JP2024500311A - 抗結合組織成長因子抗体を含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、抗結合組織成長因子抗体を含む医薬組成物を提供する一方、上記抗結合組織成長因子抗体を含む医薬組成物の用途を更に提供する。

Description

本開示は、医薬製剤分野に属し、具体的には、抗体を含む医薬組成物、及びその薬剤としての用途に関する。

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。

結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の発現は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーにより誘導される。当該スーパーファミリーは、ＴＧＦβ－１、－２と－３、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－２及びアクチビンを含む。デキサメタゾン、トロンビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とアンギオテンシンＩＩを含む多くの調整剤、及び高血糖と高血圧を含む環境刺激も、ＣＴＧＦの発現を誘導する。

ＴＧＦβのＣＴＧＦ発現への刺激は迅速且つ長期的で、ＴＧＦβを持続的に加える必要がない。ＴＧＦβは、ＣＴＧＦプロモーター中のＤＮＡ調節エレメントによる転写活性化により、ＣＴＧＦの発現を向上させる。糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、巣状分節性糸球体硬化症と糖尿病性腎症において、ＣＴＧＦの発現はアップレギュレートされる。慢性尿細管間質性（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）障害部位にも、ＣＴＧＦ発現細胞数の増加が見られ、且つＣＴＧＦレベルは障害程度に関わっている。また、腎実質の瘢痕化と硬化に関連する種々の腎症において、ＣＴＧＦは、糸球体と尿細管間質における発現も増える。ＣＴＧＦの上昇レベルは肝線維症、心筋梗塞と肺線維症にも関わっている。例えば、自発性肺線維症（ＩＰＦ）を患った患者において、生検と気管支肺胞洗浄液細胞において、ＣＴＧＦは強くアップレギュレートされる。従って、上記の疾患において、ＣＴＧＦは効果的な治療標的の一つである。

本開示は、抗ＣＴＧＦ抗体を含む医薬組成物を提供する。当該組成物は、安定性が良く、凍結乾燥形態が良いといった利点を有する。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｉ）上記重鎖可変領域は、配列が配列番号６で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、又は
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列が配列番号８で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、配列が配列番号９で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｉｉ－ｉ）上記重鎖可変領域は、配列が配列番号６９で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７０で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、又は
ｉｉ－ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列が配列番号８５で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７０で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１３、配列番号１４と配列番号１５で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、又は
ｉｖ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７と配列番号１８で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０と配列番号２１で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｉｖ－ｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号７１、配列番号７２と配列番号７３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号７４、配列番号７５と配列番号７６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、又は
ｉｖ－ｉｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１０２、配列番号１０３と配列番号１０４で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号７４、配列番号７５と配列番号７６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の抗ＣＴＧＦ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
（ｖ－１）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６、２７、２８又は２９と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７、２２、２３、２４、２５又は２６と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
（ｖｉ－１）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号８、３３、３４、３５又は３６と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号９、３０、３１又は３２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、或いは
（ｖｉ－ｉ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６９、８１、８２、８３、８４又は８５と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７０、７７、７８、７９又は８０と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
（ｖ）上記重鎖可変領域は、配列番号６、２７、２８又は２９で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号７、２２、２３、２４、２５又は２６で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、或いは
（ｖｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号８、３３、３４、３５又は３６で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号９、３０、３１又は３２で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、或いは
上記重鎖可変領域は、配列番号６で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号７で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、
上記重鎖可変領域は、配列番号２７、２８又は２９で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号２２、２３、２４、２５又は２６で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、
上記重鎖可変領域は、配列番号８で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号９で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、
上記重鎖可変領域は、配列番号３３、３４、３５又は３６で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３０、３１又は３２で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
（ｖｉ－ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号６９、８１、８２、８３、８４又は８５で示される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号７０、７７、７８、７９又は８０で示される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記の抗ＣＴＧＦ抗体において、上記抗ＣＴＧＦ抗体はヒト化抗体であり、上記ヒト化抗体はヒト抗体のフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域変異体を含み、上記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域においてそれぞれ多くとも１０個の復帰変異を有する。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
（ａ）上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１３、配列番号１４と配列番号１５で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含むと共に、４Ｌ、３６Ｆ、４３Ｓ、４５Ｋ、４７Ｗ、５８Ｖ又は７１Ｙから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、及び／又は、上記重鎖可変領域は、配列がそれぞれ配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含むと共に、２８Ｓ、３０Ｎ、４９Ａ、７５Ｅ、７６Ｓ、９３Ｖ、９４Ｅ又は１０４Ｄから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、或いは
（ｂ）上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０と配列番号２１で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含むと共に、３６Ｖ、４４Ｆ、４６Ｇ又は４９Ｇから選ばれる１つ又は複数の復帰変異を含み、及び／又は、上記重鎖可変領域は、配列がそれぞれ配列番号１６、配列番号１７と配列番号１８で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含むと共に、４４Ｇ、４９Ｇ、２７Ｆ、４８Ｌ、６７Ｌ、７１Ｋ、７８Ｖ又は８０Ｆの中の１つ又は複数の復帰変異を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
（ｂ－ｉ）軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号７４、配列番号７５と配列番号７６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、及び４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓ又は７０Ｙから選ばれる１つ又は複数の復帰変異を含み、且つ重鎖可変領域は、それぞれ配列番号７１、配列番号７２と配列番号７３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌ又は７２Ｆの中の１つ又は複数の復帰変異を含み、或いは
（ｂ－ｉｉ）軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号７４、配列番号７５と配列番号７６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含むと共に、４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓ又は７０Ｙから選ばれる１つ又は複数の復帰変異を含み、且つ重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１０２、配列番号１０３と配列番号１０４で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含むと共に、２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌ又は７２Ｆの中の１つ又は複数の復帰変異を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
（ｖｉｉ）上記重鎖可変領域配列は配列番号６で示され、且つ上記軽鎖可変領域配列は配列番号７で示され、
（ｖｉｉｉ）上記重鎖可変領域配列は配列番号２７、２８又は２９で示され、且つ上記軽鎖可変領域配列は配列番号２２、２３、２４、２５又は２６で示され、
（ｉｘ）上記重鎖可変領域配列は配列番号８で示され、且つ上記軽鎖可変領域配列は配列番号９で示され、或いは
（ｘ）上記重鎖可変領域配列は配列番号３３、３４、３５又は３６で示され、且つ上記軽鎖可変領域配列は配列番号３０、３１又は３２で示される。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
（ｘｉ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６９で示され、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７０で示され、或いは
（ｘｉｉ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号８１、８２、８３、８４又は８５で示され、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７７、７８、７９又は８０で示される。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、下記の表１、表２と表３に示されるような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
（ｘｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号２７で示され、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号２２で示され、
（ｘｉｖ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３４で示され、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３０で示され、或いは
（ｘｖ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号８５で示され、且つ上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７７で示される。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記の抗ＣＴＧＦ抗体において、上記抗体は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を更に含み、好ましくは、上記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、上記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、上記抗体は、配列が配列番号３７又は３８で示される重鎖定常領域と、配列が配列番号３９又は４０で示される軽鎖定常領域とを含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、
（ｃ）配列が配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７又は４８で示される重鎖と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する重鎖、及び配列が配列番号４２、４９、５０、５１、５２又は５３で示される軽鎖と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する軽鎖、
（ｄ）配列が配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２又は６３で示される重鎖と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する重鎖、及び配列が配列番号５５、６４、６５又は６６で示される軽鎖と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する軽鎖、
（ｅ）配列が配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７又は４８で示される重鎖、及び配列が配列番号４２、４９、５０、５１、５２又は５３で示される軽鎖、或いは
（ｆ）配列が配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２又は６３で示される重鎖、及び配列が配列番号５５、６４、６５又は６６で示される軽鎖、
を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、
（ｇ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６又は９７と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号８７、９８、９９、１００又は１０１と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、或いは
（ｈ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６又は９７で示される重鎖、及び配列番号８７、９８、９９、１００又は１０１で示される軽鎖、
を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体は、
（ｊ）配列番号４６で示される重鎖、及び配列番号４９で示される軽鎖、
（ｋ）配列番号６１で示される重鎖、及び配列番号６４で示される軽鎖、或いは
（Ｌ）配列番号９７で示される重鎖、及び配列番号９８で示される軽鎖、
を含む。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物には、更に緩衝剤が含まれる。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は、ヒスチジン塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、枸櫞酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤又はリン酸塩緩衝剤である。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は、ヒスチジン－塩酸塩緩衝剤又はヒスチジン－酢酸塩緩衝剤である。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤はヒスチジン－塩酸塩緩衝剤である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．５である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．０である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４又は約５．５である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．０～６．５である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．０～６．０である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．５～５．７である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４又は６．５であり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は約１００ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は、約１００ ｍｇ／ｍＬ、約１１０ ｍｇ／ｍＬ、約１２０ ｍｇ／ｍＬ、約１３０ ｍｇ／ｍＬ、約１４０ ｍｇ／ｍＬ、約１５０ ｍｇ／ｍＬ、約１６０ ｍｇ／ｍＬ、約１７０ ｍｇ／ｍＬ、約１８０ ｍｇ／ｍＬ、約１９０ ｍｇ／ｍＬ又は約２００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は１００ ｍｇ／ｍＬ～２００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は１５０ ｍｇ／ｍＬ～２００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は１００ ｍｇ／ｍＬ、１１０ ｍｇ／ｍＬ、１２０ ｍｇ／ｍＬ、１３０ ｍｇ／ｍＬ、１４０ ｍｇ／ｍＬ、１５０ ｍｇ／ｍＬ、１６０ ｍｇ／ｍＬ、１７０ ｍｇ／ｍＬ、１８０ ｍｇ／ｍＬ、１９０ ｍｇ／ｍＬ又は２００ ｍｇ／ｍＬであり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物は界面活性剤を更に含む。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサルコール、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノール－スルホベタイン、ステアリン－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノール－サルコシン、ステアリン－サルコシン、リノール－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルミタミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、メチルオレイルタウリンナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールの共重合体などから選ばれる。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は、ポリソルベート又はポロキサマーである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８である。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤はポリソルベート８０である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記界面活性剤の濃度は、約０．０５ ｍｇ／ｍＬ～約１．０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、約０．０５ ｍｇ／ｍＬ、約０．１ ｍｇ／ｍＬ、約０．２ ｍｇ／ｍＬ、約０．３ ｍｇ／ｍＬ、約０．４ ｍｇ／ｍＬ、約０．５ ｍｇ／ｍＬ、約０．６ ｍｇ／ｍＬ、約０．７ ｍｇ／ｍＬ、約０．８ ｍｇ／ｍＬ、約０．９ ｍｇ／ｍＬ又は約１．０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．０５ ｍｇ／ｍＬ～１．０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．２ ｍｇ／ｍＬ～０．６ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．０５ ｍｇ／ｍＬ、０．１ ｍｇ／ｍＬ、０．２ ｍｇ／ｍＬ、０．３ ｍｇ／ｍＬ、０．４ ｍｇ／ｍＬ、０．５ ｍｇ／ｍＬ、０．６ ｍｇ／ｍＬ、０．７ ｍｇ／ｍＬ、０．８ ｍｇ／ｍＬ、０．９ ｍｇ／ｍＬ又は１．０ ｍｇ／ｍＬであり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物は糖を更に含む。幾つかの実施形態において、上記糖は、通常の組成物（ＣＨ_２Ｏ）_ｎ及びその誘導体から選ばれ、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む。上記糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、ｓｙｌｉｔｏｌ、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソ－マルツロースなどから選ばれてもよい。幾つかの実施形態において、上記糖は、スクロース、マンニトール及びトレハロースから選ばれる１種又は複数種である。幾つかの実施形態において、上記糖はスクロースである。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記糖の濃度は、約２０ ｍｇ／ｍＬ～約１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、約６０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、約２０ ｍｇ／ｍＬ、約３０ ｍｇ／ｍＬ、約４０ ｍｇ／ｍＬ、約５０ ｍｇ／ｍＬ、約６０ ｍｇ／ｍＬ、約７０ ｍｇ／ｍＬ、約８０ ｍｇ／ｍＬ、約９０ ｍｇ／ｍＬ又は約１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、２０ ｍｇ／ｍＬ～１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、４０ ｍｇ／ｍＬ～８０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、６０ ｍｇ／ｍＬ～８０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記糖の濃度は、２０ ｍｇ／ｍＬ、３０ ｍｇ／ｍＬ、４０ ｍｇ／ｍＬ、５０ ｍｇ／ｍＬ、６０ ｍｇ／ｍＬ、７０ ｍｇ／ｍＬ、８０ ｍｇ／ｍＬ、９０ ｍｇ／ｍＬ又は１００ ｍｇ／ｍＬであり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記緩衝剤の濃度は、約５ ｍＭ～約１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は、約３０ ｍＭ～約７０ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は、約５ ｍＭ、約１０ ｍＭ、約２０ ｍＭ、約３０ ｍＭ、約４０ ｍＭ、約５０ ｍＭ、約６０ ｍＭ、約７０ ｍＭ、約８０ ｍＭ、約９０ ｍＭ又は約１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は、５ ｍＭ～１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は、３０ ｍＭ～７０ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は５ ｍＭ、１０ ｍＭ、２０ ｍＭ、３０ ｍＭ、４０ ｍＭ、５０ ｍＭ、６０ ｍＭ、７０ ｍＭ、８０ ｍＭ、９０ ｍＭ又は１００ ｍＭであり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物は、追加の安定剤を更に含む。幾つかの実施形態において、上記追加の安定剤は、任意選択的な塩、糖アルコール、界面活性剤、ポリエーテル類、アミノ酸やキレート剤などである。幾つかの実施形態において、上記追加の安定剤は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、アルギニンとＥＤＴＡから選ばれる。幾つかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧ ３３５０又はＰＥＧ ４０００である。幾つかの実施形態において、上記ＰＥＧの濃度は、１０ ｍｇ／ｍＬ～５０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記ＰＥＧの濃度は、１０ ｍｇ／ｍＬ、２０ ｍｇ／ｍＬ、３０ ｍｇ／ｍＬ、４０ ｍｇ／ｍＬ又は５０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記アルギニンの濃度は、１０ ｍＭ～１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記アルギニンの濃度は、１０ ｍＭ、２０ ｍＭ、３０ ｍＭ、４０ ｍＭ、５０ ｍＭ、６０ ｍＭ、７０ ｍＭ、８０ ｍＭ、９０ ｍＭ又は１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記ＥＤＴＡの濃度は、０．５ ｍＭ～１０ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記ＥＤＴＡの濃度は、０．５ ｍＭ、１ ｍＭ、２ ｍＭ、３ ｍＭ、４ ｍＭ、５ ｍＭ、６ ｍＭ、７ ｍＭ、８ ｍＭ、９ ｍＭ又は１０ ｍＭであり、或いはこれらの点値間の任意の範囲である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）約１００ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．０５ ｍｇ／ｍＬ～約１ ｍｇ／ｍＬの界面活性剤と、（ｃ）約２０ ｍｇ／ｍＬ～約１００ ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約５ ｍＭ ～約１００ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約３０ ｍＭ ～約７０ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．０である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．５～約５．７である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５～５．７である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭの酢酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．０～５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－酢酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのコハク酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのクエン酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５～６．５である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは、５．５、６．０又は６．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのリン酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは６．０～６．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは６．０である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．２ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、（ｅ）２％のＰＥＧ ３３５０と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、（ｅ）５０ ｍＭのアルギニンと、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、（ｅ）１％のマンニトールと、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、（ｅ）０．５ ｍＭ～１０ ｍＭのＥＤＴＡと、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。幾つかの実施形態において、上記ＥＤＴＡの濃度は、０．５ ｍＭ、５ ｍＭ、１０ ｍＭである。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物は、下記の成分、即ち、
（ａ）１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０ ｍｇ／ｍＬのトレハロースと、（ｄ）５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物であって、上記医薬組成物は液体製剤である。幾つかの実施形態において、上記液体製剤の溶媒は水である。

