CN106905431A

CN106905431A - 抗人补体d因子的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN106905431A
Application number: CN201710229191.2A
Authority: CN
Inventors: 高永娟; 孙乃超; 周若芸; 李强; 刘瑞贤; 金宜慧
Original assignee: Xuhua (shanghai) Biological Research & Technology Center Co Ltd
Current assignee: Xuhua (shanghai) Biological Research & Technology Center Co Ltd
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN106905431B

Abstract

本发明提供了以高亲和力与人D因子特异性结合的抗体及其抗原结合片段，还提供了编码所述抗体及其抗原结合片段的核酸分子，用于表达所述抗体及其抗原结合片段的表达载体和宿主细胞，以及所述抗体及其抗原结合片段的生产方法。此外，本发明还提供了包含所述抗体及其抗原结合片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及所述抗体及其抗原结合片段在用于制备治疗多种疾病(包括与年龄有关的黄斑变性（AMD）、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎和成人呼吸窘迫综合症) 的药物中的用途。

Description

抗人补体D因子的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于治疗性单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及一种针对人补体D因子的抗体；还涉及所述抗体在用于制备治疗多种疾病（包括与年龄有关的黄斑变性（AMD）、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎和成人呼吸窘迫综合症）药物中的用途。

背景技术

补体系统是人免疫系统的一部分，可增强（补充）抗体和吞噬细胞从生物体清除微生物和受损细胞的能力，促进炎症并攻击病原体的质膜。它是先天免疫系统的一部分，不会为适应环境的改变而调整，并且在个体的一生中不改变，但可通过适应性免疫系统发挥作用。

补体系统由血液中一些小型蛋白组成，通常由肝脏合成，以没有活性的前体（前蛋白）在血液中循环。当其受到触发物刺激时，系统中的蛋白酶会切割特定蛋白质以释放细胞因子并引发一系列的串联反应作进一步裂解。这种补体激活作用可以通过传统途径，凝集素途径和替代途径三种不同的途径进行，而每个相应途径由不同的组分和机制激活（P.N.Nesargikar, B. Spiller, R. Chavez. European Journal of Microbiology &Immunology. 2012; 2: 103–11）。传统途径和凝集素途径由相同的成分组成。除了负责初始活化的因子，补体的传统途径通常需要抗原抗体复合物的参与，并且由C1复合物的激活触发。凝集素途径依赖于特定的碳水化合物部分激活，例如位于微生物表面上的甘露聚糖，凝集素途径的激活由甘露糖结合凝集素（Mannose-Binding Lectin，MBL）或Ficolins介导，而不是由C1复合物介导。Ficolins是由类似胶原蛋白的细长伸展分子和类似纤维蛋白原的球状结构域组成的寡聚凝集素组，通常对N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）具有特异性。MBL与病原体表面上的甘露糖残基结合，从而激活与MBL相关的丝氨酸蛋白酶，MASP-1和MASP-2。Ficolin与MBL同源，并通过MASP以相似的方式发挥其功能，但与其结合的残基不是甘露聚糖而是其他碳水化合物。最后，替代途径系通过C3的水解而活化，事实上C3的水解是自发性的，在低水平下持续活化。所有三个途径均导致蛋白酶C3转化酶的同源变体的形成，其切割C3形成C3a和C3b。 C3b又是裂解C5的C5转化酶的一部分，其最终导致膜攻击复合物（Membrane Attack Complexes， MAC）或可溶性末端补体复合物(soluble TerminalComplement Complex, sTCC)的形成。这些活化过程最终导致白细胞趋药性，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞等的活化，增高血管通透性，细胞溶解和组织损伤的炎症活性。

补体串联需受严谨的调节以防止免疫介导疾病的发生以及宿主细胞在非感染状态下受到脱靶损伤。补体激活和抑制之间的平衡由一系列调节蛋白介导。补体途径的关键抑制剂包括补体D因子（Complement Factor D，CFD)及H因子（CFH）等等，其功能在于通过平衡附着于正常宿主细胞的活化补体蛋白来确保补体系统靶向外源而不是宿主细胞。补体系统因子的串联作用若因免疫系统的失调而过度活化，或失去控制地活化将导致病理性的炎症和自身免疫性疾病的发生。因此，若能将过度活化或无法控制的活化补体加以适当抑制，在临床上将可以为患有病理性炎症和自身免疫性疾病的患者提供治疗效果。

