CZ2001846A3 - Přípravky pro modulaci interakce mezi receptorem APJ a virem HIV - Google Patents

Abstract

Řešení se týká receptoru APJ ("orphan seven transmembrane receptor"), který působí jako konceptor pro infekci buňky virem HIV. Příprava buněčných linií, které koexprimují CD4 a APJ poskytuje cenný nástroj pro další výzkum infekce HIV a pro vývoj léčiv proti HIV.

Description

Přípravky pro. modulaci interakce mezi receptorem APJ a virem HIV

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká receptoru APJ (orphan seven transmembrane domain receptor), který působí jako koreceptor pro infekci buňky virem HIV. Příprava buněčných linií, které koexprimují CD4 a APJ poskytuje cenný nástroj pro další výzkum infekce HIV a pro vývoj léčiv proti HIV.

Dosavadní stav techniky

Vstup viru HIV-1 do buňky zahrnuje navázání virového obalového proteinu (env) na CD4 po které následuje interakce s jedním z mnoha koreceptorů (viz přehledy E.A. Berger, 1997, AIDS, 11:S3-S16; Broder a kol., 1997, J. Leucocyte Biol., 62:2029; Doms a kol., 1997, Virology, 235:279-190; a Moore a kol., 1997, Curr. Opinion Immunol., 9:551-562). Má se za to, že navázání env proteinu na příslušný receptor spouští konformačni změny v env, které zprostředkují fúzi mezi obalem viru (virovou membránou) a membránou hostitelské buňky. Chemokinové receptory CCRS a CXCR4 byly identifikovány jakožto hlavní koreceptory HIV-1, neboť všechny dosud zkoumané kmeny HIV-1 jednu z těchto molekul nebo obě jako druhý receptor. CCRS podporuje infekci virovými kmeny R5 (M-tropní), zatímco CXCR4 podporuje infekcí virovými izoláty X4 (T-tropní) (Alkhatib a kol., 1996, Science, 272:1955-1958; Berger a kol., 1998, Nátuře, 391:240; Choe a kol., 1996, Cell, 85:1135-1148; Deng a kol., 1996, Nátuře, 381:661-666; Doranz a kol., 1996, Cell, 85:1149-1158; Dragic a kol., 1996, Nátuře, 381:667-673; a Feng a kol./ 1996, Science, 272:872-877). Protein env viru R5-X4 (s duálním tropismem) může ve spojení s CD4 užít pro vstup do buňky buďto CCRS nebo CXCR4.

• · · · • · • · · · • ·

Různé využití CCRS nebo CXCR4 kmeny HIV, spolu s expresním profilem v CD4 pozitivních buňkách z větší části vysvětluje virový tropismus na úrovni vstupu do buňky.

Bylo ukázáno, že kromě CCRS a CXCR4 funguje celá řada chemokinů a „orphan seven transmembrane domaín receptory jakožto koreceptory pro jeden nebo více vírových kmenů in vítro, včetně např. CCR2b, CCR3, CCRS, CX3CR1, GPRI, GPR 15, STRL33, US28, a ChemR23 (Choe a kol., 1996, Cell 85:1135-1148; Deng a kol., 1997, Nátuře 388:296-300; Doranz a kol., 1996, Cell 85:1149-1158; Farzan a kol., 1997, J. Exp. Med. 186:405411; Liao a kol., 1997, J. Exp. Med. 195:2015-2023; Pleskoff a kol., 1997, Science 276:1874-1878; Reeves a kol., 1997, Virology 231:120-134; Rucker a kol., 1997, J. Virol. 71:89999007). Obecně platí, že tyto alternativní koreceptory podporují virovou infekci s menší účinností než CCRS nebo CXCR4. Avšak užití alternativních koreceptorů může napomoci vysvětlit určité rysy tropismu virů HIV-1 a patogeneze in vivo. Tak např. neurologické onemocnění je relativně častým a vážným následkem infekce HIV-1, kdy mikroglie jsou primárním cílem virové infekce v centrálním nervovém systému (Bagasra a kol., 1996, AIDS, 10:573-585; Sharer a kol., 1992, J. Neuropath. Exp. Neurol., 51:3-11; Wiley a kol., 1986, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83:7089-7093). Mikroglie exprimují jak CCR3 tak CCRS a předpokládalo se, že využití CCR3 virovým kmenem koreluje s neurotropismem (He a kol., 1997, Nátuře, 385:645-649).

Identifikace dalších koreceptorů pro HIV-1 virus by poskytla důležité nástroje pro výzkum a kontrolu infekce HIV.

>· · ···

Podstata vynálezu

První aspekt předkládaného vynálezu se týká rekombinantní eukaryotické buňky transformované polynukleotidem, který kóduje polypeptid APJ a/nebo polynukleotidem, který kóduje polypeptid CD4, přičemž buňka koexprimuje (současně exprimuje) polypeptidy APJ a CD4.

Předkládaný vynález se také týká protilátky, která se specificky váže na extracelulární doménu APJ, přičemž protilátka inhibuje HIV infekci cílové buňky, která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4 nebo inhibuje membránovou fúzi mezi první buňkou koexprimující polypeptidy APJ a CD4 a druhou buňkou exprimující env protein z HIV.

Vynález se dále týká v podstatě purifikovaného fragmentu peptidu APJ, kterýžto peptid inhibuje infekci HIV cílové buňky která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4 nebo inhibuje fúzi mezi první buňkou koexprimující polypeptidy APJ a CD4 a druhou buňkou exprimující env protein z HIV.

Další aspekt předkládaného vynalezu se tyká způsobů identifikace sloučenin, které modulují interakci mezi virem HIV a receptorem APJ.

Předkládaný vynález se také'týká způsobu inhibice infekce HIV cílové buňky exprimující polypeptidy APJ a CD4, který obsahuje kroky, kdy se cílové buňky přivedou do kontaktu s účinným množstvím APJ vazebného nebo blokujícího agens.

Předkládaný vynález se také týká léčení subjektu, který je ohrožen infekcí HIV nebo příbuznou nemocí, které spočívá v podávání terapeuticky účinného množství protilátky anti-APJ subjektu.

Popis obrázků

Obr. 1 graf ukazující fúzi buněk zprostředkovanou • 9 9 • · · ·

9· «9

proteinem env viru HIV-1 nebo HIV-2. Všechny uvedené proteiny env pocházejí z HIV-1, kromě HIV-2/ST, který pochází z HIV-2. Buňky QT6 exprimující CD4, uvedený receptor a luciferázu pod kontrolou promotoru T7 byly smíchány s buňkami exprimujícími T7 polymerázu a uvedený protein env z HIV-1 nebo HIV-2. Stupeň fúze buňka-buňka byl hodnocen 8 hodin po smíchání měřením aktivity luciferázy. Výsledky byly normalizovány vzhledem ke 100% hodnotě, kterou představovala fúze získaná koexpresí CD4 a buďto CCR5 (pro R5 env proteiny) nebo CXCR4 (pro X4 env proteiny). Rozsah fúze získané s hlavními koreceptory HIV-1 byl obecně 40 až 100 x vyšší než základní hladina. Svislé úsečky na tomto a následujícím obrázku představují střední chybu průměru získanou z více nezávislých experimentů.

Obr. 2 je graf ukazující fúzi buněk zprostředkovanou proteinem env viru SIV. Stupeň fúze buňka-buňka byl stanoven stejně jak bylo popsáno u obr. 1, avšak s env proteinem SIV namísto HIV. Výsledky byly normalizovány vzhledem ke 100% hodnotě, kterou představovala fúze získaná koexpresí CD4 a CCR5. Rozsah fúze získané s různými proteiny env byl obecně 40 až 100 x vyšší než základní hladina (definovaná samotným CD4).

Obr. 3 je graf ukazující infekci vírovým pseudotypem. Buňky HEK 293 exprimující CD4 a uvedený koreceptor byly infikovány virovými pseudotypy s luciferázou, které nesly uvedené env proteiny HIV nebo SIV, a 2 až 3 dny po infekci byla stanovena luciferázová aktivita.