本開示は、再溶解した後に上記の何れか一項に記載の医薬組成物を形成することができることを特徴とする凍結乾燥製剤を更に提供する。

本開示は、凍結乾燥製剤を調製する方法であって、上記の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む方法を更に提供する。

本開示は、上記の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することで得られる凍結乾燥製剤を更に提供する。幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の凍結乾燥は、順に予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥のステップを含む。幾つかの実施形態において、当該凍結乾燥製剤は、４０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間又は少なくとも２８日間安定している。

本開示は、上記の何れか一項に記載の凍結乾燥製剤を再溶解して調製することで得られ、任意選択的に、上記の何れか一項に記載の凍結乾燥製剤を生理的に許容される溶媒において再溶解することで得られ、上記生理的に許容される溶媒は注射用水、生理食塩水、緩衝剤を含むが、これらに限定されない、ことを特徴とする再溶解溶液を更に提供する。

幾つかの実施形態において、上記の再溶解溶液は、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約３０ ｍＭ ～約７０ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．０である。

幾つかの実施形態において、上記の再溶解溶液は、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．５～約５．７である。

幾つかの実施形態において、上記の再溶解溶液は、
（ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨは約５．５である。

幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物又は再溶解溶液は、静脈注射製剤、皮下注射製剤、腹腔注射製剤又は筋肉注射製剤であり、幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物又は再溶解溶液は、静脈注射製剤である。幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物又は再溶解溶液は、静脈注射、皮下注射、腹腔注射又は筋肉注射に適用される。幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の医薬組成物又は再溶解溶液又は凍結乾燥製剤は、静脈注射、皮下注射、腹腔注射又は筋肉注射の薬剤の調製に用いられる。

本開示は、上記の何れか一項に記載の医薬組成物、上記の何れか一項に記載の凍結乾燥製剤又は上記の何れか一項に記載の再溶解溶液が入った容器を含む製品を更に提供する。

幾つかの実施形態において、本開示は、上記の何れか一項に記載の医薬組成物、上記の何れか一項の凍結乾燥製剤、上記の何れか一項の再溶解溶液又は上記の何れか一項に記載の製品の、ＣＴＧＦに関連する疾患を治療する薬剤の調製における用途を更に提供する。

本開示は、ＣＴＧＦに関連する疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の上記の何れか一項に記載の医薬組成物、上記の何れか一項の凍結乾燥製剤、上記の何れか一項の再溶解溶液又は上記の何れか一項に記載の製品を患者に投与することを含む方法を更に提供する。

幾つかの実施形態において、本開示は、ＣＴＧＦに関連する疾患の治療に用いられる、上記の何れか一項に記載の医薬組成物、上記の何れか一項の凍結乾燥製剤、上記の何れか一項の再溶解溶液、又は上記の何れか一項に記載の製品を更に提供する。

幾つかの実施形態において、上記ＣＴＧＦに関連する疾患は、線維性疾患、高血圧、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障又はがんである。幾つかの実施形態において、上記線維性疾患は、自発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、変形性関節症、強皮症、慢性心不全、肝硬変又は腎線維症から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記がんは、急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織増殖性がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、消化管がん又は肝がんから選ばれる。

ＥＬＩＳＡによる、ｍａｂ１６４由来のヒト化抗体のヒトＣＴＧＦとの親和性の検出である。 ｍａｂ１４７由来又はｍａｂ１６４由来のヒト化抗体によるＳＵ８６．８６マウス移植腫瘍への抑制実験の結果である。

用語
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本願で特に明確な定義のない限り、本願に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に一般的に理解されている意味を持っている。

本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。

結合組織成長因子（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）は、最初にヒト臍帯静脈内皮細胞から単離した３６ ｋＤのシステインに富んだヘパリン結合分泌糖タンパク質である。ＣＴＧＦはタンパク質ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ）ファミリー（分泌糖タンパク質）に属し、当該ファミリーは、血清誘導性の前初期遺伝子産物Ｃｙｒ６１、推測されるがん遺伝子Ｎｏｖ、ＥＣＭ関連タンパク質ＦＩＳＰ－１２、ｓｒｃ誘導性の遺伝子ＣＥＦ－１０、Ｗｎｔ誘導性の分泌タンパク質ＷＩＳＰ－３及びプロヒビチンＨＩＣＰ／ｒＣＯＰを含む。ＣＣＮタンパク質は、全アミノ酸含有量の１０％以上を占めると共に、Ｎ末端とＣ末端構造ドメインを有するモジュール構造（ｍｏｄｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する保存的な３８個のシステイン残基に特徴付けられる。ＣＴＧＦモジュール構造は、Ｎ末端構造ドメインにおけるインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦ－ＢＰ）とｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＣ）に対する保存モチーフ、及びＣ末端構造ドメインにおけるトロンボスポンジン（ＴＳＰ１）とシステイン結モチーフを含む。本開示のＣＴＧＦは、任意由来の野生型タンパク質又はその機能を残した変異体を含む。

本開示の「抗体」という用語は、所望の抗原結合活性が示されれば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体又はその抗原結合断片（「抗原結合部分」とも呼ばれる）、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体、親和性成熟した抗体を含むが、これらに限定されない。天然抗体とは、天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合で結合した２本の同じ軽鎖と２本の同じ重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの重鎖には、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）が１つあり、その次は３つに定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３）である。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの軽鎖には、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）が１つあり、その次は１つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインである。「全長抗体」、「完全抗体」と「全抗体」は、本願で互いに交換して使用されてもよく、天然抗体の構造とほぼ類似の構造を有し、又は本願に限定されるようなＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。幾つかの実施形態において、本開示の全長抗体は、表１、表２と表３中の軽重鎖可変領域の組み合わせにおける軽鎖可変領域と軽鎖定常領域が連結され、及び重鎖可変領域と重鎖定常領域が連結されてから形成される全長抗体を含む。当業者は、実際の必要に応じて、異なる抗体由来の軽鎖定常領域、重鎖定常領域、例えば、ヒト抗体由来の軽鎖定常領域と重鎖定常領域を選択することができる。

「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体重鎖又は軽鎖における抗体の抗原への結合に関わるドメインである。ＶＨ及びＶＬは、４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ含む。そのうち、「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」という用語は、可変構造ドメインにおける抗原結合を主に促進する領域を指し、「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基を除く可変構造ドメイン残基を指す。ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３という３つのＣＤＲ領域を含み、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３という３つのＣＤＲ領域を含む。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。単一のＶＨ又はＶＬは、抗原結合特異性を十分に付与することが可能である。

ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則、「ＡｂＭ」番号付け規則、「ｃｏｎｔａｃｔ」番号付け規則（Ｍａｒｔｉｎ、ＡＣＲ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］． ２００１を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５～７７（２００３）を参照）などを含む種々の公知の方案によって決定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けとＩＭＧＴ番号付けシステムなどを含む番号付けシステム間の関係は、当業者によく知られているもので、且つ下記の表４に示される通りである。

抗体の「種類」とは、その重鎖が持つ定常領域のタイプである。その定常領域アミノ酸配列によって、抗体軽鎖は、カッパ（κ）とラムダ（λ）という２種類を含む。抗体重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序によって、抗体を５種類に分け、又はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプと称してもよく、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いによって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４に分けられてもよい。５種類のＩｇのそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。本開示に記載されるヒト抗体重鎖定常領域及びヒト抗体軽鎖定常領域の「通常変異体」は、従来技術に開示された抗体可変領域の構造と機能を変更しないヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の変異体を指し、例示的な変異体は、重鎖定常領域に対して部位特異的改変とアミノ酸置換を行ったＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４重鎖定常領域変異体を含む。幾つかの実施形態において、上記置換は、ＹＴＥ変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、及び／又は杵臼（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）構造を得る変異である。これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更せずに、抗体に新たな性能を付与することが確認された。幾つかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ_１アイソタイプのものであり、エフェクター機能を低減するために、ヒンジ領域におけるＰ３２９、Ｐ２３４とＰ２３５変異を有する。幾つかの実施形態において、抗体はＩｇＧ_２アイソタイプである。幾つかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ_４アイソタイプのものであり、ＩｇＧ_４抗体の安定性を改善するために、ヒンジ領域におけるＳ２２８Ｐ変異を有する。

「抗体断片」は、完全抗体とは異なる分子を指し、完全抗体に結合する抗原と結合する、完全抗体の一部を含む。抗体断片の実例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体、二重抗体、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片からなる多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

「Ｆｃ領域」又は「断片結晶化可能領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するためであり、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位置でのアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシ末端へ延びると定義される。抗体重鎖のＦｃ領域の境界は変えてもよく、例えば、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）の欠失、又はＦｃ領域のＣ末端グリシンとリジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４６と４４７）の欠失である。従って、幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、あらゆるＫ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を除去した抗体群を含んでもよい。幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、Ｋ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を除去していない抗体群を含んでもよい。幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、Ｋ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を持つ、及び持たない抗体混合物の抗体群を有する。本願に記載される抗体に用いられる好適な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３とＩｇＧ４を含む。本願において特に規定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付け方は、ＥＵインデックスとも呼ばれ、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているＥＵ番号付けシステムに従う。

「マウス抗体」は、本開示においてこの分野での知識と技術により調製された、ヒトＣＴＧＦに対するマウス由来のモノクローナル抗体である。調製時にＣＴＧＦ抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を持つ抗体を発現したハイブリドーマを分離する。本開示の一好ましい実施形態において、上記マウス抗ＣＴＧＦ抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。

「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。キメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成し、そしてマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローンし、更に、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローンし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように接続した後、発現ベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。本開示の一好ましい実施形態において、上記キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含む。上記ＣＴＧＦキメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、及び／又は、Ｓ２２８Ｐ変異）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４変異体を使用する。

「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して発生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことにより誘導された異種反応性を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む共通ＤＮＡデータベース又は開示された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース、及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見出すことができる。免疫原性の低下と共に引き起こされる活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保ったり、向上させたりすることができる。本開示のヒト化抗体は、更に酵母菌で提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟変異を行ったヒト化抗体も含む。

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合リガンド（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の全強度である。特に明記のない限り、本願に使用されるように、「結合親和性」は、内部結合親和性を指し、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する。分子ＸによるそのリガンドＹへの親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）で示すことができる。親和性は、この分野における既知の通常の方法（本願に記載されるもの）により測定することができる。以下、結合親和性を測定するための具体的な説明的と例示的実施例を記載している。

「ｋａｓｓｏｃ」又は「ｋａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すが、本願に使用される「ｋｄｉｓ」又は「ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。本願に使用されるように、「ＫＤ」という用語は解離定数を指し、ｋｄとｋａの比率（即ち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、且つモル濃度（Ｍ）で示される。抗体のＫＤ値は、この分野における公知の方法により測定することができる。抗体ＫＤを測定するための方法は、バイオセンサシステムによる例えば表面プラズモン共鳴のシステム測定、又は溶液平衡滴定法（ＳＥＴ）による溶液中の親和性の測定を含む。

「親和性成熟した」抗体とは、抗体の１つ又は複数のＣＤＲに１箇所又は複数箇所の改変があることで、当該抗体の抗原に対する親和性がこのような改変のない親抗体と比べて改善された抗体である。好ましくは、幾つかの実施形態において、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルや更にピコモルオーダーの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、この分野における既知のプロシージャーにより生成することができる。

「アミノ酸変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入と修飾をカバーする。最終構築体が所望の特性を有すれば、置換、欠失、挿入と修飾の任意の組み合わせを行うことにより、最終構築体を実現することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ酸及び／又はカルボキシ末端の欠失及びアミノ酸の挿入を含む。具体的なアミノ酸変異は、アミノ酸置換であってもよい。一実施形態において、アミノ酸変異は、非保存的アミノ酸置換であり、即ち、１つのアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸又は２０種の天然アミノ酸の誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置換を含む。アミノ酸変異は、この分野で公知の遺伝学的又は化学的方法により生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでもよい。遺伝子工学以外のアミノ酸側鎖基を改変する方法、例えば、化学修飾も利用可能であろうと予測される。本願では、様々な名称で同一のアミノ酸変異を示すことが可能である。

「約」は、当業者により決定されるような特定値の許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、それは、部分的に、上記値が如何に計測又は測定されるかによって決定され、即ち、上記測定システムによって制限されている。特定の測定、結果又は実施形態の文脈において、実施例又は明細書の他の場所で特に明記のない限り、「約」は、所定値±５％以内の範囲を意味する。

「緩衝剤」は、その酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に耐える緩衝剤を指す。ｐＨを適当な範囲に制御する緩衝剤の例は、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、枸櫞酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グリシルグリシン及び他の有機酸緩衝剤を含む。

「ヒスチジン塩緩衝剤」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝剤である。ヒスチジン塩緩衝剤の実例は、ヒスチジン－塩酸塩、ヒスチジン－酢酸塩、ヒスチジン－リン酸塩、ヒスチジン－硫酸塩などの緩衝剤を含み、好ましくはヒスチジン－塩酸塩緩衝剤又はヒスチジン－酢酸塩緩衝剤であり、ヒスチジン－酢酸塩緩衝剤は、ヒスチジンと酢酸により調製されたもので、ヒスチジン－塩酸塩緩衝剤は、ヒスチジンとヒスチジン塩酸塩により調製されたもの、又はヒスチジンと塩酸により調製されたものである。

「枸櫞酸塩緩衝剤」は、枸櫞酸イオンを含む緩衝剤である。枸櫞酸塩緩衝剤の実例は、枸櫞酸－枸櫞酸ナトリウム、枸櫞酸－枸櫞酸カリウム、枸櫞酸－枸櫞酸カルシウム、枸櫞酸－枸櫞酸マグネシウムなどを含む。好ましい枸櫞酸塩緩衝剤は、枸櫞酸－枸櫞酸ナトリウムである。

「コハク酸塩緩衝剤」は、コハク酸イオンを含む緩衝剤である。コハク酸塩緩衝剤の実例は、コハク酸－コハク酸ナトリウム、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウム塩などを含む。好ましいコハク酸塩緩衝剤は、コハク酸－コハク酸ナトリウムである。例示的に、上記コハク酸－コハク酸ナトリウムは、コハク酸と水酸化ナトリウムにより調製され、又はコハク酸とコハク酸ナトリウムにより調製されてもよい。

「リン酸塩緩衝剤」は、リン酸イオンを含む緩衝剤である。リン酸塩緩衝剤の実例は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム－枸櫞酸などを含む。好ましいリン酸塩緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。

「酢酸塩緩衝剤」は、酢酸イオンを含む緩衝剤である。酢酸塩緩衝剤の実例は、酢酸－酢酸ナトリウム、酢酸ヒスチジン塩、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。好ましい酢酸塩緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウムである。

「安定剤」とは、特に凍結及び／又は凍結乾燥及び／又は貯蔵期間（特にストレス（ｓｔｒｅｓｓ）に晒される時）に、バイオ医薬品の構造的完全性の保持に寄与する成分である。このような安定作用は様々な原因で発生可能であり、一般的に、このような安定剤は、タンパク質変性を低減する浸透剤として機能することができる。本願において追加の安定剤は、緩衝系、界面活性剤と糖アルコール以外の安定剤を指し、例えば、ＰＥＧ、アルギニンとＥＤＴＡから選ばれる安定剤である。

「医薬組成物」は、１種又は複数種の本願に記載の抗体と他の化学成分とを含む混合物を示し、上記他の成分は、例えば、生理学的／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤である。医薬組成物は、活性成分の安定性を保持し、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮するためのものである。

本開示において、「医薬組成物」と「製剤」は相互に排他的ではない。

本開示に記載される医薬組成物の溶液形態は、特に説明のない限り、その中の溶媒は何れも水である。

「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液形態の医薬組成物又は液体若しくは溶液製剤に対して真空凍結乾燥工程を行った後に得られた製剤又は医薬組成物を示す。

本開示は、含有量範囲又は含有量値を提供しているが、上記含有量範囲又は含有量値は、測定される具体値の許容可能な誤差範囲をカバーしていることが当業者に理解される。

本開示に記載される医薬組成物は、安定的な効果を達成することができ、即ち、その中の抗体が貯蔵後に基本的にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を保持している医薬組成物であり、好ましくは、医薬組成物は貯蔵後に、基本的にその物理的・化学的安定性及びその生物学的活性を保持している。貯蔵期間は、一般的に医薬組成物の所定の保存期間によって選択される。現在、タンパク質の安定性を測定する分析技術は複数種あり、所定温度で、所定期間貯蔵した後の安定性を測定することができる。

安定した製剤は、冷蔵温度（２℃～８℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１年間、そして更に好ましくは２年間も保存した場合に、顕著な変化が認められない製剤である。また、安定した液体製剤は、２５℃を含む温度で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月を含む期間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤を含む。安定性の典型的な例としては、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集又は分解を発生した抗体モノマーが通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えないことが測定される。視覚的分析によると、製剤は、淡黄色でほぼ無色透明な液体又は無色透明な液体であり、又は清澄からやや乳白色である。上記製剤の濃度、ｐＨ及び重量モル浸透圧濃度は、変化が±１０％を超えない。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない減少が見られる。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない凝集が形成される。

色及び／又は透明度を目視で検査したところ、又はＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）により測定したところ、抗体が顕著な凝集の増加、沈殿及び／又は変性を示さない場合、上記抗体は、薬物製剤において「その物理的安定性を保持している」とする。タンパク質の配座の変化は、蛍光分光法（タンパク質の三次構造を確定するもの）により、及びＦＴＩＲ分光法（タンパク質の二次構造を確定するもの）により評価することができる。

