JP4323167B2 - 分泌タンパク質を発現する細胞の単離 - Google Patents
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Description
本発明の分野は、分泌タンパク質を産生する細胞を同定および単離するための方法である。この方法は、個々の細胞の表面上の分泌タンパク質を一時的に捕捉し、不均一な集団からの希少な細胞クローンの選択を可能にすることによる、分泌タンパク質の特定の特徴または発現レベルに基づく。この分野はまた、所望のレベルの分泌タンパク質または特定の特徴の分泌タンパク質を生じる細胞、ならびにこのような細胞を保有する生物を作製するための、この方法の使用を包含する。詳細には、この方法は、高発現組換え抗体産生細胞株の迅速な単離を可能にするか、あるいは特定のハイブリドーマの迅速な単離、または抗体産生トランスジェニック動物の単離に直接適用され得る。この方法は、タンパク質を分泌する任意の細胞に適用可能である。
本発明の方法は、タンパク質分泌細胞の単離および同定のための現在の方法を超える、かなりの利点を提供する。記載される方法は、より効率的であり、より正確であり、そしてより広範に適用可能である。詳細には、タンパク質を分泌する任意の細胞は、本発明の方法により単離され得る。この局面は、多くの治療用タンパク質が分泌される場合に、とくに重要である。さらに、分泌タンパク質産生細胞は、タンパク質の特徴に基づいて単離され得る。例えば、抗体を分泌する細胞は、所望の特異性、アビディティー、またはアイソタイプに基づいて、迅速かつ便利に単離され得る。さらに、産生される分泌タンパク質の量は、従来技術の多くの方法(ここで、分泌タンパク質の産生は、間接的に定量される)と異なり、直接定量され得る。
潜在的に薬学的価値のある、多くのタンパク質は、分泌タンパク質であり、これらとしては、増殖因子、可溶性レセプタードメイン、および最も重要なものとしてモノクローナル抗体が挙げられる。これらのタンパク質および他のタンパク質を産生するための組換えDNA技術を用いる産生方法は、宿主細胞および発現ベクターを用いる遺伝子発現系を使用する。
本発明は、POIについての直接的なスクリーニングによる、タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための、高スループットスクリーニング法を記載する。本発明はまた、製造プロセスの間に、単一細胞基準でのPOI発現の簡便なモニタリングを可能にする。さらに、この技術は、抗体産生細胞のスクリーニングに直接適用され得る。
a)そのPOIに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でその細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)POIをコードする第2の核酸で、その細胞を同時にかその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなPOIが分泌される、工程;
c)そのPOIに結合する検出分子とその細胞を接触させることによって、表面に提示されるPOIを検出する工程;
d)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
a)そのPOIに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)その細胞表面捕捉分子を発現するa)からの細胞を検出する工程;
c)(b)において検出された細胞を単離および培養する工程;
d)その細胞を、POIをコードする第2の核酸で同時にかまたはその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなPOIが分泌される、工程;
e)表面に提示されるPOIを、その細胞を検出分子と接触させることにより検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がそのPOIに結合する、工程;
f)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
a)細胞表面捕捉分子を一過性にかまたは安定に高収量で発現する細胞を検出する工程;
b)(a)において検出された細胞を、単離および培養する工程;
c)POIをコードする核酸で(b)における細胞をトランスフェクトする工程であって、そのようなタンパク質が分泌される、工程;
d)その細胞を検出分子と接触させることによって、表面に提示されるPOIを検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がそのPOIと結合する、工程;
e)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
a)そのPOIと結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)その細胞表面捕捉分子を高収量で発現する(a)からの細胞を検出する工程;
c)(b)において検出された細胞を単離および培養し、そして十分な時間その細胞にそのPOIを分泌させる工程;
d)その細胞を検出分子と接触させることによって表面に提示されるPOIを検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がPOIと結合する、工程;
