CN106029884A - 新型抗人pai-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过与活性型人PAI‑1结合、抑制活性型人PAI‑1介导的作用来预防或治疗肺纤维化的抗人PAI‑1抗体。本发明人们对抗PAI‑1抗体进行了研究，提供包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI‑1抗体。

Description

新型抗人PAI-1抗体
技术领域
本发明涉及新型抗人PAI-1抗体。
背景技术
纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1；PAI-1)是由血管内皮等产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂之一。PAI-1与作为丝氨酸蛋白酶的纤溶酶原激活物(plasminogen activator；PA)结合，使PA的酶活性失活(Mol.Cell.Endocrinol.、1990、Vol.68、p.1-19)。PAI-1中存在活性型PAI-1、潜在型PAI-1、以及与PA结合而形成了复合物的PAI-1，仅活性型PAI-1具有抑制该PA的PAI-1的特性(Blood、1987、Vol.70、p.1090-1098)。PA中存在组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogenactivator；tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator；uPA。也称为尿激酶)这两种，均使纤溶酶原活化而转化为纤溶酶，由此催化溶解血液凝固中生成的纤维蛋白的反应(以下称为纤溶系统)。活性型PAI-1与tPA和uPA结合，形成复合物。使PA失活的生物学特性已充分阐明，活性型PAI-1与PA结合的结果是，抑制纤溶系统，促进血栓形成。
活性型PAI-1的立体结构的特征在于，作为与PA的结合部位的活性中心环伸展并露出于蛋白的外侧(J.Biol.Chem.、2001、Vol.276、p.44912-44918)。在循环血液中，活性型PAI-1可以与作为其辅助因子的玻连蛋白结合而形成复合物(J.Biol.Chem.、1988、Vol.263、p.15454-15461)。玻连蛋白抑制PAI-1从活性型向潜在型的立体结构变化(J.Biol.Chem.、1990、Vol.265、p.18490-18498)。潜在型PAI-1是活性中心环向内部折叠的稳定的立体结构，一旦形成潜在型，则PAI-1变得无法与PA结合(J.Biol.Chem.、2008、Vol.283、p.18147-18157。Nature、1992、Vol.355、p.270-273)。另外，与tPA或uPA形成了复合物的PAI-1分别与tPA或uPA结合，因此，该PAI-1无法与其他PA进行新的结合。即，活性型PAI-1中存在以单体的形式存在的活性型PAI-1和以与玻连蛋白的复合物的形式存在的活性型PAI-1，它们具有与PA结合而使PA失活的功能。
血浆中活性型PAI-1的增加暗示通过抑制PA参与组织的纤维化、血栓形成，作为结果，认为与下述疾病相关：特发性肺纤维化等肺纤维化、间质性肺炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、糖尿病性肾病、狼疮性肾炎、移植物抗宿主病、肾小球肾炎、肾病综合征、肾纤维化、慢性阻塞性肺疾病、急性肾功能障碍、急性肺功能障碍、急性呼吸衰竭、老年性黄斑变性、弥散性血管内凝血综合征、术后粘连、症状性玻璃体黄斑粘连、糖尿病视网膜病、动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、肺梗塞、青光眼手术后的结膜的瘢痕化等伴有眼纤维化的疾病、腹膜硬化症等。
作为与肺纤维化的联系，报告了在特发性肺纤维化患者的肺活检来源的成纤维细胞中PAI-1的表达和分泌增加(J.Biol.Chem.、2010、Vol.285、No.11、p.8196-8206)。此外，在使用博来霉素诱发性的肺纤维化病态模型小鼠的试验中，在PAI-1的遗传缺陷小鼠中确认到肺的纤维化得到抑制(J.Clin.Invest.、1996、Vol.97、No.1、p.232-237)。另外，在对上述病态模型小鼠给药低分子PAI-1抑制剂和PAI-1的siRNA的情况下，也确认到通过PAI-1抑制使肺的纤维化得到抑制(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.、2008、Vol.28、p.672-677。Thorax、2010、Vol.65、p.334-340)。
因此，只要能够开发出具有与活性型PAI-1特异性地结合而抑制活性型PAI-1所产生的作用的活性的单克隆抗体，则可以期待对于活性型PAI-1参与病态形成的各种疾病的预防和治疗有用。
作为对活性型人PAI-1显示出功能抑制作用的抗体，报告了小鼠单克隆抗体MA-33B8(专利文献1)、MA-33H1F7(非专利文献1)、MA-55F4C12(非专利文献1)、MA-56A7C10(专利文献2)、以及MA-33B8的人源化抗体CT140(专利文献1)、利用噬菌体制作的完全人型抗体MEDI-579(也称为CAT-1001或PICK167_A01-fgl IgG1。专利文献3)等。其中，MA-56A7C10和MEDI-579对于活性型人PAI-1分别显示出与对于活性型以外的立体结构的人PAI-1相比约4.0倍和约20倍高的结合活性(专利文献2和专利文献3)。另外，MEDI-579对小鼠PAI-1也显示出抑制作用，根据使用狼疮性肾炎、硬皮病、糖尿病性肾病和血栓病的病态模型小鼠的实验结果，可以期待对于这些疾病的药效(专利文献3)。
在将抗人PAI-1抗体作为抗体药物使用的情况下，作为规定其有效给药量的主要因素，可以列举抗体所具有的抑制活性型PAI-1与PA结合的活性和对活性型PAI-1的选择性、以及体内存在的活性型PAI-1和其他立体结构的PAI-1的量。在此，其他立体结构的PAI-1是指潜在型PAI-1和与tPA或uPA形成了复合物的PAI-1。
人血浆中的总PAI-1的90％以上储存在血小板中。在除去血小板后的血浆中，总PAI-1的约三分之二为活性型(Br.J.Haematol.、1988、Vol.70、p.327-333。Blood、1988、Vol.71、p.220-225)。不仅是血浆中的PAI-1活性(以与tPA的结合能表示的活性型PAI-1活性)，血浆中的总PAI-1量(利用检测全部PAI-1的抗PAI-1抗体检测到的PAI-1的总量)、血浆中的PAI-1与tPA的复合物的量(利用抗PAI-1抗体与抗tPA抗体的组合检测到的复合物的量)在各种人疾病中也升高(Thromb.Res.、2008、Vol.122、p.466-472。Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.、2000、Vol.20、p.2019-2023。Nat.Med.、1996、Vol.2、p.800-803)。在除去血小板的血浆中，也存在约为活性型PAI-1量的三分之一的tPA-PAI-1复合物(Blood、1990、Vol.76、p.930-937)。另外，在组织中，不仅存在tPA，也存在uPA，还存在PAI-1与uPA的复合物。作为结论，活性型PAI-1以外的其他PAI-1以在PAI-1总量中无法忽视的比例存在于人体内。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2010/0254979号
专利文献2：国际公开第2002/034776号
专利文献3：国际公开第2011/139973号
非专利文献
非专利文献1：“The Journal of Biological Chemistry”、(美国)、2000、Vol.275、p.6375-6380
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供通过与现有的抗人PAI-1抗体相比更加选择性地抑制活性型人PAI-1来预防或治疗肺纤维化的抗人PAI-1抗体。
用于解决问题的方法
本发明人们在对活性型人PAI-1的选择性高的抗人PAI-1抗体的制作中反复进行了大量独创性研究，结果，制作出包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体(实施例1～3)，并且发现，该抗人PAI-1抗体抑制血浆中的活性型人PAI-1(实施例5)、并且对与玻连蛋白形成复合物的活性型人PAI-1具有高选择性(实施例6)。其结果，提供上述抗人PAI-1抗体，从而完成了本发明。
即，本发明包含作为医学上或产业上有用的物质或方法的下述发明。
(1)一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31～35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50～66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸序号99～107的氨基酸序列构成的CDR3，所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸序号24～34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50～56的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸序号89～97的氨基酸序列构成的CDR3。
(2)如(1)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段选自下述1)～2)中的任一个：
1)包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段；以及
2)上述1)的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。
(3)如(2)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(4)如(2)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段为包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。
(5)如(2)或(4)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Igγ1恒定区。
(7)如(1)～(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为轻链恒定区的人Igκ恒定区。
(8)如(1)～(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Igγ1恒定区，并且包含作为轻链恒定区的人Igκ恒定区。
(9)如(3)所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
(10)如(1)～(8)中任一项所述的抗原结合片段，其为单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
(11)一种抗人PAI-1抗体，其为(9)所述的抗人PAI-1抗体经翻译后修饰生成的抗体。
(12)如(11)所述的抗人PAI-1抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
(13)如(11)所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
(14)一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段抑制(9)或(13)所述的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合。
(15)一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段与(9)或(13)所述的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。
(16)一种多核苷酸，其包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列。
(17)一种多核苷酸，其包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。
(18)一种表达载体，其包含(16)和/或(17)所述的多核苷酸。
(19)利用(18)所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述(a)～(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(20)利用(18)所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述(a)～(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(21)一种生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤，
(a)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(22)一种生产抗人PAI-1抗体的方法，包括对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体的步骤：
(a)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(23)通过(21)中记载的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
(24)通过(22)中记载的方法生产的抗人PAI-1抗体。
(25)一种药物组合物，其包含(1)～(15)、(23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
