JP6512213B2 - 新規抗ヒトpai−1抗体 - Google Patents
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Description
(1)配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から66までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号99から107までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から34までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号50から56までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号89から97までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(2)以下の1)〜2)のいずれかから選択される、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
1)配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント;並びに
2)1)の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(3)配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、(2)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(4)配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、(2)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(5)翻訳後修飾が、重鎖可変領域N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、(2)又は(4)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(6)ヒトIgγ1定常領域である重鎖定常領域を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(7)ヒトIgκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(8)ヒトIgγ1定常領域である重鎖定常領域を含み、ヒトIgκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(9)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体。
(10)一本鎖可変領域フラグメント、Fab、Fab’、又はF(ab’)2である、(1)〜(8)のいずれかに記載の抗原結合フラグメント。
(11)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトPAI−1抗体。
(12)翻訳後修飾が、重鎖可変領域N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、(11)に記載の抗ヒトPAI−1抗体。
(13)配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、(11)に記載の抗ヒトPAI−1抗体。
(14)(9)又は(13)に記載の抗ヒトPAI−1抗体と活性型ヒトPAI−1との結合を阻害し、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトPAI−1に結合し、かつ、潜在型ヒトPAI−1にも、プラスミノーゲンアクチベーターと複合体を形成したヒトPAI−1にも結合しない、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(15)(9)又は(13)に記載の抗ヒトPAI−1抗体と同じヒトPAI−1エピトープに結合する、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(16)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(17)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(18)(16)及び/又は(17)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(19)以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、(18)に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(20)以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、(18)に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(21)以下の(a)〜(c)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
(a)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(22)以下の(a)〜(c)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトPAI−1抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトPAI−1抗体を生産する方法。
(a)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(23)(21)に記載の方法で生産された抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(24)(22)に記載の方法で生産された抗ヒトPAI−1抗体。
(25)(1)〜(15)、(23)、及び(24)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
(26)(3)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント、(4)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
(27)(9)に記載の抗ヒトPAI−1抗体、(13)に記載の抗ヒトPAI−1抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
(28)肺線維症の予防又は治療用医薬組成物である、(25)〜(27)のいずれかに記載の医薬組成物。
(29)肺線維症が特発性肺線維症である、(28)に記載の医薬組成物。
(30)(1)〜(15)、(23)、及び(24)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、肺線維症を予防又は治療する方法。
(31)肺線維症が特発性肺線維症である、(30)に記載の方法。
(32)肺線維症の予防又は治療に使用するための、(1)〜(15)、(23)、及び(24)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(33)肺線維症が特発性肺線維症である、(32)に記載の使用。
(34)肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の製造における、(1)〜(15)、(23)、及び(24)のいずれかに記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
(35)肺線維症が特発性肺線維症である、(34)に記載の使用。
本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下の特徴を有する抗ヒトPAI−1抗体が含まれる。
