KR20160124840A - 신규 항인간 pai-1 항체 - Google Patents

신규 항인간 pai-1 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20160124840A
KR20160124840A KR1020167025778A KR20167025778A KR20160124840A KR 20160124840 A KR20160124840 A KR 20160124840A KR 1020167025778 A KR1020167025778 A KR 1020167025778A KR 20167025778 A KR20167025778 A KR 20167025778A KR 20160124840 A KR20160124840 A KR 20160124840A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
pai
human pai
antigen
human
Prior art date
Application number
KR1020167025778A
Other languages
English (en)
Inventor
히로쓰구 다나카
마사야스 요시노
Original Assignee
아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 filed Critical 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20160124840A publication Critical patent/KR20160124840A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

[과제] 활성형 인간 PAI-1에 결합하여, 활성형 인간 PAI-1을 통하는 작용을 저해하는 것에 의해 폐섬유증을 예방 또는 치료하는 항인간 PAI-1 항체를 제공하는 것에 있다.
[해결수단] 본 발명자들은, 항PAI-1 항체에 대해 검토하여, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체를 제공했다.

Description

신규 항인간 PAI-1 항체{NEW ANTI-HUMAN PAI-1 ANTIBODY}
본 발명은, 신규한 항인간 PAI-1 항체에 관한 것이다.
플라스미노젠 액티베이터 인히비터-1(plasminogen activator inhibitor-1; PAI-1)은, 혈관 내피 등으로부터 산생(産生)되는 세린 프로테아제 인히비터의 하나이다. PAI-1은, 세린 프로테아제인 플라스미노젠 액티베이터(plasminogen activator; PA)와 결합하여, PA의 효소 활성을 실활시킨다(Mol. Cell. Endocrinol., 1990, Vol. 68, p. 1-19). PAI-1에는, 활성형 PAI-1, 잠재형 PAI-1, 및 PA와 결합하여 복합체를 형성한 PAI-1이 존재하고, 이 PA를 저해하는 PAI-1의 특성은, 활성형 PAI-1만이 갖는다(Blood, 1987, Vol. 70, p. 1090-1098). PA에는, 조직 플라스미노젠 액티베이터(tissue plasminogen activator; tPA)와 우로키나제형 플라스미노젠 액티베이터(urokinase-type plasminogen activator; uPA. 우로키나제라고도 칭한다)의 2종이 존재하고, 모두 플라스미노젠을 활성화시켜 플라스민으로 변환시키는 것에 의해, 혈액 응고로 생성된 피브린을 용해하는 반응(이하, 선용계(線溶系)라고 칭한다)을 촉매한다. 활성형 PAI-1은 tPA 및 uPA와 결합하여, 복합체를 형성한다. PA를 실활시키는 생물학적 특성은 충분히 해명이 끝난 상태이며, 활성형 PAI-1이 PA와 결합하는 결과로서, 선용계를 저해시켜 혈전 형성을 촉진한다.
활성형 PAI-1의 입체 구조의 특징은, PA와의 결합 부위인 활성 중심 루프가 단백의 외측에 신장 및 노출되는 점이다(J. Biol. Chem., 2001, Vol. 276, p. 44912-44918). 순환 혈액 중에서는, 활성형 PAI-1은, 그의 보인자(補因子)인 비트로넥틴과 결합하여 복합체를 형성할 수 있다(J. Biol. Chem., 1988, Vol. 263, p. 15454-15461). 비트로넥틴은, PAI-1의 활성형으로부터 잠재형으로의 입체 구조 변화를 억제한다(J. Biol. Chem., 1990, Vol. 265, p. 18490-18498). 잠재형 PAI-1은, 활성 중심 루프가 내부로 절첩된, 안정된 입체 구조이며, 일단 잠재형이 되면, PAI-1은 PA와는 결합할 수 없게 된다(J. Biol. Chem., 2008, Vol. 283, p. 18147-18157. Nature, 1992, Vol. 355, p. 270-273). 또한, tPA 또는 uPA와 복합체를 형성한 PAI-1은 각각 tPA 또는 uPA와 결합하고 있기 때문에, 당해 PAI-1은 다른 PA와 새롭게 결합할 수 없다. 즉, 활성형 PAI-1에는, 단량체로서 존재하는 활성형 PAI-1과, 비트로넥틴과의 복합체로서 존재하는 활성형 PAI-1이 있고, 이들이 PA에 결합하여, PA를 실활시키는 기능을 갖는다.
혈장중 활성형 PAI-1의 증가는, PA의 저해를 통하여 조직의 섬유화나 혈전 형성에 관여한다는 것이 시사되어 있고, 그 결과로서 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증, 간질성 폐렴, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 당뇨병성 신증, 루프스 신염, 이식편대숙주병, 사구체 신염, 네프로제 증후군, 신섬유증, 만성 폐색성 폐질환, 급성 신장애, 급성 폐장애, 급성 호흡부전, 노인성 황반변성, 파종성 혈관내응고증후군, 수술후유착, 증후성 초자체황반유착, 당뇨병 망막증, 동맥경화, 심근경색, 뇌경색, 폐경색, 녹내장 수술 후의 결막의 반흔화 등의 안섬유화를 수반하는 질환, 복막 경화증 등의 질환에 관여한다고 생각되고 있다.
폐섬유증과의 관련으로서는, 특발성 폐섬유증 환자의 폐생검 유래의 섬유아세포에 있어서 PAI-1의 발현 및 분비가 증가하고 있다는 것이 보고되어 있다(J. Biol. Chem., 2010, Vol. 285, No. 11, p. 8196-8206). 더하여, 블레오마이신 유발성의 폐섬유증 병태 모델 마우스를 이용한 시험에 있어서, PAI-1의 유전적 결손 마우스에 있어서는 폐의 섬유화가 억제되었다는 것이 확인되어 있다(J. Clin. Invest., 1996, Vol. 97, No. 1, p. 232-237). 또한, 상기 병태 모델 마우스에 대해서 저분자 PAI-1 저해제 및 PAI-1의 siRNA를 투여한 경우에, PAI-1 억제에 의해 폐의 섬유화가 억제된다는 것도 확인되어 있다(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008, Vol. 28, p. 672-677. Thorax, 2010, Vol. 65, p. 334-340).
따라서, 활성형 PAI-1에 특이적으로 결합하여, 활성형 PAI-1에 의한 작용을 저해하는 활성을 갖는 모노클로널 항체를 개발할 수 있으면, 활성형 PAI-1이 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 및 치료에 유용할 것이 기대된다.
활성형 인간 PAI-1에 대해서 기능 저해 작용을 나타내는 항체로서는, 마우스 모노클로널 항체 MA-33B8(특허문헌 1), MA-33H1F7(비특허문헌 1), MA-55F4C12(비특허문헌 1) 및 MA-56A7C10(특허문헌 2), 및 MA-33B8의 인간화 항체 CT140(특허문헌 1) 및 파지에서 제작된 완전 인간형 항체 MEDI-579(CAT-1001 또는 PICK167_A01-fgl IgG1이라고도 칭한다. 특허문헌 3) 등이 보고되어 있다. 그 중에서도, MA-56A7C10 및 MEDI-579는, 활성형 이외의 입체 구조의 인간 PAI-1과 비교하여, 활성형 인간 PAI-1에 대해서 각각, 약 4.0배 및 약 20배 높은 결합 활성을 나타낸다(특허문헌 2 및 특허문헌 3). 또한, MEDI-579는, 마우스 PAI-1에도 저해 작용을 나타내어, 루프스 신염, 강피증, 당뇨병성 신증 및 혈전증의 병태 모델 마우스를 이용한 실험 결과로부터, 이들 질환에 대한 약효가 기대되고 있다(특허문헌 3).
항인간 PAI-1 항체를 항체 의약으로서 사용하는 경우, 그의 유효 투여량을 규정하는 주된 요인으로서는, 항체가 갖는 활성형 PAI-1과 PA의 결합 저해 활성 및 활성형 PAI-1에 대한 선택성, 및 체내에 존재하는 활성형 PAI-1 및 그 외의 입체 구조의 PAI-1의 양을 들 수 있다. 여기에서, 그 외의 입체 구조의 PAI-1이란, 잠재형 PAI-1, 및 tPA 또는 uPA와 복합체를 형성한 PAI-1을 의미한다.
인간 혈장 중의 총 PAI-1의 90% 이상이 혈소판에 저장되어 있다. 혈소판을 제외한 혈장 중에서는 총 PAI-1의 약 3분의 2가 활성형이다(Br. J. Haematol., 1988, Vol. 70, p. 327-333. Blood, 1988, Vol. 71, p. 220-225). 혈장 중의 PAI-1 활성(tPA와의 결합능으로 나타나는 활성형 PAI-1 활성)뿐만 아니라, 혈장 중의 총 PAI-1량(모든 PAI-1을 검출하는 항PAI-1 항체에 의해 검출되는 PAI-1의 총량)이나, 혈장 중의 PAI-1과 tPA의 복합체의 양(항PAI-1 항체와 항tPA 항체의 조합으로 검출되는 복합체의 양)은, 다양한 인간 병태에서 상승한다(Thromb. Res., 2008, Vol. 122, p. 466-472. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2000, Vol. 20, p. 2019-2023. Nat. Med., 1996, Vol. 2, p. 800-803). 혈소판을 제외한 혈장에 있어서도, tPA-PAI-1 복합체가 활성형 PAI-1량의 약 3분의 1 존재한다. (Blood, 1990, Vol. 76, p. 930-937). 또한, 조직 중에서는, tPA뿐만 아니라 uPA도 존재하여, PAI-1과 uPA의 복합체도 존재한다. 결론으로서, 활성형 PAI-1 이외의 다른 PAI-1이, 전 PAI-1량에 있어서 무시할 수 없는 비율로 인간 체내에 존재한다.