(26)一种药物组合物，其包含(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、(4)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
(27)一种药物组合物，其包含(9)所述的抗人PAI-1抗体、(13)所述的抗人PAI-1抗体和药学上可接受的赋形剂。
(28)如(25)～(27)中任一项所述的药物组合物，其为肺纤维化的预防或治疗用药物组合物。
(29)如(28)所述的药物组合物，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
(30)一种预防或治疗肺纤维化的方法，其包括以治疗有效量给药(1)～(15)、(23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤。
(31)如(30)中记载的方法，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
(32)用于在肺纤维化的预防或治疗中使用的(1)～(15)、(23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
(33)如(32)所述的使用，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
(34)(1)～(15)、(23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段在制造肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
(35)如(34)所述的应用，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
上述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括与其他肽和蛋白质的融合抗体、结合修饰剂而得到的修饰抗体。
发明效果
本发明的抗人PAI-1抗体通过抑制活性型人PAI-1的功能，能够用作活性型人PAI-1参与病态形成的疾病、例如特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗剂。
附图说明
图1示出完全人型HOT-1的猴血中活性型PAI-1抑制作用。纵轴表示血浆中活性型PAI-1浓度。
具体实施方式
以下，对本发明进行详述。
抗体存在IgG、IgM、IgA、IgD和IgE这5个类型。抗体分子的基本结构在各类型中是共通的，由分子量5万～7万的重链与分子量2万～3万的轻链构成。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链构成，每种类型具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE相对应地称为Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。IgG中进一步存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的亚类，各自所对应的重链称为Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这2种，分别称为Igλ、Igκ。抗体分子的基本结构的肽构成是将各自相同的2条重链和2条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键进行结合，分子量为15万～19万。2种轻链与任一种重链均能够配对。各个抗体分子总是由相同的2条轻链和相同的2条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(Igμ、Igε中有五个)、在轻链中有二个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端的结构域，即使是来自于同种动物的同一类型(亚类)的样品，其氨基酸序列也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。比可变区更靠近C末端侧的氨基酸序列在各类型或亚类中大致恒定，被称为恒定区(各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL)。
抗体的抗原决定部位由VH和VL构成，结合的特异性由该部位的氨基酸序列决定。另一方面，与补体、各种Fc受体表达细胞结合这样的生物学活性反映出各类型Ig的恒定区的结构的差异。已知轻链和重链的可变区的可变性基本受限于在任一种链中均存在的3个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；自N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，较为恒定。
抗体的包含VH和VL的各种抗原结合片段也具有抗原结合活性，作为这样的代表性的抗原结合片段，可以列举单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2。Fab是由轻链与包含VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段。Fab’是由轻链与包含VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段，该铰链区的部分包含构成重链间S-S键的半胱氨酸残基。F(ab’)2片段是2个Fab’片段通过铰链区中的重链间S-S键结合而成的二价抗体片段。scFv是通过连接肽(linker)连接的由VH与VL构成的一价抗体片段。
<本发明的抗人PAI-1抗体>
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含具有下述特征的抗人PAI-1抗体。
包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段优选为具有上述特征且进一步包含重链恒定区和轻链恒定区的抗体。作为恒定区，可以选择任一亚类的恒定区(例如，作为重链，为Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4的恒定区，作为轻链，为Igλ或Igκ的恒定区)，但优选人Igγ1恒定区作为重链恒定区。
作为人Igγ1恒定区，可以列举例如由序列号2的氨基酸序号119～448的氨基酸序列构成的人Igγ1恒定区。
作为轻链恒定区，优选人Igκ恒定区。
作为人Igκ恒定区，可以列举例如由序列号4的氨基酸序号109～214的氨基酸序列构成的人Igκ恒定区。
作为本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，更优选为包含上述重链可变区和轻链可变区、重链恒定区为人Igγ1恒定区、轻链恒定区为人Igκ恒定区的抗人PAI-1抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗原结合片段为scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2。
在一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
使抗体在细胞中表达的情况下，已知抗体会在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰的示例，可以列举重链C末端的赖氨酸基于羧肽酶的切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸通过焦谷氨酸化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗体中都发生这样的翻译后修饰(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426-2447)。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括受到翻译后修饰的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。作为受到翻译后修饰的本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的示例，可以列举受到重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。本领域公知，这样的基于N末端的焦谷氨酸化或C末端赖氨酸缺失的翻译后修饰不会给抗体的活性带来影响(AnalyticalBiochemistry、2006、Vol.348、p.24-39)。
在一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为具有下述特征的抗人PAI-1抗体。
包含下述重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体，所述重链为由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链，其中，序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸和/或缺失序列号2的氨基酸序号448的赖氨酸。
在又一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为具有下述特征的抗人PAI-1抗体。
包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
本发明还包括具有下述特征的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
包含下述重链可变区和下述轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31～35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50～66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸序号99～107的氨基酸序列构成的CDR3，所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸序号24～34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50～56的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸序号89～97的氨基酸序列构成的CDR3。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段为与同玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1(也称为VTN-PAI-1复合物)结合的抗体。作为在生物体内存在的活性型人PAI-1，有以单体形式存在的活性型人PAI-1和VTN-PAI-1复合物。其中，关于VTN-PAI-1复合物，通过与玻连蛋白结合抑制了人PAI-1从活性型向潜在型的立体结构变化，与以单体形式存在的活性型人PAI-1相比，活性型人PAI-1的结构保持得更稳定。另外，VTN-PAI-1复合物中，活性型人PAI-1的活性中心环结构不受影响(Nat.Struct.Biol.、2003、Vol.10、p.541-544)。因此，通过评价抗人PAI-1抗体对VTN-PAI-1复合物的结合活性，能够更准确地评价抗体对活性型人PAI-1的选择性。
另外，本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括不仅与VTN-PAI-1复合物结合、还与以单体形式存在的活性型人PAI-1结合的抗体。
对于是否与VTN-PAI-1复合物或以单体形式存在的活性型PAI-1结合，可以使用公知的结合活性测定方法进行确认。作为测定结合活性的方法，可以列举例如酶联免疫吸附检测(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)等方法。使用ELISA的情况下，在例示性的方法中，使玻连蛋白(BD Biosciences公司、354238)固相化，封闭之后使重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)固相化，由此使VTN-PAI-1复合物固相化。向其中添加受试抗体进行反应。反应后，使由辣根过氧化物酶(HRP)等标记的抗IgG抗体等二次抗体进行反应，清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况下为过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司))等进行活性测定，由此能够确认受试抗体是否与VTN-PAI-1复合物结合。使用SPR的情况下，可以使用例如Biacore(注册商标)T200(GE healthcare日本公司)。在例示性的方法中，使受试抗体固相化于传感芯片的表面，向流路中添加重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)。对抗体与活性型人PAI-1的结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)进行分析，由此能够确认受试抗体是否与以单体形式存在的活性型人PAI-1结合。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段优选为与VTN-PAI-1复合物结合、且对血浆中的活性型人PAI-1具有抑制活性的抗体。本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段更优选为与VTN-PAI-1复合物结合、对血浆中的活性型人PAI-1具有抑制活性、且既不与潜在型人PAI-1结合也不与同PA形成了复合物的人PAI-1结合的抗体。作为具体地评价对血浆中的活性型人PAI-1的抑制活性的方法，可以使用如后述实施例5中记载的方法。