Obr. 4 je graf ukazující virovou infekci buněk HEK 293 exprimujících CD4 a uvedený koreceptor a také plazmid kódující luciferázu pod kontrolou LTR HIV-1. Buňky byly infikovány živým HIV-1 IIIB (HxB) nebo HIV-1 89.6. Výsledky byly normalizovány vzhledem ke 100% hodnotě, kterou představovala infekce • · · ·

získaná buďto CCR5 (pro R5 env proteiny) nebo CXCR4 (pro X4 env proteiny).

Obr. 5 je snímek Southernova blotu ukazující vstup viru do buněk exprimujících CD4 a APJ. Buňky QT6 trvale exprimují CD4 a přechodně exprimují požadovaný koreceptor byly infikovány bezbuněčným DNázou ošetřeným virovým preparátem. Virově specifické LTR DNA sekvence byly detekovány 2 dny po infekci užitím amplifikace v PCR (polymerázové řetězové reakci), po které následovalo rozdělení produktu na 2% agarózovém gelu a detekce sekvence užitím značené sondy.

Obr. 6 je snímek Northernova blotu ukazující expresi APJ v lidské mozkové tkáni. Membrány obsahující póly A+ RNA z různých oblastí lidského mozku byly získány od firmy Clontech a byly přes noc inkubovány se značenou cDNA sondou specifickou pro APJ. Pak byly membrány exponovány na zobrazovacím zařízení FUJI Imaging 4 hodiny. Byly vyšetřeny následující tkáně: Panel A: (1) Amygdala; (2) Nucleus caudatus; (3) Corpus callosum; (4) Hippocampus; (5) Celý mozek; (6) Substantia nigra; (7) Nucleus subthalamícus; (8) Thalamus; Panel (B) : (1} Cerebellum; (2) Kůra mozková; (3) Medulla oblongata (4) Páteřní mícha; (5) Okcipitální lalok; (6) Frontální lalok; (7) Temporální lalok; (8) Putamen.

Obr. 7 snímek Northernova blotu ukazující expresi APJ v lidské mozkové tkáni. Membrány obsahující póly A+ RNA z různých oblastí lidského mozku byly získány od firmy Clontech a byly přes noc inkubovány se značenou cDNA sondou specifickou pro APJ. Pak byly membrány exponovány na zobrazovacím zařízení FUJI Imaging 4 hodiny. Byly vyšetřeny následující tkáně: Panel A: (1) Slezina; (2) Thymus; (3) Prostata; (4) Varlata; (5) vaječníky; (6) Tenké střevo; (7) Sliznice tlustého střeva; (8)

Celkové lymfocyty periferní krve.

Obr. 8 je snímek obarveného agarózového gelu, který ukazuje expresi APJ v primárních buňkách a liniích T buněk. RNA z uvedených buněk byla použita v RT-PCR reakci provedené v jediné zkumavce a 10 μΐ z každé 25 μΐ reakce bylo analyzováno na 2% agarózovém gelu. Predikovaná velikost pásu APJ produktu byla 481 párů baží. Jako pozitivní kontroly byly užity plazmidové DNA i RNA izolovaná z trvale transfekovaných buněk U87-APJ a v negativní kontrole byla místo templátu užita voda.

Obr. 9 je nukleotidová sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence lidského APJ (0'Dowd a kol., 1993, Gene 136:355-360) (uvedená zde jako sekvence id. č. 1). Pozice sedmi transmembránových úseků jsou následující: transmembránový úsek 1 (TMI) odpovídá aminokyselinám 26 až 54, transmembránovy úsek 2 (TM2) odpovídá aminokyselinám 66 až 90, transmembránový úsek 3 (TM3) odpovídá aminokyselinám 104 až 125, transmembránový úsek 4 (TM4) odpovídá aminokyselinám 144 až 167, transmembránový úsek 5 (TM5) odpovídá aminokyselinám 199 až 225, transmembránový úsek 6 (TM6) odpovídá aminokyselinám 246 až 271 a transmembránový úsek 7 (TM7) odpovídá aminokyselinám 285 až 312. Extracelulární úseky polypeptídu APJ jsou lokalizovány v aminokoncovém segmentu před transmembránovou doménou 1 (aminokyseliny 1 až 25), mezi transmembránovou doménou 2 a 3 (aminokyseliny 91 až 103), mezi transmembránovou doménou 4 a 5 (aminokyseliny 168 až 198) a mezi transmembránovou doménou 6 a 7 (aminokyseliny 272 až 284).

Podle předkládaného vynálezu bylo objeveno, že receptor APJ, orphan seven transmembrane domain receptor, (0'Dowd a kol., 1993, Gene 136:355-360), působí jako účinný koreceptor pro mnohé kmeny HIV-1 a SIV. APJ slouží také jako velmi účinný koreceptor pro některé virové kmeny X4 (T-tropní) a R5-X4 (s duálním tropismem), zatímco izoláty R5 (M-tropní) využívají APJ s menší účinností. APJ slouží jako koreceptor také několika kmenů SIV.

V souladu s vynálezem byla také objevena široce rozšířená exprese APJ v lidském centrálním nervovém systému. Účinné využití APJ řadou virových kmenů spojené s expresí APJ v centrálním nervovém systému ukazuje, že využití těchto receptorů může být důležité při HIV neuropatogenezi.

Podle vynálezu byla také objevena exprese APJ v CD4 pozitivní T buněčné linii C8166.

V jednom provedení se podle vynálezu týká rekombinantní buněčné linie, která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4 a obsahuje exogenní polynukleotid, který kóduje buďto polypeptíd APJ nebo CD4.

Předkládaný vynález se také týká buněčných linií, jejíchž buňky koexprimují polypeptidy APJ a CD4 a obsahují exogenní polynukleotid, který kóduje polypeptíd APJ, a obsahují exogenní polynukleotid, který kóduje polypeptíd CD4. termín polypeptíd CD4” v předkládaném popisu znamená CD4 polypeptíd savce, výhodně člověka nebo opice, nebo jeho biologicky aktivní fragment. Termín polypeptíd APJ v předkládaném popisu znamená APJ polypeptíd savce, výhodně člověka nebo opice, nebo jeho biologicky aktivní fragment. Přičemž termín biologicky aktivní označuje schopnost specificky interagovat s HIV nebo SIV virem a týká se polypeptidů majících alespoň jeden epitop pro protilátku ímunoreaktivní s APJ nebo CD4 polypeptidy.

Předkládaný vynález se netýká jen přirozeně se vyskytujících APJ a CD4 polypeptidů, ale také mutovaných polypeptidů APJ a CD4. Tak např. vynález zahrnuje i změny v aminokyselinové sekvenci APJ. APJ může být modifikován tím, že se změní DNA, která kóduje protein APJ. Výhodně se provádějí ·· ···♦ ·· tttt histidin;

asparagin;

jen konzervativní záměny aminokyselin užitím aminokyselin, které mají stejné nebo podobné vlastnosti. Jako ilustraci aminokyselinových záměn lze uvést např. alanin za serin; arginin za lysin; asparagin za glutamin nebo aspartát za glutamát; cystein za serin; glutamin za glutamát za aspartát; glycín za prolin; histidin za asparagin nebo glutamin; isoleucin za leucin nebo valin; leucin za valin nebo isoleucin; lysin za arginin, glutamin nebo glutamát; methionin za leucin nebo isoleucin; fenylalanin za tyrosin, leucin nebo methionin; serin za threonín; threonin za serin; tryptofan za tyrosin; tyrosin za tryptofan nebo fenylalanin a valin za isoleucin nebo leucin.