抗体が顕著な化学的変化を示さない場合、上記抗体は、薬物製剤において「その化学的安定性を保持している」とする。化学的に形態が変化されたタンパク質を検出・定量することにより、化学的安定性を評価することができる。タンパク質の化学構造を常に変化させる分解過程は、加水分解又は切断（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーやＣＥ－ＳＤＳなどの方法で評価される）、酸化（例えば、質量分析法又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと結合するペプチドマッピング法などの方法で評価される）、脱アミド作用（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング法、イソアスパラギン酸の測定などの方法で評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含有量の測定、ペプチドマッピング法などで評価される）を含む。

所定の期間における抗体の生物活性が薬物製剤の調製時に示された生物活性の所定範囲にあると、上記抗体は、薬物製剤において「その生物活性を保持している」とする。

「投与」、「与える」及び「処理」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「投与」、「与える」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、ここで、上記流体は細胞と接触する。「投与」、「与える」及び「処理」はまた、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。

「治療」は、例えば、本開示の何れか１つの医薬組成物を含む、内用又は外用治療剤を患者に与えることを意味し、上記患者は、１種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。通常、治療される患者又は集団には、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を抑制する。何れかの具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者において必要な治療効果を発生させる能力など、種々の要因によって変化することができる。当該症状の重症度や進行状況の評価に医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各標的疾患症状の緩和において無効である可能性があるが、この分野で既知の任意の統計学的検定方法、例えばＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を低減するはずであることが確認された。

本開示において、ＣＴＧＦに関連する疾患は制限がなく、ＣＴＧＦに関連する疾患であればよく、例えば、本開示の分子により誘導される治療反応は、ヒトＣＴＧＦに結合し、そしてＣＴＧＦとその受容体／リガンドとの結合を阻害し、又はＣＴＧＦを過剰発現した腫瘍細胞を殺傷することにより実現することができる。従って、治療的応用に適する調製物及び製剤にある場合、本開示の分子は、肺線維症、腎線維症、腫瘍の形成と成長、緑内障、細胞増殖性疾患、白内障、脈絡膜血管新生、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、角膜瘢痕化と角膜混濁、嚢腫、低下した血管石灰化、膵管腺がん、膵臓がん、黒色腫、放射線誘発線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＲＩＦ））、特発性肺線維症、集団構成である喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺気腫などから選ばれる肺リモデリング疾患を選択的に含み、好ましくは膵臓がん、肺線維症、腎線維症である、腫瘍又はがんに罹患したヒトに非常に有用である。

上記の明細書には、本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本願の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記のない限り、単数形は複数の指示対象のことを含む。特に定義のない限り、本願に用いられる技術・科学用語の全ては、当業者により理解されている一般的な意味を持っている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと理解すべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。

実施例
以下、実施例と合わせて本開示を更に説明するが、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、冷泉港実験室に出版された『抗体技術実験マニュアル』、『分子クローンマニュアル』のような通常の条件に従い、或いは原料又は商品メーカーにより勧められた条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
一、抗体

実施例 １－１． ＣＴＧＦ抗原、抗体の調製
一、抗原の設計及び発現
ヒトＣＴＧＦタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１９０１．２）をテンプレートとして、抗原及び検出用タンパク質のアミノ酸配列を設計し、選択的にＣＴＧＦタンパク質又は断片に異なるタグを融合し、それぞれｐＴＴ５ベクター又はｐＸＣベクターにクローニングし、２９３細胞において一過性トランスフェクションして発現し、又はＬＯＮＺＡ ＣＨＯ細胞において安定的に発現し、本開示の抗原及び検出用タンパク質をコードすることができた。以下、ＣＴＧＦ抗原は、特に説明のない限り、ヒトＣＴＧＦを指す。
ヒトＣＴＧＦ全長タンパク質（免疫用）、配列番号１）
ＣＴＧＦ－ｈｉｓ（ヒトＣＴＧＦ成熟タンパク質とｈｉｓタグの融合タンパク質）、検出に利用可能、配列番号２
ｍＣＴＧＦ－ｍＦｃ（マウスＣＴＧＦコード領域とマウスＦｃタグの融合タンパク質）、検出に利用可能、配列番号３
マウス ＣＴＧＦタンパク質－Ｈｉｓタグ、配列番号４
カニクイザルＣＴＧＦ－Ｆｃ（カニクイザルＣＴＧＦコード領域とＦｃの融合タンパク質）、検出に利用可能、配列番号５

二、ＣＴＧＦ関連組換えタンパク質の精製、及び抗ヒトＣＴＧＦハイブリドーマ抗体、組換え抗体の精製
１． ＰｒｏｔｅｉｎＧ 親和性クロマトグラフィーによるハイブリドーマ上清の分離・精製
マウスハイブリドーマ上清の精製には、最初にＰｒｏｔｅｉｎＧを選んで親和性クロマトグラフィーを行い、培養して得られたハイブリドーマを遠心分離して上清を取り、上清の体積によって１０％～１５％の体積のＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～８．５）１ Ｍを加えて上清のｐＨを中性に調整した。６ Ｍの塩酸グアニジンにより、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを３倍～５倍のカラム体積で洗浄してから、純水により３倍～５倍のカラム体積で洗浄し、例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）によりクロマトグラフィーカラムを３倍～５倍のカラム体積で平衡し、細胞上清を低流速でカラムにかけて結合し、保持時間が約１ ｍｉｎ又はそれ以上になるように流速を制御し、紫外線吸収が基線に反落されるように、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でクロマトグラフィーカラムに対して３倍～５倍のカラム体積で洗浄し、０．１ Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液により試料を溶離し、紫外線検出により溶離ピークを収集し、溶離生成物は、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶離生成物のｐＨを５～６に速く調整した。当業者によく知られている方法により、溶離生成物に対して溶液を置換することができ、例えば、限外ろ過管により限外ろ過して濃縮し、且つ溶液を所望の緩衝系に置換し、又はＧ－２５脱塩などのサイズ排除により所望の緩衝系に置換し、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００などの高分解能サイズ排除カラムにより溶離生成物における量体成分を除去することで試料の純度を向上させた。

２．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性クロマトグラフィーによる抗体の精製：
まず、抗体を発現した細胞培養上清を高速に遠心分離して上清を収集した。６ Ｍの塩酸グアニジンにより、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラムを３倍～５倍のカラム体積で洗浄してから、純水により３倍～５倍のカラム体積で洗浄した。例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）によりクロマトグラフィーカラムを３倍～５倍のカラム体積で平衡した。細胞上清を低流速でカラムにかけて結合し、保持時間が約１ ｍｉｎ又はそれ以上になるように流速を制御し、結合完了後に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により、紫外線吸収が基線に反落されるように、クロマトグラフィーカラムを３倍～５倍のカラム体積で洗浄した。０．１ Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）緩衝液により試料を溶離し、紫外線検出により溶離ピークを収集し、溶離生成物は、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶離生成物のｐＨを５～６に速く調整した。当業者によく知られている方法により、溶離生成物に対して溶液を置換することができ、例えば、限外ろ過管により限外ろ過して濃縮し、且つ溶液を所望の緩衝系に置換し、又はＧ－２５脱塩などのサイズ排除により所望の緩衝系に置換し、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００などの高分解能サイズ排除カラムにより溶離生成物における量体成分を除去することで試料の純度を向上させた。

３． ニッケルカラムによるヒトＣＴＧＦ－ｈｉｓなどのＣＴＧＦ関連組換えタンパク質の精製
細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去し、且つ緩衝液をＰＢＳに置き換え、最終濃度が５ ｍＭになるようにイミダゾールを入れた。５ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液によりニッケルカラムを平衡し、２～５倍のカラム体積で洗浄した。置き換えた上清試料をカラムにかけて結合し、媒介としては、異なる会社のニッケルカラムを選択してもよい。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、５ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液によりカラムを洗浄した。その後、ＰＢＳ＋１０ ｍＭのイミダゾールによりクロマトグラフィーカラムを洗浄し、非特異的結合のヘテロタンパク質を除去し、流出液を収集した。更に３００ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液により標的タンパク質を溶離し、溶離ピークを収集した。

収集された溶離生成物を濃縮した後、ゲルクロマトグラフＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）で更に精製し、移動相がＰＢＳとされ、量体及びヘテロタンパク質ピークを除去し、標的生成物の溶離ピークを収集した。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマッピング、ＬＣ－ＭＳにより正確であると同定してから、分注して使用に備えた。

４． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性クロマトグラフィーによるヒトＣＴＧＦ－Ｆｃ、カニクイザルＣＴＧＦ－ＦｃなどのＣＴＧＦ関連組換えタンパク質の精製
まず、培養上清を高速に遠心分離して上清を収集した。６ Ｍの塩酸グアニジンにより、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラムを３倍～５倍のカラム体積で洗浄してから、純水により３倍～５倍のカラム体積で洗浄した。例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）によりクロマトグラフィーカラムを３倍～５倍のカラム体積で平衡した。細胞上清を低流速でカラムにかけて結合し、保持時間が約１ ｍｉｎ又はそれ以上になるように流速を制御し、結合完了後に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により、紫外線吸収が基線に反落されるように、クロマトグラフィーカラムを３倍～５倍のカラム体積で洗浄した。０．１ Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）緩衝液により試料を溶離し、紫外線検出により溶離ピークを収集した。

収集された溶離生成物を濃縮した後、ゲルクロマトグラフＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）で更に精製し、移動相がＰＢＳとされ、量体及びヘテロタンパク質ピークを除去し、標的生成物の溶離ピークを収集した。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマッピング、ＬＣ－ＭＳにより正確であると同定してから、分注して使用に備えた。

実施例１－２：抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体の調製
一、免疫
抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体は、免疫マウスにより産生された。実験用ＳＪＬ白いマウスは、雌で、６週齢～８週齢（北京維通利華実験動物技術有限公司、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１）である。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度が２０℃～２５℃、湿度が４０％～６０％である実験室環境で１週間飼育した。環境に馴れたマウスは、以下の計画で免疫された。免疫抗原は、ＣＴＧＦ（Ｒ＆Ｄ）及びｍＣＴＧＦ－ｍＦｃである。

免疫計画：ＣＴＧＦタンパク質をマウスに免疫し、２５ μｇ／匹／回で、腹腔内注射した。０日目に１００ μＬ／匹で腹膜内（ＩＰ）に注射し、その後１４日間ごとに１回追加免疫した。２１、３５、４９、６３日目に採血し、ＥＬＩＳＡ方法でマウス血清中の抗体価を決定した。７回～９回免疫した後、血清中の抗体価が高くて安定する傾向があるマウスを選択して脾細胞の融合を行った。脾細胞融合の３日前に追加免疫を行い、生理食塩水で調製したＣＴＧＦタンパク質抗原溶液を２５ μｇ／匹で腹膜内（ＩＰ）に注射した。

二、脾細胞の融合
ＰＥＧ媒介性の融合ステップにより、脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－８２８７（商標））を融合してハイブリドーマ細胞を得た。融合したハイブリドーマ細胞は、０．５×１０^６／ｍＬ～１×１０^６／ｍＬの密度で、完全培地（２０％のＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）で再懸濁し、１００ μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ_２で３日間～４日間インキュベートした後、ＨＡＴ完全培地を１００ μＬ／ウェルで補充し、針先のようなクローンが形成されるまで３日間～４日間培養し続けた。上清を除去し、２００ μＬ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％のＦＢＳ、１×ＨＴ及び１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％のＣＯ_２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出を行った。