e)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
本発明は、分泌タンパク質を生成する細胞を同定および単離する新規かつこれまで未知の方法を記載する。本発明は、細胞表面に位置した、POIに結合する分子を発現する細胞の生成に基づく。次いで、細胞表面に提示されたPOIは、種々の検出分子で標識されることにより検出され得る。特定の条件下で細胞表面に提示されたPOIの量は、分泌されたPOIの総量の直接的な尺度である。次いで、POI産生細胞は、非産生細胞から単離され得、生成レベルまたはPOI特徴が識別され得る。本発明の利点は、mRNAを間接的に測定するのではなく、分泌POIを直接定量することである。
一端または両端を改変する、介在配列(イントロン)の全てまたは一部を除去するなど。
pTE084の構築:pTE084を、ヒトFcγRI(hFcγRI;GenBank受託番号M21091)をコードするpCAE100由来の1,436bp XbaIフラグメントを、pRG821のXbaI部位に連結することにより、構築した。連結から生じる所望のプラスミドにおけるhFcγRIの方向を、NotI、PstI、EcoRI、およびStuIを用いる制限マッピングにより試験した。pTE084をhFcγRI(ヒトIgGのFcドメインについての高親和性細胞表面レセプター)の高レベル発現のために設計した。それは、2つの独立した発現カセットを含む。1つのカセットは、CMV−MIEプロモーターにより駆動されるhFcγRI遺伝子であり、そして第二のカセットは、SV40後期プロモーターにより駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(npt)遺伝子(これは、G418に対する耐性を与える)である。
CHO K1細胞(4×106)を、リポフェクタミンTM(Life Technologies;Rockville,MD)を用いて製造業者の示唆に従ってpTE084でトランスフェクトした。細胞を、500μg/ml G418(Life Technologies)を含有する培養培地(10%ウシ胎児血清、90% Ham’s F−12,2mM Lグルタミン;すべての試薬はLife Technologies,Rockville,MDから得た)中に15日間配置した。G418選択で生存した細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてFITC結合体化ヒトIgG,Fcフラグメント(FITC−hFc;Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)で染色した。簡単に説明すると、10cm培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム(Life Technologies)を含まないダルベッコ燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回洗浄した。0.25% トリプシン(Life Technologies)の3mlを各プレートに添加した。プレートを、細胞がプレートから脱離するまで旋回させた。10ml培養培地を、脱離した細胞の各プレートに即時に添加した。次いで、細胞を、1,000×gで4分間の遠心分離によって採集した。上清の除去後、細胞を、培養培地中に希釈した2μg/ml FITC−hFcの4ml中に再懸濁した。次いで、細胞をプラットフォームシェーカー上に配置し、そして室温で1時間染色した。未結合FITC−hFcを除去するために、細胞を20ml PBSで2回洗浄した。細胞に対するFITC−hFc標識の程度をMofloセルソーター(Cytomation;Fort Collins,CO)においてフローサイトメトリーによって測定した。FITC−hFcは、模擬トランスフェクト親CHO K1細胞を染色しなかった(図2Aおよび2B)が、G418耐性のpTE084トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた(図2C)。選択されたプール由来の上部の1%の最も蛍光のある細胞を、フローサイトメトリーにより1細胞/ウェルで96ウェルプレート中に配置した。9日後、96ウェルプレート中の88細胞クローンを、24ウェルプレートに増殖した。3日後、個々のウェル中の細胞を1ml PBSで1回洗浄し、0.5mlの2μg/ml FITC−hFcで1時間染色し、1ml PBSで2回洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で細胞表面染色について調べた。33の最も蛍光のあるクローンを選択し、増殖し、次いでフローサイトメトリーによってスクリーニングした。1つのこのようなクローンRGC3のFITC−hFc染色を図2Dに示す。
