JP7418508B2 - 抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体およびその使用 - Google Patents

抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月１５日に出願された“ＡＮＴＩ－ＰＲＯ／ＬＡＴＥＮＴ－ＭＹＯＳＴＡＴＩＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ”と題する米国仮特許出願番号第６２／２１９，０９４号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張しており、その内容は、すべての目的のために参考として本明細書中に援用される。
開示の分野
本開示の実施形態は、増殖因子活性の調節物質を含んでよい。いくつかの実施形態ではそのような調節物質は、抗体を含んでよく、ＴＧＦ－βファミリーメンバー活性および／または生物学を調節できる。
開示の背景
ミオスタチンは、筋肉量（ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ）を負に制御する分泌型増殖因子である。過度筋肉（ｈｙｐｅｒｍｕｓｃｕｌａｒ）の表現型をもたらすミオスタチン遺伝子中の機能喪失変異が、ウシ、ヒツジ、魚類、イヌおよびヒトにおいて記載されている。ミオスタチン発現は、一般に骨格筋に限定されており、低レベルの発現が脂肪および心臓組織において報告されている。ミオスタチンシグナル伝達の阻害は、筋肉のサイズの増加をもたらす。
開示の要旨
本開示の態様は、いくつかの実施形態ではミオスタチンの形態（例えばプロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチン）に特異的に結合する抗体に関する。例えば本明細書で提供される抗体は、プロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチンなどのミオスタチンのプロ形態および／または潜在型形態の１つまたは複数に特異的に結合する。ある特定の態様では、本開示は純粋な、または実質的に純粋なプロＧＤＦ８（プロミオスタチンとも称する）に特異的に結合する、本明細書で提供する抗体の驚くべき発見に基づいている。いくつかの実施形態では本明細書で提供する抗体はミオスタチンシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態ではミオスタチンシグナル伝達の阻害は、筋肉量を増加させるまたは筋萎縮症を予防するのに有用である。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ミオスタチンに結合し、プロタンパク質転換酵素および／またはトロイドプロテアーゼによるミオスタチンの切断を妨げる。プロミオスタチン又は潜在型ミオスタチンの切断を妨げることは、いくつかの実施形態では、ミオスタチン活性化を妨げる。本開示のさらなる態様は、抗原への親和性がｐＨに感受性である抗体に関する。いくつかの実施形態では、そのようなｐＨ感受性抗体は、血清から抗原を排除するのに有効である。さらに、いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、血清から抗原（例えばプロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチン）を効率的に排除できるスイーピング抗体である。
本開示の態様は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体を含み、重鎖可変ドメインは配列番号１０～１１のいずれか１つに記載の配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む。いくつかの実施形態では抗体は、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では軽鎖可変ドメインは、配列番号２２～２３のいず
れか１つに記載の配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。別の実施形態では前記抗体は、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号１～３のいずれか１つに記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４～９のいずれか１つに記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１０～１１のいずれか１つに記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１２～１７のいずれか１つに記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号１８～２１のいずれか１つに記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２２～２３のいずれか１つに記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では前記ＣＤＲＨ１は、配列番号１または２に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４または５に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１２または１３に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号１８または１９に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２２に記載の配列を含む。
別の実施形態では前記ＣＤＲＨ１は配列番号１または３に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号６または７に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１４または１５に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２０または２１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２３に記載の配列を含む。
他の実施形態ではＣＤＲＨ１は配列番号１または３に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号８または９に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１６または１７に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２０または２１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２３に記載の配列を含む。
別の実施形態では前記抗体は、配列番号２５～２９のいずれか１つに記載の重鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では前記抗体は、配列番号３０～３５のいずれか１つに記載の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
本開示の他の態様は、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合し、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号２２～２３のいずれか１つに記載の配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。いくつかの実施形態では前記抗体は、配列番号３０の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
本開示のいくつかの態様は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、可変重鎖ドメインである。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）同一である。
本開示のいくつかの態様は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、可変軽鎖ドメインである。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４または配列番号３５に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）同一である。
本開示の別の態様は、プロ／潜在型ミオスタチンへの結合について上に記載の抗体と競合する抗体を含む。いくつかの実施形態では前記抗体は、上に記載の抗体と同じエピトープにおいてプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。別の実施形態では抗体は、１０－６Ｍ未満である抗体とプロ／潜在型ミオスタチンとの間の平衡解離定数、Ｋｄでプロ／潜在型ミオスタチンへの結合について競合する。他の実施形態では前記抗体のＫｄは、１０－１１Ｍから１０－６Ｍの範囲にある。
いくつかの実施形態では抗体はヒト化抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはＦｖ断片である。別の実施形態では抗体は、ヒト化抗体である。別の実施形態では抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では抗体は、ヒト生殖系列配列を有するフレームワークを含む。別の実施形態では抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥ定常ドメインからなる群より選択される重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では抗体は、ＩｇＧ４の定常ドメインを含む。他の実施形態では抗体は、ＩｇＧ１様ヒンジを生じ、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするＳｅｒからＰｒｏへの骨格置換を有するＩｇＧ４の定常ドメインを含む。別の実施形態では抗体は、蛍光性作用物質、発光性作用物質、酵素性作用物質および放射性作用物質からなる群より選択される作用物質にコンジュゲートされる。
別の実施形態では抗体は、成熟ミオスタチンと比較してプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では抗体は、トランスホーミング増殖因子ベータファミリーの別のメンバーと比較してプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。別の実施形態では前記メンバーは、ＧＤＦ１１またはアクチビンである。
本開示のさらなる態様は、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合し、トロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態では前記抗体は、トロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を１μＭ未満のＩＣ５０で阻害する。いくつかの実施形態では抗体は、ヒトおよびネズミプロ／潜在型ミオスタチンと交差反応性である。他の実施形態では抗体は、ＧＤＦ１１またはアクチビンと比較してプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。別の実施形態では抗体は、成熟ミオスタチンと比較してプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。
本開示の別の態様は、プロ／潜在型ミオスタチンを含む培地中に存在する細胞におけるミオスタチン受容体活性化を低減する方法であって、上に記載の抗体を、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性化を阻害するのに有効な量で培地に送達することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では培地は、プロタンパク質転換酵素をさらに含む。他の実施形態では培地は、トロイドプロテアーゼをさらに含む。別の実施形態では抗体は、トロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性化を阻害するのに有効な量で培地に送達される。いくつかの実施形態では細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにある。他の実施形態では細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。
本開示の別の態様は、ミオパチーを有する被験体を処置する方法であって、上に記載の抗体の有効量を被験体に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態ではミオパチーは原発性ミオパチーである。別の実施形態では原発性ミオパチーは非活動性萎縮症を含む。他の実施形態では非活動性萎縮症は、股関節骨折、待機的人工関節置換術（ｅｌｅｃｔｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、救命医療ミオパチー（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、脊髄損傷または発作（ｓｔｒｏｋｅ）に関連する。いくつかの実施形態ではミオパチーは、筋肉喪失（ｍｕｓｃｌｅ ｌｏｓｓ）が疾患病態に続発する二次性ミオパチーである。他の実施形態では二次性ミオパチーは、脱神経
、遺伝性筋脱力または悪液質を含む。別の実施形態では二次性ミオパチーは、筋萎縮性側索硬化症または脊髄性筋萎縮症に関連する脱神経である。いくつかの実施形態では二次性ミオパチーは、筋ジストロフィーに関連する遺伝性筋脱力である。他の実施形態では二次性ミオパチーは、腎不全、ＡＩＤＳ、心臓の状態、がんまたは加齢に関連する悪液質である。
本開示の別の態様は、加齢に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。加齢に関連する例示的疾患および状態は、非限定的に、筋肉減少症（加齢性筋肉喪失）、虚弱およびアンドロゲン欠乏症を含む。
本開示の別の態様は、非活動性萎縮症／外傷に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。非活動性萎縮症／外傷に関連する例示的疾患および状態は、非限定的に、集中治療室（ＩＣＵ）で過ごした時間に関連する筋脱力、股関節置換術、股関節骨折、発作、床上安静、ＳＣＩ、回旋筋腱板損傷、膝置換術、骨折および熱傷を含む。
本開示の別の態様は、神経変性疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的神経変性疾患または状態は、非限定的に脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。
本開示の別の態様は、悪液質に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。悪液質に関連する例示的疾患および状態は、非限定的にがん、慢性心不全、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を含む。
本開示の別の態様は、まれな疾患に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的なまれな疾患および状態は、非限定的に骨形成不全症、孤発性封入体筋炎および急性リンパ芽球性白血病を含む。
本開示の別の態様は、代謝障害および／または身体組成に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。いくつかの実施形態では疾患または状態は肥満（例えば重度の肥満）、プラダー・ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病または食欲不振である。しかし代謝障害および／または身体組成に関連する追加的疾患または状態は本開示の範囲内である。
本開示の別の態様は、先天性ミオパチーに関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的先天性ミオパチーは、非限定的にＸ連鎖筋細管ミオパチー、常染色体優性中心核ミオパチー、常染色体劣性中心核ミオパチー、ネマリンミオパチーおよび先天性筋線維型不均衡ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｆｉｂｅｒ－ｔｙｐｅ ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｍｙｏｐａｔｈｙ）を含む。
本開示の別の態様は、筋ジストロフィーに関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的筋ジストロフィーは、非限定的にデュシェンヌ型、ベッカー型、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨ）および肢帯型筋ジストロフィーを含む。
本開示の別の態様は、泌尿婦人科関連疾患または状態、声門障害（狭窄）、外眼性ミオパチー、手根管（ｃａｒｐｅｌ ｔｕｎｎｅｌ）、ギランバレーまたは骨肉腫を有する被験体を処置する方法を含む。
いくつかの実施形態では処置は、被験体において筋力の改善を生じる。他の実施形態では処置は、被験体において代謝状態の改善を生じる。
いくつかの実施形態では抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では抗体は、０．３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
いくつかの実施形態では抗体は、被験体に静脈内投与される。他の実施形態では抗体は、被験体に皮下投与される。別の実施形態では抗体は、被験体に複数の機会に投与される。いくつかの実施形態では、前記複数回投与は、少なくとも毎月実施される。別の実施形態では前記複数回投与は、少なくとも毎週実施される。
本開示のさらなる態様は、上に記載の任意の抗体および担体を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では前記担体は薬学的に許容される担体である。他の実施形態では抗体および担体は凍結乾燥形態にある。別の実施形態では抗体および担体は溶液中にある。いくつかの実施形態では抗体および担体は凍結されている。他の実施形態では抗体および担体は、－６５℃未満またはそれに等しい温度で凍結される。
本開示の他の態様は、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含むタンパク質をコードする単離された核酸を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１０または１１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では前記ＣＤＲＨ１は、配列番号１、２または３に記載の配列を含む。他の実施形態ではＣＤＲＨ２は、配列番号４～９のいずれか１つに記載の配列を含む。
本開示の別の態様は、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含むタンパク質をコードする単離された核酸を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では前記ＣＤＲＬ１は配列番号１２～１７のいずれか１つに記載の配列を含む。他の実施形態ではＣＤＲＬ２は配列番号１８～２１のいずれか１つに記載の配列を含む。
本開示のさらなる態様は、配列番号３８～４９のいずれか１つに記載の配列を含む単離された核酸を含む。
本開示の別の態様は、上に記載の単離された核酸を含む単離された細胞を含む。
本開示はいくつかの態様では、ミオパチーを有する被験体から得られた生物学的試料を評価する方法を含む。いくつかの実施形態では方法は、被験体から得られた生物学的試料のタンパク質と、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する抗体とを含む免疫学的反応混合物を調製すること；抗体とプロ／潜在型ミオスタチンとの間で結合複合体が形成されることを可能にする条件下に免疫学的反応混合物を維持すること；および結合複合体形成の程度を決定することを含む。いくつかの実施形態では方法は、被験体から得られた生物学的試料のタンパク質と、プロミオスタチンに特異的に結合する抗体とを含む免疫学的反応混合物を調製すること；抗体とプロミオスタチンとの間で結合複合体が形成されることを可能にする条件下に免疫学的反応混合物を維持すること；および結合複合体形成の程度を決定することを含む。いくつかの実施形態では方法は、被験体から得られた生物学的試料のタンパク質と、潜在型ミオスタチンに特異的に結合する抗体とを含む免疫学的反応混合物を調製すること；抗体と潜在型ミオスタチンとの間で結合複合体が形成されることを可能にする条件下に免疫学的反応混合物を維持すること；および結合複合体形成の程度を決定することを含む。いくつかの実施形態では方法は、被験体から得られた生物学的試料のタンパク質と、成熟ミオスタチンに特異的に結合する抗体とを含む免疫学的反応混合物を調製すること；抗体と成熟ミオスタチンとの間で結合複合体が形成されることを可能にする条件下に免疫学的反応混合物を維持すること；および結合複合体形成の程度を決定
することを含む。
一態様では、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体が本明細書に開示される。一実施形態では抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の態様では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
別の態様では、配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号６を含むＣＤＲＨ２配列、および配列番号１１を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１４を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号２０を含むＣＤＲＬ２配列、および配列番号２３を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体が本明細書に開示される。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号２６の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号３２の配列を含む。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号２７の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号３３の配列を含む。
別の態様では、配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号８を含むＣＤＲＨ２配列、および配列番号１１を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号２０を含むＣＤＲＬ２配列、および配列番号２３を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体が本明細書に開示される。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号２８の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号３４の配列を含む。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号２９の配列を含む。一実施形態では軽鎖可変領域は配列番号３５の配列を含む。
一実施形態では抗体はヒト抗体である。一実施形態では抗体はＩｇＧ４定常ドメインを含む。一実施形態では抗体は、ＩｇＧ１様ヒンジを生じ、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするＳｅｒからＰｒｏへの骨格置換を有するＩｇＧ４の定常ドメインを含む。
一実施形態では抗体はプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。一実施形態では抗体はプロミオスタチンに特異的に結合する。別の実施形態では抗体は潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。一実施形態では抗体は成熟ミオスタチンに結合しない。
一実施形態では抗体は、トロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を阻害する。一実施形態では抗体は、トロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を１μＭ未満のＩＣ５０で阻害する。
一実施形態では抗体は、ヒトおよびネズミのプロ／潜在型ミオスタチンと交差反応性である。別の実施形態では抗体は、プロ／潜在型ミオスタチンと結合するが、ＧＤＦ１１またはアクチビンと結合しない。
一態様では、プロ／潜在型ミオスタチンを含む培地中に存在する細胞におけるミオスタチン受容体活性化を低減する方法であって、本明細書に記載の抗体を、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性化を阻害するのに有効な量で培地に送達することを含む方法が本明細書に開示される。一実施形態では培地はプロタンパク質転換酵素を含む。別の実施形態では培地はトロイドプロテアーゼを含む。一実施形態では細胞はｉｎ
ｖｉｔｒｏにある。別の実施形態では細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。
別の態様では、ミオパチーを有する被験体を処置する方法であって、本明細書に開示される抗体の有効量を被験体に投与することを含む方法が本明細書に開示される。
一実施形態ではミオパチーは原発性ミオパチーである。別の実施形態では原発性ミオパチーは非活動性萎縮症である。一実施形態では非活動性萎縮症は、股関節骨折、待機的人工関節置換術、救命医療ミオパチー、脊髄損傷および／または発作に関連する。
別の実施形態ではミオパチーは筋肉喪失が疾患病態に続発する二次性ミオパチーである。一実施形態では二次性ミオパチーは、脱神経、遺伝性筋脱力または悪液質を含む。別の実施形態では二次性ミオパチーは、筋萎縮性側索硬化症または脊髄性筋萎縮症に関連する脱神経である。さらに別の実施形態では二次性ミオパチーは、筋ジストロフィーに関連する遺伝性筋脱力である。一実施形態では二次性ミオパチーは、腎不全、ＡＩＤＳ、心臓の状態、がんまたは加齢に関連する悪液質である。
一実施形態では投与によって被験体において筋力の改善を生じる。一実施形態では投与によって被験体において代謝状態の改善を生じる。
一実施形態では抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では抗体は、０．３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
一実施形態では抗体は被験体に静脈内投与される。別の実施形態では抗体は被験体に皮下投与される。
一実施形態では抗体は被験体に複数の機会に投与される。一実施形態では複数回投与は少なくとも毎月実施される。別の実施形態では複数回投与は少なくとも毎週実施される。
別の態様では、本明細書に開示した抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書に開示される。一実施形態では組成物は凍結乾燥された組成物である。別の実施形態では、組成物は液体組成物である。一実施形態では組成物は凍結されている。一実施形態では組成物は、－６５℃未満またはそれに等しい温度で凍結されている。
別の態様では、本明細書に記載した医薬組成物を含むシリンジが本明細書に開示される。
別の態様では、配列番号３９の核酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４５の核酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体をコードする単離された核酸が本明細書に開示される。
別の態様では、配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号６を含むＣＤＲＨ２配列、および配列番号１１を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１４を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号２０を含むＣＤＲＬ２配列、および配列番号２３を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体をコードする単離された核酸が本明細書に開示される。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号４０の配列を含む。一実施形態では軽鎖可変領域は配列番号４６の配列を含む。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号４１の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号４７の配列を含む。
別の態様では配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号８を含むＣＤＲＨ２配列、および配列番号１１を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号２０を含むＣＤＲＬ２配列、および配列番号２３を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体をコードする単離された核酸が本明細書に開示される。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号４２の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号４８の配列を含む。
一実施形態では重鎖可変領域は配列番号４３の配列を含む。別の実施形態では軽鎖可変領域は配列番号４９の配列を含む。
別の態様では、本明細書に記載した単離された核酸を含む単離された細胞が本明細書に開示される。
図１Ａ～１Ｂは、ミオスタチンのドメイン構造およびプロミオスタチンアセンブリを示す。図１Ａは、阻害性のプロドメインの後にジスルフィド連結二量体として存在するＣ末端増殖因子ドメインが続く、プロタンパク質として分泌されるミオスタチンを示す。図１Ｂは、プロドメイン（暗灰色）が増殖因子（明灰色）を、「ストレートジャケット」アセンブリにより封入する不活性なコンフォメーションでアセンブルされた前駆体タンパク質を示す。この図は、潜在型ＴＧＦβ１の構造（Shiら、Nature、２０１１年）の改作である。
図２は、ミオスタチンの活性化が２つの異なるプロテアーゼ事象を伴い、３つの主要なミオスタチン種を生成することを示す。生合成前駆体タンパク質であるプロミオスタチンは、２つの別個のプロテアーゼによってプロセシングされる。プロミオスタチン（およびプロＧＤＦ１１）の切断は、プロドメインと成熟増殖因子の間の保存されたＲＸＸＲ部位で切断する、フューリン／ＰＡＣＥ３（Ｐａｉｒｅｄ Ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ３）またはＰＣＳＫ５（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ５）などのプロタンパク質転換酵素によって行われる。この切断によって潜在的複合体が産生され、この中で成熟増殖因子はプロドメインによりその受容体に対する結合から遮蔽されている。活性増殖因子の活性化および放出は、ＴＬＬ－２（トロイド様タンパク質２）またはＢＭＰ１（骨形成タンパク質１）などのＢＭＰ／トロイドファミリーのさらなるプロテアーゼによる切断後に達成される。これらの切断事象によって成熟型のミオスタチンが生成され、これは活性ミオスタチンまたは成熟ミオスタチンと称され得る。
図３Ａ～３Ｃは、Ａｂ１が、プロテアーゼのトロイドファミリーのメンバーによるプロミオスタチンの切断を遮断することを示す。Ａｂ１の漸増量と共にプレインキュベートした潜在型ミオスタチン試料を、ミオスタチン活性化アッセイにおいて分析した。レポーターアッセイ（図３Ａ）によるミオスタチン放出の分析後、次いで、試料を還元条件下で泳動させて、ミオスタチンのプロドメインに対して惹起された抗体によるウエスタンブロットによってプロービングした（図３Ｂ）。トロイド切断後に生成されたプロドメインのＡＲＭ部分に対応する約１８ｋＤａのバンド（四角で囲った部分）は、Ａｂ１の用量の増加に比例して減少した。潜在型およびプロミオスタチンの標準物質（４５ｎｇをロードした）により、プロミオスタチンが約５０ｋＤａに、およびプロドメインが約３７ｋＤａに移動したことが示される。図３Ｃは、ミオスタチンの活性化が２つの異なるプロテアーゼ事象を伴い、３つの主要なミオスタチン種を生成することを示す。生合成前駆体タンパク質であるプロミオスタチンは、２つの別個のプロテアーゼによってプロセシングされる。プロミオスタチン（およびプロＧＤＦ１１）の切断は、プロドメインと成熟増殖因子の間の保存されたＲＸＸＲ部位で切断する、フューリン／ＰＡＣＥ３（Ｐａｉｒｅｄ Ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ３）またはＰＣＳＫ５（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ５）などのプロタンパク質転換酵素によって行われる。この切断によって、潜在的複合体が産生され、この中で成熟増殖因子は、プロドメインによりその受容体に対する結合から遮蔽されている。トロイドプロテアーゼの起こり得る阻害を説明し、プロミオスタチンのさらなる切断の遮断を説明する、図３Ｂを参照されたい。活性増殖因子の活性化および放出は、ＴＬＬ－２（トロイド様タンパク質２）またはＢＭＰ１（骨形成タンパク質１）などのＢＭＰ／トロイドファミリーのさらなるプロテアーゼによる切断後に達成される。 図３Ａ～３Ｃは、Ａｂ１が、プロテアーゼのトロイドファミリーのメンバーによるプロミオスタチンの切断を遮断することを示す。Ａｂ１の漸増量と共にプレインキュベートした潜在型ミオスタチン試料を、ミオスタチン活性化アッセイにおいて分析した。レポーターアッセイ（図３Ａ）によるミオスタチン放出の分析後、次いで、試料を還元条件下で泳動させて、ミオスタチンのプロドメインに対して惹起された抗体によるウエスタンブロットによってプロービングした（図３Ｂ）。トロイド切断後に生成されたプロドメインのＡＲＭ部分に対応する約１８ｋＤａのバンド（四角で囲った部分）は、Ａｂ１の用量の増加に比例して減少した。潜在型およびプロミオスタチンの標準物質（４５ｎｇをロードした）により、プロミオスタチンが約５０ｋＤａに、およびプロドメインが約３７ｋＤａに移動したことが示される。図３Ｃは、ミオスタチンの活性化が２つの異なるプロテアーゼ事象を伴い、３つの主要なミオスタチン種を生成することを示す。生合成前駆体タンパク質であるプロミオスタチンは、２つの別個のプロテアーゼによってプロセシングされる。プロミオスタチン（およびプロＧＤＦ１１）の切断は、プロドメインと成熟増殖因子の間の保存されたＲＸＸＲ部位で切断する、フューリン／ＰＡＣＥ３（Ｐａｉｒｅｄ Ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ３）またはＰＣＳＫ５（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ５）などのプロタンパク質転換酵素によって行われる。この切断によって、潜在的複合体が産生され、この中で成熟増殖因子は、プロドメインによりその受容体に対する結合から遮蔽されている。トロイドプロテアーゼの起こり得る阻害を説明し、プロミオスタチンのさらなる切断の遮断を説明する、図３Ｂを参照されたい。活性増殖因子の活性化および放出は、ＴＬＬ－２（トロイド様タンパク質２）またはＢＭＰ１（骨形成タンパク質１）などのＢＭＰ／トロイドファミリーのさらなるプロテアーゼによる切断後に達成される。
図４は、細胞ベースのレポーターアッセイにおける親Ａｂ１抗体および他の候補の性能を示す。プロタンパク質転換酵素およびトロイドプロテアーゼファミリーの両方からの酵素とのタンパク質分解反応を終夜行った後、２９３Ｔ細胞におけるＣＡＧＡ系レポーターアッセイによって成熟増殖因子の放出を測定した。結果を対照反応と比較し、アッセイ中に放出されたプロミオスタチンまたはプロＧＤＦ１１の割合を計算した。３回の複製の平均値の標準偏差を示すが、値が小さいために、ほとんどのデータ点についてグラフ上で見えない。
図５は、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６抗体がプロＧＤＦ１１活性化を阻害しないことをグラフで示す。
図６は、平均体重変化率を評価するアッセイの結果を示す。動物の体重を毎日測定して、０日目からの体重変化率を算出した。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。試験４２日目の各群の平均変化率データを、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ＰＢＳ対照群との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して分析した。＊＊ｐ＜０．０１。