配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、ただし、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び/又は配列番号2のアミノ酸番号448のリジンを欠く重鎖、並びに配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から66までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号99から107までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から34までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号50から56までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号89から97までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(潜在型ヒトPAI−1に対する結合活性評価)
組換え潜在型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−L)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、潜在型ヒトPAI−1を固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置する。洗浄液(0.05% Tween−20含有トリス緩衝生理食塩水(TBS))で洗浄し、0.1%ウシ血清由来アルブミン(BSA)含有PBSで100000ng/mLから0.01ng/mLまで8段階に希釈した被験抗体を1ウェルあたり100μL添加し、室温で30分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトFc領域を有する場合はMEDI−579(特許文献3)を、被験抗体がマウスFc領域を有する場合はMA−56A7C10(Hycult Biotech社、HM2182)を、それぞれ0.1%BSA含有PBSで10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルを準備する。洗浄液で3回洗浄した後、PBSで20倍に希釈したブロッキング剤(ナカライテスク社、03953−95)溶液を使用して2000倍に希釈した検出抗体を1ウェルあたり100μL添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ヤギ抗マウスIg抗体(Southern Biotech社、1010−05)を、ヒト抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ウサギ抗ヒトIg抗体(Southern Biotech社、6145−05)を用いる。室温にて30分間インキュベートした後、洗浄液で3回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト社)に含まれる発色液を1ウェルあたり100μL添加し、室温で15分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を100μL添加して、そのOD450値をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定する。被験抗体の各濃度におけるPAI−1結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルの測定値を0%とし、被験抗体の最大濃度における測定値を100%と設定する。ただし、被験抗体がヒトFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMEDI−579の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MEDI−579の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。被験抗体がマウスFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMA−56A7C10の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MA−56A7C10の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。算出されたPAI−1結合率を解析し、4パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のEC50値を算出する。
(uPA−PAI−1複合体に対する結合活性評価)
uPA(ウロキナーゼ静注用6万単位「ベネシス(登録商標)」;田辺三菱製薬株式会社)をPBSで100unit/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、uPAを固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置する。0.1%BSA含有PBSで1000ng/mLに希釈した組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を1ウェルあたり100μL添加し、uPAに捕捉させる。洗浄液(0.05% Tween−20含有TBS)で洗浄し、0.1%BSA含有PBSで100000ng/mLから0.01ng/mLまで8段階に希釈した被験抗体を1ウェルあたり100μL添加し、室温で30分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトFc領域を有する場合はMEDI−579(特許文献3)を、被験抗体がマウスFc領域を有する場合はMA−56A7C10(Hycult Biotech社、HM2182)を、それぞれ0.1%BSA含有PBSで10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルを準備する。洗浄液で3回洗浄した後、PBSで20倍に希釈したブロッキング剤(ナカライテスク社、03953−95)溶液を使用して2000倍に希釈した検出抗体を1ウェルあたり100μL添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ヤギ抗マウスIg抗体(Southern Biotech社、1010−05)を、ヒト抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ウサギ抗ヒトIg抗体(Southern Biotech社、6145−05)を用いる。室温にて30分間インキュベートした後、洗浄液で3回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト社)に含まれる発色液を1ウェルあたり100μL添加し、室温で15分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を100μL添加して、そのOD450値をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定する。被験抗体の各濃度におけるPAI−1結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルの測定値を0%とし、被験抗体の最大濃度における測定値を100%と設定する。ただし、被験抗体がヒトFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMEDI−579の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MEDI−579の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。被験抗体がマウスFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMA−56A7C10の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MA−56A7C10の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。算出されたPAI−1結合率を解析し、4パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のEC50値を算出する。
(tPA−PAI−1複合体に対する結合活性評価)