“不与潜在型人PAI-1结合”是指，在评价抗体对潜在型人PAI-1的结合活性的情况下EC50值(ng/mL)>10000，EC50值(ng/mL)>10000是指显示出最大活性的50％时的抗体浓度大于10000ng/mL。该评价中使用的方法如下所示。
(对潜在型人PAI-1的结合活性评价)
将重组潜在型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-L)用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释至1000ng/mL，以每1孔100μL添加到NuncMaxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使潜在型人PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。用清洗液(含有0.05％吐温-20的Tris缓冲生理盐水(TBS))进行清洗，以每1孔100μL添加用含有0.1％牛血清来源白蛋白(BSA)的PBS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在室温下静置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文献3)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100μL添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司)中含有的显色液，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100μL，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其OD450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔的测定值设定为0％，将受试抗体的最大浓度下的测定值设定为100％。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值时，将MEDI-579的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试抗体的EC50值。
“不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合”是指，在评价抗体对于与作为纤溶酶原激活物(PA)的uPA或tPA形成了复合物的人PAI-1(分别也称为uPA-PAI-1复合物和tPA-PAI-1复合物)的结合活性的情况下，对各复合物的EC50值(ng/mL)>10000，EC50值(ng/mL)>10000是指显示出最大活性的50％时的抗体浓度大于10000ng/mL。该评价中使用的方法如下所示。
(对uPA-PAI-1复合物的结合活性评价)
用PBS将uPA(尿激酶静注用6万单位“ベネシス(注册商标)”；田边三菱制药株式会社)稀释至100单位/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，使uPA捕获重组活性型人PAI-1。用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)进行清洗，以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在室温下静置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文献3)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100μL添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司)中含有的显色液，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100μL，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其OD450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔的测定值设定为0％，将受试抗体的最大浓度下的测定值设定为100％。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值时，将MEDI-579的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试抗体的EC50值。
(对tPA-PAI-1复合物的结合活性评价)
将tPA(アクチバシン(注册商标)注600万；协和发酵麒麟株式会社)用PBS稀释至1000单位/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使tPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(ThermoSCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，使tPA捕获重组活性型人PAI-1。用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)进行清洗，以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在室温下静置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文献3)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100μL添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司)中含有的显色液，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100μL，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其OD450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1％BSA的PBS代替受试抗体的孔的测定值设定为0％，将受试抗体的最大浓度下的测定值设定为100％。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值时，将MEDI-579的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，在即使添加最大浓度(100000ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值设定为100％。对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试抗体的EC50值。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段中也包括下述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段：其抑制包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合。
对于受试抗体是否抑制包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，可以使用下述方法进行确认。使玻连蛋白(BD Biosciences公司、354238)固相化，封闭之后使活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)固相化，由此使VTN-PAI-1复合物固相化。向其中添加受试抗体，使其反应。反应后，使利用HRP等进行了标记的包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体作为二次抗体进行反应，清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况下为过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司))等进行活性测定。在由于受试抗体的添加而导致包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体的结合活性显著降低的情况下，可以判断为受试抗体抑制包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段中也包括下述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段：其与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。在此，表位是指抗体所识别的抗原部位。
对于受试抗体是否与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位，可以使用公知的表位确定方法进行确认。作为确定表位的方法，可以列举例如X射线晶体结构分析、ELISA等方法。使用ELISA的情况下，在例示性的方法中，使人PAI-1部分肽固相化，向其中添加受试抗体，使其反应。反应后，使利用HRP等进行了标记的抗IgG抗体等二次抗体进行反应，清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况下为过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司))等进行活性测定，由此能够确认受试抗体是否与该人PAI-1部分肽结合。通过评价对于具有各种氨基酸序列的人PAI-1部分肽的结合活性，能够确定受试抗体的表位。在受试抗体的表位与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体的表位相同的情况下，可以判断为受试抗体与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。
另外，对于本发明的抗人PAI-1抗体而言，如果是与VTN-PAI-1复合物结合的抗体，也包括除了与VTN-PAI-1复合物结合、也与同玻连蛋白形成了复合物的其他动物来源的活性型PAI-1(例如，同玻连蛋白形成了复合物的活性型猴PAI-1)结合的抗体。
本发明的抗人PAI-1抗体可以由本领域技术人员基于本说明书中公开的本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息使用本领域中公知的方法容易地制作。本发明的抗人PAI-1抗体没有特别限定，可以按照例如后述的<生产本发明的抗人PAI-1抗体的方法和利用该方法生产的抗人PAI-1抗体>中记载的方法进行制造。
本发明的抗人PAI-1抗体根据需要进一步纯化后，按照常规方法制剂化，能够用于特发性肺纤维化等肺纤维化、间质性肺炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、糖尿病性肾病、狼疮性肾炎、移植物抗宿主病、肾小球肾炎、肾病综合征、肾纤维化、慢性阻塞性肺疾病、急性肾功能障碍、急性肺功能障碍、急性呼吸衰竭、老年性黄斑变性、弥散性血管内凝血综合征、术后粘连、症状性玻璃体黄斑粘连、糖尿病视网膜病、动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、肺梗塞、青光眼手术后结膜的瘢痕化等伴有眼纤维化的疾病、腹膜硬化症等、活性型PAI-1参与病态形成的疾病的预防或治疗。
<本发明的多核苷酸>
本发明的多核苷酸包括：包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、以及包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列所示的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1的碱基序号1～354的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3的碱基序号1～324的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列使用本领域中公知的方法容易地制作。例如，本发明的多核苷酸可以利用本领域中公知的基因合成方法进行合成。作为这样的基因合成方法，可以使用WO90/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
<本发明的表达载体>
本发明的表达载体包括：含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和/或包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
作为优选的本发明的表达载体，可以列举含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、或者含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
作为用于表达本发明的多核苷酸所使用的表达载体，只要在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如大肠杆菌)的各种宿主细胞中表达包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和/或包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸且能够产生由这些多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，可以优选使用pEE6.4、pEE12.4(龙沙公司)。另外，也可以将可变区基因片段导入到AG-γ1、AG-κ(例如参考WO94/20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体中来表达抗体基因。