미국 특허출원 공개 제2010/0254979호 국제공개 제2002/034776호 국제공개 제2011/139973호
「더 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(The Journal of Biological Chemistry)」, (미국), 2000, Vol. 275, p. 6375-6380
본 발명의 과제는, 종래의 항인간 PAI-1 항체와 비교하여 활성형 인간 PAI-1을 보다 선택적으로 저해시킴으로써 폐섬유증을 예방 또는 치료하는 항인간 PAI-1 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 활성형 인간 PAI-1에 선택성이 높은 항인간 PAI-1 항체의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체를 제작하여(실시예 1∼3), 당해 항인간 PAI-1 항체가 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1을 저해시킨다는 것(실시예 5), 및 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1에 대한 높은 선택성을 갖는다는 것(실시예 6)을 발견했다. 이들의 결과, 상기 항인간 PAI-1 항체를 제공하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은, 의학상 또는 산업상 유용한 물질 또는 방법으로서 이하의 발명을 포함하는 것이다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(2) 이하의 1)∼2)의 어느 것으로부터 선택되는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트; 및
2) 1)의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, (1)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(3) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, (2)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(4) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, (2)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(5) 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 라이신 결실인, (2) 또는 (4)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(6) 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는, (1)∼(5)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(7) 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, (1)∼(5)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(8) 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하고, 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, (1)∼(5)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(9) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체.
(10) 1본 쇄 가변 영역 프래그먼트, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, (1)∼(8)의 어느 것에 기재된 항원 결합 프래그먼트.
(11) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 PAI-1 항체.
(12) 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 라이신 결실인, (11)에 기재된 항인간 PAI-1 항체.
(13) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, (11)에 기재된 항인간 PAI-1 항체.
(14) (9) 또는 (13)에 기재된 항인간 PAI-1 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합을 저해하고, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1에 결합하며, 또한 잠재형 인간 PAI-1에도, 플라스미노젠 액티베이터와 복합체를 형성한 인간 PAI-1에도 결합하지 않는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(15) (9) 또는 (13)에 기재된 항인간 PAI-1 항체와 동일한 인간 PAI-1 에피토프에 결합하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(16) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
(17) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
(18) (16) 및/또는 (17)에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
(19) 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (18)에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(20) 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (18)에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(21) 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법.
(a) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(22) 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법.
(a) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(23) (21)에 기재된 방법으로 생산된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(24) (22)에 기재된 방법으로 생산된 항인간 PAI-1 항체.
(25) (1)∼(15), (23) 및 (24)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
(26) (3)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, (4)에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
(27) (9)에 기재된 항인간 PAI-1 항체, (13)에 기재된 항인간 PAI-1 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
(28) 폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, (25)∼(27)의 어느 것에 기재된 의약 조성물.
(29) 폐섬유증이 특발성 폐섬유증인, (28)에 기재된 의약 조성물.
(30) (1)∼(15), (23) 및 (24)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 폐섬유증을 예방 또는 치료하는 방법.
(31) 폐섬유증이 특발성 폐섬유증인, (30)에 기재된 방법.
(32) 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, (1)∼(15), (23) 및 (24)의 어느 것에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
(33) 폐섬유증이 특발성 폐섬유증인, (32)에 기재된 사용.
(34) 폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, (1)∼(15), (23) 및 (24)의 어느 것인가에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 사용.
(35) 폐섬유증이 특발성 폐섬유증인, (34)에 기재된 사용.
상기 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 다른 펩타이드 및 단백질과의 융합 항체나, 수식제를 결합시킨 수식 항체도 포함된다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 활성형 인간 PAI-1의 기능 저해에 의해, 활성형 인간 PAI-1이 병태 형성에 관여하는 질환, 예를 들어, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
도 1은 완전 인간형 HOT-1의 원숭이 혈중 활성형 PAI-1 저해 작용을 나타낸다. 세로축은 혈장중 활성형 PAI-1 농도를 나타낸다.
이하에, 본 발명에 대해 상술한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만∼7만의 중쇄와 2만∼3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라고 불린다. 더욱이 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, L형과 K형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩타이드 구성은, 각각 상동인 2본의 중쇄 및 2본의 경쇄가, 다이설파이드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만∼19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2본과 동일한 중쇄 2본으로 이루어져 있다.
쇄내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(Igμ, Igε에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100∼110잔기마다 하나의 루프를 이루며, 이 입체 구조는 각 루프간에 유사하여, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이어도, 그의 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 가변 영역보다 C말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있다(각 도메인은, 각각, CH1, CH2, CH3 또는 CL로 표시된다).
항체의 항원 결정 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 달려 있다. 한편, 보체(補體)나 각종 Fc 수용체 발현 세포와의 결합이라고 하는 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차이를 반영하고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쪽의 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것을 알 수 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부르고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 불리며, 비교적 일정하다.
항체의 VH 및 VL을 포함하는 각종 항원 결합 프래그먼트도 항원 결합 활성을 갖고, 이와 같은 대표적인 항원 결합 프래그먼트로서 1본 쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab, Fab', F(ab')2를 들 수 있다. Fab는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab'는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab')2 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄간 S-S 결합으로 결합한 2가의 항체 프래그먼트이다. scFv는, 링커로 연결된 VH와 VL로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다.
＜본 발명의 항인간 PAI-1 항체＞
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 PAI-1 항체가 포함된다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 상기의 특징을 갖고, 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는 항체가 바람직하다. 정상 영역으로서는, 어떠한 서브클래스의 정상 영역(예를 들어, 중쇄로서 Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4, 경쇄로서 Igλ 또는 Igκ의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있지만, 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역이 바람직하다.
인간 Igγ1 정상 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 번호 119로부터 448까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igγ1 정상 영역을 들 수 있다.
경쇄 정상 영역으로서는, 인간 Igκ 정상 영역이 바람직하다.
인간 Igκ 정상 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 4의 아미노산 번호 109로부터 214까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igκ 정상 영역을 들 수 있다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트로서는, 상기의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역이며, 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역인, 항인간 PAI-1 항체가 보다 바람직하다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항원 결합 프래그먼트는, scFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체이다.
항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는다는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C말단의 라이신의 카복시펩티다제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아마이드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러 가지 항체에 있어서, 이와 같은 번역 후 수식이 생긴다는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 번역 후 수식을 받은 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 번역 후 수식을 받은 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 가변 영역 N말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 라이신 결실을 받은 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 들 수 있다. 이와 같은 N말단의 피로글루타밀화 또는 C말단 라이신 결실에 의한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아니라는 것은 당해 분야에서 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 하기의 특징을 갖는 항인간 PAI-1 항체이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로서, 단, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산에 수식되고 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 448의 라이신을 결하는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 하기의 특징을 갖는 항인간 PAI-1 항체이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
본 발명에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1(VTN-PAI-1 복합체라고도 칭한다)에 결합하는 항체이다. 생체 내에 존재하는 활성형 인간 PAI-1로서는, 단량체로서 존재하는 활성형 인간 PAI-1과, VTN-PAI-1 복합체가 있다. 이 중, VTN-PAI-1 복합체에 대해서는, 비트로넥틴과의 결합에 의해 인간 PAI-1의 활성형으로부터 잠재형으로의 입체 구조 변화가 억제되어, 단량체로서 존재하는 활성형 인간 PAI-1보다도, 활성형 인간 PAI-1의 구조가 보다 안정되게 유지된다. 또한, VTN-PAI-1 복합체에 있어서, 활성형 인간 PAI-1의 활성 중심 루프 구조는 영향을 받지 않는다(Nat. Struct. Biol., 2003, Vol. 10, p. 541-544). 따라서, VTN-PAI-1 복합체에 대한 항인간 PAI-1 항체의 결합 활성을 평가하는 것에 의해, 활성형 인간 PAI-1에 대한 항체의 선택성을 보다 정확하게 평가할 수 있다.
또한, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, VTN-PAI-1 복합체뿐만 아니라, 단량체로서 존재하는 활성형 인간 PAI-1에도 결합하는 항체도 포함된다.
VTN-PAI-1 복합체 또는 단량체로서 존재하는 활성형 PAI-1에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 등의 방법을 들 수 있다. ELISA를 이용하는 경우, 예시적인 방법에 있어서, 비트로넥틴(BD Biosciences사, 354238)을 고상화하고, 블로킹 후에 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 고상화함으로써 VTN-PAI-1 복합체를 고상화시킨다. 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨다. 반응 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 등으로 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, HRP 표지의 경우, 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)) 등을 이용한 활성 측정을 행하는 것에 의해, 피험 항체가 VTN-PAI-1 복합체에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. SPR을 이용하는 경우는, 예를 들어, Biacore(등록상표) T200(GE헬스케어재팬사)을 이용할 수 있다. 예시적인 방법에 있어서, 피험 항체를 센서 칩의 표면에 고상화하고, 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 유로에 첨가시킨다. 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 해리 상수(KD)를 해석하는 것에 의해, 피험 항체가 단량체로서 존재하는 활성형 인간 PAI-1에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, VTN-PAI-1 복합체에 결합하고, 또한 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1에 대한 저해 활성을 갖는 항체이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, VTN-PAI-1 복합체에 결합하여, 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1에 대한 저해 활성을 갖고, 또한 잠재형 인간 PAI-1에도, PA와 복합체를 형성한 인간 PAI-1에도 결합하지 않는 항체이다. 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1에 대한 저해 활성을 구체적으로 평가하는 방법으로서는, 후기 실시예 5에 기재되는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
「잠재형 인간 PAI-1에 결합하지 않는다」란, 잠재형 인간 PAI-1에 대한 항체의 결합 활성을 평가한 경우에, EC50치(ng/mL)가 ＞10000인 것을 의미하고, EC50치(ng/mL)＞10000이란, 최대 활성의 50%를 나타내는 항체 농도가 10000ng/mL보다도 크다는 것을 의미한다. 이 평가에 이용하는 방법은, 이하에 나타내는 대로이다.
(잠재형 인간 PAI-1에 대한 결합 활성 평가)
재조합 잠재형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-L)을 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 눙크(Nunc) 맥시소프(MaxiSorp) 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, 잠재형 인간 PAI-1을 고상화한다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 세정액(0.05% Tween-20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS))으로 세정하고, 0.1% 소 혈청 유래 알부민(BSA) 함유 PBS로 100000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 8단계로 희석한 피험 항체를 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 비교 항체로서, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우는 MEDI-579(특허문헌 3)를, 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우는 MA-56A7C10(Hycult Biotech사, HM2182)을, 각각 0.1% BSA 함유 PBS로 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하고, 웰에 첨가한다. 컨트롤로서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰을 준비한다. 세정액으로 3회 세정한 후, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 2000배로 희석한 검출 항체를 1웰당 100μL 첨가하여 반응시킨다. 검출 항체로서는, 마우스 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 염소 항마우스 Ig 항체(Southern Biotech사, 1010-05)를, 인간 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 토끼 항인간 Ig 항체(Southern Biotech사, 6145-05)를 이용한다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정한다. 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)에 포함되는 발색액을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 15분간 정도 정치한 후, 상기 발색 키트에 포함되는 반응 정지액을 100μL 첨가하고, 그 OD450치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정한다. 피험 항체의 각 농도에 있어서의 PAI-1 결합률을 산출함에 있어서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 피험 항체의 최대 농도에 있어서의 측정치를 100%로 설정한다. 단, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 산출된 PAI-1 결합률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출한다.