人补体D因子(或人D因子， human CFD) 是激活补体替代途径所必需的高度特异性丝氨酸蛋白酶。它切割与C3b结合的B因子，产生C3b / Bb酶，成为替代途径C3 / C5转化酶的活性元件。D因子在人体中的血浆浓度非常低（1.8μg/ ml），并且已有证据显示它是激活补体替代途径中具有限速作用的酶（P. H. Lesavre and H. J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J. E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401）。因此，D因子在激活补体替代途径中是相当合适的疾病抑制靶标。

在动物模型和离体研究中，已经证明若将补体的活化下调可以有效治疗下列几种病症，包括系统性红斑狼疮和肾小球肾炎（Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568）、类风湿性关节炎（Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959）、心肺血管繞道手术和血液透析（C. S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572）、器官移植中的超滤排斥（T. J. Kroshus et al.,Transplantation, 1995; 60: 1194-1202）、心肌梗死（J. W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H. F. Weisman et al., Science, 1990; 249:146-151）、缺血再灌注造成的组织损伤（E. A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457）和成人呼吸窘迫综合征（R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750）。此外，其他炎性病症和自身免疫疾病也与补体激活密切相关（V.M. Holers, “Complement”, In: Clinical Immunology: Principles and Practice,R.R. Rich Ed., Mosby Press, 1996, pp. 383-391; B. P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994:24:219-228），包括热损伤、严重哮喘、过敏性休克、肠炎、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、皮肌炎、膜性增生性肾小球肾炎和干燥综合征（Sjogren's syndrome）。

因此，藉由针对补体系统抑制靶标，如D因子，发展出特异性的抑制剂，例如抗人D因子抗体，能对补体的活化功能下调，则此类抑制剂将具有治疗上述疾病的潜在功效。在这些潜在的疾病靶标中值得一提的是与年龄有关的黄斑变性（Age-related MacularDegeneration， AMD）（M. La Cour, J.F. Kiilgaard, M.H. Nissen. Drugs Aging 2002;19:101-133.）。AMD的问题一般认为是发生在视网膜外部和视网膜色素上皮，遗传倾向、年龄、缺血和环境因素可能在病变发展中扮演主要角色。最近的一些研究报导了AMD和补体串联中的关键蛋白之间的关联。Hendrik P.N.Scholl及其同事发现，在患有AMD的患者中，C3d，CFB和CFD显著增加（H.P. Scholl, P. Charbel Issa, M. Walier, S. Janze, B.Pollok-Kopp, F. Borncke et al. PLoS One 2008;3:e2593.）。这些激活产物存在于循环血液中显示了与AMD有关的炎症不局限于视网膜，而有可能遍及全身。

许多正在开发的AMD疗法是以补体串联的特定成分作为靶向。补体疗法还具有潜力能在疾病的早期阶段发挥作用，阻止AMD进展到晚期。在这些不同的靶向疗法中，有一种是以抗D因子抗体来抑制补体串联的D因子（E.J. Tanhehco, K.S. Kilgore, D.A. Liff,K.L. Murphy, M.S. Fung, W.N. Sun, C. Sun, and B.R. Lucchesi. Transplantation Proc., 31:2168-2171.）。D因子的功能在于调节补体串联终极产物的产生，抑制因子D旨在减弱补体激活，而不是完全关闭系统。当抗D因子抗体通过玻璃体内注射进入AMD病患的眼球后可以选择性地抑制D因子，降低D因子在眼球中的含量，从而阻止AMD的恶化甚或改善病况。目前Roche研发的Lampalizumab处于III期临床研究阶段。研发新型的抗人补体D因子单克隆抗体，具有更高的特异性、更低毒副作用、更佳临床药效，也将给患者提供更多的用药选择。特别是含有极高源自人成份的人源化抗体，其在临床上治疗因补体过度活化引起的疾病应更安全，而在人体内的持久，可能使功效更显著。

发明内容

本发明目的在于提供一种对人补体D因子具有高亲和力的单克隆抗体。

在一方面，本发明提供了分离的结合人补体D因子的单克隆抗体，其包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，

其中：

(i) 重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的CDR-H1序列及其保守修饰的氨基酸序列，和SEQ ID NO：8所示的CDR-H2序列及其保守修饰的氨基酸序列，和SEQ ID NO：9所示的CDR-H3序列及其保守修饰的氨基酸序列；和

(ii) 轻链可变区包含SEQ ID NO：12所示的CDR-L1序列及其保守修饰的氨基酸序列，和SEQ ID NO：13所示的CDR-L2序列及其保守修饰的氨基酸序列，和SEQ ID NO：14所示的CDR-L3序列及其保守修饰的氨基酸序列。

进一步地，包含上述CDR序列的抗体为鼠源的、嵌合的或人源化的。

例如，所述抗体为鼠源的或嵌合的，其重链可变区进一步包含鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或其变体的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠κ、λ链或其变体的轻链FR区。