図７Ａ～７Ｄは、組織重量を評価するアッセイの結果を示す。図７Ａは、平均腓腹筋重量を示す。図７Ｂは、平均胸筋重量を示す。図７Ｃは、平均ヒラメ筋重量を示す。図７Ｄは、平均三頭筋重量を示す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ビヒクル対照群（群１）との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して行った。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１。棒グラフは、左から右に群１～５を示す。
図８Ａ～８Ｃは、組織重量を評価するアッセイの結果を示す。図８Ａは、平均前脛骨筋重量を示す。図８Ｂは、平均横隔膜重量を示す。図８Ｃは、平均四頭筋重量を示す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ビヒクル対照群（群１）との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して行った。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。棒グラフは、左から右に群１～５を示す。
図９Ａ～９Ｂは、平均体重変化率および平均除脂肪量変化率を評価するアッセイの結果を示す。図９Ａは、試験を通して週に２回体重測定した動物において算出された０日目からの体重変化率を示すグラフである。図９Ｂにおいて、－４、７、１４、２１、および２８日目に身体組成を測定するために、動物にＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）を実施して、０日目からの除脂肪量変化率を算出した。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。体重および除脂肪量の両方に関して、試験２８日目での各群の平均変化率データを、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ＩｇＧ対照群（群２）との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して分析した。＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ（有意ではない）。
図１０Ａ～１０Ｄは、筋重量を評価するアッセイの結果を示すグラフである。図１０Ａは平均四頭筋重量を示し、図１０Ｂは平均腓腹筋重量を示し、図１０Ｃは平均前脛骨筋重量を示し、図１０Ｄは平均横隔膜重量を示す。ＩｇＧ対照群と比較してＡｂ１処置群の平均筋重量の差の百分率を、それぞれの棒グラフの上に記す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ＩｇＧ対照群（群２）との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して行った。データは群の平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ（有意ではない）。 図１０Ａ～１０Ｄは、筋重量を評価するアッセイの結果を示すグラフである。図１０Ａは平均四頭筋重量を示し、図１０Ｂは平均腓腹筋重量を示し、図１０Ｃは平均前脛骨筋重量を示し、図１０Ｄは平均横隔膜重量を示す。ＩｇＧ対照群と比較してＡｂ１処置群の平均筋重量の差の百分率を、それぞれの棒グラフの上に記す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、ＩｇＧ対照群（群２）との比較においてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ事後検定を使用して行った。データは群の平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ（有意ではない）。
図１１Ａ～１１Ｂは、平均体重変化率および平均除脂肪量変化率を評価するアッセイの結果を示す。図１１Ａは、試験を通して週に２回体重測定した動物から算出された０日目からの体重変化率を示す。（図１１Ｂ）－１、６、および１３日目に身体組成を測定するために、動物にＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）を実施して、－１日目からの除脂肪量変化率を算出した。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体およびＡｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。１４日目（体重に関して）および１３日目（除脂肪量に関して）での各群の平均変化率データを、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５）および群５（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１、＋＋＋ｐ＜０．０００５、＋＋ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５）に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して分析した。ｎｓ（有意ではない）。
図１２Ａ～１２Ｄは、異なる筋重量を評価するアッセイの結果を示すグラフである。図１２Ａは平均腓腹筋重量（グラム）を示し、図１２Ｂは平均四頭筋重量（グラム）を示し、図１２Ｃは、ＰＢＳ（ＩＰ）および通常の飲料水（群１）で処置した対照動物と比較した平均腓腹筋重量変化率を示し、図１２Ｄは、ＰＢＳ（ＩＰ）および通常の飲料水（群１）で処置した対照動物と比較した平均四頭筋重量変化率を示す。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体およびＡｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。図１２Ａ～１２Ｂに関して、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。図１２Ｃ～１２Ｄに関して、エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５）および群５（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１、＋＋＋ｐ＜０．０００５、＋＋ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５）に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して行った。ｎｓ（有意ではない）。棒グラフは左から右に、ＰＢＳ、水；ＰＢＳ、ｄｅｘ；ＩｇＧ対照；Ａｂ１（２０）；およびＡｂ１（２）を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、異なる筋重量を評価するアッセイの結果を示すグラフである。図１２Ａは平均腓腹筋重量（グラム）を示し、図１２Ｂは平均四頭筋重量（グラム）を示し、図１２Ｃは、ＰＢＳ（ＩＰ）および通常の飲料水（群１）で処置した対照動物と比較した平均腓腹筋重量変化率を示し、図１２Ｄは、ＰＢＳ（ＩＰ）および通常の飲料水（群１）で処置した対照動物と比較した平均四頭筋重量変化率を示す。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体およびＡｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。図１２Ａ～１２Ｂに関して、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。図１２Ｃ～１２Ｄに関して、エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５）および群５（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１、＋＋＋ｐ＜０．０００５、＋＋ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５）に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して行った。ｎｓ（有意ではない）。棒グラフは左から右に、ＰＢＳ、水；ＰＢＳ、ｄｅｘ；ＩｇＧ対照；Ａｂ１（２０）；およびＡｂ１（２）を示す。
図１３Ａ～１３Ｂは、平均体重変化率および平均除脂肪量変化率を評価するアッセイの結果を示す。図１３Ａは、試験を通して週に２回体重測定した動物に関して算出した０日目からの体重変化率を示す。図１３Ｂは、－１、７、および１４日目に身体組成を測定するためにＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）を実施した動物から算出した－１日目からの除脂肪量変化率を示す。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体およびＡｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。データは、群の平均値±ＳＥＭを表す。
図１４Ａ～１４Ｄは、筋重量を評価するアッセイの結果を示す。図１４Ａは、ギプス固定した脚からの平均腓腹筋重量（グラム）を示し、図１４Ｂは、ギプス固定した脚からの平均四頭筋重量（グラム）を示し、図１４Ｃは、ＰＢＳ（ＩＰ）で処置して、ギプス固定していない対照動物（群１）と比較した平均腓腹筋重量変化率を示し、図１４Ｄは、ＰＢＳ（ＩＰ）で処置して、ギプス固定していない対照動物（群１）と比較した平均四頭筋重量変化率を示す。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体、Ａｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。図１４Ａ～１４Ｂに関して、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。図１４Ｃ～１４Ｄに関して、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５）および群５（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１、＋＋＋ｐ＜０．０００５、＋＋ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５）に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して行った。ｎｓ（有意ではない）。棒グラフは左から右へ、ＰＢＳ、非ギプス固定；ＰＢＳ、ギプス固定；ＩｇＧ対照（２）、ギプス固定；Ａｂ１（２０）、ギプス固定；Ａｂ１（２）、ギプス固定を示す。 図１４Ａ～１４Ｄは、筋重量を評価するアッセイの結果を示す。図１４Ａは、ギプス固定した脚からの平均腓腹筋重量（グラム）を示し、図１４Ｂは、ギプス固定した脚からの平均四頭筋重量（グラム）を示し、図１４Ｃは、ＰＢＳ（ＩＰ）で処置して、ギプス固定していない対照動物（群１）と比較した平均腓腹筋重量変化率を示し、図１４Ｄは、ＰＢＳ（ＩＰ）で処置して、ギプス固定していない対照動物（群１）と比較した平均四頭筋重量変化率を示す。ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＩｇＧ（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＩｇＧ対照抗体、Ａｂ１（２０）＝２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体、Ａｂ１（２）＝２ｍｇ／ｋｇ／週で投与したＡｂ１抗体。図１４Ａ～１４Ｂに関して、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。図１４Ｃ～１４Ｄに関して、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５）および群５（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１、＋＋＋ｐ＜０．０００５、＋＋ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５）に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して行った。ｎｓ（有意ではない）。棒グラフは左から右へ、ＰＢＳ、非ギプス固定；ＰＢＳ、ギプス固定；ＩｇＧ対照（２）、ギプス固定；Ａｂ１（２０）、ギプス固定；Ａｂ１（２）、ギプス固定を示す。
図１５は、２１日目（右上）および２８日目（左上）での除脂肪量変化を評価するアッセイの結果を示す。この図はまた、試験した抗体の３つの異なる用量、２０ｍｇ／ｋｇ／週（左下）、２ｍｇ／ｋｇ／週（中央下）、および０．５ｍｇ／ｋｇ／週（右下）、ＰＢＳ対照、ならびにＩｇＧ対照の除脂肪量変化率も示す。統計学的評価は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、群１（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）およびＩｇＧ対照に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較試験を使用して行った。上の２つのパネルに関して、棒グラフは左から右へ、ＰＢＳ；ＩｇＧ対照、２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２ｍｇ／ｋｇ／週；およびＡｂ６ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週である。左下のパネル（２０ｍｇ／ｋｇ／週）についてデータ点は投与２８日後に対応し、上から下へＡｂ１、Ａｂ４、Ａｂ２、Ａｂ６、ＩｇＧ対照、およびＰＢＳに対応する。中央下のパネル（２ｍｇ／ｋｇ／週）についてデータ点は投与２８日後に対応し、上から下へＡｂ２、Ａｂ１、Ａｂ６、Ａｂ４、ＩｇＧ対照、およびＰＢＳに対応する。右下のパネル（０．５ｍｇ／ｋｇ／週）についてデータ点は投与２８日後に対応し、上から下へＩｇＧ対照、Ａｂ１、Ａｂ２、ＰＢＳ、Ａｂ４、およびＡｂ６に対応する。
図１６Ａ～１６Ｂは、ミオスタチン前駆体型のドメイン構造および評価を示す。図１６Ａは、プロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンのドメイン構造を示し、プロテアーゼ切断部位を示す。図１６Ｂは、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて泳動させた、部分的プロタンパク質転換酵素切断プロミオスタチンを示す。還元条件下では、タンパク質バンドは、プロミオスタチンモノマー（約５０ｋＤ）、プロドメイン（約３７ｋＤ）および増殖因子（１２．５ｋＤ）からなった。
図１７Ａ～１７Ｂは、Ａｂ１がミオスタチンに対して特異的であることを示す。図１７Ａは、Ａｂ１がプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンに特異的に結合することを示し、ＴＧＦＢスーパーファミリーの他のメンバー、特にＧＤＦ１１の対応する型に対する結合は観察されなかった。Ａｂ１を、表記の抗原でコーティングされたＦｏｒｔｅ－Ｂｉｏ ＢＬＩチップに高濃度（５０ｕｇ／ｍＬ）で投与して、オンレートおよびオフレートを測定して、およそのＫｄ値を得た。結合事象を示すバイオセンサー応答の大きさを、黒色の棒グラフによってグラフ表示し、算出されたＫｄをオレンジ色で示す。図１７Ｂは、Ａｂ１がプロミオスタチンの活性化を遮断するが、プロＧＤＦ１１は遮断しないことを示している。プロタンパク質転換酵素およびトロイドプロテアーゼファミリーの両方からの酵素によって一晩タンパク質分解反応を行った後、２９３Ｔ細胞においてＣＡＧＡベースのレポーターアッセイを使用して成熟増殖因子の放出を測定した。結果を対照反応と比較して、アッセイにおいて放出されたプロミオスタチンまたはプロＧＤＦ１１の割合を算出した。
図１８Ａ～１８Ｃは、候補抗体によるＳＣＩＤ用量反応を示す。図１８Ａは腓腹筋重量を示し、図１８Ｂは四頭筋重量を示す。図１８ＣはＰＢＳ対照と比較した平均筋重量変化率を示す。図１８Ａ～１８Ｂの棒グラフは左から右へＰＢＳ；ＩｇＧ対照２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２ｍｇ／ｋｇ／週；およびＡｂ６ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週である。 図１８Ａ～１８Ｃは、候補抗体によるＳＣＩＤ用量反応を示す。図１８Ａは腓腹筋重量を示し、図１８Ｂは四頭筋重量を示す。図１８ＣはＰＢＳ対照と比較した平均筋重量変化率を示す。図１８Ａ～１８Ｂの棒グラフは左から右へＰＢＳ；ＩｇＧ対照２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ１ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ２ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ２ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ４ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２０ｍｇ／ｋｇ／週；Ａｂ６ ２ｍｇ／ｋｇ／週；およびＡｂ６ ０．５ｍｇ／ｋｇ／週である。
図１９は、Ａｂ１を既存のミオスタチン抗体（ＡｂＭｙｏ）と比較する、作用試験の持続時間の結果を示す。ＰＢＳを陰性対照として使用した。ＩｇＧを陽性対照として使用した。除脂肪量の変化を異なる投与プロトコールに従って２１日後に調べた。
図２０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでミオスタチン活性化を再構成するアッセイを説明する概略図である。
図２１Ａ～２１Ｂは、セリンがプロリンに置換されたＩｇＧ４サブタイプのヒト化モノクローナル抗体（Ａｂ２）の重鎖（図２１Ａ、配列番号５０）および軽鎖（図２１Ｂ、配列番号５１）を示す。これはＩｇＧ１様ヒンジ配列を生成し、ＩｇＧ４の特徴である鎖間ジスルフィド架橋の不完全な形成を最小限にする。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示す。太字で示したＮＳＴ配列、Ｎ－結合グリコシル化コンセンサス配列部位、太字で示したＤＰ配列は起こり得る切断部位である。ＸがＳ、Ｔ、またはＧであってよい太字で示したＮＸ配列は起こり得る脱アミド化部位である。ＸがＧ、Ｓ、Ｔ、またはＳＤＧであってよい太字で示したＤＸ配列は起こり得る異性化部位である。太字で示したメチオニンは起こり得るメチオニン酸化部位である。太字で示したＱは予想されるＮ末端ピログルタミン酸である。
図２２は、生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）による免疫原性リスクの低減を示す概略図である。２４Ｈ４（ＷＴ）は、概略図に示すように、フレームワーク領域内に５つの非生殖系列アミノ酸を含有する。
図２３Ａ～２３Ｃは、Ａｂ１の最適化を示す。プロミオスタチンに特異的に結合する最適化された候補を選択して、それによって親和性が増加した何ダースものクローンを得た。Ａｂ１（図２３Ａ）と比較して酵母クローン（図２３Ｂ）の結合の増加を示すために、ＦＡＣＳを実施した。図２３Ｃは、親和性成熟改変体が、同様にｏｃｔｅｔによってより遅いオフレートを有することを示している。 図２３Ａ～２３Ｃは、Ａｂ１の最適化を示す。プロミオスタチンに特異的に結合する最適化された候補を選択して、それによって親和性が増加した何ダースものクローンを得た。Ａｂ１（図２３Ａ）と比較して酵母クローン（図２３Ｂ）の結合の増加を示すために、ＦＡＣＳを実施した。図２３Ｃは、親和性成熟改変体が、同様にｏｃｔｅｔによってより遅いオフレートを有することを示している。
図２４Ａ～２４Ｂは、親Ａｂ１の可変重鎖領域（図２４Ａ）および可変軽鎖領域（図２４Ｂ）と、親和性最適化改変体Ａｂ３およびＡｂ５との配列アラインメントを示す。配列識別子は、上から下に配列番号２４、２６、２８に対応する（図２４Ａ）。配列識別子は、上から下に配列番号３０、３２、３４に対応する（図２４Ｂ）。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ（下線）およびＩＭＧＴ命名法（太字）を使用して定義する。親Ａｂ１からの置換を薄い灰色で示す。
図２５は、正常マウスおよび萎縮症マウスからの筋肉および血漿中のプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンの発現を示す。
図２６は、筋肉および血漿中のプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンの変化の定量を示す。棒グラフは左から右へプロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、プロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、および潜在型ミオスタチンを示す。
図２７は、Ａｂ２がプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンを特異的に認識し、血清および筋肉の両方でミオスタチンの主な形態と結合することを示す。プロドメイン（暗灰色）および成熟増殖因子（明灰色）についての非還元性ウェスタンブロット。組換えプロミオスタチン（ｒプロミオスタチン）はゲル上で、矢印で強調したプロミオスタチンおよびミオスタチンプロドメイン（潜在型ミオスタチン）の移動を示す。血清では、Ａｂ２とＡｂＭｙｏの両方が潜在型ミオスタチン（プロドメインバンド）および多重部分処理前駆体に結合するが、Ａｂ２のみがプロミオスタチンを認識する（上のバンド）。筋肉では、Ａｂ２はプロミオスタチンを沈降させ、筋肉組織ではＡｂＭｙｏとプロミオスタチンとの相互作用はない。
図２８Ａ～２８Ｂは、正常筋肉と萎縮筋肉におけるミオスタチンのフラックスのモデルを提供する。正常筋肉（図２８Ａ）では、筋肉中でプロミオスタチンが産生され、フューリンプロテアーゼによる切断を介して潜在型ミオスタチンに転換され、これは細胞の内部または外部のいずれかで起こり得る。次いで筋肉中の潜在型ミオスタチンのある割合が循環系に放出され、潜在型ミオスタチンの循環プールを形成する。筋萎縮症（図２８Ｂ）では、活性ミオスタチン増殖因子の増加が、筋肉中のプロミオスタチンの上方調節および潜在型ミオスタチンの活性増殖因子への転換の増加によって引き起こされる。その結果、潜在型ミオスタチンの筋肉プールがｍＴＬＬ２切断によって成熟ミオスタチンの形成へと再指向されると共に、潜在型ミオスタチンの循環が減少する。
図２９は、投与したラットの血清中のＡｂ２（上の線）およびＩｇＧ対照（下の線）抗体の検出を示す。Ａｂ２はＩｇＧ対照と比較して循環系中でレベルの増加を示し、試験の最後には血清中のＡｂ２の平均が１７．１μｇ／ｍｌとなった。Ａｂ２レベルは参照基準として用いた既知量の各抗体と共に、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。
図３０Ａ～３０Ｂは、処置したラットにおけるＡｂ２の薬力学的効果を示す。図３０Ａは、Ａｂ２で処置したラットがＰＢＳまたはＩｇＧ対照で処置した動物と比較して増加した除脂肪量を示すことを示す。Ａｂ２およびＩｇＧは０日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。除脂肪量は投与の７、１４、２１および２８日後にｑＮＭＲ（群あたりＮ＝８）で測定した。図３０Ｂは、試験の最後に全ての群から（群あたりＮ＝８）大腿直筋および前脛骨筋を採取し、秤量して筋肉量を測定したことを示す。Ａｂ２で処置したラットは大腿直筋量および前脛骨筋量がそれぞれ１４％および１１％増加したことを示す。
図３１Ａ～３１Ｂは、Ａｂ２で処置したラットにおけるプロ／潜在型ミオスタチンのレベルを示す。図３１Ａは、Ａｂ２による処置（上の線）によってラット血清中の潜在型ミオスタチンレベルが約２０倍に増加することを示す。図３１Ｂは、ラットの筋肉（大腿直筋）においてミオスタチンの潜在型がＡｂ２処置によって１．９倍に増加することを示す。左から右へのバーは、プロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、プロミオスタチン、および潜在型ミオスタチンに対応する。ラット筋肉においてはプロミオスタチンの統計学的に有意な変化は観察されない。これらのデータは群あたり試料数ｎ＝３とした定量的ウェスタン解析によるものである。
図３２は、Ａｂ２による処置（Ａｂ２）またはコンパレーター抗体（ＡｂＭｙｏ）による処置によって抗体投与の７日後と早く除脂肪量が増加することを示す。除脂肪量の増加はＡｂ２とＡｂＭｙｏについて投与の２１日後まで同等である。しかし投与の２８日後までに、除脂肪量の増加はＡｂＭｙｏ処置群では失われるが、Ａｂ２処置群における増加は試験の経過を通して維持されている。上の線はＡｂ２に対応し、中間の線はＡｂＭｙｏに対応し、下の線はＩｇＧ対照に対応している（５ｍｇ／ｋｇ）。
図３３は、Ａｂ２（上の線）またはコンパレーター抗体（ＡｂＭｙｏ；下の線）の５ｍｇ／ｋｇの単回投与の後、抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して薬物の血清中レベルを測定したことを示す。薬物は血清中に投与の１時間後と早く検出され、両方の抗体の１μｇ／ｍｌを超えるレベルが試験を通して検出できる。しかし、Ａｂ２はＡｂＭｙｏよりも有意に長い半減期および推測曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）を示し、同様の用量でＡｂ２はＡｂＭｙｏよりも有意に大きな曝露を示すことが示唆される。
図３４は、薬物処置したマウスおよび対照において蛍光ウェスタンブロットを使用して血清ミオスタチンを測定したことを示す。Ａｂ２の血清曝露が増加したにも関わらず、Ａｂ２およびＡｂＭｙｏで処置した両方のマウスにおける血清中潜在型ミオスタチンレベルは同様であった。これらのデータは、遊離薬物の循環レベルは標的のレベルに対して十分に過剰であるので、Ａｂ２の血清曝露が増加してもＡｂＭｙｏ群で観察されたよりも大きな循環潜在型ミオスタチンの増加はもたらされないことを示唆している。データの群は左から右へＩｇＧ、Ａｂ２、ＡｂＭｙｏ、ＩｇＧ、Ａｂ２、およびＡｂＭｙｏに対応している。
図３５Ａ～３５Ｂは、潜在型およびプロミオスタチンの相対的レベルをマウス筋肉溶解物において蛍光ウェスタンブロットで測定したことを示す。図３５Ａは、潜在型ミオスタチンがＡｂ２およびＡｂＭｙｏ処置筋肉で上昇することを示す。しかし、ＡｂＭｙｏ処置筋肉における潜在型ミオスタチンの上昇は２８日目までにベースラインに戻る一方、Ａｂ２処置筋肉の潜在型ミオスタチンは少なくともこの時までは上昇したままである（ＡｂＭｙｏ処置に対してＰ＜０．００３）。図３５Ｂはプロミオスタチンについても同様の傾向が観察されることを示しているが、２８日目におけるＡｂ２とＡｂＭｙｏ処置群の間の差異は統計学的に有意ではない（Ｐ＝０．０６８）。
図３６Ａは、マウスの筋肉量および機能に対するＡｂ２処置の効果を示す。図３６Ｂは、マウスの最大力発生に対するＡｂ２処置の効果を示す。
詳細な記載
ミオスタチンは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、２個のメンバー：ミオスタチン（ＧＤＦ８としても公知）およびＧＤＦ１１を含むサブファミリーに属している。ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーと同様に、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１は、両方とも不活性前駆体ポリペプチド（それぞれプロミオスタチンおよびプロＧＤＦ１１と呼ばれる）として最初発現される。ドメイン構造および命名法は図１Ａに示されている。図１Ｂは、成熟増殖因子が「潜在型ラッソ（ｌａｔｅｎｃｙ ｌａｓｓｏ）」と呼ばれるループによって繋がれた２個のアルファヘリックスから構成されるケージに閉じ込められているプロミオスタチンの全体構造のカートゥーンモデルを例示する。
成熟増殖因子の活性化および放出は、図２に概説する数個の別々のプロテアーゼ切断事象によって達成される。プロミオスタチンおよびプロＧＤＦ１１の第１の切断ステップは、プロドメインと成熟増殖因子との間の保存されたＲＸＸＲ部位で切断するプロタンパク質転換酵素によって実行される。この切断は、成熟増殖因子がプロドメインによってその受容体への結合から遮蔽されている潜在型複合体を生じる。成熟、活性ミオスタチン増殖因子の活性化および放出は、ｍＴＬＬ－２などのＢＭＰ／トロイドファミリー由来の追加的プロテアーゼによる切断後に達成される（図２）。
ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルにおける例示的プロＧＤＦ８配列は下に提供される。これらのプロＧＤＦ８配列において、プロタンパク質転換酵素切断部位は、太字で示され、トロイドプロテアーゼ部位は下線で示される。いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、配列番号５２～５５のアミノ酸残基２４０から２４３を含む。いくつかの実施形態ではトロイドプロテアーゼ部位は、配列番号５２～５５のアミノ酸残基７４～７５を含む。本明細書で提供される例示的プロＧＤＦ８配列が限定的であることを意図せず、他の種由来の追加的プロＧＤＦ８配列が、その任意のアイソフォームを含め、本開示の範囲内であることは理解されるべきである。
Figure 0007418508000001
Figure 0007418508000002
ミオスタチンおよびＧＤＦ１１は、９０パーセントの同一性を有してそれらの成熟増殖因子ドメイン間で比較的高い程度の保存を共有するが、それらのプロドメイン領域では２
個の間で５０パーセント未満のアミノ酸同一性であり、十分に保存されていない。ミオスタチンおよびＧＤＦ１１は、ＩＩ型受容体（ＡＣＴＲＩＩＡ／Ｂ）と会合しているＩ型受容体（ＡＬＫ４／５）からなる同じ受容体に結合し、それを通じてシグナル伝達する。Ｉ型およびＩＩ型受容体とのミオスタチンの会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、ＳＭＡＤリン酸化および筋萎縮症遺伝子の転写活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始させる。成熟増殖因子における比較的高い程度の保存は、成熟ミオスタチンとＧＤＦ１１とを区別できるモノクローナル抗体などの試薬を同定することを困難なものにしている。
いくつかの実施形態では増殖因子ドメインおよびＧＤＦ１１のＮ末端プロペプチド部分およびＧＤＦ８のプロペプチドのＣ末端部分を含有するキメラ構築物に特異的に結合するプロ／潜在型ミオスタチン抗体が本明細書で提供される。以下に記載するこのキメラ構築物はＧＤＦ１１Ａｒｍ８と称される。
Figure 0007418508000003
ミオパチーにおけるミオスタチンの役割
骨格筋は、体重のおよそ４０％を占め、動的器官であり、１日あたり１～２％の割合で代謝回転する。筋萎縮症は、非活動性期間中に（例えば非活動性萎縮症）および／または増大した全身性炎症（悪液質）に応答して生じる高度に制御された異化工程である。床上安静中などの長期の固定期間中に生じる場合がある非活動性萎縮症では、筋肉喪失が急速に生じる。例えば１週間の入院中に平均的患者は約１．３ｋｇの筋肉量を失う。
筋萎縮症は、幅広い臨床状態において顕著な病的状態を生じる。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のような脱神経の疾患および筋ジストロフィーを含む遺伝疾患では、筋力および機能の喪失は適切な処置がない高度に身体障害性の臨床症状発現である。腎不全、ＡＩＤＳ、心臓の状態またはがんによる悪液質症候群では、筋消耗は原発性状態の処置の成功をしばしば台無しにする。筋肉喪失は、加齢の自然な経過としても生じ、その最も重症の形態は、筋肉減少症、治療介入を必要とする病的状態としてますます認識されるようになっている高齢者における広汎性の状態として分類されている。最後に、筋萎縮症を進行させる大きな要因は非活動性である。固定は、股関節骨折、待機的人工関節置換術、脊髄損傷、救命医療ミオパチーおよび発作などの状態の大きな群において急速で顕著な筋肉喪失を生じる。それらの原因は様々だが、これらの徴候は顕著な身体障害、長い身体のリハビリテーションおよび回復時間ならびに生活の質の低下をもたらす筋脱力の特徴を共有する。
筋萎縮症状態に関する医学的必要性は満たされていない。したがって、筋萎縮症を処置するために、いくつかの実施形態において方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では本明細書で提供される方法は、原発性ミオパチーの処置に関する。いくつかの実
施形態では本明細書で提供される方法は、例えば脱神経、遺伝性筋脱力および悪液質の疾患、筋肉喪失が疾患病態に続発する状態などの二次性ミオパチーの処置に関する。いくつかの実施形態では、非活動性萎縮症（例えば股関節骨折または脊髄損傷（ＳＣＩ）に関連する）などの原発性ミオパチーの処置のために本明細書で提供される方法は、被験体において筋肉量、強度および機能の増加を生じる。
ミオスタチン経路阻害
筋肉関連状態の処置に向けて臨床開発の種々の段階にあるいくつかのミオスタチン経路アンタゴニストがある。そのような経路アンタゴニストは、成熟増殖因子またはそのＩＩ型受容体のいずれかを標的化し、大部分は複数のＴＧＦβファミリーメンバーのシグナル伝達に拮抗する。例えばいくつかの現在の臨床候補は、それぞれ生殖生物学、創傷治癒、赤血球生成および血管形成の制御因子である、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１ならびにＢＭＰ９および１０などの追加的増殖因子を遮断する。本開示の態様は、ミオスタチンに加えてこれらの因子を遮断することが、容認できない副作用のために安全に治療を受けられる患者の集団を限定している可能性があるという認識に関する。
したがって、プロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチンに結合でき、それによりミオスタチン活性を阻害する抗体ならびにミオパチーを伴う疾患および障害を処置するためのその使用が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、循環中の潜在的複合体が優勢であることを考慮して、成熟増殖因子よりむしろ、より豊富でより長く存在するミオスタチン前駆体、例えばプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンを特異的に標的化する処置が本明細書で提供される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本明細書で提供される抗体は、例えばＩ型（ＡＬＫ４／５）およびＩＩ型（ＡＣＴＲＩＩＡ／Ｂ）受容体に結合することによって、ミオスタチン経路を活性化できるミオスタチンの「活性」形態と考えられる成熟ミオスタチンへのタンパク質分解を介したプロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチンの活性化を妨げることができる。
本明細書において使用される場合、用語「プロ／潜在型ミオスタチン」は、プロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、またはその両方を指す。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体はプロミオスタチンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は潜在型ミオスタチンとプロミオスタチンの両方に特異的に結合する。本明細書において「潜在型ミオスタチン」および「プロミオスタチン」は、それぞれ「潜在型ＧＤＦ８」および「プロＧＤＦ８」をも意味することを認識されたい。
本明細書において使用される場合、用語「成熟ミオスタチン」は、ミオスタチンの成熟した、生物学的に活性な形態を指す。いくつかの実施形態では成熟ミオスタチンは、ミオスタチン受容体結合および／または活性化が可能である。そのプロミオスタチン型からのｉｎ ｖｉｖｏにおける成熟ミオスタチンの活性化および放出は、いくつかの別々のプロテアーゼ切断事象によって達成される。初めに、「プロミオスタチン」がプロタンパク質転換酵素によって切断され、「潜在型ミオスタチン」が生じ、ここで成熟ミオスタチンはプロドメインの一部によって受容体への結合が遮断されている。成熟ミオスタチンの活性化および放出は、ｍＴＬＬ－２などのＢＭＰ／トロイドファミリー由来の追加的プロテアーゼによる潜在型ミオスタチンの切断後に達成される。例えば図１Ａ、１Ｂおよび２を参照されたい。本明細書において使用される場合、用語「成熟ミオスタチン」は、全長の成熟ミオスタチンならびに全長の成熟ミオスタチンの生物学的活性を保持した断片の両方を指す。例示的な成熟ミオスタチン配列、その変異体、および成熟ミオスタチンを産生する方法は当技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載されている。
用語「プロミオスタチン」は「プロＧＤＦ８」としても知られているが、ジスルフィド連結ホモダイマーを含む成熟ミオスタチンの不活性前駆体を指し、ホモダイマーのそれぞれの分子はカルボキシル末端成熟ミオスタチンドメインに共有結合したアミノ末端プロドメインを含む。一実施形態では「プロミオスタチン」は、プロタンパク質転換酵素またはＢＭＰ／トロイドファミリーのプロテアーゼのいずれによっても切断されていない。例示的なプロミオスタチン配列、その変異体、およびプロミオスタチンを産生する方法は当技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載されている。