「플라스미노젠 액티베이터와 복합체를 형성한 인간 PAI-1에 결합하지 않는다」란, 플라스미노젠 액티베이터(PA)인 uPA 또는 tPA와 복합체를 형성한 인간 PAI-1(각각 uPA-PAI-1 복합체 및 tPA-PAI-1 복합체라고도 칭한다)에 대한 항체의 결합 활성을 평가한 경우에, 각각의 복합체에 대해서 EC50치(ng/mL)가 ＞10000인 것을 의미하고, EC50치(ng/mL)＞10000이란, 최대 활성의 50%를 나타내는 항체 농도가 10000ng/mL보다도 크다는 것을 의미한다. 이 평가에 이용하는 방법은, 이하에 나타내는 대로이다.
(uPA-PAI-1 복합체에 대한 결합 활성 평가)
uPA(우로키나제 정주용(靜注用) 6만 단위 「베네시스(등록상표)」; 다나베미쓰비시제약주식회사)를 PBS로 100unit/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, uPA를 고상화한다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 0.1% BSA 함유 PBS로 1000ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 100μL 첨가하여, uPA에 포착시킨다. 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 세정하고, 0.1% BSA 함유 PBS로 100000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 8단계로 희석한 피험 항체를 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 비교 항체로서, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우는 MEDI-579(특허문헌 3)를, 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우는 MA-56A7C10(Hycult Biotech사, HM2182)을, 각각 0.1% BSA 함유 PBS로 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하고, 웰에 첨가한다. 컨트롤로서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰을 준비한다. 세정액으로 3회 세정한 후, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 2000배로 희석한 검출 항체를 1웰당 100μL 첨가하여 반응시킨다. 검출 항체로서는, 마우스 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 염소 항마우스 Ig 항체(Southern Biotech사, 1010-05)를, 인간 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 토끼 항인간 Ig 항체(Southern Biotech사, 6145-05)를 이용한다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정한다. 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)에 포함되는 발색액을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 15분간 정도 정치한 후, 상기 발색 키트에 포함되는 반응 정지액을 100μL 첨가하고, 그 OD450치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정한다. 피험 항체의 각 농도에 있어서의 PAI-1 결합률을 산출함에 있어서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 피험 항체의 최대 농도에 있어서의 측정치를 100%로 설정한다. 단, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 산출된 PAI-1 결합률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출한다.
(tPA-PAI-1 복합체에 대한 결합 활성 평가)
tPA(액티바신(등록상표) 주 600만; 교와핫코기린주식회사)를 PBS로 1000unit/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, tPA를 고상화한다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 0.1% BSA 함유 PBS로 1000ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 100μL 첨가하여, tPA에 포착시킨다. 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 세정하고, 0.1% BSA 함유 PBS로 100000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 8단계로 희석한 피험 항체를 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치한다. 비교 항체로서, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우는 MEDI-579(특허문헌 3)를, 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우는 MA-56A7C10(Hycult Biotech사, HM2182)을, 각각 0.1% BSA 함유 PBS로 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하고, 웰에 첨가한다. 컨트롤로서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰을 준비한다. 세정액으로 3회 세정한 후, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 2000배로 희석한 검출 항체를 1웰당 100μL 첨가하여 반응시킨다. 검출 항체로서는, 마우스 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 염소 항마우스 Ig 항체(Southern Biotech사, 1010-05)를, 인간 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 토끼 항인간 Ig 항체(Southern Biotech사, 6145-05)를 이용한다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정한다. 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)에 포함되는 발색액을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 15분간 정도 정치한 후, 상기 발색 키트에 포함되는 반응 정지액을 100μL 첨가하고, 그 OD450치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정한다. 피험 항체의 각 농도에 있어서의 PAI-1 결합률을 산출함에 있어서, 피험 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 피험 항체의 최대 농도에 있어서의 측정치를 100%로 설정한다. 단, 피험 항체가 인간 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MEDI-579의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 피험 항체가 마우스 Fc 영역을 갖는 경우, 피험 항체를 최대 농도(100000ng/mL) 첨가해도 MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도(10000ng/mL)의 측정치에 도달하지 않을 때는, MA-56A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정한다. 산출된 PAI-1 결합률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 피험 항체의 EC50치를 산출한다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합을 저해하고, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1에 결합하며, 또한 잠재형 인간 PAI-1에도, 플라스미노젠 액티베이터와 복합체를 형성한 인간 PAI-1에도 결합하지 않는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
피험 항체가 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합을 저해하는지 여부는, 이하의 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 비트로넥틴(BD Biosciences사, 354238)을 고상화하고, 블로킹 후에 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 고상화함으로써 VTN-PAI-1 복합체를 고상화시킨다. 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨다. 반응 후, HRP 등으로 표지한 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체의 2차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, HRP 표지의 경우, 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)) 등을 이용한 활성 측정을 행한다. 피험 항체의 첨가에 의해, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체의 결합 활성이 유의하게 저하되는 경우, 피험 항체가 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합을 저해한다고 판단할 수 있다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 동일한 인간 PAI-1 에피토프에 결합하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 여기에서 에피토프란 항체가 인식하는 항원 부위를 말한다.
피험 항체가 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 동일한 인간 PAI-1 에피토프에 결합하는지 여부는, 공지된 에피토프 결정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 에피토프를 결정하는 방법으로서는, 예를 들어, X선 결정 구조 해석이나 ELISA 등의 방법을 들 수 있다. ELISA를 이용하는 경우, 예시적인 방법에 있어서, 인간 PAI-1 부분 펩타이드를 고상화하고, 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨다. 반응 후, HRP 등으로 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, HRP 표지의 경우, 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)) 등을 이용한 활성 측정을 행하는 것에 의해, 피험 항체가 당해 인간 PAI-1 부분 펩타이드에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 여러 가지 아미노산 서열을 갖는 인간 PAI-1 부분 펩타이드에 대한 결합 활성을 평가하는 것에 의해, 피험 항체의 에피토프를 결정할 수 있다. 피험 항체의 에피토프가, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체의 에피토프가 동일한 경우, 피험 항체가, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체와 동일한 인간 PAI-1 에피토프에 결합한다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체에는, VTN-PAI-1 복합체에 결합하는 항체이면, VTN-PAI-1 복합체에의 결합에 더하여, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 다른 동물 유래의 활성형 PAI-1(예를 들어, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 원숭이 PAI-1)에도 결합하는 항체도 포함된다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 본 명세서에 개시되는, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 후술하는 ＜본 발명의 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산된 항인간 PAI-1 항체＞에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 필요에 따라 추가로 정제된 후, 정해진 방법에 따라 제제화되어, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증, 간질성 폐렴, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 당뇨병성 신증, 루프스 신염, 이식편대숙주병, 사구체 신염, 네프로제 증후군, 신섬유증, 만성 폐색성 폐질환, 급성 신장애, 급성 폐장애, 급성 호흡부전, 노인성 황반변성, 파종성 혈관내응고증후군, 수술후유착, 증후성 초자체황반유착, 당뇨병 망막증, 동맥경화, 심근경색, 뇌경색, 폐경색, 녹내장 수술 후의 결막의 반흔화 등의 안섬유화를 수반하는 질환, 복막 경화증 등, 활성형 PAI-1이 병태 형성에 관여하는 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞
본 발명의 폴리뉴클레오타이드에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열에 나타나는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1의 염기 번호 1로부터 354까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3의 염기 번호 1로부터 324까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 그의 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이와 같은 유전자 합성 방법으로서는, WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
＜본 발명의 발현 벡터＞
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
바람직한 본 발명의 발현 벡터로서는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 또는 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터로서는, 진핵 세포(예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵 세포(예를 들어, 대장균)의 각종의 숙주 세포 중에서 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하고, 이들에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는, pEE6.4나 pEE12.4(론자사)를 사용할 수 있다. 또한, AG-γ1이나 AG-κ(예를 들어, WO94/20632를 참조) 등의 미리 인간 Ig 정상 영역 유전자를 갖는 발현 벡터에 가변 영역 유전자 단편을 도입하여 항체 유전자를 발현할 수도 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 세균(예를 들어, 에셰리키아속 균)에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 효모에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서 동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 인핸서 서열, 본 발명의 항체 또는 그의 중쇄 가변 영역 혹은 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
＜본 발명의 형질 전환된 숙주 세포＞
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
(a) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포로서는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환하는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어, 항체를 발현할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 형질 전환하는 숙주 세포로서는, 예를 들어, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립(樹立)된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 동물 세포(예를 들어, CHO-K1SV 세포), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 세균(에셰리키아속 균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있고, 바람직하게는, CHO 세포(CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포 등), 293 세포, NS0 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.
＜본 발명의 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산된 항인간 PAI-1 항체＞
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 해당 방법에서 사용되는 바람직한 숙주 세포로서는, 전술한 바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH, 및 배양 시간은, 적절히 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 약 5∼20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1959, Vol. 130, No. 3373, p. 432-7), DMEM 배지(Virology, 1959, Vol. 8, p. 396), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519), 199 배지(Exp. Biol. Med., 1950, Vol. 73, p. 1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼72시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol. 82, p. 8404) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들어, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프 리커, 펩톤, 카제인, 고기 추출물, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류 등), 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등)을 포함하고 있어도 된다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 바람직한 배지로서는, 예를 들어, LB 배지, M9 배지(Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, Vol. 3, A2.2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 14∼39℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, Vol. 77, p. 4505) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 환기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술과 같은 배양에 의해, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정에 더하여, 추가로, 해당 형질 전환된 숙주 세포로부터 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 배양 상청 중에 축적된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예를 들어, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법으로 생산된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다.
＜본 발명의 의약 조성물＞
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 따라 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수종의 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역 후 수식을 받고 있지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재되는 의약 조성물도 포함된다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물.
