TW202323817A - Ｐｈ建模及控制之系統及方法 - Google Patents

Abstract

本揭示案係關於用於控制樣品pH之系統及方法，其包含量測初始pH、添加一定量之滴定劑及量測第二pH，且使用無因次化建模將滴定劑標準化且確定達到最終pH所需之滴定劑之量。該等系統及方法可用於在蛋白質樣品滅活病毒或滴定期間控制pH。

Description

pH建模及控制之系統及方法

本揭示案係關於用於控制樣品pH之系統及方法，其包含量測初始pH、添加一定量之滴定劑及量測第二pH，且使用無因次化建模將滴定劑標準化(normalize)且確定達到最終pH所需之滴定劑之量。該等系統及方法可用於在蛋白質樣品滅活病毒或滴定期間控制pH。

在涉及改變樣品pH之製程期間，習知量測及控制pH之方法可能有問題。消毒pH探針且將探針插入樣品之方法通常與pH探針校準不相容。因此本技藝中對控制樣品pH之系統及方法存在需求。

本揭示案提供在包括改變樣品（諸如蛋白質樣品）之pH的製程中量測及控制pH之系統及方法。

在本揭示案之方法之一些實施例中，該等方法包含：（a）量測樣品之初始pH（pH _初始）；（b）將至少第一量之滴定劑（滴定劑 _n）添加至該樣品且量測至少第一額外pH值（pH _n），滴定劑 _n為添加至該樣品以達到pH _n之滴定劑之量，其中pH _n不同於pH _初始；（c）應用模型來確定標準化之滴定劑初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑 _n，其中該模型將添加至該樣品之標準化之滴定劑聯繫至該樣品之pH；及（d）確定待添加至樣品以達到目標pH（pH _n+1）之滴定劑之另一額外量，pH _n+1為藉由將全部量之滴定劑添加至樣品而達到的pH。

在本揭示案之方法之一些實施例中，該等方法包含將第二量之滴定劑（滴定劑 _n+2）添加至樣品且量測第二額外pH（滴定劑 _n+2），且重複步驟（c）及（d）。在一些實施例中，方法包含將第三量之滴定劑添加至樣品及量測第三額外pH，且重複步驟（c）及（d）。在一些實施例中，將第三量之滴定劑添加至樣品中引起pH在最終目標pH（pH _最終）之0.05至0.10 pH單位內。在一些實施例中，方法包含將第四量之滴定劑添加至樣品且量測第四額外pH。在一些實施例中，方法包含不超過3或4次添加滴定劑以將樣品pH變為pH _最終。

在本揭示案之方法之一些實施例中，該等方法包含生成模型。在一些實施例中，方法包含：（i）自至少一個參考樣品生成至少一個參考滴定曲線，將添加至參考樣品之滴定劑之量聯繫至參考樣品之pH；（ii）將該至少一個參考滴定曲線標準化；及（iii）生成模型以擬合至少一個參考滴定曲線。在一些實施例中，模型包含將標準化之滴定劑聯繫至pH之多項式。

在本揭示案之方法之一些實施例中，所量測之樣品pH與模型之間的差值鑑別用於量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。在一些實施例中，方法包含：重新校準pH計；（a）將額外量之滴定劑添加至樣品且量測額外pH；（b）應用模型且將標準化之滴定劑及pH與模型進行比較；及（c）當pH與模型相對應時，將剩餘量之滴定劑添加至樣品以達到pH _最終；從而防止添加過多滴定劑至樣品對樣品造成損傷。在一些實施例中，樣品包含蛋白質，且方法防止對蛋白質造成損傷。

本揭示案提供滅活樣品中之病毒之方法，其包含：（a）提供在4.0或更大之初始pH（pH _初始）下的樣品；（b）將第一量之酸滴定劑（滴定劑 _{n_ 酸}）添加至樣品且量測第一額外酸pH值（pH _{n_ 酸}），滴定劑 _{n_ 酸}為添加至樣品以達到pH _{n_ 酸}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 酸}不同於pH _初始；（c）應用模型以確定標準化之滴定劑，其中該模型將標準化之添加至樣品之滴定劑聯繫至樣品pH；（d）基於標準化之滴定劑、pH及模型，確定添加至樣品以達到目標酸pH（pH _{酸 _ 目標}）之滴定劑之量；（e）將該量之滴定劑添加至樣品中以達到pH _{酸 _ 目標}；（f）重複步驟（d）及（e）直至達到最終酸pH（pH _{酸 _ 最終}）為止；（g）將樣品保持在pH _{最終 _ 酸}下足以滅活病毒之時段；（h）將第一量之鹼性滴定劑（滴定劑 _{n_ 鹼}）添加至樣品且量測第一額外鹼pH值（pH _{n_ 鹼}），滴定劑 _{n_ 鹼}為添加至樣品以達到pH _{n_ 鹼}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 鹼}不同於pH _{酸 _ 最終}；（i）藉由應用第二模型將滴定劑 _{n_ 鹼}標準化；（j）基於標準化之滴定劑、pH及模型，確定添加至樣品以將樣品pH變為目標鹼性pH（pH _{目標 _ 鹼}）之鹼性滴定劑之量；（k）將該量之鹼性滴定劑添加至樣品中以達到pH _{目標 _ 鹼}；及（l）重複步驟（j）及（k）直至達到最終鹼性pH（pH _{最終 _ 鹼}）為止。在一些實施例中，方法包含至少一次重複步驟（b）及（c）以確認樣品之行為與模型相對應。在一些實施例中，方法包含重複步驟（d）及（e）1、2或3次。在一些實施例中，方法包含重複步驟（d）及（e）2或3次，且重複步驟（d）及（e）2或3次引起目標酸pH在pH _{酸 _ 最終}之0.05至0.10 pH單位內。在一些實施例中，方法包含再一次重複步驟（d）及（e）以達到pH _{酸 _ 最終}。在一些實施例中，方法包含總共不超過3或4次添加酸滴定劑。在一些實施例中，方法包含重複步驟（h）及（i）至少一次，以確認樣品之行為與模型相對應。在一些實施例中，方法包含重複步驟（j）及（k）1、2或3次。在一些實施例中，方法包含重複步驟（j）及（k）2或3次，且重複步驟（j）及（k）2或3次引起pH在pH _{最終 _ 鹼}之0.05至0.10 pH單位內。在一些實施例中，方法包含再一次重複步驟（j）及（k）以達到pH _{最終 _ 鹼}。在一些實施例中，方法包含總共不超過3或4次添加鹼性滴定劑。在一些實施例中，pH _{酸 _ 最終}介於約3.0與4.0之間、介於約3.1與3.9之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，pH _{最終 _ 鹼}介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5-8.0之間或介於約7.0與8.5之間。

本揭示案提供經組態以用於本發明之方法之設備。

本揭示案提供用於在蛋白質純化中控制pH之設備。在一些實施例中，設備可包括反應器及pH流通槽，其包含安置於其中之pH探針，該pH流通槽流體耦接至反應器。pH流通槽可接收用於自反應器取樣之滑流且含有安置於其中之pH探針，該pH探針量測滑流之pH。該設備包括流體耦接至反應器之酸滴定劑供應。酸滴定劑供應向反應器提供酸滴定劑，以降低反應器中之pH。該設備進一步包括流體耦接至反應器之鹼滴定劑供應。鹼滴定劑供應向反應器提供鹼滴定劑，以增加反應器中之pH。在一些實施例中，該設備可進一步包括取樣棒，其將滑流自反應器遞送至pH流通槽。在一些實施例中，該設備可包括自pH流通槽接收流出物之廢棄物接收器。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2021年10月7日申請之美國臨時申請案第63/253,281號之優先權及權益，其內容以全文引用的方式併入本文中。

本揭示案係關於在涉及改變樣品pH之製程期間控制pH之方法。涉及pH改變之製程之一實例為諸如抗體或其他治療性蛋白質之生物製劑的大規模製造。許多治療性蛋白質之製造涉及培養表現治療性蛋白質之細胞，接著自培養細胞及/或細胞培養基純化蛋白質。在細胞培養期間控制細胞培養基之pH及在蛋白質純化期間控制樣品之pH對治療性蛋白質生產而言均很重要。大多數哺乳動物細胞具有支持最佳細胞生長、代謝及蛋白質產生的特定pH範圍。此外，用於製造治療性蛋白質之細胞可能攜帶病毒，若病毒污染原料藥或藥品，則可能有害。一種使潛在有害病毒滅活之方法係藉由在純化治療性蛋白質期間短暫降低pH值。許多病毒在約5.0至5.5之pH下發生不可逆變性且有效破壞。若干包膜病毒在約3.5至4.0之pH範圍下有效滅活。然而，過度降低蛋白質樣品之pH有使治療性蛋白質變性之風險，此可能導致一批蛋白質被破壞及增加製造成本。因此，在製造治療性蛋白質期間，在細胞培養期間與蛋白質純化期間，存在量測及控制pH之需求。

在蛋白質純化期間量測pH之習知方法不可靠，且導致蛋白質產品之浪費。在一種方法中，在蛋白質純化期間藉由將無菌pH探針直接插入含有蛋白質溶液之反應容器中來量測pH。然而，使用此方法可能難以維持無菌性及探針準確性。pH探針通常經校準，密封在具有用於將探針插入反應容器之波紋管連接器的袋中，且經由高壓釜或γ照射滅菌。然而，此會導致校準與pH探針乾燥時進行使用之間有一段時間，此會影響探針準確性。此外，pH探針由玻璃製成，且在插入容器時可能破裂。在維持無菌性的同時插入探針，可能存在困難。在間接量測蛋白質溶液之pH的另一種方法中，自主要蛋白質溶液取出「滑流」，且使用pH探針量測滑流之pH。然而，在不直接量測主要蛋白質溶液池的情況下，無法對滴定進行直接反饋控制來調整pH。此外，任何自主要池吸取滑流以量測pH的蛋白質均不會回到主要池，且最終浪費。雖然統計滴定模型可用於預測在製造過程期間對蛋白質溶液進行pH調整時添加之酸或鹼之量，但此等模型需要使用者手動輸入蛋白質濃度，且各滴定類型（酸或鹼）均需要大型歷史資料集來生成模型。此外，此等模型對於蛋白質之所有製程及類型並不普遍準確。

因此，需要在蛋白質製造中量測及控制pH之額外方法，其不需要將pH探針直接插入蛋白質溶液池中，或連續自蛋白質池吸取材料滑流。本揭示案提供用於在蛋白質製造期間建模及控制pH之方法及系統。本揭示案之方法在廣泛蛋白質上係準確的，不需要操作員輸入或離線濃度量測，且不需要大量歷史資料。本揭示案之方法亦可用於推斷製造過程期間調整pH所需之酸或鹼之量。此外，本文所揭示之方法及系統能夠在改變樣品pH之製程期間可再現且準確地達成在所需目標pH之0.05至0.10 pH單位內之pH值。滴定劑僅添加3至4次即可準確且可靠地達成最終目標pH，例如用於蛋白質樣品之病毒滅活之目標酸性pH，或在滅活後之目標鹼性pH。此外，本文所揭示之方法及系統亦能夠準確地確定及添加待添加至樣品中之酸或鹼滴定劑之量，且可以每次滴定劑添加10%體積誤差或更少誤差之準確性添加所需體積之滴定劑。

本揭示案提供以下方法，其包含量測蛋白質池之初始pH，添加保守量之滴定劑，諸如酸性或鹼性溶液，量測中間pH，視情況添加第二量之滴定劑且重複pH量測，及基於初始量測及模型確定達到目標pH所需之滴定劑的額外量，該模型基於參考樣品將pH聯繫至標準化之滴定劑量。本揭示案進一步提供用於進行本揭示案方法之設備。

因此，本揭示案提供方法，其包含：（a）量測樣品之初始pH（pH _初始）；（b）將至少第一量之滴定劑（滴定劑 _n）添加至該樣品且量測至少第一額外pH值（pH _n），滴定劑 _n為添加至樣品以達到pH _n之滴定劑之量，其中pH _n不同於pH _初始；（c）應用模型來確定標準化之滴定劑 _n，其中該模型將添加至樣品之標準化之滴定劑聯繫至樣品之pH；及（d）確定待添加至樣品以達到最終pH（pH _最終）之滴定劑的剩餘量，藉由將全部量之滴定劑（滴定劑 _總）添加至樣品而達到pH _最終。 定義

如本文所用，術語「初始pH」係指在添加用於改變pH之滴定劑，亦即相對於樣品初始pH為酸性或鹼性之溶液之前樣品的pH。

如本文所用，「最終pH」係指樣品之所需pH。舉例而言，樣品可具有3.6之pH，但為適於特定目的，需要為7.5之pH，且本文中所用之方法用於經由控制添加鹼性滴定劑將pH值由3.6改變為7.5。在此情況下，3.6為初始pH，且7.5為最終或目標pH。熟習此項技術者將瞭解，視樣品、樣品條件及應用而定，任何特定樣品之初始及最終pH值可不同。一般熟習此項技術者將瞭解，當進行改變pH之方法時，該方法可涵蓋多個步驟，各步驟在達到樣品之最終pH（或最終目標pH）之前具有相關目標pH。

如本文所用，「總滴定劑」（滴定劑 _總）係指添加至樣品以將pH自初始pH改變為最終pH之滴定劑之量。

如本文所用，「pH _n」係指添加一些量之滴定劑（將樣品自先前pH（pH _n-1）改變為pH _n所需的）之後樣品之pH。因此，將pH自例如初始pH改變為pH _n所需的滴定劑之量在本文中稱為滴定劑 _n。熟習此項技術者將瞭解，量測之pH值及添加至樣品中以改變樣品pH至此等量測之pH值之滴定劑的對應量可為迭代的。亦即，另一量的滴定劑可添加至pH _n之樣品中，以將樣品pH改變為pH _n+1，且添加至樣品以將pH自初始pH改變為pH _n+1之滴定劑之量稱為滴定劑 _n+1。類似地，將一定量之滴定劑添加至pH _n+1之樣品，以將樣品pH改變至pH _n+2，及其類似方式，直至達到目標pH。

術語「樣品」係指進行本文所述之方法以改變其pH之樣品。在一些情況下，樣品包含蛋白質，例如液體溶液中之純化或部分純化蛋白質。然而，其他類型之樣品考慮在本揭示案之範疇內，且包括DNA、RNA及藥物。一般熟習此項技術者將瞭解，如本文所用，樣品係指液體溶液，例如包含複數個生物分子（DNA、RNA或蛋白質）或分析物（化合物、藥物及其類似物）之液體溶液。樣品可在任何適合濃度或初始pH下，且包括任何適合之緩衝劑或載劑。

術語「參考樣品」係指具有與樣品相似或相同性質之參考樣品，其經受與樣品之pH變化類似之變化，且已自其中收集有關pH及滴定劑添加之資料及兩者間之關係。參考樣品可與樣品相同，例如，自較大樣品中取得之參考樣品（亦即，子樣品作為參考樣品）。然而，若在添加滴定劑時行為與樣品相似，則參考樣品無需與樣品相同。舉例而言，樣品及參考樣品可為由相同或相似製程生產及純化之相同蛋白質的不同批次。作為另一實例，樣品及參考樣品可為相似但不相同之蛋白質，諸如兩種抗體，或具有相似糖基化模式之兩種蛋白質，其在進行相似滴定過程時行為相似。

如本文所用，術語「滴定曲線」係指將作為自變量的添加至樣品之滴定劑體積聯繫至作為因變數之溶液pH的圖形（或一系列量測）。滴定曲線可藉由連續量測，例如藉由直接將pH探針插入樣品中且進行連續量測來生成。或者，可自不連續量測來生成滴定曲線，接著將適當曲線擬合至所量測資料點。

如本文所用，「標準化」係指將在不同尺度上量測之值調整至共同尺度。

如本文所用，「滴定劑」係指具有已知pH且較佳已知濃度之溶液，其添加（滴定）至另一溶液以改變該溶液之pH。

「酸滴定劑」係指具有比樣品更酸性之pH之滴定劑。一般而言，酸滴定劑之pH將小於7.0。常用酸滴定劑包括磷酸（H ₃PO ₄）、甘胺酸鹽酸鹽（C ₂H ₆ClNO ₂或甘胺酸HCl）、乙酸（CH ₃COOH）、鹽酸（HCl）、過氯酸（HClO ₄）及硫酸（H ₂SO ₄）。酸滴定劑溶液可藉由稀釋市售濃縮儲備溶液來製備，且藉由針對標準弱鹼進行標準化來確定濃度。示例性酸滴定劑包括濃度在0.20 M至2.0 M之間、0.25 M至1.5 M之間或0.5 M至1.0 M之間的磷酸。舉例而言，濃度為0.10 M、0.20 M、0.25 M、0.30 M、0.35 M、0.40 M、0.45 M、0.50 M、0.60 M、0.70 M、0.80 M、0.90 M、1.0 M、1.1 M、1.2 M、1.3 M、1.4 M、1.5 M、1.6 M、1.7 M、1.8 M、1.9 M或2.0 M的磷酸可用作酸滴定劑。其他示例性酸滴定劑包括濃度在0.1 M與1.0 M之間、0.2 M與0.75 M之間、0.25 M與0.75 M之間或0.25 M與0.5 M之間的甘胺酸HCl。舉例而言，濃度為0.10 M、0.20 M、0.25 M、0.30 M、0.35 M、0.40 M、0.45 M、0.50 M、0.60 M、0.70 M、0.80 M、0.90 M或1.0 M的甘胺酸HCl為酸滴定劑。其他示例性酸滴定劑包括濃度在0.5 M至3.0 M、1.0 M至2.5 M、1.0 M至2.0 M或1.5 M至2.0 M之間的乙酸。舉例而言，濃度為0.50 M、0.60 M、0.70 M、0.80 M、0.90 M、1.0 M、1.1 M、1.2 M、1.3 M、1.4 M、1.5 M、1.6 M、1.7 M、1.8 M、1.9 M、2.0 M、2.1 M、2.2 M、2.3 M、2.4 M、2.5 M、2.6 M、2.7 M、2.8 M、2.9 M或3.0 M的乙酸為酸滴定劑。「鹼滴定劑」或「鹼性滴定劑」係指具有比樣品更鹼性之pH的滴定劑。常用鹼滴定劑包括氫氧化鈉（NaOH），其可以不純固體形式及以約50% w/v溶液形式市購。NaOH溶液可針對弱酸標準進行標準化以確定濃度。其他常用鹼滴定劑包括緩血酸胺（亦稱為參(羥甲基)胺基甲烷或tris鹼，式為C ₄H ₁₁NO ₃）。示例性鹼滴定劑包括濃度在0.5 M至3.0 M、1.0 M至2.5 M、1.0 M至2.0 M或1.5 M至2.0 M之間的緩血酸胺。舉例而言，濃度為0.50 M、0.60 M、0.70 M、0.80 M、0.90 M、1.0 M、1.1 M、1.2 M、1.3 M、1.4 M、1.5 M、1.6 M、1.7 M、1.8 M、1.9 M、2.0 M、2.1 M、2.2 M、2.3 M、2.4 M、2.5 M、2.6 M、2.7 M、2.8 M、2.9 M或3.0 M的緩血酸胺為鹼滴定劑。

pH計量測基於水之溶液中的氫離子活性，指示其酸度或鹼度，以pH表示。pH計量測pH電極與參考電極之間的電位差。pH「探針」係指含有pH電極及參考電極之計量器部分。通常，pH電極為玻璃電極，其為由對特定離子敏感之摻雜玻璃隔膜製成的一種類型離子選擇性電極。示例性pH電極為對氫離子敏感之玻璃電極。相對於一些參考值（即參考電極），玻璃電極之電壓對氫離子活性之變化敏感。換言之，所量測溶液中之氫離子活性影響參考電極與氫離子敏感電極之間的電化學電位。校準pH計以使電化學電位聯繫至pH值。

「pH計校準」係指針對一或多種已知pH之標準化緩衝液校準pH計的方法，因為已知pH電極自其校準設定偏離。典型校準方法使用由至少三種標準緩衝液生成之校準曲線，但亦可使用兩點校準。示例性校準方案包含清潔電極，將經沖洗之電極浸泡在pH 4.0之第一標準中，隨後浸泡在pH 7.0之第二標準及pH 10.0之最終標準中，在量測之間清潔電極。

如本文所用，「滑流（slipstream）」或「滑流（slip stream）」係指一種取樣方法，其中例如使用插入主樣品中之管自主樣品抽出或分離子樣品，且對子樣品進行量測。滑流可為連續的，亦即，不斷自樣品中抽出，或為不連續的，僅在製程中之離散時間點自樣品中抽出。

如本文所用，「線上探針」或「線上pH探針」係指在pH改變期間量測樣品pH之探針（線上pH），以及結合本文所述之模型，使用其中資訊確定在滴定劑添加步驟期間添加至樣品之滴定劑之量。線上探針可為例如安裝在耦接至滑流之流量槽中的滑流探針。或者，可將線上探針直接插入反應器中。

如本文所用，「肽」、「多肽」及「蛋白質」通篇可互換使用且係指包含兩個或更多個藉由肽鍵相互接合之胺基酸殘基的分子。肽、多肽及蛋白質亦可包括修飾，諸如糖基化、脂質附接、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、烷基化、羥基化及ADP核糖基化。肽、多肽及蛋白質可具有科學或商業利益，包括基於蛋白質之藥物（生物治療劑）。肽、多肽及蛋白質尤其包括抗體及嵌合或融合蛋白。肽、多肽及蛋白質可由重組動物細胞株（諸如哺乳動物細胞株）使用細胞培養方法產生。

如本文所用，片語「病毒降低/滅活」意欲指特定樣品中之病毒粒子數目降低減少（「降低（reduction）」），以及特定樣品中病毒粒子之活性，例如但不限於感染力或複製能力減少（「不活化」）。病毒粒子數目及/或活性之此類減少可大約為50%至約99%、甚至更佳約60%至約99%、更佳約70%至約99%、更佳約80%至99%、更佳約90%至約99%、更佳約95%至99%、更佳約95%至99.9%、更佳約95%至99.99%及更佳約98%至99.99%。在某些非限制性實施例中，純化抗體產品中之病毒（若存在）之量小於病毒之ID50（將感染50百分比目標群體之病毒之量），較佳比該病毒之ID50小至少10倍，更佳比該病毒之ID50小至少100倍，且更佳比該病毒之ID50小至少1000倍。

本文提及之所有公開案及專利均以全文引用的方式併入本文中，如同各個別公開案或專利具體地且獨立地以引用的方式併入本文中。在有矛盾的情況下，可以本申請案（包括本文中之任何定義）為準。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或以任何形式表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之通常知識之一部分。 改變樣品 pH