本明細書において使用される場合、用語「潜在型ミオスタチン」は、ジスルフィド連結ホモダイマーを含む成熟ミオスタチンの不活性前駆体を指し、ホモダイマーのそれぞれの分子はカルボキシル末端成熟ミオスタチンドメインに非共有結合したアミノ末端プロドメインを含む。一実施形態では「潜在型ミオスタチン」は、プロタンパク質転換酵素によって切断されたが、ＢＭＰ／トロイドファミリーのプロテアーゼによっては切断されていないプロミオスタチンから産生される。別の実施形態では「潜在型ミオスタチン」は、プロドメインとカルボキシ末端成熟ミオスタチンドメインをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせ、これらを適当に折り畳むようにさせることによって産生することができる。例えばSengleら、J. Biol.Chem.、２８６巻（７号）：５０８７～５０９９頁、２０１１年を参照されたい。例示的な潜在型ミオスタチン配列、その変異体、および潜在型ミオスタチンを産生する方法は当技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載されている。
本明細書において使用される場合、用語「プロ／潜在型ミオスタチン」は、プロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、またはプロミオスタチンと潜在型ミオスタチンの両方を指す。一実施形態では本明細書に開示される抗体はプロミオスタチンに結合する。別の実施形態では本明細書に開示される抗体は潜在型ミオスタチンに結合する。別の実施形態では本明細書に開示される抗体はプロミオスタチンと潜在型ミオスタチンに結合する。
本明細書において使用される場合、用語「純プロミオスタチン」または「純プロＧＤＦ８」は、潜在型ミオスタチンおよび成熟ミオスタチンなどの他の形態のミオスタチンを含んでいないか、実質的に含んでいないプロミオスタチンを含む組成物を指す。一実施形態では本明細書に開示される抗体は、純プロミオスタチンに特異的に結合する。換言すれば、そのような抗体は他の形態のミオスタチン、潜在型ミオスタチンおよび成熟ミオスタチンの欠如する組成物中のプロミオスタチンに結合する。
本明細書において使用される場合、用語「プロタンパク質転換酵素切断部位」は、プロミオスタチンがプロタンパク質転換酵素によって切断される部位を指す。一実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、プロドメインと生物学的に活性なドメイン、即ち成熟ミオスタチンの間の保存されたＲＸＸＲ部位である。例えば図１Ａ、１Ｂ、および２を参照されたい。
本明細書において使用される場合、用語「ＢＭＰ／トロイドプロテアーゼファミリー切断部位」は、潜在型ミオスタチンがＢＭＰ／トロイドプロテアーゼファミリーメンバーによって切断される部位を指す。一実施形態ではＢＭＰ／トロイドプロテアーゼファミリーメンバーはｍＴＬＬ－２である。例えば図１Ａ、１Ｂ、および２を参照されたい。
プロ／潜在型ミオスタチンに結合する抗体
本開示は、ある特定のプロ／潜在型ミオスタチン特異的抗体（例えば本明細書でＡｂ１と称される抗体）が、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの成熟ミオスタチンへの活性化を妨げたという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。さらにそのような抗体を使用するミオスタチン活性化の阻害は、デキサメタゾンおよびギプス固定誘導筋萎縮症マウスモデルの両方において筋肉量の増加に有効であった。本開示の態様
は、プロ／潜在型ミオスタチンに結合し、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの成熟ミオスタチンへの活性化を阻害する抗体（例えば抗体および抗原結合性断片）を提供する。
抗体（複数形と互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、インタクト（例えば全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合性断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）ならびに抗体のグリコシル化改変体、抗体のアミノ酸配列改変体および共有結合的に改変された抗体を含む求められる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構成も包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭなどの任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体を含み、抗体はいずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは様々なクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５個の主なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知である。
用語「単離された抗体」は、本明細書において使用される場合、異なった抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する単離された抗体は、プロ／潜在型ミオスタチン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのプロ／潜在型ミオスタチン分子などの他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は他の細胞性材料および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。
用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列およびその断片に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本開示のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３におけるヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでもよい（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異によって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入される変異）。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことを意図していない。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態ではエピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面群を含み、ある特定の実施形態では特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有してよい。エピトープは抗体が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では抗体が、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗体は抗原に特異的に結合すると称される。
本明細書に記載の抗体は、プロ／潜在型ミオスタチンに結合でき、それによりタンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの成熟ミオスタチンへの活性化を阻害する。い
くつかの場合では本明細書に記載の抗体は、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性化を少なくとも２０％、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高く阻害できる。いくつかの場合では本明細書に記載の抗体は、プロタンパク質転換酵素（例えばフューリン）によるタンパク質分解を介したプロミオスタチンの切断を少なくとも２０％、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高く阻害できる。いくつかの場合では本明細書に記載の抗体は、トロイドプロテアーゼ（例えばｍＴＬＬ２）によるタンパク質分解を介したプロミオスタチンまたは潜在型ミオスタチンの切断を少なくとも２０％、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高く阻害できる。抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の阻害活性は、日常的方法によって、例えば実施例１および図３に記載のウエスタンブロット分析によって測定され得る。しかし、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの切断への抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の阻害活性を測定するために追加的方法が使用され得ることは理解されるべきである。いくつかの実施形態ではプロ／潜在型ミオスタチン切断（例えばプロタンパク質転換酵素および／またはトロイドプロテアーゼによる）の阻害は、阻害剤効力の尺度を提供し、プロテアーゼ（例えばプロタンパク質転換酵素またはトロイドプロテアーゼの）活性を半分に低減するために必要な阻害剤（例えば抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体）の濃度であり、酵素または基質濃度に依存しない阻害定数（Ｋｉ）として反映され得る。
いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素は（ｉ）プロタンパク質転換酵素切断部位を含有するタンパク質のペプチド結合を加水分解する触媒ドメイン、および（ｉｉ）プロタンパク質転換酵素切断部位を有するｒＴＧＦに結合する結合ポケットを含む。本開示による使用のためのプロタンパク質転換酵素の例は、非限定的にＰＣＳＫ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＡＣＥ７およびＰＡＣＥ３（例えばフューリン）を含む。プロタンパク質転換酵素は、いくつかの実施形態では、非限定的にヒト、サルまたはげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター）を含む任意の哺乳動物から得られる。
いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素は、ＰＣＳＫ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＡＣＥ７およびＰＡＣＥ３（例えばフューリン）からなる群より選択されるプロタンパク質転換酵素に相同性である。例えばプロタンパク質転換酵素は、ＰＣＳＫ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＡＣＥ７またはＰＡＣＥ３（例えばフューリン）と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一であってよい。
プロタンパク質転換酵素切断部位は、いくつかの実施形態では、プロタンパク質転換酵素（例えばＰＣＳＫ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＡＣＥ７およびＰＡＣＥ３）によって切断され得るアミノ配列である。いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、アミノ酸配列Ｒ－Ｘ－Ｘ－Ｒを含み、式中Ｒはアルギニンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、アミノ酸配列Ｒ－Ｘ－（Ｋ／Ｒ）－Ｒを含み、式中Ｒはアルギニンであり、Ｋはリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、Ｒ－Ｖ－Ｒ－Ｒ（配列番号５７）であるアミノ酸配列を含み、式中Ｒはアルギニンであり、Ｖはバリンである。ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルミオスタチンについての例示的プロタンパク質転換酵素切断部位は、配列番号５２～５５において太字で示される。いくつかの実施形態ではプロタンパク質転換酵素切断部位は、アミノ酸配列ＲＳＲＲ（配列番号５６）を含む。
いくつかの実施形態では本開示による使用のためのトロイドプロテアーゼは、非限定的に、ＢＭＰ－１、ｍＴＬＬ－１およびｍＴＬＬ－２を含む。トロイドプロテアーゼは、非
限定的にヒト、サルまたはげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター）を含む任意の哺乳動物から得ることができる。いくつかの実施形態ではトロイドプロテアーゼは、ＢＭＰ－１、ｍＴＬＬ－１およびｍＴＬＬ－２からなる群より選択されるトロイドプロテアーゼに相同性である。例えばトロイドプロテアーゼは、ＢＭＰ－１、ｍＴＬＬ－１およびｍＴＬＬ－２と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一であってよい。
トロイドプロテアーゼ切断部位は、いくつかの実施形態では、トロイド（例えばＢＭＰ－１、ｍＴＬＬ－１およびｍＴＬＬ－２）によって切断され得るアミノ配列である。ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルミオスタチンについての例示的トロイドプロテアーゼ切断部位は、配列番号５２～５５において下線で示される。いくつかの実施形態ではトロイド切断部位は、アミノ酸配列ＱＲを含み、式中Ｑはグルタミンであり、Ｒはアルギニンである。
いくつかの実施形態では本明細書に記載の抗体は、プロ／潜在型ミオスタチンに結合でき、それによりミオスタチン活性を阻害する。いくつかの場合では本明細書に記載の抗体は、ミオスタチンシグナル伝達を少なくとも２０％、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高く阻害できる。いくつかの実施形態ではミオスタチンシグナル伝達の阻害は、日常的方法によって、例えば実施例１に記載のミオスタチン活性化アッセイを使用して測定され得る。しかし、追加的方法がミオスタチンシグナル伝達活性を測定するために使用され得ることは理解されるべきである。
例えばプロタンパク質転換酵素および／またはトロイドプロテアーゼによる、タンパク質分解を介したミオスタチンの切断の程度は、任意の好適な方法を使用して測定および／または定量され得ることは理解されるべきである。いくつかの実施形態ではタンパク質分解を介したミオスタチンの切断の程度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定および／または定量される。例えばＥＬＩＳＡは、放出された増殖因子（例えば成熟ミオスタチン）のレベルを測定するために使用され得る。別の例としてプロミオスタチン、潜在型ミオスタチンおよび／または成熟ミオスタチンに特異的に結合する抗体は、ミオスタチン（例えばプロ／潜在型／成熟ミオスタチン）の特定の形態のレベルを測定するため、タンパク質分解を介したミオスタチンの切断の程度を定量するためのＥＬＩＳＡにおいて使用され得る。いくつかの実施形態ではタンパク質分解を介したミオスタチンの切断の程度は、免疫沈降に続いてトリプシンペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥもしくは質量分析、蛍光異方性に基づく技術、ＦＲＥＴアッセイ、水素－重水素交換質量分析、および／またはＮＭＲ分光法を使用して測定および／または定量される。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンとしても公知の抗体は、それぞれおよそ２５ｋＤａの２本の軽鎖（Ｌ）およびそれぞれおよそ５０ｋＤａの２本の重鎖（Ｈ）から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。ラムダおよびカッパと呼ばれる２つの型の軽鎖が抗体において見出され得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて免疫グロブリンは、５個の主なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭに割り当てられてよく、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を典型的には含む。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３個または４個のＣドメイン（ＣＨ１－３）およびヒンジ領域を典型的には含む。ＶＨに最も近位のＣＨドメインはＣＨ１と名付けられる。ＶＨおよびＶＬドメインは、超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３個の領域のための足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された
配列の４個の領域からなる。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用に関与する残基の大部分を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成成分はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と称され、一方軽鎖上のＣＤＲ構成成分はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と称される。ＣＤＲは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１年）、Ｋａｂａｔら編に記載のＫａｂａｔ ＣＤＲを典型的には指す。抗原結合部位を特徴付けるための別の基準は、Ｃｈｏｔｈｉａによって記載の超可変ループを指す。例えばＣｈｏｔｈｉａ， Ｄ．ら、（１９９２年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７９９～８１７頁およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５年）ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻：４６２８～４６３８頁を参照されたい。さらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。一般に例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ （Ｄｕｅｂｅｌ， ＳおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ．編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓを参照されたい。Ｋａｂａｔ ＣＤＲに関して記載された実施形態は、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループにもしくはＡｂＭ定義ループに関して、またはこれらの方法のいずれかの組合せに関して同様に記載された関係を使用して代替的に実行され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体および抗体をコードする本開示の核酸分子は、表１に示すＣＤＲアミノ酸配列を含む。
Figure 0007418508000004
表１ではＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の単一の配列はＫａｂａｔおよびＩＭＧＴを反映している。
いくつかの実施形態では本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン結合剤（例えば抗体）は
、表１に示される抗体のいずれか１つに提供されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３またはそれらの組合せを含む任意の抗体（抗原結合性断片を含む）を含む。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン結合剤は、表１に示される抗体のいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。本開示は、表１に示される抗体のいずれか１つに提供されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３を含む分子をコードする任意の核酸配列も含む。抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を演じる場合がある。したがって、本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン結合剤またはその核酸分子は、表１に示す抗体の少なくとも重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。
本開示の態様は、プロ／潜在型ミオスタチンタンパク質に結合し、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含むモノクローナル抗体または抗原結合性断片に関する。
いくつかの実施形態ではＣＤＲＨ１は配列番号１～３のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態ではＣＤＲＨ２は配列番号４～９のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態ではＣＤＲＨ３は配列番号１０～１１のいずれか１つに記載の配列を含む。ＣＤＲＬ１は配列番号１２～１７のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態ではＣＤＲＬ２は配列番号１８～２１のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態ではＣＤＲＬ３は配列番号２２～２３のいずれか１つに記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では（例えば表１に示される抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体Ａｂ１について）ＣＤＲＨ１は配列番号１または２に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４または５に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１２または１３に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号１８または１９に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２２に記載の配列を含み、抗体はプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。
いくつかの実施形態では（例えば表１に示される抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体Ａｂ３について）ＣＤＲＨ１は配列番号１または３に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号６または７に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１４または１５に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２０または２１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２３に記載の配列を含み、抗体はプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。
いくつかの実施形態では（例えば表１に示される抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体Ａｂ５について）ＣＤＲＨ１は配列番号１または３に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号８または９に記載の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１６または１７に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２０または２１に記載の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２３に記載の配列を含み、抗体はプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。いくつかの例では本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン結合剤（例えば抗体）のいずれかは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２および／またはＣＤＲＬ３に実質的に類似する１つまたは複数のＣＤＲ（例えばＣＤＲＨまたはＣＤＲＬ）配列を有する任意の抗体（抗原結合性断片を含む）を含む。例えば抗体は、配列番号１～２３のいずれか１つの対応するＣＤＲ領域と比較して５個、４個、３個、２個または１個までのアミノ酸残基バリエーションを含有する、表１（配列番号１～２３）に示される１つまたは複数のＣＤＲ配列を含んでよい。表１に列挙される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域についての完全なアミノ酸および核酸配列は下
に提供される。
Figure 0007418508000005
Figure 0007418508000006
Figure 0007418508000007
Figure 0007418508000008
Figure 0007418508000009
Figure 0007418508000010
いくつかの実施形態では本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、配列番号２４～２９のいずれか１つの重鎖可変ドメインまたは配列番号３０～３５のいずれか１つの軽鎖可変ドメインを含む任意の抗体を含む。いくつかの実施形態では本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、配列番号２４および３０；２５および３１；２６および３２；２７および３３；２８および３４；または２９および３５）の重鎖可変および軽鎖可変の対を含む任意の抗体を含む。
本開示の態様は、本明細書に記載のもののいずれかに相同性の重鎖可変および／または軽鎖可変アミノ酸配列を有する抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体を提供する。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、配列番号２４～２９のいずれかの重鎖可変配列または配列番号３０～３５のいずれか１つの軽鎖可変配列と少なくとも７５％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの実施形態では相同性重鎖可変および／または軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書で提供されるＣＤＲ配列のいずれの内でも変化していない。例えばいくつかの実施形態では配列バリエーションの程度（例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）は本明細書で提供されるＣＤＲ配列のいずれかを除外して重鎖可変および／または軽鎖可変配列内で生じてよい。
２個のアミノ酸配列の「パーセント同一性」はＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３～７７頁、１９９３年のとおり改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：２２６４～６８頁、１９９０年のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３～１０頁、１９９０年のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、目的のタンパク質分子に相同性のアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行され得る。２個の配列間にギャップが存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁、１９９７年に記載のとおり利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。
いくつかの実施形態では保存的変異は、結晶構造に基づいて決定されるプロ／潜在型ミオスタチンとの相互作用に残基が関与しそうにない位置でＣＤＲまたはフレームワーク配列に導入されてよい。本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。改変体は、そのような方法をまとめている参考文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年また
はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見出されるような当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製されてよい。アミノ酸の保存的置換は、次の群：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ内のアミノ酸の間で行われる置換を含む。
いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、抗体に望ましい特性を付与する変異を含む。例えば、天然ＩｇＧ４ ｍＡｂで生じることが公知であるＦａｂアーム交換による起こり得る困難な状況を回避するために、本明細書で提供される抗体は、セリン２２８（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ番号付け残基２４１）がプロリンに変換されてＩｇＧ１様（ＣＰＰＣＰ（配列番号５８））ヒンジ配列が生じる安定化「Ａｄａｉｒ」変異を含む場合がある（Ａｎｇａｌ Ｓ．ら、「Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ （ＩｇＧ４） ａｎｔｉｂｏｄｙ」Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０巻、１０５～１０８頁；１９９３年）。したがって、抗体のいずれかは、安定化「Ａｄａｉｒ」変異またはアミノ酸配列ＣＰＰＣＰ（配列番号５８）を含んでよい。
本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン結合剤は、任意選択で抗体定常領域またはその一部を含んでよい。例えばＶＬドメインは、そのＣ末端でＣκまたはＣλなどの軽鎖定常ドメインに付着され得る。同様にＶＨドメインまたはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭならびに任意のアイソタイプサブクラスのような重鎖の全体または一部に付着され得る。抗体は、好適な定常領域を含み得る（例えばＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第９１～３２４２号、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照されたい）。したがって、この範囲内の抗体は、任意の好適な定常領域と組み合わされたＶＨおよびＶＬドメイン、またはその抗原結合性部分を含み得る。
ある特定の実施形態ではＶＨおよび／またはＶＬドメインは、生殖系列配列に復帰されてよく、例えばこれらのドメインのＦＲは、生殖系列細胞によって産生されるものに適合するように従来の分子生物学技術を使用して変異される。例えばＶＨおよび／またはＶＬドメインは、それぞれＩｇＨＶ３－３０（配列番号３６）および／またはＩｇＬＶ１－４４（配列番号３７）の生殖系列配列に復帰されてよい。ＶＨおよび／またはＶＬドメインのいずれかが任意の好適な生殖系列配列に復帰され得ることは理解されるべきである。他の実施形態ではＦＲ配列は、コンセンサス生殖系列配列から逸脱したままである。
Figure 0007418508000011
いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体または抗原結合性断片は、配
列番号２４～３５に示す抗体のフレームワーク領域を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、ネズミ抗体であり、ネズミフレームワーク領域配列を含む。
いくつかの実施形態では本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、比較的高い親和性で、例えば１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満またはそれより低いＫｄでプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。例えば抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、５ｐＭから５００ｎＭの間、例えば５０ｐＭから１００ｎＭの間、例えば５００ｐＭから５０ｎＭの間の親和性でプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。本開示は、プロ／潜在型ミオスタチンへの結合について本明細書に記載の抗体のいずれかと競合し、５０ｎＭまたはそれより低い（例えば２０ｎＭもしくはそれより低い、１０ｎＭもしくはそれより低い、５００ｐＭもしくはそれより低い、５０ｐＭもしくはそれより低い、または５ｐＭもしくはそれより低い）親和性を有する抗体または抗原結合性断片も含む。抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の親和性および結合動態は、これに限定されないがバイオセンサー技術（例えばＯＣＴＥＴまたはＢＩＡＣＯＲＥ）を含む任意の好適な方法を使用して試験されてよい。
標的抗原に「特異的に結合する」抗体は非標的抗原に結合するよりも大きな親和性、アビディティ、より容易におよび／またはより長い持続時間で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する抗体が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、プロ／潜在型ミオスタチンのトロイド切断部位にもしくはその近くにまたはトロイドドッキング部位にもしくはその近くに結合する。いくつかの実施形態では抗体は、トロイド切断部位またはトロイドドッキング部位の１５またはそれより少ないアミノ酸残基内に結合する場合に、トロイド切断部位近く、またはトロイドドッキング部位近くに結合する。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、トロイド切断部位またはトロイドドッキング部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基内に結合する。いくつかの実施形態では抗体は、ＧＤＦ８のトロイド切断部位にまたはその近くに結合する。例えば抗体は、配列番号６２ ＰＫＡＰＰＬＲＥＬＩＤＱＹＤＶＱＲＤＤＳＳＤＧＳＬＥＤＤＤＹＨＡＴ（配列番号６２）に記載のアミノ配列に結合できる。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体のいずれかは、プロ／潜在型ミオスタチンのプロタンパク質転換酵素切断部位にもしくはその近くに、またはプロタンパク質転換酵素ドッキング部位にもしくはその近くに結合する。いくつかの実施形態では抗体は、プロタンパク質転換酵素切断部位またはプロタンパク質転換酵素ドッキング部位の１５またはそれより少ないアミノ酸残基内に結合する場合、プロタンパク質転換酵素切断部位近くに、またはプロタンパク質転換酵素ドッキング部位近くに結合する。いくつかの実施形態では本明細書で提供する抗体のいずれかは、プロタンパク質転換酵素切断部位またはプロタンパク質転換酵素ドッキング部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基内に結合する。いくつかの実施形態では抗体は、ＧＤＦ８のプロタンパク質転換酵素切断部位にまたはその近くに結合する。例えば抗体は、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に結合できる。
ＧＬＮＰＦＬＥＶＫＶＴＤＴＰＫＲＳＲＲＤＦＧＬＤＣＤＥＨＳＴＥＳＲＣ（配列番号６３）。
一例では本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、ミオスタチンの他の形態および／または増殖因子のＴＧＦβファミリーの他のメンバーと比較してプロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する。増殖因子のＴＧＦβファミリーのメンバーは、非限定的にＡＭＨ、ＡＲＴＮ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ａ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、Ｇ
ＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＮＦ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＮＯＤＡＬ、ＮＲＴＮ、ＰＳＰＮ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３タンパク質を含む。そのような抗体は、増殖因子のＴＧＦβファミリーの他のメンバーと比較してはるかに高い親和性（例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１，０００倍高い）でプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。いくつかの実施形態ではそのような抗体は、増殖因子のＴＧＦβファミリーの他のメンバーと比較して少なくとも１，０００倍高い親和性でプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ＧＤＦ１１または成熟ミオスタチンの１つまたは複数の形態と比較してはるかに高い（例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１，０００倍高い）親和性でプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ＧＤＦ１１（例えばプロＧＤＦ１１、潜在型ＧＤＦ１１もしくは成熟ＧＤＦ１１）または成熟ミオスタチンの１つまたは複数の形態と比較して少なくとも１，０００倍高い親和性でプロ／潜在型ミオスタチンに結合できる。代替的にまたはさらに抗体は、プロ／潜在型ＧＤＦ１１などのＴＧＦβファミリーの他のメンバーと比較して、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの切断（例えばプロタンパク質転換酵素またはトロイドプロテアーゼによる）に対してはるかに高い阻害活性（例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍高い）を示し得る。
いくつかの実施形態では抗体は抗原に結合するが、抗原を血漿から有効に除去できない。したがって、いくつかの実施形態では血漿中の抗原の濃度は、抗原のクリアランスを低減することによって増加され得る。しかし、いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体（例えばスイーピング抗体）は、抗原への親和性がｐＨに感受性である。そのようなｐＨ感受性抗体は、中性ｐＨで血漿中の抗原に結合でき、酸性エンドソーム中で抗原から解離し、それにより抗体媒介抗原蓄積を低減し、および／または血漿からの抗原クリアランスを促進する。
本開示の態様は、スイーピング抗体に関する。本明細書において使用される場合、「スイーピング抗体」は、ｐＨ感受性抗原結合および、中性または生理学的ｐＨで細胞表面新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への少なくとも閾値レベルの結合の両方を有する抗体を指す。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに中性ｐＨで結合する。例えばスイーピング抗体は、７．０から７．６の範囲のｐＨでＦｃＲｎに結合できる。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、抗原に抗原結合部位で結合でき、細胞性ＦｃＲｎに抗体のＦｃ部分を介して結合できる。いくつかの実施形態では次いでスイーピング抗体は、内部移行され、分解される場合がある抗原を酸性エンドソーム中に放出できる。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、もはや抗原に結合せず、次いで（例えばエキソサイトーシスによって）細胞によって血清に戻して放出され得る。
いくつかの実施形態では血管内皮（例えば被験体の）中のＦｃＲｎは、スイーピング抗体の半減期を延ばす。いくつかの実施形態ではミオスタチン（例えばプロミオスタチン、潜在型ミオスタチンまたはプライムドミオスタチン（ｐｒｉｍｅｄ Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ））などの抗原に結合するスイーピング抗体を、いくつかの実施形態では血管内皮細胞は内部移行させる。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、血流に戻って再循環される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、その従来の対応物と比較して半減期（例えば被験体の血清中）が増加している。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体の従来の対応物は、スイーピング抗体の由来元である抗体を指す（例えばｐＨ７でより大きな親和性でＦｃＲｎに結合するように従来の抗体のＦｃ部分を操作する前）。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、被験体の血清中でその従来の対応物と比較して少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、１００％、
１５０％、２００％または２５０％長い半減期を有する。
いくつかの実施形態ではスイーピング抗体のＦｃ部分は、ＦｃＲｎに結合する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体のＦｃ部分は、ＦｃＲｎに７．４のｐＨで１０－３Ｍから１０－８Ｍの範囲のＫｄで結合する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、ＦｃＲｎに７．４のｐＨで１０－３Ｍから１０－７Ｍ、１０－３Ｍから１０－６Ｍ、１０－３Ｍから１０－５Ｍ、１０－３Ｍから１０－４Ｍ、１０－４Ｍから１０－８Ｍ、１０－４Ｍから１０－７Ｍ、１０－４Ｍから１０－６Ｍ、１０－４Ｍから１０－５Ｍ、１０－５Ｍから１０－８Ｍ、１０－５Ｍから１０－７Ｍ、１０－５Ｍから１０－６Ｍ、１０－６Ｍから１０－８Ｍ、１０－６Ｍから１０－７Ｍまたは１０－７Ｍから１０－８Ｍの範囲のＫｄで結合する。いくつかの実施形態ではＦｃＲｎは、スイーピング抗体のＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ領域に結合する。いくつかの実施形態ではＦｃＲｎは、プロテインＡまたはプロテインＧと同じ領域に結合する。いくつかの実施形態ではＦｃＲｎは、ＦｃγＲとは異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体Ｆｃ領域のアミノ酸残基ＡＡは、ＦｃＲｎへの結合のために必要である。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体Ｆｃ領域のアミノ酸残基ＡＡは、ＦｃＲｎへの結合に影響を与える。
いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、より高い親和性でＦｃＲｎに結合するように操作される。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、ｐＨ７．４でより高い親和性でＦｃＲｎに結合するように操作される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体のＦｃＲｎへの親和性は、それらの従来の対応物と比較してそれらの薬物動態（ＰＫ）特性を伸ばすように増加される。例えばいくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、より低い用量での効能に起因してより少ない有害反応を誘発する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、より少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体のある特定の組織型への経細胞輸送は増加される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、経胎盤性送達の効率を増強する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、産生するためにあまり費用がかからない。
いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、低親和性でＦｃＲｎに結合するように操作される。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、ｐＨ７．４で、低親和性でＦｃＲｎに結合するように操作される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体のＦｃＲｎへの親和性は、それらの従来の対応物と比較してそれらの薬物動態的（ＰＫ）特性を短くするように減少される。例えばいくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、画像化および／または放射免疫療法に関してさらに急速に排除される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、自己免疫疾患に対する処置として内在性病原性抗体のクリアランスを促進する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、材料胎児特異的抗体の経胎盤輸送によって生じる可能性がある有害な妊娠転帰のリスクを低減する。
いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、中性または生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）と比較して低いｐＨで抗原への親和性が減少する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）と比較して酸性ｐＨ（例えば５．５から６．５の範囲のｐＨ）で抗原への親和性が減少する。本明細書で提供される抗体のいずれかはｐＨ変化に応じて抗原から解離するように操作されてよい（例えばｐＨ感受性抗体）ことは理解されるべきである。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるスイーピング抗体は、ｐＨに応じて抗原に結合するように操作される。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるスイーピング抗体は、ｐＨに応じてＦｃＲｎに結合するように操作される。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるスイーピング抗体は、エンドサイトーシスによって内部移行される。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるスイーピング抗体は、ＦｃＲｎ結合によって内部移行される。いくつかの実施形態ではエンドサイ
トーシスされたスイーピング抗体は、抗原をエンドソーム中に放出する。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、細胞表面に戻って再循環される。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、細胞に結合したままである。いくつかの実施形態ではエンドサイトーシスされたスイーピング抗体は、血漿に戻って再循環される。本明細書で提供される抗体のいずれかのＦｃ部分が、異なるＦｃＲｎ結合活性を有するように操作されてよいことは理解されるべきである。いくつかの実施形態ではＦｃＲｎ結合活性は、スイーピング抗体による抗原のクリアランス時間に影響を与える。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、長時間作用型または速効型スイーピング抗体であってよい。
いくつかの実施形態では従来の治療用抗体をスイーピング抗体に変換することは、有効用量を低減する。いくつかの実施形態では従来の治療用抗体をスイーピング抗体に変換することは、有効用量を少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低減する。いくつかの実施形態では従来の治療用抗体をスイーピング抗体に変換することは、有効用量を少なくとも１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／８、１／１０、１／１５、１／２０、１／５０または１／１００に低減する。
いくつかの実施形態では治療のためのスイーピング抗体の適切な用量を選択することは、経験的に実行され得る。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体の高用量は、ＦｃＲｎを飽和する場合があり、血清中の抗原を内部移行することなく安定化する抗体を生じる。いくつかの実施形態では低用量のスイーピング抗体は、治療的に有効でない場合がある。いくつかの実施形態ではスイーピング抗体は、１日１回、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、６週間ごとに１回、８週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、１２週間ごとに１回、１６週間ごとに１回、２０週間ごとに１回または２４週間ごとに１回投与される。
いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれもスイーピング抗体になるように改変または操作されてよい。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれも任意の好適な方法を使用してスイーピング抗体に変換されてよい。例えばスイーピング抗体を作製するための好適な方法はＩｇａｗａら、（２０１３年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｗｅｅｐｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８巻（５号）：ｅ６３２３６頁；およびＩｇａｗａら、「ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄａｌｉｔｙ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８４４巻（２０１４年）１９４３～１９５０頁に以前に記載されており、これらのそれぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書で提供されるスイーピング抗体を作製するための方法が限定されることを意味しないことは理解されるべきである。したがって、スイーピング抗体と作製するための追加的方法は本開示の範囲内である。
本開示のいくつかの態様は、本明細書で提供される抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体のいずれかの親和性（例えばＫｄとして表される）がｐＨの変化に感受性であるという認識に基づいている。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、比較的高いｐＨ（例えば７．０～７．４の範囲のｐＨ）と比較して比較的低いｐＨ（例えば４．０～６．５の範囲のｐＨ）でプロ／潜在型ミオスタチンへの結合のＫｄが増加している。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ｐＨが４．０から６．５の間である場合に、１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍの範囲のプロ／潜在型ミオスタチンへの結合のＫｄを有する。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ｐＨが７．０から７．４の間である場合に、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ
、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍの範囲のプロ／潜在型ミオスタチンへの結合のＫｄを有する。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体は、ｐＨ７．０から７．４の間と比較してｐＨ４．０から６．５の間で少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍または少なくとも１００００倍大きいプロ／潜在型ミオスタチンへの結合のＫｄを有する。
いくつかの実施形態では（配列番号６４）に記載されるアミノ酸配列の中のエピトープに特異的に結合しないプロ／潜在型ミオスタチン抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるプロ／潜在型ミオスタチン抗体は、２０１５年１２月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／００６３２３号に基づいて２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０９８３５７号の表２ａ、１１ａ、１１ｂ、または１３に記載された抗体と同じエピトープに特異的に結合しない。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるプロ／潜在型ミオスタチン抗体は、２０１５年１２月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／００６３２３号に基づいて２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０９８３５７号の表２ａ、１１ａ、１１ｂ、または１３に記載された抗体と同じエピトープへの結合に関して競合または交差競合しない。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるプロ／潜在型ミオスタチン抗体は、２０１５年１２月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／００６３２３号に基づいて２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０９８３５７号の表２ａ、１１ａ、１１ｂ、または１３に記載されたＶＨおよびＶＬの対を含む抗体と同じエピトープに特異的に結合しない。いくつかの実施形態では本明細書で提供されるプロ／潜在型ミオスタチン抗体は、２０１５年１２月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／００６３２３号に基づいて２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０９８３５７号の表２ａ、１１ａ、１１ｂ、または１３に記載されたＶＨおよびＶＬの対を含む抗体と同じエピトープへの結合に関して競合または交差競合しない。
ポリペプチド
本開示のいくつかの態様は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。いくつかの実施形態ではポリペプチドは可変重鎖ドメインである。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）同一である。
本開示のいくつかの態様は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。いくつかの実施形態ではポリペプチドは可変軽鎖ドメインである。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４または配列番号３５に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）同一である。
抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体と競合する抗体
本開示の態様は、本明細書で提供される抗体のいずれかと競合または交差競合する抗体に関する。抗体に関して本明細書において使用される用語「競合する」は、第１の抗体が、第２の抗体の結合と十分に類似した様式でタンパク質（例えば潜在型ミオスタチン）のエピトープに結合し、そのエピトープとの第１の抗体の結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して第２の抗体の存在下で検出可能に減少されることを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少
される別の場合が可能であるが、そうである必要はない。すなわち第１の抗体は第２の抗体のそのエピトープへの結合を、第２の抗体がそのそれぞれのエピトープへの第１の抗体の結合を阻害することなく阻害できる。しかし、各抗体がそのエピトープまたはリガンドとの他の抗体の結合を検出可能に阻害する場合、同じ程度、より大きい程度またはより小さい程度であるかに関わらず、抗体はそれらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」といえる。競合するおよび交差競合する両方の抗体は、本開示の範囲内である。そのような競合または交差競合が生じる機構（例えば立体障害、コンフォメーション変化もしくは共通エピトープまたはそれらの部分への結合）に関わらず、当業者は、そのような競合および／または交差競合抗体が包含され、本明細書で提供される方法および／または組成物に有用であり得ることを理解する。
本開示の態様は、本明細書で提供される抗体のいずれかと競合または交差競合する抗体に関する。いくつかの実施形態では抗体は、本明細書で提供される抗体のいずれかと同じエピトープにおいてまたはその近くに結合する。いくつかの実施形態では抗体は、それがエピトープの１５またはそれより少ないアミノ酸残基内に結合する場合にエピトープ近くに結合する。いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、本明細書で提供される抗体のいずれかが結合するエピトープの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基内に結合する。
別の実施形態では抗体は、１０－６Ｍ未満の抗体とタンパク質との間の平衡解離定数Ｋｄで本明細書で提供される抗原のいずれか（例えばプロ／潜在型ミオスタチン）への結合について競合または交差競合する。他の実施形態では抗体は、１０－１１Ｍから１０－６Ｍの範囲のＫｄで、本明細書で提供される抗原のいずれかへの結合について競合または交差競合する。
本開示の態様は本明細書で提供される抗体のいずれかとプロ／潜在型ミオスタチンへの結合について競合する抗体に関する。いくつかの実施形態では抗体は、本明細書で提供される抗体のいずれかと同じエピトープにおいてプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。例えば、いくつかの実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、プロ／潜在型ミオスタチンのトロイド切断部位にもしくはその近くにまたはトロイドドッキング部位にもしくはその近くに結合する。他の実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかは、プロ／潜在型ミオスタチンのプロタンパク質転換酵素切断部位にもしくはその近くにまたはプロタンパク質転換酵素ドッキング部位にもしくはその近くに結合する。別の実施形態では抗体は、１０－６Ｍ未満の抗体とプロ／潜在型ミオスタチンとの間の平衡解離定数Ｋｄでプロ／潜在型ミオスタチンへの結合について競合する。他の実施形態では本明細書で提供される抗体のいずれかと競合する抗体は、１０－１１Ｍから１０－６Ｍの範囲のＫｄでプロ／潜在型ミオスタチンに結合する。
本明細書で提供される抗体のいずれかは、任意の好適な方法を使用して特徴付けられてよい。例えば１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年の１１章に記載のとおり、抗体抗原複合体の結晶構造を解析すること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイおよび合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための多数の好適な方法がある。追加的例ではエピトープマッピングは、抗体が結合する配列を決定するために使用され得る。エピトープは、直鎖状エピトープであり得、すなわちアミノ酸の単一のストレッチに含有され得る、または必ずしも単一のストレッチ（一次構造直鎖状配列）に含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成されるコンフォメ
ーショナルエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）であってよい。多様な長さ（例えば少なくとも４～６アミノ酸長）のペプチドは、単離または合成（例えば組換え的に）され、抗体との結合アッセイのために使用されてよい。別の例では抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列由来の重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによる系統的スクリーニングにおいて決定され得る。遺伝子断片発現アッセイにより、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームは、無作為にまたは特異的な遺伝的構築によってのいずれかで断片化され、発現された抗原断片と試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えばＰＣＲによって産生され、次いで放射性アミノ酸の存在下でタンパク質へｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。抗体の放射性標識抗原断片への結合は、次いで免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。ある特定のエピトープは、ファージ粒子の表面に提示された無作為ペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用しても同定され得る。代替的に、重複ペプチド断片の規定のライブラリーは、簡単な結合アッセイにおいて試験抗体への結合について試験され得る。追加的例では、抗原結合ドメインの変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニンスキャンニング変異誘発は、エピトープ結合のために要求される、十分なおよび／または必要な残基を同定するために実施され得る。例えばドメイン交換実験は、プロ／潜在型ミオスタチンポリペプチドの種々の断片が、ＴＧＦβタンパク質ファミリーの別のメンバー（例えばＧＤＦ１１）などの密接に関連しているが抗原性が異なるタンパク質由来の配列で置き換えられて（交換されて）いる標的抗原の変異体を使用して実施され得る。抗体の変異体プロ／潜在型ミオスタチンへの結合を評価することによって、抗体結合への特定の抗原断片の重要性が評価され得る。
代替的に、競合アッセイは、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために同じ抗原に結合することが公知である他の抗体を使用して実施されてよい。競合アッセイは当業者に周知である。
好適な方法のいずれか、例えば本明細書に記載のエピトープマッピング法は、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体が本明細書に記載のプロ／潜在型ミオスタチン中の特異的残基／セグメントの１つまたは複数に結合するかどうかを決定するために適用され得る。さらに抗体と、プロ／潜在型ミオスタチン中のこれらの定義された残基の１つまたは複数との相互作用は、日常的技術によって決定され得る。例えば結晶構造を決定することができ、プロ／潜在型ミオスタチン中の残基と抗体中の１つまたは複数の残基との間の距離はそれに従って決定され得る。そのような距離に基づいて、プロ／潜在型ミオスタチン中の特定の残基が抗体中の１つまたは複数の残基と相互作用するかどうかが決定され得る。さらに、競合アッセイおよび標的変異誘発アッセイなどの好適な方法は、変異体プロ／潜在型ミオスタチンなどの別の標的と比較した、候補抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体のプロ／潜在型ミオスタチンへの優先的な結合を決定するために適用され得る。
プロ／潜在型ミオスタチンに結合する抗体の産生
多数の方法は、本開示の抗体またはその抗原結合性断片を得るために使用され得る。例えば抗体は、組換えＤＮＡ方法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体は、公知の方法によりハイブリドーマの生成によっても産生され得る（例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６号：４９５～４９９頁を参照されたい）。この様式で形成されたハイブリドーマは、次いで、特定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（例えばＯＣＴＥＴまたはＢＩＡＣＯＲＥ）解析などの標準的方法を使用してスクリーニングされる。特定の抗原の任意の形態、例えば組換え抗原、天然に存在する形態、その任意の改変体または断片、およびその抗原性ペプチド（例えば直鎖状エピトープとしてまたはコンフォメーショナルエピトープとして足場内の本明細書に記載のエピトープのいずれか）は免疫原として使用され得る。抗体を
作製する１つの例示的方法は、抗体またはその断片（例えばｓｃＦｖ）を発現するタンパク質発現ライブラリー、例えばファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えばＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８巻：１３１５～１３１７頁、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁、Ｍａｒｋｓら、（１９９１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０およびＷＯ９０／０２８０９に記載されている。
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定の抗原（例えばプロミオスタチン）は、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ハムスター、またはラットを免疫化するために使用されてよい。一実施形態では非ヒト動物はマウスである。
別の実施形態ではモノクローナル抗体は、非ヒト動物から得られ、次いで好適な組換えＤＮＡ技術を使用して改変される（例えばキメラ）。キメラ抗体を作製するための種々のアプローチは記載されている。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８１巻：６８５１頁、１９８５年、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４巻：４５２頁、１９８５年、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。
追加的な抗体産生技術についてＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。本開示は、抗体のいずれかの特定の供給源、産生の方法または他の特別な特徴に必ずしも限定されない。
本開示のいくつかの態様は、ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核または真核細胞であってよい。宿主細胞に存在するポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、または染色体外に維持されていてもよい。宿主細胞は、細菌性、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの任意の原核または真核細胞であってよい。いくつかの実施形態では真菌細胞は、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のもの、具体的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものである。用語「原核生物」は、抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされ得る全ての細菌を含む。原核生物の宿主は、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陰性およびグラム陽性細菌を含んでよい。用語「真核生物」は、酵母、高等植物、昆虫ならびに脊椎動物細胞、例えばＮＳＯおよびＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化されてよい、またはグリコシル化されなくてよい。抗体または対応する免疫グロブリン鎖は、開始メチオニンアミノ酸残基も含んでよい。
いくつかの実施形態では、ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件下に維持されてよく、所望により、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体もしくはインタクト抗体、抗原結合性断片または他の免疫グロブリン形態の回収および精製が続いてよい；Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９７９年）を参照されたい。したがって、ポリヌクレオチドまたはベクターは
、次に抗体または抗原結合性断片を産生する細胞に導入される。さらに、前述の宿主細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、抗体または抗体断片の大規模産生のために使用されてよい。
形質転換された宿主細胞は、発酵槽で増殖され、最適な細胞増殖を達成するための任意の好適な技術を使用して培養されてよい。発現されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、他の免疫グロブリン形態または抗原結合性断片は、硫酸アンモニウム沈殿法、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的手順により精製されてよい；Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）を参照されたい。次いで抗体または抗原結合性断片は、増殖培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離されてよい。例えば微生物で発現された抗体または抗原結合性断片の単離および精製は、例えば調製用クロマトグラフィー分離および、例えば抗体の定常領域に対して指向されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの免疫学的分離などの任意の従来の手段によってであってよい。
本開示の態様は、モノクローナル抗体の無期限に延長される供給源を提供するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマの培養物から直接免疫グロブリンを得るための代替法として、不死化ハイブリドーマ細胞は、続く発現および／または遺伝子操作のための再編成重鎖および軽鎖遺伝子座の供給源として使用されてよい。再編成抗体遺伝子は、ｃＤＮＡを産生するために適切なｍＲＮＡから逆転写されてよい。いくつかの実施形態では重鎖定常領域は、異なるアイソタイプのものと交換されるかまたは全体が除去されてよい。可変領域は、一本鎖Ｆｖ領域をコードするように連結されてよい。複数のＦｖ領域は、１つより多い標的への結合能力を付与するために連結されてよく、またはキメラ重鎖および軽鎖組合せが用いられてよい。任意の適切な方法は、抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の生成のために使用されてよい。
いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする適切な核酸が得られ、標準的組換え宿主細胞にトランスフェクトされ得る発現ベクターに挿入される。種々のそのような宿主細胞が使用されてよい。いくつかの実施形態では哺乳動物宿主細胞は、効率的なプロセシングおよび産生のために有利である場合がある。この目的のために有用な典型的な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞、２９３細胞またはＮＳＯ細胞を含む。抗体または抗原結合性断片の産生は、改変組換え宿主を宿主細胞の増殖およびコード配列の発現に適切な培養条件下で培養することによって実行されてよい。抗体または抗原結合性断片は、培養物からそれらを単離することによって回収され得る。発現系は、生じた抗体が培地に分泌されるように、シグナルペプチドを含める形で設計されてよいが；細胞内産生物も可能である。
本開示は、本明細書に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態ではポリヌクレオチドによってコードされる可変領域は、上に記載のハイブリドーマのいずれか１つによって産生された抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
抗体または抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成的に産生されたＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独もしくは組合せで含む組換え的に産生されたキメラ核酸分子であってよい。いくつかの実施形態ではポリヌクレオチドは、ベクターの一部である。そのようなベクターは、好適な宿主細胞においておよび好適な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでよい。