본 발명의 의약 조성물에는, 중쇄 C말단 라이신의 결실 항체, N말단 번역 후 수식을 받은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 중쇄 C말단 라이신을 결실하고 N말단 번역 후 수식을 받은 항체, 및/또는 중쇄 C말단 라이신을 갖고 N말단 번역 후 수식을 받고 있지 않은 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 항인간 PAI-1 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)∼(4) 중 2종 이상의 항인간 PAI-1 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
(2) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
(3) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
(4) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
또 하나의 실시형태에 있어서, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재되는 의약 조성물도 포함된다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 PAI-1 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
상기 제제화에 있어서의 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 항체의 결합 역가 등에 따라 다르지만, 예를 들어 0.001mg/kg∼100mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 활성형 인간 PAI-1이 병태 형성에 관여하는 질환, 예를 들어, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 포함하는, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증을 치료 또는 예방하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 포함된다. 더욱이, 본 발명에는, 특발성 폐섬유증 등의 폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의, 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 사용이 포함된다.
＜융합 항체 및 수식 항체＞
당업자이면, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를, 다른 펩타이드 또는 단백질을 융합한 융합 항체로서 제작하는 것이나, 수식제를 결합시킨 수식 항체로서 제작하는 것도 가능하다. 본 발명의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 이와 같은 융합체나 수식체의 형태의 항체 또는 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에는, 다른 펩타이드 또는 단백질과 융합한 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 또는 수식제를 결합시킨 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 융합 항체로서 VTN-PAI-1 복합체와의 결합 활성을 갖고 있는 한, 융합에 이용되는 다른 펩타이드 또는 단백질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩타이드, 인공 헬릭스 모티프 펩타이드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스퍼라제, 각종 독소, 그 외 다량체화를 촉진할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 수식 항체로서 VTN-PAI-1 복합체와의 결합 활성을 갖고 있는 한, 수식에 이용되는 수식제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에 대해 더욱 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
시판되는 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 대해서는, 특별히 예고하지 않는 한 첨부된 프로토콜에 따라 실험을 행했다. 또한, 편의상, 농도 mol/L를 M으로서 나타낸다. 예를 들어, 1M 수산화나트륨 수용액은 1mol/L의 수산화나트륨 수용액인 것을 의미한다.
(실시예 1: 면역 항원의 검토 및 항인간 PAI-1 항체 산생 하이브리도마의 제작)
활성형 인간 PAI-1에 선택성이 높은 항체를 취득하기 위해서, 최적인 인간 PAI-1 펩타이드 항원을 검토했다. 펩타이드의 길이나 아미노산 서열을 검토한 결과, 인간 PAI-1 중의 16 아미노산 잔기의 펩타이드 항원 STAVIVSARMAPEEII(서열 번호 5)의 C말단에 Multiple Antigen Peptide 8(MAP8) 펩타이드(J. Biol. Chem., 1988, Vol. 263, No. 4, p. 1719-1725)를 연결한 것을 면역시킨 경우에, 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1을 중화하는 항체를 취득할 수 있다는 것이 명백해졌다. 추가로 항원에 연결하는 단백질이나 면역 방법 등을 창의 검토한 결과, 이 펩타이드 항원의 C말단에 Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH) 단백질을 연결한 것과 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 혼합하여 동시에 면역시킨 경우에, 혈장 중의 활성형 인간 PAI-1을 강력하게 중화시키고, 또한 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1(VTN-PAI-1 복합체)에 선택성이 높은 항체를 취득할 수 있다는 것이 명백해졌다.
인간 모노클로널 항체 개발 기술 「벨로시뮨」(VelocImmune antibody technology: Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항체를 제작했다. 구체적으로는, 벨로시뮨 마우스에, 면역 반응을 야기하는 아주반트와 함께, 인간 PAI-1 중의 16 아미노산 잔기의 펩타이드 항원 STAVIVSARMAPEEII(서열 번호 5)의 C말단에 KLH 단백질을 연결한 펩타이드 항원과 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 면역시켰다. 마우스에 복수회 면역시켜, 혈장중 항체가의 상승을 확인했다. 최종적으로 7회 면역을 행하고, 정해진 방법에 따라, 면역시킨 마우스의 림프절을 적출하여 림프구를 회수하고, 이것을 마우스 유래 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC: CRL-1581)와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작했다. 하이브리도마의 한계 희석 샘플을 제작하여, 단클론화를 행했다. 각 클론에 대해, 확대 배양을 행한 후에 무혈청 배지인 CD 하이브리도마 미디엄(Invitrogen사)으로 배지 변경하여, 약 1주간 배양했다. 얻어진 배양 상청으로부터 프로틴 G 컬럼(GE헬스케어사)을 이용하여 항체를 정제했다. 벨로시뮨 기술에서는, 내인성의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 대응하는 인간 가변 영역에서 치환된 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 이용하기 때문에, 얻어진 항체는, 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체(키메라 항체라고도 칭한다)이다.
(실시예 2: ELISA 어세이)
항체의 항원 특이적 결합 활성을 측정하기 위해서, ELISA 어세이를 사용했다. 여기에서, 활성형 인간 PAI-1에 대한 선택성을 평가하기 위해서, 비트로넥틴을 고상화하고, 활성형 인간 PAI-1을 첨가하여 제작한 플레이트와, 활성형 인간 PAI-1 대신에 잠재형 인간 PAI-1을 첨가하여 제작한 플레이트를 이용하여 시험했다.
비트로넥틴(BD Biosciences사, 354238)을 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, 비트로넥틴을 고상화했다. 역원심에 의해 비트로넥틴 고상액을 제거하고, PBS로 1000ng/mL의 농도로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A) 또는 재조합 잠재형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-L)을 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치했다. 역원심에 의해 용액을 제거하고, PBS로 3배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 1웰당 200μL 첨가했다. 실온에서 1시간 정치한 후, 역원심에 의해 블로킹제를 제거했다. PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 이용하여, 정제 항체 샘플을, 활성형 인간 PAI-1을 첨가한 플레이트에 대해서는 1000ng/mL로부터 0.1ng/mL까지, 잠재형 인간 PAI-1을 첨가한 플레이트에 대해서는 3000ng/mL로부터 0.3ng/mL까지 각각 7단계로 희석하고, 1웰당 100μL 첨가했다. 컨트롤로서, 항체 대신에 PBS로 20배로 희석한 블로킹제 용액을 첨가한 웰을 준비했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 세정액(0.05% Tween-20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS))으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹제 용액으로 2000배로 희석한 HRP 표지 토끼 항마우스 Ig 항체(DAKO사, P260)를 100μL 첨가했다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정했다. 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)에 포함되는 발색액을 100μL 가하고, 실온에서 15분간 정도 정치한 후, 상기 발색 키트에 포함되는 반응 정지액을 100μL 첨가하고, 그 OD450치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정했다.
각 항체의 각 농도에 있어서의 PAI-1 결합률을 산출함에 있어서, 항체 대신에 PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 각 항체의 측정치의 최대치를 100%로 설정했다. 측정치로부터 산출한 PAI-1 결합률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 EC50치를 산출했다.
그 결과, HOT-1이라고 명명한 항체(키메라 항체)가, VTN-PAI-1 복합체에 대해서 선택적으로, 잠재형 PAI-1과 비교하여 높은 결합 활성을 갖는다는 것이 명백해졌다.
(실시예 3: 완전 인간형 항체의 제작)
전술한 항체는, 가변 영역이 인간 유래이며, 정상 영역이 마우스 유래의 항체이다. 그래서, 본 발명자들은, 포유 세포 발현용 벡터인 GS 벡터(Lonza사)를 이용하여, 중쇄 및 경쇄의 양 유전자를 포함하는 발현 벡터를 구축하여, 완전 인간형 항체를 제작했다. 구체적으로는, 실시예 2에서 동정된 HOT-1에 대해, 하이브리도마로부터 RNA를 추출하고, cDNA 증폭 키트(SMARTer RACE cDNA Amplification kit; Clontech사)를 이용하여, cDNA를 제작했다. 그 다음에, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 신장 및 증폭했다. HOT-1의 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(Nigel Whittle 등, Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505)을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igγ1의 정상 영역 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 355로부터 1344까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결하고, 이 중쇄 유전자를 GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 또한, HOT-1의 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(Nigel Whittle 등, 앞서 나옴)을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자(서열 번호 3의 아미노산 번호 325로부터 642까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결하고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4에 삽입했다.
pEE6.4에 삽입한 항체의 중쇄 유전자 서열, pEE12.4에 삽입한 항체의 경쇄 유전자 서열을 시퀀서로 해석하고, 그 결과 얻어진 아미노산 서열로부터, Kabat 등의 데이터베이스(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office)를 참조하여 CDR 서열을 결정했다.
제작한 HOT-1의 완전 인간형 항체(완전 인간형 HOT-1)의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 해당 항체의 경쇄의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. 서열 번호 2에서 나타나는 중쇄의 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35, 50으로부터 66, 99로부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열 번호 4에서 나타나는 경쇄의 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34, 50으로부터 56, 89로부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
완전 인간형 HOT-1의 중쇄와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 GS 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, DNA Ligation 키트(다카라바이오사)를 이용하여 라이게이션을 행하여, 중쇄와 경쇄의 양 유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축했다. 당해 GS 벡터를 이용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항체 발현을 행했다. 일과성 발현에 대해서는, FreeStyle 293 Expression medium(Invitrogen사)에서 약 100만개/mL로 배양된 FreeStyle 293 세포(Invitrogen사)에 대해, 당해 GS 벡터를 유전자 도입 시약 Freestyle MAX(Invitrogen사)를 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 그의 배양 상청으로부터 프로틴 G 컬럼(GE헬스케어사)을 이용하여, 완전 인간형 항체의 정제 항체를 얻었다. 항상적 발현에 대해서는, 당해 GS 벡터를 일렉트로포레이션법을 이용하여 CHO-K1SV 세포(Lonza사)에 트랜스펙션하는 것에 의해 항체를 발현시켰다. 그의 배양 상청으로부터 프로틴 A 컬럼(GE헬스케어사)을 이용하여, 완전 인간형 항체를 정제했다.
(실시예 4: 완전 인간형 항체의 아미노산 수식 분석)
정제한 완전 인간형 HOT-1의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제 항체의 대부분에 있어서, 중쇄 C말단의 라이신 결실이 생겨 있었다.