本揭示案提供改變樣品pH之方法，其包含進行初始pH量測，將至少第一量之滴定劑添加至樣品中，量測至少第一額外pH值，及應用模型，該模型將樣品pH聯繫至標準化之添加至樣品之滴定劑量。在一些實施例中，方法進一步包含將第四量之滴定劑添加至樣品，且量測第二pH，且應用模型。在一些實施例中，方法進一步包含添加第三、第四、另外量之滴定劑，在每次添加後量測pH，且應用模型。添加保守量之滴定劑及檢查pH之額外步驟可用於驗證樣品行為如模型所預測，且在製程中不存在誤差，例如由pH計校準引起之誤差。在滴定劑添加一或多次及量測之後，此等量測及模型可用於確定待添加至樣品以使樣品pH變為最終或目標pH的滴定劑之量。

本揭示案之方法可使用相對較少次數之離散量測及模型確定添加至樣品以改變pH之滴定劑之量來達成。當與藉由將pH探針插入至樣品中來量測pH之方法相比時，藉由使用該模型，該等方法可提高到達樣品最終pH之準確性。所量測之pH值與模型之間的差值亦可用於鑑別製程中之誤差，例如pH計校準或功能中之誤差。

在一些實施例中，藉由添加多個量之滴定劑改變樣品pH。在一些實施例中，藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次添加滴定劑來改變樣品pH以達到最終pH。在一些實施例中，藉由2次添加滴定劑來改變樣品pH以達到最終pH。在一些實施例中，藉由3次添加滴定劑來改變樣品pH以達到最終pH。在一些實施例中，藉由4次添加滴定劑來改變樣品pH以達到最終pH。在一些實施例中，藉由5次添加滴定劑來改變樣品pH以達到最終pH。在一些實施例中，樣品pH改變成在最終pH之0.01至0.20、0.01至0.15、0.01至0.10、0.05至0.20、0.05至0.15、0.05至0.10、0.01至0.07或0.05至0.07 pH單位內的pH值，接著最終添加滴定劑以達到最終pH。在一些實施例中，樣品pH改變成最終pH之0.05至0.10 pH單位的pH值，接著最終添加滴定劑以達到最終pH。舉例而言，藉由1、2、3、4或5次添加滴定劑，可將樣品pH改變成在最終pH之0.05至0.10 pH單位內的目標pH，接著最終添加滴定劑以達到最終pH。在一些實施例中，例如樣品pH降低之彼等實施例，滴定劑為酸。在替代實施例中，例如樣品pH提高之彼等實施例，滴定劑為鹼。在本文所述之添加步驟中之任一步驟由本文所述之模型預測之目標pH與所量測之pH的不匹配可指示用於進行量測之pH計具有校準誤差。舉例而言，若給定添加步驟之預測與量測之pH值的差值大於0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20或更大pH單位，則其指示用於量測樣品之pH計正給出錯誤讀數。作為另一實例，若給定添加步驟之預測與量測之pH值的差值大於0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10 pH單位，則其指示用於量測樣品之pH計正給出錯誤讀數。在一些實施例中，方法包含當預測之pH值與所量測之pH值之間出現差值時，停止改變樣品pH之製程，直至重新校準pH計或替換pH探針為止。

本揭示案之方法可在需要改變樣品pH之任何時間使用。舉例而言，若諸如蛋白質純化之製程產生包含具有不適合下游純化步驟或應用之pH的所關注之蛋白（有時稱作蛋白質池）之液體樣品，則本文所述之方法可用於將樣品pH改變至所需pH。作為另一實例，本揭示案之方法可用於將蛋白質樣品之pH降低至足夠低以使可能污染蛋白質樣品之病毒滅活的pH，且接著將pH升高至中性pH以用於進一步蛋白質純化及分析製程。

在一些實施例中，樣品包含所關注之蛋白質，例如治療性蛋白質，且方法用於滅活包含治療性蛋白質之樣品中的病毒。

pH病毒滅活之方法包括（但不限於）在低pH下培育混合物一段時間，且隨後中和pH且藉由過濾移除微粒。在一些實施例中，樣品pH降低至約2與5之間的pH，較佳在約3與4之間的pH下，且更佳在約3.6之pH下，且樣品在此pH下培育以滅活任何存在之病毒。樣品混合物之pH可藉由任何適合之酸降低，包括（但不限於）磷酸、甘胺酸鹽酸鹽、過氯酸、鹽酸、檸檬酸、乙酸、辛酸或其他適合之酸。pH水準之選擇主要視樣品中蛋白質之穩定性概況及緩衝液組分而定。

在滅活樣品中之病毒的示例性方法中，添加保守初始量之酸滴定劑，評估pH，且接著添加額外保守量之酸滴定劑，接著再進行pH評估。此可在可耗費30分鐘與2小時之間的過程中使用少量酸重複進行，直至達成目標pH為止。樣品保持在目標pH下足以滅活病毒之時段，且樣品pH藉由上述之相同製程升高。

在一些實施例中，滅活病毒之低pH培育時段之持續時間將為0.5小時至2小時，或0.5小時至1.5小時，或0.5小時至1小時。在一些實施例中，低pH培育為約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約70分鐘、約80分鐘或約90分鐘。因此，視所關注之蛋白質而定，熟習此項技術者將能夠選擇適當蛋白質濃度、pH及持續時間來達成病毒滅活。

在一些實施例中，改變包含所關注之蛋白質之樣品的pH涉及降低樣品pH。舉例而言，樣品之最終pH（pH _最終）小於樣品之初始pH（pH _初始），且滴定劑為酸。可使用任何適合之酸性溶液，只要滴定劑之pH小於樣品之初始pH即可。

在一些實施例中，例如降低pH之彼等實施例，樣品之初始pH（pH _初始）介於約4.0與4.7之間、介於約4.0與4.5之間、介於約4.0與4.3之間、介於約4.1與4.6之間、介於約4.1與4.5之間、介於約4.1與4.4之間、介於約4.1與4.3之間、介於約4.1與4.2之間、介於約4.2與4.5之間、介於約4.3與4.5之間、介於約4.1與4.4之間或介於約4.2與4.4之間。在一些實施例中，pH _初始介於約4.0至4.5之間、介於約4.1與4.5之間、介於約4.2與4.5之間、介於約4.3與4.5之間、介於約4.1與4.4之間或介於約4.2與4.4之間。在一些實施例中，初始pH為約4.1。在一些實施例中，樣品之最終pH（pH _最終）介於約3.0與3.8之間、介於約2.0與3.7之間、介於約3.0與3.6之間、介於約3.0與3.5之間、介於約3.0與3.4之間、介於約3.0與3.3之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.3與3.8之間、介於約3.5與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與4.0之間、介於約3.5與4.0, 3.4與3.9之間、介於約3.4與3.8之間、介於約3.4與3.7之間、介於約3.4與3.6之間、介於約3.5與3.9之間、介於約3.5與3.8之間、介於約3.5與3.7之間或介於約3.5與3.6之間。在一些實施例中，pH _最終介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，最終pH介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，最終pH為約3.6。

在一些實施例中，改變包含所關注之蛋白質之樣品的pH涉及升高樣品pH。舉例而言，樣品之最終pH（pH _最終）大於樣品之初始pH（pH _初始），且滴定劑為鹼。可使用任何適合之鹼性溶液，只要滴定劑之pH大於樣品之初始pH即可。

在一些實施例中，例如升高pH之彼等實施例，樣品之初始pH（pH _初始）介於約3.0與3.8之間、介於約2.0與3.7之間、介於約3.0與3.6之間、介於約3.0與3.5之間、介於約3.0與3.4之間、介於約3.0與3.3之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.3與3.8之間、介於約3.5與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與4.0之間、介於約3.5與4.0, 3.4與3.9之間、介於約3.4與3.8之間、介於約3.4與3.7之間、介於約3.4與3.6之間、介於約3.5與3.9之間、介於約3.5與3.8之間、介於約3.5與3.7之間或介於約3.5與3.6之間。在一些實施例中，pH _最終介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，pH _初始介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，初始pH介於約3.1與3.8之間。在一些實施例中，初始pH介於約3.3與3.8之間。在一些實施例中，初始pH介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，初始pH為約3.6。在一些實施例中，最終pH（pH _最終）介於5.1與8.5之間、介於約5.1與8.3之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.1與8.0之間、介於約5.1與7.7之間、介於約5.1與7.5之間、介於約5.1與7.3之間、介於約5.1與7.0之間、介於約5.3與8.5之間、介於約5.3與8.3之間、介於約5.3與8.1之間、介於約5.3與8.0之間、介於約5.3與7.7之間、介於約5.3與7.5之間、介於約5.3與7.3之間、介於約5.3與7.0之間、介於約5.5與8.5之間、介於約5.5與8.3之間、介於約5.5與8.1之間、介於約5.5與8.0之間、介於約5.5與7.7之間、介於約5.5與7.0之間、介於約6.0與8.5之間、介於約6.0與8.3之間、介於約6.0與8.0之間、介於約6.0與7.7之間、介於約6.0與7.0之間、介於約6.5與8.5之間、介於約6.5與8.3之間、介於約6.5與8.0之間、介於約6.5與7.7之間、介於約6.5與7.0之間、介於約7.0與8.5之間、介於約7.0與8.3之間、介於約7.5與8.0之間、介於約7.7與8.0之間、介於約7.7與8.5之間、介於約7.7與8.3之間、介於約7.9與8.2之間、介於約7.0與8.0之間、介於約7.0與7.9之間、介於約7.0與7.5之間、介於約6.8與7.8之間、介於約6.8與7.6之間或介於約6.8與7.4之間。在一些實施例中，pH _最終介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5與8.0之間或介於約7.5與8.0之間。在一些實施例中，最終pH介於約5.5與8.0之間。在一些實施例中，最終pH介於約7.0與8.0之間。

本揭示案提供滅活樣品中之病毒之方法。在一些實施例中，方法包含提供包含所關注之蛋白質之樣品，例如已經由管柱層析法自經培養細胞純化之樣品，且降低pH。示例性樣品可具有約4.1至4.5之初始pH，且最終pH為約3.5至3.7，視情況約3.6。初始pH將視所關注之蛋白質、所用純化方法及蛋白質純化步驟之後樣品之組成（例如溶離緩衝液及其類似物）而定。在降低pH且保持一段時間以滅活病毒之後，pH隨後升高至約7.5與8.5之間、或約7.5與8.0、或約7.6之最終鹼性pH。最終鹼性pH將視所關注之蛋白質以及緩衝液及其類似物之選擇而定，緩衝液及其類似物之選擇將視所需下游應用而定。

因此，本揭示案提供滅活樣品中之病毒之方法。在一些實施例中，樣品包含所關注之蛋白質。在一些實施例中，方法包含提供在4.0或更大，例如4.1、4.2、4.3、4.4或4.5之初始pH（pH _初始）下的樣品。在一些實施例中，方法包含在添加酸滴定劑之前量測初始pH。在一些實施例中，方法包含將第一量之酸滴定劑（滴定劑 _{n_ 酸}）添加至樣品且量測第一額外酸pH值（pH _{n_ 酸}），滴定劑 _{n_ 酸}為添加至樣品以達到pH _{n_ 酸}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 酸}不同於pH _初始。第一量之滴定劑通常為保守量之滴定劑。例如，滴定劑之第一量為根據先前參考樣品預測的滴定劑量，其足以使樣品pH變化不超過達到目標pH之方式的一半，或不超過達到目標pH之方式的三分之二，或不超過達到目標pH之方式的四分之三。熟習此項技術者應瞭解，每次添加時待添加至樣品之酸滴定劑之量可視樣品、樣品之初始pH、最終目標pH以及添加至樣品以改變樣品pH之酸滴定劑之添加次數進行調整。在一些實施例中，方法包括將pH標準化且應用模型以確定標準化之滴定劑，亦即與初始pH及添加第一量之酸滴定劑之後的pH相對應之標準化之滴定劑量，其中模型將添加至樣品之標準化之滴定劑聯繫至樣品pH。視情況，可重複添加一定量之滴定劑至少一次、兩次、三次、四次、五次或更多次，以確認樣品之行為與模型相對應。若樣品不符合模型，或懷疑存在pH計校準誤差，則熟習此項技術者可減少添加之滴定劑之量，且增加添加滴定劑之次數，以在製程期間更準確地量測pH，且避免超過目標pH。在一些實施例中，方法包含基於標準化之滴定劑、pH及模型確定待添加至樣品以達到介於3.4與3.7之間的最終酸pH（pH _{酸 _ 最終}）之滴定劑的剩餘量。在一些實施例中，方法包含將剩餘量之滴定劑添加至樣品以達到pH _{酸 _ 最終}。

在一些實施例中，方法包含將樣品保持在pH _{最終 _ 酸}下足以滅活病毒之時段，例如如上所述之培育時間。在一些實施例中，方法包含將第一量之鹼性滴定劑（滴定劑 _{n_ 鹼}）添加至樣品且量測第一額外鹼pH值（pH _{n_ 鹼}），滴定劑 _{n_ 鹼}為添加至樣品以達到pH _{n_ 鹼}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 鹼}不同於pH _{酸 _ 最終}。添加至樣品之鹼之量通常為保守量之滴定劑，亦即根據先前參考樣品預測的滴定劑量，其足以使樣品pH變化不超過達到目標鹼性pH之方式的一半，或不超過達到目標鹼性pH之方式的三分之二，或不超過達到目標鹼性pH之方式的四分之三。熟習此項技術者應瞭解，每次添加時添加至樣品之鹼滴定劑之量可視樣品、樣品之初始pH、最終目標pH以及添加至樣品以改變樣品pH之鹼滴定劑之添加次數進行調整。在一些實施例中，方法包括藉由應用第二模型將滴定劑 _{n_ 鹼}標準化。在一些實施例中，方法包含重複添加及量測步驟至少一次、兩次、三次、四次、五次或更多次，以確認樣品行為與模型相對應。若樣品不符合模型，或懷疑存在pH計校準誤差，則熟習此項技術者可減少添加之滴定劑之量，且增加添加滴定劑之次數，以在製程期間更準確地量測pH，且避免超過目標pH。在一些實施例中，方法包含基於標準化之滴定劑、pH及模型確定待添加至樣品以將樣品pH改變成介於7.0與8.5之間的最終pH（pH _{最終 _ 鹼}）之鹼性滴定劑的剩餘量。在一些實施例中，方法包含將剩餘量之滴定劑添加至樣品以達到pH _{最終 _ 鹼}。

在一些實施例中，方法包含添加一或多個保守量之滴定劑，亦即預期將樣品pH改變成不超過目標pH一半之滴定劑之量，量測pH，及應用模型以確定待添加至樣品以達到目標或最終pH之pH的剩餘量。在一些實施例中，確定待添加至樣品中之滴定劑之最終量係藉由下式來確定：

（等式15）。 在此式中，標準化之滴定劑 _總為添加至樣品以實現最終pH的標準化之後的總量，標準化之滴定劑 _初始為添加至樣品以實現初始pH的標準化之後的量（此值在標準化前可為0），且標準化之滴定劑 _n為添加至樣品以達到中間pH _n的使用該模型標準化之滴定劑之量，其中pH _n落在pH _初始與pH _最終之間。熟習此項技術者應瞭解，在向樣品中添加多個中間量之滴定劑且量測對應pH值之情況下，將根據上文所述之式重新計算待添加至樣品以達到最終pH之滴定劑之剩餘量。

在一些實施例中，方法包含將第一量之滴定劑（滴定劑 _n）添加至樣品且量測至少第一額外pH值（pH _n），滴定劑 _n為添加至樣品以達到pH _n之滴定劑之量，其中pH _n不同於初始pH（pH _初始）；應用模型來確定標準化之滴定劑之初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑 _n，其中該模型將添加至樣品之標準化之滴定劑聯繫至樣品pH；及確定待添加至樣品以達到目標pH（pH _n+1）之滴定劑之另一額外量（滴定劑 _n+1），pH _n+1係藉由將另一額外量之滴定劑（滴定劑 _n+1）添加至樣品而達到的pH。在一些實施例中，方法包含應用模型，且計算添加至樣品以達到第二目標pH（pH _n+2）之滴定劑之額外量（滴定劑 _n+2）。在一些實施例中，方法進一步包含將額外量之滴定劑（滴定劑 _n+2）添加至樣品，藉此將樣品pH改變成第二目標pH（pH _n+2）。在一些實施例中，方法進一步包含應用模型，且計算添加至樣品以達到第三目標pH（pH _n+3）之滴定劑之額外量（滴定劑 _n+3）。在一些實施例中，方法包含添加滴定劑 _n+3，藉此將樣品pH改變成pH _n+3。在一些實施例中，方法進一步包含應用模型，且計算添加至樣品以達到第四目標pH（pH _n+4）之滴定劑之額外量（滴定劑 _n+4）。在一些實施例中，添加滴定劑 _n+1、滴定劑 _n+2、滴定劑 _n+3或滴定劑 _n+4產生在最終目標pH（pH _最終）之0.05至0.10 pH單位內的目標pH。在一些實施例中，將藉由應用模型確定之額外量之滴定劑添加至樣品以達到最終目標pH。舉例而言，pH _n+2在最終目標pH之0.05至0.10 pH單位內，其藉由添加滴定劑 _n+3來達到，其中針對滴定劑 _n+3添加之滴定劑之量藉由應用模型來確定。作為另一實例，pH _n+3在最終目標pH之0.05至0.10 pH單位內，其藉由添加滴定劑 _n+4來達到，其中針對滴定劑 _n+4添加之滴定劑之量藉由應用模型來確定。一般熟習此項技術者應瞭解，視所需pH變化之程度以及樣品及滴定劑之性質而定，比上文所述之滴定劑添加多或少之滴定劑添加可用於達到最終目標pH。在一些實施例中，藉由添加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次滴定劑添加達到最終pH，其中在每次添加之後量測pH，且應用模型以確定待添加以達到額外目標pH及視情況所需最終pH之滴定劑之量。在一些實施例中，方法包含將本文所述之添加步驟中之任一步驟的目標pH（例如pH _n+1、pH _n+2、pH _n+3、pH _n+4等）與模型針對該對應步驟所預測之目標pH進行比較。

當進行本文所述之改變pH之方法時，可使用插入自樣品移出之子樣品中的pH探針來量測樣品之pH量測值。可經由滑流，例如將含有樣品之反應容器連接至其中插入pH探針之流通槽的滑流，自樣品移出子樣品。在一些實施例中，滑流為連續的。在一些實施例中，滑流為不連續或間歇的。在一些實施例中，樣品pH不使用直接插入樣品中之pH探針量測。 pH 計校準

本文所述之方法可用於確定pH計校準或功能中是否存在誤差。當樣品為蛋白質時，超出蛋白質可耐受之pH的pH變化可導致蛋白質變性，可能破壞樣品。因此，與此項技術中已知之其他方法相比，快速且可靠地鑑別pH計校準誤差之能力係本文所揭示之方法的優點。舉例而言，若偵測到pH計校準中之誤差，則pH計可經重新校準，換成新pH計，或可使用自第二pH計取得之量測值對自不準確pH計取得之量測值進行數學校正。在一些實施例中，方法包含重新校準pH計。在一些實施例中，方法包含更換pH計或pH探針。在一些實施例中，方法進一步包含：將額外量之滴定劑添加至樣品且量測額外pH；應用模型且將標準化之滴定劑及pH或標準化之pH與模型進行比較；及當pH或標準化之pH與模型相對應時，將剩餘量之滴定劑添加至樣品以達到pH _最終；從而防止添加過多滴定劑至樣品對所關注之蛋白質造成損傷。

在一些實施例中，所量測之樣品pH與模型之間的差值鑑別用於量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。在一些實施例中，所量測之pH與由模型預測之pH的差值＞ 0.01 pH單位、＞ 0.02 pH單位、＞ 0.03 pH單位、＞ 0.04 pH單位、＞ 0.05 pH單位、＞ 0.06 pH單位、＞ 0.07 pH單位、＞ 0.08 pH單位、＞ 0.09 pH單位或＞ 0.10 pH單位指示與pH計有關之誤差，諸如校準誤差。在一些實施例中，＞0.01 pH單位之差值指示pH計誤差。在一些實施例中，＞0.05 pH單位之差值指示pH計誤差。在一些實施例中，＞0.10 pH單位之差值指示pH計誤差。

在一些實施例中，方法進一步包含在測定樣品之pH值或用於生成模型之至少一個參考樣品的pH值時校正pH計校準。在一些實施例中，針對pH計校準進行校正包含：（a）在添加滴定劑之前移出樣品或參考樣品的第一部分，且用獨立校準之pH計量測該第一部分之pH，藉此生成離線初始pH值（pH _{初始 _ 離線}）；（b）在添加全部量之滴定劑之後移出樣品或參考樣品之第二部分且用獨立校準之pH計量測該第二部分之pH，藉此生成離線最終pH值（pH _{最終 _ 離線}）；及（c）應用離線pH值與所量測之pH值之間的關係確定參考樣品之校正pH。獨立校準之pH計可為在另一輪校準之後的與用於進行初始量測之pH計相同的pH計。或者，獨立校準之pH計可為不同pH計。

離線量測可用於根據下式計算經校正之pH，其中藉由下式確定樣品（或參考樣品）之經校正之pH：

。（等式16） 此處，pH _{初始 _ 離線}為藉由離線pH計量測之樣品之初始pH，pH _{最終 _ 離線}為藉由離線pH計量測之樣品之最終pH，pH _初始及pH _最終為藉由線上pH計（具有校準誤差之計量器）量測之初始pH值及最終pH值，且pH _n為來自未校正pH計之未校正之pH量測值。若經校正之pH計用於量測參考樣品，則經校正之pH與未校正之pH之間保持如針對樣品所描述的相同關係。 模型

本揭示案提供用於本揭示案方法之模型以及生成此等模型之方法。

在一些實施例中，生成模型包含無因次化(non-dimensionalization)，例如參考滴定曲線之滴定劑值之無因次化。無因次化為藉由取代合適變數而自涉及物理量之等式部分或完全移除物理尺寸。舉例而言，添加至樣品之滴定劑之體積可藉由泵之旋轉數/公斤，或每公斤總樣品添加之滴定劑毫升數確定，且此等尺寸可藉由無因次化技術移除。無因次化可簡化及參數化(parameterize)涉及量測單位之問題。在一些情況下，當無因次化用以將多個資料集轉換成共同尺度時，尺度化(scaling)可與無因次化互換。

在一些實施例中，生成模型包含回歸分析。回歸分析為用於估計依變數（通常稱為『反應』變數）與更獨立變數（在此情況下為pH與標準化之滴定劑）之間的關係的一組統計過程。回歸分析之一種常見形式為線性回歸，其中熟習此項技術者根據特定數學準則發現最緊密擬合資料之線。舉例而言，普通最小平方法計算最小化真實資料與該線之間的差值平方和之獨特線。

在一些實施例中，擬合模型包含線性回歸。線性回歸為用於將純量反應變數與一或多個解釋變數之間的關係模型化的線性方法。一種解釋變數之情況稱為簡單線性回歸。在線性回歸中，使用線性預測函數將關係模型化，該等線性預測函數之未知模型參數係自資料估計的。此類模型稱為線性模型。

線性回歸為第一類型回歸分析，其被嚴格研究且廣泛用於實際應用中。此係因為線性依賴於其未知參數之模型比與其參數非線性相聯繫之模型更易於擬合，且因為所得估計值之統計屬性更容易確定。