较优选地，上述鼠源或嵌合抗体包含：

(a) 重链可变区，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；和

(b) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

例如，所述抗体为人源化的。制备人源化抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过将本发明的CDR序列转移至人抗体可变区中来制备本发明的人源化抗人D因子抗体。所述人源化抗体不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，不会因被抗抗体中和而被快速清除。

本发明的一些优选实施例中，所述抗体为人源化的，其重链可变区具有选自SEQID NOs: 16、20、24和28 所示的氨基酸序列；和所述轻链可变区具有选自SEQ ID NOs: 18、22、26和30所示的氨基酸序列。更优选地，由此产生的所述人源化抗体AS01237、AS01326、AS01328、AS01337，其重链可变区分别包含如SEQ ID NO：16、20、24和28所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如SEQ ID NO：18、22、26和30所示的氨基酸序列。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明抗体的序列进行替换、添加和/或缺失一个或更多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个）氨基酸，以获得所述抗体序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少75%同源；更优地，本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。

本发明的抗体可以为全长抗体，例如，在一些优选的实施方案中，本发明的抗人D因子抗体还包含人IgG4或IgG1的重链恒定区和人κ轻链恒定区；或者，所述抗体可以仅包含抗原结合片段，诸如Fab或Fab’2片段，或单链抗体ScFv。

在上述任何实施例中，本发明所述抗体能够以约1 nM或更低的KD结合人D因子；在较优选的实施例中，所述抗体能够以约100 pM或更低的KD结合D因子；在更优选的实施例中，所述抗体能够以约10 pM或更低的KD结合D因子；在最优选的实施例中，所述抗体能够以约1 pM或更低的KD结合D因子。

本发明另一方面，提供一种编码如上所述抗体的DNA分子。

本发明一优选实施例中，编码所述抗体重链可变区的DNA分子包含选自SEQ IDNO：5、15、19、23和27所示的序列；和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子包含选自SEQ IDNO：10、17、21、25或29所示的序列。更优选的地，编码所述抗体Mab25、AS01237、AS01326、AS01328和AS01337重链可变区的DNA分子分别如SEQ ID NO：5、15、19、23和27所示；和编码其轻链可变区的DNA分子分别如SEQ ID NO：10、17、21、25或29所示。

本发明另一方面，提供一种包含如上所述DNA分子的表达载体。

本发明另一方面，提供一种用如上所述表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞优选为CHO细胞。

本发明另一方面，还提供了包含本发明所述抗体的任何一种双特异性分子。

本发明另一方面，还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明又一方面，还提供了制备本发明所述抗体的方法，其包括：(a)在允许产生所述抗体的条件下培养本发明的上述宿主细胞；(b) 回收、分离产生的所述抗体。

本发明再一方面，还涉及根据本发明所述结合人D因子的抗体、或包含其的药物组合物、或包含其的免疫缀合物、或包含其的双特异性分子在制备用于治疗人体内补体活性过度活化所致疾病的药物中的用途，所述疾病包括但不限于与年龄有关的黄斑变性（AMD）、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎和成人呼吸窘迫综合症等。优选地，在制备治疗人体内补体活性过度活化所致疾病药物中可以使用嵌合的、人源化的抗人D因子抗体；较优选地，使用人源化的。

本发明的再一方面涉及所述抗人补体D因子抗体具有至少一种活性，包括例如但不限于对补体介导的体外溶血的抑制作用。

发明详述

缩写和定义

CDR 用Kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区

HRP 辣根过氧化物酶

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统

mAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

V区在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

K_D 平衡解离常数

ka 结合速率常数

Kd 解离速率常数

本发明所使用的术语“抗体”涵盖全长抗体(例如，IgG1或IgG4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段)以及经过修饰的抗体(例如人源化、糖基化等)。本发明还包括具有糖基化修饰的抗人D因子抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点，例如在寡糖链上去岩藻糖修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能；在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。

术语“单克隆抗体或mAb”，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。

“抗体片段”和“抗原结合片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10%的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20%、50%、70%、80%5、90%、95%或100%或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子，例如ScFv、单抗体(技术来自Genmab)；纳米抗体(技术来自Domantis)；结构域抗体(技术来自Ablynx)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger等, 2005; NatBiotechnol, 23: 1126-1136中。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。

“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994) ThePharmacology of Monoclonal Antibodies (单克隆抗体药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。

“抗原结合片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。

术语“嵌合抗体（Chimeric antibody）”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核表达系统或原核表达系统中表达嵌合抗体分子。在本发明的一优选实施方案中，所述的抗人D因子嵌合抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。所述抗人D因子嵌合抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或其变体的重链FR区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）毒性的IgG1。