(실시예 5: 인간 혈장중 활성형 PAI-1 저해 활성 측정)
실시예 2에서 동정한 HOT-1(키메라 항체) 및 실시예 3에서 제작한 완전 인간형 HOT-1에 대해 인간 혈장 중의 활성형 PAI-1 저해 활성을 평가하기 위해서, 비만 환자의 혈장을 이용하여, 활성형 PAI-1 저해 어세이를 실시했다. 정상인의 혈장을 이용한 경우, 활성형 PAI-1의 농도가 낮아 어세이계의 구축이 곤란하기 때문에, 혈장중 활성형 PAI-1 농도가 높다는 것이 알려져 있는 비만 환자의 혈장을 이용했다(Nature Medicine, 1996, Vol. 2, p. 800-803).
uPA(우로키나제 정주용 6만 단위 「베네시스」(등록상표); 다나베미쓰비시제약주식회사)를 PBS로 50unit/mL가 되도록 희석하고, 어세이 플레이트인 눙크 맥시소프 백색 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, uPA를 고상화했다. 고상액을 역원심으로 제거하고, PBS로 3배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 1웰당 200μL 첨가하고 실온에서 1시간 정치했다.
그 동안에, 비만 환자 혈장 및 항체 샘플의 혼합액(혈장-항체 혼합액)을 조제했다. 구체적으로는, 0.1% 소 혈청 유래 알부민(BSA) 함유 PBS를 이용하여, 혈장-항체 혼합액을 조제했을 때에 비만 환자 혈장이 35배 희석이 되도록 혈장을 희석했다(혈장-항체 혼합액에 포함되는 인간 혈장 유래 활성형 PAI-1의 농도는 약 360pg/mL). 또한, 0.1% BSA 함유 PBS를 이용하여, 항체의 종(終)농도가 7단계의 희석 계열에서 1000ng/mL로부터 1ng/mL까지 되도록 항체 샘플을 희석했다. 그 후, 상기 혈장 및 항체 샘플을 혼합하여, 혈장-항체 혼합액을 조제했다. 검량선용 샘플로서 0.1% BSA 함유 PBS로 10000pg/mL로부터 10pg/mL까지 7단계로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 조제했다. 컨트롤 샘플로서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 비만 환자 혈장과 혼합한 샘플을 준비했다. 이들 혈장-항체 혼합액, 검량선 샘플, 및 컨트롤 샘플을 실온에서 30분간 정치하여, 프리인큐베이트했다.
상기 어세이 플레이트 중의 블로킹제를 역원심으로 제거한 후, 상기 프리인큐베이트한 혈장-항체 혼합액, 검량선용 샘플, 및 컨트롤 샘플을 어세이 플레이트에 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 플레이트를 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액으로 3000배로 희석한 항PAI-1 항체(Progen Biotechnik사, MA-33H1F7)를 1웰당 100μL 첨가했다. 실온에서 30분간 정치한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액으로 2000배로 희석한 비오틴화 항마우스 Ig 항체(Ancell사, 234010)를 1웰당 100μL 첨가했다. 실온에서 30분간 정치한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액으로 1000배로 희석한 알칼리 포스파타제 표지 스트렙트아비딘(Thermo SCIENTIFIC사)을 1웰당 100μL 첨가했다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정했다. 2mM 트리스(pH 9.8) 함유 0.1mM 염화마그네슘 수용액으로 5배 희석한 알칼리 포스파타제 기질(Chemiluminescent AP; SurModics사, APU4-0100-01)을 1웰당 100μL 가하고, 그의 시그널치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정했다.
검량선을 이용하여 활성형 인간 PAI-1 농도를 산출했다. 각 항체에 대해 듀플리케이트로 시험을 행하여, 평균치를 산출했다. 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 비만 환자 혈장과 혼합한 샘플을 첨가한 웰의 활성형 인간 PAI-1 농도를 100%로서 설정하고, 항체 1000ng/mL를 비만 환자 혈장과 혼합한 웰의 활성형 인간 PAI-1 농도를 0%로서 설정했다. 산출된 활성형 인간 PAI-1 억제율을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 IC50치를 산출했다.
그 결과, HOT-1(키메라 항체)의 IC50치는 11.3ng/mL이고, 완전 인간형 HOT-1의 IC50은 6.0ng/mL로, 어느 항체도 인간 혈장 중의 활성형 PAI-1의 uPA 결합 활성을 저해한다는 것이 분명해졌다.
(실시예 6: VTN-PAI-1 복합체에 대한 결합 선택성 평가)
ELISA 어세이를 이용하여, 실시예 3에서 제작한 완전 인간형 HOT-1의 VTN-PAI-1 복합체에 대한 결합 선택성을 평가했다. 다음의 (1)∼(4)의 네 가지의 인간 PAI-1 고상화 플레이트를 제작하고, 각 플레이트를 이용하여 시험했다.
(1) VTN-PAI-1 복합체 고상화 플레이트
비트로넥틴(BD Biosciences사, 354238)을 PBS로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, 비트로넥틴을 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 0.1% BSA 함유 PBS로 1000ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 100μL 첨가하여, 비트로넥틴에 포착시켰다. 본 플레이트에서의 시험에 의해, VTN-PAI-1에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다.
(2) 잠재형 인간 PAI-1 고상화 플레이트
재조합 잠재형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-L)을 PBS로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, 잠재형 인간 PAI-1을 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 본 플레이트에서의 시험에 의해, 잠재형 인간 PAI-1에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다.
(3) uPA-PAI-1 복합체 고상화 플레이트
uPA(우로키나제 정주용 6만 단위 「베네시스」(등록상표); 다나베미쓰비시제약주식회사)를 PBS로 100unit/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, uPA를 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 0.1% BSA 함유 PBS로 1000ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 100μL 첨가하여, uPA에 포착시켰다. 본 플레이트에서의 시험에 의해, uPA-PAI-1 복합체에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다.
(4) tPA-PAI-1 복합체 고상화 플레이트
tPA(액티바신(등록상표) 주 600만; 교와핫코기린주식회사)를 PBS로 1000unit/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 투명 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, tPA를 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 0.1% BSA 함유 PBS로 1000ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 100μL 첨가하여, tPA에 포착시켰다. 본 플레이트에서의 시험에 의해, tPA-PAI-1 복합체에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다.
제작한 각 인간 PAI-1 고상화 플레이트를 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 세정하고, 0.1% BSA 함유 PBS로 100000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 8단계로 희석한 완전 인간형 HOT-1을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 비교 항체로서, 완전 인간형 항인간 PAI-1 항체인 MEDI-579(특허문헌 3), 마우스 항인간 PAI-1 항체인 MA-33B8(Progen Biotechnik사), MA-33H1F7(Progen Biotechnik사), MA-55F4C12(Hycult Biotech사, HM2180), 및 MA-56A7C10(Hycult Biotech사, HM2182)을 0.1% BSA 함유 PBS를 이용하여 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하고, 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 또한, 컨트롤로서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰을 제작했다. 세정액으로 3회 세정한 후, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 2000배로 희석한 검출 항체를 1웰당 100μL 첨가하여 반응시켰다. 검출 항체로서는, 마우스 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 염소 항마우스 Ig 항체(Southern Biotech사, 1010-05)를, 인간 항체의 Fc 영역을 갖는 피험 항체의 검출용으로 HRP 표지 토끼 항인간 Ig 항체(Southern Biotech사, 6145-05)를 이용했다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정했다. 퍼옥시다제용 발색 키트(스미토모 베이클라이트사)에 포함되는 발색액을 1웰당 100μL 가하고, 실온에서 15분간 정도 정치한 후, 상기 발색 키트에 포함되는 반응 정지액을 100μL 첨가하고, 그 OD450치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정했다.
플레이트마다, 각 항체의 시험을 듀플리케이트로 행하여, 평균치를 산출했다. 각 항체의 각 농도에 있어서의 PAI-1 결합률을 산출함에 있어서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰의 측정치를 0%로 하고, 각 항체에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정했다. 단, 완전 인간형 HOT-1에 대해서는, 잠재형 인간 PAI-1, uPA-PAI-1 복합체, 및 tPA-PAI-1 복합체에 대한 결합 활성 평가계에 있어서, 최대 농도 첨가해도 동일한 인간 Fc 영역을 갖는 MEDI-579의 최대 농도의 측정치에 도달하지 않았기 때문에, MEDI-579의 각 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정했다. 또한, MA33-B8에 대해서는, VTN-PAI-1 복합체에 대한 결합 활성 평가계에 있어서, 최대 농도 첨가해도 동일한 마우스 Fc 영역을 갖는 MA56-A7C10의 최대 농도의 측정치에 도달하지 않았기 때문에, MA56-A7C10의 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정했다. 산출된 PAI-1 결합률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 EC50치를 산출했다.
표 1: 항인간 PAI-1 항체의 각종 인간 PAI-1에 대한 결합 활성
EC50치(ng/mL)
VTN-PAI-1 잠재형 인간 PAI-1 인간 uPA-PAI-1 인간 tPA-PAI-1
완전 인간형 HOT-1 4.2 88801 ＞100000 ＞100000
MEDI-579 5.2 22.1 6.1 3.2
MA33-H1F7 14.3 13.6 12.7 11.7
MA33-B8 5685 639.8 12.9 22.8
MA55-F4C12 7.5 12.8 9.8 9.2
MA56-A7C10 23.9 29.9 16.0 12.7
＞100000은, MEDI-579의 각 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치의 50%를 나타내는 항체 농도가 100000ng/mL보다도 크다는 것을 의미한다.
그 결과, 완전 인간형 HOT-1은, VTN-PAI-1 복합체에 대해서 강한 결합 활성을 나타내고, 또한 극히 높은 선택적 결합 활성을 갖는다는 것이 명백해졌다.
완전 인간형 HOT-1은, 각 비교 항체와 비교하여 VTN-PAI-1 복합체에 대해서 극히 높은 선택적 결합 활성을 갖기 때문에, 완전 인간형 HOT-1은, 종래 알려져 있던 항인간 PAI-1 항체와는 PAI-1과의 결합 부위가 달라, 인간 PAI-1의 활성 중심 또는 그 주변에 보다 가까운 부위에 결합하고 있다는 것이 시사되었다.
(실시예 7: 단량체 활성형 인간 PAI-1에 대한 결합 평가)
완전 인간형 HOT-1의 단량체 활성형 인간 PAI-1에의 결합 활성을 측정하기 위해서, SPR 해석을 행했다. SPR 해석에 있어서는, Biacore(등록상표) T200(GE헬스케어재팬) 및 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 이용하여 해석을 행했다. 그 결과, 완전 인간형 HOT-1이 단량체로서 존재하는 활성형 인간 PAI-1에 결합한다는 것이 분명해졌다.