いくつかの実施形態ではポリヌクレオチドは、原核または真核細胞での発現を可能にする発現調節配列に作動可能に連結される。ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞での発現を確実にする制御エレメントは、当業者に周知である。それらは、転写の開始を促進する制御配列ならびに任意選択で転写の終了および転写物の安定化を促進するポリＡシグナルを含んでよい。追加的制御エレメントは、転写および翻訳エンハンサー、ならびに／または天然で関連するもしくは異種性のプロモーター領域を含んでよい。原核生物の宿主細胞での発現を可能にする可能性のある制御エレメントは例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＬ、Ｌａｃ、ＴｒｐまたはＴａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞での発現を可能にする制御エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
転写の開始に関与するエレメント以外のそのような制御エレメントはＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位などのポリヌクレオチドの下流の転写終結シグナルも含み得る。さらに、用いられる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞コンパートメントに向かわせるまたはそれを培地に分泌することができるリーダー配列を、ポリヌクレオチドのコード配列に加えてよく、以前に記載されている。リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始および終止配列と適切なフェーズ（ｐｈａｓｅ）でアセンブルされ、好ましくは、リーダー配列は翻訳されたタンパク質またはその部分の例えば細胞外培地への分泌を導くことができる。望ましい特徴、例えば発現される組換え産物の安定化または精製の簡略化を与えるＣまたはＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードする異種性ポリヌクレオチド配列を、任意選択で使用してもよい。
いくつかの実施形態では軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、両方の免疫グロブリン鎖または１つだけの可変ドメインをコードしてよい。同様にポリヌクレオチドは、同じプロモーターの調節下にあってよく、または発現のために別々に調節されてよい。さらにいくつかの態様は、抗体または抗原結合性断片の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを、任意選択で抗体の他の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドとの組合せで含む、遺伝子工学において従来使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。
いくつかの実施形態では発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクター中の真核プロモーター系として提供されるが、原核生物の宿主のための調節配列も使用されてよい。レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、ポリヌクレオチドまたはベクターを標的化された細胞集団（例えば抗体または抗原結合性断片を発現するように細胞を操作するため）に送達するために使用されてよい。種々の適切な方法は、組換えウイルス性ベクターを構築するために使用されてよい。いくつかの実施形態ではポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成されてよい。ポリヌクレオチド（例えば配列および発現調節配列をコードする免疫グロブリン鎖の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン（複数可））を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する好適な方法によって宿主細胞に移行されてよい。
修飾
本開示の抗体または抗原結合性断片は、プロ／潜在型ミオスタチンの検出および単離のために、これらに限定されないが、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、ポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、および親和性標識を
含む検出可能な標識で修飾されてよい。検出可能な物質は、本開示のポリペプチドに直接または、好適な技術を使用して中間体（例えばリンカーなど）を通じて間接のいずれかでカップリングまたはコンジュゲートされてよい。好適な酵素の非限定的例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；好適な補欠分子族複合体の非限定的例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；好適な蛍光材料の非限定的例はビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み；生物発光材料の非限定的例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み；好適な放射性材料の例は、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、８６Ｒ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅおよびスズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）などの放射性金属イオン、例えばアルファ放射体または他の放射性同位元素を含む。検出可能な物質は、本開示の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体に直接または、好適な技術を使用して中間体（例えばリンカーなど）を通じて間接のいずれかでカップリングまたはコンジュゲートされてよい。検出可能な物質にコンジュゲートされた抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、本明細書に記載の診断アッセイのために使用され得る。
医薬組成物
抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の１つまたは複数は、ミオパチーに関連する疾患または障害の緩和に使用するための医薬組成物を形成するために緩衝剤を含む薬学的に許容される担体（賦形剤）と混合されてよい。「許容される」は、担体が組成物の活性成分と適合性でなければならず（好ましくは活性成分を安定化できる）、処置される被験体に有害であってはならないことを意味する。緩衝剤を含む薬学的に許容される賦形剤（担体）の例は、当業者に明らかであり、以前に記載されている。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ
Ｅｄ．（２０００年）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ編、Ｋ． Ｅ． Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。一例では本明細書に記載の医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープ／残基を認識する１個より多い抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体を含有する。
本方法において使用される医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で含んでよい。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００年）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ編、Ｋ． Ｅ． Ｈｏｏｖｅｒ）。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸などの緩衝剤；アルコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリドなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパ
ラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類およびグルコース、マンノースもしくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎタンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでよい。薬学的に許容される賦形剤はさらに本明細書に記載される。
いくつかの例では本明細書に記載の医薬組成物は、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：３６８８頁（１９８５年）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４０３０頁（１９８０年）ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載のものなどの任意の好適な方法によって調製され得る抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体を含有するリポソームを含む。循環時間が増強されたリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、望ましい直径を有するリポソームを得るために規定のポアサイズのフィルターを通して押し出される。
抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルにも捕捉され得る。例示的技術は、以前に記載されており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）を参照されたい。
他の例では本明細書に記載の医薬組成物は、徐放性形式で製剤化されてよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、マトリクスは成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）または、ポリ（ビニルアルコール（ｖ ｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ））、ポリラクチド乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸グリコール酸共重合体、スクロースアセテートイソブチレートおよびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成される。治療用抗体組成物は、一般に無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通できるストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与または吸入もしくは吹送法による投与のための錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁物または座薬などの単位投与形態であってよい。
錠剤などの固体組成物を調製するために主要活性成分は、医薬用担体、例えばコーンデ
ンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムもしくはガムなどの従来の錠剤化成分、および本開示の化合物の均一な混合物を含有する固体予備製剤組成物を形成するための他の医薬用希釈剤、例えば水、または無毒性の薬学的に許容されるそれらの塩と混合されてよい。これらの予備製剤組成物を均一と称する場合、活性成分が組成物全体に均質に分散されており、それにより組成物が錠剤、丸剤およびカプセルなどの同等に有効な単位投与形態に容易に分割され得ることを意味する。この固体予備製剤組成物は、次いで本開示の活性成分０．１ｍｇから約５００ｍｇを含有する上に記載の種類の単位投与形態に分割される。新規組成物の錠剤または丸剤は、長期作用の利点をもたらす投与形態を提供するためにコーティングまたは他の方法で配合されてよい。例えば錠剤または丸剤は、内剤（ｉｎｎｅｒ ｄｏｓａｇｅ）および外剤（ｏｕｔｅｒ ｄｏｓａｇｅ）構成成分を含んでよく、後者は前者を覆うエンベロープの形態にある。２個の構成成分は、胃での崩壊に抵抗するために役立ち、内部の構成成分が十二指腸へインタクトなまま通過することまたは放出を遅らせることを可能にする腸溶性層（ｅｎｔｅｒｉｃ ｌａｙｅｒ）によって分離されてよい。種々の材料がそのような腸溶性層またはコーティングのために使用されてよく、そのような材料はいくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
好適な表面活性剤は、具体的にはポリオキシエチレンソルビタン（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性剤を含む。表面活性剤を含む組成物は、好都合には０．０５から５％の表面活性剤を含み、０．１から２．５％であってよい。必要に応じて他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルが添加されてよいことは理解される。
好適なエマルジョンは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの商業的に入手できる脂肪エマルジョンを使用して調製されてよい。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物に溶解されてよく、または代替的に油（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油もしくはアーモンド油）およびリン脂質（例えば卵リン脂質、ダイズリン脂質もしくはダイズレシチン）と水とを混合して形成されたエマルジョンに溶解されてもよい。他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースが、エマルジョンの張度を調整するために加えられてよいことは理解される。好適なエマルジョンは、典型的には２０％まで、例えば５から２０％の油を含有する。
エマルジョン組成物は、抗プロミオスタチン抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）とまたはその構成成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されるものであってよい。
吸入または吹送法のための医薬組成物は、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒またはそれらの混合物中の溶液および懸濁物ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上に記載の好適な薬学的に許容される賦形剤を含有してよい。いくつかの実施形態では組成物は、局所または全身性効果のために経口または経鼻呼吸経路によって投与される。
好ましくは無菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧されてよい。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸われてよい、または噴霧デバイスはフェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸器に取り付けられてよい。溶液、懸濁物または粉末組成物は、好ましくは経口または経鼻で適切な様式で製剤を送達するデバイスから投与されてよい。
疾患／障害を処置するための抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の使用
本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、ミオパチーを伴う疾患または障害を処置するのに有効である。本明細書において使用される場合、用語「ミオパチー」は、筋肉線維が正しく機能せず、典型的には筋脱力を生じる筋肉疾患を指す。ミオパチーは、実際は神経筋性または筋骨格性である筋肉疾患を含む。いくつかの実施形態ではミオパチーは遺伝性ミオパチー（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｙｏｐａｔｈｙ）である。遺伝性ミオパチーは、非限定的に、ジストロフィー、筋緊張症、先天性ミオパチー（例えばネマリンミオパチー、マルチ／ミニコアミオパチーおよび中心核ミオパチー）、ミトコンドリアミオパチー、家族性周期性ミオパチー、炎症性ミオパチーならびに代謝性ミオパチー（例えばグリコーゲン貯蔵疾患および脂質貯蔵障害）を含む。いくつかの実施形態ではミオパチーは後天性ミオパチーである。後天性ミオパチーは、非限定的に、外来物質誘導性ミオパチー（例えば薬物誘導性ミオパチーおよびグルココルチコイドミオパチー、アルコール性ミオパチーおよび他の毒性作用物質によるミオパチー）、筋炎（例えば皮膚筋炎、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｏｓｉｔｉｓ）および封入体筋炎）、骨化性筋炎、横紋筋融解症ならびにミオグロビン尿症ならびに非活動性萎縮症を含む。いくつかの実施形態ではミオパチーは非活動性萎縮症であり、骨折（例えば股関節骨折）によってまたは神経損傷（例えば脊髄損傷（ＳＣＩ））によって生じる場合がある。いくつかの実施形態ではミオパチーは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、腎不全による悪液質症候群、ＡＩＤＳ、心臓の状態および／またはがんなどの疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態ではミオパチーは加齢に関連する。
本開示の態様は、ミオパチーを有する被験体を処置する方法であって、上に記載の抗体の有効量を被験体に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態ではミオパチーは原発性ミオパチーである。別の実施形態では原発性ミオパチーは非活動性萎縮症を含む。他の実施形態では非活動性萎縮症は、股関節骨折、待機的人工関節置換術、救命医療ミオパチー、脊髄損傷または発作に関連する。いくつかの実施形態ではミオパチーは、筋肉喪失が疾患病態に続発する二次性ミオパチーである。他の実施形態では二次性ミオパチーは、脱神経、遺伝性筋脱力または悪液質を含む。別の実施形態では二次性ミオパチーは、筋萎縮性側索硬化症または脊髄性筋萎縮症に関連する脱神経である。いくつかの実施形態では二次性ミオパチーは、筋ジストロフィーに関連する遺伝性筋脱力である。他の実施形態では二次性ミオパチーは、腎不全、ＡＩＤＳ、心臓の状態、がんまたは加齢に関連する悪液質である。
本開示の別の態様は、加齢に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。加齢に関連する例示的疾患および状態は、非限定的に筋肉減少症（加齢性筋肉喪失）、虚弱およびアンドロゲン欠乏症を含む。
本開示の別の態様は、非活動性萎縮症／外傷に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。非活動性萎縮症／外傷に関連する例示的疾患および状態は、非限定的に、集中治療室（ＩＣＵ）で過ごした時間に関連する筋脱力、股関節置換術、股関節骨折、発作、床上安静、ＳＣＩ、回旋筋腱板損傷、膝置換術、骨折および熱傷を含む。
本開示の別の態様は、神経変性疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的神経変性疾患または状態は、非限定的に脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。
本開示の別の態様は、悪液質に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。悪液質に関連する例示的疾患および状態は、非限定的にがん、慢性心不全、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を含む。
本開示の別の態様は、まれな疾患に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的なまれな疾患および状態は、非限定的に骨形成不全症、孤発性封入体筋炎および急性リンパ芽球性白血病を含む。
本開示の別の態様は、代謝障害および／または身体組成に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。いくつかの実施形態では疾患または状態は肥満（例えば重度の肥満）、プラダー・ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病または食欲不振である。しかし代謝障害および／または身体組成に関連する追加的疾患または状態は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
本開示の別の態様は、先天性ミオパチーに関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的先天性ミオパチーは、非限定的にＸ連鎖筋細管ミオパチー、常染色体優性中心核ミオパチー、常染色体劣性中心核ミオパチー、ネマリンミオパチーおよび先天性筋線維型不均衡ミオパチーを含む。
本開示の別の態様は、筋ジストロフィーに関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含む。例示的筋ジストロフィーは、非限定的にデュシェンヌ型、ベッカー型、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨ）および肢帯型筋ジストロフィーを含む。
本開示の別の態様は、泌尿婦人科関連疾患または状態、声門障害（狭窄）、外眼性ミオパチー、手根管、ギランバレーまたは骨肉腫を有する被験体を処置する方法を含む。
本明細書に記載の方法を実施するために、上に記載の医薬組成物の有効量は、処置を必要とする被験体（例えばヒト）に静脈内投与、例えばボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、吸入または局所経路によって、などの好適な経路を介して投与され得る。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む液体製剤のための商業的に入手できる噴霧器は、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧されてよく、凍結乾燥粉末は復元後に噴霧され得る。代替的に抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化されてよく、または凍結乾燥され粉砕された粉末として吸入されてよい。
本明細書に記載の方法によって処置される被験体は、哺乳動物、より好ましくはヒトであってよい。哺乳動物は、これらに限定されないが家畜、スポーツ動物、愛玩動物、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含む。処置を必要とするヒト被験体は、上に記すものなどのミオパチーを伴う疾患／障害を有する、そのリスクがあるまたはそれを有すると疑われるヒト患者であってよい。プロ／潜在型ミオスタチン関連疾患または障害を有する被験体は、日常的医学的検査、例えば臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャンまたは超音波によって同定され得る。そのような疾患／障害のいずれかを有すると疑われる被験体は、疾患／障害の１つまたは複数の症状を示す場合がある。疾患／障害のリスクがある被験体は、その疾患／障害についてのリスク因子の１つまたは複数を有する被験体であってよい。
本明細書において使用される「有効量」は、単独または１つもしくは複数の他の活性剤との組合せのいずれかで、被験体に治療効果を付与するために必要な各活性剤の量を指す。当業者によって認識されるとおり、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別および体重を含む個々の患者パラメータ、処置の期間、同時に行われている治療（ある場合）の性質、投与の特定の経路ならびに医療関係者の知識および専門的意見内の同様の要因などに応じて変化する。これらの要因は当業者に周知で
あり、日常的な実験程度で対処され得る。個々の構成成分またはその組合せの最大用量、すなわち正当な医学的判断による最高安全用量が使用されることは一般に好ましい。しかし患者が医学的根拠、心理的理由のためにまたは事実上任意の他の理由のためにより低い用量または許容できる用量を主張できることは、当業者によって理解される。いくつかの実施形態では有効量は、障害もしくはその１つまたは複数の症状の重症度および／または持続期間を低減しもしくは改善し、障害の進行を防止し、障害の退縮を惹起し、障害に伴う１つまたは複数の症状の再発、発症、発病または進行を防止し、障害を検出し、または別の治療法（例えば予防薬もしくは治療薬）の予防もしくは治療効果（複数可）を増強もしくは改善するために十分な抗体もしくはその抗原結合部分の量を指す。
いくつかの実施形態では、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の被験体への投与という観点から、有効量は対照筋肉量と比較して被験体における標的筋肉量を増加させるために効果的な量である。いくつかの実施形態では筋肉量の増加は、対照筋肉量と比較して少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍またはそれを超える増加である。いくつかの実施形態では筋肉量の増加は、対照筋肉量と比較して１倍～５倍、２倍～１０倍、１倍～１．５倍、１倍～２倍などの範囲の増加である。
本明細書において使用される場合、用語「対照筋肉量」は、被験体における目標筋肉量に対する条件（例えばプロ／潜在型ミオスタチン抗体による処置）の効果を評価するために有用な参照基準を指す。いくつかの実施形態では対照筋肉量は所定の値である。いくつかの実施形態では対照筋肉量は実験的に決定される。いくつかの実施形態では対照筋肉量は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与されなかった被験体における目標筋肉量である。いくつかの実施形態では対照筋肉量は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与されなかった被験体の集団における目標筋肉量（例えば平均量）である。いくつかの実施形態では対照筋肉量は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与される前（例えば直前）の被験体における目標筋肉量である。いくつかの実施形態では対照筋肉量は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の代わりにプロ／潜在型ミオスタチン抗体が指向する抗原に曝露されなかった動物から得られた通常の抗体（例えばプロ／潜在型ミオスタチン抗体と同じアイソタイプの）を投与された被験体における目標筋肉量である。いくつかの実施形態では対照筋肉量は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の代わりにビヒクル、例えば生理食塩水を投与された被験体における目標筋肉量である。
いくつかの実施形態では、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の被験体への投与の観点から、有効量は対照力発生能力と比較して被験体における目標筋肉の力発生能力（例えば水平潅流浴に適合させた筋肉レバーシステムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで決定される最大力発生）を増加させるために効果的な量である。いくつかの実施形態では力発生能力の増加は、対照力発生能力と比較して少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍またはそれを超える増加である。いくつかの実施形態では力発生能力の増加は、対照力発生能力と比較して１倍～５倍、２倍～１０倍、１倍～１．５倍、１倍～２倍などの範囲の増加である。
本明細書において使用される場合、用語「対照力発生能力」は、被験体における筋肉の力発生能力に対する条件（例えばプロ／潜在型ミオスタチン抗体による処置）の効果を比較するために有用な参照基準を指す。いくつかの実施形態では対照力発生能力は所定の値である。対照力発生能力は実験的に決定される。いくつかの実施形態では対照力発生能力は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与されなかった被験体における目標筋肉の力発生
能力である。いくつかの実施形態では対照力発生能力は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与されなかった被験体の集団における目標筋肉の力発生能力（例えば平均力発生能力）である。いくつかの実施形態では対照力発生能力は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与される前（例えば直前）の被験体における目標筋肉の力発生能力である。いくつかの実施形態では対照筋肉力発生能力は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の代わりにプロ／潜在型ミオスタチン抗体が指向する抗原に曝露されなかった動物から得られた通常の抗体（例えばプロ／潜在型ミオスタチン抗体と同じアイソタイプの）を投与された被験体における目標筋肉の力発生能力である。いくつかの実施形態では対照力発生能力は、プロ／潜在型ミオスタチン抗体の代わりにビヒクル、例えば生理食塩水を投与された被験体における目標筋肉の力発生能力である。
半減期などの経験的検討事項は、一般に投薬量の決定に寄与する。例えばヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系に適合性である抗体は、抗体の半減期を延長し、かつ宿主の免疫系によって抗体が攻撃されることを防ぐために使用されてよい。投与の頻度は、治療の経過にわたって決定および調整されてよく、一般に、必ずではないが、ミオパチーを伴う疾患／障害の処置および／または抑制および／または回復および／または遅延に基づく。代替的に抗プロ／潜在型ミオスタチンの徐放性持続的放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）製剤も適切である場合がある。徐放を達成するための種々の製剤およびデバイスは、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
一例では本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体についての投薬量は、抗体の１回または複数回の投与を与えられた個体において経験的に決定され得る。個体は、漸増する投薬量のアンタゴニストを与えられる。アンタゴニストの効能を評価するために、疾患／障害の指標が追跡されてよい。
一般に、本明細書に記載した抗体のいずれの投与についても、初回の候補用量は約２ｍｇ／ｋｇであってよい。本開示の目的のため、典型的な日用量は上述の要素に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ～３０μｇ／ｋｇ～３００μｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇまたはそれを超えるいずれかの範囲でよい。数日間またはそれよりも長い期間にわたる繰り返し投与のためには、病状に応じて、所望の症状の抑制が起こるまで、またはプロ／潜在型ミオスタチンに伴う疾患もしくは障害またはその症状を緩和するために十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続する。例示的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量、続いて毎週の抗体約１ｍｇ／ｋｇの維持用量、または続いて１週おきの約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。しかし、臨床医が達成したい薬力学的減衰のパターンに応じて他の投与レジメンも有用である。例えば、週１～４回の投与が意図される。いくつかの実施形態では約３μｇ／ｍｇ～約２ｍｇ／ｋｇ（例えば約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇ）が用いられる。いくつかの実施形態では、投与頻度は毎週、２週ごと、４週ごと、５週ごと、６週ごと、７週ごと、８週ごと９週ごと、もしくは１０週ごとに１回、または毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、８か月ごと、１０か月ごと、毎年、またはそれよりも長い期間に１回である。この治療の進行は従来の手技およびアッセイによって容易にモニターできる。投与レジメン（用いる抗体を含む）は時と共に変更してよい。
いくつかの実施形態では正常体重の成人患者について、約０．３から５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が投与され得る。特定の投与レジメン、例えば用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の医療歴および個々の薬剤の特性（薬剤の半減期および他の関連する検討事項など）に依存する。
本開示の目的のために抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の適切な投薬量は、用いられる
特異的抗体（またはその組成物）、疾患／障害の種類および重症度、抗体が予防または治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴およびアンタゴニストへの応答ならびに主治医の判断に依存する。いくつかの実施形態では、望ましい結果を達成する投薬量に到達するまで、臨床医は、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体を投与する。抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の投与は、投与の目的が治療的または予防的であるかに関わらず、例えばレシピエントの生理学的状態、および熟練した医師に公知である他の要因に応じて連続的または間欠的であってよい。抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の投与は、予め選択した期間にわたって本質的に連続的であっても、または間隔をあけた一連の用量、例えばプロ／潜在型ミオスタチンに関連する疾患または障害が発症する前、その間またはその後のいずれかであってもよい。
本明細書において使用される場合、用語「処置する」は、ミオパチーを伴う疾患／障害、疾患／障害の症状または疾患／障害に対する素因を有する被験体への、障害、疾患の症状または疾患／障害に対する素因を治癒する（ｃｕｒｅ）、治す（ｈｅａｌ）、緩和する、軽減する、変える、改善する（ｒｅｍｅｄｙ）、回復させる、改善するまたは影響を与えるための１つまたは複数の活性剤を含む組成物の適用または投与を指す。
プロ／潜在型ミオスタチンに関連する疾患／障害を緩和することは、疾患の発症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）もしくは進行を遅らせること、または疾患の重症度を低減することを含む。疾患を緩和することは、必ずしも治癒的結果を要求しない。本明細書で使用する場合、プロ／潜在型ミオスタチンに関連する疾患／障害の発症を「遅らせること」は、疾患の進行を遅らせる（ｄｅｆｅｒ）、妨げる（ｈｉｎｄｅｒ）、遅くする（ｓｌｏｗ）、遅らせる（ｒｅｔａｒｄ）、安定化するおよび／または先に延ばす（ｐｏｓｔｐｏｎｅ）ことを意味する。この遅らせることは、病歴および／または処置される個体に応じて様々な時間の長さであってよい。疾患の発症を「遅らせる」もしくは緩和する、または疾患の発病（ｏｎｓｅｔ）を遅らせる方法は、方法を使用しない場合と比較して所与の時間枠において疾患の１つもしくは複数の症状の発症の可能性を低減するおよび／または所与の時間枠において症状の程度を低減する方法である。そのような比較は、統計的に有意な結果をもたらすのに十分な数人の被験体を使用する臨床研究に典型的には基づく。
疾患の「発症」または「進行」は、疾患の初期症状発現および／または後に続く疾患の進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であり得、標準的臨床技術を使用して評価され得る。しかし発症は、検出不能である場合がある進行も指す。本開示の目的に関して発症または進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」は出現（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）、再発および発病を含む。本明細書において使用される場合、ミオパチーを伴う疾患／障害の「発病」または「出現」は、初回発病および／または再発を含む。