本发明的表达载体可以包含以能够发挥功能的方式与本发明的多核苷酸连接的启动子。作为用于在动物细胞中表达本发明的多核苷酸的启动子，可以列举例如CMV、RSV、SV40等病毒来源启动子、肌动蛋白启动子、EF(elongation factor，延伸因子)1α启动子、热休克启动子等。作为用于在细菌(例如埃希氏菌属菌)中表达的启动子，可以列举例如trp启动子、lac启动子、λPL启动子、tac启动子等。另外，作为用于在酵母中表达的启动子，可以列举例如GAL1启动子、GAL10启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
在使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。这种情况下，本发明的表达载体可以包含增强子序列、编码本发明的抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧的非翻译区域、分泌信号序列、剪切接合部、多聚腺苷酸化部位或可复制单元等。在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。这种情况下，本发明的表达载体可以根据目的包含通常使用的选择标记(例如四环素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、新霉素耐性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
<本发明的进行了转化的宿主细胞>
本发明的进行了转化的宿主细胞包括选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为优选的本发明的进行了转化的宿主细胞，可以列举利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为进行转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、能够被该表达载体转化且表达抗体，则没有特别限定。作为进行转化的宿主细胞，可以列举例如本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如，动物细胞(例如CHO-K1SV细胞)、昆虫细胞(例如Sf9)、细菌(埃希氏菌属菌等)、酵母(酵母菌属、毕赤酵母属等)等)，可以优选使用CHO细胞(CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞等)、293细胞、NS0细胞等培养细胞。
对宿主细胞进行转化的方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法等。
<生产本发明的抗人PAI-1抗体的方法和利用该方法生产的抗人PAI-1抗体>
生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法包括：包含对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤的生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法。
(a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，生产本发明的抗人PAI-1抗体的方法包括：包含对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体的步骤的生产抗人PAI-1抗体的方法。
(a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法只要包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤，则没有特别限定。作为该方法中使用的优选的宿主细胞，可以列举上述优选的本发明的进行了转化的宿主细胞。
进行了转化的宿主细胞的培养可以利用公知的方法进行。培养条件例如温度、培养基的pH、和培养时间可适当选择。在宿主细胞为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用例如含有约5％～约20％的胎牛血清的MEM培养基(Science、1959、Vol.130、No.3373、p.432-7)、DMEM培养基(Virology、1959、Vol.8、p.396)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol.199、p.519)、199培养基(Exp.Biol.Med.、1950、Vol.73、p.1-8)等。培养基的pH优选为约6～约8，培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约30℃～约40℃下进行约15小时～约72小时。在宿主细胞为昆虫细胞的情况下，作为培养基，可以使用例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1985、Vol.82、p.8404)等。培养基的pH优选为约5～约8，培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约20℃～约40℃下进行约15小时～约100小时。在宿主为胞为大肠杆菌或酵母的情况下，作为培养基，例如含有营养源的液体培养基是适当的。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以列举例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以列举例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆粕、马铃薯提取液等。可以根据期望含有其他营养素(例如，无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类等)、抗生物质(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)。培养基的pH优选为约5～约8。在宿主细胞为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以使用例如LB培养基、M9培养基(Mol.Clo.、冷泉港实验室、2001、Vol.3、A2.2)等。培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约14℃～约39℃下进行约3小时～约24小时。在宿主细胞为酵母的情况下，作为培养基，可以使用例如Burkholder基本培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1980、Vol.77、p.4505)等。培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约20℃～约35℃下进行约14小时～约144小时。通过如上所述的培养，能够表达本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法中，除了对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤之外，可以进一步包括从该进行了转化的宿主细胞中回收、优选分离或纯化抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤。作为分离或纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差异的方法；离子交换色谱、羟基磷灰石层析等利用带电的方法；亲和层析等利用特异亲和性的方法；反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法；等电点电泳等利用等电点差异的方法等。蓄积在培养上清中的抗体可以优选通过各种层析、例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的柱层析进行纯化。
本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段也包含通过生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
<本发明的药物组合物>
本发明的药物组合物包括：包含本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等利用通常使用的方法进行制备。作为这些药物组合物的剂型的示例，可以列举例如注射剂、点滴用剂等非口服剂，可以通过静脉内给药、皮下给药等进行给药。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。
本发明的药物组合物可以包含多种本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。例如，含有未受到翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段、以及该抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段的药物组合物也包含在本发明中。
在一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的本发明的药物组合物也包括如下所述的药物组合物。
含有包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、以及该抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本发明的药物组合物也包括：含有重链C末端赖氨酸缺失的抗体、受到N末端翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段、重链C末端赖氨酸缺失且受到N末端翻译后修饰的抗体、和/或具有重链C末端赖氨酸且未受到N末端翻译后修饰的抗体的药物组合物。
在一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体的本发明的药物组合物也包括含有下述(1)～(4)中的2种以上的抗人PAI-1抗体的药物组合物。
(1)包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
(2)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
(3)包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
(4)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
在又一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的本发明的药物组合物也包括如下所述的药物组合物。
含有包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
上述制剂化时的本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型或抗体的结合效价等而有所不同，例如可以使用约0.001mg/kg～约100mg/kg。
本发明的药物组合物能够用作活性型人PAI-1参与病态形成的疾病、例如特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗剂。
本发明中包括含有本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗用药物组合物。另外，本发明包括包含以治疗有效量给药本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤的、治疗或预防特发性肺纤维化等肺纤维化的方法。另外，本发明包括用于在特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗中使用的本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。此外，本发明包括本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段在制造特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
<融合抗体和修饰抗体>
本领域技术人员也可以使用本领域中公知的方法，以融合有其他肽或蛋白质的融合抗体的形式制作抗体或其抗原结合片段，或者以结合有修饰剂的修饰抗体的形式制作抗体或其抗原结合片段。本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段也包括这样的融合体、修饰体的形态的抗体或抗原结合片段。例如，也包括在包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段上融合其他肽或蛋白质而得到的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、或者结合修饰剂而得到的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。只要本发明的抗体或其抗原结合片段作为融合抗体具有与VTN-PAI-1复合物结合的活性，则融合中使用的其他肽或蛋白质没有特别限定，可以列举例如人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S转移酶、各种毒素、其他能够促进多聚体化的肽或蛋白质等。只要本发明的抗体或其抗原结合片段作为修饰抗体具有与VTN-PAI-1复合物结合的活性，则修饰中使用的修饰剂没有特别限定，可以列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂、核糖体、低分子化合物等。