术语“双特异性分子”，是指本发明的抗人D因子抗体或其抗原结合片段可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质（例如肿瘤相关抗原、细胞因子和细胞表面受体）以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接（例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式）至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。例如，“双特异性抗体”是指包含两个可变结构域或ScFv单位使得所得抗体识别两种不同抗原。

本文使用的术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原（对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的）之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(K_D)表示，其中K_D值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出。(参见Malmqvist M,Nature,1993, 361:186-187)。Kd/Ka的比率等于解离常数K_D (通常参见Davies等人,Annual Rev Biochem, 1990; 59:439-473)。可用任何有效的方法测量K_D、ka和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例3.4中所述的ForteBio Octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。当平衡结合常数(K_D)为≤10 μM，优选为≤ 100 nM，更优选为≤10 nM，和最优选为≤ 100 pM~约1 pM时，本发明的抗体被认为特异性地结合至人D因子表位。

同源抗体

在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明抗人D因子抗体的期望的功能特性。

例如，本发明提供了人源化的结合人D因子的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：6、16、20、24和28所示的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；更优地，所述重链可变区包含与选自SEQ IDNOs：6、16、20、24和28 所示的氨基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：11、18、22、26和30所示的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：11、18、22、26和30所示的氨基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源的氨基酸序列。

具有保守修饰的抗体

术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β-分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。

在某些实施方式中，本发明的抗体包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体（例如AS01237、AS01326、AS01328和AS01337）的特定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留了本发明抗人D因子抗体的期望的功能特性。因此，本发明提供了分离的结合人D因子的抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区CDR-H1序列包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H2序列包含选自SEQ ID NO：8所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H3序列包含选自SEQ ID NO：9所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L1序列包含选自SEQ ID NO：12所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L2序列包含选自SEQ ID NO：13所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L3序列包含选自SEQ ID NO：14所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

附图说明

图1、抗人D因子鼠源抗体与人D因子的结合曲线。

图2、抗人D因子鼠源抗体对补体替代途径激活引起的体外溶血的抑制作用。

图3、对15个亲和力最高的人源化克隆与其嵌合抗体进行的多循环动力学分析（Biacore T200）。

图4、6个亲和力最高的人源化克隆与其嵌合抗体与BSA结合的的热稳定性分析。在图中，TG1是未转化的TG1细胞培养基（阴性对照）。 a，室温； b，在50℃下加热； c，65℃下加热；d，在70℃加热。

图5、6个亲和力最高的人源化克隆与其嵌合抗体与人D因子抗原结合的热稳定性分析。在图中，TG1是未转化的TG1细胞培养基（阴性对照）.a，室温； b，在50℃下加热；c，65℃下加热；d，在70℃加热。

图6、选定的四个抗人D因子人源化抗体与其嵌合抗体的亲和力测定结果。抗原浓度为0.20nM、0.39nM、0.78nM、1.56nM、3.125nM（×2），6.25nM和12.5nM。

图7、选定的四个抗人D因子人源化抗体对补体激活引起的体外溶血的抑制性。

图8、四个抗人D因子人源化抗体AS01237、AS01326、AS01328、AS01337与鼠源抗体Mab25重链可变区氨基酸序列的并列比较。

图9、四个抗人D因子人源化抗体AS01237、AS01326、AS01328、AS01337与鼠源抗体Mab25轻链可变区氨基酸序列的并列比较。

具体实施方式

实施例1：抗人D因子鼠源单克隆抗体的制备

1) 免疫

以人D因子（购自Complement Technology Inc.）20μg在完全辅佐剂中给四周龄的BALB/c小鼠皮下注射。每三至四星期注射一次，一共五次。最后，并在腹膜内单次注射20μghFactor D蛋白。

2) 以 ELISA 法测试定小鼠血清与人D因子抗原的结合

以人D因子包被酶标板（Costar），室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温(Tween)20的PBS洗孔。然后分别加入稀释血清和作为阴性对照的非相关抗体（Irrevalent mAb），室温孵育1小时，用含有0.05%吐温(Tween)20的PBS洗孔，然后每孔加入50μl HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体（JacksonLaboratory）作为检测抗体。经血清测试后，鉴定出含有高水平抗人D因子抗体血清的小鼠。