在一些實施例中，回歸分析包含多項式回歸。多項式回歸為回歸分析之一種形式，其中獨立變數（例如，標準化之滴定劑）與依變數（例如，pH）之間的關係被模型化為第n次多項式。多項式回歸擬合獨立變數之值與依變數之對應條件均值之間的非線性關係。儘管多項式回歸將非線性模型與資料擬合，但作為統計估計問題，其係線性的，意義在於回歸函數在自資料估計之未知參數中為線性的。出於此原因，多項式回歸被視為一種類型多元線性回歸。

可使用最小平方法擬合多項式回歸模型。在高斯-馬爾可夫定理（Gauss-Markov theorem）之條件下，最小平方法將係數之無偏估計值的變異數降至最低。

在一些實施例中，擬合模型包含曲線擬合。曲線擬合為建構曲線或數學函數之過程，其與一系列資料點最佳擬合。曲線擬合可涉及內插，其中需要與資料準確擬合，或平滑化，其中建構大致擬合資料之「平滑」函數。曲線可外推，亦即延伸超出所觀測資料之範圍，但外推曲線具有一定程度不確定性。

擬合模型可使用此項技術中已知之任何適合程式進行，例如Microsoft excel、MATLAB或R。

在一些實施例中，自由一或多個參考樣品生成之一或多個滴定曲線確定模型。參考樣品可與樣品一致，例如經歷一致pH製程之較大樣品之子樣品。或者，參考樣品可類似於樣品。此類參考樣品之實例包括與所關注之蛋白質一致之先前純化批次之蛋白質，其使用類似或相同方法純化，且經受實質上相同之pH製程。作為又一替代方案，參考蛋白質可為與所關注之蛋白質類似但不一致的蛋白質，例如兩種抗體或兩種Fc受體融合蛋白，只要兩種蛋白質在經歷類似pH變化方案時行為類似即可。歸因於本文所述之無因次化及模型化方法，所有參考樣品及樣品之初始及最終pH值無需完全一致。舉例而言，一或多個參考樣品及樣品之初始及/或最終pH值可相差約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5 pH單位。或者，一或多個參考樣品及樣品之初始及/或最終pH值可一致。

因此，本揭示案提供用以生成本文所用之模型之一或多個參考樣品。本揭示案提供滴定曲線，其藉由改變參考樣品之pH且將參考樣品pH聯繫至添加至參考樣品之滴定劑之量而生成。一般熟習此項技術者已知生成及繪製滴定曲線之方法。

在一些實施例中，方法包含：（i）自至少一個參考樣品生成至少一個參考滴定曲線，將添加至參考樣品之滴定劑之量聯繫至參考樣品之pH；（ii）將該至少一個參考滴定曲線標準化；及（iii）生成模型以擬合至少一個參考滴定曲線。在一些實施例中，生成至少一個參考滴定曲線包含量測參考樣品之初始pH（pH _{初始 _ 參考}）。此後將足以改變參考樣品之pH之量的滴定劑添加至參考樣品（滴定劑 _{n_ 參考}），且在添加此滴定劑（pH _{n_ 參考}）之後量測額外參考pH值。可重複此等步驟直至達到最終pH，且使用此項技術中已知之任何合適程式繪製滴定劑之量相對於參考樣品之pH之圖。當生成參考滴定曲線時，可使用添加滴定劑之任何合適方法。可在離散步驟中添加滴定劑，例如藉由添加離散量之滴定劑，攪拌一定量之時間以將其混合至參考樣品中（例如直至參考樣品之pH穩定為止），且進行pH量測。或者，可連續添加滴定劑，且可連續量測pH。當生成參考樣品或樣品之滴定曲線時，可使用量測pH之任何合適方法。舉例而言，參考樣品之pH可藉由直接插入參考樣品中之pH探針量測，或可藉由插入自參考樣品抽取之連續或離散取樣之滑流中的pH探針量測。

在一些實施例中，添加至參考樣品中之滴定劑之量係藉由下式來標準化：

。（等式17） 在此式中，滴定劑 _{1_ 參考}為添加至該參考樣品以達到第一pH _{1_ 參考}之滴定劑之量，且滴定劑 _{2_ 參考}為添加至該參考樣品以達到pH _{2_ 參考}之滴定劑之量。

在一些實施例中，例如當單個參考樣品及對應滴定曲線用於生成模型時，pH _{1_ 參考}可與參考樣品之初始pH相同，且pH _{2_ 參考}可與參考樣品之最終pH相同。

在替代實施例中，複數個參考樣品及對應滴定曲線用於生成模型。當複數個滴定曲線不具有相同初始及/或最終pH值時，pH _{1_ 參考}不與參考樣品之初始pH值中之一些或全部相同，且pH _{2_ 參考}不與參考樣品之最終pH值中之一些或全部相同。各參考滴定曲線包含pH _{初始 _ 參考}及pH _{最終 _ 參考}，且pH _{1_ 參考}為來自複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{初始 _ 參考}，pH _{2_ 參考}為來自複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{最終 _ 參考}，且pH _{1_ 參考}及pH _{2_ 參考}經選擇以涵蓋值之最大差值，同時仍涵蓋複數個參考滴定曲線中之所有曲線覆蓋的pH值。因此，pH _{1_ 參考}及pH ₂儘可能相隔得遠，但與pH _初始及pH _最終偏移一定程度。舉例而言，在參考滴定曲線包含升高pH的情況下，pH _{1_ 參考}可為具有最高初始pH之參考滴定曲線之pH _{初始 _ 參考}，且pH _{2_ 參考}為具有最低最終pH之參考滴定曲線之pH _{最終 _ 參考}。熟習此項技術者將瞭解，當參考滴定曲線包含降低pH時，將保持相反關係。

在一些實施例中，樣品之初始pH（pH _初始）及pH _{1_ 參考}約相同。

舉例而言，若pH值彼此在約0.05單位內，則pH值可視為約相同。或者，彼此在10%、5%或3%內之pH值可視為約相同。

在一些實施例中，樣品之初始pH（pH _初始）與pH _{1_ 參考}不相同，亦即pH _初始與pH _{1_ 參考}之間的差值為約0.05至1.5，為約0.05至1、約0.1至1、約0.1至0.5或約0.1至0.3 pH單位。在一些實施例中，pH _初始與pH _{1_ 參考}之間的差值為約0.1至0.5 pH單位。

在一些實施例中，樣品之最終pH（pH _最終）及pH _{2_ 參考}約相同。

在一些實施例中，pH _最終與pH _{2_ 參考}不相同，亦即pH _最終與pH _{2_ 參考}之間的差值為約0.5至1.5，為約0.05至1、約0.1至1、約0.1至0.5或約0.1至0.3 pH單位。在一些實施例中，pH _最終與pH _{2_ 參考}之間的差值為約0.5至1.5 pH單位。在一些實施例中，pH _最終與pH _{2_ 參考}之間的差值為約0.5至1.0 pH單位。在一些實施例中，pH _最終與pH _{2_ 參考}之間的差值為約0.1至0.5 pH單位。

在一些實施例中，pH _初始、pH _{初始 _ 參考}及pH _{1_ 參考}相同，且其中pH _最終、pH _{最終 _ 參考}及pH _{2_ 參考}相同。

一般熟習此項技術者應瞭解pH _{1_ 參考}及pH _{2_ 參考}之選擇取決於特定參考樣品、對應參考滴定曲線及其中所含之相對於初始及最終pH值之變化量。

在一些實施例中，樣品之最終pH（pH _最終）小於樣品之初始pH（pH _初始），且滴定劑為酸。在一些實施例中，樣品及複數個參考樣品包含所關注之蛋白質。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}為約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9，且pH _{2_ 參考}為約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8或3.9。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}為約4.1，且pH _{2_ 參考}為約3.6。在一些實施例中，樣品及複數個參考樣品之初始pH介於約4.1與4.5之間。在一些實施例中，樣品及複數個參考樣品之最終pH介於約3.5與3.7之間，視情況約3.6。在一些實施例中，添加至複數個參考樣品之滴定劑之量經標準化為約-0.76至約1.49之尺度。在一些實施例中，自複數個參考樣品生成模型包含擬合多項式。在一些實施例中，多項式包含下式之四階多項式：

。（等式18） 在一些實施例中，多項式包含：

。（等式19） 上述由模型生成之多項式可用於自所量測之pH值計算添加至樣品之標準化之滴定劑。

在一些實施例中，其中樣品之最終pH（pH _最終）大於初始pH（pH _初始），且滴定劑為鹼。在一些實施例中，樣品及複數個參考樣品包含所關注之蛋白質。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}介於約3.1與3.8之間。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}介於約3.4與4.1之間。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}為約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8或3.9。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}為約3.6。在一些實施例中，pH _{1_ 參考}為約3.7。在一些實施例中，pH _{2_ 參考}介於約7.5與8.5之間。在一些實施例中，pH _{2_ 參考}為約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0.、7.,1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3或8.4。在一些實施例中，pH _{2_ 參考}為約7.6。在一些實施例中，pH _初始介於約3.5與3.7之間。在一些實施例中，pH _最終介於約5.1與8.5之間。在一些實施例中，pH _最終介於約7.5與8.0之間。在一些實施例中，pH _最終介於約7.5與8.0之間。在一些實施例中，pH _最終介於約7.0與8.0之間、介於約7.1與7.9之間、介於約7.2與7.8之間、介於約7.3與7.7之間或介於約7.4與7.6之間。在一些實施例中，添加至參考樣品之滴定劑之量經標準化至約-0.06至約1.53之尺度。在一些實施例中，自複數個參考樣品生成模型包含擬合多項式。在一些實施例中，多項式包含下式之五階多項式：

（等式20） 在一些實施例中，多項式包含： 標準化之滴定劑 _n= 12.256725 - 10.723277 * pH _n+ 3.3662386 * pH _n ²- 0.4588175 * pH _n ³+ 0.0255417 * pH _n ⁴- 0.0003153 * pH _n ⁵（等式21） 上述由模型生成之多項式可用於自所量測之pH值計算添加至樣品之標準化之滴定劑。 上述之模型意欲為示例性且非限制性的。熟習此項技術者應瞭解，視一或多個參考樣品或樣品之初始及最終pH值而定，藉由本文所述之方法自參考樣品生成之其他模型（包括其他多項式）將適合用於本文所述之方法中。 所關注之蛋白質

本揭示案提供包含所關注之蛋白質之樣品，其用於本文所述之方法中。所關注之蛋白質可為治療性蛋白質，亦即向個體投與以用於治療疾病或病症之蛋白質。示例性所關注之蛋白質包括（但不限於）抗體、受體Fc融合蛋白（諸如陷阱蛋白）、細胞介素、趨化介素、生長因子及其類似物。

在一些實施例中，所關注之蛋白質為抗原結合蛋白，諸如抗體。

片語「抗原結合蛋白」包括具有至少一個互補決定區（CDR）且能夠選擇性識別抗原，亦即能夠以至少在微莫耳範圍內之KD結合抗原的蛋白質。治療性抗原結合蛋白（例如，治療性抗體）常需要在奈莫耳(nanomolar)或皮莫耳(picomolar)範圍內之KD。通常，抗原結合蛋白包括兩個或更多個CDR，例如2、3、4、5或6個CDR。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體之抗原結合片段，諸如含有抗體之重鏈及輕鏈之可變區的多肽（例如，Fab片段、F(ab')2片段），及含有抗體之重鏈及輕鏈之可變區且含有來自重鏈及/或輕鏈之恆定區的額外胺基酸（諸如一或多個恆定域，亦即CL、CH1、鉸鏈、CH2及CH3域中之一或多者）的蛋白質。

「抗體」係指由四條多肽鏈、藉由二硫鍵互連之兩條重（H）鏈及兩條輕（L）鏈組成的免疫球蛋白分子。各重鏈具有重鏈可變區（HCVR或VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈具有輕鏈可變區（VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個域（CL）組成。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其間散佈著較保守性區域，稱為框架區（FR）。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。術語「抗體」包括任何同型或子類之糖基化與未糖基化免疫球蛋白。術語「抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體分子，諸如自經核苷酸序列轉染以表現抗體之宿主細胞中分離的抗體。術語「抗體」亦包括雙特異性抗體，該雙特異性抗體包括可結合於超過一種抗原決定基之異源四聚體免疫球蛋白。如本文所用，術語「抗體」亦包括完整抗體分子之抗原結合片段及包含抗體或抗原結合片段之融合蛋白。

術語抗體之「抗原結合部分」（或「抗體片段」）係指抗體之保留特異性結合於抗原之能力的一或多個片段。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內之蛋白質結合片段的非限制性實例包括：（i）Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；（ii）F(ab')2片段，其為包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；（iii）Fd片段，其由VH及CH1域組成；（iv）Fv片段，其由抗體單臂之VL及VH域組成；（v）dAb片段（Ward等人, Nature (1989) 241:544-546），其由VH域組成；（vi）經分離之CDR；以及（vii）scFv，其由Fv片段之兩個域VL及VH組成，該VL及VH藉由合成連接子接合以形成單個蛋白質鏈，其中VL與VH區配對形成單價分子。術語「抗體」下亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。參見例如Holliger等人, PNAS USA (1993) 90:6444-6448；Poljak等人, Structure (1994) 2:1121-1123。

再此外，抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之一部分，該免疫黏附分子藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價締合而形成。此類免疫黏附分子之非限制性實例包括使用鏈黴抗生物素蛋白核心區製成四聚scFv分子（Kipriyanov等人, Human Antibodies and Hybridomas (1995) 6:93-101）及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端聚組胺酸標籤製成二價且生物素標記之scFv分子（Kipriyanov等人 Mol. Immunol. (1994) 31:1047-1058）。諸如Fab和F(ab')2片段之抗體部分可由全抗體，使用習知技術，諸如對全抗體進行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化來製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附分子可使用此項技術中通常已知之標準重組DNA技術（參見Sambrook等人, 1989）獲得。

術語「人類抗體」意欲包括具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區之抗體。本揭示案之人類抗體可包括例如CDR且尤其CDR3中不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變）。

如本文所用，術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體；自重組組合人類抗體文庫分離之抗體；自人類免疫球蛋白基因轉殖基因之動物（例如小鼠）分離之抗體（參見例如Taylor等人Nucl. Acids Res. (1992) 20:6287-6295）；或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經受活體外突變誘發（或當使用人類Ig序列轉殖基因之動物時，為活體內體細胞突變誘發），且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相聯繫，但該等胺基酸序列為可在活體內不天然存在於人類抗體生殖系庫內之序列。

考慮額外治療性蛋白質在本發明所揭示之細胞培養方法及治療性蛋白質產生方法之範疇內。在某些實施例中，治療性蛋白質為抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為IgG1抗體、IgG2抗體、IgG4抗體、嵌合IgG2/IgG4抗體、嵌合IgG2/IgG1抗體或嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗體。

在一些實施例中，抗體係選自由以下組成之群：抗計劃性細胞死亡1抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2015/0203579A1號中所描述之抗PD1抗體）、抗計劃性細胞死亡配位體-1（例如，如美國專利申請公開案第US2015/0203580A1號中所描述之抗PD-L1抗體）、抗Dll4抗體、抗血管生成素-2抗體（例如，如美國專利第9,402,898號中所描述之抗ANG2抗體）、抗類血管生成素3抗體（例如，如美國專利第9,018,356號中所描述之抗AngPtl3抗體）、抗血小板衍生生長因子受體抗體（例如，如美國專利第9,265,827號中所描述之抗PDGFR抗體）、抗Erb3抗體、抗泌乳素受體抗體（例如，如美國專利第9,302,015號中所描述之抗PRLR抗體）、抗補體5抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2015/0313194A1號中所描述之抗C5抗體）、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體（例如，如美國專利第9,132,192號中所描述之抗EGFR抗體或如美國專利申請公開案第US2015/0259423A1號中所描述之抗EGFRvIII抗體）、抗前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9抗體（例如，如美國專利第8,062,640號或美國專利申請公開案第US2014/0044730A1號中所描述之抗PCSK9抗體）、抗生長及分化因子-8抗體（例如抗GDF8抗體，亦稱為抗肌肉抑制素抗體，如美國專利第8,871,209號或第9,260,515號中所描述）、抗升糖素受體（例如，如美國專利申請公開案第US2015/0337045A1號或第US2016/0075778A1號中所描述之抗GCGR抗體）、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、介白素4受體抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2014/0271681A1號或美國專利第8,735,095號或第8,945,559號中所描述之抗IL4R抗體）、抗介白素6受體抗體（例如，如美國專利第7,582,298號、第8,043,617號或第9,173,880號中所描述之抗IL6R抗體）、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33（例如，如美國專利申請公開案第US2014/0271658A1號或第US2014/0271642A1號中所描述之抗IL33抗體）、抗呼吸道融合病毒抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2014/0271653A1號中所描述之抗RSV抗體）、抗分化簇3（例如抗CD3抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國申請案第62/222,605號中所描述）、抗分化簇20（例如，如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國專利第7,879,984號中所描述之抗CD20抗體）、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化簇-48（例如，如美國專利第9,228,014號中所描述之抗CD48抗體）、抗Fel d1抗體（例如，如美國專利第9,079,948號中所描述）、抗中東呼吸道症候群病毒（例如，如美國專利申請公開案第US2015/0337029A1號中所描述之抗MERS抗體）、抗伊波拉病毒（Ebola virus）抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2016/0215040號中所描述）、抗茲卡病毒（Zika virus）抗體、抗淋巴球活化基因3抗體（例如抗LAG3抗體或抗CD223抗體）、抗神經生長因子抗體（例如，如美國專利申請公開案第US2016/0017029號及美國專利第8,309,088號及第9,353,176號中所描述之抗NGF抗體）以及抗活化素A抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體係選自由以下組成之群：抗CD3×抗CD20雙特異性抗體（如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號中所描述）、抗CD3×抗黏蛋白16雙特異性抗體（例如抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體）及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體（例如抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體）。在一些實施例中，所關注之蛋白質係選自由以下組成之群：阿利庫單抗（alirocumab）、賽瑞單抗（sarilumab）、法神單抗（fasinumab）、奈伐單抗（nesvacumab）、度匹魯單抗（dupilumab）、曲弗單抗（trevogrumab）、依凡納單抗（evinacumab）及瑞努庫單抗（rinucumab）。貫穿本揭示案提及之所有公開案以全文引用的方式併入本文中。

在其他實施例中，治療性蛋白質為含有Fc部分及另一域之重組蛋白（例如，Fc融合蛋白）。在一些實施例中，Fc融合蛋白為受體Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之受體之一或多個胞外域。在一些實施例中，Fc部分包含鉸鏈區，隨後為IgG之CH2及CH3域。在一些實施例中，受體Fc融合蛋白含有結合於單一配位體或多個配位體之兩條或更多條獨特受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白為陷阱蛋白，諸如例如IL-1阱（例如，利納西普（rilonacept），其含有與Il-1R1細胞外區融合之IL-1RAcP配位體結合區，該Il-1R1細胞外區與hIgG1之Fc融合；參見美國專利第6,927,004號，其以全文引用的方式併入本文中）、VEGF阱（例如，阿柏西普（aflibercept）或ziv-阿柏西普，其含有與VEGF受體Flk1之Ig域3融合之VEGF受體Flt1之Ig域2，該VEGF受體Flk1之Ig域3與hIgG1之Fc融合；參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號；或康柏西普（conbercept），其含有與VEGF受體Flk1之Ig域3融合之VEGF受體Flt1之Ig域2，該VEGF受體Flk1之Ig域3與VEGF受體Flk1之Ig域4融合，該VEGF受體Flk1之Ig域4與hIgG1之Fc融合；參見美國專利第8,216,575號）或TNF阱（例如，依那西普（etanercept），其含有與hIgG1之Fc融合的TNF受體；參見美國專利第5,610,279號）。在其他實施例中，Fc融合蛋白為ScFv-Fc融合蛋白，其含有一或多個抗原結合域中之一者或多者，諸如與Fc部分偶合之抗體的可變重鏈片段及可變輕鏈片段。

在一些實施例中，所關注之蛋白質為糖蛋白。具有天冬醯胺連接（N連接）之聚糖之醣蛋白普遍存在於真核細胞中。此等聚糖之生物合成及其向多肽之轉移發生在內質網（ER）中。N-聚糖結構進一步藉由ER中之多種糖苷酶及糖基轉移酶以及高基複合體（Golgi complex）修飾。治療性蛋白質之糖基化對於治療性蛋白質之品質及有效性可為關鍵的。舉例而言，抗體糖基化為常見轉譯後修飾，且可在抗體效應功能以及抗體穩定性中起作用。熟習此項技術者將已知分析蛋白質樣品中之糖基化模式及糖基化蛋白質百分比之方法。 蛋白質純化

熟習此項技術者將已知純化由本文所述之細胞及細胞培養方法產生之所關注之蛋白質以產生所關注之蛋白質的方法。自細胞培養基或自細胞純化所關注之蛋白質之方法包括層析及非層析方法。層析方法包含使包含抗體之溶液穿過固相（例如，二氧化矽樹脂或珠粒、單片管柱或纖維素膜）且視採用「結合與溶離」還是「流過」層析法而定，使所關注之蛋白質結合或穿過。層析方法包括（但不限於）親和力-標籤結合、蛋白A結合、離子交換層析法（諸如陰離子交換層析法）、尺寸排阻層析法或免疫親和層析法。純化亦可經由使用基因融合之純化標籤（諸如聚組胺酸標籤或FLAG標籤）實現。

示例性蛋白質純化方案包含獲得包含所關注之蛋白質之澄清溶液，及進行不同純化技術之組合，包括離子交換分離步驟及疏水相互作用分離步驟。分離步驟基於蛋白質之電荷、疏水性程度或尺寸分離蛋白質混合物。在本發明之一個態樣中，使用包括陽離子、陰離子及疏水相互作用之層析法進行分離。此等步驟中之各者可利用不同層析樹脂，從而使得純化方案針對所涉及之特定蛋白質進行精確修改。分離方法中之各者的本質在於可引起蛋白質以不同速率沿著管柱向下橫移，實現物理分離，該物理分離隨著蛋白質進一步沿著管柱向下遞送而增加，或選擇性地黏附於分離介質，隨後藉由不同溶劑有差異地溶離。在一些情況下，當雜質特異性地黏附於管柱且蛋白質不黏附於管柱時，亦即所關注之蛋白質存在於流過物中，所關注之蛋白質與雜質分開。

在一些實施例中，所關注之蛋白質之純化涉及主要回收步驟。在一些實施例中，主要回收步驟涉及層析管柱，諸如親和管柱。主要回收步驟之後亦可為使用本文所述之方法，例如藉由使溶離液中所關注之蛋白質池經歷本文所述之pH變化來使病毒滅活的時刻。

在一些實施例中，自主要回收步驟回收之蛋白質樣品經歷額外純化步驟，以進一步純化所關注之蛋白質。舉例而言，可使用親和層析法。可使用之層析材料之非限制性實例包括：蛋白A、蛋白G、包含由所關注之抗體結合之抗原的層析材料或結合於所關注之蛋白質的抗體及包含Fc結合蛋白之層析材料。作為另一實例，疏水相互作用管柱可用於移除諸如聚集體之雜質。

