 1860 gcccaggggg aatggagtga agatctcact gcttggaccc ttagtgacat tcttcctcct 1920 caaccagaaa acatcaagat ttccaacatt acacactcct cagctgtgat ttcttggaca 1980 atattggatg gctattctat ttcttctatt actatccgtt acaaggttca aggcaagaat 2040 gaagaccagc acgttgatgt gaagataaag aatgccacca tcactcagta tcagctcaag 2100 ggcctagagc ctgaaacagc ataccaggtg gacatttttg cagagaacaa catagggtca 2160 agcaacccag ccttttctca tgaactggtg accctcccag aatctcaagc accagcggac 2220 ctcggagggg ggaagatgct gcttatagcc atccttggct ctgctggaat gacctgcctg 2280 actgtgctgt tggcctttct gatcatattg caattgaaga gggcaaatgt gcaaaggaga 2340 atggcccaag ccttccaaaa cagggaagaa ccagctgtgc agttcaactc agggactctg 2400 gccctaaaca ggaaggtcaa aaacaaccca gatcctacaa tttatccagt gcttgactgg 2460 aatgacatca aatttcaaga tgtgattggg gagggcaatt ttggccaagt tcttaaggcg 2520 cgcatcaaga aggatgggtt acggatggat gctgccatca aaagaatgaa agaatatgcc 2580 tccaaagatg atcacaggga ctttgcagga gaactggaag ttctttgtaa acttggacac 2640 catccaaaca tcatcaatct cttaggagca tgtgaacatc gaggctactt gtacctggcc 2700 attgagtacg cgccccatgg aaaccttctg gacttccttc gcaagagccg tgtgctggag 2760 acggacccag catttgccat tgccaatagc accgcgtcca cactgtcctc ccagcagctc 2820 cttcacttcg ctgccgacgt ggcccggggc atggactact tgagccaaaa acagtttatc 2880 cacagggatc tggctgccag aaacatttta gttggtgaaa actatgtggc aaaaatagca 2940 gattttggat tgtcccgagg tcaagaggtg tatgtgaaaa agacaatggg aaggctccca 3000 gtgcgctgga tggccatcga gtcactgaat tacagtgtgt acacaaccaa cagtgatgta 3060 tggtcctatg gtgtgttact atgggagatt gttagcttag gaggcacacc ctactgcgga 3120 atgacttgtg cagaactcta cgagaagctg ccccagggct acagactgga gaagcccctg 3180 aactgtgatg atgaggtgta tgatctaatg agacaatgct ggcgggagaa gccttatgag 3240 aggccatcat ttgcccagat attggtgtcc ttaaacagaa tgttagagga gcgaaagacc 3300 tacgtgaata ccacgcttta tgagaagttt acttatgcag gaattgactg ttctgctgaa 3360 gaagcggcc 3369 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thrombin cleavage site <400> 22 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 23 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (34)

  1. 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
    해당 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
    해당 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하며,
    1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
    항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트:
    (1) 4개의 중쇄 가변 영역 및 4개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서,
    해당 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
    해당 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지며,
    1개의 해당 중쇄 가변 영역과 1개의 해당 경쇄 가변 영역이 1개의 항원 결합 부위를 구성하고, 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 4개의 항원 결합 부위를 포함하는,
    항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트; 및
    (2) (1)의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화를 받은 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  3. 제 1 항에 기재된 항인간 Tie2 항체로서, 해당 항체는 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
    각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31에서 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50에서 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99에서 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 카복시 말단(C말단)이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 아미노 말단(N말단)과 연결되어 있고,
    각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24에서 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 55에서 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 94에서 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
    항인간 Tie2 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는 항인간 Tie2 항체:
    (1) 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고,
    각 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 122까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역으로 이루어지는 구조를 2개, 및 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고, 한쪽의 해당 구조의 C말단이 링커를 통하여 다른 한쪽의 해당 구조의 N말단과 연결되어 있고,
    각 경쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1에서 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는,
    항인간 Tie2 항체; 및
    (2) (1)의 항인간 Tie2 항체의 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화를 받은 항인간 Tie2 항체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는 항인간 Tie2 항체:
    (1) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체; 또는
    (2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 파이로글루탐산으로 수식되는 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 679의 리신을 결여하는 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는, 항인간 Tie2 항체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체.
  7. 제 5 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1에서 678까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 2개, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 4개 포함하는 항인간 Tie2 항체.
  8. (a) 및 (b)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. (a) 및 (b)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  10. (i) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
    (ii) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 발현 벡터.
  11. (i) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
    (ii) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 발현 벡터.
  12. 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
    (a) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (b) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  13. 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
    (a) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (b) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  14. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 4가의 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법:
    (a) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 2 항의 (1)에 기재된 항인간 Tie2 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  15. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 Tie2 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 Tie2 항체를 생산하는 방법:
    (a) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체의 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항인간 Tie2 항체의 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  16. 제 6 항에 기재된 항인간 Tie2 항체 및/또는 제 7 항에 기재된 항인간 Tie2 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  17. 제 5 항에 있어서,
    당뇨병 황반부종, 당뇨병 망막증 또는 중증 하지허혈의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항인간 Tie2 항체.
  18. 삭제
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