3) 细胞融合和筛选

经血清测试后，鉴定出含有高水平抗人D因子抗体血清的小鼠。取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株相融合。混合5×10⁸Sp2/0细胞与5×10⁸脾细胞在50%聚乙二醇 (PEG，分子量为1450)和5%二甲基亚砜(DMSO)溶液中融合。用Iscove培养基(含有10%胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和1.6mM胸苷)来调整脾脏细胞数至7.5×10⁵/mL，以0.2ml加入96孔培养板的孔内。置于37°C，5% CO₂的培养箱内。10天后，取出各孔内的培养基测试其中鼠源抗体对本实验室表达的抗人D因子抗体Mab238与人D因子结合的抑制作用，以此筛选出与Mab238竞争的阳性孔。Mab238的可变区序列来源于美国专利8273352号中的抗人D因子人源化Fab 238。再将上述含有能够抑制HRP 标记Mab238与人D因子结合的单克隆抗体的孔内融合细胞进行亚克隆，同样以竞争ELISA方法筛选得到四个表达高亲和力鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株13、17、23和25。

制备纯化的鼠单克隆抗体 Mab13、Mab17、Mab23和Mab25的抗体, 以获得待测试的抗体样品。在补充10%FCS的RPMI1640培养基中培养产生特异性抗体的克隆。当细胞密度达到大约5×10⁵个细胞/ml 时，用无血清培养基替换该培养基。2至4天后，将培养过的培养基离心，以收集培养物上清液。将蛋白G柱用于纯化抗体。用150mM NaCl透析单克隆抗体洗脱液。通过0.2μm滤器将透析的溶液过滤除菌，以获得待测试的抗体样品。抗人D因子抗体的定性有两种测定法，一种方法是测定抗体对人D因子抗原的结合,另一种方法是测定抗体对补体介导的体外溶血的抑制作用。

实施例2：抗人D因子鼠源单克隆抗体的定性

1) ELISA法测定与人D因子抗原的结合

以人D因子包被酶标板（Costar），室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温(Tween)20的PBS洗孔。然后分别加入每孔50μl纯化的抗人D因子鼠源抗体Mab13、Mab17、Mab23、Mab25和含有抗另一种抗原的非相关抗体作为阴性对照，室温孵育1小时，用含有0.05%吐温(Tween)20的PBS洗孔，然后每孔加入50μl HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体（Jackson Laboratory）作为检测抗体，其结果示于图1。

2)亲和力分析试验

采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的鼠单克隆抗体Mab13，Mab17，Mab23和Mab25与抗原的结合亲和力常数进行测定（ForteBio Octet RED&QK系统，PALL公司）。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nM，分别亲和偶联AMC传感器(Anti-mIgG Fc Capture)。分析亲和力分析动力学拟合曲线及各通道动力学参数测定结果，计算得出各个鼠源抗体的亲和力常数（见表1）。

表1. 抗人D因子鼠源抗体结合人D因子的亲和力(Octet)

表1显示抗人D因子鼠源抗体Mab13、Mab17、Mab23和Mab25针对人D因子具有极高的结合亲和力，均可达到10-10M数量级及以上。

3)对补体介导的体外溶血的抑制作用

体外溶血试验用于检测抗人D因子抗体对补体激活的抑制活性。方法如下所述。正常的兔红细胞（RBCs，购自上海榕柏生物技术有限公司）与10mM EGTA混合以抑制补体激活的经典途径。50μl每孔加入梯度稀释的抗人D因子鼠源抗体与EGTA处理的人血清混合，抗人D因子抗体Mab238作为阳性对照。然后加入EGTA处理过的兔红细胞在37^o孵育1小时，离心收集上清读OD_405nm的吸光值。抗人D因子抗体对溶血的抑制作用通过下列公式得出的抑制率（%）来体现：抑制率（%） = 100×[(OD_{无抗体样品读数} – OD_{血清背景值}) - (OD_{有抗体样品读数} –OD_{血清背景值})]/(OD_{无抗体样品读数} – OD_{血清背景值})。

其结果示于图2，抗人D因子鼠源抗体Mab13、Mab17、Mab23、Mab25和对照抗体Mab238都具有对补体介导的体外溶血的抑制作用。相比之下，在0.5μg/ml和1μg/ml两个浓度下Mab25都达到了最大的抑制效果，同时Mab25也具有较好的抗原结合活性和亲和力，故选择Mab25进行抗体的人源化。