任何純化步驟均可製造可經受本文所述之方法的樣品。可在任何合適純化步驟之後，在任何合適純化步驟之後使用本文所述之pH控制製程使潛在病毒滅活。另外，或包含所關注之蛋白質之溶液的pH可使用本文所述之方法改變，例如改變成下一純化步驟或其他下游應用所需之pH。 細胞及細胞培養

本揭示案提供用於產生本文所述之所關注之蛋白質的細胞群體。合適細胞包括細菌細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。

在一些實施例中，細胞群體自能夠產生所關注之蛋白質之細胞株分離或獲得。用於產生治療性蛋白質之細胞株之非限制性實例尤其包括初級細胞、BSC細胞、希拉細胞（HeLa cell）、HepG2細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、CHO-K1細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、3T3細胞、293細胞、RK細胞、Per.C6細胞及雞胚胎細胞。在一些實施例中，細胞群體包含CHO細胞。在一些實施例中，CHO細胞包含來自經最佳化以用於大規模產生蛋白質之若干特異性CHO細胞變異體中之一或多者的CHO細胞，例如CHO-K1、CHO-K1來源之EESYR®（增強表現及穩定性區域）細胞（美國專利第7,771,997號）或美國專利第6,919,183號中所述之FASTR技術，該技術提供產生分泌蛋白之細胞的分離。

在一些實施例中，進行培養且表現所關注之蛋白質之細胞群體為藉由具有且表現編碼所關注之治療性蛋白質之聚核苷酸的細胞（亦即，先驅細胞）之純系擴增獲得的細胞群體。在一些實施例中，藉由自先驅細胞進行純系擴增而獲得或源自純系擴增之細胞群體之構成細胞的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或約100%含有編碼蛋白質之聚核苷酸且表現所關注之蛋白質。

在一些實施例中，進行培養且表現治療性蛋白質之細胞群體藉由培養已冷凍且儲存之細胞產生。哺乳動物細胞可冷凍且冷凍保存在例如含有二甲亞碸（DMSO）及細胞培養基之冷凍保存培養基中。在一示例性冷凍保存方案中，將哺乳動物細胞轉移至冷凍保存培養基，且緩慢冷凍，隨後儲存在液氮下。舉例而言，細胞可經擴增且冷凍保存以產生細胞庫，其為由具有所需特徵之單一細胞池產生的一組細胞。

本揭示案提供用於在純化之前培養表現所關注之蛋白質之細胞的方法。

「細胞培養」或「培養」意謂在多細胞生物體或組織外的細胞生長及繁殖。適用於哺乳動物細胞之培養條件係此項技術中已知的。參見例如Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood編輯, Oxford University Press, New York (1992)。哺乳動物細胞可在懸浮液中培養或同時與固體基板連接。具有或不具有微載體且以分批、分批進料、連續、半連續或灌注模式操作之流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌槽生物反應器可用於哺乳動物細胞培養。

在一些實施例中，培養表現所關注之蛋白質之細胞群體包含擴增或生長期，其中細胞群體擴增至足以在生產階段生產所需數量之所關注之蛋白質的尺寸。

在一些實施例中，培養表現所關注之蛋白質之細胞群體包含生產期，其中細胞群體在生產細胞培養基中在足以生產所關注之蛋白質之條件下培養。生產期可在任何培養規模下進行，自個別燒瓶及搖瓶或波袋（wave bag），至一公升生物反應器，及至大規模工業生物反應器。大規模製程可在約100公升至20,000公升或更大的體積中進行。若干手段中之一或多者可用以控制蛋白質產生，諸如溫度變化或化學誘導。生長期可在比生產期更高的溫度下進行。舉例而言，生長期可在約35℃至38℃之第一溫度下進行，且生產期可在約29℃至37℃，視情況約30℃至36℃或約30℃至34℃之第二溫度下進行。另外，蛋白質產生之化學誘導劑，諸如咖啡鹼、丁酸酯、他莫昔芬（tamoxifen）、雌激素、四環素、去氧羥四環素（doxycycline）及六亞甲基雙乙醯胺（HMBA）可在溫度變化的同時、之前或之後添加。若在溫度變化之後添加誘導劑，則可在溫度變化之後的一小時至五天，諸如在溫度變化之後的一天至兩天添加該等誘導劑。生產細胞培養物可作為連續饋料培養系統操作，如在恆化器中（參見C. Altamirano等人, Biotechnol Prog. 2001年11月-12月; 17(6):1032-41），或根據分批進料製程（Huang, 2010）。

如本文所用，術語「細胞培養基（cell culture media）」、「培養基（media）」、「細胞培養基（cell media）」、「細胞培養基（cell culture medium）」或「培養基（culture medium）」係指用於細胞、例如動物或哺乳動物細胞生長的任何營養液，且一般提供至少一或多種來自以下之組分：能量來源（通常呈碳水化合物形式，諸如葡萄糖)；所有必需胺基酸中之一或多者，且一般為二十種基本胺基酸；通常需要低濃度之維生素及/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪酸；及微量元素，例如通常需要極低濃度，通常在微莫耳範圍內之無機化合物或天然存在之元素。在一些實施例中，藉由將大豆或其他植物蛋白水解產物與一或多種額外成分組合來形成細胞培養基。

如本文所用，「額外成分」包括細胞培養基組分中之任一者或多者，包括但不限於水；能量來源；所有必需胺基酸中之一或多者，且一般為二十種基本胺基酸；通常需要低濃度之維生素及/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪酸、微量元素及多胺，諸如鳥胺酸及腐胺。舉例而言，細胞培養基可藉由將大豆水解產物與基礎細胞培養基組合且向培養基補充額外多胺來形成。

在一些實施例中，細胞培養基含有化學成分確定之基礎培養基，諸如定製調配物或市售基礎培養基。

市售培養基將為熟習此項技術者所知，且尤其包括伊格爾MEME（Eagle's MEME，最低必需培養基）（Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504）、Ham's F12（Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293）、F-12 K培養基、杜爾貝科氏培養基（Dulbecco's medium）、杜爾貝科氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952年8月; 38(8): 747-752）、DMEM/Ham's F12 1:1、Trowell's T8、A2培養基（Holmes及Wolf, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401）、Waymouth培養基（Davidson及Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2):188-199）、Williams E培養基（Williams等人, Exp. Cell Res., 1971, 69:105及以下）、RPMI 1640（Moore等人, J. Amer. Med. Assoc., 1967, 199:519-524）、MCDB 104/110培養基（Bettger等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):5588-5592）、Ventrex HL-1培養基、白蛋白-球蛋白培養基（Orr等人, Appl. Microbiol., 1973, 25(1):49-54）、RPM I-1640培養基、RPMI-1641培養基、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、McCoy's 5 A培養基、Leibovitz's L-15培養基及無血清培養基，諸如EX-CELL™ 300系列（JRH Biosciences, Lenexa, Kans.）、魚精蛋白-鋅-胰島素培養基（Weiss等人, 1974, 美國專利第4,072,565號）、生物素-葉酸鹽培養基（Cartaya, 1978, US Re30,985）、運鐵蛋白-脂肪酸培養基（Baker, 1982, 美國專利第4,560,655號）、運鐵蛋白-EGF培養基（Hasegawa, 1982, 美國專利第4,615,977號；Chessebeuf, 1984, 美國專利第4,786,599號）及其他培養基置換（參見Inlow, 美國專利第6,048,728號；Drapeau, 美國專利第7,294,484號；Mather, 美國專利第5,122,469號；Furukawa, 美國專利第5,976,833號；Chen, 美國專利第6,180,401號；Chen, 美國專利第5,856,179號；Etcheverry, 美國專利第5,705,364號；Etcheverry, 美國專利第7,666,416號；Ryll, 美國專利第6,528,286號；Singh, 美國專利第6,924,124號；Luan, 美國專利第7,429,491號；及其類似物）。

在一些實施例中，細胞培養基無血清。在一些實施例中，細胞培養基無血清且無水解產物

在一些實施例中，培養基在其適用濃度下（亦即，1×）含有至少40±6 mM或至少55±10.5 mM之胺基酸或胺基酸鹽之混合物。在一個實施例中，培養基含有至少40 mM之胺基酸混合物。在此或另一實施例中，培養基含有至少55 mM之胺基酸混合物。在一個實施例中，胺基酸混合物（除麩醯胺酸之外，其可作為使用點添加物來加回至培養基）含有丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。

在一些實施例中，培養基含有一或多種脂肪酸。在一個特定實施例中，培養基含有脂肪酸（或脂肪酸衍生物）與α生育酚之混合物。脂肪酸或脂肪酸衍生物係選自由以下組成之群：亞麻油酸、次亞麻油酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、酸、月桂酸、二十二烷酸、癸酸、十二烷酸、己酸、二十四烷酸、肉豆蔻酸及辛酸。

在一些實施例中，培養基含有核苷混合物。在一個實施例中，培養基含有腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷及次黃嘌呤。

在一些實施例中，培養基含有鹽混合物。鹽包括二價陽離子，諸如鈣及鎂。在一個實施例中，培養基含有氯化鈣及硫酸鎂。其他鹽可包括磷酸鹽之鹽。

視細胞培養過程而定，在細胞培養期間不同時間可使用不同細胞培養基。舉例而言，當擴增來自冷凍等分試樣之初始細胞群體以產生用於產生所關注之蛋白質之細胞群體時，可使用擴增細胞培養基。第二生產細胞培養基可用於培養經擴增之細胞群體以生產所關注之蛋白質，且第三「進料」細胞培養基可用於在生產期間細胞培養物進料。或者，可在整個細胞培養過程中使用相同細胞培養基。作為另一替代方案，擴增培養基可不同於生產及進料培養基，生產及進料培養基具有相同或類似組成。

在一些實施例中，一或多種使用點添加物可在細胞培養期間添加至如本文所述之細胞培養基中之任一者。

在一些實施例中，培養細胞群體包含將進料培養基添加至生產細胞培養物中。如本文所用，「進料培養基」係指添加至培養細胞以補充耗盡之營養物的培養基。進料培養基可經濃縮。舉例而言，當與生產細胞培養基相比時，進料培養基之一種或所有組分可濃縮。或者，進料培養基之濃度可與生產細胞培養基類似。當受到監測之特定培養基組分的濃度超出所需範圍時，可添加培養基至c培養物顯著地或在培養物期間以間隔時間（例如每天、每隔一天）添加，或細胞培養物可進給。

在一些實施例中，在細胞培養期間根據分批進料製程以一定時間間隔補充培養基。分批進料培養一般為此項技術中已知且用於優化蛋白質生產。參見例如Y.M. Huang等人, Biotechnol Prog. (2010) 26(5) 第1400-1410頁。

可在本文所述之細胞培養方法期間的任何時間點量測活細胞百分比。測定活細胞計數及細胞密度之方法包括（但不限於）成像細胞及定量細胞數目、密度、直徑及生物標記物表現。

哺乳動物細胞（諸如CHO細胞）可在小規模細胞培養容器中，諸如在具有約25 ml培養基之125 ml容器、具有約50至100 ml培養基之250 ml容器或具有約100至200 ml培養基之500 ml容器中培養。舉例而言，此等小規模容器可為搖瓶。細胞培養燒瓶為此項技術中已知，且可購自例如Corning、Fisher Scientific及其他供應商。

或者，細胞培養物可以實驗室規模生長。此等包括例如具有約300至1000 ml培養基之1000 ml容器、具有約500 ml至3000 ml培養基之3000 ml容器、具有約2000 ml至8000 ml培養基之8000 ml容器及具有約4000 ml至15000 ml培養基之15000 ml容器。合適細胞培養系統為可商購的。

用於製造之培養物（亦即生產細胞培養物）可含有10, 000 L培養基或更多。諸如用於蛋白質治療劑之製造的大規模細胞培養物或「生產細胞培養物」通常維持數天或甚至數週，同時細胞生產所需蛋白質。在此時間期間，培養物可補充有濃縮進料培養基，該濃縮進料培養基含有在培養過程期間消耗的組分，諸如營養物及胺基酸。

在一些實施例中，在細胞生長或蛋白質生產過程期間，細胞培養基補充有一或多種「使用點添加物」，亦稱為添加物、使用點成分或使用點化學物質。使用點添加物包括生長因子或其他蛋白質、緩衝液、能量來源、鹽、胺基酸、金屬、滲透劑及螯合劑中之任一者或多者。其他蛋白質包括運鐵蛋白及白蛋白。包括細胞介素及趨化介素之生長因子一般為此項技術中已知的，且已知刺激細胞生長，或在一些情況下刺激細胞分化。生長因子通常為蛋白質（例如胰島素）、小肽或類固醇激素，諸如雌激素、DHEA、睪固酮及其類似物。

在一些實施例中，細胞培養基補充有以下使用點添加物中之任一者或多者或全部：碳酸氫鈉、右旋糖、L-麩醯胺酸、L-酪胺酸、胺基酸混合物及磷酸鈉。

緩衝劑一般為此項技術中已知的。本發明並不限於任一或任何特定緩衝液，且任何一般熟習此項技術者可選擇供與產生特定蛋白質之特定細胞株一起使用的適當緩衝液或緩衝系統。

適用作細胞培養物中之使用點添加物的能源來源亦為此項技術中熟知的。非限制性地，在一些實施例中，使用點添加物能量來源為葡萄糖。在其他實施例中，使用點添加物能量來源為右旋糖。

螯合劑同樣為細胞培養及蛋白質生產之技術中熟知的。EDTA四鈉脫水物及檸檬酸鹽為在此項技術中使用之兩種常用螯合劑，但其他螯合劑可用於本發明之實踐中。

其他使用點添加物包括各種金屬鹽中之一或多者，諸如鐵鹽、鎳鹽、鋅鹽及銅鹽。在一個實施例中，細胞培養基補充有硫酸銅、硫酸鋅、氯化鐵及硫酸鎳中之任一者或多者。 設備

本揭示案提供用於本文所述之方法中的設備。

在一些實施例中，設備可用於控制pH且實施pH順序（改變樣品pH之順序），以有效地使反應器中之蛋白質樣品中的病毒滅活。自反應器抽取樣品及量測樣品pH可解決由使用插入反應器中之探針產生的若干問題。舉例而言，探針在滅菌之後通常無法進行校準。滅菌可影響探針校準曲線。高壓滅菌通常包括與第三方協調，因此耗時。探針可在滅菌之後儲存於乾燥環境中，此可減少探針效能及存放期。探針之使用通常包括使用額外無菌連接孔口。另外，探針之使用包括探針斷裂且使參考溶液滲漏至藉由探針量測之蛋白質產物中的風險。

圖19係根據一實施例之用於pH控制之設備100的方塊圖。如所示，設備100包括反應器110、pH流通槽120、酸滴定劑供應130、鹼滴定劑供應140及視情況選用之廢棄物接收器150。pH流通槽120含有安置於其中之pH探針121以量測流通槽中之流體樣品之pH。組件之間的管線表示流體耦接。設備100可包括一或多個控制器以控制其製程單元中之任一者。控制器可控制步驟順序（例如使用酸滴定劑/鹼滴定劑）。在一些實施例中，一或多個控制器可基於pH流通槽中之pH量測控制順序。控制器可經由使用者介面存取。在一些實施例中，使用者介面可包括電腦、膝上型電腦、行動裝置、平板電腦、行動電話或任何其他適合裝置。

在反應器110中，基於使用者定義之順序，例如使用者定義之經設計以使包含經純化或部分純化之蛋白質之樣品中的病毒滅活的pH變化順序控制pH。在一些實施例中，反應器110可為分批反應器或具有分批反應器之性質。在一些實施例中，反應器110可為持續攪拌槽反應器（CSTR）或具有CSTR之性質。在一些實施例中，反應器110可為塞式流動反應器（PFR）或具有PFR之性質。在一些實施例中，反應器110可包括安置於其中之混合器。在一些實施例中，混合器可包括葉輪。混合器可在即將添加酸滴定劑及/或鹼滴定劑時、添加酸滴定劑及/或鹼滴定劑之後或期間使反應器110之內含物均勻化。在一些實施例中，混合器由控制器控制，亦即，控制器將信號發送至混合器以開啟葉輪、終止葉輪或控制葉輪之速率。在一些實施例中，設備100可包括安置於反應器110外部之混合器。換言之，混合器可為與反應器110分開之單元。在一些實施例中，酸混合器（未示）可流體耦接至酸滴定劑供應130且在添加至反應器110之前混合酸滴定劑。在一些實施例中，鹼混合器（未示）可流體耦接至鹼滴定劑供應140且在添加至反應器110之前混合鹼滴定劑。在一些實施例中，反應器110可不存在安置於其中之pH量測探針。反應器110可經由自酸滴定劑供應130及/或鹼滴定劑供應140遞送酸滴定劑及/或鹼滴定劑而保持在所需pH值下。

在一些實施例中，控制器在開始酸滴定劑泵（對於酸滴定劑添加）之前或在開始鹼滴定劑泵（對於鹼滴定劑添加）之前將信號發送至混合器以開啟混合器。在一些實施例中，控制器將信號發送至混合器以在酸滴定劑泵或鹼滴定劑泵停止之後停止固定時段。舉例而言，控制器可將信號發送至混合器以在酸滴定劑泵或鹼滴定劑泵停止之後停止15秒、30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘或1小時。

在一些實施例中，反應器110可具有至少約1 L、至少約2 L、至少約3 L、至少約4 L、至少約5 L、至少約6 L、至少約7 L、至少約8 L、至少約9 L、至少約10 L、至少約20 L、至少約30 L、至少約40 L、至少約50 L、至少約60 L、至少約70 L、至少約80 L、至少約90 L、至少約100 L、至少約200 L、至少約300 L、至少約400 L、至少約500 L、至少約600 L、至少約700 L、至少約800 L、至少約900 L、至少約1 m ³、至少約2 m ³、至少約3 m ³、至少約4 m ³、至少約5 m ³、至少約6 m ³、至少約7 m ³、至少約8 m ³、至少約9 m ³、至少約10 m ³、至少約20 m ³、至少約30 m ³、至少約40 m ³、至少約50 m ³、至少約60 m ³、至少約70 m ³、至少約80 m ³或至少約90 m ³之體積。在一些實施例中，反應器110可具有至多約100 m ³、至多約90 m ³、至多約80 m ³、至多約70 m ³、至多約60 m ³、至多約50 m ³、至多約40 m ³、至多約30 m ³、至多約20 m ³、至多約10 m ³、至多約9 m ³、至多約8 m ³、至多約7 m ³、至多約6 m ³、至多約5 m ³、至多約4 m ³、至多約3 m ³、至多約2 m ³、至多約1 m ³、至多約900 L、至多約800 L、至多約700 L、至多約600 L、至多約500 L、至多約400 L、至多約300 L、至多約200 L、至多約100 L、至多約90 L、至多約80 L、至多約70 L、至多約60 L、至多約50 L、至多約40 L、至多約30 L、至多約20 L、至多約10 L、至多約9 L、至多約8 L、至多約7 L、至多約6 L、至多約5 L、至多約4 L、至多約3 L或至多約2 L之體積。

反應器110之上述體積的組合亦為可能的（例如，至少約1 L且至多約100 m ³或至少約10 L且至多約500 L），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，反應器110可具有約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約20 L、約30 L、約40 L、約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約200 L、約300 L、約400 L、約500 L、約600 L、約700 L、約800 L、約900 L、約1 m ³、約2 m ³、約3 m ³、約4 m ³、約5 m ³、約6 m ³、約7 m ³、約8 m ³、約9 m ³、約10 m ³、約20 m ³、約30 m ³、約40 m ³、約50 m ³、約60 m ³、約70 m ³、約80 m ³、約90 m ³或約100 m ³之體積。在一些實施例中，反應器110可包括液位指示器。

在一些實施例中，pH探針121可安置於pH流通槽120中。在一些實施例中，可基於來自pH流通槽120中之pH探針121之讀數來確定或確認反應器110中之pH。pH流通槽120中之pH探針121在插入來自反應器110之流出物中時量測參考電極與氫離子選擇性電極之間的電位差。換言之，流出物中之氫離子活性影響參考電極與氫離子選擇性電極之間的電化學電位，且校準pH變送器（未示）以將電位差與pH相聯繫。在一些實施例中，設備100可包括pH變送器（未示）。在一些實施例中，pH變送器耦接至pH探針121且經組態以接收由pH探針121產生之信號。在一些實施例中，pH變送器將自pH探針121接收之信號轉換成pH量測值。在一些實施例中，pH變送器包含經組態以顯示pH量測值之使用者介面。在一些實施例中，pH變送器可為與pH流通槽120分開之組件。在一些實施例中，pH變送器可將pH讀數自pH探針121傳達至控制器。在一些實施例中，控制器將pH讀數自pH變送器發送至經組態以顯示pH讀數之使用者介面（未示）。基於pH變送器所傳達之pH，設備100可維持其當前操作或起始操作之改變（例如，自酸滴定劑供應130添加酸滴定劑）。在一些實施例中，可自動實施操作之改變。在一些實施例中，操作之改變可經由使用者輸入來實施。

在一些實施例中，安置於pH流通槽120中之pH探針121可量測下限pH值與上限pH值之間的pH。在一些實施例中，下限pH值可為約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9或約2.0，包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，上限pH值可為約8.5、約8.7、約8.8、約8.9、約9.0、約9.1、約9.2、約9.3、約9.4、約9.5、約9.6、約9.7、約9.8、約9.9、約10.0、約10.2、約10.5、約10.7、約11.0、約11.5、約12.0或約12.5，包括其間之所有值及範圍。

pH探針量測pH流量槽120中來自反應器110之樣品體積的pH。在一些實施例中，樣品體積可為至少約0.1 mL、至少約0.2 mL、至少約0.3 mL、至少約0.4 mL、至少約0.5 mL、至少約0.6 mL、至少約0.7 mL、至少約0.8 mL、至少約0.9 mL、至少約1 mL、至少約2 mL、至少約3 mL、至少約4 mL、至少約5 mL、至少約6 mL、至少約7 mL、至少約8 mL、至少約9 mL、至少約10 mL、至少約20 mL、至少約30 mL、至少約40 mL、至少約50 mL、至少約60 mL、至少約70 mL、至少約80 mL、至少約90 mL、至少約100 mL、至少約110 mL、至少約120 mL、至少約130 mL、至少約140 mL或至少約150 mL。在一些實施例中，樣品體積可為至多約150 mL、至多約140 mL、至多約130 mL、至多約120 mL、至多約110 mL、至多約100 mL、至多約90 mL、至多約80 mL、至多約70 mL、至多約60 mL、至多約50 mL、至多約40 mL、至多約30 mL、至多約20 mL、至多約10 mL、至多約9 mL、至多約8 mL、至多約7 mL、至多約6 mL、至多約5 mL、至多約4 mL、至多約3 mL、至多約2 mL、至多約1 mL、至多約0.9 mL、至多約0.8 mL、至多約0.7 mL、至多約0.6 mL、至多約0.5 mL、至多約0.4 mL、至多約0.3 mL或至多約0.2 mL。上述樣品體積之組合亦為可能的（例如至少約0.1 mL且至多約100 mL或至少約10 mL且至多約20 mL），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，樣品體積可為約0.1 mL、約0.2 mL、約0.3 mL、約0.4 mL、約0.5 mL、約0.6 mL、約0.7 mL、約0.8 mL、約0.9 mL、約1 mL、約2 mL、約3 mL、約4 mL、約5 mL、約6 mL、約7 mL、約8 mL、約9 mL、約10 mL、約20 mL、約30 mL、約40 mL、約50 mL、約60 mL、約70 mL、約80 mL、約90 mL或約100 mL。