tPA(アクチバシン(登録商標)注600万;協和発酵キリン株式会社)をPBSで1000unit/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、tPAを固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置する。0.1%BSA含有PBSで1000ng/mLに希釈した組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を1ウェルあたり100μL添加し、tPAに捕捉させる。洗浄液(0.05% Tween−20含有TBS)で洗浄し、0.1%BSA含有PBSで100000ng/mLから0.01ng/mLまで8段階に希釈した被験抗体を1ウェルあたり100μL添加し、室温で30分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトFc領域を有する場合はMEDI−579(特許文献3)を、被験抗体がマウスFc領域を有する場合はMA−56A7C10(Hycult Biotech社、HM2182)を、それぞれ0.1%BSA含有PBSで10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルを準備する。洗浄液で3回洗浄した後、PBSで20倍に希釈したブロッキング剤(ナカライテスク社、03953−95)溶液を使用して2000倍に希釈した検出抗体を1ウェルあたり100μL添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ヤギ抗マウスIg抗体(Southern Biotech社、1010−05)を、ヒト抗体のFc領域を有する被験抗体の検出用にHRP標識ウサギ抗ヒトIg抗体(Southern Biotech社、6145−05)を用いる。室温にて30分間インキュベートした後、洗浄液で3回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト社)に含まれる発色液を1ウェルあたり100μL添加し、室温で15分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を100μL添加して、そのOD450値をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定する。被験抗体の各濃度におけるPAI−1結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに0.1%BSA含有PBSを添加したウェルの測定値を0%とし、被験抗体の最大濃度における測定値を100%と設定する。ただし、被験抗体がヒトFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMEDI−579の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MEDI−579の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。被験抗体がマウスFc領域を有する場合、被験抗体を最大濃度(100000ng/mL)添加してもMA−56A7C10の評価系における最大濃度(10000ng/mL)の測定値に達しない時は、MA−56A7C10の評価系における最大濃度の測定値を100%と設定する。算出されたPAI−1結合率を解析し、4パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のEC50値を算出する。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び/又は本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
(a)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、以下の(a)〜(c)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。
(a)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)本発明の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。
(1)配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
(3)配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
(4)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトPAI−1抗体、配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトPAI−1抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
当業者であれば、当該分野で公知の方法を用いて、抗体又はその抗原結合フラグメントを、他のペプチド又は蛋白質を融合した融合抗体として作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体として作製することも可能である。本発明の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントには、このような融合体や修飾体の形態の抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。例えば、配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド又は蛋白質と融合した抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは修飾剤を結合させた抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは融合抗体としてVTN−PAI−1複合体との結合活性を有している限り、融合に用いられる他のペプチド又は蛋白質は特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンSトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは修飾抗体としてVTN−PAI−1複合体との結合活性を有している限り、修飾に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
活性型ヒトPAI−1に選択性の高い抗体を取得するために、最適なヒトPAI−1ペプチド抗原を検討した。ペプチドの長さやアミノ酸配列を検討した結果、ヒトPAI−1中の16アミノ酸残基のペプチド抗原STAVIVSARMAPEEII(配列番号5)のC末端にMultiple Antigen Peptide 8(MAP8)ペプチド(J.Biol.Chem.、1988、Vol.263、No.4、p.1719−1725)をつなげたものを免疫した場合に、血漿中の活性型ヒトPAI−1を中和する抗体を取得できることが明らかになった。さらに抗原につなげる蛋白質や免疫方法等を創意検討した結果、このペプチド抗原のC末端にKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)蛋白質をつなげたものと組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を混合して同時に免疫した場合に、血漿中の活性型ヒトPAI−1を強力に中和し、かつビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトPAI−1(VTN−PAI−1複合体)に選択性の高い抗体を取得できることが明らかになった。
抗体の抗原特異的結合活性を測定するために、ELISAアッセイを使用した。ここで、活性型ヒトPAI−1に対する選択性を評価するために、ビトロネクチンを固相化し、活性型ヒトPAI−1を添加して作製したプレートと、活性型ヒトPAI−1の代わりに潜在型ヒトPAI−1を添加して作製したプレートを用いて試験した。
前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、本発明者らは、哺乳細胞発現用ベクターであるGSベクター(Lonza社)を用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、実施例2で同定されたHOT−1について、ハイブリドーマからRNAを抽出し、cDNA増幅キット(SMARTer RACE cDNA Amplification kit;Clontech社)を用いて、cDNAを作製した。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。HOT−1の重鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列(Nigel Whittleら、Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499−505)をコードする遺伝子を、そして3’側にヒトIgγ1の定常領域遺伝子(配列番号1の塩基番号355から1344までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をGSベクターpEE6.4に挿入した。また、HOT−1の軽鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列(Nigel Whittleら、前出)をコードする遺伝子を、そして3’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子(配列番号3のアミノ酸番号325から642までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をGSベクターpEE12.4に挿入した。