实施例3：抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链和轻链可变区基因的克隆

1) Mab25鼠源抗体的重链可变区的克隆

为设计鼠源抗体的人源化，首先须获得含鼠源抗体Mab25重链和轻链可变区编码序列的DNA片段。用mRNA纯化试剂盒(NEB) 从Mab25小鼠杂交瘤细胞分离出mRNA，以此制备cDNA(SMARTer RACE试剂盒，Clontech)。通过聚合酶链式反应(PCR) 从cDNA中分离重链可变区DNA片段。PCR的5’-引物使用混合液 : 0.4 μM 的5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（SEQ ID NO:1，引物1）和2μM的 5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(SEQ ID NO:2，引物2)。 PCR的3’-引物使用 5’-catcccagggtcaccatggagtta-3’ (SEQ ID NO:3，引物3)。引物3与小鼠IgG1重链恒定区同源反义。将胶纯化后得到的DNA片段克隆入TOPO-TA载体(Invitrogen)并测序，得到编码Mab25小鼠杂交瘤重链的可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，及其互补决定区的氨基酸序列CDR-H1 (SEQ ID NO：7)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 8)和 CDR-H3 (SEQID NO: 9) (互补决定区的定义参见Kabat E.等人的Sequences of Proteins ofImmunological Interest 第5版U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)。

2) Mab25鼠源抗体的轻链可变区的克隆

以相似的PCR方法，使用上述5’-引物混合液和另一个与小鼠免疫球蛋白轻链恒定区同源反义的3’-引物5’-gactgaggcacctccagatgttaa-3’(SEQ ID NO: 4，引物4)，从 cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆入ΤOΡO-TA载体并测序，得到编码Mab25小鼠杂交瘤轻链的可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:10)和氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，及其互补决定区的氨基酸序列CDR-L1 (SEQ ID NO：12)，CDR-L2 (SEQ ID NO: 13)和CDR-L3 (SEQ ID NO:14)。

实施例4：抗人D因子人源化抗体的制备和定性

抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25的人源化是按照 "框架组合"法（美国专利申请20120316085(A1)号)完成的。简单来说，就是选择与鼠单克隆抗体同源性最高的人的一系列种系基因的框架区部分替换鼠的框架区，用重叠的CDR部分做PCR把各个框架区组装起来，合成人源化抗体Fab区的基因文库，插入到噬菌粒载体中，形成人源化Fab的嗜菌粒文库，之后用噬菌体展示技术分离高亲和力的人源化抗体，再通过高通量筛选，找到亲和力和热稳定性等性质相对最好的人源化抗体。在高通量筛选的亲和力排序实验中，把待选的人源化的Fab片段捕获到CM5（GE healthcare）芯片表面，经过平衡以后，注射抗原蛋白300秒使之与待选的人源化的Fab片段结合（此为结合阶段），之后注射缓冲液900秒，抗原蛋白解离（此为解离阶段），最后将芯片再生，注射下一批要分析的人源化的Fab片段直到所有抗体分析结束。根据这些抗体的解离速率常数将这些抗体进行排序，选出其中亲和力最高的15个抗体片段。之后用SPR (Surface Plasmon Resonance，表面等离子体共振) 技术从这些选中的人源化抗体Fab片段的亲和力做粗略估计，实验步骤与上文描述的亲和力排序类似，不过用了不是一个，而是三个‘结合-解离-再生’的循环，实验使用的抗原浓度为0.78125,3.125, 12.5 nM，结合时间300秒，解离时间1500秒，将样品信号减去参照池信号及缓冲液注射信号处理后，用Biacore T200 (GE Healthcare)分析软件中的1：1结合模型拟合数据（见图3），得到这15个亲和力最高的人源化抗体片段的亲和力参数（见表2）。

表2. 选择的15个人源化克隆与鼠源抗人D因子Fab的动力学数据（Biacore T200）

同时也从表2中选出6个亲和力较高的抗体,即AS01230, AS01232, AS01237,AS01326, AS01328, 和AS01337。并对这些抗体及嵌合抗体的热稳定性用ELISA进行粗略的评估。对由于人源化抗体及嵌合抗体的Fab片段带有SASA标签（SASA与BSA结合的亲和力为4pM），因此抗体可以同时与BSA和人D因子抗原蛋白结合。通过检测抗体与这两个蛋白在不同温度，包括室温、50摄氏度、65摄氏度和70摄氏度下的结合活性，可以粗略的估计抗体的热稳定性。结果显示AS01237、AS01326、AS01328和AS01337的热稳定性与嵌合抗体相比不相上下（见图4和图5），因此选择这四个克隆进行Fab区DNA片段的扩增，从而获得AS01237、AS01326、AS01328和AS01337人源化抗体可变区核苷酸序列（SEQ ID NO: 15、17、19、21、23、25、27、29）和氨基酸序列（SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、26、28、30）。然后将扩增得到的DNA片段插入pTT5载体构建成表达全长抗体的质粒，瞬转HEK293细胞，用蛋白A亲和力层析法纯化细胞分泌的抗体蛋白进行人源化后全长抗体的亲和力测定。