在一些實施例中，樣品體積可為固定體積。在一些實施例中，樣品體積可為可變體積。在一些實施例中，樣品體積可基於多種因素變化，該等因素包括但不限於反應器110中流體之量、反應器110中蛋白質之類型及/或反應器110之尺寸。在一些實施例中，可自反應器110抽取樣品且以規定時間間隔量測。在一些實施例中，可自反應器110抽取樣品且以使用者指定之自發時間間隔量測。

在一些實施例中，一或多個控制器可基於pH流通槽120所量測之pH值觸發動作。舉例而言，若藉由pH流通槽120量測之pH大於所需pH值，則控制器可觸發酸滴定劑自酸滴定劑供應130遞送至反應器110。在一些實施例中，若藉由pH流通槽120量測之pH小於所需pH值，則控制器可觸發鹼滴定劑自鹼滴定劑供應140遞送至反應器110。在一些實施例中，控制器可將pH保持在所需值下所需時間段。在一些實施例中，動作可手動觸發（亦即，經由使用者干擾）。在一些實施例中，動作可自動（亦即，基於規定順序）觸發。在一些實施例中，規定順序可包括使反應器110中之pH降低至第一pH值，且接著使反應器中之pH增加至第二pH值。在一些實施例中，第一pH值可介於約3.0與約4.5之間、介於約3.5與約4.3之間、介於約3.5與約4.0之間、介於約3.1與約3.9之間、介於約3.2與約3.8之間、介於約3.3與約3.7之間、介於約3.4與約3.7之間、介於約3.3與約3.6之間、介於約3.4與約3.6之間、介於約3.4與約3.5之間或介於約3.5與約3.6之間。在一些實施例中，第二pH值可介於約7與約8.5之間、介於約7.1與約8.4之間、介於約7.2與約8.3之間、介於約7.3與約8.2之間、介於約7.4與約8.2之間、介於約7.4與約8.1之間、介於約7.4與約8.0之間、介於約7.5與約8.2之間、介於約7.5與約8.1之間、介於約7.5與約8.0之間、介於約7.6與約8.1之間、介於約7.6與約8.0之間、介於約7.6與約7.9之間、介於約7.7與約8.0之間、介於約7.7與約7.9之間或介於約7.7與約7.8之間。

在一些實施例中，可呈多個相遞送酸滴定劑以達到第一pH值。換言之，可添加具有顆粒性之酸滴定劑，使得可以精細方式監測反應器110之內含物的pH。在一些實施例中，可呈1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、約15、約20、約35、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95或約100個相，包括其間之所有值及範圍，遞送酸滴定劑以達到第一pH值。在一些實施例中，可呈1、2、3或4個相遞送酸滴定劑以達到第一pH值。此可解決檢查pH計之困難，因為滴定劑之少量添加可更加可預測地改變反應器110之內含物的pH。

在一些實施例中，可呈多個相遞送鹼滴定劑以達到第二pH值。換言之，可添加具有顆粒性之鹼滴定劑，使得可以精細方式監測反應器110之內含物的pH。在一些實施例中，可呈1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、約15、約20、約35、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95或約100個相，包括其間之所有值及範圍，遞送鹼滴定劑以達到第二pH值。在一些實施例中，可呈1、2、3或4個相遞送鹼滴定劑以達到第二pH值。

必要時，可自酸滴定劑供應130遞送酸滴定劑。在一些實施例中，酸滴定劑可經由泵（未示）遞送。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可包括容器。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可包括槽。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可具有至少約10 mL、至少約20 mL、至少約30 mL、至少約40 mL、至少約50 mL、至少約60 mL、至少約70 mL、至少約80 mL、至少約90 mL、至少約100 mL、至少約200 mL、至少約300 mL、至少約400 mL、至少約500 mL、至少約600 mL、至少約700 mL、至少約800 mL、至少約900 mL、至少約1 L、至少約2 L、至少約3 L、至少約4 L、至少約5 L、至少約6 L、至少約7 L、至少約8 L、至少約9 L、至少約10 L、至少約20 L、至少約30 L、至少約40 L、至少約50 L、至少約60 L、至少約70 L、至少約80 L、至少約90 L、至少約100 L、至少約200 L、至少約300 L、至少約400 L、至少約500 L、至少約600 L、至少約700 L、至少約800 L、至少約900 L、至少約1 m ³、至少約2 m ³、至少約3 m ³、至少約4 m ³、至少約5 m ³、至少約6 m ³、至少約7 m ³、至少約8 m ³或至少約9 m ³之體積。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可具有至多約10 m ³、至多約9 m ³、至多約8 m ³、至多約7 m ³、至多約6 m ³、至多約5 m ³、至多約4 m ³、至多約3 m ³、至多約2 m ³、至多約1 m ³、至多約900 L、至多約800 L、至多約700 L、至多約600 L、至多約500 L、至多約400 L、至多約300 L、至多約200 L、至多約100 L、至多約90 L、至多約80 L、至多約70 L、至多約60 L、至多約50 L、至多約40 L、至多約30 L、至多約20 L、至多約10 L、至多約9 L、至多約8 L、至多約7 L、至多約6 L、至多約5 L、至多約4 L、至多約3 L、至多約2 L、至多約1 L、至多約900 mL、至多約800 mL、至多約700 mL、至多約600 mL、至多約500 mL、至多約400 mL、至多約300 mL、至多約200 mL、至多約100 mL、至多約90 mL、至多約80 mL、至多約70 mL、至多約60 mL、至多約50 mL、至多約40 mL、至多約30 mL或至多約20 mL之體積。

酸滴定劑供應130之上述體積的組合亦為可能的（例如，至少約10 mL且至多約10 m ³或至少約1 L且至多約5 L），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可具有約10 mL、約20 mL、約30 mL、約40 mL、約50 mL、約60 mL、約70 mL、約80 mL、約90 mL、約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約20 L、約30 L、約40 L、約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約200 L、約300 L、約400 L、約500 L、約600 L、約700 L、約800 L、約900 L、約1 m ³、約2 m ³、約3 m ³、約4 m ³、約5 m ³、約6 m ³、約7 m ³、約8 m ³或約9 m ³或約10 m ³之體積。

在一些實施例中，酸滴定劑供應130可維持在至少約0.5、至少約1、至少約1.5、至少約2、至少約2.5、至少約3、至少約3.5、至少約4、至少約4.5、至少約5、至少約5.5、至少約6或至少約6.5之pH下。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可維持在至多約7、至多約6.5、至多約6、至多約5.5、至多約5、至多約4.5、至多約4、至多約3.5、至多約3、至多約2.5、至多約2、至多約1.5、至多約1或至多約0.5之pH下。酸滴定劑供應130中上述pH值之組合亦為可能的（例如，至少約0.5且至多約7或至少約2且至多約6），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，酸滴定劑供應130可維持在約0、約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5或約7之pH下。

必要時，可自鹼滴定劑供應140遞送鹼滴定劑。在一些實施例中，鹼滴定劑可經由泵（未示）遞送。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可包括容器。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可包括槽。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可具有至少約10 mL、至少約20 mL、至少約30 mL、至少約40 mL、至少約50 mL、至少約60 mL、至少約70 mL、至少約80 mL、至少約90 mL、至少約100 mL、至少約200 mL、至少約300 mL、至少約400 mL、至少約500 mL、至少約600 mL、至少約700 mL、至少約800 mL、至少約900 mL、至少約1 L、至少約2 L、至少約3 L、至少約4 L、至少約5 L、至少約6 L、至少約7 L、至少約8 L、至少約9 L、至少約10 L、至少約20 L、至少約30 L、至少約40 L、至少約50 L、至少約60 L、至少約70 L、至少約80 L、至少約90 L、至少約100 L、至少約200 L、至少約300 L、至少約400 L、至少約500 L、至少約600 L、至少約700 L、至少約800 L、至少約900 L、至少約1 m ³、至少約2 m ³、至少約3 m ³、至少約4 m ³、至少約5 m ³、至少約6 m ³、至少約7 m ³、至少約8 m ³或至少約9 m ³之體積。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可具有至多約10 m ³、至多約9 m ³、至多約8 m ³、至多約7 m ³、至多約6 m ³、至多約5 m ³、至多約4 m ³、至多約3 m ³、至多約2 m ³、至多約1 m ³、至多約900 L、至多約800 L、至多約700 L、至多約600 L、至多約500 L、至多約400 L、至多約300 L、至多約200 L、至多約100 L、至多約90 L、至多約80 L、至多約70 L、至多約60 L、至多約50 L、至多約40 L、至多約30 L、至多約20 L、至多約10 L、至多約9 L、至多約8 L、至多約7 L、至多約6 L、至多約5 L、至多約4 L、至多約3 L、至多約2 L、至多約1 L、至多約900 mL、至多約800 mL、至多約700 mL、至多約600 mL、至多約500 mL、至多約400 mL、至多約300 mL、至多約200 mL、至多約100 mL、至多約90 mL、至多約80 mL、至多約70 mL、至多約60 mL、至多約50 mL、至多約40 mL、至多約30 mL或至多約20 mL之體積。

鹼滴定劑供應140之上述體積之組合亦為可能的（例如，至少約10 mL且至多約10 m ³或至少約1 L且至多約5 L），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可具有約10 mL、約20 mL、約30 mL、約40 mL、約50 mL、約60 mL、約70 mL、約80 mL、約90 mL、約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約20 L、約30 L、約40 L、約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約200 L、約300 L、約400 L、約500 L、約600 L、約700 L、約800 L、約900 L、約1 m ³、約2 m ³、約3 m ³、約4 m ³、約5 m ³、約6 m ³、約7 m ³、約8 m ³或約9 m ³或約10 m ³之體積。

在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可維持在至少約7、至少約7.5、至少約8、至少約8.5、至少約9、至少約9.5、至少約10、至少約10.5、至少約11、至少約11.5、至少約12、至少約12.5、至少約13或至少約13.5之pH下。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可維持在至多約14、至多約13.5、至多約13、至多約12.5、至多約12、至多約11.5、至多約11、至多約10.5、至多約10、至多約9.5、至多約9、至多約8.5、至多約8或至多約7.5之pH下。鹼滴定劑供應140中上述pH值之組合亦為可能的（例如，至少約7.5且至多約14或至少約8且至多約10），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，鹼滴定劑供應140可維持在約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約10.5、約11、約11.5、約12、約12.5、約13、約13.5或約14之pH下。

廢棄物接收器150視情況存在且可接收來自在pH流通槽120中量測之樣品的流出物。在一些實施例中，廢棄物接收器150可包括可接收來自pH流通槽120之流出物的容器、槽、處理設施或任何其他適合之裝置。

圖20係根據一實施例之用於pH控制之設備200的示意圖。如所示，設備200包括反應器210、具有pH探針221之pH流通槽220、取樣泵222、止回閥224（亦稱為逆止閥）、酸滴定劑供應230、酸滴定劑泵232、酸滴定劑流量計234、鹼滴定劑供應240、鹼滴定劑泵242、鹼滴定劑流量計244、廢棄物接收器250、控制器260及使用者介面262。在一些實施例中，止回閥224允許僅在一個方向上流動，自反應器210流出，藉此防止反應器210被pH流通槽220中該體積之樣品污染。在一些實施例中，反應器210、pH流通槽220、酸滴定劑供應230、鹼滴定劑供應240及廢棄物接收器250可與反應器110、pH流通槽120、酸滴定劑供應130、鹼滴定劑供應140及廢棄物接收器150相同或實質上相似，如上文參考圖19所述。因此，本文中未更詳細地描述反應器210、pH流通槽220、酸滴定劑供應230、鹼滴定劑供應240及廢棄物接收器250之某些態樣。如所示，箭頭表示流體之流動。

如所示，物流可自反應器210流動至廢棄物接收器250。反應器210自酸滴定劑供應230及鹼滴定劑供應240接收物流。在一些實施例中，反應器210可包括安置於其中之混合器。在一些實施例中，設備200可包括一或多個在反應器210外部之混合器。

在一些實施例中，pH流通槽220可為Mettler Toledo pH流通槽。在一些實施例中，pH探針221可安置於pH流通槽220中。適合於本文所述之設備的示例性pH探針包括來自Mettler Toledo、Thermo Fisher Scientific或Cole-Parmer之直列式pH探針。在一些實施例中，pH探針221耦接至pH變送器。pH變送器可例如為Mettler Toledo M400 pH變送器。在一些實施例中，pH變送器可在視覺上在其上面顯示pH讀數。在一些實施例中，pH變送器將pH讀數傳送至控制器260。在一些實施例中，控制器260將pH讀數傳達至使用者介面262，該使用者介面顯示pH讀數。在一些實施例中，pH變送器可將pH讀數傳達至使用者介面262。流過流通槽220之流量可藉由取樣泵222控制。

取樣泵222泵送來自反應器210之一定體積的樣品流體（亦即滑流），使得該體積之樣品流體可進入pH流通槽220。在一些實施例中，取樣泵222可包括蠕動泵、隔膜泵、齒輪泵、多葉泵、活塞泵、離心泵或任何其他適合之泵或其組合。在一些實施例中，取樣泵222可包括Watson-Marlow 120泵。

止回閥224允許僅在一個方向上流動，自反應器210流出，藉此防止反應器210被流通槽220中該體積之樣品污染。如所示，閥224在取樣泵222上游。在一些實施例中，閥224可位於取樣泵222的下游。在一些實施例中，設備200可包括反應器210下游且流體耦接至反應器210之截流閥（未示）。在一些實施例中，截流閥可實體耦接至反應器。

酸滴定劑供應230含有酸滴定劑。可經由酸滴定劑泵232自酸滴定劑供應230抽取出酸滴定劑。酸滴定劑泵232自酸滴定劑供應230抽取流體且促進酸滴定劑流動至反應器210。在一些實施例中，酸滴定劑泵232可促成至少約1 mL/min、至少約2 mL/min、至少約3 mL/min、至少約4 mL/min、至少約5 mL/min、至少約6 mL/min、至少約7 mL/min、至少約8 mL/min、至少約9 mL/min、至少約10 mL/min、至少約20 mL/min、至少約30 mL/min、至少約40 mL/min、至少約50 mL/min、至少約60 mL/min、至少約70 mL/min、至少約80 mL/min、至少約90 mL/min、至少約100 mL/min、至少約200 mL/min、至少約300 mL/min、至少約400 mL/min、至少約500 mL/min、至少約600 mL/min、至少約700 mL/min、至少約800 mL/min、至少約900 mL/min、至少約1 L/min、至少約2 L/min、至少約5 L/min、至少約10 L/min、至少約20 L/min、至少約30 L/min、至少約40 L/min或至少約50 L/min之酸滴定劑流速。在一些實施例中，酸滴定劑泵232可促成至多約50 L/min、至多約40 L/min、至多約30 L/min、至多約20 L/min、至多約10 L/min、至多約5 L/min、至多約2 L/min、至多約1 L/min、至多約900 mL/min、至多約800 mL/min、至多約700 mL/min、至多約600 mL/min、至多約500 mL/min、至多約400 mL/min、至多約300 mL/min、至多約200 mL/min、至多約100 mL/min、至多約90 mL/min、至多約80 mL/min、至多約70 mL/min、至多約60 mL/min、至多約50 mL/min、至多約40 mL/min、至多約30 mL/min、至多約20 mL/min、至多約10 mL/min、至多約9 mL/min、至多約8 mL/min、至多約7 mL/min、至多約6 mL/min、至多約5 mL/min、至多約4 mL/min、至多約3 mL/min或至多約2 mL/min之酸滴定劑流速。

上述酸滴定劑流速之組合亦為可能的（例如，至少約1 mL/min且至多約1 L/min或至少約10 mL/min且至多約50 mL/min），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，酸滴定劑泵232可促成約1 mL/min、約2 mL/min、約3 mL/min、約4 mL/min、約5 mL/min、約6 mL/min、約7 mL/min、約8 mL/min、約9 mL/min、約10 mL/min、約20 mL/min、約30 mL/min、約40 mL/min、約50 mL/min、約60 mL/min、約70 mL/min、約80 mL/min、約90 mL/min、約100 mL/min、約200 mL/min、約300 mL/min、約400 mL/min、約500 mL/min、約600 mL/min、約700 mL/min、約800 mL/min、約900 mL/min或約1 L/min之酸滴定劑流速。

酸滴定劑之流速可藉由酸滴定劑流量計234量測。在一些實施例中，酸滴定劑流量計234可包括超音波計、旋渦混合器、磁力計、Coriolis計或任何其他適合之流量計或其組合。適合之酸滴定劑流量計可購得，例如酸滴定劑流量計234可包括Sonotec超音波流量計。

在一些實施例中，酸滴定劑泵232可包括蠕動泵、隔膜泵、齒輪泵、多葉泵、活塞泵、離心泵或任何其他適合之泵或其組合。適合之酸滴定劑泵（232）可購得，例如Watson-Marlow 530泵。

鹼滴定劑供應240含有鹼滴定劑。可經由鹼滴定劑泵242自鹼滴定劑供應240抽取出鹼滴定劑。鹼滴定劑泵242自鹼滴定劑供應240抽取流體且促進鹼滴定劑流動至反應器210。在一些實施例中，鹼滴定劑泵242可促成至少約1 mL/min、至少約2 mL/min、至少約3 mL/min、至少約4 mL/min、至少約5 mL/min、至少約6 mL/min、至少約7 mL/min、至少約8 mL/min、至少約9 mL/min、至少約10 mL/min、至少約20 mL/min、至少約30 mL/min、至少約40 mL/min、至少約50 mL/min、至少約60 mL/min、至少約70 mL/min、至少約80 mL/min、至少約90 mL/min、至少約100 mL/min、至少約200 mL/min、至少約300 mL/min、至少約400 mL/min、至少約500 mL/min、至少約600 mL/min、至少約700 mL/min、至少約800 mL/min、至少約900 mL/min、至少約1 L/min、至少約2 L/min、至少約5 L/min、至少約10 L/min、至少約20 L/min、至少約30 L/min、至少約40 L/min或至少約50 L/min之鹼滴定劑流速。在一些實施例中，鹼滴定劑泵242可促成至多約50 L/min、至多約40 L/min、至多約30 L/min、至多約20 L/min、至多約10 L/min、至多約5 L/min、至多約2 L/min、至多約1 L/min、至多約900 mL/min、至多約800 mL/min、至多約700 mL/min、至多約600 mL/min、至多約500 mL/min、至多約400 mL/min、至多約300 mL/min、至多約200 mL/min、至多約100 mL/min、至多約90 mL/min、至多約80 mL/min、至多約70 mL/min、至多約60 mL/min、至多約50 mL/min、至多約40 mL/min、至多約30 mL/min、至多約20 mL/min、至多約10 mL/min、至多約9 mL/min、至多約8 mL/min、至多約7 mL/min、至多約6 mL/min、至多約5 mL/min、至多約4 mL/min、至多約3 mL/min或至多約2 mL/min之酸滴定劑流速。

上述鹼滴定劑流速之組合亦為可能的（例如，至少約1 mL/min且至多約1 L/min或至少約10 mL/min且至多約50 mL/min），包括其間之所有值及範圍。在一些實施例中，鹼滴定劑泵242可促成約1 mL/min、約2 mL/min、約3 mL/min、約4 mL/min、約5 mL/min、約6 mL/min、約7 mL/min、約8 mL/min、約9 mL/min、約10 mL/min、約20 mL/min、約30 mL/min、約40 mL/min、約50 mL/min、約60 mL/min、約70 mL/min、約80 mL/min、約90 mL/min、約100 mL/min、約200 mL/min、約300 mL/min、約400 mL/min、約500 mL/min、約600 mL/min、約700 mL/min、約800 mL/min、約900 mL/min或約1 L/min之鹼滴定劑流速。

鹼滴定劑之流速可藉由鹼滴定劑流量計244量測。在一些實施例中，鹼滴定劑流量計244可包括超音波計、旋渦混合器、磁力計、Coriolis計或任何其他適合之流量計或其組合。適合之鹼滴定劑流量計可購得，例如鹼滴定劑流量計244可包括Sonotec超音波流量計。

在一些實施例中，鹼滴定劑泵242可包括蠕動泵、隔膜泵、齒輪泵、多葉泵、活塞泵、離心泵或任何其他適合之泵或其組合。適合之鹼滴定劑泵可購得，例如鹼滴定劑泵242可包括Watson-Marlow 530泵。

如所示，點線框包圍組件，使用者介面262可在該等組件上展現一定控制水準。換言之，使用者介面262可經由控制器260或多個控制器起作用以控制設備200之組件中之任一者。在一些實施例中，使用者介面262可與反應器210、pH流通槽220、取樣泵222、閥224、酸滴定劑供應230、酸滴定劑泵232、酸滴定劑流量計234、鹼滴定劑供應240、鹼滴定劑泵242、鹼滴定劑流量計244及/或廢棄物接收器250通信且可對其進行控制。在一些實施例中，對上述組件中之任一者的控制可由使用者起始。換言之，使用者可手動控制設備200之組件中之任一者以起始組件中之至少一者中的動作。在一些實施例中，設備200之組件中之任一者的控制可回應於設備200中之條件（例如，在pH流通槽220中量測之pH）而自動進行。在一些實施例中，對設備200之組件中之任一者的控制可在無任何使用者參與的情況下進行。在一些實施例中，使用者可經由使用者介面262將指令發送至控制器260以控制或推進預程式化之pH順序或添加預定量之酸滴定劑或鹼滴定劑。

在一些實施例中，控制器260可與酸滴定劑流量計234、鹼滴定劑流量計244、pH探針221、酸滴定劑泵232及/或鹼滴定劑泵242通信。在一些實施例中，控制器260可接收來自酸滴定劑流量計244之信號，藉此控制器260確定添加至樣品之酸滴定劑之量。在一些實施例中，控制器260可接收來自鹼滴定劑流量計244之信號，藉此控制器260確定添加至樣品之鹼滴定劑之量。在一些實施例中，控制器260可接收來自pH探針221之信號，藉此該信號將pH量測值傳送至控制器260，且控制器260將pH量測值與添加至樣品之酸滴定劑或鹼滴定劑之對應量相聯繫。在一些實施例中，控制器260可將信號發送至酸滴定劑泵232以開啟泵、停止泵或改變泵速度。在一些實施例中，控制器260可將信號發送至鹼滴定劑泵242以開啟泵、停止泵或改變泵速度。在一些實施例中，控制器260可將模型應用於pH量測值及添加至樣品之酸或鹼滴定劑之對應量。