K polynukleotídovým sekvencím podle vynálezu patří DNA, cDNA a RNA sekvence, které kódují polypeptidy APJ a CD4. K takovým polynukleotidům patří jak přirozeně se vyskytující polynukleotidy, tak i syntetické nebo záměrně upravené polynukleotidy. Tak např. částí sekvence mRNA mohou být změněny díky alternativnímu sestřihu mRNA nebo použitím alternativních promotorů pro transkripci. Jiným příkladem je místně cílená mutageneze APJ nebo CD4. K polynukleotídovým sekvencím APJ a CD4 patří také antisense sekvence. A vynález se také týká polynukleotidu, který kóduje APJ polypeptíd, který má biologickou aktivitu, nebo CD4 polypeptíd, který má biologickou aktivitu.

K vhodným typům buněk patří, avšak výčet tím není omezen, následující typy: myší buňky NIH 3T3, buňky Mvllu (norek), opičí buňky BS-C-1 (Afričan Green Monkey), lidské embryonální ledvinné buňky (HEK) 293 (ATCC CRL 1573), a křepelčí buňky QT6. Takové buňky byly popsány např. v katalogu americké sbírky mikroorganismů a tkáňových kultur (ATCC). Tyto buňky mohou být trvale nebo dočasně transformovány metodami, které jsou odborníkům známy, viz např. Ausubel, a kol., Introduction of DNA Into Mammalian Cells, in Current Protocols in Molecular • · 4 444

Biology, sekce 9.5.1-9.5.6 (John Wiley & Sons, lne. 1995). Termín trvalá transformace v popisu vynálezu se týká buněk, které jsou nesmrtelné v tom smyslu, že již prodělaly alespoň 50 buněčných dělení.

Exogenní polynukleotidy APJ nebo CD4 mohou být exprimovány pomoci indukovatelných nebo konstitutivních regulačních elementů exprese. Obecně užívané konstitutivní nebo indukovatelné promotory jsou odborníkům známy. Příkladem jsou promotory získané z genomu savců (např. promotor metalothioneninu) nebo savčích virů (např. promotor z LTR, dlouhé terminální repetice, retroviru, adenovirový pozdní promotor, promotor 7,5K z viru vakcínie). pro transkripci exogenních ACJ nebo CD4 polynukleotidů se také mohou užít promotory připravené technikami rekombinantní DNA nebo syntetické promotory.

Požadované sekvence kódující protein s operativně připojeným promotorem se vnesou do hostitelské buňky ve formě nereplikující se molekuly DNA (nebo RNA), která je buďto lineární nebo výhodněji kovalentně uzavřená kruhová molekula. Jelikož takové molekuly nejsou schopné autonomní replikace, k expresi dochází formou přechodné exprese vnesené sekvence. Alternativně může dojít k trvalé expresi, když se vnesená sekvence integruje do chromozómu hostitele. Ve výhodném provedení je vnesená sekvence vložena ve virovém nebo plazmidovém vektoru, který je schopen autonomní replikace v hostiteli. Pro tento účel lze užít celou řadu vektorů. K důležitým faktorů při výběru plazmidového nebo vírového vektoru patří: jak snadno lze rozpoznat hostitelskou buňku obsahující vektor a selektovat ji od buňky neobsahující vektor, počet kopií vektoru potřebných v daném hostiteli, potřeba kyvadlového vektoru střídajícího se mezi hostiteli různých biologických druhů.

Pro expresi je k dispozici řada expresních systémů. Jedna ·· ·«·« ·· ···· třída vektorů užívá DNA elementy, které poskytují autonomně se replikující extrachromozomální plazmidy, odvozené z virů jako jsou např. hovězí papilloma virus, polyoma virus, adenovirus nebo virus SV40. K druhé třídě vektorů patří expresní vektory založené na viru vakcínie. Třetí třída vektorů je založena na integraci požadované genové sekvence do chromozómu hostitele. Buňky, které mají vnesenou DNA trvale integrovanou do svého chromozómu mohou být selektovány tím, že se do nich vnese jeden nebo více markérů (např. exogenních genů), které dovolují selekci hostitelských buněk obsahujících expresní vektor. Markér např. poskytuje prototrofii jinak auxotrofnímu hostiteli nebo rezistenci k biocidní látce, např. k antibiotiku nebo těžkému kovu, např. rezistenci k mědi. Gen pro selekční markér může být také přímo spojen se sekvencemi DNA, které se mají exprimovat, nebo může být vnesen do téže buňky kotransformací. Pro optimální syntézu mRNA mohou být potřeba ještě další elementy. K těmto elementům patří sestřihové signály, promotor transkripce, enhancery (zesilovače) transkripce a terminační signály transkripce. K cDNA expresním vektorům, které obsahují takové elementy, patří vektory popsané v Okayama, H., Mol. Cell. Biol., 3:280 (1983) a dalších publikacích.

Jakmile je připraven vektor nebo DNA konstrukt, je vnesen (transformací) do vhodného hostitele. K různým způsobům, které lze pro transformaci užít, patří např. fúze protoplastů, precipitace s kalciumfosfátem, elektroporace, mikroinjekce, přenos pomocí liposomů, virová infekce nebo jiné v oboru známé techniky.

Jiné provedení předkládaného vynálezu se týká transgenních zvířat, která obsahují buňky koexprimující lidské polypeptídy CD4 a APJ. Taková transgenní zvířata představují modelový systém pro výzkum HIV infekce a vývoj účinnějších léků proti HIV.

Termín zvíře v popisu vynálezu označuje všechny druhy ·· ···· «· ···· savců kromě člověka. Zahrnuje také jednotlivá zvířata ve všech stadiích vývoje včetně embryonálního a fetálního stadia. Hospodářská zvířata (prasata, kozy, ovce, krávy, koně, králíci apod.), hlodavci (např. myš) a domácí zvířata (např. kočky a psi) mohou být taktéž předmětem vynálezu.

Transgenní zvíře je podle vynálezu jakékoliv zvíře, které obsahuje buňky nesoucí vnesenou genetickou informaci, přímo nebo nepřímo, záměrnou genetickou manipulací na subcelulární úrovni, jako je např. mikroinjekce nebo infekce rekombinantním virem. Termín transgenní podle vynálezu nezahrnuje zvířata získané klasickým křížením nebo fertilizací ín vítro, ale zvířata, kde do jedné nebo více buněk byla vnesena rekombinantní molekula DNA. Ačkoliv je velmi výhodné, když je tato molekula integrovaná do chromozómu zvířete. Předkládaný vynález ale zahrnuje také použití extrachromozomálně se replikující sekvence DNA, která může být vložena metodami genového inženýrství do umělého kvasinkového chromozómu. Termín transgenní zvíře zahrnuje také zvíře transgenní v zárodečné linii. Zvíře transgenní v zárodečné linii je transgenní zvíře, u kterého byla genetická informace vnesena do zárodečné linie, a tudíž mají schopnost předávat informaci potomstvu. Jestliže takové potomstvo obsahuje část nebo celou takovou informaci, jde o transgenní potomstvo.

Výhodná je příprava transgenních zvířat podle vynálezu vnesením polynukleotidu, který kóduje APJ nebo CD4, do jednobuněčných embryí takovým způsobem, že tyto polynukleotidy se integrují do DNA zárodečných buněk dospělých zvířat, a pak se dědí normálním mendelovským způsobem. Pokroky v technikách míkromanipulace s embryi umožňují vnesení polynukleotidu do fertilizovaného vajíčka savce. NApř. totipotentní nebo pluripotentní kmenové buňky mohou být transformovány mikroinjekcí, precipitací zprostředkovanou kalciumfosfátem, fúzí liposomů, retrovirovou infekcí nebo jiným způsobem, a ·· ···· • · · • · · • · · ·· · «· ···· • · · • · * • * · · ·· ·· ·· • · transformované kmenové buňky se pak vnesou do embrya a embryo se vyvíjí vyvíjej ící v transgenní se embryo požadovaný polynukleotid zvíře. Ve výhodném provedení je infikováno retrovirem obsahujícím a transgenní zvíře je připraveno z takto infikovaného embrya. Nejvýhodnějším způsobem jsou vhodné polynukleotídy společně injikovány (koinjikovány) do pronukleu nebo cytoplazmy embryí, výhodně ve stadiu jedné buňky, a pak jsou embrya ponechána, aby se vyvinula na dospělá transgenní zvířata. NApř. existují přehledy o laboratorních postupech mikroinjekcí exogenní DNA do oplodněného vajíčka savce (myš, prase, králík, ovce, koza, kráva) jako např.: Hogan a kol., Manipulating The Mouše Embryo (Cold Spring Barbor Press 1986); Krimpenfort a kol., BiolTechnology 9:86 (1991);

Palíniter a kol., Cell 41:343 (1985); Kraemer a kol., Genetic

Manipulation of The Early Mammalian Embryo (Cold Spring Barbor Laboratory Press 1985); Hammer a kol., Nátuře 315:680 (1985);

Purcel a kol., Science 244: 1281 (1986); Wagner a kol., U.S.