对于选定的四个抗人D因子人源化抗体AS01237、AS01326、AS01328和AS01337的亲和力测定也是利用SPR技术，根据仪器Biacore T200的说明书进行操作。在测定实验里，抗人IgGFc的多克隆抗体通过氨基偶联法固定在CM5芯片表面，人源化抗体流过与多克隆抗体作用被捕获到芯片表面，用抗原蛋白作为流动相，流过抗体表面与之相互作用。处理得到的数据，并用Biacore T200的分析软件1：1结合的模型拟合实验数据，拟合数据与实验数据基本重叠，得到结合和解离速率常数k _a和k _d，用k _d除k _a得到平衡解离常数K _D。实验结果显示，选择的四个人源化抗人D因子抗体的亲和力与其嵌合抗体的亲和力相当（见图6和表3）。

表3. 嵌合和人源化抗人D因子抗体的亲和力分析

体外溶血试验对四个选定的抗人D因子人源化抗体AS01237、AS01326、AS01328、AS01337和抗人D因子鼠源抗体Mab25进行检测，结果显示四个人源化抗体与鼠源抗体对补体激活具有相同的抑制活性，其结果示于图7。

图8显示4个抗人D因子人源化抗体和鼠源抗体Mab25的重链可变区氨基酸序列的并列比较。图9显示4个人源化的抗体和鼠源抗体Mab25的轻链可变区氨基酸序列的并列比较。可变区中，互补决定区(CDRs) 与构架区(FRs)有如标示。4个人源化抗体互补决定区是鼠源，构架区是完全人源的。而构架区中变化的氨基酸集中在某些位置。

实施例5：人源化抗体表达载体的构建和蛋白表达

用上述方法中获得的重链和轻链的编码cDNA插入到pCMAB2M 真核表达载体(本实验室构建)中，构建人源化表达载体。该表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动因子-增强子。同时，载体质粒中含有可选择标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，载体质粒中含有DHFR基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲喋呤(Methotrexate, MTX, Sigma) 共扩增人源化抗体基因和DHFR基因。

将上述已构建的重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达人源化抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞（参见，例如Chasin,L.等人的美国专利4818679号）。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为250V电场和960 μFd电容的Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories), 在比色杯内加入2×10⁷个细胞悬浮在0.8 mL 的PBS中，并含有10μg用PvuI（Takara)线性化的表达载体质粒DNA。转染2天后，加入含有0.2 mg/mL G418 以及200 nM氨甲喋呤（methotrexate 或MTX)。为了实现较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因共扩增转染的人源化抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子及ELISA的方法测定各细胞系的分泌率，选出高水平表达人源化抗体的细胞株。收集人源化抗体的条件培养基, 用于测定对补体介导的体外溶血的抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 旭华（上海）生物研发中心有限公司

<120> 抗人补体D因子的单克隆抗体及用途

<130> 201703

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物 1

<400> 1

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

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catcccaggg tcaccatgga gtta 24

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gactgaggca cctccagatg ttaa 24

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<212> DNA

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链可变区核苷酸序列

<400> 5

gcggtccagc ttcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctgggta cacatttact agttatgtta taaactggat gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acattgatga ttctgaatat 180

aatgagaagt tcgaaggcaa ggccactctg acttcagaca aaacctccag tatagcctac 240

atggaactca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagagagggg 300

cctgcttttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 6

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链可变区氨基酸序列

<400> 6

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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Val Ile Asn Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Thr Ser Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

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Thr Val Ser Ala

115

<210> 7

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链可变区CDR-H1氨基酸序列

<400> 7

Ser Tyr Val Ile Asn

1 5

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链可变区CDR-H2氨基酸序列

<400> 8

Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Glu

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Gly

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25重链可变区CDR-H3氨基酸序列

<400> 9

Glu Gly Pro Ala Phe Ala Tyr

1 5

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<212> DNA

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25轻链可变区核苷酸序列

<400> 10

gatattttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcatgcctcc 60

gtctcttgca gatctagtca gaatcttgta catagtaatg gagacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgattt acaaagtttc cacccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aagctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 11

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25轻链可变区氨基酸序列

<400> 11

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

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Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

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Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25轻链可变区CDR-L1氨基酸序列

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Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25轻链可变区CDR-L2氨基酸序列

<400> 13

Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser

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<212> PRT

<213> 抗人D因子鼠源单克隆抗体Mab25轻链可变区CDR-L3氨基酸序列

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<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体AS01237重链可变区核苷酸序列

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cctggacaag ggcttgagtg gatgggatac attaacccgt atattgacga tagcgagtac 180

aacgaaaagt tcgagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggt 300

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<211> 116

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01237重链可变区氨基酸序列

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Glu Gly Pro Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