在一些實施例中，使用者介面262可經由控制器260與反應器210及/或安置於其中之混合器通信。在一些實施例中，控制器260可與混合器通信以控制混合時序及混合速度。舉例而言，控制器260可將信號發送至混合器以在即將添加酸滴定劑及/或鹼滴定劑時及添加酸滴定劑及/或鹼滴定劑期間起始。在滴定劑添加期間混合可防止樣品中出現大量高滴定劑濃度，此可能會損壞樣品。在一些實施例中，混合時序可基於添加多少酸滴定劑及/或鹼滴定劑進行修改。在一些實施例中，控制器260可與閥224通信以停止或允許取樣流體流過其。在一些實施例中，控制器260可與取樣泵222通信以啟動取樣流體泵送穿過其或改變取樣流體穿過其之流動速率。在一些實施例中，至取樣泵222及閥224之次序可基於經由pH變送器及控制器260傳達至使用者介面262之資料。

控制器260經組態以接收來自本文所述之設備之組件的信號，且將指令發送至本文所述之設備之組件。在一些實施例中，控制器260可與酸滴定劑泵232通信以泵送酸滴定劑穿過其。舉例而言，控制器260發送開啟酸滴定劑泵232之信號，停止酸滴定劑泵，或改變酸滴定劑泵之速度。在一些實施例中，與酸滴定劑泵232之通信可基於經由pH變送器及/或酸滴定劑流量計234傳達至控制器260之資料。在一些實施例中，控制器260可與鹼滴定劑泵242通信以泵送鹼滴定劑穿過其。舉例而言，控制器260發送開啟鹼滴定劑泵242之信號，停止鹼滴定劑泵，或改變鹼滴定劑泵之速度。在一些實施例中，與鹼滴定劑泵242之通信可基於經由pH變送器及/或鹼滴定劑流量計244傳達至控制器260之資料。在一些實施例中，控制器260經組態以接收來自pH探針221之pH值（例如經由pH變送器），且控制器260在量測pH時將數學模型應用於pH值，應用於添加至樣品之酸或鹼滴定劑之對應量。在一些實施例中，控制器260經組態以將本文所述之模型應用於一或多個pH值及添加至樣品之滴定劑之對應量。在一些實施例中，控制器260經組態以自所量測之pH值、添加至樣品之滴定劑之量及模型確定待添加至樣品以達到目標pH之滴定劑的剩餘量。視情況，此等步驟可重複一或多次，直至達到最終目標pH。舉例而言，控制器260經組態以接收初始pH讀數，將信號發送至酸或鹼滴定劑泵242，藉此將預定量之酸或鹼滴定劑添加至樣品中，其後pH探針221獲取讀數且經由pH變送器將所量測之pH值發送至控制器260。接著控制器260將模型應用於初始pH值、添加滴定劑之後量測之pH值及添加至樣品之滴定劑之量，且確定添加至樣品之滴定劑之額外量。在一些實施例中，例如在存在預定之pH順序的情況下，控制器260可發送指令以自動推進pH順序。在其他實施例中，使用者經由使用者介面發指令給控制器260以推進pH順序，且控制器260例如藉由啟動酸滴定劑泵232或鹼滴定劑泵242、獲取pH讀數及其類似方面來將該等指令轉送至設備。

在一些實施例中，控制器260可包括伺服器、電腦、膝上型電腦、行動裝置、平板電腦、行動電話或任何其他適合裝置。控制器260可包括一或多個中央處理單元（「處理器」）、記憶體及輸入/輸出裝置。在某些實施例中，控制器260包括一或多個記憶體及/或儲存裝置。記憶體及儲存裝置可為一或多個電腦可讀儲存媒體，其可儲存實施本文所述之各種實施例之至少部分的電腦可執行指令。在一些實施例中，控制器260包括電腦可讀儲存媒體，其儲存電腦可執行指令，包括（但不限於）以下各者：啟動、停止酸滴定劑泵232或改變其速度之指令；啟動、停止鹼滴定劑泵242或改變其速度之指令；接收及儲存來自pH探針221及/或pH變送器之pH值的指令；及接收及儲存來自酸滴定劑流量計234及/或鹼滴定劑流量計244之資料的指令。在一些實施例中，電腦可執行指令包括接收及儲存使用者輸入之pH值的指令，例如當偵測到安置於pH流通槽220中之pH探針221中的誤差時由使用者量測及輸入之離線pH值。在一些實施例中，電腦可執行指令包括用以自來自酸滴定劑流量計234或鹼滴定劑流量計244及視情況酸滴定劑泵232或鹼滴定劑泵242之資料計算添加至樣品之酸或鹼滴定劑之量的指令。在一些實施例中，電腦可執行指令包括將本文所述之模型應用於pH值及添加至樣品之滴定劑之量的指令。在一些實施例中，電腦可執行指令包括視情況回應於經由使用者介面來自使用者之命令，執行pH順序之一或多個步驟的指令。在一些實施例中，控制器260包括經組態以執行上文所述之指令的處理器。

本揭示案提供使用者介面262，其經組態以接收來自控制器260之信號且將指令發送至控制器260。在一些實施例中，使用者介面262為工業用人機介面。適合之使用者介面包括視覺介面（電腦監視器、平面螢幕、觸控螢幕及其類似物）以及鍵盤、指標裝置（諸如滑鼠）及等效裝置。在一些實施例中，使用者介面262經組態以顯示來自控制器260之pH量測值。在一些實施例中，使用者介面262經組態以接收來自使用者之一或多個離線pH量測值。在一些實施例中，使用者介面262經組態以接收來自使用者之指令，藉此將指令發送至控制器260以推進pH順序。

本說明書闡述大量示例性組態、方法、參數及其類似者。然而，應認識到此類描述並不意欲限制本揭示案之範疇，而是被提供作為示例性實施例之描述。上文所描述之本發明主題之實施例單獨或與一或多個其他態樣或實施例組合可為有益的。在不限制前述描述之情況下，本發明之某些非限制性實施例提供於下文中。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案時將顯而易見，可使用經單獨編號之實施例中之各者或與之前或之後經單獨編號之實施例中之任一者組合使用。此意欲提供對實施例之所有此類組合的支援且不限於下文明確提供之實施例的組合。 列舉之實施例

可參看以下所列舉實施例理解本揭示案：

1. 一種方法，其包含： （ a ）量測樣品之初始pH（pH _初始）； （ b ）將至少第一量之滴定劑（滴定劑 _n）添加至該樣品且量測至少第一額外pH值（pH _n），滴定劑 _n為添加至該樣品以達到pH _n之滴定劑之量，其中pH _n不同於pH _初始； （ c ）應用模型來確定標準化之滴定劑初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑 _n，其中該模型將添加至該樣品之該標準化之滴定劑與該樣品之pH相聯繫；及 （ d ）確定待添加至該樣品以達到目標pH（pH _n+1）之滴定劑之另一額外量（滴定劑 _n+1），pH _n+1係藉由將該另一額外量之滴定劑添加至該樣品而達到的pH。

2. 實施例1之方法，其包含將第二量之滴定劑（滴定劑 _n+2）添加至該樣品且量測第二額外pH（pH _n+2），且重複步驟（c）及（d）。

3. 實施例2之方法，其包含將第三量之滴定劑（滴定劑 _n+3）添加至該樣品且量測第三額外pH（pH _n+3），且重複步驟（c）及（d）。

4. 實施例3之方法，其中將該第三量之滴定劑添加至該樣品中引起pH在最終目標pH（pH _最終）之0.05至0.10 pH單位內。

5. 實施例1至4中任一項之方法，其包含將第四量之滴定劑添加至該樣品且量測第四額外pH。

6. 實施例1至5中任一項之方法，其中該方法包含不超過3或4次添加滴定劑以將該樣品之該pH變為pH _最終。

7. 實施例1至6中任一項之方法，其包含： （i）自至少一個參考樣品生成至少一個參考滴定曲線，將添加至該參考樣品之滴定劑之量與該參考樣品之pH相聯繫； （ii）視情況將該至少一個參考滴定曲線標準化；及 （iii）生成該模型以擬合該至少一個參考滴定曲線。

8. 實施例7之方法，其中生成該至少一個參考滴定曲線包含： （i）量測該參考樣品之初始pH（pH _{初始 _ 參考}）； （ii）將一定量之滴定劑添加至該參考樣品（滴定劑 _{n_ 參考}）且量測額外參考pH值（pH _{n_ 參考}），滴定劑 _{n_ 參考}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 參考}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 參考}不同於pH _{初始 _ 參考}； （iii）重複步驟（i）-（ii）直至藉由將全部量之滴定劑添加至該參考樣品（滴定劑 _{總 _ 參考}），該至少一個參考樣品達到最終pH（pH _{最終 _ 參考}）；及 （iv）將所添加之滴定劑之量相對於該參考樣品之pH繪圖。

9. 實施例7或8之方法，其中在複數個時段期間在離散步驟中將滴定劑添加至該參考樣品。

10. 實施例7或8之方法，其中將滴定劑連續添加至該參考樣品中。

11. 實施例7至10中任一項之方法，其中該參考樣品之pH藉由直接插入該參考樣品中之pH探針量測。

12. 實施例7至10中任一項之方法，其中該參考樣品之pH藉由插入來自該參考樣品之連續或離散取樣之滑流中的pH探針量測。

13. 實施例7至12中任一項之方法，其中添加至該參考樣品之滴定劑之量藉由以下來標準化：

（等式17），其中滴定劑 _{1_ 參考}為添加至該參考樣品以達到pH _{1_ 參考}之滴定劑之量，且滴定劑 _{2_ 參考}為添加至該參考樣品以達到pH _{2_ 參考}之滴定劑之量。

14. 實施例7至13中任一項之方法，其中該至少一個參考滴定曲線包含單個滴定曲線，且其中pH _{1_ 參考}= pH _{初始 _ 參考}，且pH _{2_ 參考}= pH _{最終 _ 參考}。

15. 實施例7至13中任一項之方法，其中該至少一個參考滴定曲線包含複數個參考滴定曲線。

16. 實施例15之方法，其中各參考滴定曲線包含pH _{初始 _ 參考}及pH _{最終 _ 參考}，且其中： （ a ）pH _{1_ 參考}為來自該複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{初始 _ 參考}， （ b ）pH _{2_ 參考}為來自該複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{最終 _ 參考}，且 其中pH _{1_ 參考}及pH _{2_ 參考}經選擇以涵蓋值之最大差異，同時仍涵蓋由所有該複數個參考滴定曲線覆蓋的pH值。

17. 實施例13至16中任一項之方法，其中該樣品之該初始pH（pH _初始）與pH _{1_ 參考}大約相同。

18. 實施例13至16中任一項之方法，其中該樣品之該初始pH（pH _初始）與pH _{1_ 參考}不相同。

19. 實施例18之方法，其中pH _初始與pH _{1_ 參考}之間的差值為約0.05至1、約0.1至1、約0.1至0.5或約0.1至0.3 pH單位。

20. 實施例13至19中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）與pH _{2_ 參考}大約相同。

21. 實施例13至19中任一項之方法，其中pH _最終與pH _{2_ 參考}不相同。

22. 實施例21之方法，其中pH _最終與pH _{2_ 參考}之間的差值為約0.05至1、約0.1至1、約0.1至0.5或約0.1至0.3 pH單位。

23. 實施例13至22中任一項之方法，其中pH _初始、pH _{初始 _ 參考}及pH _{1_ 參考}大約相同，且其中pH _最終、pH _{最終 _ 參考}及pH _{2_ 參考}大約相同。

24. 實施例1至23中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）小於該樣品之該初始pH（pH _初始），且該滴定劑為酸。

25. 實施例24之方法，其中添加至該參考樣品之滴定劑之量經標準化為約-0.76至約1.49之尺度。

26. 實施例24或25之方法，其中pH _{1_ 參考}介於約4.0與4.3之間，且視情況其中pH _{1_ 參考}為約4.1，且pH _{2_ 參考}介於約3.4與3.9之間，且視情況其中pH _{2_ 參考}為約3.7。

27. 實施例24至26中任一項之方法，其中pH _初始介於約4.0至4.5之間、介於約4.1與4.5之間、介於約4.2與4.5之間、介於約4.3與4.5之間、介於約4.1與4.4之間或介於約4.2與4.4之間。

28. 實施例24至27中任一項之方法，其中pH _最終介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。

29. 實施例24至27中任一項之方法，其中pH _最終為約3.6。

30. 實施例24至29中任一項之方法，其中該模型包含多項式。

31. 實施例30之方法，其中該模型包含下式之四階多項式：

（等式18）。

32. 實施例30或31之方法，其中該多項式包含：

（等式19）。

33. 實施例1至23中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）大於該初始pH（pH _初始），且該滴定劑為鹼。

34. 實施例33之方法，其中添加至該參考樣品之滴定劑之量經標準化為約-0.06至約1.53之尺度。

35. 實施例33或34之方法，其中pH _{1_ 參考}介於約3.0與3.8之間或介於約之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7，且pH _{2_ 參考}介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5-8.0之間或介於約7.5與8.0之間。

36. 實施例33或34之方法，其中pH _{1_ 參考}為約3.7，且pH _{2_ 參考}為約7.6。

37. 實施例33至36中任一項之方法，其中pH _初始介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。

38. 實施例33至37中任一項之方法，其中pH _最終介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5-8.0之間或介於約7.5與8.0之間。

39. 實施例33至38中任一項之方法，其中該模型包含多項式。

40. 實施例39之方法，其中該模型包含下式之5階多項式：

（等式20）。

41. 實施例37或38之方法，其中該多項式包含： 標準化之滴定劑 _n= 12.256725 - 10.723277*pH _n+ 3.3662386*pH _n^2 - 0.4588175*pH _n^3 + 0.0255417*pH _n^4 - 0.0003153*pH _n^5 （等式21）。

42. 實施例1至41中任一項之方法，其進一步包含在測定該樣品或該至少一個參考樣品之pH值時針對pH計校準進行校正。

43. 實施例42之方法，其中針對pH計校準進行校正包含： （ a ）在滴定劑之該添加之前移除該樣品或該參考樣品之第一部分，且用獨立校準之pH計量測該第一部分之pH，藉此生成離線初始pH值（pH _{初始 _ 離線}）； （ b ）在該全部量之滴定劑之該添加之後移除該樣品或該參考樣品之第二部分且用獨立校準之pH計量測該第二部分之pH，藉此生成離線最終pH值（pH _{最終 _ 離線}）；及 （ c ）應用該離線pH值與所量測之pH值之間的關係來確定該參考樣品之校正pH。

44. 實施例43之方法，其中該參考樣品之經校正之pH藉由以下來確定：

（等式22）。

45. 實施例43之方法，其中該樣品之經校正之pH藉由以下來確定：

。（等式16）

46. 實施例1至45中任一項之方法，其中確定待添加至該樣品之滴定劑的剩餘量藉由以下在步驟（d）來確定：

（等式23）。

47. 實施例1至46中任一項之方法，其中該樣品之該pH使用插入自該樣品移除之子樣品或分開取樣之滑流中之pH探針來量測。

48. 實施例1至46中任一項之方法，其中該樣品之該pH使用直接插入該樣品或連續滑流中之pH探針來量測。

49. 實施例1至48中任一項之方法，其中該樣品包含第一所關注之蛋白質且該至少一個參考樣品包含第二所關注之蛋白質。

50. 實施例49之方法，其中該第一所關注之蛋白質與該第二所關注之蛋白質相同。

51. 實施例49之方法，其中該第一所關注之蛋白質與該第二所關注之蛋白質不相同，但針對該滴定劑至該樣品及該參考樣品之該添加類似地反應。

52. 實施例49至51中任一項之方法，其中該第一所關注之蛋白質及該第二所關注之蛋白質為糖基化蛋白質。

53. 實施例49至52中任一項之方法，其中該第一所關注之蛋白質及該第二所關注之蛋白質各自為抗體。

54. 實施例53之方法，其中該抗體係選自由以下組成之群：選自由以下組成之群：抗PD1抗體、抗PDL-1抗體、抗Dll4抗體、抗ANG2抗體、抗AngPtl3抗體、抗PDGFR抗體、抗Erb3抗體、抗PRLR抗體、抗TNF抗體、抗EGFR抗體、抗PCSK9抗體、抗GDF8抗體、抗GCGR抗體、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、抗IL4R抗體、抗IL6R抗體、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗RSV抗體、抗NGF抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗CD48抗體、抗CD3/抗CD20雙特異性抗體、抗CD3/抗MUC16雙特異性抗體及抗CD3/抗PSMA雙特異性抗體。

55. 實施例49至54中任一項之方法，其中該第一所關注之蛋白質及該第二所關注之蛋白質各自為受體Fc融合（TRAP）蛋白。

56. 實施例55之方法，其中該TRAP蛋白包含VEGF TRAP或IL-1 TRAP。

57. 實施例1至56中任一項之方法，其中與pH藉由將pH探針直接插入該樣品或自該樣品抽取之連續滑流中來量測的方法相比，該方法提高到達該樣品之最終pH的準確度。

58. 實施例1至57中任一項之方法，其中與pH藉由插入自該樣品抽取之連續滑流中的pH計量測之方法相比，該方法減少樣品廢棄物。

59. 實施例1至58中任一項之方法，其中所量測之樣品pH與該模型之間的差值鑑別用於量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。

60. 實施例59之方法，其包含： （ a ）重新校準該pH計； （ b ）將額外量之滴定劑添加至該樣品且量測額外pH； （ c ）應用該模型且將標準化之滴定劑及pH或標準化之pH與該模型進行比較；及 （ d ）當該pH或標準化之pH與該模型相對應時，將剩餘量之滴定劑添加至該樣品以達到pH _最終； 藉此防止由添加過多滴定劑至該樣品引起之對該所關注之蛋白質之損傷。

61. 一種使樣品中之病毒滅活之方法，其包含： （ a ）提供在4.0或更大之初始pH（pH _初始）下的樣品； （ b ）將第一量之酸滴定劑（滴定劑 _{n_ 酸}）添加至該樣品且量測第一額外酸pH值（pH _{n_ 酸}），滴定劑 _{n_ 酸}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 酸}之滴定劑之量，其中該pH _{n_ 酸}不同於該pH _初始； （ c ）應用模型以確定標準化之滴定劑初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑，其中該模型將標準化之添加至該樣品之滴定劑與該樣品之該pH相聯繫； （ d ）基於該標準化之滴定劑、pH及該模型，確定待添加至該樣品以達到目標酸pH（pH _{酸 _ 目標}）之滴定劑之量； （ e ）將該量之滴定劑添加至該樣品中以達到pH _{酸 _ 目標}； （ f ）重複步驟（d）及（e）直至達到最終酸pH（pH _{酸 _ 最終}）為止； （ g ）將該樣品保持在pH _{最終 _ 酸}下足以使該病毒滅活之時段； （ h ）將第一量之鹼性滴定劑（滴定劑 _{n_ 鹼}）添加至該樣品且量測第一額外鹼pH值（pH _{n_ 鹼}），滴定劑 _{n_ 鹼}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 鹼}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 鹼}不同於該pH _{酸 _ 最終}； （ i ）藉由應用第二模型將滴定劑 _{n_ 鹼}標準化； （ j ）基於標準化之滴定劑、pH及該模型，確定添加至該樣品以將該樣品之該pH變為目標鹼性pH（pH _{目標 _ 鹼}）之鹼性滴定劑之量； （ k ）將該量之鹼性滴定劑添加至該樣品中以達到pH _{目標 _ 鹼}；及 （ l ）重複步驟（j）及（k）直至達到最終鹼性pH（pH _{最終 _ 鹼}）為止。

62. 實施例61之方法，其包含重複步驟（b）及（c）至少一次以確認該樣品之行為與該模型相對應。

63. 實施例61或62之方法，其包含重複步驟（d）及（e）1、2或3次。

64. 實施例61至63中任一項之方法，其包含重複步驟（d）及（e）2或3次，且其中重複步驟（d）及（e）2或3次引起目標酸pH在pH _{酸 _ 最終}之0.05至0.10 pH單位內。

65. 實施例64之方法，其包含再一次重複步驟（d）及（e）以達到pH _{酸 _ 最終}。

66. 實施例61至65中任一項之方法，其包含重複步驟（h）及（i）至少一次，以確認該樣品之行為與該模型相對應。

67. 實施例61至66中任一項之方法，其包含重複步驟（j）及（k）1、2或3次。

68. 實施例61至66中任一項之方法，其包含重複步驟（j）及（k）2或3次，且其中重複步驟（j）及（k）2或3次引起pH在pH _{最終 _ 鹼}之0.05至0.10 pH單位內。

69. 實施例68之方法，其包含再一次重複步驟（j）及（k）以達到pH _{最終 _ 鹼}。

70. 實施例61至69中任一項之方法，其中pH _{酸 _ 最終}介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。

71. 實施例61至70中任一項之方法，其中pH _{最終 _ 鹼}介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5-8.0之間或介於約7.0與8.5之間。

72. 實施例61至71中任一項之方法，其中該第一模型包含多項式。

73. 實施例72之方法，其中該多項式包含：

（等式13）。

74. 實施例61至73中任一項之方法，其中該第二模型包含多項式。

75. 實施例74之方法，其中該多項式包含： 標準化之滴定劑 _n= 12.256725 - 10.723277*pH _n+ 3.3662386*pH _n ²- 0.4588175*pH _n ³+ 0.0255417*pH _n ⁴- 0.0003153*pH _n ⁵（等式21）。

76. 實施例61至75中任一項之方法，其進一步包含針對pH計校準進行校正。

77. 實施例61至76中任一項之方法，其中該樣品之該pH使用插入自該樣品移除之子樣品或分開取樣之滑流中之pH探針來量測。

78. 實施例61至77中任一項之方法，其中量測該樣品之該pH不包括直接插入該樣品中之pH探針。

79. 實施例61至78中任一項之方法，其中該樣品包含所關注之蛋白質。

80. 實施例79之方法，其中該所關注之蛋白質為治療性蛋白質。

81. 實施例79或80之方法，其中該所關注之蛋白質為抗體。

82. 實施例79或80之方法，該所關注之蛋白質為受體Fc融合（TRAP）蛋白。

83. 實施例61至82中任一項之方法，其中與pH藉由將pH計插入該樣品或自該樣品抽取之連續滑流中來量測的方法相比，該方法提高到達該樣品之最終pH的準確度。

84. 實施例61至83中任一項之方法，其中與pH藉由插入自該樣品抽取之連續滑流中的pH計量測之方法相比，該方法減少樣品廢棄物。

85. 實施例61至84中任一項之方法，其中所量測之樣品pH與該模型之間的差值鑑別用於量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。

86. 實施例85之方法，其包含： （ a ）重新校準該pH計； （ b ）將額外量之滴定劑添加至該樣品且量測額外pH； （ c ）應用該模型且將標準化之滴定劑及pH與該模型進行比較；及 （ d ）當該pH與該模型相對應時，將剩餘量之滴定劑添加至該樣品以達到pH _最終； 藉此防止由添加過多滴定劑至該樣品對該所關注之蛋白質造成損傷。