为了对本发明获得进一步理解，在此提供参考的特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并不限定本发明。
实施例
关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则按照附带的操作程序进行实验。另外，为了方便起见，将浓度mol/L以M表示。例如，1M羟化钠水溶液表示为1mol/L的羟化钠水溶液。
(实施例1：免疫抗原的研究和产生抗人PAI-1抗体的杂交瘤的制作)
为了获取对活性型人PAI-1的选择性高的抗体，对最佳的人PAI-1肽抗原进行了研究。对肽的长度和氨基酸序列进行研究的结果表明，在利用在人PAI-1中的16个氨基酸残基的肽抗原STAVIVSARMAPEEII(序列号5)的C末端连接有多抗原肽8(MultipleAntigen Peptide 8，MAP8)(J.Biol.Chem.、1988、Vol.263、No.4、p.1719-1725)的肽进行免疫的情况下，能够获取中和血浆中的活性型人PAI-1的抗体。进一步对与抗原连接的蛋白质、免疫方法等进行独创性研究的结果表明，在将在该肽抗原的C末端连接有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)蛋白质的肽与重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)混合后同时进行免疫的情况下，能够获取强力地中和血浆中的活性型人PAI-1、且对与玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1(VTN-PAI-1复合物)的选择性高的抗体。
使用人单克隆抗体开发技术“VelocImmune”(VelocImmuneantibody technology：Regeneron公司(美国专利6596541号))小鼠来制作抗体。具体而言，将在人PAI-1中的16个氨基酸残基的肽抗原STAVIVSARMAPEEII(序列号5)的C末端连接有KLH蛋白质的肽抗原和重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)与引起免疫反应的佐剂一同对VelocImmune小鼠进行免疫。对小鼠进行多次免疫，确认到血浆中抗体效价的升高。最后进行7次免疫，按照常规方法摘取免疫后的小鼠的淋巴结，回收淋巴细胞，将其与小鼠来源骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC：CRL-1581)进行细胞融合，由此制作杂交瘤。制作杂交瘤的有限稀释样品，进行单克隆化。对各克隆进行扩大培养后，将培养基变更为作为无血清培养基的CD杂交瘤培养基(Invitrogen公司)，培养约1周。使用蛋白G柱(GE healthcare公司)从所得到的培养上清中纯化出抗体。在VelocImmune技术中，使用内源性免疫球蛋白重链和轻链的可变区被相应的人可变区置换的转基因小鼠，因此，所得到的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也称为嵌合抗体)。
(实施例2：ELISA检测)
为了测定抗体的抗原特异的结合活性，使用ELISA检测。在此，为了评价对活性型人PAI-1的选择性，使用使玻连蛋白固相化并添加活性型人PAI-1而制作的板、和添加潜在型人PAI-1代替活性型人PAI-1而制作的板来进行试验。
将玻连蛋白(BD Biosciences公司、354238)用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释至1000ng/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使玻连蛋白固相化。通过反向离心除去玻连蛋白固相液，以每1孔100μL添加用PBS稀释至1000ng/mL的浓度的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)或重组潜在型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-L)，在4℃静置1小时。通过反向离心除去溶液，以每1孔200μL添加用PBS稀释至3倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液。在室温下静置1小时后，通过反向离心除去封闭剂。使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，对于添加有活性型人PAI-1的板，将纯化抗体样品稀释为从1000ng/mL至0.1ng/mL的7个梯度，对于添加有潜在型人PAI-1的板，将纯化抗体样品稀释为从3000ng/mL至0.3ng/mL的7个梯度，每1孔添加100μL。作为对照，准备添加了用PBS稀释至20倍的封闭剂溶液来代替抗体的孔。在室温下孵育1小时后，用清洗液(含有0.05％吐温-20的Tris缓冲生理盐水(TBS))清洗3次，添加用以PBS稀释至20倍的封闭剂溶液稀释至2000倍的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体(DAKO公司、P260)100μL。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司)中含有的显色液100μL，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100μL，利用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其OD450值。
计算各抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了用PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液来代替抗体的孔的测定值设定为0％，将各抗体的测定值的最大值设定为100％。对由测定值算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的EC50值。
结果表明，命名为HOT-1的抗体(嵌合抗体)对VTN-PAI-1复合物具有选择性的、比对潜在型PAI-1高的结合活性。
(实施例3：完全人型抗体的制作)
上述抗体是可变区为人来源、恒定区为小鼠来源的抗体。因此，本发明人使用作为哺乳细胞表达用载体的GS载体(Lonza公司)，构建包含重链和轻链这两者的基因的表达载体，制作出完全人型抗体。具体而言，对于实施例2中鉴定的HOT-1，从杂交瘤中提取RNA，使用cDNA扩增试剂盒(SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech公司)制作cDNA。接着，利用聚合酶链式反应(PCR)对重链和轻链的可变区进行延伸和扩增。在HOT-1的重链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(Nigel Whittle等、Protein Engineering、1987、Vol.1、No.6、p.499-505)的基因，然后在3’侧连接人Igγ1的恒定区基因(由序列号1的碱基序号355～1344的碱基序列构成)，将该重链基因插入到GS载体pEE6.4中。另外，在HOT-1的轻链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(NigelWhittle等、同前)的基因，然后在3’侧连接人κ链的恒定区基因(由序列号3的氨基酸序号325～642的碱基序列构成)，将该轻链基因插入到GS载体pEE12.4中。
利用测序仪对插入到pEE6.4中的抗体的重链基因序列、插入到pEE12.4中的抗体的轻链基因序列进行分析，根据由该结果得到的氨基酸序列，参考Kabat等的数据库(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”、美国卫生和公众服务部、美国政府印刷办公室)来确定CDR序列。
将所制作的HOT-1的完全人型抗体(完全人型HOT-1)的重链的碱基序列示于序列号1，将由其编码的氨基酸序列示于序列号2，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号3，将由其编码的氨基酸序列示于序列号4。序列号2所示的重链的可变区由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成，重链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号2的氨基酸序号31～35、50～66、99～107的氨基酸序列构成。序列号4所示的轻链的可变区由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成，轻链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸序号24～34、50～56、89～97的氨基酸序列构成。
将分别插入有完全人型HOT-1的重链和轻链的基因的上述GS载体用NotI和PvuI进行限制酶切割，使用DNA连接试剂盒(宝生物公司)进行连接，构建插入有重链和轻链这两者的基因的GS载体。使用该GS载体，利用瞬时性表达和永久性表达这两种方法进行抗体表达。关于瞬时性表达，针对使用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen公司)培养至约100万个/mL的FreeStyle 293细胞(Invitrogen公司)，使用基因导入试剂FreestyleMAX(Invitrogen公司)转染该GS载体，培养7天。使用蛋白G柱(GEHealthcare公司)从其培养上清中得到完全人型抗体的纯化抗体。关于永久性表达，使用电穿孔法将该GS载体转染到CHO-K1SV细胞(Lonza公司)中，由此使其表达抗体。使用蛋白A柱(GEHealthcare公司)从其培养上清中纯化出完全人型抗体。
(实施例4：完全人型抗体的氨基酸修饰分析)
对纯化的完全人型HOT-1的氨基酸修饰进行分析，结果，在大部分纯化抗体中发生了重链C末端的赖氨酸缺失。
(实施例5：人血浆中活性型PAI-1抑制活性测定)
为了针对实施例2中鉴定的HOT-1(嵌合抗体)和实施例3中制作的完全人型HOT-1进行人血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，使用肥胖症患者的血浆，实施了活性型PAI-1抑制检测。在使用正常人的血浆的情况下，活性型PAI-1的浓度低，难以构建检测系统，因此，使用已知血浆中活性型PAI-1浓度高的肥胖症患者的血浆(NatureMedicine、1996、Vol.2、p.800-803)。
将uPA(尿激酶静注用6万单位“ベネシス”(注册商标)；田边三菱制药株式会社)用PBS稀释至50单位/mL，以每1孔100μL添加到作为检测板的Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加用PBS稀释至3倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，在室温下静置1小时。
在此期间，制备肥胖症患者血浆与抗体样品的混合液(血浆-抗体混合液)。具体而言，使用含有0.1％牛血清来源白蛋白(BSA)的PBS，在制备血浆-抗体混合液时，以将肥胖症患者血浆稀释至35倍的方式对血浆进行稀释(血浆-抗体混合液中含有的人血浆来源活性型PAI-1的浓度为约360pg/mL)。另外，使用含有0.1％BSA的PBS，以抗体的终浓度为从1000ng/mL至1ng/mL的7个梯度的稀释系列的方式对抗体样品进行稀释。然后，将上述血浆和抗体样品混合，制备血浆-抗体混合液。作为标准曲线用样品，制备用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000pg/mL至10pg/mL的7个梯度的重组活性型人PAI-1(MolecularInnovation公司、PAI-A)。作为对照样品，准备将含有0.1％BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆进行混合的样品。将这些血浆-抗体混合液、标准曲线样品和对照样品在室温下静置30分钟，进行预孵育。
通过反向离心除去上述检测板中的封闭剂后，以每1孔100μL在检测板中添加上述预孵育后的血浆-抗体混合液、标准曲线用样品和对照样品，在室温下静置30分钟。将板用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)清洗3次，以每1孔100μL添加用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至3000倍的抗PAI-1抗体(Progen Biotechnik公司、MA-33H1F7)。在室温下静置30分钟后，将板用清洗液清洗3次，以每1孔100μL添加用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的生物素化抗小鼠Ig抗体(Ancell公司、234010)。在室温下静置30分钟后，将板用清洗液清洗3次，以每1孔100μL添加用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至1000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Thermo SCIENTIFIC公司)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100μL添加用含有2mM Tris(pH9.8)的0.1mM氯化镁水溶液稀释5倍的碱性磷酸酶底物(Chemiluminescent AP；SurModics公司、APU4-0100-01)，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其信号值。