(실시예 8: 원숭이 PAI-1에 대한 결합 선택성 평가)
ELISA 어세이를 이용하여, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 원숭이 PAI-1(VTN-원숭이 PAI-1 복합체라고도 칭한다)에 대한 완전 인간형 HOT-1의 결합 선택성을 평가했다. 다음의 (1)∼(4)의 네 가지의 원숭이 PAI-1 고상화 플레이트를 제작하고, 각 플레이트를 이용하여 시험했다. 비교 항체로서 MEDI-579를 사용했다.
(1) VTN-원숭이 PAI-1 복합체 고상화 플레이트
실시예 6(1)에 기재된 방법에 따라, VTN-원숭이 PAI-1에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다. 단, 재조합 활성형 인간 PAI-1 대신에, 재조합 활성형 원숭이 PAI-1(Molecular Innovation사, CYPAI)을 사용했다. 또한, 완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579를 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하여 사용했다.
(2) 잠재형 원숭이 PAI-1 고상화 플레이트
실시예 6(2)에 기재된 방법에 따라, 잠재형 원숭이 PAI-1에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다. 단, 재조합 잠재형 인간 PAI-1 대신에, 재조합 잠재형 원숭이 PAI-1(Molecular Innovation사, CYPAI-L)을 사용했다. 또한, 완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579를 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하여 사용했다.
(3) uPA-원숭이 PAI-1 복합체 고상화 플레이트
실시예 6(3)에 기재된 방법에 따라, uPA-원숭이 PAI-1 복합체에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다. 단, 재조합 활성형 인간 PAI-1 대신에, 재조합 활성형 원숭이 PAI-1(Molecular Innovation사, CYPAI)을 사용했다. 또한, 완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579를 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하여 사용했다.
(4) tPA-원숭이 PAI-1 복합체 고상화 플레이트
실시예 6(4)에 기재된 방법에 따라, tPA-원숭이 PAI-1 복합체에 대한 항체의 결합 활성을 평가했다. 단, 재조합 활성형 인간 PAI-1 대신에, 재조합 활성형 원숭이 PAI-1(Molecular Innovation사, CYPAI)을 사용했다. 또한, 완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579를 10000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 7단계로 희석하여 사용했다.
제작한 각 원숭이 PAI-1 고상화 플레이트를 이용하여, 실시예 6에 기재된 방법에 따라, 각 항체의 EC50치를 산출했다. 단, 완전 인간형 HOT-1에 대해서는, 잠재형 원숭이 PAI-1, uPA-원숭이 PAI-1 복합체, 및 tPA-원숭이 PAI-1 복합체에 대한 결합 활성 평가계에 있어서, 최대 농도 첨가해도 동일한 인간 Fc 영역을 갖는 MEDI-579의 최대 농도의 측정치에 도달하지 않았기 때문에, MEDI-579의 각 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치를 100%로 설정했다.
표 2: 항PAI-1 항체의 각종 원숭이 PAI-1에 대한 결합 활성
EC50치(ng/mL)
VTN-원숭이 PAI-1 잠재형 원숭이 PAI-1 uPA-원숭이 PAI-1 tPA-원숭이 PAI-1
완전 인간형 HOT-1 3.6 ＞10000 ＞10000 ＞10000
MEDI-579 4.1 48.2 5.4 4.3
＞10000은, MEDI-579의 각 평가계에 있어서의 최대 농도의 측정치의 50%를 나타내는 항체 농도가 10000ng/mL보다도 크다는 것을 의미한다.
그 결과, 완전 인간형 HOT-1 항체는, VTN-원숭이 PAI-1 복합체에 대해서 강한 결합 활성을 나타내고, 또한 극히 높은 선택적 결합 활성을 갖는다는 것이 명백해졌다.
(실시예 9: 인간 및 원숭이 혈장중 활성형 PAI-1 저해 활성 측정)
완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579의 인간 및 원숭이 혈장 중의 활성형 PAI-1 저해 활성의 평가를 실시했다. 인간 혈장에 대해서는, 실시예 5와 마찬가지로 비만 환자의 혈장을 이용했다. 원숭이 혈장에 대해서는, 카니쿠이 원숭이에 LPS를 정맥내 투여하여, 채취한 혈장을 이용했다.
인간 혈장 중의 활성형 PAI-1 저해 활성의 평가에 관해서는, 실시예 5의 방법에 따랐다. 원숭이 혈장 중의 활성형 PAI-1 저해 활성의 평가에 관해서는, 실시예 5에 기재된 방법 중, 인간 혈장 대신에, 원숭이 혈장을 이용했다. 원숭이 혈장에 대해서는, 0.1% BSA 함유 PBS를 이용하여, 혈장-항체 혼합액을 조제했을 때에 원숭이 혈장이 120배 희석이 되도록 혈장을 희석했다. 양 평가계 모두, 각 항체의 종농도는, 300ng/mL로부터 0.3ng/mL(7단계 희석)로 실시했다. 검량선용 샘플로서 0.1% BSA 함유 PBS로 3000pg/mL로부터 3pg/mL까지 7단계로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 사용했다.
검량선을 이용하여 각 활성형 PAI-1 농도를 산출했다. 각 항체에 대해 듀플리케이트로 시험을 행하여, 평균치를 산출했다. 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 비만 환자 혈장 또는 원숭이 혈장과 혼합한 샘플을 첨가한 웰의 활성형 PAI-1 농도를 100%로서 설정하고, MEDI-579 항체 300ng/mL를 비만 환자 혈장 또는 원숭이 혈장과 혼합한 웰의 각 활성형 PAI-1 농도를 0%로서 설정했다. 산출된 각 활성형 PAI-1 억제율을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 IC50치를 산출했다.
그 결과, 인간 혈장중 활성형 PAI-1의 uPA 결합 활성에 대한, 완전 인간형 HOT-1의 IC50치는 4.2ng/mL이며, MEDI-579의 IC50치는 0.73ng/mL였다. 원숭이 혈장중 활성형 PAI-1의 uPA 결합 활성에 대한, 완전 인간형 HOT-1의 IC50치는 37ng/mL이며, MEDI-579의 IC50치는 0.83ng/mL였다.
완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579는 인간 및 원숭이 혈장 중의 활성형 PAI-1의 uPA 결합 활성을 저해한다는 것이 분명해졌다.
(실시예 10: in vitro 혈관내 재현계에서의 PAI-1 저해 활성 측정)
혈관벽에 있어서 uPA 및 tPA가 혈관 내피로부터 산생되어, 혈관 내피에 결합하고 있다는 것이 알려져 있다(Baillieres Clin. Haematol., 1993, Vol. 6, No. 3, p. 559-576. Blood, 2011, Vol. 118, No. 11, p. 3182-3185). 즉, uPA 및 tPA는 혈중뿐만 아니라 혈관벽에도 존재한다. 실시예 9에서는, 항PAI-1 항체에 의한 혈장 중의 활성형 PAI-1의 저해 활성을 측정했지만, 이 실험계는 혈장중 성분만을 추출하고 있기 때문에 혈관벽의 영향이 고려되어 있지 않다. 그 때문에, 실제의 혈관중에 있어서의 생체 반응을 반영하고 있다고는 말하기 어렵다고 생각된다. 그래서, 실제의 혈관내 상태를 모방한 계로서 uPA-PAI-1 복합체를 고상화한 어세이 플레이트에 활성형 PAI-1, uPA 및 uPA 기질 펩타이드를 혼합한 평가계를 이용하여, 완전 인간형 HOT-1 및 MEDI-579의 활성과 uPA의 활성을 지표로 측정했다.
재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 PBS로 10μg/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 백색 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 20분간 플레이트를 정치함으로써, 활성형 PAI-1을 고상화했다. 고상액을 역원심으로 제거하고, 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 1웰당 200μL 첨가하여 실온에서 15분간 정치했다. 역원심으로 용액을 제거한 후, PBS로 3배로 희석한 블로킹제로 uPA(우로키나제 정주용 6만 단위 「베네시스」(등록상표); 다나베미쓰비시제약주식회사)을 50unit/mL가 되도록 희석하고 1웰당 100μL 첨가했다. 실온에서 20분간 정치한 후, 중탄산 완충액(시그마사, C3041-50CAP)을 1웰당 200μL 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다.
0.1% BSA 함유 PBS를 이용하여, 각 항체의 종농도가 10단계의 희석 계열로 500ng/mL로부터 0.015ng/mL까지 되도록 희석했다. 각 항체 용액에, PBS로 종농도 0.0025μg/mL가 되도록 희석한 재조합 인간 활성형 PAI-1, PBS로 종농도 0.0025μg/mL가 되도록 희석한 비트로넥틴, PBS로 종농도 65ng/mL가 되도록 희석한 uPA의 기질 펩타이드인 Glutarylglycyl-L-arginine 4-methylcoumaryl-7-amide(펩타이드 연구소, 3097-v), PBS로 종농도 1.25mg/mL가 되도록 희석한 BSA, 및 PBS로 종농도 0.05unit/mL가 되도록 희석한 uPA를 혼합했다. 또한, 컨트롤로서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰, 및 항체 및 재조합 인간 활성형 PAI-1 대신에 0.1% BSA 함유 PBS 및 PBS를 혼합한 웰을 제작했다.
플레이트를 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정한 후, 상기 혼합액을 1웰당 50μL 첨가하고, 실온에서 24시간 정치함으로써 uPA가 기질 펩타이드를 절단하는 효소 반응을 진행시켰다. 기질 펩타이드가 절단되면 형광 물질인 7-아미노-4-메틸-쿠마린이 펩타이드 본체로부터 절리된다. 각 웰의 샘플을 1웰당 20μL씩 채취하여 눙크 흑색 384 플레이트(Nunc사)로 옮기고, 여기 파장 400nm 및 형광 파장 505nm의 형광 시그널치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정했다.
각 항체의 시험을 듀플리케이트로 행하여, 평균치를 산출했다. 각 항체의 각 농도에 있어서의 uPA 활성률을 산출함에 있어서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰의 측정치의 평균치를 0%로 하고, 항체 및 재조합 인간 활성형 PAI-1 대신에 0.1% BSA 함유 PBS 및 PBS를 첨가한 웰의 측정치의 평균치를 100%로 설정했다. 산출된 uPA 활성률을 해석하여, 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 EC50치를 산출했다. PAI-1은 uPA 활성을 저해하기 때문에, 항체의 인간 PAI-1 저해 활성이 높을수록, uPA 활성이 높아진다.