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Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01237轻链可变区核苷酸序列

<400> 17

gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60

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taccagcaga aaccaggaca gcctcctaag ctgctcattt acaaagtgag cacccgtttc 180

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<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01237轻链可变区氨基酸序列

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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser

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Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

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<211> 348

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01326重链可变区核苷酸序列

<400> 19

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aacgaaaagt tcgagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc aagagaaggt 300

ccggcgtttg cgtactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 20

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01326重链可变区氨基酸序列

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

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Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Val Ser Ser

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<211> 336

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01326轻链可变区核苷酸序列

<400> 21

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgcc gtagcagcca aaatctggtg cacagcaacg gcgacaccta cctggagtgg 120

tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct ataaagtgag cacccgtttc 180

agcggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agccgggtgg aggctgagga ttttggagtt tattactgct ttcagggcag ccatgttccg 300

ccgaccttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01326轻链可变区氨基酸序列

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 348

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01328重链可变区核苷酸序列

<400> 23

caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctacgtga tcaactgggt gcgacaggcc 120

actggacaag ggcttgagtg gatgggatac attaacccgt atattgacga tagcgagtac 180

aacgaaaagt tcgagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggt 300

ccggcgtttg cgtactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 24

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01328重链可变区氨基酸序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01328轻链可变区核苷酸序列

<400> 25

gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgcc gtagcagcca aaatctggtg cacagcaacg gcgacaccta cctggagtgg 120

tacctgcaga agccaggcca ggctcccagg ctcctcatct ataaagtgag cacccgtttc 180

agcggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgct ttcagggcag ccatgttccg 300

ccgaccttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01328轻链可变区氨基酸序列

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 348

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01337重链可变区核苷酸序列

<400> 27

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggacctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggatt cacctttact agctacgtga tcaactgggt gcgacaggct 120

cgtggacaac gccttgagtg gataggatac attaacccgt atattgacga tagcgagtac 180

aacgaaaagt tcgagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagaaggt 300

ccggcgtttg cgtactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 28

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01337重链可变区氨基酸序列

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01337轻链可变区核苷酸序列

<400> 29

gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgcc gtagcagcca aaatctggtg cacagcaacg gcgacaccta cctggagtgg 120

taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct ataaagtgag cacccgtttc 180

agcggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agccgggtgg aggctgagga ttttggagtt tattactgct ttcagggcag ccatgttccg 300

ccgaccttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗人D因子人源化单克隆抗体 AS01337轻链可变区氨基酸序列

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种分离的抗人补体D因子的抗体，其包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，

其中：

2.如权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体为鼠源的或嵌合的，其重链可变区包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或其变体的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。

3.如权利要求2所述抗体，其特征在于，其重链可变区包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体为人源化的。

5.如权利要求4所述抗体，其特征在于，其重链可变区具有选自SEQ ID NOs: 16、20、24和28 所示的氨基酸序列；和其轻链可变区具有选自SEQ ID NOs: 18、22、26和30所示的氨基酸序列。

6.如权利要求3或5所述的抗体，其特征在于，所述抗体可变区的序列包含一个或更多个氨基酸的替换、添加和/或缺失；优选地，所述变体的序列可以与其来源序列至少75%同源；更优地，本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。

7.如权利要求1-6任一项权利要求所述抗体，其特征在于，所述抗体以1 nM或更低的KD结合人D因子，较优选地，以100 pM或更低的KD结合人D因子；更优选地，以10 pM或更低的KD结合人D因子；最优选地，以1 pM或更低的KD结合人D因子。

8.包含如权利要求1-6任一项所述抗体的双特异性分子。

9.药物组合物，其包含如权利要求1-6任一项所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

10.编码如权利要求1-6任一项所述抗体的DNA分子。

11.如权利要求10所述的DNA分子，其特征在于，编码所述抗体重链可变区的DNA分子包含选自SEQ ID NO：5、15、19、23和27所示的序列；和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子包含选自SEQ ID NO：10、17、21、25或29所示的序列。

12.包括如权利要求10或11所述的核酸序列的载体。

13.包含如权利要求12所述的载体的宿主细胞。

14.制备如权利要求1-6任一项所述抗体的方法，其包括：在允许产生所述抗体的条件下培养包含如权利要求14所述的宿主细胞，以及回收、分离产生的所述抗体。

15.如权利要求1-6任一项所述抗体在用于制备治疗因补体过度活化引起的疾病药物中的用途；所述疾病包括与年龄有关的黄斑变性（AMD）、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎和成人呼吸窘迫综合症。