Patent 5,175,385; Krimpenfort a kol., U.S. Patent 5,175,384, které jsou formou odkazu součástí předkládané přihlášky.

Polynukleotídy, které kódují APJ nebo CD4 mohou být fúzovány ve vhodném čtecím rámci pod transkripční a translační kontrolou vektoru, aby vytvořily genový konstrukt, který je pak amplifikován, např. přípravou bakteriálních vektorů metodami, které jsou odborníkům známy (jsou popsány např. v příručce Sambrook a kol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Cold Spring Barbor Press 1989), která je vložena formou odkazu). Amplifikovaný konstrukt je pak vystřižen z vektoru a purifikován pro přípravu transgenních zvířat.

Příprava transgenních zvířat obsahujících gen lidského CD4 již byla popsána, viz např. Snyder a kol., Mol. Reprod. & Devel. 40:419-428 (1995); Dunn et 25 al., J. Gen. Virology

76:1327-1336 (1995), která je vložena formou odkazu).

Jiné provedení vynálezu se týká protilátek, které váží »· φφφφ » φ φ « φ • φ · φ · • · · φφφ • φ φ · φ φφ » φ* φ* φφφφ • φ · φ * φ φφφ φ φφφ φφ φφ

APJ a tak inhibují vstup HIV do CD4 pozitivních cílových buněk nebo tak inhibují buněčné fúze mezi buňkou prvního druhu exprimující polypeptidy CD4 a APJ a buňkou druhého druhu, která exprimuje protein env. Termín protein env označuje jakýkoliv protein env z viru HIV, a to jak HIV-1 tak HIV-2, nebo z viru SIV. Exprese proteinu env buňkami typicky vede k expresi skupiny gpl20 env proteinu na povrchu buňky, protilátky podle vynálezu inhibují také vazbu gp!20 na APJ. Takové protilátky mohou být buďto diagnostickým nebo výzkumným nástrojem při výzkumu infekce HIV a vývoji účinnějších léků proti HIV. Kromě toho farmaceutické přípravky obsahující protilátky proti APJ mohou být samy účinnými léky proti HIV. Protilátky vhodné pro blokování buněčné fúze zprostředkované env, vstupu HIV do CD4 pozitivních buněk nebo blokování vazby gpl20 na A.PJ jsou specifické alespoň pro část extracelulárního úseku polypeptidu APJ, např. první extracelulární úsek (aminokyseliny 1 až 25), druhý extracelulární úsek (aminokyseliny 91 až 103), třetí extracelulární úsek (aminokyseliny 168 až 198) nebo čtvrtý extracelulární úsek (aminokyseliny 272 až 284), jak je ukázáno na obr. 9. Výhodné protilátky jsou ty protilátky, které rozpoznávají epitop obsahující část prvního nebo druhého extracelulárního úseku. Zvláště výhodné jsou protilátky, které rozpoznávají epitop obsahující aminokyselinovou sekvenci AsnTyr-Tyr-Gly (sekvence id. č. 3), která je obsažena v prvním extracelulárním úseku.

K anti-APJ protilátkám podle vynálezu patří polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a fragmenty polyklonálních a monoklonálních protilátek. Příprava polyklonálních protilátek je v oboru dobře známa (viz např. Green a kol., Production of Polyclonal Antisera, in Immunochemical Frotocols (Manson, ed.), s. 1-5 (Humana Press 1992); Coligan a kol., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, in Current Protocols in Immunology, sekce 2.4.1 (1992).

• · ··· · ·’ » · · · « l · · · ¹

I « · · · 1 např. patří afinitní Sepharose, vylučovací způsoby, chromatografie

Také příprava monoklonálních protilátek je známá. Viz např. Kohler & Milstein, Nátuře 256:495 (1975); Coligan a kol., Current Protocols in Immunology, sekce 2.5.1-2.6.7; a Harlow a kol., Antibodies: A Laboratory Manual, s. 726 ,Cold Spring Harbor Pub. (1988), na které se tímto plně odkazuje. Stručně shrnuto, monoklonální protilátky se připravují tak, že se myši injikuje přípravek obsahující antigen, ověří se přítomnost protilátky ve vzorku séra, vyjme se slezina jakožto zdroj B lymfocytů, B lmfocyty se fúzují s myelomovými buňkami, čímž vznikne hybridom a hybridom se pak klonuje, přičemž se selektují pozitivní klony, které produkují protilátky k danému antígenu a z hybridomové kultury se pak izolují protilátky. Izolace a purifkace protilátek se provádí mnoha známými Ke způsobům izolace na Protein-A chromatografie, afinitní purifikace s antigenem a iontoměničová chromatografie, viz např. Coligan a kol., Current Protocols in Imrnunology, sekce 2.7.1-2.7.12 a sekce 2.9.1-2.9.3; Barnes a kol., Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, s. 79-104 (Humana Press 1992).

Metody in vitro a in vivo multiplikace monoklonálních protilátek jsou odborníkům dobře známy. Metody multiplikace in vitro se provádějí ve vhodném kultivačním médiu jako je např. médium DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) nebo RPMI 1640, volitelně doplněné sérem, jako je např. telecí fetální sérum, nebo stopovými prvky a složkami, které jsou nezbytné pro udržení růstu jako je např. buňky peritoneálního exudátu normálních myší, buňky sleziny, makrofágy kostní dřeně. Produkce in vitro poskytuje relativně čisté protilátky a dovoluje zvětšit měřítko přípravy na velká množství protilátek. Kultivace hybridomů ve velkém měřítku se mohou provádět jako homogenní suspenzní kultury v provzdušňovaném reaktoru nebo v kontinuálně. míchaném reaktoru nebo v reaktoru « · · · · · • * · • · · • · * • · · · · · · • · * * • · .·, · · 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 4 • · ft s imobilizovanými nebo zachycenými buňkami. Multiplikace in vivo se může provádět tak, že se injikují buněčné klony do savce histokompatibilního s parentálními buňkami, např. syngenní myší, a tím se indukuje růst nádorů produkujících se zvíře před oleji jako Po jednom až injekcí premedikuje je např. přistaň třech týdnech se protilátku. Případně uhlovodíky, zejména (tetramethylpentadekan) požadovaná protilátka izoluje z tělesných tekutin zvířete.

Terapeutické aplikace anti-APJ protilátek jsou také předmětem předkládaného vynálezu, tak např. protilátky podle vynálezu mohou být také získány z protilátek primátů. Obecné metody přípravy protilátek v paviánech byly např. popsány v mezinárodní patentové přihlášce Goldenberga a kol., WO 91/11465 (1991) a v publikaci Losman a kol., Int. J. Cancer 46:310 (1990), které jsou vloženy formou odkazu.

Alternativně mohou být terapeuticky a diagnosticky užitečné anti-APJ protilátky odvozeny z humanizovaných monoklonálních protilátek. Humanizované monoklonální protilátky se připravují tak, že se komplementaritu určující úseky z těžkého a lehkého řetězce myšího imunoglobulinu přenesou do variabilní domény lidského imunoglobulinu a pak se zbytky v rámcových oblastech myši protilátky nahradí lidskými zbytky. Použití protilátkových komponent odvozených z humanizovaných monoklonálních protilátek zabraňuje potenciálním problémům spojeným s imunogeničností konstantních úseků myší protilátky. Obecné techniky klonování variabilních domén myšího imunoglobulinu byly popsány např. v Orlandi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Techniky přípravy humanizovaných monoklonálních protilátek byly popsány např, v

Jones a kol., Nátuře 321:522 332:323 (1988); Verhoyen a (1986); Riechmann a kol., Nátuře kol., Science 239:1534 (1988);

Carter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992);

Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992) a Singer a kol., J.