三、ハイブリドーマ細胞の選別
ハイブリドーマ細胞の成長密度によって、結合ＥＬＩＳＡ方法で、ハイブリドーマ培養上清の検出を行った。そして、結合ＥＬＩＳＡで検出した陽性ウェル細胞上清をサルＣＴＧＦ／マウスＣＴＧＦ／ヒトＣＴＧＦタンパク質と合わせて実験を行った（具体的な方法は実施例３と同様）。タンパク質ＥＬＩＳＡ結合実験で陽性とされたウェル細胞を適時に増幅して種として凍結保存し、且つ単細胞クローンが得られるまで２回～３回サブクローニングした。

細胞をサブクローニングするたびに、ＣＴＧＦ結合ＥＬＩＳＡを行う必要もある。以上の実験により選別してハイブリドーマクローナルを得て、無血清細胞培養法で抗体を更に調製し、精製実例に従って抗体を精製し、検出例での使用に備えた。

四、ハイブリドーマ陽性クローンの配列決定
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ． １５５９６－０１８）で試薬キットの取扱説明書の手順に従ってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ試薬キットで逆転写した（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ Ｎｏ． ２６８０Ａ）。逆転写で得られたｃＤＮＡを、ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）でＰＣＲ増幅した後、増幅生成物をシークエンシング社に送ってシークエンシングした。シークエンシングにより、マウス抗ＣＴＧＦ抗体：ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４、ｍａｂ９５の可変領域アミノ酸配列を次のように得た。

ｍａｂ１４７ ＶＨアミノ酸配列は配列番号６で示され、
ｍａｂ１４７ ＶＬアミノ酸配列は配列番号７で示され、
ｍａｂ１６４ ＶＨアミノ酸配列は配列番号８で示され、
ｍａｂ１６４ ＶＬアミノ酸配列は配列番号９で示され、
ｍａｂ９５ ＶＨアミノ酸配列は配列番号６９で示され、
ｍａｂ９５ ＶＬアミノ酸配列は配列番号７０で示され、
上記ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４、ｍａｂ９５抗体可変領域配列において、イタリック体はＦＲ配列、下線イタリック体はＣＤＲ配列であり、配列順番は、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

五、ヒトＩｇＧ１キメラ抗体の調製
ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４、ｍａｂ９５候補分子を増幅してシークエンシングすることで、可変領域コード遺伝子配列が得られ、シークエンシングにより得られた配列をもって両端部のプライマーを設計し、シークエンシング遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲにより各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を組み立て、更に発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及びｈＩｇＧ１／ｈｋａｐｐａ／ｈｌａｍｂｄａ定常領域付きの遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）断片）と相同組換えを行い、組換えキメラ抗体の全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築し、Ｃｈ１４７、Ｃｈ１６４、Ｃｈ９５という３つのキメラ抗体を形成した。

六、マウス抗ヒトＣＴＧＦ抗体のヒト化
ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重・軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子のデータベースとＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、分子操作環境）ソフトウェアをアラインメントすることにより、テンプレートとしてマウス抗体と相同性の高い重鎖と軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をそれぞれ選択し、マウス抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒトテンプレートに移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という順の可変領域配列を形成した。

１． ｍａｂ１４７のヒト化改変
マウス抗体ｍａｂ１４７は、ヒト化軽鎖テンプレートがＩＧＫＶ３－１１＊０１とＩＧＫＪ２＊０１又はＩＧＫＶ１－３９＊０１とＩＧＫＪ２＊０１で、ヒト化重鎖テンプレートがＩＧＨＶ３－７２＊０１とＩＧＨＪ１＊０１であり、マウス抗体ｍａｂ１４７のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、更に、ヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、その中で、軽鎖可変領域復帰変異は、４Ｌ、３６Ｆ、４３Ｓ、４５Ｋ、４７Ｗ、５８Ｖ又は７１Ｙのうちの１つ又はそれ以上を含み、重鎖可変領域復帰変異は、２８Ｓ、３０Ｎ、４９Ａ、７５Ｅ、７６Ｓ、９３Ｖ、９４Ｅ又は１０４Ｄのうちの１つ又はそれ以上を含み（軽鎖可変領域と重鎖可変領域における復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）、異なる配列を有する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を得た。即ち、ｍａｂ１４７のＣＤＲを含むヒト化抗体が得られ、その可変領域配列は以下の通りである。

ｍＡｂ１４７ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は、以下の通りである。
Ｈｕ１４７－ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号２２で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＬ２アミノ酸配列は配列番号２３で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＬ３アミノ酸配列は配列番号２４で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＬ４アミノ酸配列は配列番号２５で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＬ５アミノ酸配列は配列番号２６で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＨ１アミノ酸配列は配列番号２７で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号２８で示される：
Ｈｕ１４７－ＶＨ３アミノ酸配列は配列番号２９で示される：
注記：下線部はＫａｂａｔ規則によって定義されたＣＤＲ配列であり、順番は、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

２． ｍａｂ１６４のヒト化改変
マウス抗体ｍａｂ１６４は、ヒト化軽鎖テンプレートがそれぞれＩＧＬＶ７－４３＊０１とＩＧＬＪ２＊０１、ＩＧＬＶ８－６１＊０１とＩＧＬＪ２＊０１、又はＩＧＬＶ１－４０＊０２とＩＧＬＪ２＊０１からなり、ヒト化重鎖テンプレートがそれぞれＩＧＨＶ２－２６＊０１とＩＧＨＪ６＊０１、又はＩＧＨＶ４－３１＊０２とＩＧＨＪ６＊０１からなり、マウス抗体ｍａｂ１６４のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、更に、ヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、その中で、軽鎖可変領域復帰変異は、３６Ｖ、４４Ｆ、４６Ｇ又は４９Ｇのうちの１つ又はそれ以上を含み、重鎖可変領域復帰変異は、４４Ｇ、４９Ｇ、２７Ｆ、４８Ｌ、６７Ｌ、７１Ｋ、７８Ｖ又は８０Ｆのうちの１つ又はそれ以上を含み（その中の復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）、これで、ｍａｂ１６４のヒト化抗体重鎖、ヒト化抗体軽鎖が得られ、その可変領域配列は以下の通りである。

ｍＡｂ１６４ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は、以下の通りである。
Ｈｕ１６４－ＶＬ７アミノ酸配列は配列番号３０で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＬ８アミノ酸配列は配列番号３１で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＬ９アミノ酸配列は配列番号３２で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＨ５アミノ酸配列は配列番号３３で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＨ６アミノ酸配列は配列番号３４で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＨ７アミノ酸配列は配列番号３５で示される：
Ｈｕ１６４－ＶＨ８アミノ酸配列は配列番号３６で示される：
注記：上記Ｈｕ１６４抗体配列において、下線部はＫａｂａｔ規則によって定義されたＣＤＲ配列であり、順番は、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

３． ｍａｂ９５のヒト化改変
マウス抗体ｍａｂ９５は、ヒト化軽鎖テンプレートがＩＧＫＶ３－２０＊０２とＩＧＫＶ１－４０＊０１で、ヒト化重鎖テンプレートがＩＧＨＶ１－３＊０１であり、マウス抗体ｍａｂ９５のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、更に、ヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、その中で、軽鎖可変領域復帰変異は、４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓ又は７０Ｙのうちの１つ又はそれ以上を含み、重鎖可変領域復帰変異は、２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌ又は７２Ｆのうちの１つ又はそれ以上を含み（軽鎖可変領域と重鎖可変領域における復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）、異なる配列を有する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を得た。即ち、ｍａｂ９５のＣＤＲを含むヒト化抗体が得られ、その可変領域配列は、以下の通りである。

ｍＡｂ９５ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は、以下の通りである。
Ｈｕ９５－ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号７７で示される：
Ｈｕ９５－ＶＬ２アミノ酸配列は配列番号７８で示される：
Ｈｕ９５－ＶＬ３アミノ酸配列は配列番号７９で示される：
Ｈｕ９５－ＶＬ４アミノ酸配列は配列番号８０で示される：
Ｈｕ９５－ＶＨ１アミノ酸配列は配列番号８１で示される：
Ｈｕ９５－ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号８２で示される：
Ｈｕ９５－ＶＨ３アミノ酸配列は配列番号８３で示される：
Ｈｕ９５－ＶＨ４アミノ酸配列は配列番号８４で示される：
Ｈｕ９５－ＶＨ５アミノ酸配列は配列番号８５で示される：
注記：下線部はＫａｂａｔ規則によって定義されたＣＤＲ配列であり、順番は、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

ここで、Ｈｕ９５－ＶＨ５のＣＤＲ領域は更に修飾されており、そのＨＣＤＲ１は配列番号１０２（ＮＹＡＩＨ）で示され、ＨＣＤＲ２は配列番号１０３（ＬＶＹＰＹＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＤ）で示され、ＨＣＤＲ３は配列番号１０４（ＷＧＭＩＰＧＴＮＳＹＦＤＶ）で示される。

４． 抗ＣＴＧＦヒト化全長抗体の構築と発現
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＬ遺伝子断片を組立て、更に発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域付きの遺伝子（ＣＨ／ＣＬ）断片）と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＣＨ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。上記ヒト化抗体の定常領域は、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域から選ばれ、且つＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３やＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域から選ばれてもよく、非限定的な実施は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４の定常領域に対して最適化設計を行い、抗体機能を改善することを含み、例えば、定常領域のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）部位変異が抗体の半減期を延長することができ、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのような他の定常領域部位の変異などである。

例示的な抗ＣＴＧＦヒト化抗体定常領域配列は、以下の通りである。

重鎖定常領域アミノ酸配列は、配列番号３７で示される（形成された全長抗体重鎖の名前の接尾語がｗである）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＹＴＥ改変抗体の重鎖定常領域アミノ酸配列は、配列番号３８で示される（形成された全長抗体重鎖の名前の接尾語がｙである）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
抗ＣＴＧＦヒト化抗体の軽鎖ｋａｐｐａ定常領域アミノ酸配列は、配列番号３９で示される（形成された全長抗体重鎖の名前の接尾語がｋである）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗ＣＴＧＦヒト化抗体の軽鎖ｌａｍｂｄａ定常領域アミノ酸配列は、配列番号４０で示される（形成された全長抗体重鎖の名前の接尾語がｌである）：
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣ
ヒト化抗体の重鎖可変領域と配列番号３７で示される重鎖定常領域を連結し、且つヒト化抗体の軽鎖可変領域と配列番号３９で示される軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を連結して形成したｍａｂ１４７由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

ヒト化抗体重鎖の可変領域と配列番号３８で示される重鎖定常領域ＹＴＥ変異体を連結し、且つヒト化抗体の軽鎖可変領域と配列番号３９で示される軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を連結して形成したｍａｂ１４７由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

ヒト化抗体重鎖可変領域と配列番号３７で示される重鎖定常領域を連結し、且つヒト化抗体軽鎖可変領域と配列番号４０で示される軽鎖ｌａｍｂｄａ定常領域を連結して形成したｍａｂ１６４由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

ヒト化抗体重鎖可変領域と配列番号３８で示される重鎖定常領域ＹＴＥ変異体を連結し、及びヒト化抗体軽鎖可変領域と配列番号４０で示される軽鎖ｌａｍｂｄａ定常領域を連結して形成したｍａｂ１６４由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