いくつかの実施形態では本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、処置を必要とする被験体にタンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性ミオスタチンへの活性化をｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも２０％（例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えて）阻害するのに十分な量で投与される。他の実施形態では抗体は、プロ／潜在型ミオスタチンまたは潜在型ミオスタチンレベルを少なくとも２０％（例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えて）低減するのに有効な量で投与される。
医学の当業者に公知である従来の方法は、処置される疾患の種類または疾患の部位に応じて被験体に医薬組成物を投与するために使用されてよい。本組成物は、他の従来の経路を介して投与されてもよく、例えば経口、非経口、吸入スプレーによって、局所的、直腸、鼻、頬側、膣または埋め込みリザーバーを介して投与され得る。本明細書において使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸
骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。さらに１、３または６ヵ月デポー注射可能なまたは生分解性材料および方法を使用するなどの投与の注射可能なデポー経路を介して被験体に投与されてもよい。
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｔａｍｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、乳酸エチル、炭酸エチル、イソプロピルミリステート、エタノールおよびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの種々の担体を含有してよい。静脈内注射用に水溶性抗体は、抗体および生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬用製剤が注入される点滴方法によって投与されてよい。生理学的に許容される賦形剤は、例えば５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル液または他の好適な賦形剤を含んでよい。筋肉内調製物、例えば抗体の好適な可溶性塩形態の無菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水または５％グルコース溶液などの医薬用賦形剤に溶解され、投与されてよい。
一実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、部位特異的または標的化局所送達技術を介して投与される。部位特異的または標的化局所送達技術の例は、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の種々の埋め込み可能なデポー供給源または、注入カテーテル、留置カテーテルもしくは針カテーテルなどの局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたは他の埋め込み可能なデバイス、部位特異的担体、直接注射または直接適用を含む。例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含有する治療用組成物の標的化送達も使用され得る。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３年） １１巻：２０２頁、Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ． Ａ． Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４年）、Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８８年）２６３巻：６２１頁、Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９４年）２６９巻：５４２頁、Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９０年）８７巻：３６５５頁、Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９１年）２６６巻：３３８頁に記載されている。
ポリヌクレオチド（例えば本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体をコードするもの）を含有する治療用組成物は、遺伝子治療プロトコールでの局所投与のためにＤＮＡ約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲で投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇおよび約２０μｇから約１００μｇまたはそれを超える濃度範囲も遺伝子治療プロトコール中に使用されてよい。
本明細書に記載の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであってよい（一般にＪｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）１巻：５１頁、Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）５巻：８４５頁、Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５年）１巻：１８５頁およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４年）６巻：１４８頁を参照されたい）。そのようなコード配列の発現は、内在性哺乳動物または異種性プロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的または制御的のいずれであってもよい。
望ましい細胞における望ましいポリヌクレオチド（例えば本明細書に開示の抗体をコードする）の送達および発現に好適なウイルスに基づくベクターは、本開示の範囲内である。例示的なウイルスに基づくビヒクルは、これらに限定されないが、組換えレトロウイルス（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、第ＷＯ９４／０３６２２号、第ＷＯ９３／２５６９８号、第ＷＯ９３／２５２３４号、第ＷＯ９３／１１２３０号、第ＷＯ９３／１０２１８号、第ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許５，２１９，７４０号、および第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスに基づくベクター（例えばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２））およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９３／０３７６９号、第ＷＯ９３／１９１９１号、第ＷＯ９４／２８９３８号、第ＷＯ９５／１１９８４号および第ＷＯ９５／００６５５号を参照されたい）を含む。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２年）３巻：１４７頁に記載の不活化アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も用いられ得る。
これらに限定されないが、不活化アデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン縮合（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）ＤＮＡ（例えばＣｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２年）３巻：１４７頁を参照されたい）；リガンド連結ＤＮＡ（例えばＷｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８９年）２６４巻：１６９８５頁を参照されたい）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号、第ＷＯ９６／１７０７２号、第ＷＯ９５／３０７６３号および第ＷＯ９７／４２３３８号を参照されたい）ならびに核電荷中和または細胞膜との融合を含む非ウイルス性送達ビヒクルおよび方法も用いられてよい。ネイキッドＤＮＡも用いられてよい。例示的ネイキッドＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用できるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号、第ＷＯ９４／２３６９７号、第ＷＯ９１／１４４４５号および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。追加的アプローチはＰｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９４年）１４巻：２４１１頁、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９４年）９１巻：１５８１頁に記載されている。
本明細書に記載の方法において使用される特定の投与レジメン、例えば用量、タイミングおよび反復は、特定の被験体およびその被験体の医療歴に依存する。
いくつかの実施形態では、１つより多い抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体または、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体と別の好適な治療剤との組合せは、処置を必要とする被験体に投与され得る。アンタゴニストは、同じ型または互いに異なっていてよい。抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、薬剤の有効性を増強するおよび／または補完するのに役立つ他の薬剤と併せて使用されてもよい。
ミオパチーを伴う疾患／障害に対する処置の効能は、任意の好適な方法を使用して評価され得る。例えばミオパチーを伴う疾患／障害に対する処置の効能は、筋脱力を評価すること（例えば脱力のパターンおよび重症度を評価すること）、筋電図検査、血液化学を評価すること（例えば電解質を評価する、内分泌的原因を評価すること、クレアチニンキナーゼレベルを測定すること、赤血球沈降速度を決定することおよび抗核抗体アッセイを実
施すること）、ならびに生検を評価すること（例えば組織学的、組織化学的、電子顕微鏡、生化学および遺伝子解析によって）によって評価され得る。
ミオパチーを伴う疾患／障害を緩和することにおける使用のためのキット
本開示は、ミオパチーを伴う疾患／障害を緩和することにおける使用のためのキットも提供する。そのようなキットは、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体、例えば本明細書に記載のもののいずれかを含む１つまたは複数の容器を含んでよい。
いくつかの実施形態ではキットは、本明細書に記載の方法のいずれかによる使用のための指示を含んでよい。含まれる指示は、本明細書に記載の標的疾患を処置する、発病を遅らせるまたは緩和するための抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の投与の記載を含み得る。キットは、個体が標的疾患を有するかどうかを同定することに基づいて処置に好適な個体を選択する記載をさらに含み得る。さらに他の実施形態では、指示は、標的疾患のリスクがある個体に抗体を投与する記載を含む。
抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の使用に関する指示は、一般に目的の処置のための投薬量、投与スケジュールおよび投与の経路についての情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば複数用量パッケージ）または部分単位用量であってよい。本開示のキット中に供給される指示は、典型的にはラベルまたはパッケージ挿入物（例えばキットに含まれる紙のシート）上の指示書であるが、機械で読み取り可能な指示（例えば磁気または光学保存ディスク上に書き込まれた指示）も許容される。
ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物がミオパチーを伴う疾患または障害を処置する、発病を遅らせるおよび／または緩和するために使用されることを示す。指示は、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するために提供されてよい。
本開示のキットは、好適なパッケージ中にある。好適なパッケージは、これらに限定されないが、バイアル、ビン、ジャー、可撓性パッケージ（例えばシールされたマイラーまたはプラスチックバッグ）などを含む。吸入器、鼻投与デバイス（例えばアトマイザー）またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスとの組合せでの使用のためのパッケージも検討される。キットは、無菌アクセスポートを有してよい（例えば容器は皮下注射針によって貫通できるストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。容器も無菌アクセスポートを有してよい（例えば容器は皮下注射針によって貫通できるストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載の抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体である。
任意選択でキットは、緩衝剤および解釈の情報などの追加的構成成分を提供できる。通常キットは、容器および、容器上にまたは容器に付随してラベルまたはパッケージ挿入物（複数可）を含む。いくつかの実施形態では本開示は、上に記載のキットの内容物を含む製造品を提供する。
プロ／潜在型ミオスタチンを検出するためのアッセイ
いくつかの実施形態では本明細書で提供される方法および組成物は、被験体から得られた試料中のプロ／潜在型ミオスタチンを検出するための方法に関する。本明細書において使用される場合、「被験体」は、個々の生物、例えば個々の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では被験体はヒトである。いくつかの実施形態では被験体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では被験体は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では被験体はげっ歯類である。いくつかの実施形態では被験体はヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。いくつかの実施形態では被験体は、脊椎動物、両生類、は虫類、魚類、昆虫
、ハエまたは線虫である。いくつかの実施形態では被験体は実験動物である。いくつかの実施形態では被験体は、遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト被験体である。被験体は、いずれの性で任意の発達段階であってよい。いくつかの実施形態では被験体は、患者または健常なボランティアである。
いくつかの実施形態では、被験体から得られた試料中のプロ／潜在型ミオスタチンを検出するための方法は（ａ）抗原が試料中に存在する場合、抗体の抗原への結合に好適な条件下で試料を抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体と接触させ、それにより結合複合体を形成すること、および（ｂ）抗原に結合した抗体または抗原結合性断片のレベルを決定すること（例えば結合複合体のレベルを決定すること）を含む。
本明細書において使用される場合、結合複合体は、抗原（例えばプロ／潜在型ミオスタチンタンパク質）に結合した抗体（抗原結合性断片を含む）の生体分子複合体を指す。結合複合体は、単一の特異性を有する抗体または異なる特異性を有する２つもしくはそれ超の抗体もしくは抗原結合性断片を含んでよい。一実施形態では結合複合体は、同じ抗原上の異なる抗原性部位を認識する２つまたはそれ超の抗体を含む。いくつかの場合では抗体は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、多糖またはタンパク質などの他の生体分子に結合している抗原に結合できる。一実施形態では結合複合体は異なる抗原を認識する２つまたはそれ超の抗体を含む。いくつかの実施形態では結合複合体中の抗体（例えば抗原に結合した固定化抗体）は、それ自体が抗原として抗体（例えば検出可能に標識された抗体）に結合できる。したがって、結合複合体は、いくつかの場合では、複数の抗原および複数の抗体または抗原結合性断片を含む場合がある。
結合複合体中に存在する抗原は、ｉｎ ｓｉｔｕでのそれらの天然のコンフォメーションであってもなくてもよい。いくつかの実施形態では結合複合体は、抗体と精製されたタンパク質抗原または抗原を含む単離されたタンパク質との間で形成され、その中で抗原はｉｎ ｓｉｔｕでのその天然のコンフォメーションではない。いくつかの実施形態では、結合複合体は、抗体と精製されたタンパク質抗原との間で形成され、その中で抗原はｉｎ
ｓｉｔｕでのその天然のコンフォメーションではなく、固体支持体（例えばＰＶＤＦ膜）に固定されている。いくつかの実施形態では結合複合体は、抗体と、例えばｉｎ ｓｉｔｕに天然のコンフォメーション（例えば細胞表面上）に存在する細胞表面タンパク質とで形成される。
結合複合体中の抗体は、検出可能に標識されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態では結合複合体は、検出可能に標識された抗体および標識されていない抗体を含む。いくつかの実施形態では結合複合体は、検出可能に標識された抗原を含む。いくつかの実施形態では結合複合体中の抗体は、１つまたは複数の固体支持体に固定されている。いくつかの実施形態では結合複合体中の抗原は、１つまたは複数の固体支持体に固定されている。例示的な固体支持体は、本明細書に開示されており、当業者に明らかである。結合複合体の前述の例は限定を意図しない。結合複合体の他の例は当業者に明らかである。
検出、診断およびモニタリング方法のいずれにおいても抗体（抗原結合性断片を含む）または抗原は、固体支持体表面に直接または間接のいずれかでコンジュゲートされてよい。固体支持体へのコンジュゲーションのための方法は、標準的であり、共有結合的および非共有結合的相互作用を介して達成されてよい。コンジュゲーション方法の非限定的例は、吸着、架橋結合、プロテインＡ／Ｇ抗体相互作用およびストレプトアビジン－ビオチン相互作用を含む。コンジュゲーションの他の方法は、当業者に容易に明らかである。
いくつかの態様では、検出、診断およびモニタリング方法は、抗原（例えばプロ／潜在型ミオスタチン）に結合した抗体（抗原結合性断片を含む）のレベルを１つまたは複数の
参照基準と比較することを含む。参照基準は、例えばプロ／潜在型ミオスタチンを有するまたは有さない被験体における対応するプロ／潜在型ミオスタチンのレベルであってよい。一実施形態では参照基準は、プロ／潜在型ミオスタチン（例えばバックグラウンドレベル）を含有しない試料において検出されるプロ／潜在型ミオスタチンのレベルである。代替的にバックグラウンドレベルは、特定のプロ／潜在型ミオスタチンを含有する試料から試料を非特異的抗体（例えば非免疫血清から得られた抗体）と接触させることによって決定され得る。再度参照基準は、プロ／潜在型ミオスタチンを含有する試料（例えば陽性対照）において検出されたプロ／潜在型ミオスタチンのレベルであってよい。いくつかの場合、参照基準は試料中のプロ／潜在型ミオスタチンの濃度の変動と関連する一連のレベルであってよく、試験試料中のプロ／潜在型ミオスタチンの濃度を定量するのに有用であり得る。参照基準の前述の例は、限定ではなく、他の好適な参照基準は、当業者に容易に明らかである。いくつかの実施形態ではプロ／潜在型ミオスタチンに結合する抗体のレベルは、成熟ミオスタチンのレベルと比較される。いくつかの場合ではプロ／潜在型ミオスタチンのレベルは、試料中の不活性ミオスタチン対活性ミオスタチンの比率を決定するために成熟ミオスタチンと比較される。
プロ／潜在型ミオスタチンのレベルは、生物学的試料から本明細書で提供されるとおり測定され得る。生物学的試料は、被験体または細胞から得られてよい任意の生物学的材料を指す。例えば生物学的試料は、全血、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、細胞（もしくは細胞溶解物）または組織（例えば正常組織もしくは腫瘍組織）であってよい。いくつかの実施形態では生物学的試料は、流体試料である。いくつかの実施形態では生物学的試料は、固形組織試料である。例えば組織試料は、非限定的に骨格筋、心臓の筋肉、脂肪組織および他の器官由来の組織を含んでよい。いくつかの実施形態では生物学的試料は、生検試料である。いくつかの実施形態では固形組織試料は、当技術分野における日常的方法を使用して流体試料にされてよい。
生物学的試料は、細胞株の１つまたは複数の細胞も含んでよい。いくつかの実施形態では細胞株は、ヒト細胞、霊長類細胞（例えばベロ細胞）、ラット細胞（例えばＧＨ３細胞、ＯＣ２３細胞）またはマウス細胞（例えばＭＣ３Ｔ３細胞）を含む。非限定的にヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種のがん細胞株（ＮＣＩ６０）由来のがん細胞、ＤＵ１４５（前立腺がん）細胞、Ｌｎｃａｐ（前立腺がん）細胞、ＭＣＦ－７（乳がん）細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４３８（乳がん）細胞、ＰＣ３（前立腺がん）細胞、Ｔ４７Ｄ（乳がん）細胞、ＴＨＰ－１（急性骨髄性白血病）細胞、Ｕ８７（神経膠芽腫）細胞、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞（骨髄腫からのクローニング）およびＳａｏｓ－２（骨がん）細胞を含む種々のヒト細胞株がある。
さらなる実施形態は、疾患または状態を有するまたは有するリスクがある被験体において疾患、状態または任意のその処置（例えばミオパチーまたはミオパチー処置）をモニタリングするための方法であって、（ａ）生物学的試料を被験体から得ること、（ｂ）プロ／潜在型ミオスタチンを検出する抗体を使用して生物学的試料中のプロ／潜在型ミオスタチンのレベルを決定すること、ならびに（ｃ）１回または複数回の機会にステップ（ａ）および（ｂ）を反復することを含む方法に関する。ミオスタチンは、筋萎縮症についてのバイオマーカーとして使用されているが、現在利用可能な商業的方法および試薬（例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにおいて使用される抗体）は、ミオスタチンに対して特異的ではないか、成熟ミオスタチンだけを検出するか、またはミオスタチンを全く検出しないかのいずれかである。したがって、疾患および／または状態（例えば筋萎縮症）の文脈において診断目的でプロ／潜在型ミオスタチンを検出するための方法および試薬（例えば抗体）が本明細書で提供される。一例としてプロ／潜在型ミオスタチンのレベルは、被験体またはそれ由来の生物学的試料において疾患または状態の進行を検出またはモニ
タリングするために測定されてよい。別の例としてプロ／潜在型ミオスタチンのレベルは、被験体またはそれ由来の生物学的試料において疾患または状態に対する処置への応答をモニタリングするために測定されてよい。プロ／潜在型ミオスタチンのレベルが、被験体が有する疾患もしくは状態または被験体が供され得る任意の処置レジメンに応じて異なる場合がある任意の好適な期間にわたってモニタリングされてよいことは理解されるべきである。
別の実施形態は、上に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のいずれか１つおよび任意選択で検出のための好適な手段を含む診断用組成物に関する。抗体は、例えば、それらを液相でまたは固相担体に結合させて利用し得るイムノアッセイにおける使用に適する。抗体を利用する場合があるイムノアッセイの例は、直接または間接形式での競合的および非競合的イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ））、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学、免疫顕微鏡検査（ｉｍｍｕｎｏ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、側方流動免疫クロマトグラフィーアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ）およびプロテオミクスアレイである。抗原および抗体は、多数の異なる固体支持体（例えば担体、膜、カラム、プロテオミクスアレイなど）に結合させてよい。固体支持体材料の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、ニトロセルロースなどの天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。支持体の性質は、固定されているかまたは溶液中に懸濁されているか（例えばビーズ）のいずれであってもよい。
さらなる実施形態によって、本明細書で提供される抗体（抗原結合性断片を含む）は、組織試料、血液試料または任意の他の適切な体液試料であってよい被験体由来の生物学的試料を得ることによって、被験体におけるプロ／潜在型ミオスタチン発現を評価するための方法においても使用され得る。手順は、血液試料（全血、血清、血漿）、組織試料またはそれから単離されたタンパク質試料を、抗体と抗原との間の結合複合体の形成を可能にする条件下で抗体と接触させることを含み得る。次いでそのような結合複合体のレベルは、任意の好適な方法によって決定され得る。いくつかの実施形態では生物学的試料は、抗原が試料中に存在する場合に抗体のプロ／潜在型ミオスタチンタンパク質への結合、および抗原に結合した抗体からなる結合複合体の形成に好適な条件下で抗体と接触させる。この接触させるステップは、チューブ、プレートウェル、メンブレンバス、細胞培養皿、顕微鏡スライドなどの反応チャンバーにおいて典型的には実施される。いくつかの実施形態では抗体は固体支持体に固定される。いくつかの実施形態では抗原は固体支持体に固定される。いくつかの実施形態では固体支持体は、反応チャンバーの表面である。いくつかの実施形態では固体支持体は、ポリマー性膜（例えばニトロセルロースストリップ、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜など）である。他の適切な固体支持体は使用されてよい。
いくつかの実施形態では抗体は、抗原と接触させる前に固体支持体に固定される。他の実施形態では抗体の固定は、結合複合体の形成後に実施される。さらに他の実施形態では抗原は、結合複合体の形成の前に固体支持体に固定される。検出試薬は、固定化された結合複合体を検出するために反応チャンバーに加えられる。いくつかの実施形態では検出試薬は、抗原に対して指向される、検出可能に標識された二次抗体を含む。いくつかの実施形態では一次抗体は、それ自体が検出可能に標識され、そのため検出試薬である。
一態様では検出方法は、固体支持体に抗体を固定するステップ；試料（例えば生物学的試料または単離されたタンパク質試料）を、抗原が試料中に存在する場合に抗原の抗体へ
の結合を可能にする条件下で固体支持体に適用するステップ；固体支持体から過剰な試料を除去するステップ；検出可能に標識された抗体を、検出可能に標識された抗体の抗原結合固定化抗体への結合を可能にする条件下で適用するステップ；固体支持体を洗浄するステップおよび固体支持体上の標識の存在をアッセイするステップを含む。
いくつかの実施形態では抗原は、反応チャンバー（例えばメンブレンバス）中の抗体と接触させる前に、ＰＶＤＦ膜などの固体支持体に固定される。検出試薬は、固定化された結合複合体を検出するために反応チャンバーに加えられる。いくつかの実施形態では検出試薬は、抗原に対して指向される、検出可能に標識された二次抗体を含む。いくつかの実施形態では検出試薬は、一次抗体に対して指向される、検出可能に標識された二次抗体を含む。本明細書で開示のとおり検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、フルオロフォア、発光分子、酵素、ビオチン成分、エピトープタグまたは色素分子であってよい。いくつかの実施形態では一次抗体は、それ自体が検出可能に標識され、そのため検出試薬である。好適な検出可能な標識は、本明細書に記載され、当業者に容易に明らかである。
したがって、（ａ）抗原結合試薬（例えばプロ／潜在型ミオスタチン結合試薬）として、検出可能に標識された抗体および／または非標識抗体、（ｂ）検出試薬、ならびに任意選択で（ｃ）試料中の抗原を検出するための試薬を使用するための完全な指示を含む家庭内または臨床使用に好適な診断用キット（ポイントオブケアサービス）が提供される。いくつかの実施形態では診断キットは、固体支持体に固定された抗体および／またはプロ／潜在型ミオスタチンを含む。本明細書に記載の固体支持体のいずれかは、診断キットへの組み込みに好適である。好ましい実施形態では固体支持体は、プレートウェルの反応チャンバーの表面である。典型的にはプレートウェルは、６個、１２個、２４個、９６個、３８４個および１５３６個から選択されるいくつかのウェルを有するマルチウェルプレート中にあるが、そのように限定されない。他の実施形態では診断キットは、検出可能に標識された抗体を提供する。診断キットは、これらの実施形態に限定されず、キット組成物における他のバリエーションは当業者に容易に明らかである。
したがって、次の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈され、決して本開示の残部の限定ではないと解釈される。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で参照する目的または主題について参照により組み込まれる。
（実施例１：抗体の生成および選択）
抗体の概要
Ａｂ２は、ヒトのプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンに高い親和性（ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢＬＩによりＫｄ＝３４２０ｐＭ）で結合するＩｇＧ４／ラムダアイソタイプの完全ヒト抗プロ／潜在型ミオスタチンモノクローナル抗体である。抗体は、０．５マイクロモル濃度の範囲のＩＣ５０値（アッセイの限界またはほぼ限界である）で、タンパク質分解を介したプロ／潜在型ミオスタチンの活性化を阻害することができる。ポリペプチドの理論的分子量は、１４４，７３６Ｄａであり、その理論的ｐＩは６．７である。抗体ディスプレイを使用する親和性の最適化を行って、より高い親和性の改変体Ａｂ４およびＡｂ６を同定した。親和性最適化改変体を、ヒトＩｇＧ４／ラムダアイソタイプフレームワークにおいて同様に構築する。
Figure 0007418508000012
親抗体のプラットフォームおよび同定
親Ａｂ１抗体は、選択のための一次抗原としてプロおよび潜在型ミオスタチンを使用したナイーブファージディスプレイライブラリーの選択を介して同定した。ファージ選択および初回スクリーニングは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年）によって記載される形式と類似の形式で従来のｓｃＦｖをディスプレイするライブラリーを使用して実施した。各選択ラウンドは、事前除去（ｐｒｅ－ｃｌｅａｒｉｎｇ）（非特異的ファージ抗体を除去するため）、抗原とのインキュベーション、洗浄、溶出、および増幅からなった。選択は、固相（イムノチューブにコーティングされたビオチン化抗原）および溶液相（ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して捕捉されたビオチン化抗原）パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）戦略の両方を使用して複数ラウンドを介して行われた。
全体で１０，０００個の個々のｓｃＦｖクローンを、２つの別個の作戦を通してプロまたは潜在型ミオスタチンに対する結合に関してスクリーニングした。第１のプログラムは、抗原としてプロ／潜在型ミオスタチンを利用したが、第２の作戦は、抗原として潜在型ミオスタチンを使用した。目的のｓｃＦｖクローンのＤＮＡをシークエンシングして、独自のクローン２１６個を同定した。結合陽性のｓｃＦｖクローンを、プロＧＤＦ１１ならびに無関係なタンパク質のパネルに対する結合に関してカウンタースクリーニングして、プロ／潜在型ミオスタチンに関する特異性を確認した。独自のｓｃＦｖクローンのパネルから１０１個（ＧＤＦ８特異的クローン１３４個中）を、さらに特徴付けるために完全長のＩｇＧ（ＩｇＧ１アイソタイプ）に変換した。
完全長のＩｇＧ抗体を、ヒトおよびネズミのプロおよび潜在型形態のミオスタチンならびにＧＤＦ１１に対する結合に関してＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた。ミオスタチンプロドメイン、プロＴＧＦβ（ヒトおよびネズミ）、ミオスタチンの成熟増殖因子、ＧＤＦ１１成熟増殖因子、アクチビンＡ増殖因子、およびプロアクチビンＡに対する結合に関しても、抗体をスクリーニングした。リード抗体を、ヒトおよびネズミのプロおよび潜在型ミオスタチンと交差反応するが、ＧＤＦ１１ともアクチビンともＴＧＦβタンパク質とも相互作用しないことに基づいて選択した。
２つの形態のエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ）を使用した。第１に、ミオスタチンのプロドメインの一部とＧＤＦ１１の一部とを交換したキメラ構築物を設計して生成した。これらのキメラタンパク質を、ＥＬＩＳＡによって、スクリーニング抗体との相互作用に関してアッセイした。ビオチン化プロ／潜在型ミオスタチン抗体がストレプトアビジンコーティングバイオセンサーチップに固定されたＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢＬＩ機器を使用してエピトープビニングを行い、センサー応答によって抗体の交差遮断を評価した。ＥＬＩＳＡ結合実験のデータと共に、これらのエピトープビニング実験によ
り、本発明者らの機能的に活性なリード抗体（以下を参照されたい）を、３つの異なるエピトープ群（表３を参照されたい）に分離することができた。
*一元配置ANOVAとDunnettにより統計学的に有意。
Ab8は、潜在型ミオスタチンに結合せず、プロミオスタチンのみに結合する。ネズミプロ/潜在型ミオスタチン調製物は約40%の潜在型材料を有し、そのために機能的アッセイにお
いて見かけの効能が低減する。
ND:決定していない
抗体がプロ／潜在型ミオスタチンに結合してその活性化を阻害する能力を評価するために、いくつかの生化学および細胞アッセイが確立された。プロおよび潜在型ミオスタチンに対する結合動態を、ビオチン化基質タンパク質がストレプトアビジンコーティングセンサーチップに固定されたＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔによって測定した。スクリーニングからの候補の平衡解離定数を表３に示す。
ＩｇＧがミオスタチンのシグナル伝達を阻害する能力を測定するために、ミオスタチン活性化アッセイを開発した。ｍＴｌｌ２（トロイドプロテアーゼはミオスタチンの活性化を必要とする）またはフューリン（プロドメインから成熟増殖因子を切断するプロタンパク質転換酵素）のいずれかを過剰発現する細胞から馴化培地を生成した。試験抗体とのプレインキュベーション後、プロ／潜在型ミオスタチンまたは潜在型ミオスタチンを、ｍＴｌｌ２およびフューリン馴化培地（プロミオスタチン）の混合物またはｍＴｌｌ２馴化培地（潜在型ミオスタチン）のいずれかと共にインキュベートした。一晩のタンパク質分解反応の後、成熟増殖因子の放出を、２９３Ｔ細胞におけるＣＡＧＡベースのレポーターアッセイを使用して測定した。抗体を、同じアッセイにおいて用量反応によってさらに確認し、その結果を表３に示す。
５つの親抗体（表３）は、上記のアッセイの全てにおいて一貫して強力な選択性および活性を示し、これらをｉｎ ｖｉｖｏでさらに特徴付けるためにさらに選択した（実施例２において考察される）。Ａｂ８は、潜在型ミオスタチンを認識しないが、一貫性のために、プロ／潜在型ミオスタチンに対するこれらの抗体の結合および活性を要約する。
抗体候補の作用機序を決定するために、図３に示すようにミオスタチンのプロドメインに対して惹起されたポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって試料を分
析した。これによって、ｍＴｌｌ２切断後に生成されるミオスタチンプロドメインの断片（四角で囲った部分）の追跡が可能となった。Ａｂ１の濃度が増加するにつれて、この断片の生成の用量依存的な減少が認められた。この実験は、エピトープビン１の抗体が、プロテアーゼのトロイドファミリーによるプロおよび潜在型ミオスタチンの切断を遮断することによって作用することを示している。
活性抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ活性に基づいて、Ａｂ１を、親和性成熟、生殖系列化、および製造可能性分析を含むさらなる最適化のためのリードとして選択した。
Ａｂ１の最適化
Ａｂ１抗体をさらなる最適化のために選択した。プロ／潜在型ミオスタチンの親和性を、酵母ディスプレイを使用して最適化した。さらに、ヒト可変領域フレームワーク内の非生殖系列アミノ酸位置の起こり得る免疫原性傾向を低減させるために、Ａｂ１の配列を生殖系列化した。