精製した完全ヒト型HOT−1のアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖C末端のリジン欠失が生じていた。
実施例2で同定したHOT−1(キメラ抗体)及び実施例3で作製した完全ヒト型HOT−1についてヒト血漿中の活性型PAI−1阻害活性を評価するために、肥満患者の血漿を用いて、活性型PAI−1阻害アッセイを実施した。健常人の血漿を用いた場合、活性型PAI−1の濃度が低くアッセイ系の構築が困難であるため、血漿中活性型PAI−1濃度が高いことが知られている肥満患者の血漿を用いた(Nature Medicine、1996、Vol.2、p.800−803)。
ELISAアッセイを用いて、実施例3で作製した完全ヒト型HOT−1のVTN−PAI−1複合体に対する結合選択性を評価した。次の(1)〜(4)の4通りのヒトPAI−1固相化プレートを作製し、各プレートを用いて試験した。
(1)VTN−PAI−1複合体固相化プレート
ビトロネクチン(BD Biosciences社、354238)をPBSで1000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、ビトロネクチンを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置した。0.1%BSA含有PBSで1000ng/mLに希釈した組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を1ウェルあたり100μL添加し、ビトロネクチンに捕捉させた。本プレートでの試験により、VTN−PAI−1に対する抗体の結合活性を評価した。
(2)潜在型ヒトPAI−1固相化プレート
組換え潜在型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−L)をPBSで1000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、潜在型ヒトPAI−1を固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置した。本プレートでの試験により、潜在型ヒトPAI−1に対する抗体の結合活性を評価した。
(3)uPA−PAI−1複合体固相化プレート
uPA(ウロキナーゼ静注用6万単位「ベネシス」(登録商標);田辺三菱製薬株式会社)をPBSで100unit/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、uPAを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置した。0.1%BSA含有PBSで1000ng/mLに希釈した組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を1ウェルあたり100μL添加し、uPAに捕捉させた。本プレートでの試験により、uPA−PAI−1複合体に対する抗体の結合活性を評価した。
(4)tPA−PAI−1複合体固相化プレート
tPA(アクチバシン(登録商標)注600万;協和発酵キリン株式会社)をPBSで1000unit/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明96プレート(Nunc社)に1ウェルあたり100μL添加し、4℃で一晩プレートを静置することで、tPAを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤(Thermo SCIENTIFIC社、37532)を1ウェルあたり200μL添加し、室温にて30分間静置した。0.1%BSA含有PBSで1000ng/mLに希釈した組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を1ウェルあたり100μL添加し、tPAに捕捉させた。本プレートでの試験により、tPA−PAI−1複合体に対する抗体の結合活性を評価した。
表1:抗ヒトPAI−1抗体の各種ヒトPAI−1に対する結合活性
完全ヒト型HOT−1の単量体活性型ヒトPAI−1への結合活性を測定するために、SPR解析を行った。SPR解析においては、Biacore(登録商標)T200(GEヘルスケアジャパン)及び組換え活性型ヒトPAI−1(Molecular Innovation社、PAI−A)を用いて解析を行った。その結果、完全ヒト型HOT−1が単量体として存在する活性型ヒトPAI−1に結合することが明らかとなった。
ELISAアッセイを用いて、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型サルPAI−1(VTN−サルPAI−1複合体とも称する)に対する完全ヒト型HOT−1の結合選択性を評価した。次の(1)〜(4)の4通りのサルPAI−1固相化プレートを作製し、各プレートを用いて試験した。比較抗体としてMEDI−579を使用した。
実施例6(1)に記載の方法に従って、VTN−サルPAI−1に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトPAI−1の代わりに、組換え活性型サルPAI−1(Molecular Innovation社、CYPAI)を使用した。また、完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579を10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈して使用した。
(2)潜在型サルPAI−1固相化プレート
実施例6(2)に記載の方法に従って、潜在型サルPAI−1に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え潜在型ヒトPAI−1の代わりに、組換え潜在型サルPAI−1(Molecular Innovation社、CYPAI−L)を使用した。また、完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579を10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈して使用した。
(3)uPA−サルPAI−1複合体固相化プレート
実施例6(3)に記載の方法に従って、uPA−サルPAI−1複合体に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトPAI−1の代わりに、組換え活性型サルPAI−1(Molecular Innovation社、CYPAI)を使用した。また、完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579を10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈して使用した。
(4)tPA−サルPAI−1複合体固相化プレート
実施例6(4)に記載の方法に従って、tPA−サルPAI−1複合体に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトPAI−1の代わりに、組換え活性型サルPAI−1(Molecular Innovation社、CYPAI)を使用した。また、完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579を10000ng/mLから0.01ng/mLまで7段階に希釈して使用した。
表2:抗PAI−1抗体の各種サルPAI−1に対する結合活性
完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579のヒト及びサル血漿中の活性型PAI−1阻害活性の評価を実施した。ヒト血漿については、実施例5と同様に肥満患者の血漿を用いた。サル血漿については、カニクイザルにLPSを静脈内投与し、採取した血漿を用いた。