hFcγRIクローナル細胞株中の全ての細胞が細胞表面hFcγRIを発現するので、それらは、全てIgGまたはIgGのFcドメインからなる融合タンパク質を結合する能力を有する。hFcγRIは、種々の種由来のIgGを結合する(van de WinkelおよびAnderson,1991)ので、動物IgGのパネルを、hFcγRI発現細胞へのヒトIgG1(hIgG1)Fcタグ(4SC622)を含むタンパク質の結合をブロックする能力について試験した。4SC622は、hIL−4Rγ細胞外ドメインに融合され、次いでhIG−1Fcドメインに融合されたIL−2Rγ細胞外ドメインからなるキメラ分子である。この実験において、RGC1の培養物、pTE084で安定にトランスフェクトしたCHO K1細胞から選択されたhFcγRI発現細胞株を、1μg/ml 4SC622と、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、1mg/mlの異なる種由来のIgGの存在または不在下で、18時間、インキュベートした。4SC622の細胞表面結合を、洗浄細胞を、FITC−hFcでの細胞染色について概説された手順に従って、4SC622のhIL−2Rγ成分に特異的なフィコエリトリン結合体化マウスIgG1モノクローナルAG184(PE−AG184)(BD PharMingen;San Diego,CA)で染色した後、フローサイトメトリーにより決定した。図3は、hIgGが、4SC622がRGC1の表面上で発現したhFcγRIに結合することを完全にブロックしたことを示す。ラット、ウサギ、およびイヌに由来するIgGもまた結合を有効にブロックしたが、ウシおよびヒツジに由来するIgGはブロックしなかった。外因的に添加したラットIgGが、外因的に添加したhIgG1 Fc−タグ化タンパク質(4SC622)の細胞表面hFcγRIへの結合をブロックすることができる(図4)ことは、ラットIgGもまた、異なるレベルでhIgG1 Fcタグ化タンパク質を発現する細胞間の移動をブロックし得ることを示唆する。このことを試験するために、緑色蛍光タンパク質(EGFP)の存在または不在により区別され得る2つの細胞株を、RGC1から生成させた。簡単に説明すると、RGC1細胞をEGFPでマーキングするために、2×106のRGC1細胞を、0.5μg PTE073(これは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする)および5μg pRG816−EGFP(これは、CMV−MIEプロモーターにより駆動されるEGFP遺伝子をコードする)で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、200μg/mlハイグロマイシンB(Sigma;St.Louis,MO)で、2週間、選択した。緑色蛍光細胞をフローサイトメトリーによって単離した。1つのEGFPおよびhFcγRI発現クローン、RGC2を細胞混合実験において使用した。これらの実験において使用した他の細胞株RGC4は、プラスミドpEE14.1−622でのRGC1の安定なトランスフェクションにより生成した。pEE14.1−622は、4SC622の発現がCMV−MIEプロモーターにより駆動されるプラスミドであり、そして、グルタミンシンセターゼミニ遺伝子を含む。このグルタミンシンセターゼミニ遺伝子は、アナログメチオニンスルホキシイミン(MSX)に対する耐性を付与し、安定な組み込み事象の選択を可能にする。RGC4細胞は、細胞表面上にhFcγRIを発現させ、hIgG1 Fcタグ化タンパク質4SC622を分泌する。50%RGC2細胞および50%RGC4細胞で構成される混合細胞の1プレートを、18時間、1mg/mlラットIgGとインキュベートし、その後PE−AG184で染色し、次いでフローサイトメトリーによって調べた。図5Aは、RGC2細胞のEGFP蛍光を示し、そして図5Bは、RGC2細胞もまた、PE−AG184蛍光の増加により示されるように、外因的に添加された4SC622(1μg/ml)を結合することを示す。図5Cは、RGC4がEGFPゲートにおいて蛍光しなかったことを示す。有意には、外因的に添加されたラットIgGは、細胞表面4SC622についてポジティブに染色したRGC4細胞のパーセントを減少しなかった(図5D)。このことは、このタンパク質が細胞表面に移行中である間に、hFcγRIへの4SC622の結合が生じたことを示唆する。RGC2細胞およびRGC4細胞を混合した場合(図5E)、RGC4細胞から分泌された4SC622タンパク質が、培地中に蓄積し、そしてRGC2細胞のほとんどを結合した。しかしながら、1mg/mlラットIgGの添加は、4SC622を結合したRGC2細胞のパーセントを有意に減少した(図5F)。このことは、ラットIgGが発現細胞から非発現細胞への分泌hIgG1 Fcタグ化タンパク質の移動をブロックしたことを実証する。
細胞表面蛍光は4SC622の発現レベルと相関する:
RGC1細胞(4×106)をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクト体のプールを10%透析ウシ胎児血清、90%無グルタミンダルベッコ改変イーグル培地,1×GS補充,および25μM MSXで構成される培地中での2週間の選択後に得た(全ての試薬はJRH Biosciences,Lenexa,KSから得た)。ラットIgGを、免疫染色の18時間前に1mg/mlまで培養培地に添加した。細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、そして、1.5μg/mlのポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメント(Jackson ImmunoResearch Laboratories)で、室温で1時間、実施例1においてFITC−hFc染色について記載したような手順に従って染色した。