87. 一種設備，其經組態以執行實施例1至86中任一項之方法。

88. 實施例87之設備，其包含： 一反應器； 一pH流通槽，其包含一安置於其中之pH探針，該pH流通槽流體耦接至該反應器，該pH流通槽經組態以接收來自該反應器之取樣滑流且量測該滑流之pH； 一酸滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該酸滴定劑供應經組態以向該反應器提供酸滴定劑，以降低該反應器中之pH；及/或 一鹼滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該鹼滴定劑供應經組態以向該反應器提供鹼滴定劑，以增加該反應器中之pH。

89. 一種設備，其包含： 一反應器； 一pH流通槽，其包含一安置於其中之pH探針，該pH流通槽流體耦接至該反應器，該pH流通槽經組態以接收來自該反應器之取樣滑流且量測該滑流之pH； 一酸滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該酸滴定劑供應經組態以向該反應器提供酸滴定劑，以降低該反應器中之pH；及/或 一鹼滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該鹼滴定劑供應經組態以向該反應器提供鹼滴定劑，以增加該反應器中之pH。

90. 實施例88或89之設備，其進一步包含： 一取樣泵，其經組態以將該滑流自該反應器遞送至該pH流通槽。

91. 實施例88或89之設備，其進一步包含： 一廢棄物接收器，其經組態以接收來自該pH流通槽之流出物。

92. 實施例88或89之設備，其進一步包含： 一酸滴定劑泵，其經組態以自該酸滴定劑供應遞送該酸滴定劑至該反應器；及 一酸滴定劑流量計，其經組態以量測該酸滴定劑自該酸滴定劑供應至該反應器之流速。

93. 實施例92之設備，其進一步包含： 一鹼滴定劑泵，其經組態以自該鹼滴定劑供應遞送該鹼滴定劑至該反應器；及 一鹼滴定劑流量計，其經組態以量測該鹼滴定劑自該鹼滴定劑供應至該反應器之流速。

94. 實施例93之設備，其進一步包含一控制器，該控制器與該酸滴定劑流量計、該鹼滴定劑流量計、該pH探針、該酸滴定劑泵及該鹼滴定劑泵通信。

95. 實施例94之設備，其中該控制器經組態以： （a）接收來自該酸滴定劑流量計之一信號，藉此該控制器確定添加至該樣品之酸滴定劑之量； （b）接收來自該鹼滴定劑流量計之一信號，藉此該控制器確定添加至該樣品之鹼滴定劑之量； （c）接收來自該pH探針之一信號，藉此該信號傳達pH量測值至該控制器，且該控制器將該pH量測值與添加至該樣品之酸滴定劑或鹼滴定劑之對應量相聯繫； （d）發送一信號至該酸滴定劑泵以開啟該泵、停止該泵或改變泵速度；及 （e）發送一信號至該鹼滴定劑泵以開啟該泵、停止該泵或改變泵速度。

96. 實施例94或95之設備，其中該控制器與該取樣泵通信，其中該控制器經組態以發送一信號至該取樣泵以開啟該泵、停止該泵或改變泵速度。

97. 實施例94至96中任一項之設備，其中該控制器經組態以將模型應用於該pH量測值及添加至該樣品之酸或鹼滴定劑之對應量。

98. 實施例94至97中任一項之實施例之設備，其中該控制器經組態以當在該pH流通槽中量測之pH大於所需值時啟動該酸滴定劑泵且添加預定數量之酸滴定劑，且該控制器經進一步組態以當在該pH流通槽中量測之該pH小於該所需值時啟動該鹼滴定劑泵且添加預定數量之鹼滴定劑。

99. 實施例94至98中任一項之設備，其中該控制器經組態以當預定量之酸滴定劑已添加至該樣品時發送一信號至該酸滴定劑泵以停止該泵，且當預定量之鹼滴定劑已添加至該樣品時發送一信號至該鹼滴定劑泵以停止該泵。

100. 實施例94至99中任一項之設備，其中該控制器經組態以將該pH保持在所需值下一段時間。

101. 實施例100之設備，其中該所需值隨時間推移變化，與pH順序一致。

102. 實施例101之設備，其中該pH順序適合於使可能存在於該反應器中之病毒滅活。

103. 實施例102之設備，其中該pH順序包含 （a）將pH降低至介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間的第一目標pH， （b）將該pH值保持在該第一目標pH下一段時間， （c）將該pH升高至介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1、介於約5.5-8.0之間或介於約7.5與8.0之間的第二目標pH，及 （d）將該pH保持在該第二目標pH下。

104. 實施例103之設備，其中在步驟（a）降低該pH或在步驟（c）升高該pH包含添加足以改變該樣品之該pH的一或多種量之滴定劑且量測該樣品之該pH。

105. 實施例88至104中任一項之設備，其進一步包含： 一止回閥，其在該反應器與該pH流通槽之間流體耦接，該止回閥經組態以防止該反應器被來自該pH流通槽之回流污染。

106. 實施例88至105中任一項之設備，其中該反應器不包括安置於其中之一pH量測探針。

107. 實施例88至106中任一項之設備，其進一步包含安置於該反應器中之一混合器，其經組態以在即將添加該酸滴定劑及/或該鹼滴定劑時、添加該酸滴定劑及/或該鹼滴定劑期間及/或之後混合該反應器中之內含物。

108. 實施例107之設備，其中該控制器與該混合器通信，且其中該控制器經組態以在開啟該酸泵或該鹼泵之前發送一信號至該混合器，啟動該混合器。

109. 實施例108之設備，其中該控制器經組態以發送一信號至該混合器，藉此該混合器在停止該酸泵或鹼泵之後停止固定時段。

110. 實施例88至109中任一項之設備，其進一步包含使用者介面，該使用者介面經組態以接收且顯示來自該控制器之pH量測值。

111. 實施例110之設備，其中該使用者介面經組態以發送一信號至該控制器，藉此該控制器發信號給該酸滴定劑泵或鹼滴定劑泵，以向該樣品添加預定體積之酸或鹼滴定劑。

112. 實施例110或111之設備，其中該使用者介面經組態以發送一信號至該控制器，藉此該使用者可或發指令給該控制器在該pH順序中前進一步驟。

113. 實施例110至112中任一項之設備，其中該使用者介面經組態以接收來自該使用者之一或多個離線pH量測值，其中該一或多個離線pH量測值包含獨立於安置於該pH流通槽中之該pH探針的該樣品之pH量測值。

114. 實施例88至113中任一項之設備，其中遞送至該反應器之酸滴定劑或鹼滴定劑之體積具有10%或更低之誤差百分比。 實例 實例 1 ：降低蛋白質溶液之 pH 值之滴定的模型化

表現五種不同蛋白質之細胞在生物反應器中生長，且蛋白質分泌於細胞培養基中。在移除細胞及細胞碎片之初始收穫步驟之後，使用蛋白A層析系統捕捉蛋白質，洗滌且溶離。接著將含有部分純化之蛋白質的溶離液轉移至自動化系統以藉由將pH降低至3.6使病毒滅活。

為量測pH，校準Mettler Toledo InPro 3253 pH探針，接著在具有Kleenpak連接件之密封波紋管中經由高壓釜或γ照射滅菌以使得能夠與含有部分純化之蛋白質溶液之池容器無菌連接。將pH探針插入池容器中，且添加酸溶液直至獲得3.6之目標pH。將pH探針直接插入池容器中允許對滴定進行反饋控制以控制最終pH。在此實例中，連續給與滴定劑，且連續量測pH。

針對跨越5種不同蛋白質之11次病毒滅活操作，量測pH對比所添加之鹼的量，且繪製於圖1中。在圖1中，所添加之鹼的量係以任何滴定劑添加之前容器中每千克產物之泵旋轉數為單位來指示，且泵速度資料經時間遷移以考慮鹼添加與pH反應之間的延遲。如圖1中可見，所有滴定曲線之形狀在視覺上相似。滴定曲線基本上為線性，觀測到略微向下曲線。滴定曲線在X及Y截距方面亦不同。

將軸之線性變換應用於圖1中所示之滴定曲線。

使用以下等式將Y軸（pH）變換成1à0之尺度（初始pHà最終pH）：

（等式1）。 使用以下等式將X軸（所添加之酸）變換成0à1之尺度（初始à最終）：

（等式2）。 引起各曲線上之2個點收斂之兩條軸之線性變換應導致所有曲線收縮，如圖2中所示。圖2中所示之所得變換資料模型化產生二階多項式： 標準化之pH v1 = 1.0584433-1.0049047*標準化之滴定劑添加v1 - 0.214062*(標準化之滴定劑添加v1-0.56403)^2 （等式3）。 多項式擬合之概述展示於下表1中： 表1. 擬合之概述

R平方值	0.996943
R平方值調整	0.996936
均方根誤差	0.017471
反應平均值	0.470191
觀測（或權重和)	830

二次擬合之RMSE（均方根誤差）=0.0175標準化之pH單位，其以pH為單位大約為：

0.011 pH（等式4）。初始及最終pH值在各操作之間略微變化。 實例 2 ：升高蛋白質溶液之 pH 值之滴定的模型化

在病毒滅活之後，使用與實例1中所描述相同的方法，藉由添加鹼性溶液使溶液之pH升高至中性或接近中性之pH。

針對跨越7種不同蛋白質之12次病毒滅活操作，量測pH對比所添加之鹼的量，且繪製於圖4中。在圖4中，所添加之鹼的量係以任何滴定劑添加之前容器中每千克產物之泵旋轉數為單位來指示，且泵速度資料經時間遷移以考慮鹼添加與pH反應之間的延遲。如圖4中可見，曲線形狀相似，其中一致反曲點大約為pH 6。此反曲點在X軸上之位置為可變的。

將軸之線性變換應用於圖4中所示之滴定曲線。理論上，引起各曲線上之2個精選點收斂之線性變換應導致所有曲線收縮成單個曲線。初始方法係基於以上實例1中所述之酸滴定模型化。

在此第一方法中，使用以下等式將Y軸（pH）變換成0 à 1之尺度（初始pHà最終pH）：

（等式5）。

使用以下等式將X軸（所添加之鹼）變換成0à1之尺度（初始à最終）：

（等式6）。

此變換之結果展示於圖5中。如圖5中可見，此初始標準化方法未引起鹼滴定曲線在實例1中之酸滴定曲線之程度上收縮（比較圖5與圖2）。

對於此變化之一個解釋為，雖然酸滴定之目標pH跨越蛋白質係相同的（pH 3.6），但鹼滴定之目標pH在蛋白質之間不同，在7.7至8.0範圍內，視蛋白質而定。因此，在標準化下滴定曲線之最終資料點不應收斂。

因此，第二種標準化方法考慮到滴定端點不應收斂。在此第二方法中，Y軸在時間=0時設定為0，且接近但小於目標pH之pH 7.60設定為1。類似地，針對時間=0，X軸固定於0，且針對達到pH 7.60所需之滴定劑之量，固定於1。

在此第二種方法中，使用以下等式將Y軸（pH）變換成0 à 1+之尺度（初始àpH 7.60）：

（等式7）。

使用以下等式將X軸（所添加之鹼）變換成0 à 1+之尺度（初始àpH 7.60）：

（等式8）。

此第二次變換之結果展示於圖6中。如圖6中所示，在時間=0及pH=7.60之迫斂性實質上改良擬合。然而，兩個滴定曲線仍偏離其餘曲線。

此偏離可能由pH探針校準問題引起。舉例而言，在密封袋中使用高壓釜或γ照射對用於生成滴定曲線之pH探針進行滅菌。在校準後但在使用前進行滅菌，以便探針在校準與其進行第一次量測之時間之間乾燥一段時間。pH探針之問題可能導致此兩個滴定曲線偏離模型。所有pH滴定操作開始及結束時量測離線pH。亦即，在降低或升高pH之各次操作開始及結束時，自池移除少量蛋白質溶液，且用未進行滅菌之探針分開量測pH。如圖7所示，與模型偏離最大之兩次操作在初始線上及離線量測中亦顯示最大差異，表明該問題最有可能由用於生成此兩個滴定曲線之探針引起。

線上pH量測之問題可使用兩個離線量測（初始及最終）藉由線性變換來校正。此相當於事後2點pH標準化。第三種標準化方法考慮（1）滴定端點不應收斂，及（2）線上量測與離線量測之間的差異。使用以下等式計算經校正之線上pH：

（等式9）。 結果展示於圖8中。如圖8中所示，線上pH值之校正增加擬合。

使用第四種方法來進一步收緊擬合。因為不同操作具有略微不同之初始pH，所以迫使不同滴定曲線在2個中間點處收斂，而非如先前嘗試中之單一中間點（pH 7.60）。迫使在2個中間點處收斂：pH 3.70及7.60。不需要pH值變換（Y軸），因為迫使在2個固定pH值下收斂。使用以下計算，將所添加之鹼之量（X軸）變換成約0 à 1+之尺度（pH 3.70 à pH 7.60）：

（等式10）。

結果展示於圖10中。此經校正、經變換之資料集用於生成用於添加鹼之模型（線，圖10）。由於與酸添加滴定曲線相比，鹼添加滴定曲線之曲線形狀更複雜，所以擬合需要6+階多項式： pH (線上，校正) = 2.5460075+5.5157799*滴定劑-0.1694419*(滴定劑-0.63949)^2-11.009696*(滴定劑-0.63949)^3+2.1806629*(滴定劑-0.63949)^4+13.771715*(滴定劑-0.63949)^5-7.7443576*(滴定劑-0.63949)^6 （等式11）。 （滴定劑值為來自等式10之標準化值）。

鹼調整模型RMSE=0.080 pH單位。擬合之概述展示於下表2中。

表2. 擬合之概述

R平方值	0.997091
R平方值調整	0.997069
均方根誤差	0.079609
反應平均值	6.035137
觀測（或權重和)	773

總體而言，實例1及2中所描述之方法使得能夠藉由非連續滑流量測方法進行準確的自動pH調整。在調整pH值時可取少量樣品，且pH模型用於以高度準確性確定應添加多少額外酸或鹼來達到目標pH，且無需連續取樣或量測。可利用少至一個實驗資料集來開發用於模型化之滴定曲線。此方法亦使得能夠滴定至訓練資料集內之任何pH值。最後，可藉由添加額外中間取樣點來提高pH控制準確度。 實例 3 ：用於 pH 調整及控制之系統的開發

開發一種系統以在病毒滅活期間量測pH，其使用插入不連續滑流中之pH探針及將pH與添加至樣品之滴定劑相聯繫的無因次模型。用於此系統之部件之示例性清單展示於圖11中。系統之圖式展示於圖19-20中。

在該系統之此實例中，酸及鹼滴定劑添加至含有樣品之反應容器各由連接至SonotecCO. 55超音波流量計之各別Watson Marlow 530泵控制。泵自連接至滴定劑袋之管接收滴定劑，接著經由流量計將滴定劑傳送至反應容器。來自反應容器之取樣管線經由止回閥連接至取樣泵，該止回閥可用於在取樣總成錯誤安裝之情況下防止反應容器被污染。取樣泵將樣品自反應容器傳送至其中插有pH探針之pH流通槽。pH探針連接至pH變送器。樣品自流通槽傳送至廢棄物接收器。所有泵均連接至控制器，使得控制器之程式化控制邏輯可控制酸及鹼滴定劑之體積及流速以及是否自反應容器抽取樣品及抽取多少樣品用於分析。

此系統之優點包括以下。當探針插入反應容器中時，探針在滅菌之後（且在插入之前）無法校準。滅菌可影響探針校準曲線。在此系統中，探針插入單獨流通槽中，且不需要滅菌。不需要高壓釜或Kleenpak無菌連接孔口，且消除反應容器中之探針斷裂或使探針溶液滲漏至蛋白質產物中的風險。取樣泵及止回閥產生離散樣品供pH量測，從而減少產品廢棄物。系統亦可經由取樣管線連接至任何反應容器，且因此為高度可撓性的。

酸調整工作流程之實例展示於圖12中。在包括探針校準及使流量計自動歸零之裝備設定之後，在酸滴定劑之任何添加之前自動進行初始pH量測，且將第一量之酸滴定劑添加至樣品。添加體積使用來自流量計之反饋來控制。酸之此初始量通常為保守的，以確保目標pH不被超過。以恆定速率（反應容器中每千克蛋白質池的酸毫升數）添加酸，允許計算總初始添加體積。接著在已添加此初始添加中的全部體積之滴定劑之後自動量測pH，且將初始及所量測之pH值及經添加以得到第二pH值之酸的量饋入模型中以確定對應的無因次滴定劑添加值。選擇介於最終目標pH與第一次添加滴定劑之後的pH之間的中間目標pH，且使用模型計算對應的無因次滴定劑添加值。根據下式計算需要添加至樣品以達到此中間pH之無因次滴定劑之量：

（等式15）。

在此式中，標準化之滴定劑 _總為在標準化後添加至樣品以實現中間目標pH之總量，標準化之滴定劑 _初始為在標準化後添加至樣品中以達到初始pH之滴定劑之量（此值在標準化前可為0），且標準化之滴定劑 _n為添加至樣品以達到第一中間pH之滴定劑之量，使用模型標準化。應注意，模型亦用於計算標準化之滴定劑 _初始。利用兩個標準化之滴定劑以及添加之實際（因次）量之滴定劑，可在標準化之滴定劑與未標準化之滴定劑之間進行轉換。添加第二體積之酸，重複此等步驟以驗證模型及pH計之準確性，且接著添加最終體積之酸以達到目標pH。在保持低pH以使病毒滅活之後，使用一系列類似步驟將pH調回中性。

用於升高pH之類似工作流程展示於圖13中。在使流量計自動歸零之後，將第一量之鹼滴定劑添加至樣品中，量測pH，且使用將所添加之鹼之mL/kg聯繫至目標中性pH的線性函數計算第一體積。將初始pH、所量測之pH及鹼滴定劑之體積與模型擬合。添加第二體積之鹼，重複此等步驟以驗證模型及pH計之準確性，且接著添加最終體積之鹼以達到目標pH。

在此等製程中，在各次量測之後，將滑流pH值與期望值進行比較。若所量測之pH超出預期範圍，則提示使用者獲取樣品，在獨立校準之pH計上量測離線pH，且將離線值輸入至模型中。若兩個量測值相差＞0.10 pH單位，則使用者應利用離線pH量測完成製程，且使用保守體積及額外量測步驟完成製程。在酸調整步驟期間保守添加彌補先期自線上pH探針進行自動取樣之pH量測的潛在不準確性。

雖然該製程仍為自動化，但代替在每次添加滴定劑後自動取樣pH，使用者介面提示使用者取樣，例如使用獨立pH探針量測pH離線，且將離線值輸入使用者介面。換言之，若在調整步驟中間（例如在已進行第一次酸添加之後的酸調整期間）確定pH流通槽中之線上探針誤校準，則使用保守添加及離線pH量測進行該調整步驟之剩餘部分（例如酸調整）。在此情境下，鹼調整亦使用無因次滴定模型進行，但使用者應繼續使用獨立pH探針及輸入使用者介面中之離線pH值，而非量測流通槽中之pH值。將模型應用於離線pH值以結束pH順序。

若差值≤0.10 pH單位，則製程可使用滑流pH量測方法繼續。製程步驟、體積計算方法及可接受之線上pH的概述展示於下表3中： 表3. 線上pH之接受準則

製程步驟	添加體積計算方法	可接受之線上pH
蛋白質池pH量測	N/A	4.00-4.50
添加#1	保守添加 酸-恆定mL酸/kg捕捉池 鹼-mL/kg目標中性pH之線性函數	由統計VI模型預測之可能範圍內的∆pH
添加#2	無因次滴定模型 目標：最終pH之一半	與目標相差≤ 0.10 pH單位
添加#3	無因次滴定模型 目標：最終pH	與目標相差≤ 0.10 pH單位

表3適用於具有3個添加步驟之pH順序。舉例而言，若使用四次（或更多次）添加，則相對於最終pH，每次添加之目標pH應相應地調整。 實例 4 ：用於線上製程中之 pH 計之校準

需要用當前系統解決之一個問題為pH探針校準及如何在pH變送器外部進行校準。工業pH變送器（例如Mettler Toledo M400）通常限於2點校準製程。然而，跨pH 2至10以確保準確性之4點校準為合乎需要的，且標準程序使用離線探針。

因此，開發用於線上探針之4點校準製程，接受與離線探針所接受之校準程序同等的校準程序。

開發一種校準程序，其在系統之控制邏輯內進行（例如經由MATLAB）而非使用變送器校準函數。在此校準程序中，替代所計算之pH信號，變送器將原始探針mV及探針溫度信號發送至控制器。控制邏輯引導使用者完成校準步驟且記錄各緩衝標準之mV及溫度。使用以下校準接受準則： 斜率：95 - 105% 偏移：± (0 - 15 mV) 溫度：所有標準物均為20-25℃ 線性測試：校準之後所有標準物在0.05 pH單位內

在校準期間，亦在控制邏輯內計算溫度補償以考慮緩衝液標準物之pH之溫度依賴性。亦在滴定製程期間之製程內量測期間計算溫度補償。

圖14中展示示例性線上探針校準曲線。 實例 5 ：在無 pH 標準化下用於 pH 調整之額外模型

開發將滴定劑與pH相聯繫之另一模型，其並未針對酸或鹼添加使用pH標準化。

在此方法中，對於酸添加，自實例1中所述之歷史滴定曲線選擇兩個pH值，其與滴定曲線之終點偏移。選擇此等pH參考pH值（pH ₁及pH ₂），以使得其儘可能相隔得遠，同時仍為包括在每個參考滴定曲線上之pH值。接著藉由以下等式計算標準化滴定劑： 標準化之滴定劑 = (所添加之滴定劑 - 在參考pH ₁下添加之滴定劑) / (在參考 pH ₂下添加之滴定劑- 在參考pH ₁下添加之滴定劑) （等式12）。 對於酸滴定劑模型，參考pH ₁為4.1且參考pH ₂為3.7。對於鹼滴定劑模型，參考pH ₁為3.7且參考pH ₂為7.6。

此標準化滴定劑在低於0至高於1之範圍內。用於生成酸調整模型之資料集的範圍為-0.76至1.49，其產生將酸滴定劑標準化之尺度。用於生成鹼調整模型之資料集的範圍為-0.06至1.53，其產生將鹼滴定劑標準化之尺度。所用範圍視資料集中初始及最終pH值之變化性而定。選擇用於標準化之兩個參考pH值儘可能相隔得遠，同時保持在參考滴定曲線集合之界限內。此方法之一個優點為樣品之最終pH可沿著由參考樣品生成之滴定曲線在任何位置，只要其含在參考滴定曲線內即可。舉例而言，用於酸調整之最終pH可大於或等於參考物之最終pH。類似地，用於鹼調整之最終pH可小於或等於參考物之最終pH。

使用此標準化策略產生以下4階多項式，用於在酸添加期間將酸滴定劑標準化： 標準化之酸滴定劑添加 = 283.35764 - 279.43987*pH + 104.25395*pH^2 - 17.257125*pH^3 + 1.0589067*pH^4 （等式13）。