ヒト化抗体重鎖可変領域と配列番号３７で示される重鎖定常領域を連結し、且つヒト化抗体軽鎖可変領域と配列番号３９で示される軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を連結して形成したｍａｂ９５由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

ヒト化抗体重鎖可変領域と配列番号３８で示される重鎖定常領域ＹＴＥ変異体を連結し、且つヒト化抗体軽鎖可変領域と配列番号３９で示される軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を連結して形成したｍａｂ９５由来の全長ヒト化抗体は、以下を含む。

例示的な抗ＣＴＧＦ抗体全長アミノ酸配列は、以下の通りである。

陽性対照となるＣＴＧＦ抗体ｍＡｂ１（ＣＮ１８２９７４０Ｂに由来し、抗体名がｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂで、またＦＧ－３０１９とも呼ばれる）の配列は、以下の通りである。

重鎖：（配列番号６７） ＥＧＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＧＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＧＴＧＧＧＴＹＳＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＭＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＹＧＳＧＳＦＦＤＣＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
軽鎖：（配列番号６８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

実施例１－３． ＣＴＧＦ抗体の結合活性検出
一、ＣＴＧＦ抗体のヒトＣＴＧＦタンパク質との結合のＥＬＩＳＡ実験
抗ヒトＣＴＧＦ抗体の結合力は、抗体とヒトＣＴＧＦタンパク質のＥＬＩＳＡ実験及びＢｉａｃｏｒｅにより検出された。ＣＴＧＦ組換えタンパク質をそのまま９６ウェルマイクロプレートで被覆し、抗体を加えた後、シグナルの強さは、抗体のＣＴＧＦとの結合活性を判断するために用いられた。具体的な実験方法は以下の通りである。

ｐＨ７．４のＰＢＳ（上海源培、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｂ３２０）緩衝液でＣＴＧＦタンパク質（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ Ｎｏ． ９１９０－ＣＣ）を０．２ μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、５０ μＬ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に加え、３７℃のインキュベータに２時間置き、又は４℃で一晩（１６時間～１８時間）置いた。液体を捨ててから、ＰＢＳで希釈された５％脱脂乳（ＢＤ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｃａｔ Ｎｏ．２３２１００）ブロッキング液を２５０ μＬ／ウェルで加え、３７℃のインキュベータで３時間インキュベートし、又は４℃で一晩（１６時間～１８時間）置いてブロッキングした。ブロッキングが終了した後、ブロッキング液を捨て、且つＰＢＳＴ緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）でプレートを５回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈された異なる濃度の検出待ち抗体（ハイブリドーマ精製抗体又はヒト化抗体）を加え、３７℃のインキュベータに入れて１時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈されたＨＲＰで標識したヒツジ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １１５－０３５－００３）又はヒツジ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルでＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、Ｃａｔ Ｎｏ． ５２－００－０３）を加え、室温で５ ｍｉｎ～１０ ｍｉｎインキュベートし、５０ μＬ／ウェルで１ ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を中止し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＶＥＲＳＡ ｍａｘ）により波長４５０ ｎｍで吸収値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によりデータを分析し、ＣＴＧＦ抗体のヒトＣＴＧＦタンパク質に対する結合ＥＣ５０値を算出した。実験の結果は、図１及び表１３に示されている。

実験の結果によると、本開示のヒト化全長抗ＣＴＧＦ抗体は、何れもヒトＣＴＧＦタンパク質に対して優れた結合作用を有する。

二、ＣＴＧＦ抗体のカニクイザルＣＴＧＦタンパク質との結合のＥＬＩＳＡ実験
抗サルＣＴＧＦ抗体の結合力は、抗体とサルＣＴＧＦタンパク質のＥＬＩＳＡ実験により検出された。抗－ｍＦｃタンパク質をそのまま９６ウェルマイクロプレートで被覆し、その後、Ｆｃタグ付きのｃｙｎｏ－ＣＴＧＦタンパク質をプレートに結合してから、抗体を加え、加入後のシグナルの強さは、抗体のｃｙｎｏ－ＣＴＧＦとの結合活性を判断するために用いられた。具体的な実験方法は以下の通りである。

ｐＨ７．４のＰＢＳ（上海源培、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｂ３２０）緩衝液で抗－ｍＦｃタンパク質（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｍ４２８０）を２ μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、５０ μＬ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ Ｎｏ． ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に加え、３７℃のインキュベータに２時間置いた。液体を捨ててから、ＰＢＳで希釈された５％脱脂乳（ＢＤ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｃａｔ Ｎｏ．２３２１００）ブロッキング液を２５０ μＬ／ウェルで加え、３７℃のインキュベータで３時間インキュベートし、又は４℃で一晩（１６時間～１８時間）置いてブロッキングした。ブロッキングが終了した後、ブロッキング液を捨て、且つＰＢＳＴ緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）でプレートを３回洗浄した後、各ウェルに１ μｇ／ｍＬのｃｙｎｏ－ＣＴＧＦ－ｍＦｃタンパク質５０ μＬを加え、３７℃のインキュベータで１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴ緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）でプレートを３回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈された異なる濃度の検出待ち抗体（ハイブリドーマ精製抗体又はヒト化抗体）を加え、３７℃のインキュベータに入れて１時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈されたＨＲＰで標識したヒツジ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １１５－０３５－００３）又はヒツジ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルでＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、Ｃａｔ Ｎｏ． ５２－００－０３）を加え、室温で５ ｍｉｎ～１０ ｍｉｎインキュベートし、５０ μＬ／ウェルで１ ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を中止し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＶＥＲＳＡ ｍａｘ）により波長４５０ ｎｍで吸収値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によりデータを分析し、ＣＴＧＦ抗体のカニクイザルＣＴＧＦタンパク質に対する結合ＥＣ５０値を算出した。実験の結果は、表１４に示されている。

実験の結果によると、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体は、何れもサルＣＴＧＦタンパク質に対して優れた結合作用を有する。

三、ＣＴＧＦ抗体とマウスＣＴＧＦタンパク質のＥＬＩＳＡ実験
抗マウスＣＴＧＦ抗体の結合力は、抗体とマウスＣＴＧＦタンパク質のＥＬＩＳＡ実験により検出された。マウス－ＣＴＧＦ融合タンパク質をそのまま９６ウェルマイクロプレートで被覆し、抗体を加えた後、シグナルの強さは、抗体のマウス－ＣＴＧＦとの結合活性を判断するために用いられた。具体的な実験方法は以下の通りである。

ｐＨ７．４のＰＢＳ（上海源培、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｂ３２０）緩衝液でマウスＣＴＧＦ－ｈｉｓタンパク質を０．５ μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、５０ μＬ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ Ｎｏ． ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に加え、３７℃のインキュベータに２時間置いた。液体を捨ててから、ＰＢＳで希釈された５％脱脂乳（ＢＤ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｃａｔ Ｎｏ．２３２１００）ブロッキング液を２５０ μＬ／ウェルで加え、３７℃のインキュベータで３時間インキュベートし、又は４℃で一晩（１６時間～１８時間）置いてブロッキングした。ブロッキングが終了した後、ブロッキング液を捨て、且つＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４ ０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを３回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈された異なる濃度の検出待ち抗体（ハイブリドーマ精製抗体又はヒト化抗体）を加え、３７℃のインキュベータに入れて１時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、５０ μＬ／ウェルで試料希釈液で希釈されたＨＲＰで標識したヒツジ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １１５－０３５－００３）又はヒツジ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ． １０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルでＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、Ｃａｔ Ｎｏ． ５２－００－０３）を加え、室温で５ ｍｉｎ～１０ ｍｉｎインキュベートし、５０ μＬ／ウェルで１ ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を中止し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＶＥＲＳＡ ｍａｘ）により波長４５０ ｎｍで吸収値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によりデータを分析し、ＣＴＧＦ抗体のマウスＣＴＧＦタンパク質に対する結合ＥＣ５０値を算出した。実験の結果は、表１５に示されている。

実験の結果によると、本開示のヒト化全長抗ＣＴＧＦ抗体は、何れもマウスＣＴＧＦタンパク質に対して優れた結合作用を有する。

実施例１－４． ＣＴＧＦ抗体の機能阻害実験
当該試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、検出待ちヒト化抗ＣＴＧＦ抗体によるヒトＴＧＦ－β１機能への阻害活性を検出した。

まず、抗原ヒトＣＴＧＦをアミンカップリングでＣＭ５バイオセンサチップ（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）に固定し、固定化レベルが１５００ ＲＵであり、そして、チップ表面に濃度の高いＣＴＧＦ抗体（１５０ μｇ／ｍＬ）を１５０ ｓ流し、更に５０ ｎＭのＴＧＦ－β１タンパク質を１２０ ｓ注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合・解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、再生緩衝液でバイオセンサチップを洗浄して再生した。

試験で得られたデータは、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ソフトフェアにより統計的分析を行った。

阻害効率（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）＝［１－（試料応答値／ブランク対照応答値）］×１００％。具体的な結果は、表１６に示されている。

試験の結果によると、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体は、何れも機能阻害活性が高い。

抗ＣＴＧＦ抗体親和性のＢｉａｃｏｒｅ測定
当該試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、検出待ちヒト化抗ＣＴＧＦ抗体のヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦとの親和性を測定した。

それぞれＰｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサチップ（Ｃａｔ． ＃ ２９１２７５５６、ＧＥ）により一定量の検出待ち抗体を親和的に捕捉し、そしてチップ表面に一定濃度のヒト、マウスＣＴＧＦ抗原を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合・解離曲線を得た。各サイクル解離が完了した後、ｐＨ１．５のグリシン－塩酸再生溶液（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００３－５４、ＧＥ）でバイオチップを洗浄して再生した。試験作動緩衝液が１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００１－８８、ＧＥ）である。

試験で得られたデータは、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ソフトフェアにより（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでフィッティングし、親和性の値を得て、具体的には表１７、１８に示されている。

試験の結果によると、マウス抗体ｍＡｂ１４７とｍＡｂ１６４由来のキメラ抗体Ｃｈ１４７とＣｈ１６４及びヒト化抗ＣＴＧＦ抗体は、何れも、ヒトＣＴＧＦ及びマウスＣＴＧＦと高い親和性で結合することができ、種々のヒト由来の抗体生殖細胞系ＦＲ領域の置換と復帰変異改変は、何れもヒト化抗体の親和性に影響を与えず、一部の改変は、抗体の抗原との親和性を向上させることさえできる。

実施例１－５． ＣＴＧＦ抗体によるＴＧＦβ誘導性のＣ２Ｃ１２細胞インビトロ遊走抑制実験
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞、中国科学院細胞バンク、＃ＧＮＭ２６）を０．２５％のパンクレアチン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５２００－０７２）で消化し、遠心分離した後、無血清のＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１０５６４－０２９）により再懸濁した。無血清のＤＭＥＭ培地により細胞－抗体混合物及びＴＧＦβ１－抗体混合物を調製し、細胞密度は２×１０^５／ｍＬで、組換えヒトＴＧＦβ１（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃８９１５ＬＣ）の濃度は１０ ｎｇ／ｍＬであり、検出待ち抗体の濃度は何れも３０ μｇ／ｍＬである。

ＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標） Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ、＃１０６－８）の上蓋及びろ過膜を開け、ＴＧＦβ－抗体混合物を下室に入れ、１ウェルあたり３０ μＬ、１群あたり４つの平行ウェルとした。ろ過膜をかけ、膜に細胞－抗体混合物を加え、各ウェルに５０ μＬ加え、１群あたり４つの平行ウェルとした。上蓋をかけ、インキュベータ（３７℃、５％ ＣＯ_２）に置いた。

４８時間インキュベートした後、きれいなティッシュペーパーによりろ過膜における液体を吸い取り、ろ過膜を開け、下室に１ウェルあたり１０ μＬの予冷した０．２５％のパンクレアチンを加え、ろ過膜をかけた。５分間消化した後、１０００ ｒｐｍで１分間遠心分離した。ろ過膜を開け、下室に１ウェルあたり２０ μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７３）を加え、室温で１０分間インキュベートした。液体を３８４ウェルの白いベースプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６７４６２）に移し、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ、＃ＰｈｅｒａＳｔａｒ）により化学発光法でプレートを読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６でデータを分析して処理した。

その結果、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体は、ＴＧＦβ１により誘導された後のＣ２Ｃ１２細胞のインビトロでの遊走能力を抑制することができ、Ｃ２Ｃ１２細胞遊走能力への抑制が何れも陽性対照抗体ｍＡｂ１よりも強かったことが分かる。

実施例１－６． ＣＴＧＦ抗体によるＴＧＦβ誘導性のＰＡＮＣ１細胞インビトロ遊走抑制実験
ＰＡＮＣ－１細胞（ヒト膵臓がん細胞、ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１４６９）を０．２５％のパンクレアチン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５２００－０７２）で消化し、遠心分離した後、０．１％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃ １００９９－１４１）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１０５６４－０２９）により再懸濁した。０．１％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地により細胞－抗体混合物及びＴＧＦβ－抗体混合物を調製し、細胞密度は４×１０^５／ｍＬで、組換えヒトＴＧＦβ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃８９１５ＬＣ）の濃度は１０ ｎｇ／ｍＬであり、検出待ち抗体の濃度は何れも３０ μｇ／ｍＬである。

ＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標） Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ、＃１０６－８）の上蓋及びろ過膜を開け、ＴＧＦβ－抗体混合物を下室に入れ、１ウェルあたり３０ μＬ、１群あたり４つの平行ウェルとした。ろ過膜をかけ、膜に細胞－抗体混合物を加え、各ウェルに５０ μＬ加え、１群あたり４つの平行ウェルとした。上蓋をかけ、インキュベータ（３７℃、５％ ＣＯ_２）に置いた。

４８時間インキュベートした後、きれいなティッシュペーパーによりろ過膜における液体を吸い取り、ろ過膜を開け、下室に１ウェルあたり１０ μＬの予冷した０．２５％のパンクレアチンを加え、ろ過膜をかけた。５分間消化した後、１０００ ｒｐｍで１分間遠心分離した。倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、＃ＤＭＩＬ ＬＥＤ）にてプレートの底に沈んだ細胞をカウントした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６でデータを分析して処理した。抑制率＝［（ＴＧＦβ平均値－試料群平均値）／（ＴＧＦβ群平均値－未処理群平均値）］×１００％

その結果、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体は、何れもＴＧＦβ１により誘導された後のＰＡＮＣ１細胞のインビトロでの遊走能力を抑制できたことが分かる。

実施例１－７． ＣＴＧＦ抗体によるＰＡＮＣ１軟寒天インビトロ増殖への抑制実験
寒天（ＢＤ、＃２１４２２０）に脱イオン水を加え、加熱して１．４％のゲル溶液に調製した。２×ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ、＃１２１０００４６）とゲル溶液を１：１の体積比で混合し、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３５２４）において各ウェルに５００ μＬ加え、４℃で放置して凝固させた。

ＰＡＮＣ－１細胞（ヒト膵臓がん細胞、ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１４６９）を０．２５％のパンクレアチン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５２００－０７２）により消化し、遠心分離した後に４％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃ １００９９－１４１）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＥ、＃ＳＨ３０２４３．０１）で細胞密度を５×１０^４個／ｍＬに調整した。２×ＤＭＥＭ培地により抗体を２ ｍｇ／ｍＬに調製した。細胞、抗体及び１．４％のゲル溶液を２：１：１の体積比で混合し、下層ゲルを敷いた２４ウェルプレートにおいて各ウェルに２００ μＬ加えた。上層ゲルが凝固すると、２４ウェルプレートにおいて２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地２００ μＬを更に加えた。インキュベータにおいて（３７℃、５％ ＣＯ２）２８日間培養した後、ハイコンテント解析システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ）により写真を撮り、且つ形成された細胞クローン面積を分析した。抑制率＝（１－試料群平均値／未処理群平均値）×１００％。実験の結果は、表２１に示されている。

その結果、ｍＡｂ１４７とｍＡｂ１６４クローン由来のヒト化抗体は、ヒト膵臓がん細胞（ＰＡＮＣ－１細胞）のインビトロ増殖に対して顕著な抑制作用を有することが分かる。

実施例１－８． ＣＴＧＦ抗体の動物体内での生物学的活性
一、ＣＴＧＦ抗体によるブレオマイシン誘導性のマウス肺線維症への抑制試験
実験の方法：４０匹のマウスを体重によってランダムに、正常対照群（ＰＢＳ、ｉｐ、ｑｏｄ）、ｍＡｂ１群（１０ ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｏｄ）、Ｈｕ１６４－６７ｗｌ（１０ ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｏｄ）群、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ（１０ ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｏｄ）群という４群に分けた。１群あたり１０匹であり、具体的な群分けは、下記の表２１に示されている。実験の初日に、体重によって対応する溶媒と抗体（１０ ｍＬ／ｋｇで、正常対照とモデル群にＰＢＳを投与した）を腹腔内注射し、２時間後にブレオマイシンを霧化して（５０ ｍｇ／８ ｍＬで３０ ｍｉｎ霧化して５ ｍｉｎ滞在させた）モデル構築を行った。そして、上記群別によって溶媒又は抗体を１日おきに１回腹腔内注射し、実験周期が２１日間で、合計１１回腹腔内投与した。実験の２２日目に、マウスの腹腔内に１％のペントバルビタールナトリウム（１０ ｍＬ／ｋｇ）を注射して麻酔した後、マウスを仰向けにして作業台に固定し、頸部の正中線に沿って皮膚を１ ｃｍ切開し、切込みの下縁が胸郭入り口に至るようにし、止血鉗子により皮下結合組織及び筋肉を鈍的に切開して気管を露出し、気管両側及び気管と食道との間の結合組織を分離し、気管を遊離し、静脈留置針を挿入し、手術縫合糸によりカニューレが気管に入った所に結紮固定した。１ ｍＬの注射器で０．８ ｍＬのＰＢＳを吸引し、静脈套管針の液体注入端に接続してＰＢＳを徐々に気管に注入し、３０ ｓ滞在させた後、ＰＢＳを徐々に吸い戻したら、乳白色がかった泡沫状液体が吸い出されたことが見られ、繰り返して３回洗浄し、洗浄灌流液をＥＰ管に移してから、０．５ ｍＬのＰＢＳを吸い取り、上記のステップを繰り返した。２回の洗浄灌流液を混合した後、１５００ ｒｐｍで５ ｍｉｎ遠心分離し、上清液を－２０℃で保存して検出に備え、ＢＡＬＦ上清を再び１００００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心分離した後に上清を取って可溶性コラーゲンを検出した（試薬キット：Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、バッチ番号ＡＡ８８３）。

平均値がａｖｇ（Ａｖｅｒａｇｅ、平均値）で算出され、ＳＤ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｖｉａｔｉｏｎ、標準偏差）値がＳＴＤＥＶ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｖｉａｔｉｏｎ、標準差）で算出され、ＳＥＭ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒ ｏｆ Ｍｅａｎ、試料平均数の標準差）値がＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（Ｓｑｕａｒｅ ｒｏｏｔ、平方根）（各群の動物数）で算出されるように、Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアを利用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（二元配置分散分析）又はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）によりデータを統計的に分析した。実験の結果は、表２３に示されている。

その結果、Ｈｕ１６４－６７ｗｌ又はＨｕ１６４－６７ｙｌは、非常に強いマウス肺線維症抑制作用を示したことが示されている。

二、ＣＴＧＦ抗体によるＳｕ８６．８６ヒト膵臓がん細胞皮下移植腫瘍への抑制実験
実験の方法：ＳＵ８６．８６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１８３７、３．０×１０^６個）２００ μＬをＮｕ／Ｎｕヌードマウスの右肋部皮下に接種し、１１日間接種した後、腫瘍体積が～１４０ ｍｍ^３になると、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで５群に分け、１群あたり１０匹であり、当日から投与し始めた。抗体を腹腔内に注射し、週２回で、合計１８日間注射した。週１～２回で腫瘍体積を測定し、体重を量り、データを記録した。群分け及び投与状況は、表２４に示されている。

平均値がａｖｇで算出され、ＳＤ値がＳＴＤＥＶで算出され、ＳＥＭ値がＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（各群の動物数）で算出されるように、Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアによりデータを記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ又はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによりデータを統計的に分析した。

腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ_ｔ－Ｔ_０）／（Ｃ_ｔ－Ｃ_０）×１００で、そのうち、Ｔ_ｔ、Ｃ_ｔは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ_０、Ｃ_０は実験開始時の腫瘍体積である。

腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。

実験の結果：
実験の１日目～１８日目に（Ｄ０は実験開始時、Ｄ１８は１８日目を表す）、週２回皮下注射で投与し、ＣＴＧＦ抗体によるＳＵ８６．８６腫瘍の成長への抑制作用を検出した。試験の結果は、表２４及び図２に示されている。ホモヒトＩｇＧのブランク対照群と比べて、ｍＡｂ１－４０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－４０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－２０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１４７－３３ｗｋ（４０ ｍｇ／ｋｇ）群の腫瘍抑制率は、それぞれ４５％、５３％、４７％と５４％であり、ｍＡｂ１－４０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－４０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－２０ ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１４７－３３ｗｋ（４０ ｍｇ／ｋｇ）群は、Ｓｕ８６．８６腫瘍の成長（ｐ＜０．００１）を顕著に抑制することができると共に、ＳＵ８６．８６腫瘍への抑制作用が一定の用量依存性を有する。また、各群のマウスは、体重に明らかな変化がなかった。

二、製剤
製剤の調製と検出中に使用された機器、抗体及び方法は、以下の通りである。
ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー：
ゲル細孔の孔径のサイズと高分子試料分子のコイル寸法との間の相関関係に基づいて溶質を分離する分析方法である。

ＳＥＣ％（ＳＥＣモノマーの含有量百分率）＝Ａモノマー／Ａ全×１００％（Ａモノマーは試料中のメインピークモノマーのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である）。

ＳＥＣ測定用機器：アジレント１２６０、カラム：ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｇｅ ＢＥＨ２００Å ＳＥＣ（３００ ｍｍ×７．８ ｍｍ、３．５ μｍ）。

ＮＲ－ＣＥキャピラリーゲル電気泳動：
ゲルをキャピラリーに支持媒体として移動して行われる電気泳動であり、一定の電圧で試料の分子量の大きさによって分離する方法である。