使用标准曲线算出活性型人PAI-1浓度。以复孔对各抗体进行试验，算出平均值。添加了将含有0.1％BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆进行混合的样品的孔的活性型人PAI-1浓度设定为100％，将抗体1000ng/mL与肥胖症患者血浆混合的孔的活性型人PAI-1浓度设定为0％。对算出的活性型人PAI-1抑制率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的IC50值。
结果，HOT-1(嵌合抗体)的IC50值为11.3ng/mL，完全人型HOT-1的IC50为6.0ng/mL，表明任一种抗体均抑制人血浆中的活性型PAI-1的uPA结合活性。
(实施例6：对VTN-PAI-1复合物的结合选择性评价)
利用ELISA检测，评价实施例3中制作的完全人型HOT-1对VTN-PAI-1复合物的结合选择性。制作下述(1)～(4)的四种人PAI-1固相化板，使用各板进行试验。
(1)VTN-PAI-1复合物固相化板
将玻连蛋白(BD Biosciences公司、354238)用PBS稀释至1000ng/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使玻连蛋白固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，使玻连蛋白捕获重组活性型人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对VTN-PAI-1的结合活性。
(2)潜在型人PAI-1固相化板
将重组潜在型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-L)用PBS稀释至1000ng/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使潜在型人PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(ThermoSCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。通过利用该板进行的试验，评价抗体对潜在型人PAI-1的结合活性。
(3)uPA-PAI-1复合物固相化板
将uPA(尿激酶静注用6万单位“ベネシス”(注册商标)；田边三菱制药株式会社)用PBS稀释至100单位/mL，以每1孔100μL添加NuncMaxisorp透明96板(Nunc公司)，将板在4℃静置一晩，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(ThermoSCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，使uPA捕获重组活性型人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对uPA-PAI-1复合物的结合活性。
(4)tPA-PAI-1复合物固相化板
将tPA(アクチバシン(注册商标)注600万；协和发酵麒麟株式会社)用PBS稀释至1000单位/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使tPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(ThermoSCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，使tPA捕获重组活性型人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对tPA-PAI-1复合物的结合活性。
将所制作的各人PAI-1固相化板用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)进行清洗，以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的完全人型HOT-1，在室温下静置30分钟。作为比较抗体，将作为完全人型抗人PAI-1抗体的MEDI-579(专利文献3)、作为小鼠抗人PAI-1抗体的MA-33B8(ProgenBiotechnik公司)、MA-33H1F7(Progen Biotechnik公司)、MA-55F4C12(Hycult Biotech公司、HM2180)和MA-56A7C10(HycultBiotech公司、HM2182)用含有0.1％BSA的PBS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，每1孔添加100μL，在室温下静置30分钟。另外，作为对照，制作添加了含有0.1％BSA的PBS来代替抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100μL添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司)中含有的显色液，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100μL，利用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定其OD450值。
在各板中以复孔进行各抗体的试验，算出平均值。计算各抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1％BSA的PBS来代替抗体的孔的测定值设定为0％，将各抗体的最大浓度的测定值设定为100％。其中，关于完全人型HOT-1，在对潜在型人PAI-1、uPA-PAI-1复合物和tPA-PAI-1复合物的结合活性评价系统中，即使添加最大浓度也达不到具有相同的人Fc段的MEDI-579的最大浓度的测定值，因此，将MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。另外，关于MA33-B8，在对VTN-PAI-1复合物的结合活性评价系统中，即使添加最大浓度也达不到具有相同的小鼠Fc段的MA56-A7C10的最大浓度的测定值，因此，将MA56-A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的EC50值。
表1：抗人PAI-1抗体对各种人PAI-1的结合活性
>100000是指，显示出MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值的50％的抗体浓度大于100000ng/mL。
结果表明，完全人型HOT-1对VTN-PAI-1复合物显示出强结合活性，并且具有极高的选择性结合活性。
与各比较抗体相比，完全人型HOT-1对VTN-PAI-1复合物具有极高的选择性结合活性，由此暗示出，完全人型HOT-1与PAI-1的结合部位不同于现有已知的抗人PAI-1抗体与PAI-1的结合部位，其结合更接近于人PAI-1的活性中心或其周围的部位。
(实施例7：对单体活性型人PAI-1的结合评价)
为了测定完全人型HOT-1对单体活性型人PAI-1的结合活性，进行了SPR分析。SPR分析中，使用Biacore(注册商标)T200(GE Healthcare日本)和重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)进行分析。结果表明，完全人型HOT-1与以单体形式存在的活性型人PAI-1结合。
(实施例8：对猴PAI-1的结合选择性评价)
利用ELISA检测，评价完全人型HOT-1对同玻连蛋白形成了复合物的活性型猴PAI-1(也称为VTN-猴PAI-1复合物)的结合选择性。制作下述(1)～(4)的四种猴PAI-1固相化板，使用各板进行试验。作为比较抗体，使用MEDI-579。
(1)VTN-猴PAI-1复合物固相化板
按照实施例6(1)中记载的方法，评价抗体对VTN-猴PAI-1的结合活性。其中，使用重组活性型猴PAI-1(Molecular Innovation公司、CYPAI)代替重组活性型人PAI-1。另外，将完全人型HOT-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。
(2)潜在型猴PAI-1固相化板
按照实施例6(2)中记载的方法，评价抗体对潜在型猴PAI-1的结合活性。其中，使用重组潜在型猴PAI-1(Molecular Innovation公司、CYPAI-L)来代替重组潜在型人PAI-1。另外，将完全人型HOT-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。
(3)uPA-猴PAI-1复合物固相化板
按照实施例6(3)中记载的方法，评价抗体对uPA-猴PAI-1复合物的结合活性。其中，使用重组活性型猴PAI-1(Molecular Innovation公司、CYPAI)来代替重组活性型人PAI-1。另外，将完全人型HOT-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。
(4)tPA-猴PAI-1复合物固相化板
按照实施例6(4)中记载的方法，评价抗体对tPA-猴PAI-1复合物的结合活性。其中，使用重组活性型猴PAI-1(Molecular Innovation公司、CYPAI)来代替重组活性型人PAI-1。另外，将完全人型HOT-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。
使用所制作的各猴PAI-1固相化板，按照实施例6中记载的方法，计算各抗体的EC50值。其中，关于完全人型HOT-1，在对潜在型猴PAI-1、uPA-猴PAI-1复合物和tPA-猴PAI-1复合物的结合活性评价系统中，即使添加最大浓度也达不到具有相同的人Fc段的MEDI-579的最大浓度的测定值，因此，将MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值设定为100％。
表2：抗PAI-1抗体对各种猴PAI-1的结合活性
>10000是指，显示出MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值的50％的抗体浓度大于10000ng/mL。
结果表明，完全人型HOT-1抗体对VTN-猴PAI-1复合物显示出强结合活性，并且具有极高的选择性结合活性。
(实施例9：人和猴血浆中活性型PAI-1抑制活性测定)
实施了完全人型HOT-1和MEDI-579的人和猴血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价。关于人血浆，与实施例5同样地使用肥胖症患者的血浆。关于猴血浆，使用对食蟹猴静脉内给药LPS并采集的血浆。
关于人血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，按照实施例5的方法进行。关于猴血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，在实施例5记载的方法中，使用猴血浆来代替人血浆。对于猴血浆，使用含有0.1％BSA的PBS，在制备血浆-抗体混合液时，以将猴血浆稀释120倍的方式对血浆进行稀释。两个评价系统均以各抗体的终浓度为300ng/mL至0.3ng/mL(7个梯度稀释)的条件实施。作为标准曲线用样品，使用以含有0.1％BSA的PBS稀释为从3000pg/mL至3pg/mL的7个梯度的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)。
使用标准曲线算出各活性型PAI-1浓度。以复孔对各抗体进行试验，算出平均值。将添加了将含有0.1％BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆或猴血浆进行混合的样品的孔的活性型PAI-1浓度设定为100％，将MEDI-579抗体300ng/mL与肥胖症患者血浆或猴血浆混合的孔的各活性型PAI-1浓度设定为0％。对算出的各活性型PAI-1抑制率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的IC50值。
结果，完全人型HOT-1对人血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为4.2ng/mL，MEDI-579对人血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为0.73ng/mL。完全人型HOT-1对猴血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为37ng/mL，MEDI-579对猴血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为0.83ng/mL。
表明完全人型HOT-1和MEDI-579抑制人和猴血浆中的活性型PAI-1的uPA结合活性。
(实施例10：利用体外血管内重现系统的PAI-1抑制活性测定)
已知在血管壁中uPA和tPA由血管内皮产生，并且结合在血管内皮上(Baillieres Clin.Haematol.、1993、Vol.6、No.3、p.559-576。Blood、2011、Vol.118、No.11、p.3182-3185)。即，uPA和tPA不仅存在于血中，也存在于血管壁。在实施例9中，测定了抗PAI-1抗体对血浆中的活性型PAI-1的抑制活性，但该实验系统仅提取了血浆中成分，未考虑血管壁的影响。因此，认为很难说其反映了实际的血管中的生物反应。因此，作为模拟实际的血管内状态的系统，使用在固相化有uPA-PAI-1复合物的检测板中将活性型PAI-1、uPA和uPA底物肽混合的评价系统，以uPA的活性作为指标对完全人型HOT-1和MEDI-579的活性进行了测定。