次いで、細胞染色をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光の分布は、選択されたプールが広範な4SC622発現レベルを有する細胞を含有することを示唆した(図6)。それらの免疫蛍光に関して上部の3%(R3階層(bracket))、7〜11%(R5階層)、および15〜19%(R7階層)における細胞を、3つの異なるプールに分別し、そして9日間増殖させた。プールについての細胞当たりの平均4SC622産生を、免疫に基づくPandexアッセイ(Idexx;Westbrook,ME)により、製造者の推奨に従って、3日増殖後の培地中の細胞数および4SC622レベルを測定することにより決定した。Pandexアッセイにおいて、ヤギ抗ヒトIgG,γ鎖特異的抗体(Sigma)でコートしたフルオリコンポリスチレンアッセイ粒子を用いて、培地から4SC622を捕捉し、そしてFITC結合体化ヤギ抗ヒトIgG,Fc特異的(Sigma)を用いてビーズ結合4SC622を検出した。既知量の精製4SC622を、較正のためにアッセイ中に含ませた。上部の3%、7〜11%、および15〜19%プール中の細胞はそれぞれ、1.42pg/細胞/日、0.36pg/細胞/日、および0.22pg/細胞/日で4SC622を産生することが見出された。従って、細胞表面4SC622染色と特異的タンパク質産生との間には相関があった。この結果は、高レベルで4SC622を発現する個々の細胞が、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントにより最も明るく染色した細胞を単離することにより、得られ得ることを示唆する。
RGC1における発現クローンの単離:
IL−4トラップ。本発明者らの方法により高レベルの分泌タンパク質産生を伴うクローナル細胞株を生成することにおける効率を直接的に示すために、クローナル4SC622産生細胞株をRGC1から生成した。RGC1細胞(4×106)をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そし25μM MSXを用いて2週間選択し、安定なトランスフェクト体のプールを得た。MSX耐性細胞をプールし、PE−AG184での染色前に、18時間、1mg/ml ヒトIgGとインキュベートした。細胞表面4SC622染色のフローサイトメトリー分析により決定された上部の5%ゲート由来の6つの細胞を、単離し、そして増殖させた。6つのクローナル株からの4SC622産生を決定し、そして選択コロニーのハンドピッキング、次いで希釈クローニングおよび増幅により得られたクローンからの4SC622産生と比較した。1つのRGC1由来クローンRGC4は、12pg/細胞/日で4SC622を産生した(図7)。このレベルは、2,700クローンのハンドピッキングおよび分析により単離された最良の4SC622産生細胞のレベルに類似する。従って、コロニーのハンドピッキングと比較して、本発明において概説された方法は、高い産生細胞のスクリーニングおよびクローニングにおいてずっとより効率的であることがわかる。
細胞表面結合hIgG1 Fcタグ化タンパク質は、RGC1によってインターナライズされる:
hFcγRIは、その細胞表面結合リガンドのインターナライゼーションを誘導することが知られている。RGC1細胞が細胞表面結合4SC622をインターナライズできるか否かを分析するために、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、この細胞を、PE−AG184での4SC622免疫染色およびフローサイトメトリー分析のために即時に加工した。細胞の93%が細胞表面4SC622についてポジティブに染色した(図8B)。あるいは、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いでこの細胞を洗浄し、そして4SC622を含まない培養培地中で、PE−AG184とともに、18時間、インキュベートした。4SC622についての免疫染色後のフローサイトメトリー分析は、細胞の9%が、細胞表面上に4SC622を保持することを示した(図8C)。表面結合4SC622の損失をさらに特徴付けるために、精製された4SC622タンパク質をRGC1および親CHO K1細胞の培地に添加し、次いで培地中の4SC622のレベルを経時的に測定した。図9は、2μg/mlまで10cmプレート中の培養培地に添加した4SC622が、3日のインキュベーション後、RGC1馴化培地において、CHO K1コントロールに比較して有意に低かったことを示す。これらの結果は、培養培地中の4SC622の濃度が細胞表面上のhFcγRIの存在によって減少されることを示す。これらの結果は、培地からの4SC622の涸渇が、hFcγRI−4SC622複合体のインターナライゼーションの結果であったことを示唆する。レセプター−リガンド複合体のこのインターナライゼーションは、18時間ブロッキング工程の間IgGのブロッキングの存在下で非発現細胞から全ての4SC622を有効に除去することを容易にし得る。
誘導性hFcγRI発現を有するCHO K1細胞株の構築:
hFcγRIを用いるフローサイトメトリーに基づく自系分泌トラップ法は、高発現クローンの迅速な単離を可能にする。しかし、hFcγRIがFcタグ化タンパク質のターンオーバーを媒介する場合、操作されたhFcγRI発現細胞による分泌タンパク質の実現産生は、hFcγRI発現が産生期の間に阻害され得る場合により高い。このために、hFcγRIの発現がテトラサイクリンまたはアナログのドキシサイクリンによって誘導されるCHO K1細胞株を構築した。この系において、まず、CHO K1細胞を、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)を発現するように操作し、そしてhFcγRIを、その活性がTetRによって調節されるプロモーターの転写制御下に配置した。2つの直列のTetRオペレーター(TetO)をpTE084においてCMV−MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置し、pTE158を生成した(図10)。pTE158におけるCMV−MIEプロモーターからのhFcγRIの転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の適切なインデューサーの不在下でTetRによってブロックされた。インデューサーの存在下では、TetRタンパク質は、TetOに結合し得ず、hFcγRIの転写が生じる。
RGC10からの4SC622産生細胞株の単離:
RGC10細胞をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そしてMSX耐性細胞を、25μM MSXでの2週間の選択後プールした。hFcγRIの発現を、培養培地への1μg/mlのドキシサイクリンの3日間の添加により誘導した。1mg/mlラットIgGを、ドキシサイクリンを含有する培養培地に添加し、18時間後に、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。最も高いレベルの4SC622を発現した細胞(上部の1%)を、1ウェルあたり1細胞で96ウェルプレート中に分別した(図12C)。図12Bは、ドキシサイクリンによるhFcγRI発現の誘導なしでは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色は、細胞表面結合4SC622を検出できないことを示す。60クローンを、ドキシサイクリンの不在下で増殖させた。図13は、Pandexアッセイにより決定されたような13の最も高い産生細胞の特異的生産性を示す。クローン1C2の特異的生産性は、17.8pg/細胞/日であり、未調節のhFcγRI細胞株RGC1を用いて以前に単離された最良の4SC622細胞株について観察された12pg/細胞/日よりも有意に良好であった。
Sp2/0骨髄腫細胞は、細胞表面捕捉タンパク質を発現するように操作され得る:
本実施例では、Sp2/0−Agl4骨髄腫細胞株を、hFcγRIを安定に発現するように操作し、自系分泌トラップ法がCHO以外の細胞株に適用可能であることを実証した。hFcγRIの遺伝子をレトロウイルス感染により骨髄腫細胞に導入した。プラスミドpLXRN(Clontech;Palo Alto,CA)(これは、目的の遺伝子が上流Moloneyマウス肉腫ウイルス長末端反復(MoMuSV LTR)プロモーターから発現され得るレトロウイルスDNAベクターである)を用いて、hFcγRI遺伝子をコードするレトロウイルスを生成した。ヒトFcγRI遺伝子をコードする、pTE084由来の1,363bp XhoIフラグメントを、pLXRNのXhoI部位にクローニングした。hFcγRI cDNA発現がMoMuSV LTRに依存するプラスミドを選択し、そしてpTE255と名付けた(図14)。
汎親和性hFcγRIレトロウイルスを使用して、1×107のSp2/0−Ag14骨髄腫細胞(American Type Culture Collection;Manassas、VA)を、1細胞当たり約10の多重度の感染性粒子で感染させた。感染の3日後に、細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーで分析する前に、PBSで2回洗浄した。結合したFITC−hFcによって示されるようなhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによって、プールとして収集した。このプールを13日間増殖させ、次いでFITC−hFcで再び染色し、そしてhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによってプールとして収集した。これらの分別された細胞を10%ウシ胎仔血清、4.5g/l グルコースおよび4mM グルタミンを含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(D−MEM)中で3週間培養し、FITC−hFcで染色し、そして集団中の上位1%の平均蛍光を有する細胞を、単一細胞分別によってクローン化した。増殖後、24個のクローンをhFcγRIの発現についてフローサイトメトリーによって上記のように試験し、1つのクローン(Sp2−hFcγRI−4)を、さらなる特徴付けのために選択した(図15)。