Immunol. 150:2844 (1933)(všechny uvedené publikace jsou vloženy formou odkazu).

Protilátky podle vynálezu mohou být také získány z fragmentů lidských protilátek izolovaných z kombinančních imunoglobulinových knihoven, viz např. Barbas a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 119 (1991); Winter a kol., Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994). Klonovací a expresní vektory vhodné pro přípravu fágové knihovny lidských imunoglobulinů mohou být získány např. od firmy Stratagene Cloning Systems {La Jolla, CA, USA).

Navíc protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být získány z lidských monoklonálních protilátek. Takové protilátky se připravují užitím transgenních myší, které byly metodami genového inženýrství upraveny tak, že v reakci na antígen produkují specifické lidské protilátky. Při tomto způsobu se elementy lokusů těžkého a lehkého řetězce lidského imunoglobulinu vnesou do myšího kmenu získaného z embryonálních buněčných linií obsahujících cíleně rozrušené endogenní lokusy těžkého a lehkého řetězce. Transgenní myši syntetizují lidské protilátky specifické pro lidské antigeny a mohou být použity k přípravě hybridomů produkujících lidské protilátky. Metody pro přípravu lidských protilátek v transgenních myších byly popsána např. v publikacích Green a kol., Nátuře Genet. 7:13 (1994); Lonberg a kol., Nátuře 368:856 (1994 a Taylor a kol., Int. Immunol. 6:579 (1994), které jsou vloženy formou odkazu.

Fragmenty protilátek podle vynálezu mohou být připraveny proteolytickou hydrolýzou protilátky nebo expresí DNA kódující příslušný fragment v E. coli. Fragmenty protilátek se mohou připravit štěpením celých protilátek pomocí pepsinu nebo papainu metodami, které jsou známy. Např. fragment protilátky, který lze připravit enzymatickým štěpením protilátky pepsinem je fragment velikosti 5S označovaný F(ab')2. tento fragment může být dále štěpen pomocí thiolového redukčního činidla, a • · ····

případně blokující skupiny pro sulfhydrylové skupiny vznikající štěpením disulfidických vazeb, čímž vzniká monovalentní fragment velikosti 3,5 S označovaný Fab ’ a fragment Fc. Tyto metody byly popány např. Goldenberqem v patentech USA č. 4,036,945 a 4,331,647, které jsou vloženy formou odkazu, a také např. v publikacích Nísonhoff a kol., Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959); Edelman a kol., Methods in Enzymology, vol. 1, s. 422 (Academie Press 1967) a Coligan a kol., Current Protocols in Immunology, sekce 2.8.1-2.8:10 a 2.10.1-2.10.4.)

Lze také užít další metody štěpení protilátek, jako je např. oddělení těžkého a lehkého řetězce a vytvoření monovalentních fragmentů lehkého řetězce, další štěpení fragmentů a nebo lze užít jiné enzymatické, chemické nebo genetické metody, pokud vedou k přípravě fragmentů, které si uchovávají schopnost vázat antigen, který je rozpoznáván intaktní protilátkou. Např. Fragmenty Fv obsahují spojení VH a VL řetězců, přičemž toto spojení může být nekovaientní, jak popsali např. Inbar a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2659 (1972). Alternativně mohou být variabilní řetězce spojeny intermolekulárními disulfidickými můstky nebo zesítěny pomocí chemických činidel jako je např. glutaraldehyd (viz např. Sandhu, Crit. Rev. Bíotech. 12:437 (1992). Výhodně fragmenty Fv obsahují VH a VL řetězce spojené peptídovým linkerem (spojkou). Tyto jednořetězcové antigen vázající proteiny (sFv) se připravují konstrukcí strukturního genu obsahujícího DNA sekvence kódující domény VH a VL spojené oligonukleotidem. Strukturní gen se pak vloží do expresního vektoru, který je pak vnesen do hostitelské buňky jako je např. E. coli. Rekombinantní hostitelské buňky pak syntetizují jednořetězcový polypeptíd se spojovacím peptidem, který spojuje dvě V domény. Metody přípravy sFv byly popsány např. v Whitlow a ' kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 97 • · · · · · (1991); Bird a kol., Science 242:423-426 (1988); Ladner a kol.,

U.S. Patent No. 4,946,778; Pack a kol., BiolTechnology 11:127177 (1993) a Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992).

Jinou formou protilátkových fragmentů jsou peptidy kódující jediný komplementaritu určující úsek (CDR). CDR peptidy (minimální rozpoznávací jednotky) lze připravit pomocí konstrukce genů kódujících CDR požadované protilátky. Takové geny se připravují např. pomocí polymerázové řetězcové reakce, kdy se syntetizují variabilní úseky z RNA z buněk produkujících protilátku (viz např. Larrick a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, vol. 2, page 106 (1991).

Bylo ukázáno, že protilátky vázající se na chemokinový receptor CXCR4, další koreceptor HIV, blokují fúzi těch kmenů HIV, které užívají CXCR4 receptor pro infekci (Feng, a kol., Science 272:872 {1996); Endres, a kol., Cell 87:745 (1996)).

V jiném provedení se předkládaný vynález týká variant APJ. Termín varianta v tomto popisu označuje molekulu, která napodobuje alespoň část struktury APJ a která inhibuje vstup HIV do cílové buňky exprimující polypeptidy CD4 a APJ, nebo inhibuje fúzi mezi buňkou prvního typu exprimující polypeptidy CD4 a APJ a buňkou druhého typu exprimující env protein.

Protein env některých izolátů HIV se podílí na infekčnosi tím, že se váže na APJ na buněčném povrchu.

Bez ohledu na stávající teorie, původci vynálezu věří, že varianty APJ mohou narušit infekčnost HIV tím, že kompetují s APJ o navázání env.

Jedno provedení předkládaného vynálezu se týká variant APJ, které jsou peptidy nebo peptidové deriváty, které mají menší počet aminokyselin než APJ. takové peptidy a peptidové deriváty jsou užitečné jako výzkumné a diagnostické nástroje pro výzkum infekce HIV a vývoj účinnějších léků proti HIV. K peptidům a peptidovým derivátům podle vynálezu patří takové, které odpovídají extracelulárním úsekům APJ, např. prvnímu • · ····

extracelulárnímu úseku (aminokyseliny 1 až 25), druhém extracelulárním úseku (aminokyseliny 91 až 103), třetím extracelulárním úseku (aminokyseliny 168 až 198) nebo čtvrtém extracelulárním úseku (aminokyseliny 272 až 284), jak je ukázáno na obr. 9. Peptidy odpovídající extracelulárním smyčkám pro jiné HIV receptory, receptory CCRS, byly již dříve popsány jako inhibitory fúze mezi buňkami exprimujícími HIV-1 env a myšími buňkami koexprimujícími CD4 a CCRS (Combadiere a kol., PCT/US97/09586, publikováno jako WO 97/45543). Výhodné peptidy a peptidové deriváty jsou ty, které odpovídají části buďto prvního nebo druhého extracelulárního úseku. Zvláště výhodné jsou peptidy a peptidové deriváty obsahující aminokyselinovu sekvenci Asn-Tyr-Tyr-Gly (sekvence id. č. 3) obsaženou v prvním extracelulárním úseku.