血管壁においてuPA及びtPAが血管内皮から産生されて、血管内皮に結合していることが知られている(Baillieres Clin.Haematol.、1993、Vol.6、No.3、p.559−576。Blood、2011、Vol.118、No.11、p.3182−3185)。つまり、uPA及びtPAは血中だけでなく血管壁にも存在する。実施例9では、抗PAI−1抗体による血漿中の活性型PAI−1の阻害活性を測定したが、この実験系は血漿中成分のみを抽出していることから血管壁の影響が考慮されていない。そのため、実際の血管中における生体反応を反映しているとは言い難いと考えられる。そこで、実際の血管内状態を模した系として、uPA−PAI−1複合体を固相化したアッセイプレートに活性型PAI−1、uPA及びuPA基質ペプチドを混合した評価系を用いて、完全ヒト型HOT−1及びMEDI−579の活性をuPAの活性を指標に測定した。
実施例6の結果から、完全ヒト型HOT−1はVTN−PAI−1複合体に対して強い結合活性を示し、かつ極めて高い選択的結合活性を有することが明らかになった。一般的に、血中における抗体はそのまま代謝される以外に抗原に結合して抗原−抗体複合体として代謝されることが知られている(Journal of Pharmaceutical Sciences、2012、Vol.101、No.12、p4367−4382)。血漿中におけるPAI−1はVTN−PAI−1以外にも、潜在型PAI−1及びtPA−PAI−1複合体等の様々な複合体の状態で存在する(Blood、1990、Vol.76、p.930−937)ことから、選択性の低い抗PAI−1抗体は様々なPAI−1と抗原−抗体複合体を形成して代謝される。一方で完全ヒト型HOT−1はVTN−PAI−1選択的に結合するため潜在型PAI−1やPA−PAI−1との複合体としては代謝されにくく、そのため血中における濃度が長期間維持される可能性が考えられた。実際抗体の血中濃度持続はこの抗原−抗体複合体の代謝速度に大きく依存することが知られている(Bioanalysis、2011、Vol.3、No.6、p.659−675)。実施例8の結果から、完全ヒト型HOT−1はVTN−サルPAI−1複合体に対する高い選択的結合活性を示したことから、サルに抗体を投与した際の血漿中抗体濃度を測定した。比較抗体として、MEDI−579を使用した。
[処置群]
HOT−1投与群(3匹):
完全ヒト型HOT−1を投与した群(2.0mg/kg)
MEDI−579投与群(2匹):
MEDI−579を投与した群(2.0mg/kg)
抗体投与前、及び、抗体投与0.25、1、2、4、8、24、48、96、168、336、504時間後に採血を行い、血漿を得た。完全ヒト型HOT−1に関しては追加で、672、936、1200、1440時間後にも採血を行い、血漿を得た。
サルの血中で長期間かつ強力にPAI−1活性を阻害することが、肺線維症等のPAI−1が病態に関与する疾患の予防又は治療に望ましい。そこで、完全ヒト型HOT−1のサル血中における活性型PAI−1阻害活性を評価した。比較抗体としてMEDI−579を使用した。
Claims (14)
- 配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から66までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号99から107までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から34までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号50から56までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号89から97までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 以下の(1)〜(2)のいずれかから選択される、請求項1に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。
(1)配列番号2のアミノ酸番号1から118までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸番号1から108までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント;並びに
(2)上記(1)の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖N末端のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 以下の(1)〜(2)のいずれかから選択される、請求項2に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメント:
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体;並びに
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、ただし、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び/又は配列番号2のアミノ酸番号448のリジンを欠く重鎖、並びに配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトPAI−1抗体。 - 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項3に記載の抗ヒトPAI−1抗体。
- 配列番号2のアミノ酸番号1から447までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項3に記載の抗ヒトPAI−1抗体。
- 以下の(a)〜(b)からなる群より選択される、ポリヌクレオチド:
(a)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び
(b)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 - 以下の(a)〜(b)からなる群より選択される、ポリヌクレオチド:
(a)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び
(b)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 - 以下の(a)及び/又は(b)を含む、発現ベクター:
(a)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び/又は
(b)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 - 以下の(a)及び/又は(b)を含む、発現ベクター:
(a)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び/又は
(b)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 - 以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、宿主細胞。
(a)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、宿主細胞。
(a)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(d)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(a)〜(c)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
(a)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)請求項2(1)に記載の抗ヒトPAI−1抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(a)〜(c)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトPAI−1抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトPAI−1抗体を生産する方法。
(a)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトPAI−1抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 請求項4に記載の抗ヒトPAI−1抗体、及び/又は、請求項5に記載の抗ヒトPAI−1抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
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