使用類似模型5階多項式用於在鹼添加期間將鹼滴定劑標準化： 標準化之鹼滴定劑添加 = 12.256725 - 10.723277*pH + 3.3662386*pH^2 - 0.4588175*pH^3 + 0.0255417*pH^4 - 0.0003153*pH^5 （等式14）。

在小規模蛋白質池上使用實例3中所描述之設備及此處所描述之模型以測試效能。測試滑流pH量測及超音波流量計準確性。來自五次測試操作之結果展示於圖15中。對於五次測試操作中之各者，按製程步驟之ΔpH及給與誤差（%）繪製於圖16中。

如圖15中所示，對於所有添加步驟，在線上探針與離線探針之間觀測到的pH差值為0.05或更小。除了第一次測試操作之最終鹼添加以外，給與誤差一般小於5%。圖16展示來自圖15之資料，其中線上pH與離線pH之間的差值在頂部且給與誤差在底部，跨越病毒滅活pH順序繪製。給與誤差為在各步驟添加之滴定劑之體積的誤差，報導為目標體積與實際體積之間的差值%。

亦在測試操作中分析流通槽對pH探針效能之影響，其比較此方法中所用之線上探針、離線探針及在流通槽外部進行量測之線上探針。在此情況下，存在四個酸添加步驟，因為在第三酸添加步驟之後離線pH不在範圍內。

對於三種探針條件中之各者，將pH相對於滴定劑添加步驟繪製於圖17中。在各滑流pH量測之後，在測試操作期間，自流通槽移出探針且直接插入樣品中以評估流通槽對量測之影響。如圖17中所示，藉由流通槽中之線上探針、藉由流通槽外部之線上探針及藉由離線探針進行之pH量測展示良好對應。

使用55.1 kg蛋白質池之測試操作中之一者的即時目測展示於圖18中。 實例 6 ：使用自動滴定系統及模型添加 3 或 4 次之 pH 調整

實例3中所述之自動滴定系統用於對18批次蛋白質進行低pH病毒滅活，該等批次蛋白質代表7種不同蛋白質產物。使用未使用pH標準化之實例5中所述之模型將在pH調整過程期間滴定劑之量與pH相聯繫。在18批次蛋白質之病毒滅活中，目標為當降低pH以使潛在病毒滅活及在病毒滅活之後將pH升回至中性時達成與最終目標pH相差小於0.10 pH單位之pH。

當每個調整步驟添加3或4次酸或鹼時，根據用於酸及鹼調整步驟之離線參考探針，所有18批次蛋白質均滿足與目標pH相差＜0.10 pH單位。結果展示於圖21中，其繪製在酸（左）或鹼（右）調整之後由離線參考探針量測之pH與目標pH之間的差值。酸或鹼分別以3次添加（圓形）或4次添加（十字形）進行添加。用於病毒滅活之目標酸pH介於3.50與3.60之間。病毒滅活後之目標中和pH介於5.50與8.00之間，視蛋白質而定。

當每個調整步驟使用3次添加時，在添加酸或鹼之後，所有蛋白質批次均在目標pH之＜0.10 pH單位內（圖21）。然而，當在低pH病毒滅活步驟之後將pH調至中性時，當每個調整步驟使用3次添加時，根據線上控制探針，在目標pH之小於0.05 pH單位內之最終pH的更嚴格目標始終未滿足（圖22，右側）。

實施4次添加策略以改良方法之準確性。使用此修訂方法，第三次添加酸或鹼將pH調至目標pH之0.05至0.10 pH單位內。進行少量的第四次添加以準確達成目標pH。如圖21及22中可見，4次添加策略提高方法之準確性，使得對於酸及鹼調整步驟兩者一致地達成在目標pH之0.05 pH單位內之最終pH。如圖22中可見，使用4次添加步驟策略調整pH之所有13批次符合根據線上探針之與目標相差小於0.05 pH單位之目標。

自動化系統亦能夠在整個病毒滅活過程中準確量測蛋白質樣品之pH。當在各添加步驟確定由離線參考探針量測之pH與由線上控制探針量測之pH之間的差值時，發現151個離散pH量測中之147個在離線參考探針與插入於流通槽中之線上控制探針之間的0.05 pH單位差值內（圖23）。因此，該模型能夠準確地確定在各步驟添加之酸或鹼的量，且對於任何給定添加步驟，系統可添加需要量之酸或鹼以在酸或鹼滴定製程期間一致地產生在目標pH之0.05 pH單位內的pH變化。

另外，自動化系統能夠準確地添加由模型確定之酸或鹼滴定劑的體積。如圖24中所示，133次添加中之133次添加之滴定劑體積具有小於10%誤差。

100:設備 110:反應器 120:pH流通槽 121:pH探針 130:酸滴定劑供應 140:鹼滴定劑供應 150:廢棄物接收器 200:設備 210:反應器 220:pH流通槽 221:pH探針 222:取樣泵 224:閥 230:酸滴定劑供應 232:酸滴定劑泵 234:酸滴定劑流量計 240:鹼滴定劑供應 242:鹼滴定劑泵 244:鹼滴定劑流量計 250:廢棄物接收器 260:控制器 262:使用者介面

圖1為顯示使用5種不同蛋白質生成之11條滴定曲線的圖。pH經由添加酸溶液來降低以達到3.6之目標pH。pH在Y軸中展示，而X軸指示以每公斤溶離劑之泵旋轉數為單位的所添加之酸滴定劑之量（rot/kg）。向泵速度資料施加時間遷移以考慮在酸添加與pH反應之間的延遲。

圖2係顯示使用等式1（Y軸）及等式2（X軸）對X軸及Y軸進行線性變換後圖1滴定曲線之圖。

圖3係顯示本揭示案一實施例中pH建模之應用的圖。

圖4為顯示使用7種不同蛋白質生成之12條滴定曲線的圖。pH經由添加鹼溶液來提高以達到7.5與8.0之間的目標pH，視蛋白質而定。pH在Y軸中展示，而X軸指示以每公斤溶離劑之泵旋轉數為單位的所添加之酸滴定劑之量（rot/kg）。向泵速度資料施加時間遷移以考慮在酸添加與pH反應之間的延遲。

圖5係顯示使用等式5（Y軸）及等式6（X軸）對X軸及Y軸進行線性變換後圖4滴定曲線之圖。

圖6係顯示使用等式7（Y軸）及等式8（X軸）對X軸及Y軸進行線性變換後圖4滴定曲線之圖。

圖7係顯示藉由用於收集各滴定曲線之資料之pH探針的初始線上量測與離線量測之間的差值進行顏色編碼的圖6標準化滴定曲線的圖。與模型（黑線）偏差最大之曲線，在初始線上量測與離線量測上亦具有最大差異。

圖8係顯示使用等式9校正線上pH之後圖6標準化滴定曲線的圖。

圖9係顯示經過2個固定pH值（pH 3.70及pH 7.60）之強制收斂且使用等式10對X軸進行線性變換後圖4滴定曲線的圖。使用等式9校正線上pH值（Y軸）。

圖10係顯示經過2個固定pH值（pH 3.70及pH 7.60）之強制收斂且使用等式10對X軸進行線性變換後圖4滴定曲線的圖。使用等式9校正線上pH值（Y軸）。適合資料之六次多項式展示為實線。

圖11為在改變樣品pH的同時控制pH之示例性系統的部件清單。

圖12係顯示用於降低病毒滅活之蛋白質樣品之pH的示例性控制策略之流程圖。VI：病毒滅活。

圖13係顯示用於提高病毒滅活之後蛋白質樣品之pH的示例性對照策略之流程圖。VIP：病毒滅活池（添加鹼之後的樣品）。

圖14顯示用於本揭示案之示例性方法中之pH計的示例性校準曲線。

圖15係顯示使用本揭示案之一實施例之設備及方法，降低及提高pH之五個測試操作之結果的表。

圖16係顯示滑流與離線pH之差異（ΔpH）（頂圖）及給料誤差給藥（底圖）的一對圖。用於計算ΔpH及給料誤差%之式展示於圖15中。

圖17係使用本揭示案之一實施例之設備及方法在病毒滅活測試操作中比較pH探針條件的圖。

圖18顯示樣品病毒滅活過程之即時過程監測。

圖19係根據一實施例之用於pH控制之設備的方塊圖。

圖20係根據一實施例之用於pH控制之設備的示意圖。

圖21係顯示使用酸或鹼3（圓形）次或4（十字形）次添加進行pH調整之後18批次蛋白質之實際pH（由離線參考探針量測）與目標pH之間的差值的圖。在左側x軸上，顯示在為使病毒滅活將pH降低至3.50與3.60（視蛋白質而定）之間的pH之後量測之pH與目標pH之間的差值。在右側x軸上，顯示在將pH提高至5.50與8.00之間（視蛋白質而定）後實際pH與目標pH之間的差值。短劃線指示在添加之後最終pH之目標，其在目標pH之0.10 pH單位內。

圖22係顯示使用酸或鹼3（圓形）次或4（十字形）次添加進行pH調整之後18批次蛋白質之由線上控制探針量測之pH與目標pH之間的差值的圖。在左側x軸上，顯示在為使病毒滅活將pH降低至3.6之pH之後量測之pH與目標pH之間的差值。在右側x軸上，顯示在將pH提高至pH 7.7至8.0（視蛋白質而定）後實際pH與目標pH之間的差值。短劃線指示在添加之後最終pH之目標，其在目標pH之0.05 pH單位內。

圖23係顯示針對18批次蛋白質在各添加步驟處藉由離線參考探針量測之pH與安裝於流通槽中之線上控制探針量測之pH的差異（ΔpH）的圖。

圖24係顯示針對18批次蛋白質（總共添加133次），各添加步驟之額外體積誤差百分比（有時稱為給料誤差）的圖。用於額外體積誤差百分比之式展示於圖15中。

無

Claims (55)

1. 一種方法，其包含： a.量測樣品之初始pH（pH _初始）； b.將至少第一量之滴定劑（滴定劑 _n）添加至該樣品且量測至少第一額外pH值（pH _n），滴定劑 _n為添加至該樣品以達到pH _n之滴定劑之量，其中pH _n不同於pH _初始； c.應用模型來確定標準化之滴定劑初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑 _n，其中該模型將添加至該樣品之該標準化之滴定劑聯繫至該樣品之pH；及 d.確定待添加至該樣品以達到目標pH（pH _n+1）之滴定劑之另一額外量（滴定劑 _n+1），pH _n+1係藉由將全部量之滴定劑添加至該樣品而達到的pH。
2. 如請求項1之方法，其包含將第二量之滴定劑（滴定劑 _n+2）添加至該樣品且量測第二額外pH（pH _n+2），且重複步驟（c）及（d）。
3. 如請求項2之方法，其包含將第三量之滴定劑添加至該樣品且量測第三額外pH，且重複步驟（c）及（d）。
4. 如請求項3之方法，其中將該第三量之滴定劑添加至該樣品中導致pH在最終目標pH（pH _最終）之0.05至0.10 pH單位內。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其包含將第四量之滴定劑添加至該樣品。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該方法包含不超過3或4次添加滴定劑以將該樣品之該pH變為pH _最終。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其包含： （i）自至少一個參考樣品生成至少一個參考滴定曲線，以將添加至該參考樣品之滴定劑之量聯繫至該參考樣品之pH； （ii）視情況將該至少一個參考滴定曲線標準化；及 （iii）生成該模型以擬合該至少一個參考滴定曲線。
8. 如請求項7之方法，其中生成該至少一個參考滴定曲線包含： （i）量測該參考樣品之初始pH（pH _{初始 _ 參考}）； （ii）將一定量之滴定劑添加至該參考樣品（滴定劑 _{n_ 參考}）且量測額外參考pH值（pH _{n_ 參考}），滴定劑 _{n_ 參考}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 參考}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 參考}不同於pH _{初始 _ 參考}； （iii）重複步驟（i）-（ii）直至藉由將全部量之滴定劑添加至該參考樣品（滴定劑 _{總 _ 參考}），使該至少一個參考樣品達到最終pH（pH _{最終 _ 參考}）；及 （iv）將所添加之滴定劑之量相對於該參考樣品之pH繪圖。
9. 如請求項7或8之方法，其中添加至該參考樣品之滴定劑之量藉由以下來標準化：

   

   ，其中滴定劑 _{1_ 參考}為添加至該參考樣品以達到pH _{1_ 參考}之滴定劑之量，且滴定劑 _{2_ 參考}為添加至該參考樣品以達到pH _{2_ 參考}之滴定劑之量。
10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中該至少一個參考滴定曲線包含單個滴定曲線，且其中pH _{1_ 參考}= pH _{初始 _ 參考}，且pH _{2_ 參考}= pH _{最終 _ 參考}。
11. 如請求項7至9中任一項之方法，其中該至少一個參考滴定曲線包含複數個參考滴定曲線，其中各參考滴定曲線包含pH _{初始 _ 參考}及pH _{最終 _ 參考}，且其中： a.pH _{1_ 參考}為來自該複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{初始 _ 參考}， b.pH _{2_ 參考}為來自該複數個參考滴定曲線中之一者的pH _{最終 _ 參考}，且 其中pH _{1_ 參考}及pH _{2_ 參考}經選擇以涵蓋值之最大差異，同時仍涵蓋由所有該複數個參考滴定曲線覆蓋的pH值。
12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該樣品之該初始pH（pH _初始）與pH _{1_ 參考}大約相同，或其中該樣品之該初始pH（pH _初始）與pH _{1_ 參考}不相同。
13. 如請求項9至12中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）與pH _{2_ 參考}大約相同，或其中pH _最終與pH _{2_ 參考}不相同。
14. 如請求項9至13中任一項之方法，其中pH _初始、pH _{初始 _ 參考}及pH _{1_ 參考}大約相同，且其中pH _最終、pH _{最終 _ 參考}及pH _{2_ 參考}大約相同。
15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）小於該樣品之該初始pH（pH _初始），且該滴定劑為酸。
16. 如請求項15之方法，其中pH _{1_ 參考}介於約4.0與4.3之間，且視情況其中pH _{1_ 參考}為約4.1，且pH _{2_ 參考}介於約3.4與3.9之間，且視情況其中pH _{2_ 參考}為約3.7。
17. 如請求項15或16之方法，其中pH _初始介於約4.0至4.5之間、介於約4.1與4.5之間、介於約4.2與4.5之間、介於約4.3與4.5之間、介於約4.1與4.4之間或介於約4.2與4.4之間。
18. 如請求項15至17中任一項之方法，其中pH _最終介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。
19. 如請求項15至18中任一項之方法，其中該模型包含四階多項式。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該樣品之該最終pH（pH _最終）大於該初始pH（pH _初始），且該滴定劑為鹼。
21. 如請求項20之方法，其中pH _{1_ 參考}介於約3.0與3.8之間或介於約之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7，且pH _{2_ 參考}介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5與8.0之間或介於約7.5與8.0之間。
22. 如請求項20或21之方法，其中pH _初始介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。
23. 如請求項20至22中任一項之方法，其中pH _最終介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5-8.0之間或介於約7.5與8.0之間。
24. 如請求項20至23中任一項之方法，其中該模型包含五階多項式。
25. 如請求項1至24中任一項之方法，其進一步包含在測定該樣品或該至少一個參考樣品之pH值時針對pH計校準進行校正。
26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該樣品包含第一所關注之蛋白質且該至少一個參考樣品包含第二所關注之蛋白質。
27. 如請求項26之方法，其中該第一所關注之蛋白質及該第二所關注之蛋白質為糖基化蛋白質。
28. 如請求項27之方法，其中該第一及第二所關注之蛋白質各自為抗體或受體Fc融合（TRAP）蛋白。
29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中與藉由將pH探針直接插入該樣品或自該樣品抽取之連續滑流中來量測pH的方法相比，該方法提高到達該樣品之最終pH的準確度。
30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中與藉由插入自該樣品抽取之連續滑流中的pH計量測pH之方法相比，該方法減少樣品廢棄物。
31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中所量測之樣品pH與該模型之間的差值鑑別出用以量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。
32. 一種滅活(inactivating)樣品中之病毒之方法，其包含： a.提供在4.0或更大之初始pH（pH _初始）下的樣品； b.將第一量之酸滴定劑（滴定劑 _{n_ 酸}）添加至該樣品且量測第一額外酸pH值（pH _{n_ 酸}），滴定劑 _{n_ 酸}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 酸}之滴定劑之量，其中該pH _{n_ 酸}不同於該pH _初始； c.應用模型以確定標準化之滴定劑初始量（滴定劑 _初始）及標準化之滴定劑，其中該模型將標準化之添加至該樣品之滴定劑聯繫至該樣品之該pH； d.基於該標準化之滴定劑、pH及該模型，確定待添加至該樣品以達到目標酸pH（pH _{酸 _ 目標}）之滴定劑之量； e.將該量之滴定劑添加至該樣品中以達到pH _{酸 _ 目標}； f.重複步驟（d）及（e）直至達到最終酸pH（pH _{酸 _ 最終}）為止； g.將該樣品保持在pH _{最終 _ 酸}下一時段，該時段足以滅活該病毒； h.將第一量之鹼性滴定劑（滴定劑 _{n_ 鹼}）添加至該樣品且量測第一額外鹼pH值（pH _{n_ 鹼}），滴定劑 _{n_ 鹼}為添加至該樣品以達到pH _{n_ 鹼}之滴定劑之量，其中pH _{n_ 鹼}不同於該pH _{酸 _ 最終}； i.藉由應用第二模型將滴定劑 _{n_ 鹼}標準化； j.基於標準化之滴定劑、pH及該模型，確定添加至該樣品以將該樣品之該pH變為目標鹼性pH（pH _{目標 _ 鹼}）之鹼性滴定劑之量； k.將該量之鹼性滴定劑添加至該樣品中以達到pH _{目標 _ 鹼}；及 l.重複步驟（j）及（k）直至達到最終鹼性pH（pH _{最終 _ 鹼}）為止。
33. 如請求項32之方法，其包含重複步驟（b）及（c）至少一次以確認該樣品之行為與該模型相對應。
34. 如請求項32之方法，其包含重複步驟（d）及（e）1、2或3次。
35. 如請求項32之方法，其包含重複步驟（d）及（e）2或3次，且其中重複步驟（b）及（c）2或3次導致pH在pH _{酸 _ 最終}之0.05至0.10 pH單位內。
36. 如請求項35之方法，其包含再一次重複步驟（d）及（e）以達到pH _{酸 _ 最終}。
37. 如請求項32至36中任一項之方法，其包含重複步驟（h）及（i）至少一次，以確認該樣品之行為與該模型相對應。
38. 如請求項32至36中任一項之方法，其包含重複步驟（j）及（k）1、2或3次。
39. 如請求項32至36中任一項之方法，其包含重複步驟（j）及（k）2或3次，且其中重複步驟（j）及（k）2或3次導致pH在pH _{最終 _ 鹼}之0.05至0.10 pH單位內。
40. 如請求項39之方法，其包含再一次重複步驟（j）及（k）以達到pH _{最終 _ 鹼}。
41. 如請求項32至40中任一項之方法，其中pH _{酸 _ 最終}介於約3.0與3.8之間、介於約3.1與3.8之間、介於約3.2與3.8之間、介於約3.3與3.7之間、介於約3.4與3.7之間或介於約3.5與3.7之間。
42. 如請求項32至41中任一項之方法，其中pH _{最終 _ 鹼}介於約5.3與8.5之間、介於約5.1與8.1之間、介於約5.5與8.0之間或介於約7.0與8.5之間。
43. 如請求項32至42中任一項之方法，其中該第一模型包含多項式。
44. 如請求項32至43中任一項之方法，其進一步包含針對pH計校準進行校正。
45. 如請求項32至44中任一項之方法，其中該樣品包含所關注之蛋白質。
46. 如請求項45之方法，其中該所關注之蛋白質為治療性蛋白質。 如請求項44或45之方法，其中該所關注之蛋白質為抗體或受體Fc融合（TRAP）蛋白。
47. 如請求項32至46中任一項之方法，其中與藉由將pH計插入該樣品或自該樣品抽取之連續滑流中來量測pH的方法相比，該方法提高到達該樣品之最終pH的準確度。
48. 如請求項32至47中任一項之方法，其中與藉由插入自該樣品抽取之連續滑流中的pH計量測pH之方法相比，該方法減少樣品廢棄物。
49. 如請求項32至48中任一項之方法，其中所量測之樣品pH與該模型之間的差值鑑別出用於量測樣品pH之pH計之校準中的誤差。
50. 一種設備，其經組態以執行如請求項1至49中任一項之方法。
51. 一種設備，其包含： 一反應器； 一pH流通槽，其包含一安置於其中之pH探針，該pH流通槽流體耦接至該反應器，該pH流通槽經組態以接收來自該反應器之取樣滑流且量測該滑流之pH； 一酸滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該酸滴定劑供應經組態以向該反應器提供酸滴定劑，以降低該反應器中之pH；及 一鹼滴定劑供應，其流體耦接至該反應器，該鹼滴定劑供應經組態以向該反應器提供鹼滴定劑，以增加該反應器中之pH。
52. 如請求項51之設備，其進一步包含： 一取樣泵，其經組態以將該滑流自該反應器遞送至該pH流通槽； 一廢棄物接收器，其經組態以接收來自該pH流通槽之流出物； 一酸滴定劑泵，其經組態以自該酸滴定劑供應遞送該酸滴定劑至該反應器； 一酸滴定劑流量計，其經組態以量測該酸滴定劑自該酸滴定劑供應至該反應器之流速； 一鹼滴定劑泵，其經組態以自該鹼滴定劑供應遞送該鹼滴定劑至該反應器；及 一鹼滴定劑流量計，其經組態以量測該鹼滴定劑自該鹼滴定劑供應至該反應器之流速。
53. 如請求項51或52之設備，其進一步包含一控制器，該控制器與該酸滴定劑流量計、該鹼滴定劑流量計、該pH探針、該酸滴定劑泵及該鹼滴定劑泵通信。
54. 如請求項53之設備，其中該控制器經組態以： （a）接收來自該酸滴定劑流量計之一信號，藉此該控制器確定添加至該樣品之酸滴定劑之量； （b）接收來自該鹼滴定劑流量計之一信號，藉此該控制器確定添加至該樣品之鹼滴定劑之量； （c）接收來自該pH探針之一信號，藉此該信號傳達pH量測值至該控制器，且該控制器將該pH量測值聯繫至添加至該樣品之酸滴定劑或鹼滴定劑之對應量； （d）發送一信號至該酸滴定劑泵以開啟該泵、停止該泵或改變泵速度；及 （e）發送一信號至該鹼滴定劑泵以開啟該泵、停止該泵或改變泵速度，其中該控制器經組態以將模型應用於該pH量測值及添加至該樣品之酸或鹼滴定劑之對應量。
55. 如請求項51至54中任一項之設備，其中遞送至該反應器之酸滴定劑或鹼滴定劑之體積具有10%或更低之誤差百分比。

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