Sp2−hFcγRI−4細胞(1×107)を、pTE209(このプラスミドは、CMV−MIEプロモーターからの4SC622タンパク質の構成的発現を可能にし、そしてハイグロマイシンに対する耐性を付与する)でトランスフェクトした(図16)。トランスフェクトした細胞を、10%FCS、90%D−MEMおよび400μg/mlのハイグロマイシンを含有する培地中に14日間配置した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色の前に、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベートした。細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前に、PBSで2回洗浄した。標識細胞を、上記のように、フローサイトメトリーによってプールとして収集し、次いで5日間培養しそして分別した。次いで、最もFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントと結合した、増殖したプール由来の細胞(上位1%集団)を、単一細胞分別によってクローン化した(図17)。10個のクローンからの4SC622の産生を、ELISAによって分析し、そして10個全てのクローンが4SC622を発現することが見出された:クローン5H11は、1日当たり、0.5pg/細胞の4SC622を産生した。これらのデータは、4SC622を分泌するクローンが、自系分泌トラップ法によって、pTE209を用いたSp2−hFcγRI−4細胞の安定なトランスフェクションに由来する細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを示した。
プロテインGキメラタンパク質は、細胞表面捕捉タンパク質として機能し得る。
RGC18細胞(6×106)を、pTE209でトランスフェクトし、そして400μg/mlのハイグロマイシン中で18日間増殖させることによって、プラスミドの組込みについて選択した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色の前に、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベートした。細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前にPBSで2回洗浄した(図21)。最も蛍光の細胞(上位5%)を、単一細胞分別によって単離し、そして3週間増殖させた。10個のクローンを、4SC622分泌について試験した。試験した全てのクローンが、高レベルで4SC622を分泌し、そして最良のクローン(RGC19)は、一日当たり6.4pg/細胞の特異的生産性を有した。この結果は、4SC622発現細胞が、自系分泌トラップ法によって、pTE209でのRGC18の安定なトランスフェクション由来の細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを実証した。さらに、これらのデータは、プロテインGのフラグメントが、シグナル配列および膜貫通ドメインを含むように操作され得、そして細胞表面捕捉タンパク質として機能し得ることを明らかに実証した。
(RGC10からの抗体産生細胞の単離)
組換え抗体を発現するCHO細胞の単離についての自系分泌トラップ法の有用性を実証するために、本発明者らは、KD5ハイブリドーマ由来の可変領域軽鎖遺伝子および可変領域重鎖遺伝子をコードするDNAをクローニングした。KD5は、ヒトTie−2レセプターに特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。
Claims (21)
- 分泌される目的のタンパク質(POI)を産生する真核生物細胞を検出および/または単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)分泌POIをコードする核酸および該POIに結合し得る細胞表面捕捉分子をコードする核酸を含む細胞を提供する工程であって、ここで、該分泌POIをコードする核酸もしくは該細胞表面捕捉分子をコードする核酸またはその両方が該細胞にトランスフェクトされている、工程;
b)該POIおよび該細胞表面捕捉分子が発現され、POI−捕捉分子複合体が細胞内で形成され、かつ該細胞表面上に提示される条件下で該細胞を培養する工程;
c)該細胞により提示された該POIに結合する検出分子に該細胞を接触させる工程であって、該接触させる工程は、該細胞表面捕捉分子に結合するか、または、該POIに結合し、そして、該分泌POIの該細胞表面捕捉分子への結合を妨げるが、該検出分子と結合しないブロッキング分子の存在下で実施される、工程;ならびに
d)該検出分子への結合に基づいて、細胞を検出および/または単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記提供工程が、前記分泌POIをコードする核酸および前記細胞表面捕捉分子をコードする核酸を前記細胞にトランスフェクトする工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団に対して実施される請求項1に記載の方法であって、前記単離工程により、前記検出分子に結合している細胞が該集団から単離される、方法。
- 前記細胞が、異なるレベルの前記POIを発現し、前記単離工程は、該POIの相対的な発現レベルに基づき細胞を単離する、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、異なるPOIを発現する、請求項3に記載の方法。