非還元ＣＥの純度百分率＝Ａメインピーク／Ａ全×１００％（Ａメインピークは、試料中の軽鎖メインピーク＋重鎖メインピークのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である）。

ＣＥ測定用機器：Ｂｅｃｋｍａｎ 型番ｐｌｕｓ８００。

ｉＣＩＥＦイメージングキャピラリー等電点電気泳動：
タンパク質の等電点ｐＩの違いによって分離する技術である。

ｉＣＩＥＦ中性ピークの含有量百分率＝中性ピーク面積／総面積×１００％（総面積は、酸性ピーク、中性ピークと塩基性ピークの面積の和である）。

ｉＣＩＥＦ測定に使用された機器のメーカーはｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎであり、型番がｍｕａｒｉｃｅである。

浸透圧の測定：
凝固点法で浸透圧を測定し、凝固点降下値が溶液のモル濃度に正比例することを基にして、高感度測温素子を使用し、溶液の凝固点を測定し、電気量で浸透圧に変換した。機器メーカー：ルーザーＬｏｓｅｒ、型番ＯＭ８１５。

タンパク質濃度の測定：
タンパク質濃度の測定機器：紫外可視分光光度計、型番：Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ｏｎｅＣ、光路１ ｍｍ。以下の抗体の濃度は、タンパク質濃度計を採用した。

ＣＴＧＦ抗体
以下の実施例に使用された抗ＣＴＧＦ抗体はＨｕ１６４－６７ｙｌであり、その中で、実施例２－１、実施例２－２、実施例２－３、実施例２－４の１番～６番の試料及び実施例２－５の１番、２番の試料に使用された抗体は、タンパク質発現後に親和性クロマトグラフィーにより得られ、実施例２－４の７番、８番の試料及び実施例２－５の３番～９番の試料に使用された抗体は、上記抗体に更にイオン交換クロマトグラフィー及びろ過を行った後に得られた。

実施例２－１． 製剤緩衝系とｐＨ値の選別
２００ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌを含む液体製剤を調製し、当該製剤は、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと様々な緩衝系を更に含む。緩衝系は、それぞれ、５０ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩（ＡＡ）ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、５０ ｍＭのヒスチジン－酢酸塩（Ｈｉｓ－ＡＡ）ｐＨ５．５、５０ ｍＭのコハク酸ナトリウム塩（ＳＡ）ｐＨ５．５、５０ ｍＭの枸櫞酸ナトリウム塩（ＣＡ）ｐＨ５．５、５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）ｐＨ５．５、ｐＨ ６．０、ｐＨ６．５、５０ ｍＭのリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム塩（ＰＢ）ｐＨ６．５、ｐＨ７．０である。それぞれの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした後、製剤を４０℃の定温条件で１ヶ月放置し、ＳＥＣ、非還元ＣＥなどの指標を評価した。

結果は表２６に示されている。ＳＥＣデータによると、４０℃で１ヶ月放置した条件下で、ＡＡ（ｐＨ５．５）、Ｈｉｓ－ＡＡ（ｐＨ５．５）、ＣＡ（ｐＨ５．５）、Ｈｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）を用いる試料は、メインピークが他の試料よりも少なく低減されることが示されており、ＮＲ－ＣＥデータによると、４０℃で１ヶ月放置した条件下で、Ｈｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）を用いる試料は、メインピークが最も少なく低減された（５．１％）ことが示されている。

注記：表中、「Ｄ」は日間を示し、例えば、Ｄ７は７日間を示し、その他はこのように類推し、Ｄ０は実験開始時を示し、「Ｍ」はヶ月を示し、例えば、Ｍ１は１ヶ月を示し、その他はこのように類推する。

実施例２－２ 長期安定性試験
２００ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含むを調製した。試料を２５℃と４℃の条件で置いて安定性を考査し、結果は表２７に示されている。

注記：表中、「Ｍ」はヶ月を示し、例えば、Ｍ３は３ヶ月を示し、その他はこのように類推する。以下同様。

その結果、試料は、２５℃の条件で５ヶ月放置した後、純度項目がやや下がりぎみであるが、下げ幅は何れも許容可能な範囲内にあり、４℃の条件で５ヶ月放置した場合、各検出項目に何れも顕著な変化がなく、当該処方の安定性が良かったことが示されている。

実施例２－３ タンパク質濃度の選別
以下の配合比をもつ液体製剤を調製した。
１）２００ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース
２）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース
２つの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料に対して４０℃での安定性及び長期安定性を考査し、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、非還元ＣＥを評価指標とした。

その結果、１）番と２）番の試料は４０℃ Ｍ１、２５℃ Ｍ３及び４℃ Ｍ５の条件で放置した後、純度項目に有意差がなかったことが示されている。１）番の試料は、２５℃ Ｍ５の条件で放置した後、ＳＥＣとｉＣＩＥＦのメインピークが２）番の試料よりもやや多く下げている。

実施例２－４ 界面活性剤の選別
１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ５．５、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース及び様々な界面活性剤を含む製剤を調製した。それぞれの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を取って振とう（２５℃、３００ ｒｐｍ）、５回の凍結融解サイクル（ＦＴ５Ｃ、条件は－３５℃から２℃～８℃）、４０℃での高温放置及び長期安定性（４℃ Ｍ３）の研究を行い、ＳＥＣ、非還元ＣＥとｉＣＩＥＦを考査し、具体的な処方設計は表２９に示されている。

実験の結果によると、異なる種類と濃度のポリソルベートを含む試料は、純度の検出結果に有意差がなかった。同じ濃度のＰＳ８０とポロキサマー１８８を含む場合、４０℃で１ヶ月放置した後、２群の試料は純度に有意差がなかった。

実施例２－５ 製剤処方の最適化
以下の配合比をもつ液体製剤を調製した。
１）２００ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
２）２００ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、７０ ｍｇ／ｍＬのトレハロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
３）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
４）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と２％のＰＥＧ ３３５０
５）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と５０ ｍＭのアルギニン
６）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と１％のマンニトール
７）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と０．５ ｍＭのＥＤＴＡ
８）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と５ ｍＭのＥＤＴＡ
９）１５０ ｍｇ／ｍＬのＨｕ１６４－６７ｙｌ、５０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、７０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と１０ ｍＭのＥＤＴＡ
それぞれの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料に対して４０℃での安定性を考査し、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、非還元ＣＥを評価指標とした。

その結果、試料は４０℃で１ヶ月放置した後、スクロースのみを加えた試料と他の安定剤を加えた試料は、純度に有意差がなく、各条件下で処方の安定性が良かったことが示されている。当該結果から、スクロース以外の他の安定剤の加入が処方の安定性に影響を与えず、且つ他の安定剤を含まない処方が他の安定剤を含む処方の安定効果に達したことを示唆している。

Claims (18)

1. 抗ＣＴＧＦ抗体及び緩衝剤を含む医薬組成物であって、前記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
   ｉ）前記重鎖可変領域は、配列が配列番号８で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列が配列番号９で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
   ｉｉ）前記重鎖可変領域は、配列が配列番号６で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
   ｉｉ－ｉ）前記重鎖可変領域は、配列が配列番号６９で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７０で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、又は
   ｉｉ－ｉｉ）前記重鎖可変領域は、配列が配列番号８５で示される重鎖可変領域と同じであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列が配列番号７０で示される軽鎖可変領域と同じであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
   前記緩衝剤はヒスチジン塩緩衝剤であり、好ましくはヒスチジン－塩酸塩緩衝剤又はヒスチジン－酢酸塩緩衝剤、より好ましくはヒスチジン－塩酸塩緩衝剤である、
   医薬組成物。
2. 前記抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、
   前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７と配列番号１８で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０と配列番号２１で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、
   好ましくは、前記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３４で示され、且つ前記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３０で示され、
   より好ましくは、前記抗ＣＴＧＦ抗体は、配列番号６１で示される重鎖及び配列番号６４で示される軽鎖を含む、
   請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．５であり、好ましくは約５．０～約６．０、より好ましくは約５．５である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記抗ＣＴＧＦ抗体の濃度は約１００ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５０ ｍｇ／ｍＬである、請求項１～３の何れか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記医薬組成物は、界面活性剤を更に含み、前記界面活性剤は、ポリソルベート又はポロキサマーが好ましく、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８がより好ましく、ポリソルベート８０が最も好ましい、請求項１～４の何れか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記界面活性剤の濃度は約０．０５ ｍｇ／ｍＬ～約１．０ ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．４ ｍｇ／ｍＬである、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記医薬組成物は糖を更に含み、前記糖は、スクロース、マンニトールとトレハロースから選ばれる１種又は複数種が好ましく、スクロースがより好ましい、請求項１～６の何れか一項に記載の医薬組成物。
8. 前記糖の濃度は約２０ ｍｇ／ｍＬ～約１００ ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約７０ ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記緩衝剤の濃度は約５ ｍＭ～約１００ ｍＭであり、好ましくは約３０ ｍＭ～約７０ ｍＭ、より好ましくは約５０ ｍＭである、請求項１～８の何れか一項に記載の医薬組成物。
10. 前記医薬組成物は安定剤を更に含み、前記安定剤はＰＥＧ、アルギニンとＥＤＴＡから選ばれる、請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物。
11. 下記の成分、即ち、
    （ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約３０ ｍＭ～約７０ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．０であり、
    好ましくは、下記の成分、即ち、
    （ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨは約５．５～約５．７であり、前記抗ＣＴＧＦ抗体は、配列番号６１で示される重鎖及び配列番号６４で示される軽鎖を含む、
    請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物。
12. 再溶解すると、請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物を形成することができる、凍結乾燥製剤。
13. 凍結乾燥製剤を調製する方法であって、請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、方法。
14. 請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することで得られる凍結乾燥製剤。
15. 請求項１２又は１４に記載の凍結乾燥製剤を再溶解することで調製され、
    好ましくは、
    （ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬ～約２００ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約４０ ｍｇ／ｍＬ～約８０ ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約３０ ｍＭ～約７０ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨは約５．０～約６．０であり、
    より好ましくは、
    （ａ）約１５０ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＣＴＧＦ抗体と、（ｂ）約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約７０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約５０ ｍＭのヒスチジン－塩酸塩緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨは約５．５～約５．７であり、前記抗ＣＴＧＦ抗体は、配列番号６１で示される重鎖及び配列番号６４で示される軽鎖を含む、
    再溶解溶液。
16. 静脈注射製剤、皮下注射製剤、腹腔注射製剤又は筋肉注射製剤であり、好ましくは静脈注射製剤である、請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物又は請求項１５に記載の再溶解溶液。
17. 請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１２又は１４に記載の凍結乾燥製剤或いは請求項１５に記載の再溶解溶液が入った容器を含む、製品。
18. ＣＴＧＦに関連する疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の請求項１～１１の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１２又は１４に記載の凍結乾燥製剤、請求項１５に記載の再溶解溶液或いは請求項１７に記載の製品を対象に投与することを含み、
    そのうち、前記ＣＴＧＦに関連する疾患は、線維性疾患、高血圧、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障又はがんが好ましく、
    好ましくは、前記線維性疾患は、自発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、変形性関節症、強皮症、慢性心不全、肝硬変又は腎線維症から選ばれ、
    好ましくは、前記がんは、急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織増殖性がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、消化管がん又は肝がんから選ばれる。