K variantám xAPJ užitečným podle vynálezu patří analogy, homology, muteiny a mimetika APJ. Varianty mohou být připraveny přímo ze samotného APJ chemickou modifikací, štěpením proteolytickými enzymy, nebo kombinací těchto metod. Kromě toho mohou být užity metody genového inženýrství a také metody přímé syntézy polypeptidů. Peptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány známými metodami jako jsou např. metody užívající t-BOC nebo FMOC chráněných alfa-aminoskupin. Podstatou obou metod je postupná syntéza, kdy v každém kroku je přidána jedna aminokyselina počínaje C-koncem peptidu (viz např. Coligan, a kol., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9) . Peptidy podle vynálezu mohou být také syntetizovány metodami syntézy peptidů na pevné fázi (byly popsány např. Merrifield, .7. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962) a Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62), užitím kopoly(styrendivinylbenzenu) obsahujícícho 0,1 až 1,0 mMol aminů na 1 g polymeru. Po ukončení chemické syntézy se odstraní ochranné skupiny (provede se deprotekce) a peptidy se odštěpí ···· l 9 9 <

·« ·· od polymerového nosiče působením kapalného HF-10% anísolu po 1/4 až 1 hodinu při teplotě 0°C. Po odpaření reagencií se peptid extrahuje z polymeru 1% octovou kyselinou a pak se surový materiál lyofilizuje. Surový standardními technikami purifikuje, např Sephadex G-15 užitím 5% kyseliny octové jakožto rozpouštědla. Lyofilizace vhodné frakce z kolony pak poskytne homogenní peptid nebo peptídový derivát, který pak může být dále charakterizován standardními postupy jako je analýza sekvence aminokyselin, chromatografie na tenké vrstvě, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, ultrafialová absorpční spektroskopie, molární rotace, rozpustnost a kvantitativní analýza Edmanovou degradací v pevné fázi.

Alternativně se peptídy připravují metodami rekombinantní DNA, které jsou odborníkům známy.

Termín v podstatě purifikovaný označuje molekuly, jako např. peptídy, které jsou v podstatě bez přítomnosti jiných proteinů, lipidů, sacharidů, nukleových kyselin a jiných biologických materiálů, se kterými jsou v přírodě spojeny, tak např. v podstatě čistá (purifikovaná) molekula jako jer polypeptid, může být tvořena ze 60 % (sušiny) požadovanou molekulou. Odborník je schopen purifikovat peptídy APJ standardním laboratorními metodami purifikace jako jsou např. elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (např. SDS-PA-GE) , sloupcová chromatografie (např. HPLC a analýza sekvence aminokoncových aminokyselin).

Jiné než peptidové (nepeptidové) sloučeniny, které napodobují vazbu a funkci APJ (APJ mimetika) lze připravit metodami podle Saragovi a kol., Science 253:792-95 (1991). Mimetika jsou molekuly, které napodobují prvky sekundární struktury proteinu (viz např. Johnson a kol., Peptide Turn Mimetics, in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto a kol., Eds., (Chapman and Halí, New York 1993). Důvodem využití peptidových materiál se pak gelovou filtrací na ·· ···· mimetik je to, že peptidová kostra proteinů má hlavní funkci orientovat aminokyselinové postranní řetězce tak, aby se usnadnily molekulární interakce. Pro účely předkládaného vynálezu lze za vhodná mimetika považovat ekvivalenty APJ. Delší peptidy mohou být připraveny technikou nativní chemické ligace, která umožňuje spojovat peptidy (Dawson, a kol., Science 266:776 (1994)). Varianty se mohou připravit technikami rekombinantní DNA s využitím klonování genomové DNA nebo cDNA. Je možné také využít místně-cílenou a úsekově-cílenou mutagenezí (viz např. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, ch. 8 , Ausubel a kol. eds., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93); Protein Engineering (Oxender & Fox eds., A. Liss, lne. 1987). Kromě toho pro mutagenezí lze využít technik skenovaní linkeru a mutagenezí zprostředkovanou PCR (viz např. PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press 1989); Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 & 2, viz výše, sekvencování proteinů a modelování struktur proteinů pro použití s jakoukoliv z výše popsaných technik byly popsány v Protein Engineering, tamtéž, a Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 & 2, viz výše). Pokud se užívají výše popsané sloučeniny, odborník snadno rutinním způsobem zajistí, aby byly přístupné pro použití podle předkládaného vynálezu v testovacím systému buněčné fúze a tetovacím systému infekčnosti.

Vynález zahrnuje také různé farmaceutické přípravky, které inhibují vstup HIV do cílových buněk exprimujících polypeptíd CD4 a APJ. Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou pomocí nosičů, excipientů, aditív a pomocných látek upraveny do formy vhodné pro podávání pacientovi, čímž umožní podání APJ varianty nebo protilátky proti APJ podle předkládaného vynálezu subjektu. K nejužívanějším nosičům a pomocným látkám patří ' uhličitan horečnatý, oxid titaničitý, laktóza, manitol a další cukry, mastek, mléčné proteiny, želatina, škrob, vitamíny, celulóza a ···· ·· ··»· její deriváty, živočišné a rostlinné oleje, polyethylenglykoly a rozpouštědla jako je např. sterilní voda, alkoholy, glycerol nebo polyhydrické alkoholy. Intravenózní přípravky obsahují tekutinu a náhradní výživu. K užívaným konzervačním látkám patří antimikrobiální činidla, antioxidanty, chelatační činidla a inertní plyny. K dalším farmaceuticky přijatelným nosičům patří vodné roztoky, netoxické excipienty včetně solí, konzervačních látek, pufrů apod., které jsou popsány např. v Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975). Hodnoty pH a přesné koncentrace různých složek farmaceutických přípravků se upraví rutinním způsobem, viz např. Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.).

Ještě další provedení vynálezu se týká způsobu inhibice vstupu HIV do cílové buňky. Způsob spočívá v tom, že se subjektu podává terapeuticky účinná dávka farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Podávání farmaceutického přípravku podle vynálezu lze uskutečnit jakýmkoliv způsobem, který je odborníkovi znám.

Subjektem je míněn jakýkoliv savec, výhodně člověk, např. u novorozenců narozených HIV-1 seropozitivním matkám byla pozorována neuropatie v mozku (Kolson a kol., 1998, Adv. Virus Res. 50:1-47). Tudíž zvláště výhodné podle vynálezu je léčení subjektu ve fetálním stadiu, který je ohrožen infekcí HIV, podáváním protilátky anti-APJ nebo fragmentu APJ. Protilátka anti-APJ nebo fragment APJ jsou fetálnímu subjektu výhodně podávány tak, že se podávají matce.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou výhodně vyrobeny a také se podávají v jednotkové lékové formě. K vhodným tuhým lékovým formám patří tablety, tobolky a čípky. Pro léčení subjektu jsou potřeba různé denní dávky, v závislosti na aktivitě sloučeniny, způsobu podávání, povaze a ·* ···· závažnosti onemocnění, věku a tělesné hmotnosti pacienta apod. Za určitých okolností jsou potřeba nižší či vyšší dávky. Podání denní dávky se může uskutečnit buďto jediným podáním ve formě jediné jednotkové lékové formy nebo podáním několika menších jednotkových lékových forem a nebo také opakovaným podáváním rozdělených dávek ve specifických intervalech.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu podle vynálezu jsou obecně podávány topicky, intravenózně, perorálně, parenterálně nebo jako implantát, ale v principu je možné i rektální podávání. Vhodné tuhé nebo kapalné lékové formy jsou např. granule, prášky, tablety, potahované tablety, (mikro)tobolky, čípky, sirupy, emulze, suspenze, krémy, aerosoly, kapky nebo roztoky pro injekce v ampulích a také lékové formy s přetrvávajícím účinkem účinné látky, kde jsou obvyklým způsobem použity excipienty, aditiva a/nebo pomocné látky jako např. rozvolňovací činidla, pojidla, potahovací činidla, bobtnací činidla, lubrikanty, ochucovadla, sladidla, stabilizátory nebo solubilizační činidla. Farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou vhodné pro použití v různých dávkovačích systémech. Stručný přehled současných systémů podávání léků podává např. Langer, Science 30 249:1527-1533 (1990).

Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být podávány lokálně nebo systémově. „Terapeuticky účinnou dávkou se myslí takové množství sloučeniny podle vynálezu, které je nutné k prevenci, léčení nebo alespoň částečnému omezení symptomů nemocí a doprovázejících komplikaci. Účinné množství samozřejmě závisí na závažnosti onemocnění, hmotnosti a obecné stavu pacienta. Typicky dávky použité in vitro poskytují užitečné vodítko pro stanovení množství pro in sítu podávání přípravku, a lze užít zvířecí modely ke stanovení účinné dávky pro léčení konkrétní nemoci. Různé úvahy v tomto směru byly publikovány např. v Gilman a kol. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The ·· ···· ·· ····

Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA, které jsou vloženy formou odkazu.

Dalším výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká diagnostiky vnímavosti k infekci HIV. Nukleotidové sekvence kódující APJ receptor a protilátky k receptoru APJ jsou zvláště užitečné pro diagnostiku vnímavosti k infekci, neboť vysoké hladiny receptoru indukují zvýšené riziko infekce HIV. Např. vyšší hladiny receptoru APJ ve tkáni centrálního nervového systému indikují zvýšené riziko neuropatogeneze spojené s infekcí HIV. Pomocí vhodných technik odborníkovi známých, jako je např. Northernový přenos („blotting), kvantitativní polymerázovvá řetězové reakce (PCR) a další, může být využita nukleotidová sekvence receptoru nebo jeho fragmentu k měření hladiny exprese RNA APJ. Alternativně protilátky k APJ mohou být použity standardním způsobem, jako je např. Westernový přenos, k detekci přítomnosti buněk exprimujících APJ receptor, a nebo např. užitím FACS nebo ELISA ke kvantifikaci hladiny exprese. Pro jakýkoliv vzorek biologické tkáně je hladina exprese APJ vyšší než referenční hladina indikátorem zvýšené citlivosti k infekci HIV. Referenční hladina se stanoví na základě vyšetření velkého počtu vzorků z velké populace .

Výhodné provedení vynálezu se týká způsobu screeningu sloučeniny („testované sloučeniny) na farmakologickou účinek proti HIV.

V jednom provedení vynálezu je užit test fúze buněk ke screeningu sloučenin s farmakologickým účinkem proti HIV. V testu fúze buněk se jeden typ eukaryotických buněk, které koexprimují polypeptidy APJ a CD3 inkubují společně s druhým typem buněk, které exprimují obalový protein env z HIV. Pak se sleduje fúze buněk dvou různých typů. Testovaná sloučenina se přidá k inkubačnímu roztoku před nebo po smíchání buněk a ·· ···· ·· ···· sleduje se mnoha různými způsoby její vliv na mírů fúzí, např. morfologickým vyšetřením nebo použitím indikátorového systému ve spojení s testem buněčné fúze. Indikátorový systém užitečný ve spojení s testem buněčné fúze je jakákoliv kombinace prvků, která poskytuje detekovatelný signál, když se přivede do kontaktu první složka v buňce prvního druhu s druhou složkou v buňce druhého typu fúzováním buněk. Tak např. první složka je gen kódující polymerázu jako je např. T7 poiymeráza a druhá složka je gen kódující reportérovou molekulu, jako je např. gen pro iucíferázu. Tak např. přichází v úvahu také systém, který vede po fúzi k produkci aktivní β-galaktosidázové reportérové molekuly.

V jiném provedení předkládaného vynálezu se užívá test infekčnosti pro screening sloučenin s farmakoiogickou účinností proti HIV. V testu infekčnosti se cílová eukaryotická buňka, která exprimuje polypeptid APJ a CD4, inkubuje s testovacím virem, který exprimuje env protein z HIV. Infekce cílové buňky testovacím virem se sleduje. Testovaná sloučenina se přidá do inkubačníno roztoku před nebo po smíchání cílových buněk s testovacím virem a pak se různými způsoby stanovuje účinek testované sloučeniny na míru infekce cílových buněk. Testovací virus může být reportérový virus, kde protein env je vnesen jako pseudotyp na základ reportérového genu. Alternativně testovacím virem může být íntaktní virus HIV. Infekčnost se obecně sleduje použitím indikátorových systémů ve spojení s testem infekčnosti. Může být použit jakýkoliv počet indikátorových systémů, přičemž výhodné jsou jakékoliv indikátorové systémy, které produkují detekovatelný signál po infekci. NApř. reportérový virus je zkonstruován s genem, který kóduje reportérovou molekulu jako je např. luciferáza nebo βgalaktosidáza, a který je exprimován, když reportérový virus infikuje cílovou buňku. V dalším příkladu cílová buňka obsahuje gen kódující reportérovou molekulu pod kontrolou LTR promotoru, ·· ·· ·♦·· ·« »♦·» • · • · • » · ·· což vede k expresi reportérové molekuly po infekci cílové buňky virem HIV. Alternativně se virová infekce monitoruje pomocí PCR, kdy se detekují virové sekvence v cílové buňce.

Test buněčné fúze a test infekčnosti HIV se mohou užít ke stanovení funkční schopnosti APJ poskytnout kompetenci k fúzi zprostředkovanou env v různém rozsahu CD4 pozitivním buňkám (buďto rekombinantně připraveným nebo přírodním), jako jsou např. (avšak bez omezení) buňky NIH 3T3 (myší), BS-C-I (opičí), HEK 293 (lidské), MviLu (norci), U-87 MG gliobiastomu, SCLI a QT6 (křepelčí). Kmeny HIV, které se mohou v užít testu nebo se užívají jako zdroj env jsou kmeny, které jsou M-tropní, Ttropní nebo kmeny s duálním tropismem. Mohou se tedy např. užít HIV kmen 8 9.6 s duálním tropismem, M-tropní kmen JRFL a Ttropní kmen IIIB (Matthews a kol., 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:9709-9713; Coiiman a kol., 1992, J. Virol. 66:7517-7521; Gartner a kol., 1986, Science 233:215-219).

Kromě toho se mohou užít také vybrané primární izoláty.

Variace metod screeningu léčiv jsou odborníkům známy. Tudíž test buněčné fúze nebo test infekčnosti HIV mohou být užity v řadě různých formátů, aby se využily vlastnosti vlastnosti receptoru APJ pro screening léčiv, která jsou účinná proti HIV.

V dalším provedení vynálezu se užívá antisense technologie jakožto specifický a účinný prostředek k inhibici infekce HIV buněk, které obsahují APJ, např. redukcí exprese APJ v těchto buňkách. Antisense polynukleotidv podle vynálezu jsou jak krátké sekvence DNA známé jako oligonukleotidy dlouhé obvykle 10 až 50 baží tak i delší sekvence DNA, které mohou přesahovat i délku samotné sekvence APJ. Antisense poiynukleotidy užitečné podle vynálezu jsou komplementární ke specifickým úsekům odpovídající cílové mRNA. hybridizace antisense poiynukieotidu s cílovým transkriptem je vysoce specifická, neboť je výsledkem komplementárního párování.

• · • # • · · · « · · · · »· · «· »· ·· ·

Schopnost antisense polynukleotidu hybridizovat je ovlivněna takovým parametry jako jsou délka, chemické modifikace a sekundární struktura transkriptu, které ovlivňují přístup antisense polynukleotidu ke komplementárnímu místu (viz např. Stein a kol., Cancer Research 48:2659 (1988)). Antisense polynukleotid se vnese do buňky jako segment DNA, která kóduje polynukleotid, takže polynukleotid se vytvoří až v buňce. Antisense polynukleotid se může do buňky vnést také přidáním polynukleotidu do média, ve kterém se kultivuje, takže ho buňky sama přímo přijme. Tento druhý způsob je vhodný pro kratší polynukleotidy do délky nejvýše 20 nukleotidů.