将重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)用PBS稀释至10μg/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公司)中，在室温下将板静置20分钟，由此使活性型PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，在室温下静置15分钟。通过反向离心除去溶液后，用以PBS稀释至3倍的封闭剂将uPA(尿激酶静注用6万单位“ベネシス”(注册商标)；田边三菱制药株式会社)稀释至50单位/mL，每1孔添加100μL。在室温下静置20分钟后，以每1孔200μL添加重碳酸盐缓冲液(西格玛公司、C3041-50CAP)，在37℃下静置一晩。
使用含有0.1％BSA的PBS对各抗体进行稀释，使各抗体的终浓度为从500ng/mL至0.015ng/mL的10个梯度的稀释系列。在各抗体溶液中混合用PBS稀释至终浓度为0.0025μg/mL的重组人活性型PAI-1、用PBS稀释至终浓度为0.0025μg/mL的玻连蛋白、用PBS稀释至终浓度为65ng/mL的作为uPA的底物肽的甘氨酰甘氨酰-L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Glutarylglycyl-L-arginine 4-methylcoumaryl-7-amide)(肽研究所、3097-v)、用PBS稀释至终浓度为1.25mg/mL的BSA、以及用PBS稀释至终浓度为0.05单位/mL的uPA。另外，作为对照，制作添加了含有0.1％BSA的PBS来代替抗体的孔、以及混合了含有0.1％BSA的PBS和PBS来代替抗体和重组人活性型PAI-1的孔。
将板用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)清洗3次后，以每1孔50μL添加上述混合液，在室温下静置24小时，由此进行uPA将底物肽切断的酶反应。底物肽被切断时，作为荧光物质的7-氨基-4-甲基-香豆素从肽主体上被切去。将各孔的样品每1孔各采集20μL，移至Nunc黑色384板(Nunc公司)中，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定激发波长400nm和荧光波长505nm的荧光信号值。
以复孔进行各抗体的试验，算出平均值。计算各抗体的各浓度下的uPA活性率时，将添加了含有0.1％BSA的PBS来代替抗体的孔的测定值的平均值设定为0％，将添加了含有0.1％BSA的PBS和PBS来代替抗体和重组人活性型PAI-1的孔的测定值的平均值设定为100％。对算出的uPA活性率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的EC50值。由于PAI-1抑制uPA活性，因此抗体的人PAI-1抑制活性越高，uPA活性就越高。
结果，以该评价系统中的uPA的活性作为指标的、完全人型HOT-1的EC50值为12.7ng/mL，MEDI-579的EC50值为42.1ng/mL。表明完全人型HOT-1具有更高的uPA活化能力。因此表明，该评价系统中，完全人型HOT-1具有更高的PAI-1抑制活性。
(实施例11：猴血浆中抗体浓度测定)
由实施例6的结果表明，完全人型HOT-1对VTN-PAI-1复合物显示出强结合活性，并且具有极高的选择性结合活性。通常已知，血中的抗体除了直接被代谢以外，还与抗原结合而以抗原-抗体复合物的形式被代谢(Journal of Pharmaceutical Sciences、2012、Vol.101、No.12、p4367-4382)。血浆中的PAI-1除了VTN-PAI-1以外，还以潜在型PAI-1和tPA-PAI-1复合物等各种复合物的状态存在(Blood、1990、Vol.76、p.930-937)，因此，选择性低的抗PAI-1抗体与各种PAI-1形成抗原-抗体复合物而被代谢。另一方面，完全人型HOT-1选择性地结合VTN-PAI-1，因此，不易以与潜在型PAI-1、PA-PAI-1的复合物的形式被代谢，因此，认为其能够长期间维持血中的浓度。已知实际的抗体的血中浓度的持续大大依赖于该抗原-抗体复合物的代谢速度(Bioanalysis、2011、Vol.3、No.6、p.659-675)。根据实施例8的结果，完全人型HOT-1对VTN-猴PAI-1复合物显示出高选择性的结合活性，因此，测定了对猴给药抗体时的血浆中抗体浓度。作为比较抗体，使用MEDI-579。
对食蟹猴静脉给药以PBS稀释的完全人型HOT-1或MEDI-579。处置组如下设定。
[处置组]
HOT-1给药组(3只)：
给药完全人型HOT-1的组(2.0mg/kg)
MEDI-579给药组(2只)：
给药MEDI-579的组(2.0mg/kg)
在抗体给药前、以及抗体给药0.25小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时后进行采血，得到血浆。关于完全人型HOT-1，在672小时、936小时、1200小时、1440小时后也追加进行采血，得到血浆。
通过电化学发光(ECL)检测对血浆中的各抗体浓度进行测定。
完全人型HOT-1的ECL检测如下所示。将玻连蛋白用TBS稀释至100ng/mL，使用Multi-array 96孔板(Meso Scale Discovery公司、L15XA-1)，每1孔添加25μL。将板在4℃静置一晩，由此使玻连蛋白固相化在板上。通过反向离心除去玻连蛋白固相液，用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)清洗3次，以每1孔25μL添加用TBS稀释至100ng/mL的重组活性型人PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)，在4℃下静置1小时，由此固相化。通过反向离心除去固相液，用清洗液清洗3次，以每1孔150μL添加封闭剂1(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)。在室温下静置1小时后，通过反向离心除去封闭剂1，用清洗液清洗3次。将给药了抗体的猴血浆用含有0.05％吐温-20的封闭剂1溶液稀释至100倍，进一步，使用含有1％的未给药抗体的猴血浆且含有0.05％吐温-20的封闭剂1溶液(以下称为含有血浆-吐温的封闭剂1溶液)稀释至标准曲线的范围内，每1孔添加25μL。标准曲线制作中，准备添加了使用含有血浆-吐温的封闭剂1溶液稀释为从100ng/mL至0.0017ng/mL的11个梯度的完全人型HOT-1的孔。作为对照，准备添加了含有血浆-吐温的封闭剂1溶液来代替抗体的孔。在室温下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用清洗液清洗3次。添加使用含有0.05％吐温-20的封闭剂1溶液稀释至80ng/mL的猴免疫球蛋白吸收抗人IgG轻链生物素(免疫生物研究所、17249)25μL。在室温下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用清洗液清洗3次。添加使用含有0.05％吐温-20的封闭剂1溶液稀释至20ng/mL的MSD SULFO-TAG链霉亲和素(Meso Scale Discovery公司、R32AD-1)25μL。在室温下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用清洗液清洗3次。添加用超纯水(MilliQ(注册商标)、默克公司)稀释至2倍的含表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4×)(MSD Read Buffer T(4x)with Surfactant)(Meso ScaleDiscovery公司、R92TC-2)150μL，利用SECTOR Imager 6000(Meso ScaleDiscovery公司)测定其电化学发光。
按照完全人型HOT-1的ECL检测的方法，测定MEDI-579的血浆中浓度。其中，玻连蛋白和重组活性型人PAI-1的浓度以75ng/mL使用。另外，作为使重组活性型PAI-1固相化后的封闭步骤，进行下述封闭处理来代替封闭剂1处理。以每1孔150μL添加用TBS以5w/v％溶解的封闭剂2(Meso Scale Discovery公司、R93BA-1)，在室温下静置1小时。除去封闭剂，用清洗液清洗3次后，以每1孔50μL添加用封闭剂1稀释4倍的封闭剂3(Meso Scale Discovery公司、R51BB-3)。
计算抗体浓度时，制作标准曲线。回归式利用5-参数逻辑模型进行分析。权重设定为1/y2。由标准曲线算出各采血点的抗体浓度。以三复孔进行各血浆的试验，求出所算出的浓度的平均值。利用BioBook(IDBS公司)按照各受试物质、各受试猴对所得到的抗体浓度进行分析，将纵轴设定为抗体浓度的对数值、将横轴设定为采血时间，由绘出的图的β层的斜率算出半衰期。
结果，MEDI-579的半衰期为52.6小时，与此相对，完全人型HOT-1的半衰期为255小时。表明完全人型HOT-1在血中维持更长的时间。
(实施例12：猴血中活性型PAI-1抑制活性测定)
对于肺纤维化等PAI-1参与病态的疾病的预防或治疗，期望在猴的血中长期间且强力地抑制PAI-1活性。因此，对完全人型HOT-1在猴血中的活性型PAI-1抑制活性进行评价。作为比较抗体，使用MEDI-579。
使用从实施例11中给药了完全人型HOT-1或MEDI-579的猴得到的血浆，测定血中活性型PAI-1的抑制活性。
将uPA(尿激酶静注用6万单位“ベネシス(注册商标)”；田边三菱制药株式会社)用PBS稀释至50单位/mL，以每1孔100μL添加到Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公司)中，将板在4℃静置一晩，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200μL添加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置1小时。用清洗液(含有0.05％吐温-20的TBS)进行清洗，以每1孔100μL添加用含有0.1％BSA的PBS稀释至10倍的血浆，在室温下静置30分钟。此时，作为标准曲线用，使用含有0.1％BSA的PBS将人活性型PAI-1(Molecular Innovation公司、PAI-A)稀释为从300ng/mL至0.003ng/mL的7个梯度，每1孔添加100μL，与血浆同时在室温下静置30分钟。另外，作为对照，制作添加了含有0.1％BSA的PBS来代替抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至10000倍的生物素化(同仁化学研究所、LK03)抗PAI-1抗体(Progen Biotechnik公司、MA-33H1F7)，使其反应。在此，根据实施例6的结果，作为识别板上的uPA-PAI-1复合物的抗PAI-1抗体，使用MA-33H1F7。另外，生物素化使用同仁化学研究所的试剂盒指定的方法进行。在室温下孵育1小时后，用清洗液清洗3次，以每1孔100μL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至1000倍的链霉亲和素-AL(Thermo SCIENTIFIC公司、21324)。在室温下孵育1小时后，用清洗液清洗3次，以每1孔100μL添加用含有2mMTris(pH9.8)的0.1mM氯化镁水溶液稀释5倍的碱性磷酸酶底物(Chemiluminescent AP；SurModics公司、APU4-0100-01)。在室温静置30分钟后，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司)测定信号值。
使用标准曲线算出活性型PAI-1浓度。将各抗体的猴血浆中活性型PAI-1抑制作用的结果示于图1。以复孔对各血浆进行试验，算出平均值。在此基础上，对试验中使用的各组猴血浆的值进行平均。将抗体给药前的活性型PAI-1浓度设为100％，将标准曲线用活性型PAI-1浓度0ng/mL设为0％，由各血浆中的活性型PAI-1浓度算出抑制比例，求出与给药前相比能够将抗体给药后的血浆中活性型PAI-1浓度抑制50％以上的天数。
结果，在给药了完全人型HOT-1的组中为28天，在MEDI-579给药组中为7天。表明与MEDI-579相比，完全人型HOT-1更长期且强力地抑制血浆中的活性型PAI-1。
产业上的可利用性
本发明的抗人PAI-1抗体对于活性型人PAI-1参与病态形成的各种疾病的预防或治疗有用。另外，本发明的多核苷酸、表达载体、进行了转化的宿主细胞和生产抗体的方法对于生产上述抗人PAI-1抗体有用。
序列表自由文本
下述序列表的数字标题<223>中记载了“Artificial Sequence”的说明。具体而言，序列表的序列号1和3所表示的碱基序列分别为完全人型HOT-1的重链和轻链的碱基序列，序列号2和4所表示的氨基酸序列分别为由序列号1和3编码的重链和轻链的氨基酸序列。

Claims (31)

1.一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31～35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50～66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸序号99～107的氨基酸序列构成的CDR3，所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸序号24～34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50～56的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸序号89～97的氨基酸序列构成的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段选自下述(1)～(2)中的任一个：
(1)包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段；以及
(2)上述(1)的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求2所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区。