그 결과, 본 평가계에 있어서의 uPA의 활성을 지표로 한, 완전 인간형 HOT-1의 EC50치는 12.7ng/mL이며, MEDI-579의 EC50치는 42.1ng/mL였다. 완전 인간형 HOT-1 쪽이 높은 uPA 활성화능을 갖는다는 것이 분명해졌다. 따라서, 본 평가계에 있어서, 완전 인간형 HOT-1 쪽이 높은 PAI-1 저해 활성을 갖는다는 것이 분명해졌다.
(실시예 11: 원숭이 혈장중 항체 농도 측정)
실시예 6의 결과로부터, 완전 인간형 HOT-1은 VTN-PAI-1 복합체에 대해서 강한 결합 활성을 나타내고, 또한 극히 높은 선택적 결합 활성을 갖는다는 것이 명백해졌다. 일반적으로, 혈중에 있어서의 항체는 그대로 대사되는 이외에 항원에 결합하여 항원-항체 복합체로서 대사된다는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012, Vol. 101, No. 12, p4367-4382). 혈장 중에 있어서의 PAI-1은 VTN-PAI-1 이외에도, 잠재형 PAI-1 및 tPA-PAI-1 복합체 등의 다양한 복합체 상태로 존재하기(Blood, 1990, Vol. 76, p. 930-937) 때문에, 선택성이 낮은 항PAI-1 항체는 다양한 PAI-1과 항원-항체 복합체를 형성하여 대사된다. 한편으로 완전 인간형 HOT-1은 VTN-PAI-1 선택적으로 결합하기 때문에 잠재형 PAI-1이나 PA-PAI-1과의 복합체로서는 대사되기 어렵고, 그 때문에 혈중에 있어서의 농도가 장기간 유지될 가능성이 생각되었다. 실제 항체의 혈중 농도 지속은 이 항원-항체 복합체의 대사 속도에 크게 의존한다는 것이 알려져 있다(Bioanalysis, 2011, Vol. 3, No. 6, p. 659-675). 실시예 8의 결과로부터, 완전 인간형 HOT-1은 VTN-원숭이 PAI-1 복합체에 대한 높은 선택적 결합 활성을 나타냈기 때문에, 원숭이에 항체를 투여했을 때의 혈장중 항체 농도를 측정했다. 비교 항체로서 MEDI-579를 사용했다.
카니쿠이 원숭이에 PBS로 희석한 완전 인간형 HOT-1 또는 MEDI-579를 정맥 투여했다. 처치군을 이하와 같이 설정했다.
[처치군]
HOT-1 투여군(3마리):
완전 인간형 HOT-1을 투여한 군(2.0mg/kg)
MEDI-579 투여군(2마리):
MEDI-579를 투여한 군(2.0mg/kg)
항체 투여 전, 및 항체 투여 0.25, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 336, 504시간 후에 채혈을 행하여, 혈장을 얻었다. 완전 인간형 HOT-1에 관해서는 추가로, 672, 936, 1200, 1440시간 후에도 채혈을 행하여, 혈장을 얻었다.
Electrochemiluminescence(ECL) 어세이에 의해, 혈장 중의 각 항체 농도를 측정했다.
완전 인간형 HOT-1의 ECL 어세이를 이하에 나타낸다. 비트로넥틴을 TBS로 100ng/mL가 되도록 희석하고, Multi-array 96-well Plate(Meso Scale Discovery사, L15XA-1)를 이용하여 1웰당 25μL 첨가했다. 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, 비트로넥틴을 플레이트에 고상화했다. 역원심에 의해 비트로넥틴 고상액을 제거하고, 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, TBS로 100ng/mL로 희석한 재조합 활성형 인간 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 1웰당 25μL 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치함으로써, 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정하고, 블로킹제 1(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)을 1웰당 150μL 첨가했다. 실온에서 1시간 정치한 후, 역원심에 의해 블로킹제 1을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다. 항체 투여의 원숭이 혈장을 0.05% Tween-20 함유 블로킹제 1 용액으로 100배로 희석하고, 추가로, 항체 미투여의 원숭이 혈장을 1% 포함하는 0.05% Tween-20 함유 블로킹제 1 용액(이하, 혈장-Tween 함유 블로킹제 1 용액이라고 칭한다)을 이용하여 검량선의 범위 내가 되도록 희석하고, 1웰당 25μL 첨가했다. 검량선 작성용으로, 혈장-Tween 함유 블로킹제 1 용액을 이용하여, 100ng/mL로부터 0.0017ng/mL까지 11단계로 희석한 완전 인간형 HOT-1을 첨가한 웰을 준비했다. 컨트롤로서, 항체 대신에 혈장-Tween 함유 블로킹제 1 용액을 첨가한 웰을 준비했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다. 0.05% Tween-20 함유 블로킹제 1 용액을 이용하여 80ng/mL로 희석한 원숭이 이뮤노글로불린 흡수 항인간 IgG 경쇄 비오틴(면역생물연구소, 17249)을 25μL 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다. 0.05% Tween-20 함유 블로킹제 1 용액을 이용하여 20ng/mL로 희석한 MSD SULFO-TAG Streptavidin(Meso Scale Discovery사, R32AD-1)을 25μL 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다. 초순수(MilliQ(등록상표), 메르크사)로 2배로 희석한 MSD Read Buffer T(4x) with Surfactant(Meso Scale Discovery사, R92TC-2)를 150μL 첨가하고, 그의 전기화학발광을 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery사)으로 측정했다.
완전 인간형 HOT-1의 ECL 어세이의 방법에 따라, MEDI-579의 혈장중 농도를 측정했다. 단, 비트로넥틴 및 재조합 활성형 인간 PAI-1의 농도는 75ng/mL로 사용했다. 또한, 재조합 활성형 PAI-1을 고상화한 후의 블로킹 공정으로서, 블로킹제 1 처리 대신에, 이하의 블로킹 처리를 행했다. TBS로 5w/v%로 용해한 블로킹제 2(Meso Scale Discovery사, R93BA-1)를 1웰당 150μL 첨가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 블로킹제를 제거하고, 세정액으로 3회 세정한 후, 블로킹제 1로 4배 희석한 블로킹제 3(Meso Scale Discovery사, R51BB-3)을 1웰당 50μL 첨가했다.
항체 농도를 산출함에 있어서, 검량선을 작성했다. 회귀식은 5-파라미터 로지스틱 모델로 해석을 행했다. 가중은 1/y2로 했다. 검량선으로부터, 각 채혈 포인트에 있어서의 항체 농도를 산출했다. 각 혈장의 시험을 트리플리케이트로 행하여, 산출한 농도의 평균치를 구했다. 얻어진 항체 농도를 각 피험 물질, 각 피험 원숭이마다, BioBook(IDBS사)으로 해석하여, 세로축을 항체 농도의 대수치, 가로축을 채혈 시간으로 하여 그린 그래프의 β층의 기울기로부터 반감기를 산출했다.
그 결과, MEDI-579의 반감기는 52.6시간인 것에 대해, 완전 인간형 HOT-1의 반감기는 255시간이었다. 완전 인간형 HOT-1 쪽이 보다 긴 시간 혈중에서 유지된다는 것이 명백해졌다.
(실시예 12: 원숭이 혈중 활성형 PAI-1 저해 활성 측정)
원숭이의 혈중에서 장기간 또한 강력하게 PAI-1 활성을 저해하는 것이, 폐섬유증 등의 PAI-1이 병태에 관여하는 질환의 예방 또는 치료에 바람직하다. 그래서, 완전 인간형 HOT-1의 원숭이 혈중에 있어서의 활성형 PAI-1 저해 활성을 평가했다. 비교 항체로서 MEDI-579를 사용했다.
실시예 11에 있어서 완전 인간형 HOT-1 또는 MEDI-579를 투여한 원숭이로부터 얻은 혈장을 이용하여 혈중 활성형 PAI-1의 저해 활성을 측정했다.
uPA(우로키나제 정주용 6만 단위 「베네시스(등록상표)」; 다나베미쓰비시제약주식회사)를 PBS로 50unit/mL가 되도록 희석하고, 눙크 맥시소프 백색 96 플레이트(Nunc사)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 플레이트를 정치함으로써, uPA를 고상화했다. 역원심에 의해 고상액을 제거하고, 블로킹제(Thermo SCIENTIFIC사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 세정액(0.05% Tween-20 함유 TBS)으로 세정하고, 0.1% BSA 함유 PBS로 10배로 희석한 혈장을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 이 때, 검량선용으로서 0.1% BSA 함유 PBS를 이용하여 인간 활성형 PAI-1(Molecular Innovation사, PAI-A)을 300ng/mL로부터 0.003ng/mL까지 7단계로 희석하고, 1웰당 100μL 첨가하고, 혈장과 동시에 실온에서 30분간 정치했다. 또한, 컨트롤로서, 항체 대신에 0.1% BSA 함유 PBS를 첨가한 웰을 제작했다. 세정액으로 3회 세정한 후, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 10000배로 희석한 비오틴화(도진화학연구소, LK03) 항PAI-1 항체(Progen Biotechnik사, MA-33H1F7)를 1웰당 100μL 첨가하여 반응시켰다. 여기에서, 실시예 6의 결과로부터, 플레이트 상의 uPA-PAI-1 복합체를 인식하는 항PAI-1 항체로서 MA-33H1F7을 사용했다. 또한, 비오틴화는 도진화학연구소의 키트에 지정된 방법으로 행했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹제(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 사용하여 1000배로 희석한 스트렙트아비딘-AL(Thermo SCIENTIFIC사, 21324)을 1웰당 100μL 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 세정액으로 3회 세정하고, 2mM 트리스(pH 9.8) 함유 0.1mM 염화마그네슘 수용액으로 5배 희석한 알칼리 포스파타제 기질(Chemiluminescent AP; SurModics사, APU4-0100-01)을 1웰당 100μL 가했다. 30분간 실온에 정치한 후에, 시그널치를 EnVision 카운터(퍼킨엘머사)로 측정했다.