酵母ディスプレイによるＡｂ１の親和性最適化
Ａｂ１親抗体を、酵母に基づくｓｃＦｖディスプレイアプローチを使用してプロ／潜在型ミオスタチンに対する結合に関して最適化した。簡単に説明すると、Ａｂ１が利用するヒトフレームワークに対応する抗体ディープシークエンシングを使用して天然のヒト抗体レパートリーにおいて観察されるアミノ酸頻度に基づいて、選択されたＣＤＲ位置に点変異を導入する３つの異なるｓｃＦｖライブラリーを作製した。それぞれのライブラリーは、得られた重鎖または軽鎖のそれぞれの改変体が、それぞれのＣＤＲに１つの置換を有し、全体で３つの置換を有するように、それぞれのＣＤＲに１つの点変異が導入されたＡｂ１配列に基づくｓｃＦｖを含有した。３つのライブラリーを、ＦＡＣＳベースのソーティングおよび選択のために使用して、プロ／潜在型ミオスタチンに対してより高い結合親和性を有するクローンのプールを同定した（図２３）。酵母発現ｓｃＦｖクローンの直接結合を使用して、哺乳動物細胞培養物において発現される完全長のＩｇＧに転換するための抗体を選択した。
酵母の作戦で同定された高親和性のｓｃＦｖクローンの多くは、重鎖の２８位で置換を含有した。いくつかのクローンでは、トレオニンのアスパラギンへの置換によって、ＣＤＲＨ１内で非標準のＮ－グリコシル化モチーフが組み込まれていた。抗体の可変領域内でのＮ－グリコシル化は望ましくないことがあるので、グリコシル化モチーフを含有するいかなるクローンも、この位置でアラニンを含有するようにさらに置換した。
次に、プロおよび潜在型ミオスタチンに対する結合動態を、親和性最適化構築物のそれぞれに関してｏｃｔｅｔによって評価して、親Ａｂ１の動態と比較した（実施例２において考察する）。クローンは全て、ミオスタチンに関して有意に増加した結合親和性を示し、ＧＤＦ１１と比較した選択的結合プロファイルに基づいて、Ａｂ３およびＡｂ５の２つを選択した。
抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体の一次配列および骨格
親Ａｂ１の可変領域とその親和性最適化改変体との配列アラインメントを以下に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ（下線）およびＩＭＧＴ命名法（太字）を使用して定義される。親Ａｂ１からの置換を、小文字で示す（下記および図２４Ａ～２４Ｂ）。
Figure 0007418508000014
抗体操作およびアイソタイプ選択の根拠
いくつかの実施形態では、ミオスタチンの遮断にとって有用な抗体は、エフェクター機能を欠如する。このため、ヒト化構築物に関して、ＩｇＧ４－Ｆｃ領域を選択した。ＩｇＧ４アイソタイプの抗体は、補体Ｃ１ｑに対する結合が不良で、したがって補体を有意に活性化しない。これらの抗体はまた、Ｆｃγ受容体に対する結合も弱く、そのため抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は非効率的であるか、または存在しない。
ネイティブＩｇＧ４ ｍＡｂに関して起こることが知られているＦａｂアーム交換による起こり得る困難な状況を回避するために、Ａｂ１およびその改変体を、セリン２２８（
ＥＵ番号付け：Ｋａｂａｔ番号付け残基２４１）がプロリンに変換されてＩｇＧ１様（ＣＰＰＣＰ（配列番号５８））ヒンジ配列が生じる安定化「Ａｄａｉｒ」変異（Ａｎｇａｌ、１９９３年）により操作した。この操作したＦｃ配列を、承認された抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ、およびＴｙｓａｂｒｉの生成、ならびに現行のいくつかの後期臨床候補ｍＡｂに使用する。
生殖系列化および免疫原性のリスク評価
Ａｂ１親抗体およびその改変体は、ファージディスプレイに由来する完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、ラムダ抗体である。抗体のＦｃ部分は、Ｆａｂアーム交換を防止するために１つの安定化変異を（上記）含有する。ＩｇＧ４ Ｆｃは、Ｆｃガンマ受容体に対して測定可能な結合を有すると予想されない（実施例２を参照されたい）。
完全ヒトナイーブファージライブラリーから単離されたＡｂ１の可変フレームワーク領域は、５つの非生殖系列アミノ酸を含有する（以下および図２２を参照されたい）。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔの命名法を使用して定義され、下線で示される。非生殖系列の残基を小文字で示す。
Figure 0007418508000015
Figure 0007418508000016
免疫原性の可能性を緩和するために、非生殖系列フレームワーク残基をその対応する生殖系列アミノ酸に置換するＡｂ１分子のさらなる改変体を作製した。いくつかの実施形態では、Ａｂ１に関する置換を、Ａｂ３およびＡｂ４、またはその生殖系列化が適切である本明細書に開示される任意の抗体に同様に適用することができる。
Ａｂ１の可変領域と、その親和性最適化改変体との配列アラインメントを、以下に示す。Ａ．）重鎖、Ｂ．）軽鎖。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ（下線）およびＩＭＧＴ命名法（太字）を使用して定義する。親Ａｂ１に存在するフレームワーク領域の置換を小文字で示す。
Figure 0007418508000017
Figure 0007418508000018
５つの置換のうち３つは、ＣＤＲ領域から離れていることが見出され、したがって、結
合に影響を及ぼさない。軽鎖の２位のプロリンはＣＤＲＬ３に対してパッキングされていることから、このプロリンを生殖系列のセリンに置換すると、ＣＤＲのコンフォメーションを安定化させることによって、プロ／潜在型ミオスタチンに対する結合を実際に改善する。
抗体全体は、９９％超がヒトである（１００％から、ＣＤＲＨ３を除く非生殖系列ＡＡの％を差し引くことによって算出した）。化学コンジュゲーションは存在しない。重鎖ＣＤＲＨ２配列は、生殖系列ＩｇＨＶ３－３０配列にも存在する、起こり得る異性化傾向（Ａｓｐ－Ｇｌｙ）を含有する。
（実施例２：薬理学的特徴付け）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学アッセイ
全体で２４個の最適化Ａｂ１改変体を発現させて、ＩｇＧ４として精製し、結合および機能的活性の改善に関してアッセイした。これらの分子に対する変化は、親和性成熟スクリーニングにおいてプロ／潜在型ミオスタチンに対する結合の増加を付与するＣＤＲの変異と共に、親可変領域に対する生殖系列化変異を含んだ（実施例１を参照されたい）。
Ａｂ１改変体を、プロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンタンパク質（ヒト、ネズミ、およびカニクイザル）に対する結合を、陰性対照タンパク質の大規模スクリーニングと共に再評価するいくつかの異なるＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてスクリーニングして、親和性成熟の結果として非特異的結合が導入されないことを確認した。陰性対照は、ＧＤＦ１１タンパク質（プロＧＤＦ１１、潜在型ＧＤＦ１１、および成熟ＧＤＦ１１）、ＴＧＦβタンパク質、ならびにアクチビンタンパク質（プロアクチビン）を含んだ。さらに、抗体を、既に公表されたスクリーニング（Ｈｏｔｚｅｌら、２０１２年）と類似のスクリーニングにおいて多重特異性（急速なクリアランスが起こり得る）に関して評価した。多重特異性スクリーニングにおいて陰性対照タンパク質またはバキュロウイルス粒子と有意に相互作用するいかなる抗体も、開発プログラムの候補としてさらに考慮しなかった。
Ａｂ１の２４個の最適化改変体も、プロミオスタチン活性化アッセイにおいて評価して、その機能的効能を決定して、用量反応曲線からのＥＣ５０値を親Ａｂ１抗体と比較した。ほとんどの抗体は同等であるか、または改善されたＥＣ５０値を有し、このアッセイにおいて効能の低減を示したのは少数であった。活性アッセイにおいて効能が低減した抗体をさらなる分析から除外した。
プロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンに対する結合が改善したが、プロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンに対して特異性を保持するＡｂ１の３つの改変体を同定した。これらの３つの改変体および親Ａｂ１分子の結合および活性データを、表４～７に要約し、配列を実施例１に示す。
細胞ベースのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの生物活性アッセイ
Ａｂ１最適化改変体を、ＧＤＦ８活性化アッセイにおいて用量反応試験で評価した。これらの実験において、０．５μＭプロミオスタチンを、漸増量の試験物質と共にプレインキュベートした。このプレインキュベーションステップの後、ｍＴｌｌ２およびフューリンプロテアーゼを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞由来の馴化培地を添加して、プロミオスタチンから成熟増殖因子を放出させた。３０℃で一晩インキュベートした後、材料を、ＳＭＡＤベースのルシフェラーゼレポータープラスミドを有する２９３Ｔ細胞に添加して、放出された材料の活性を記録した。スクリーニングのデータを図４に示す。
他のＴＧＦβファミリーメンバーよりも優先したミオスタチンに対する選択性
候補抗体の選択性も、結合および機能的アッセイの両方によって評価して、ＴＧＦβファミリーの他のメンバーに対して交差反応性がないことを確認した。ヒトミオスタチンとＧＤＦ１１とは、成熟増殖因子ドメインにおいて９０％の同一性を共有し、プロドメイン領域において４７％の同一性を共有する。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ミオスタチンのプロドメインからなる構築物にこの抗体が結合することが示されていることから、エピトープマッピング試験から、親Ａｂ１分子がプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンのプロドメイン上のエピトープを認識することが決定された。ミオスタチンのプロドメインとＧＤＦ１１は５０％未満の同一性を共有し、有意な交差反応性は予想されないものの、リード抗体の特異性を注意深く評価した。
目的の抗体と陰性対照試薬との間の相互作用を検出する感度の良いアッセイを開発した。このアッセイにおいて、ビオチン化プロＧＤＦ１１またはビオチン化プロミオスタチンを、抗体３０μｇ／ｍＬを含有するウェルに適用したＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢＬＩストレプトアビジンコーティングセンサーチップ上に固定した。検体と、チップ上に固定したタンパク質との相互作用を、バイオセンサーチップの応答の大きさによって測定する。会合５分後のバイオセンサー応答（プロＧＤＦ８の飽和シグナル）を２つの抗原の間で比較して、ＧＤＦ８結合に関する応答率として表した。抗体は全て、プロミオスタチンに関して測定される確固とした結合事象と比較して、プロＧＤＦ１１と最小限の相互作用を有した。
Figure 0007418508000023
抗体候補もＧＤＦ１１活性化アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、５０ｎＭプロＧＤＦ１１を、増加濃度の抗体と共にプレインキュベートする。プレインキュベーションの後、ＢＭＰ－１（トロイドファミリープロテアーゼ）およびＰＣＳＫ５（ＧＤＦ１１に対して特異的なフューリンファミリーメンバー）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞由来の馴化培地を添加して、タンパク質分解を介してプロＧＤＦ１１を活性化した。３０℃で一晩インキュベートした後、反応混合物をＳＭＡＤベースのレポーター細胞株においてＧＤＦ１１活性に関して評価する。表８に示すように、抗ミオスタチン抗体は、プロＧＤＦ１１活性化を阻害しないが、陽性対照抗体は、ＧＤＦ１１活性化の用量依存的阻害を付与する。
抗体候補の結合親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｑｋｅディップを使用して決定し、生体層干渉法（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を利用して標識フリーのアッセイシステムを読み取った。それぞれの実験において抗原をバイオセンサー（プロＧＤＦ８、プロＧＤＦ１１、およびプロアクチビンに関してストレプトアビジンコーティングバイオセンサー；他の全てに関して直接アミンカップリング）に固定して、抗体／構築物を、溶液中で高濃度（５０μｇ／ｍＬ）で提示して、結合相互作用を測定した。
抗体の結合親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅディップを使用して決定し、生体層干渉法を利用して標識フリーのアッセイシステムを読み取った。ヒトプロＧＤＦ８、潜在型ＧＤＦ８、プロＧＤＦ１１およびプロアクチビンをビオチン化し、ストレプトアビジンで被覆したバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。製造者（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の指示書に従ってアミン反応性チップへの直接アミンカップリングによって、成熟増殖因子を固定化した。それぞれの実験において、抗体／構築物を溶液中で単一の高濃度（５０μｇ／ｍＬ）で提示して、結合相互作用を測定した。増殖因子はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより購入し、ビオチン化タンパク質は記載した通りに生成した。
Figure 0007418508000024
抗原結合試験からの結果を表９ａに要約する。検出される結合がない実験はマイナス符号（－）で示す。不良な結合応答を有するデータにフィットさせたいくつかの算出されたＫｄ値が存在し、これらは表において弱い非特異的結合（＊）として示す。
表９ａで使用したプロＧＤＦ８試料は約１０～１５％の潜在型ＧＤＦ８を含有していたので、ヒトおよびネズミのＧＤＦ８抗原へのプロＧＤＦ８の結合を特異的に確認するために別の実験を行った。さらに、プロＧＤＦ８がプロタンパク質転換酵素およびトロイドプロテアーゼの両方によってタンパク質分解を介して切断されたプライムドＧＤＦ８も、Ａｂ２およびＡＢＭｙｏへの結合親和性について評価した。これらの実験のため、３０μＭのデカノイル－ＲＶＫＲ－ＣＭＶの存在下に培養して、安定的に組み込みが起きた２９３細胞から、ヒトプロＧＤＦ８の均一な調製物を精製した。プライムドヒトＧＤＦ８は、ｍＴｌｌ２過発現細胞からの馴化培地および精製したフューリンプロテアーゼを利用するプロＧＤＦ８のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断によって産生した。これらのタンパク質を用いた結合実験において、１５０ｎＭのＡｂ２またはＡｂＭｙｏを使用してヒトＦｃキャプチャーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の固定化部位を飽和させ、１５０ｎＭの分析物の会合および解離を評価した。
ネズミタンパク質に対する結合親和性の解析も評価し、表９ｂに報告する。ネズミプロＧＤＦ８は、潜在型および成熟ＧＤＦ８を厳密に認識する抗体（ＡｂＭｙｏ２）を用いるネガティブセレクションによって試料から全ての成熟および潜在型ネズミＧＤＦ８を除去することによって産生した。抗ヒトＦｃキャプチャーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を飽和するために５０ｎＭの抗体を使用した。最初に、単一の濃度２００ｎＭのネズミプロＧＤＦ８、ネズミ潜在型ＧＤＦ８、および成熟ＧＤＦ８に対して全ての抗体を試験した。結合が観察された場合には、既に述べたようにして抗体を固定化し、２００～０．８２ｎＭの３倍希釈による滴定で分析物を使用することによって、Ｋｄ値を決定した。Ｋｄは、ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ解析ソフトウェア８．２によるグローバルフィットを使用して決定した。成熟ミオスタチンへの結合のため、ｐＨ５の酢酸緩衝液中で５μｇ／ｍＬの増殖因
子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をアミン反応性センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にカップリングした。このミオスタチンカップリングセンサーへの結合について、全ての抗体を最初に３３３ｎＭで試験した。次いで結合を示した抗体を３３３～１．３７ｎＭの範囲で３倍希釈した濃度で試験した。グローバルフィットを使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ解析ソフトウェア８．２によって相互作用のＫｄを決定した。
Figure 0007418508000025
抗原結合試験からの結果を表９ｂに要約する。検出される結合がない実験はマイナス符号（－）で示す。＜１Ｅ－１２とラベルしたいくつかの値は非常に遅い解離速度を有し、高い親和性を定量することができない。驚くべきことに、ＡｂＭｙｏは組換えプロＧＤＦ８を認識することができず、これはLatresら（２０１５年）が報告した結果と異なる。この報告ではアーチファクトを生じる可能性がある、抗体の投与を行ったマウスの血清からの免疫沈降実験におけるＡｂＭｙｏとプロＧＤＦ８との会合が報告されている。別の驚くべき結果は、Ａｂ２とプライムドＧＤＦ８、即ちＧＤＦ８とトロイドで切断されたプロドメインとの複合体との相互作用である。Ａｂ２はプロドメインのトロイド切断を遮断するので、この結果は予想されないものであり、Ａｂ２のプロＧＤＦ８および潜在型ＧＤＦ８との相互作用はインタクトなトロイド切断部位を必要としないことを示唆している。
Ｆｃ領域の機能性の評価
いくつかの実施形態では抗プロ／潜在型ミオスタチン療法には、可溶性の標的（プロ／潜在型ミオスタチン）に結合することおよびタンパク質分解を介した活性化防止することが含まれる。いくつかの実施形態では抗体依存性細胞媒介性細胞傷害および補体結合は、このプロセスに含まれない。Ａｂ１およびその関連する改変体を、ＩｇＧ４－Ｆｃ領域を含有するように操作した。ＩｇＧ４抗体は一般的に、補体成分Ｃ１ｑおよびＦｃγ受容体に対するその結合が弱いためにエフェクター機能を欠如すると理解される。
エフェクター機能の能力が低減されていることを証明するために、Ａｂ１および関連する抗体を、ＥＬＩＳＡによってＣＤ６４（ＦｃｇＲＩ）およびＣ１ｑに対する結合に関して試験した。比較のために、Ａｂ１のＩｇＧ１改変体も調製した。このアッセイにおいて、ＩｇＧ４抗体は全て、ＩｇＧ１と比較してＣＤ６４およびＣ１ｑに対して有意に弱い結合（１／１０～１／２０）を示した。ＥＣ５０での相対的結合値を表１０に記載する。
Figure 0007418508000026
Ａｂ１およびその関連改変体のＣＤ６４およびＣ１ｑに対する見かけの結合親和性は、他のＩｇＧ４臨床候補抗体と類似であり、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体と比較してかなり低減されている。したがって、ＩｇＧ４抗体の生物学に基づいて、抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで認識可能なエフェクター機能を誘導しないと結論される。
動物モデルにおける効能
ｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付けに基づいて、４つの抗体（Ａｂ７、Ａｂ１、Ａｂ８、およびＡｂ９）を選択して、ｉｎ ｖｉｖｏ試験において試験した。試験の目的は、これらの４つの候補抗体がマウスの筋肉量を調節する能力を評価することであった。１０匹の雌性ＳＣＩＤマウスの５つの群に、試験物質を１週間に１回、０、７、１４、２１、２８、および３５日目に腹腔内（ＩＰ）注射によって投与した。試験物質の投与前（０日目）、全ての動物に握力評価を行った。握力評価はまた、試験の最終日（４２日目）にも実施した。０日目に、全血球算定（ＣＢＣ）評価のために血液を後眼窩出血を介して採取した。投与後、動物を体重および全身健康状態の観察について毎日評価した。４２日目に、握力評価の後、動物をＣＯ２過量投与によって屠殺して、ＣＢＣ評価のために心穿刺によって血液を採取した。血漿を調製するために、さらなる血液を採取した。様々な組織を単離して重量を測定した。採取した筋肉は、腓腹筋、胸筋、ヒラメ筋、三頭筋、前脛骨筋、四頭筋（大腿直筋）、および横隔膜であった。採取した臓器は、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、および鼠径部白色脂肪組織であった。組織は全て重量を測定して、瞬間凍結したが、腓腹筋は、組織学分析のためにホルマリン（脚１）およびＯＣＴ（脚２）で固定した。
要約
試験ＳＣＨ－０２における動物の平均一日体重変化率データを図６に示す。５群全ての動物の体重は、毎週増加した。抗体Ａｂ１で処置した動物は、図６に描写するように、最大の体重増加（１４．６％）を示した。Ａｂ１で処置した動物のみが、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群の動物と比較して平均体重変化率の統計学的に有意な増加を示した（図６）。
切除した筋肉の重量を図７および８にプロットする。Ａｂ１で処置した動物は、ビヒクル（ＰＢＳ）対照処置動物と比較して腓腹筋（図７Ａ）および横隔膜（図８Ｂ）重量の統計学的に有意な増加、それぞれ２７．６％および４９．８％を示した。Ａｂ１処置動物からのさらなる筋肉は、ＰＢＳ対照と比較して重量の増加を示したが、これらの差は統計学的に有意ではなかった。心臓、脾臓、腎臓、肝臓および脂肪組織の平均組織重量に関して処置群の間に統計学的有意差はなかった。
ＳＣＩＤ用量反応試験
ｉｎ ｖｉｖｏ試験（上記）において、Ａｂ１を２５ｍｇ／ｋｇで１週間に１回６週間投与した動物は、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した動物と比較して、体重および筋重量（腓腹筋および横隔膜）の統計学的に有意な増加を示した。次に、Ａｂ１のこの筋肉増強活性を、ＳＣＩＤマウスの用量反応試験においてより詳細に調べた。この試験において、筋肉量に及ぼす効果の大きさを、Ａｂ１の用量を６０ｍｇ／ｋｇ／週もの高用量まで増加させることによって増加させることができるか否か、および筋肉量に及ぼす効果の大きさを、Ａｂ１の用量を２ｍｇ／ｋｇ／週もの低用量に減少させることによって減少させることができるか否かを調べた。この試験において、Ａｂ１の活性を、さらに２つの抗体（上記の試験で当初試験したＡｂ８、およびＡｂ１０）と比較した。
１０匹の雌性ＳＣＩＤマウスの１０個の群に試験物質を腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｌ／ｋｇ）によって週に２回、０、３、７、１０、１４、１７、２１、および２４日目に投与した。試験物質の用量は以下のとおりであった：Ａｂ１（３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ１０（１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＡｂ８（１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）。対照群にはＰＢＳおよびＩｇＧ対照（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。処置群を表１１に記載する。動物は、試験開始時１０週齢であった。体重を－４日目に測定して、投与日に対応して試験を通し週に２回、測定した。身体組成パラメータ（脂肪量、除脂肪量、および水分含有量）を、ＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）によって－４、７、１４、２１、および２８日目に測定した。抗体の初回用量から３０日後に動物をＣＯ２の過量投与によって屠殺して、ＣＢＣ評価および血漿調製のために心穿刺によって血液を採取した。さらに、試験終了時に、様々な組織を単離して重量を測定した。採取した筋肉は、腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、四頭筋（大腿直筋）、および横隔膜であった。筋肉を、試験マウスの左右両方の脚から切除した。分析のために、両方の脚からの個々の筋肉の重量を合計してグラムでの平均筋重量を算出した。採取した他の組織は、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、および脂肪組織であった。組織は全て、重量を測定して、次いで、瞬間凍結したが、腓腹筋は、組織学分析のためにホルマリン（左脚）およびＯＣＴ（右脚）で固定した。
ビヒクル（ＰＢＳ）、ＩｇＧ対照、およびＡｂ１の異なる用量で処置した動物に関する平均体重変化率および平均除脂肪量変化率データを図９に示す。２０および６０ｍｇ／ｋｇ／週の用量のＡｂ１で処置した動物は、ＩｇＧ対照処置動物と比較して試験２８日目に体重の有意な増加、それぞれ１５．３％および１４．４％を示した（図９Ａ）。Ａｂ１（６０、２０、６、および２ｍｇ／ｋｇ／週の用量）で処置した動物の４つ全ての群が、ＩｇＧ対照処置動物と比較して試験２８日目に除脂肪量の統計学的に有意な増加、それぞれ、１４．１％、１２．４％、１７．１％、および１５．５％を示した（図９Ｂ）。
４つの筋肉（四頭筋、腓腹筋、前脛骨筋、および横隔膜）の重量を図１０にプロットする。ヒラメ筋も切除したが、筋肉のサイズが小さいために、データセットは極めて変動した。Ａｂ１の全ての用量で処置した動物は、ＩｇＧ対照動物と比較して筋重量の統計学的に有意な増加を示した（図１０）。ＩｇＧ対照と比較した筋肉量の平均変化率を、それぞれの筋肉グラフ上で対応する棒グラフの上に示す。四頭筋重量の平均変化率は、最高用量の２０．５％から最低用量の１０．７％までの範囲であった（図１０Ａ）。腓腹筋重量の平均重量変化率は、最高用量の１７．７％から最低用量の１５．９％までの範囲であった（図１０Ｂ）。前脛骨筋重量の平均重量変化率は、最高用量の２４．０％から最低用量の１８．０％までの範囲であった（図１０Ｃ）。横隔膜筋重量の平均重量変化率は、全ての用量群に関して３０％超であった（図１０Ｄ）。心臓、脾臓、腎臓、肝臓、および脂肪組織の平均組織重量に関して処置群間で統計学的有意差はなかった。
デキサメタゾン誘導筋萎縮症モデルにおけるＡｂ１処置
健康なＳＣＩＤマウスにおいて抗ミオスタチン抗体Ａｂ１が筋肉量を構築する能力を考慮して、Ａｂ１処置が、筋萎縮症を誘導する処置から動物を保護することもできるか否かを決定した。動物を、その飲料水中のデキサメタゾンで２週間処置することによって、コルチコステロイド誘導筋萎縮症モデルを確立した。選択した用量（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）は、除脂肪体重および個々の後肢筋肉量の有意な減少を誘導することができた。以下の実験において、動物を、Ａｂ１の異なる用量で処置して、このデキサメタゾン誘導筋萎縮症から動物を保護できるか否かを決定した。
この試験において、１０匹の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の８つの群を、１３．５週齢で試験に登録した。試験０日目に開始して、マウスに、通常の飲料水（群１～４）、またはデキサメタゾンを含有する水（群５～８）のいずれかを与えた。試験物質を、週に２回、０、３、７、および１０日目に腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｌ／ｋｇ）によって投与した。試験物質および用量は以下のとおりであった：ＰＢＳ（群１および５）、１０ｍｇ／ｋｇ ＩｇＧ対照（群２および６）、１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１（群３および７）、ならびに１ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１（群４および８）。処置群を表１２に記載する。試験を通して少なくとも週に２回、体重を測定した。身体組成パラメータ（脂肪量、除脂肪量、および水分含有量）を、ＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）によって、－１、６、および１３日目に測定した。抗体の初回用量から１４日後、動物をＣＯ２の過量投与によって屠殺して、血漿を調製するために心穿刺によって血液を採取した。さらに、試験終了時、様々な組織を単離して重量を測定した。採取した筋肉は、腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、四頭筋（大腿直筋）、および横隔膜であった。筋肉を、試験マウスの左右両方の脚から切除した。分析のために、両方の脚の個々の筋肉の重量を合計して、平均筋重量をグラムで算出した。採取した他の組織は、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、および脂肪組織であった。組織は全て、重量を測定して、次いで、瞬間凍結したが、腓腹筋は、組織学分析のためにホルマリン（左脚）およびＯＣＴ（右脚）で固定した。
Figure 0007418508000028
この実験において、抗ミオスタチン抗体Ａｂ１によるマウスの処置が、コルチコステロイド誘導筋萎縮症から動物を保護できるか否かを決定した。試験中、体重を週に２回測定して、除脂肪量を－１、６および１３日目にＱＮＭＲによって測定した。非疾患対照群（群１）およびデキサメタゾン処置群（群５～８）の動物に関して、平均体重変化率および平均除脂肪量変化率データを図１１に示す。１４日目では、これらの処置群のいずれの間でも平均体重変化率に有意差は認められなかった（図１１Ａ）。デキサメタゾンで２週間マウスを処置すると、通常の飲料水を与えた対照群（群１）と比較して除脂肪体重は有意に減少した（群５および６）（図１１Ｂ）。しかし、デキサメタゾンおよび２０ｍｇ／ｋｇ／週の抗体Ａｂ１の両方で処置したマウス（群７）は、対照群（群１）と比較して試験１４日目に除脂肪体重変化率の有意差を示さなかった。２０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１で処置した動物は、デキサメタゾン処置対照群（群５および６）のいずれかと比較して、１４日目に除脂肪体重変化率の有意差を示したが、２ｍｇ／ｋｇ／週は有意差を示さなかった。
デキサメタゾンおよび試験物質による２週間の処置の終了時、個々の筋肉を切除して、重量を測定した。２つの筋肉（腓腹筋と四頭筋）の重量データを図１２Ａ～１２Ｂにプロットする。飲料水を通してデキサメタゾンを投与され、ＰＢＳまたはＩｇＧ対照抗体のいずれかを同様に投与された動物は、非疾患対照群（群１）と比較して、腓腹筋および四頭筋の有意な萎縮症を示した（群５および６）。デキサメタゾンと２０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１の両方で処置された動物（群７）は、デキサメタゾン処置対照群（群５および６）のいずれかと比較して筋重量の有意差を示したが、２ｍｇ／ｋｇ／週は、有意差を示さなかった。さらに、デキサメタゾンと２０ｍｇ／ｋｇ／週の抗体Ａｂ１の両方で処置したマウス（群７）は、非疾患対照群（群１）と比較して、腓腹筋および四頭筋重量の有意差を示さなかった。対照群（群１、ＰＢＳおよび水）の平均筋重量と比較した各群の平均筋重量の差の百分率を、図１２Ｃ～１２Ｄに示す。ＰＢＳおよびＩｇＧ対照群におけるデキサメタゾン処置によって誘導された腓腹筋肉量の減少率は、それぞれ、１６．５％および１８．９％であった。これに対し、デキサメタゾンと２０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１の両方で処置した動物では、腓腹筋肉量の減少は４．０％に過ぎず、これは非疾患対照群（群１）と統計学的に異ならなかった。デキサメタゾンと２ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１の両方で処置した動物（群８）では、腓腹筋肉量の減少は１０％に過ぎず、この群の筋肉量の減少は、Ｐ
ＢＳおよびＩｇＧ対照群（群５および６）の減少と統計学的に異ならなかった。類似の結果が四頭筋について見られた（図１２Ｄ）。
ギプス固定誘導筋萎縮症モデルにおけるＡｂ１処置
健康なＳＣＩＤマウスにおいて抗ミオスタチン抗体Ａｂ１が筋肉量を構築する能力を考慮して、Ａｂ１処置が、筋萎縮症を誘導する処置から動物を保護することもできるか否かを調べた。マウスの右脚をギプスで２週間固定することによって、非活動性萎縮症モデルを確立した。足を足底屈位置にして右脚をこの期間ギプスで固定することにより、個々の後肢筋肉量の有意な減少を誘導することができた。以下の実験において、動物を異なる用量のＡｂ１で処置して、このギプス固定誘導筋萎縮症から動物を保護する程度を決定した。
Figure 0007418508000029
この試験において、１０匹の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の８つの群を、１４．５週齢で試験に登録した。試験０日目に開始して、マウスを麻酔下に置き、足を足底屈位置にして右後肢にギプスを固定した（群５～８）。対照群（群１～４）も麻酔下に置いたが、後肢のギプス固定を行わなかった。試験物質を、週に２回、０、３、７、および１０日目に腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｌ／ｋｇ）によって投与した。試験物質および用量は以下のとおりであった：ＰＢＳ（群１および５）、１０ｍｇ／ｋｇ ＩｇＧ対照（群２および６）、１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１（群３および７）、ならびに１ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１（群４および８）。処置群を表１３に記載する。試験を通して少なくとも週に２回、体重を測定した。身体組成パラメータ（脂肪量、除脂肪量、および水分含有量）を、ＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）によって、－１、７、および１４日目に測定した。抗体の初回用量から１４日後、動物をＣＯ２の過量投与によって屠殺して、血漿を調製するために心穿刺によって血液を採取した。
さらに、様々な組織を単離して重量を測定した。採取した筋肉は、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋、および四頭筋（大腿直筋）であった。分析のために、動物の右後肢から個々の筋肉の重量を収集した。採取した他の組織は、心臓、脂肪組織、および脾臓であった。組織は全て、重量を測定して、次いで、瞬間凍結したが、腓腹筋は、組織学分析のためにホルマリンで固定した。
要約
この実験において、抗ミオスタチン抗体Ａｂ１でのマウスの処置が、右後肢のギプス固定によって誘導された非活動性筋萎縮症からマウスを保護できるか否かを試験した。試験中、体重を週に２回測定して、除脂肪量を－１、７および１４日目にＱＮＭＲによって測定した。非疾患対照群（群１）および２週間ギプス固定した群（群５～８）の動物に関して、平均体重変化率および平均除脂肪量変化率データを図１３に示す。右後肢のギプス固定は、体重増加に対していかなる負の効果も及ぼさず（図１３Ａ）、群の除脂肪量のいかなる差も有意ではなかった（図１３Ｂ）。
２週間の試験の終了時、個々の筋肉を切除して、重量を測定した。２つの筋肉（腓腹筋と四頭筋）の重量データを図１４Ａ～１４Ｂにプロットする）。脚をギプス固定して、同様にＰＢＳまたはＩｇＧ対照抗体のいずれかを投与した動物は、非ギプス固定対照群（群１）と比較して、腓腹筋および四頭筋の有意な萎縮症を示した（群５および６）。ギプス固定して２０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１を投与した動物（群７）は、ギプス固定対照群（群５および６）のいずれかと比較して筋重量の有意差を示したが、２ｍｇ／ｋｇ／週は、有意差を示さなかった。さらに、２０ｍｇ／ｋｇ／週の抗体Ａｂ１で処置したギプス固定マウス（群７）は、非ギプス固定対照群（群１）と比較して、腓腹筋および四頭筋重量の有意差を示さなかった。非ギプス固定対照群（群１）の平均筋重量と比較して各群の平均筋重量の差の百分率を、図１４Ｃ～１４Ｄに示す。ＰＢＳおよびＩｇＧ対照群におけるギプス固定によって誘導された腓腹筋肉量の減少率は、それぞれ、２２．８％および２３．５％であった。これに対し、２０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１で処置したギプス固定マウスでは、腓腹筋肉量の減少は１０．０％に過ぎなかった。この差は、ＰＢＳおよびＩｇＧ対照抗体を投与したギプス固定対照群（群５および６）と統計学的に異なることが見出された。２ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１で処置したギプス固定マウスの筋肉量の減少は、ＰＢＳおよびＩｇＧ対照群（群５および６）の減少と統計学的に異ならなかった。類似の結果が四頭筋について見られた（図１４Ｄ）。
プロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンのドメイン構造を、プロテアーゼ切断部位を示すと共に図１６Ａに示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて行った部分的プロタンパク質転換酵素切断プロミオスタチンの例を図１６Ｂに示す。還元条件下では、タンパク質バンドは、プロミオスタチンモノマー（約５０ｋＤ）、プロドメイン（約３７ｋＤ）および増殖因子（１２．５ｋＤ）からなっていた。