4.如权利要求2所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段为包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求2或4所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
6.如权利要求1～5中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Igγ1恒定区。
7.如权利要求1～5中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为轻链恒定区的人Igκ恒定区。
8.如权利要求1～5中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Igγ1恒定区，并且包含作为轻链恒定区的人Igκ恒定区。
9.如权利要求3所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
10.如权利要求1～8中任一项所述的抗原结合片段，其为单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
11.一种抗人PAI-1抗体，其为权利要求9所述的抗人PAI-1抗体经翻译后修饰生成的抗体。
12.如权利要求11所述的抗人PAI-1抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
13.如权利要求11所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2的氨基酸序号1～447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
14.一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段抑制权利要求9或13所述的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合。
15.一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段与权利要求9或13所述的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。
16.一种多核苷酸，其包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列。
17.一种多核苷酸，其包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。
18.一种表达载体，其包含权利要求16和/或17所述的多核苷酸。
19.利用权利要求18所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述(a)～(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
20.利用权利要求18所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述(a)～(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(d)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
21.一种生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤，
(a)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
22.一种生产抗人PAI-1抗体的方法，包括对选自由下述(a)～(c)组成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体的步骤，
(a)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
23.通过权利要求21所述的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
24.通过权利要求22所述的方法生产的抗人PAI-1抗体。
25.一种药物组合物，其包含权利要求1～15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
26.一种药物组合物，其包含权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
27.一种药物组合物，其包含权利要求9所述的抗人PAI-1抗体、权利要求13所述的抗人PAI-1抗体和药学上可接受的赋形剂。
28.如权利要求25～27中任一项所述的药物组合物，其为肺纤维化的预防或治疗用药物组合物。
29.一种预防或治疗肺纤维化的方法，其包括以治疗有效量给药权利要求1～15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤。
30.用于在肺纤维化的预防或治疗中使用的权利要求1～15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
31.权利要求1～15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段在制造肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018107693A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗系统性硬化症的方法
WO2018107695A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗肾纤维化的方法
CN111072780A (zh) * 2020-03-24 2020-04-28 北京岳昊科技发展有限公司 白血病干细胞抑制剂及其在治疗慢性粒细胞白血病中的应用
US11938172B2 (en) 2017-06-19 2024-03-26 Talengen International Limited Method for regulating and controlling GLP-1/GLP-1R and drug

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4039276A4 (en) 2019-09-30 2023-11-15 Renascience Inc. INHIBITOR AGAINST THE EXPRESSION OF AN IMMUNE CHECKPOINT MOLECULE

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3742997A1 (de) * 1987-12-18 1989-06-29 Behringwerke Ag Peptide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur gewinnung von antikoerpern sowie deren verwendung zur blockierung der pai-1-aktivitaet menschlichen blutes
WO2002034776A2 (en) * 2000-10-26 2002-05-02 K.U.Leuven Research And Development Epitopes of pai-1
CN101654405A (zh) * 2008-08-19 2010-02-24 信谊药厂 抗凝化合物、组合物及其用途
WO2011139973A2 (en) * 2010-05-03 2011-11-10 Abbott Laboratories Methods of inhibiting fibrosis using anti-pai-1 antibodies

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003301809A1 (en) * 2002-05-13 2004-06-07 Children's Hospital Los Angeles Treatment and prevention of abnormal scar formation in keloids and other cutaneous or internal wounds or lesions
US7771720B2 (en) * 2007-09-07 2010-08-10 Cisthera, Inc. Humanized PAI-1 antibodies
US20100254979A1 (en) 2009-03-06 2010-10-07 Cisthera, Incorporated Humanized PAI-1 Antibodies and Uses Thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3742997A1 (de) * 1987-12-18 1989-06-29 Behringwerke Ag Peptide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur gewinnung von antikoerpern sowie deren verwendung zur blockierung der pai-1-aktivitaet menschlichen blutes
WO2002034776A2 (en) * 2000-10-26 2002-05-02 K.U.Leuven Research And Development Epitopes of pai-1
CN101654405A (zh) * 2008-08-19 2010-02-24 信谊药厂 抗凝化合物、组合物及其用途
WO2011139973A2 (en) * 2010-05-03 2011-11-10 Abbott Laboratories Methods of inhibiting fibrosis using anti-pai-1 antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANN-PASCALE BIJNENS等: "Importance of the Hinge Region between α-Helix F and the Main Part of Serpins, Based upon Identification of the Epitope of Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 Neutralizing Antibodies", 《JBC》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018107693A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗系统性硬化症的方法
WO2018107698A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗组织器官纤维化的方法
WO2018107695A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗肾纤维化的方法
WO2018107697A1 (zh) * 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种预防和治疗肺纤维化的方法
CN110121358A (zh) * 2016-12-15 2019-08-13 泰伦基国际有限公司 一种预防和治疗肺纤维化的方法
CN110191718A (zh) * 2016-12-15 2019-08-30 泰伦基国际有限公司 一种预防和治疗组织器官纤维化的方法
US11071772B2 (en) 2016-12-15 2021-07-27 Talengen International Limited Method for preventing and treating tissue and organ fibrosis
US11154595B2 (en) 2016-12-15 2021-10-26 Talengen International Limited Method for preventing and treating pulmonary fibrosis
US11219669B2 (en) 2016-12-15 2022-01-11 Talengen International Limited Method for preventing and treating liver fibrosis
US11938172B2 (en) 2017-06-19 2024-03-26 Talengen International Limited Method for regulating and controlling GLP-1/GLP-1R and drug
CN111072780A (zh) * 2020-03-24 2020-04-28 北京岳昊科技发展有限公司 白血病干细胞抑制剂及其在治疗慢性粒细胞白血病中的应用
CN111072780B (zh) * 2020-03-24 2020-06-23 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 白血病干细胞抑制剂及其在治疗慢性粒细胞白血病中的应用

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Publication number Publication date
US20160369008A1 (en) 2016-12-22
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