검량선을 이용하여 활성형 PAI-1 농도를 산출했다. 각 항체의 원숭이 혈장중 활성형 PAI-1 저해 작용의 결과를 도 1에 나타낸다. 각 혈장에 대해 듀플리케이트로 시험을 행하여, 평균치를 산출했다. 또한 시험에 이용한 각 군의 원숭이 혈장의 값을 평균했다. 항체 투여 전의 활성형 PAI-1 농도를 100%로 하고, 검량선용 활성형 PAI-1 농도 0ng/mL를 0%로 하여 각 혈장에 있어서의 활성형 PAI-1 농도로부터 억제 비율을 산출하여, 항체 투여 후의 혈장중 활성형 PAI-1 농도를 투여 전에 비해 50% 이상 억제할 수 있는 일수를 구했다.
그 결과, 완전 인간형 HOT-1을 투여한 군에 있어서는 28일, MEDI-579의 투여군에서는 7일이었다. 완전 인간형 HOT-1은 MEDI-579와 비교하여 혈장 중에 있어서의 활성형 PAI-1을 보다 장기적으로 또한 강력하게 억제한다는 것이 명백해졌다.
본 발명의 항인간 PAI-1 항체는, 활성형 인간 PAI-1이 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포 및 항체를 생산하는 방법은, 상기 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 데 유용하다.
이하의 서열목록의 숫자식별기호＜223＞에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열목록의 서열 번호 1 및 3으로 표시되는 염기 서열은, 각각 완전 인간형 HOT-1의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열이며, 염기 번호 2 및 4로 표시되는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 1 및 3에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Novel Anti-human PAI-1 antibody <130> A15003A00 <150> JP2014-031319 <151> 2014-02-21 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain gene of anti-human PAI-1 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 1 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat cat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His 20 25 30 ggc atg acc tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tct ggt att aat tgg aat ggt gct aga aca gtt tat gca gac tct gtg 192 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Arg Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctc tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cac ctg atc agt ctg aga gcc gag gac acg gcc ttg tat cac tgt 288 Leu His Leu Ile Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 gcg aga gat cgg gga ctg ggc ctc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc 336 Ala Arg Asp Arg Gly Leu Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc 384 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc 432 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac 480 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag 528 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc 576 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc 624 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act 672 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 720 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 768 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 816 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 864 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc 912 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 960 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1008 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1056 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1104 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1152 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 1200 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1248 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1296 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1344 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 tga 1347 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Arg Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ile Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Leu Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of anti-human PAI-1 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 3 gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aag atc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 tat aag gcg tct aga ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg atc agc ggc 192 Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gat gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat ggt tat tcg tac 288 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt acg gtg gct gca 336 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctg agc 528 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 ttc aac agg gga gag tgt tag 645 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile 1 5 10 15

Claims (31)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    이하의 (1)∼(2)의 어느 것으로부터 선택되는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
    (1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트; 및
    (2) 상기 (1)의 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인,
    항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  4. 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  5. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,
    번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 라이신 결실인, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하고, 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  9. 제 3 항에 있어서,
    서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1본 쇄 가변 영역 프래그먼트, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항원 결합 프래그먼트.
  11. 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 PAI-1 항체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 라이신 결실인, 항인간 PAI-1 항체.
  13. 제 11 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 447까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 PAI-1 항체.
  14. 제 9 항 또는 제 13 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체와 활성형 인간 PAI-1의 결합을 저해하고, 비트로넥틴과 복합체를 형성한 활성형 인간 PAI-1에 결합하며, 또한 잠재형 인간 PAI-1에도, 플라스미노젠 액티베이터와 복합체를 형성한 인간 PAI-1에도 결합하지 않는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  15. 제 9 항 또는 제 13 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체와 동일한 인간 PAI-1 에피토프에 결합하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  16. 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제 16 항 및/또는 제 17 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  19. 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제 18 항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
    (a) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (d) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  20. 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제 18 항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
    (a) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (d) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  21. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법.
    (a) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  22. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 PAI-1 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 PAI-1 항체를 생산하는 방법.
    (a) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 해당 항인간 PAI-1 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  23. 제 21 항에 기재된 방법으로 생산된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  24. 제 22 항에 기재된 방법으로 생산된 항인간 PAI-1 항체.
  25. 제 1 항 내지 제 15 항, 제 23 항 및 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  26. 제 3 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 제 4 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  27. 제 9 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체, 제 13 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물인 의약 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 15 항, 제 23 항 및 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 폐섬유증을 예방 또는 치료하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 15 항, 제 23 항 및 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  31. 폐섬유증의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 15 항, 제 23 항 및 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 PAI-1 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 사용.
KR1020167025778A 2014-02-21 2015-02-20 신규 항인간 pai-1 항체 KR20160124840A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014031319 2014-02-21
JPJP-P-2014-031319 2014-02-21
PCT/JP2015/054704 WO2015125904A1 (ja) 2014-02-21 2015-02-20 新規抗ヒトｐａｉ－１抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160124840A true KR20160124840A (ko) 2016-10-28

Family

ID=53878402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167025778A KR20160124840A (ko) 2014-02-21 2015-02-20 신규 항인간 pai-1 항체

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9803024B2 (ko)
EP (1) EP3109320B1 (ko)
JP (1) JP6512213B2 (ko)
KR (1) KR20160124840A (ko)
CN (1) CN106029884B (ko)
BR (1) BR112016019332A2 (ko)
CA (1) CA2939897A1 (ko)
ES (1) ES2726915T3 (ko)
MX (1) MX2016010852A (ko)
PL (1) PL3109320T3 (ko)
PT (1) PT3109320T (ko)
RU (1) RU2016137486A (ko)
TR (1) TR201907379T4 (ko)
WO (1) WO2015125904A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3047174A1 (en) * 2016-12-15 2018-06-21 Talengen International Limited Method for preventing and treating liver fibrosis
EP3556386A4 (en) * 2016-12-15 2020-07-08 Talengen International Limited METHOD FOR PREVENTING AND TREATING MEDICINAL-INDUCED KIDNEY LESION
CA3067890A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 Talengen International Limited Method for regulating and controling glp-1/glp-1r and drug
WO2021066062A1 (ja) 2019-09-30 2021-04-08 株式会社レナサイエンス 免疫チェックポイント分子の発現抑制剤
CN111072780B (zh) * 2020-03-24 2020-06-23 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 白血病干细胞抑制剂及其在治疗慢性粒细胞白血病中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034776A2 (en) 2000-10-26 2002-05-02 K.U.Leuven Research And Development Epitopes of pai-1
US20100254979A1 (en) 2009-03-06 2010-10-07 Cisthera, Incorporated Humanized PAI-1 Antibodies and Uses Thereof
WO2011139973A2 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Abbott Laboratories Methods of inhibiting fibrosis using anti-pai-1 antibodies

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3742997A1 (de) * 1987-12-18 1989-06-29 Behringwerke Ag Peptide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur gewinnung von antikoerpern sowie deren verwendung zur blockierung der pai-1-aktivitaet menschlichen blutes
JP2006507297A (ja) * 2002-05-13 2006-03-02 チルドレンズ・ホスピタル・ロサンジェルス ケロイドおよび他の皮膚または内部創傷または病変における異常瘢痕形成の処置および予防
WO2009033095A2 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Cisthera, Incorporated Humanized pai-1 antibodies
CN101654405A (zh) * 2008-08-19 2010-02-24 信谊药厂 抗凝化合物、组合物及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034776A2 (en) 2000-10-26 2002-05-02 K.U.Leuven Research And Development Epitopes of pai-1
US20100254979A1 (en) 2009-03-06 2010-10-07 Cisthera, Incorporated Humanized PAI-1 Antibodies and Uses Thereof
WO2011139973A2 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Abbott Laboratories Methods of inhibiting fibrosis using anti-pai-1 antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
「더 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(The Journal of Biological Chemistry)」, (미국), 2000, Vol. 275, p. 6375-6380

Also Published As

Publication number Publication date
CA2939897A1 (en) 2015-08-27
JPWO2015125904A1 (ja) 2017-03-30
US9803024B2 (en) 2017-10-31
BR112016019332A2 (pt) 2017-10-10
PL3109320T3 (pl) 2019-08-30
ES2726915T3 (es) 2019-10-10
MX2016010852A (es) 2016-10-26
RU2016137486A3 (ko) 2018-07-27
CN106029884A (zh) 2016-10-12
US20160369008A1 (en) 2016-12-22
TR201907379T4 (tr) 2019-06-21
EP3109320A4 (en) 2017-09-20
WO2015125904A1 (ja) 2015-08-27
JP6512213B2 (ja) 2019-05-15
CN106029884B (zh) 2019-06-25
PT3109320T (pt) 2019-06-06
EP3109320B1 (en) 2019-03-27
RU2016137486A (ru) 2018-03-22
EP3109320A1 (en) 2016-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7418508B2 (ja) 抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体およびその使用
KR101769725B1 (ko) 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 모노클로날 항체
CN107405399B (zh) 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体
KR102455680B1 (ko) 신규 항인간 Tie2 항체
KR101584416B1 (ko) 인간 tweak에 대한 항체 및 그의 용도
JP2013507115A (ja) 「終末糖化産物受容体」への結合のためのポリペプチド、さらにはそれを含む組成物及び方法
KR20160124840A (ko) 신규 항인간 pai-1 항체
KR20160099083A (ko) 신규 항인간 bdca-2 항체
AU2020350715A1 (en) GIPR antibody and fusion protein between same and GLP-1, and pharmaceutical composition and application thereof
JP7511241B2 (ja) リシル－ｔＲＮＡ合成酵素Ｎ末端に特異的に結合する抗体を有効成分として含む免疫細胞の遊走関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物
KR20210046024A (ko) 항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 용도
EP2796550B1 (en) Novel anti-human ctgf antibody
KR20210084473A (ko) 항인간 Fn14 항체
EP3957652A1 (en) Anti-fxi/fxia antibody and use thereof
CN113583134B (zh) 分离的抗原结合蛋白及其用途
WO2023274340A1 (en) Novel anti-masp-2 antibodies
JP6848016B2 (ja) 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体
RU2787044C2 (ru) АНТИТЕЛО ПРОТИВ Fn14 ЧЕЛОВЕКА
KR20160125965A (ko) 신규 인간 tlr2 및 인간 tlr4에 결합하는 이중 특이적 항체
WO2023044280A1 (en) Anti-il-1-beta antibodies