- 前記分泌POIをコードする核酸が、前記細胞表面捕捉タンパク質をコードする核酸より前に前記細胞にトランスフェクトされ、そしてここで、前記工程(a)が前記工程(b)の前に実施される、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉タンパク質をコードする核酸が、前記分泌POIをコードする核酸より前に前記細胞にトランスフェクトされる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉タンパク質をコードする核酸および前記分泌POIをコードする核酸が、同時に前記細胞にトランスフェクトされる、請求項2に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、Fcドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記POIが、抗体、Fab、単鎖抗体(ScFv)、もしくはこれらのフラグメント、または抗体定常領域と融合した分子である、請求項9に記載の方法。
- 前記POIがリガンドである場合、前記細胞表面捕捉分子が該リガンドに対するレセプターであり;該POIがレセプターである場合、該細胞表面捕捉分子が該レセプターに対するリガンドであり;該POIがタンパク質またはペプチドである場合、該細胞表面捕捉分子が、該POIに特異的な抗体であり;または、該POIが抗体である場合、該細胞表面捕捉分子が、抗体結合タンパク質である、請求項9に記載の方法。
- 前記抗体結合タンパク質が、Fcレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンScFv、プロテインA、プロテインG、またはこれらの機能的フラグメントである、請求項11に記載の方法。
- 前記分泌POI−細胞表面捕捉分子が、Tie1−Ang1、Tie2−Ang2、VEGFRI−VEGF、およびVEGFRII−VEGFからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記捕捉分子が前記POIに結合し得、かつシグナル配列および膜アンカーを有するタンパク質であり、該タンパク質は、前記細胞の膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項1に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはGPI連結である、請求項14に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、不死化細胞に融合された抗体産生細胞である、請求項16に記載の方法。
- 分泌される目的のタンパク質(POI)を産生する真核生物細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)該POIに結合し得る細胞表面捕捉分子をコードする核酸で該細胞をトランスフェクトする工程;
b)POI−細胞表面捕捉分子複合体が細胞内で形成され、該細胞表面上で発現される条件下で該細胞を培養する工程;
c)該POIに結合し得る検出分子と該細胞とを接触させる工程であって、ここで、該表面に提示されるPOIが検出され、該接触させる工程は、該細胞表面捕捉分子に結合するか、または、該POIに結合し、そして、該分泌POIの該細胞表面捕捉分子への結合を妨げるが、該検出分子と結合しないブロッキング分子の存在下で実施される、工程;ならびに
d)該検出された細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 分泌される目的のタンパク質(POI)を産生する真核生物細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)Fcドメインを含む分泌POIをコードする核酸分子で該細胞をトランスフェクトする工程;
b)Fcドメインに結合し得る細胞表面捕捉分子をコードする核酸分子で該細胞をトランスフェクトする工程;
c)POI−細胞表面捕捉分子複合体が細胞内で形成され、そして、該細胞表面上で発現される条件下で該細胞を培養する工程;
d)該POIに結合し得る検出分子と該細胞とを接触させる工程であって、ここで、該表面に提示されるPOIが検出され、該接触させる工程は、該細胞表面捕捉分子に結合するか、または、該POIに結合し、そして、該分泌POIの該細胞表面捕捉分子への結合を妨げるが、該検出分子と結合しないブロッキング分子の存在下で実施される、工程;ならびに
e)該検出された細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 抗体を単離する方法であって、以下:
細胞表面捕捉分子を発現する不死化細胞と抗体産生細胞とを融合して、複数の融合細胞を生成する工程であって、ここで、該抗体産生細胞は、B細胞またはプラズマ細胞である、工程;
該細胞を培養し、それによって、抗体−捕捉分子複合体が細胞内で形成され、該細胞の表面上に提示される、工程;
目的の抗体に結合する検出分子と該細胞とを接触させ、それによって、1つ以上の細胞が、該目的の抗体を介して該検出分子に結合する工程であって、ここで、該接触させる工程は、該捕捉分子に結合するか、または、該抗体に結合し、そして、該抗体の該捕捉分子への結合を妨げるが、該検出分子と結合しないブロッキング分子の存在下で実施される、工程;ならびに
該検出分子に結合した1つ以上の細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
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