Ａｂ１はプロミオスタチンおよび潜在型ミオスタチンに特異的に結合し、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバー、特にＧＤＦ１１の対応する型に対する結合は観察されなかった（図１７Ａ）。Ａｂ１を、表記の抗原でコーティングされたＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢＬＩチップに高濃度（５０μｇ／ｍＬ）で投与して、オンレートおよびオフレートを測定して、およそのＫｄ値を得た。結合事象を示すバイオセンサー応答の大きさを、黒色の棒グラフによってグラフ表示し、算出されたＫｄをオレンジ色で示す。さらに、Ａｂ１はプロミオスタチンの活性化を遮断するが、プロＧＤＦ１１は遮断しない（図１７Ｂ）。
Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６によるＳＣＩＤ用量反応試験
Ａｂ１による以前のｉｎ ｖｉｖｏ試験は、Ａｂ１が、健康な動物において筋肉量を増加させることができ、ならびにマウス筋萎縮症モデル（デキサメタゾンおよびギプス固定誘導萎縮症）において筋肉喪失を予防することができることを証明した。抗体操作の努力により、Ａｂ１より良好であるｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴を有する３つの抗体が同定された。この試験において、ＳＣＩＤマウスにおいて、これらの抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、３つの異なる用量で、既に確立されたＡｂ１の活性と比較した。
８匹の雌性ＳＣＩＤマウスの１４個の群に、週に２回、０、３、７、１０、１４、１７
、２１、および２４日目に腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｌ／ｋｇ）によって試験物質を投与した。試験物質の用量は以下のとおりであった：Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６は、３つの異なる用量（１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．２５ｍｇ／ｋｇ）で投与し、ＩｇＧ対照抗体は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。処置群を表１４に記載する。動物は、試験開始時１０週齢であった。投与日に対応して試験を通し、週に２回、体重を測定した。身体組成パラメータ（脂肪量、除脂肪量、および水分含有量）を、ＥｃｈｏＭＲＩ（ＱＮＭＲ）によって、０、７、１４、２１および２８日目に測定した。抗体の初回用量から２８日後、動物をＣＯ２の過量投与によって屠殺して、血漿を調製するために心穿刺によって血液を採取した。
さらに、様々な組織を単離して重量を測定した。採取した筋肉は、腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、四頭筋（大腿直筋）、足の長趾伸筋、および横隔膜であった。筋肉を、試験マウスの左右両方の脚から切除した。分析のために、両方の脚の個々の筋肉の重量を合計して、平均筋重量をグラムで算出した。採取した他の組織は、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、および脂肪組織であった。組織は全て、重量を測定して、次いで、瞬間凍結したが、左の腓腹筋は、組織学分析のためにホルマリンで固定した。
ビヒクル（ＰＢＳ）、ＩｇＧ対照、および異なる用量のＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で処置した動物についての平均除脂肪量変化率（０日目からの）のデータを図１５に示す。２０ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で
処置した動物は、ＩｇＧ対照およびビヒクル（ＰＢＳ）で処置した動物と比較して実験の２１日目および２８日目で除脂肪量の有意な増加を有していた。２ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ１およびＡｂ２で処置した動物も、実験の２１日目および２８日目で除脂肪量の有意な変化を有していた。０．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で処置した動物については、除脂肪量において対照群と有意な差はなかった。
試験の終了時（２８日目）に筋肉を採取して秤量した。四頭筋（大腿直筋）および腓腹筋の重量を図１８Ａおよび１８Ｂにプロットする。２０ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で処置した動物は、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置した動物と比較して腓腹筋および四頭筋（大腿直筋）重量において有意な増加を有していた。２ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ２およびＡｂ４で処置した動物も、腓腹筋重量において有意な変化を有していた。２ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ２で処置した動物も、四頭筋重量において有意な変化を有していた。０．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量レベルのＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で処置した動物については、筋肉量において対照群と有意な変化はなかった。異なった用量のＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、およびＡｂ６で処置した動物の（ビヒクル群と比較した時の）腓腹筋および四頭筋（大腿直筋）重量の変化率を図１８Ｃにまとめる。
ＳＣＩＤマウスにおけるＡｂ１を用いた作用試験の持続時間
ＳＣＩＤマウスにおいて単回投与および１週ごとの３回投与の後に除脂肪量を増加させるＡｂ１の能力を試験した。８匹の雌性ＳＣＩＤマウスの７つの群に、試験物質を０日目に１回（群１～４）、または０日目、７日目および１４日目に週１回（群５～７）、腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｌ／ｋｇ）によって投与した。表１５を参照されたい。抗体（ＩｇＧ対照、Ａｂ１およびＡｂＭｙｏ）は１０ｍｇ／ｋｇの用量であった。動物は試験開始時に１０～１１週令であった。投与日に対応して試験を通し週２回、体重を測定した。身体組成パラメーター（脂肪量、除脂肪量および水分含有量）を、Ｅｃｈｏ ＭＲＩ（ＱＮＭＲ）によって０、７、１４、および２１日目に測定した。
Figure 0007418508000031
ビヒクル（ＰＢＳ）、ＩｇＧ対照、Ａｂ１、ＡｂＭｙｏで処置した動物の平均除脂肪変化率データを図１９に示す。データは試験の０日目からの除脂肪量の変化として表わしている。試験物質の単回投与の後、２１日目にＡｂ１で処置した動物（群３）は（ＩｇＧ対
照動物－群１と比較して）除脂肪量の有意な増加を有し、これはＡｂ１の３回投与後（群６）の除脂肪量の変化と区別がつかなかった。除脂肪量のこれらの変化は、ＡｂＭｙｏの単回投与（群４）または１週ごとの３回投与（群７）で処置した動物に見られた変化とも同程度であった。
（実施例３）
化学／製薬科学
Ａｂ２は、２２８位でセリンをプロリンに置換したＩｇＧ４サブタイプのヒト化モノクローナル抗体である。これによって、ＩｇＧ１様ヒンジ配列が生成され、ＩｇＧ４の特徴である鎖間ジスルフィド架橋の不完全な形成を最小限にする。Ａｂ２の重鎖および軽鎖の完全なアミノ酸配列を以下に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示す。太字で示したＮＳＴ配列：Ｎ－結合グリコシル化コンセンサス配列部位；太字で示したＤＰ配列は起こり得る切断部位である。：ＸがＳ、Ｔ、またはＧであってよい太字で示したＮＸ配列：起こり得る脱アミド化部位；ＸがＧ、Ｓ、Ｔ、またはＳＤＧであってよい太字で示したＤＸ配列：起こり得る異性化部位；太字で示したメチオニンは起こり得るメチオニン酸化部位である。太字で示したＱは予想されるＮ末端ピログルタミン酸である（図２１Ａ～２１Ｂ）。
Ａｂ１の分子モデリングにより、起こり得るいくつかの翻訳後改変部位が同定された。軽鎖における２つのアスパラギン、および重鎖における７つのアスパラギンは、脱アミド化を受けやすい。これらの残基の２つは、重鎖のＣＤＲ領域内に位置する。
ネイティブＩｇＧ４ ｍＡｂは、２つの半分子（それぞれが、１つの重鎖と１つの軽鎖とを含有する）が非共有結合的相互作用によってインタクト抗体構造において維持される重鎖間ジスルフィド架橋の不完全な形成を有し得る。ＩｇＧ４分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで半分子を交換する傾向があり得、半分子のレベルは、製造バッチ間で一貫していなければならない。ＩｇＧ４構造の骨格におけるＳｅｒからＰｒｏへの置換によって、ＩｇＧ１様ヒンジ配列がもたらされ、それによって鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となり、抗体構造を顕著に安定化させる。ヒンジ領域の完全性および安定性を、非還元性キャピラリー電気泳動および遊離のスルフヒドリルの定量などのアッセイを使用して、展開中に広範な特徴付けを行いながらモニタリングする。鎖交換の可能性をｉｎ
ｖｉｖｏでモニタリングする。
要約
プロミオスタチンおよび／または潜在型ミオスタチンの活性化を遮断するプロ／潜在型ミオスタチン特異的抗体を、本明細書に提供する。この活性化遮断抗体を健康なマウスに投与すると、除脂肪体重および筋肉のサイズを増加させ、筋肉増強効果を１ヵ月間維持するために単一の用量しか必要としない。さらに、抗体の投与は、２つの別個の筋消耗モデルにおいて健康なマウスを筋萎縮症から保護する。データは、ミオスタチン活性化の遮断が、確固とした筋成長を促進してｉｎ ｖｉｖｏで筋萎縮症を防止し、筋消耗の治療介入のための代替機構を表すことを証明する。
（実施例４）
筋萎縮症におけるプロおよび潜在型ミオスタチンの分析
筋萎縮症ならびに正常条件における筋肉組織および循環系中のプロおよび潜在型ミオスタチンの存在を決定するため、ウェスタンブロットを行った。筋萎縮症の標準モデルは、マウスを２．５ｍｇ／ｋｇ／週のデキサメタゾンで処置（飲料水で投与）することを含んでおり、２週間の処置の後に筋肉および血漿を採取した。このモデルは通常、処置の経過にわたって筋肉量の１５～２５％の減少をもたらす。デキサメタゾンで処置しなかったマウスから同時に対照筋肉および血漿を採取した。大腿直筋、前脛骨筋、およびヒラメ筋を
切除し、液体窒素中で瞬間凍結し、すぐに使用できるまで－８０℃で保存した。筋肉溶解物は粉砕に続いてプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えたＴ－ＰＥＲ緩衝液で溶解することによって作製した。血漿は標準的な方法によって採取し、－８０℃で保存した。
同じ濃度のタンパク質を含有する複数の試料をＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜上にウェスタンブロットした。筋肉溶解物については、全タンパク量１０～５０ｎｇをゲルにロードした。血漿はＰＢＳで１：１０に希釈し、各試料１０μｌをゲルにロードした。大きさの標準として０．１～１ｎｇの組換えプロおよび潜在型ミオスタチンも、ゲルにロードした。ミオスタチンタンパク質の同定は、ミオスタチンのプロドメインを認識する抗体（ＡＦ１５３９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して達成した。この分析により、プロミオスタチンが筋肉中の主な形態である一方、潜在型ミオスタチンが血漿中の主な形態であることが示される（図２５）。さらに、デキサメタゾンで誘導された筋萎縮症を有するマウスにおいて、筋組織中でプロミオスタチンが増加し、血漿中で潜在型ミオスタチンが減少することが示された。
これらの結果を確認するため、蛍光標識および検出（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してウェスタンブロットを繰り返した。正常マウスおよびデキサメタゾン処置マウスの血漿ならびに大腿直筋および前脛骨筋中の各ミオスタチン形態の相対レベルを定量した。これらのデータによって上述の結果が確認され、両方の筋肉中におけるプロミオスタチンの２～２．５倍の増加、および血漿中の潜在型ミオスタチンの２．３分の１の減少が示される（図２６）。
これらのデータに基づき、正常筋肉と疾患筋肉におけるミオスタチン「フラックス」のモデルが得られる。示したように、正常筋肉（図２８Ａ）では、筋肉中でプロミオスタチンが産生され、フューリンプロテアーゼによる切断を介して潜在型ミオスタチンに転換される。これは細胞の内部または外部で起こり得る（Andersonら、２００８年）。次いで筋肉中の潜在型ミオスタチンのある割合が循環系に放出され、潜在型ミオスタチンの循環プールを形成する。筋萎縮症では、活性ミオスタチン増殖因子が増加して筋萎縮症を駆動する。この増加は筋肉中のプロミオスタチンレベルの上方調節および潜在型ミオスタチンの活性増殖因子への転換の増加によって引き起こされると考えられる（図２８Ｂ）。ここに概略を示したデータは、このモデルの第１のステップを直接支持し、筋肉中のプロミオスタチンの増加を示している。デキサメタゾン処置マウスにおいて筋肉量の減少が観察されたので、データは第２のステップをも支持しており、筋肉における潜在型ミオスタチンの増加が同時に起こることなしに成熟ミオスタチンの産生が増加することを示している。したがって、血漿中のミオスタチンレベルは減少し、成熟ミオスタチンへの転換が増加したことが示唆される。
（実施例５）
ネズミ血清および筋肉組織の免疫沈降
循環系中のプロミオスタチンの存在を決定し、血清および筋肉中の内因性ミオスタチン前駆体へのＡｂ２およびＡｂＭｙｏの結合を検討するため、免疫沈降を行った。Ａｂ２は筋肉中のミオスタチンの主な形態を認識する。図２７に示す結果より、血清プロミオスタチンのプールがＡｂ２と共に沈降することが示され、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞外プロミオスタチンが存在することが示唆される。血清中のプロミオスタチン、潜在型ミオスタチン、およびその他の部分的にプロセシングされたミオスタチンの形態への結合に加えて、Ａｂ２は筋肉抽出物からのプロミオスタチンを免疫沈降した。対照的に、ＡｂＭｙｏは血清中の潜在型ミオスタチンおよび部分的にプロセシングされた前駆体と効率的に結合するが、筋肉中のプロミオスタチンとの検出できる相互作用は伴わない。筋肉がミオスタチンのシグナル伝達が起こる部位であることを考えると、これによってＡｂ２の作用機序に重要な
利点が生じ得る。
ホモジナイズした筋肉溶解物を以下のようにして調製した。ＣｒｙｏＰｒｅｐ粉砕器（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して凍結マウス四頭筋を粉砕した。次いで粉砕した筋肉をＥＤＴＡを含まない１ｘＨａｌｔ（商標）プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルと共にＭ－Ｐｅｒ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、５０ｍｇ／ｍＬの濃度に再懸濁した。次いでプラスチックの乳棒（Ｂｉｏ－Ｐｌａｓ Ｃａｔ＃４０３０－ＰＢ）を使用して組織を粉砕し、カットオフピペットチップを用いて繰り返しピペッティングすることによりさらにホモジナイズした。次いで筋肉試料を４℃で３０分、転倒回転しながらインキュベートした。最後に試料を１６，１００ｇで１０分遠心して不溶性画分をペレット化した。可溶性画分を吸引し、以下の実験に使用した。
免疫沈降のため、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）共免疫沈降キットを使用して、メーカーの説明書に従い、Ａｂ２、ＩｇＧ Ｃｔｌ、またはＡｂＭｙｏ抗体をアガロースビーズに共有結合でコンジュゲートした。各抗体７５μｇを５０μＬのビーズスラリーにコンジュゲートし、各免疫沈降に３０μｇの抗体を利用した。３ｍＬのプールした正常マウス血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）または上述のように調製した１．０５ｍＬのホモジナイズした可溶性マウス四頭筋に対して免疫沈降を行った。抗体をコンジュゲートしたビーズおよび試料を、４℃で終夜、転倒搖動させながらインキュベートした。インキュベーションの後、ＱＩＡｖａｃ２４Ｐｌｕｓ真空マニフォールド（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して共免疫沈降キットに含まれたスピンフィルターを通して全試料体積を通過させることにより、ビーズを回収した。次いでビーズを、キットの説明書に従って２００μＬのＩＰ溶解／洗浄緩衝液で３回、および１００μＬの１ｘ調整緩衝液で１回、洗浄した。５０μＬの溶出緩衝液で５分間溶出し、次いで採取チューブの中で５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５と混合した。
試験抗体によって沈降したミオスタチン種を、ＡＦ１５３９、（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）ａｂ１２４７２１（Ａｂｃａｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを利用するウェスタンブロットによって可視化した。ブロッキングおよび一次抗体インキュベーションにはＳＥＡ ＢＬＯＣＫブロッキング緩衝液を利用した。
（実施例６）
Ａｂ２で処置したラットにおける筋肉量の増加およびミオスタチンタンパク質発現の変化試験設計
７～８週令の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに、Ａｂ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、非機能性ヒトＩｇＧ対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、または等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を単回静脈内投与した。実験の経過中、１群あたり３匹のラットから投与の４時間後、４８時間後、７日後、１４日後、２１日後、および２８日後に血清を採取した。採取は標準的な方法で行い、試料は－８０℃で保存した。除脂肪量をベースライン（０日目の投与前）ならびに７日目、１４日目、２１日目、および２８日目（ラット８匹／群）で定量的核磁気共鳴（ｑＮＭＲ）によって測定し、実験の最後（２８日目）に骨格筋（大腿直筋、前脛骨筋、およびヒラメ筋）を採取し、秤量し、－８０℃における保存のため液体窒素で瞬間凍結した。
結果
血清試料中の薬物曝露を、ヒトＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡを使用して、参照基準とし
て使用した既知量の各薬物と共に測定した。図２９に示すように、注射の４時間後にＡｂ２とＩｇＧ対照抗体の両方がラット血清中で検出される。実験の進行と共にＩｇＧ対照と比較してＡｂ２の循環薬物レベルが上昇し、実験の終了時には血清中薬物は平均１７．１μｇ／ｍｌとなった。
Ａｂ２処置の薬力学的効果を、実験の経過中の（ｑＮＭＲによる）除脂肪量の測定、および実験の終了時の切除した筋肉の重量の決定によって評価した。図３０Ａに実験の経過中の除脂肪量測定を示す。Ａｂ２で処置したラットは、ＰＢＳで処理したラットまたはヒトＩｇＧ対照抗体で処置したラットと比較して除脂肪量の明らかな増加を示す。実験の終了時（２８日目）に全部の骨格筋を採取して秤量することによって筋肉量を測定した。図３０Ｂに示すように、Ａｂ２で処置したラットは大腿直筋および前脛骨筋量がそれぞれ１４％および１１％増加したことを示す。併せて、これらのデータはＡｂ２の単回投与によるラットの処置により、筋肉量の長期継続する増加がもたらされることを示している。
プロおよび潜在型ミオスタチンの相対レベルを、筋肉溶解物または血清試料の定量的ウェスタンブロットによって決定した。筋肉溶解物は瞬間凍結筋肉試料から粉砕に続いてプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えたＴ－ＰＥＲ緩衝液で溶解することによって作製した。溶解の後、同じ濃度のタンパク質を含有する試料をＰＡＧＥゲルで分離し、低蛍光ＰＶＤＦ膜上にウェスタンブロットした。筋肉溶解物については、全タンパク質１０～５０ｎｇをゲルにロードした。血漿はＰＢＳで１：１０に希釈し、各試料１０μｌをゲルにロードした。大きさの標準として０．１～１ｎｇの組換えプロおよび潜在型ミオスタチンも、ゲルにロードした。ミオスタチンタンパク質の同定は、潜在型ミオスタチンのプロドメインを認識する抗体（ＡＦ１５３９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、続いて蛍光標識した二次抗体による検出によって達成した。全てのウェスタンブロット分析について、１群あたり最低３個の試料を分析した。
Ａｂ２による処置によって、ＩｇＧ対照で処置したラットと比較してラット血清中潜在型ミオスタチンレベルは約２０倍に増加する（図３１Ａ）。これらのデータは他の抗体薬物で見られた効果と一致しており、循環系中の薬物ターゲットの結合を反映している。ラットの筋肉（大腿直筋）において、Ａｂ２処置は（ＩｇＧ対照処置ラットと比較して）ミオスタチンの潜在型において１．９倍の増加をもたらす。プロミオスタチンについては統計学的に有意な変化は観察されない。これらのデータはＡｂ２がそのターゲットであるプロ／潜在型ミオスタチンに結合し、筋肉中ならびに循環系中のミオスタチンのプロセシングを変化させていることを示している。Ａｂ２処置がラット筋肉中の潜在型ミオスタチンを増加させるが、プロミオスタチンを増加させないことも観察された（図３１Ｂ）。
（実施例７）
Ａｂ２で処置したマウスにおける筋肉量の増加およびミオスタチンタンパク質発現の変化ならびにコンパレーター抗ミオスタチン抗体との比較
試験設計
１０週令の雄性ＳＣＩＤマウスに、Ａｂ２、非機能性ヒトＩｇＧ対照抗体、またはミオスタチン／受容体相互作用を遮断することによって作用するコンパレーター抗体（ＡｂＭｙｏ）のいずれかを単回腹腔内投与（５ｍｇ／ｋｇ）した。実験の経過中、投与の１時間後、４時間後、４８時間後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、および５６日後に血清および骨格筋を採取した。血清採取は標準的な方法で行い、試料は－８０℃で保存した。骨格筋（大腿直筋、前脛骨筋、およびヒラメ筋）を採取し、秤量し、－８０℃における保存のため液体窒素で瞬間凍結した。除脂肪量はベースライン（０日目の投与前）ならびに実験の経過中毎週、定量的核磁気共鳴（ｑＮＭＲ）によって測定した。
結果
Ａｂ２処置の薬力学的効果を、実験の経過中の除脂肪量の（ｑＮＭＲによる）測定によって評価した。図３２に実験の経過中の除脂肪量測定を示す。Ａｂ２で処置したマウスはヒトＩｇＧ対照抗体で処置したマウスと比較して除脂肪量の明らかな増加を示す。実験の最初の３週間の間、コンパレーター抗体（ＡｂＭｙｏ）で処置したマウスはＡｂ２群と同等の除脂肪量を示す。しかし、投与の２８日後までにＡｂＭｙｏで処置したマウスは増加した除脂肪量を維持しない。対照的に、Ａｂ２処置群のマウスは実験の経過を通して増加した除脂肪量を維持する（５６日）。これらのデータは、Ａｂ２がＡｂＭｙｏよりも長い作用期間を有していることを示唆している。
血清試料中の薬物曝露を、ヒトＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡを使用して、参照基準として使用した既知量の各薬物と共に測定した。図３３に示すように、注射後１時間という早さで、Ａｂ２とコンパレーター抗体（ＡｂＭｙｏ）の両方が血清中に検出され、両方の抗体の１μｇ／ｍｌを超えるレベルが実験を通して検出できる。しかし、Ａｂ２はＡｂＭｙｏよりも有意に長い半減期および推測曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）を示し、同様の用量でＡｂ２はＡｂＭｙｏよりも有意に大きな曝露を示すことが示唆される。
プロおよび潜在型ミオスタチンの相対レベルを、筋肉溶解物または血清試料の定量的ウェスタンブロットによって決定した。筋肉溶解物は瞬間凍結筋肉試料から粉砕に続いてプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えたＴ－ＰＥＲ緩衝液で溶解することによって作製した。溶解の後、同じ濃度のタンパク質を含有する試料をＰＡＧＥゲルで分離し、低蛍光ＰＶＤＦ膜上にウェスタンブロットした。筋肉溶解物については、全タンパク質１０～５０ｎｇをゲルにロードした。血漿はＰＢＳで１：１０に希釈し、各試料１０μｌをゲルにロードした。大きさの標準として０．１～１ｎｇの組換えプロおよび潜在型ミオスタチンも、ゲルにロードした。ミオスタチンタンパク質の同定は、潜在型ミオスタチンのプロドメインを認識する抗体（ＡＦ１５３９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、続いて蛍光標識した二次抗体による検出によって達成した。全てのウェスタンブロット分析について、１群あたり最低３個の試料を分析した。
薬物処置したマウスおよび対照において、蛍光ウェスタンブロットによって血清ミオスタチンを測定した。Ａｂ２の血清曝露が増加したにも関わらず、Ａｂ２およびＡｂＭｙｏで処置した両方のマウスにおける血清中潜在型ミオスタチンレベルは同様であった（図３４）。これらのデータは、遊離薬物（標的に結合していない）の循環レベルは標的のレベルに対して十分に大きいので、Ａｂ２の血清曝露が増加してもＡｂＭｙｏ群で観察されたよりも大きな循環潜在型ミオスタチンの増加はもたらされないことを示唆している。
筋肉（大腿直筋）中のミオスタチンレベルも、蛍光ウェスタンブロットによって評価した。潜在型およびプロミオスタチンの相対的レベルをマウス筋肉溶解物において蛍光ウェスタンブロットで測定した。潜在型ミオスタチンは、Ａｂ２およびＡｂＭｙｏ処置筋肉の両方で上昇する（図３５Ａ）。しかし、ＡｂＭｙｏ処置筋肉における潜在型ミオスタチンの上昇は２８日目までにベースラインに戻る一方、Ａｂ２処置筋肉の潜在型ミオスタチンは少なくともこの時までは上昇したままである（ＡｂＭｙｏ処置に対してＰ＜０．００３）。プロミオスタチンについても同様の傾向が観察される（図３５Ｂ）が、その差異は統計学的に有意ではない（Ｐ＝０．０６８）。これらのデータは、薬物作用部位である骨格筋におけるＡｂ２の作用期間がより長いことを示唆している。
（実施例８）
Ａｂ２は筋力発生を増加させる
この実施例において、Ａｂ２の筋力発生効果を評価した。簡単に述べると、雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有するＡｂ２（２０ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳを週１回、４週間、腹腔内投与した（
群あたりｎ＝１０）。
実験の終了時に、筋肉を切除して秤量し、水平潅流浴に適合させた３０５Ｃ筋肉レバーシステム（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｕｒｏｒａ、ＣＡＮ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで長趾伸筋（ＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋肉性能を測定した。氷冷した生理学的緩衝溶液中に筋肉を入れ、近位腱に絹糸で縫合した。筋肉を３０５Ｃ筋肉レバーシステムの水平浴に入れ、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で酸素化して３７℃に保った生理学的緩衝液を潅流した。
縫合糸は片側を固定したポストに結び付け、もう一方の側をレバーアームに結び付けた。縫合糸が堅く締り、発生した最大の力が安定であることを確実にするために、筋肉の側面に設けた白金電極を通して０．０１Ｈｚの周波数で一連の１Ｈｚおよび１００Ｈｚの電場刺激（パルス０．２ｍｓ、経過時間１００ｍｓ）を印加した。一旦安定化すれば、直接筋肉刺激－力対周波数を測定した。白金ワイヤ電極は筋肉の膨大部の近位および遠位に取り付けている。
パルス１ｍｓで単収縮張力をモニターし、最大の力が得られるまで電圧を増加させた。次いで刺激の周波数を増加させながら一連の刺激を行った（パルス１ｍｓ、連続継続時間２５０ｍｓ）（１、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１５０Ｈｚ、続いて１Ｈｚで最後の刺激）。
図３６Ａに示すように、Ａｂ２による４週間の処置の後、筋肉量および機能が増大した。平均ＥＤＬ重量は３３％増加、平均腓腹筋重量および四頭筋重量は１９％増加した。
図３６Ｂに示すように、Ａｂ２の４回の毎週投与後に、最大力発生は３０％増加した。
本開示のいくつかの実施形態を本明細書において記載し、説明してきたが、機能を行うための、ならびに／あるいは本明細書において記載される結果および／または１つもしくは複数の利点を得るための、多様な他の手段および／または構造は、当業者によって容易に想起され、そのような変更および／または改変のそれぞれは、本開示の範囲内であると考えられる。より一般的には、本明細書において記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、特定の応用または本開示の教示が使用される応用に依存することを、当業者は容易に理解するであろう。当業者は、単なる日常的実験を使用して、本明細書に記載される開示の特異的実施形態に対する多くの同等物を認識するまたは確認することができる。したがって、前述の実施形態は、単なる例として紹介され、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本開示は具体的に記載および特許請求される以外に実践してもよいと理解すべきである。本開示は、本明細書において記載されるそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。さらに、２つまたはそれ超のそのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない限り、本開示の範囲に含まれる。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、それらが明らかに反対を示していない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される語句「および／または」は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合では結合して存在し、別の場合では離れて存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきである。明らかに反対であることと
示していない限り、具体的に同定されたそのような要素に関連するか関連しないかによらず、「および／または」の語句によって具体的に同定された要素以外に他の要素が、任意選択で存在してもよい。このように、非制限的な例として、「含む」などの制限のない用語と共に使用する場合の「Ａおよび／またはＢ」という言及は、一実施形態ではＢを含まないＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＡを含まないＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）等を指し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リストにある項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包含的に解釈され、すなわち、いくつかの要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、１超も含み、任意選択で追加の記載されていない項目を含むと解釈される。その反対であることを明らかに示している、「唯一の」もしくは「まさに１つの」、または特許請求の範囲において使用される場合の「からなる」などの用語のみが、いくつかの要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素の包含を指す。一般的に、本明細書において使用される用語「または」は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」または「～のまさに１つ」などの排他的な用語がその前にある場合、排他的代替物（すなわち、「１つまたは他方であるが、両方ではない」）を示すとのみ解釈される。特許請求の範囲において使用される場合の「本質的にからなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１つまたは複数の要素のリストを参照する場合の語句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける要素の任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に具体的に記載されるあらゆる要素の少なくとも１つを含まず、要素のリストにおける要素の任意の組合せを除外しないと理解すべきである。この定義はまた、具体的に同定されたそれらの要素に関係するか無関係であるかによらず、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に同定された要素以外の要素が任意選択で存在してもよいことを許容する。このため、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等の「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等の「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で１超のＡを含む少なくとも１つのＡでＢは存在しない（任意選択でＢ以外の要素を含む）ことを指し；別の実施形態では、任意選択で１超のＢを含む少なくとも１つのＢでＡは存在しない（任意選択でＡ以外の要素を含む）ことを指し；なお別の実施形態では、任意選択で１超のＡを含む少なくとも１つのＡと、任意選択で１超のＢを含む少なくとも１つのＢ（任意選択で他の要素を含む）を指し得る等々である。
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」その他などの全ての移行句は、制限がないと理解すべきであり、すなわち、含むがこれらに限定されないことを意味する。「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、米国特許庁の米国特許審査便覧第２１１１．０３節に記載されているようにそれぞれ、制限的または半制限的な移行句である。
請求項の要素を修飾するための、特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」等などの序数の使用は、それ自体、いかなる優先性、選択性、または１つの請求項の要素の順位が別の請求項の要素より上であること、または方法の行為が実行される時間的順序を暗示するものではなく、請求項の要素を区別するために、ある特定の名称を有する１つの請求項の要素を、同じ名称（序数の使用以外の点で）を有する別の要素と区別するた
めの単なる表示として使用される。

Claims (8)

  1. プロ／潜在型ミオスタチンに特異的に結合する抗体の作製方法であって、
    （ｉ）配列番号５０の重鎖アミノ酸配列および配列番号５１の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）を含む宿主細胞を、前記抗体を産生するのに十分な条件下で培養するステップ、および
    （ｉｉ）前記宿主細胞から前記抗体を精製するステップ
    を含む、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    前記抗体がトロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を阻害することを確認するステップをさらに含む、
    方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、
    前記抗体がトロイドプロテアーゼによるタンパク質分解を介した成熟ミオスタチンの形成を１μＭ未満のＩＣ５０で阻害することを確認するステップをさらに含む、
    方法。
  4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記抗体を静脈内投与用に製剤化するステップをさらに含む、
    方法。
  5. 請求項１から４のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記抗体を０．３から３０ｍｇ／ｋｇでの投与に適切な濃度で製剤化するステップをさらに含む、
    方法。
  6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記抗体を凍結乾燥するまたは前記抗体を溶液中に製剤化するステップをさらに含む、
    方法。
  7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記抗体を少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含む医薬組成物中に製剤化するステップをさらに含む、
    方法。
  8. 請求項７に記載の方法であって、
    前記少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤は、ヒスチジン緩衝溶液を含む、
    方法。
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