Při výběru vhodné délky pro určitý polynukleotid je třeba udržet rovnováhu, aby se získaly nejvýhodnější vlastnosti. Kratší polynukleotidy jako jsou 10-mery až 15-mery sice lépe pronikají do buňky, ale mají zase nižší specifitu. naproti tomu zase delší polynukleotidy, 20 až 30 baží dlouhé, mají vyšší specifitu, ale také sníženou kinetiku příjmu do buňky (viz např. Stein a kol., Phosphorothíoate Oligodeoxynucleotide Analogues in Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed., McMillan Press, London 1988). Přístup k cílovým sekvencím mRNA je také důležitým faktorem, takže úseky cílové mRNA vytvářející smyčky jsou často vhodným cílem.

Termín „polynukleotid v předkládaném popisu zahrnuje jak oligomerní nukleové kyseliny stejného typu, jaké se nacházejí v přírodě,jako jsou deoxyribonukleotidové a ribonukleotidové struktury DNA a RNA, tak i uměle připravené analogy, které jsou schopné se vázat na přírodní nukleové kyseliny. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být založeny na deoxyribonukleotidových a ribonukleotidových monomerech spojených fosfodiesterovými vazbami nebo analogy spojenými prostřednictvím methylfosfonátu, fosforothioátu nebo i jinou vazbou. Mohou také obsahovat monomerní jednotky, které mají změněnou strukturu báze nebo jiné modifikace, ale uchovávají si schopnost vázat se na • · • · • φ φ ·

- - ·· t * « · · φ * a * φ ·*· φφφ «φφφ · • · · Φ Φ € · · ·- Φ ·« φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· přirozeně se vyskytující DNA nebo RNA struktury. Takové polynukleotidy mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy, např. pomocí komerčně dostupných přístrojů a souprav reagencií jako např. od firmy Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA, USA).

Polynukleotidy s fosfodiesterovými vazbami jsou zvláště citlivé k nukleázám v séru nebo uvnitř buněk, a proto ve výhodném provedení polynukleotidy podle vynálezu jsou fosfothioátové nebo methylfosfonátové analogy, které se ukázaly jako rezistentní k nukleázám. Odborník je schopen vybrat i jiné druhy vazeb pro použití ve vynálezu. Modifikace mohou být také provedeny s cílem zlepšit příjem polynukleotidu do buňky a zlepšit jeho stabilitu.

V jiném provedení vynálezu je antisense polynukleotid RNA molekula připravená tak, že se expresní konstruktu do cílové buňky. Takto připravená molekula RNA byla vybrána tak, aby měla schopnost hybridizovat s APJ mRNA. Molekuly s takovou schopností mohou inhibovat translaci APJ mRNA a tím inhibovat schopnost HIV infikovat buňky, které obsahují molekulu RNA. polynukleotid se schopností hybridizovat s cílovou mRNA může inhibovat expresi odpovídajícího genového produktu různými mechanismy. Při „zastavení translace interakce polynukleotid s cílovou mRNA blokuje aktivitu ribozomálního komplexu a tudíž brání translaci mRNA na protein (Haeuptle a kol., Nucl. Acids. Res. 14:1427 (1986)). V případě fosfodiesterových nebo fosfothioátových DNA polynukleotidů může buněčná Rnáza H štěpit sekvence cílové RNA jakmile jsou hybridizovány s DNA oligomerem (Walder and Walder, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5011 (1988)). Dalším mechanisem je „zastavení transkripce, kdy některé polynukleotidy vytvářejí „triplex, tj . trojšroubovicovou strukturu s dvouřetězcovou DNA obsahující cílový gen, čímž narušují transkripci RNA činností RNA polymerázy (Giovannangeli a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 90:10013 (1993); Ebbinghaus a • · • · ···* « · · ♦ · • « · ·

I ·· ·· mohou nebo nebo eukaryotickou transkripci vložené kol., J. Clin. Invest. 92:2433 (1993)).

Ve výhodném provedení jsou APJ polynukleotidy syntetizovány standardním postupem, fosfothioátové modifikované polynukleotidy se obvykle syntetizují pomocí automatického DNA syntetizátoru, který je komerčně dostupný od různých výrobců. Tyto přístroje jsou schopny syntetizovat polynukleotidy dlouhé přibližně až 100 nukleotidů v množství řádově nanomolů. Kratší polynukleotidy syntetizované moderními metodami se purifikovat elektroforézou na polyakrylamidovém gelu chromatografií s reverzní fází (viz např. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Chapter 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) ) .

Alternativně APJ polynukleotidy ve formě antisense RNA mohou být vneseny do buňky tím, že se ezrprimuje srandardní expresní DNA vektor. APJ DNA antisense sekvence se může klonovat ze standardního plazmidu do expresních vektorů, které mají tu vlastnost, že umožňují vysokou expresi nebo účinnější expresi polynukleotidů, které nesou. tyto konstrukty přinejmenším vyžadují prokaryotickou promotorovou sekvenci, která iniciuje sekvence DNA. Výhodný expresní vektor je takový, ve kterém je indukovatelná exprese produkující vysokou hladinu produktu. Toho lze dosáhnou přidáním regulačních úseků, které poskytují v hostitelské buňce zvýšenou expresi elementů ležících „downstream od regulační sekvence (viz Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Chapter 16, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Tak např. APJ antisense expresní vektory mohou být konstruovány užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pro amplifikací vhodného fragmentu jednořetězcové cDNA z plazmidu jako je např. pRc, do kterého byla vložena cDNA APJ (Fang a kol., J. Biol. Chem. 267:25889-25897 (1992)). Syntéza polynukleotidů a způsoby <» · purifikace byly popsány např. v příručkách Sambrook a kol. and Ausubel a kol. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience 1987) (dále zkráceně jen Ausubel). Polymerázová řetězová reakce, PCR, se provádí známým způsobem, viz např. Ausubel, a také Bangham, The Polymerase Chain Reaction: Getting Started, in Protocols in Human Molecular Genetlcs (Humana Press 1991)). Navíc lze soupravy pro PCR koupit od firem jako např. Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA) a Invitrogen (San Diego, CA) . Produkty PCR se klonují do klonovacích vektorů. V tomto kontextu termín „klonovací vektor znamená molekuluu DNA, jako je např. plazmid, kosmid nebo bakteriofág, který se může replikovat autonomně v hostitelské prokaryotické buňce. Klonovací vektory obvykle obsahují menší počet restrikčních míst, do kterých může být vložena cizorodá DNA sekvence předem daným způsobem bez ztráty nutných biologických funkcí vektoru, a také obsahují markerový gen, který je vhodný pro identifikaci a selekci buněk transformovaných klonovacím vektorem. Vhodné klonovací vektory byly popsány např. v Sambrook a kol., Ausubel, a Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academie Press 1991). Klonovací vektory mohou být získány např. od firem GIBCO BRL (Gaitherburg, MD, USA), Clontech Laboratories, lne. (Palo Alto, CA, USA), Promega Corporation (Madison, WI, USA) , Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, USA), Invitrogen (San Diego, CA, USA) , a ze sbírky mikroorganismů ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA).

Výhodně se PCR produkty ligují do TA klonovacího vektoru. Metody přípravy PCR produktů s přesahujícím thymidinem nebo adeninenm jsou odborníkům známy, viz např. Ausubel, str. 15.7.1-15.7.6. Kromě toho jsou komerčně dostupné soupravy pro TA klonování, např. od firmy Invitrogen (San Diego, CA, USA) . Klonované antisense fragmenty se pak namnoží tak, že se klonovací vektor transformuje do hostitelských bakteriálních • · buněk a buňky se pak kultivují v přítomnosti vhodného antibiotika (viz např. Sambrook a kol. a Ausubel) . PCR se pak užije pro screeníng bakteriálních buněk pro vyhledání klonů s APJ v antisense orientaci. Použití PCR pro bakteriální hostitelské buňky bylo popsáno např. v Hoffinan a kol., Sequencing DNA Amplified Directly from a Bacterial Colony, in PCR Protocols: Methods And Applications, White (ed,), pages 205-210 (Humana Press 1993), a Cooper a kol., PCR-Based FullLength cDNA Cloning Utilizing the Uruversal-Adaptor/Specifíc DOS Primer-Pair Stratégy, Id. at pages 305-316). Klonované antisense fragmenty se pak vyštěpí z klonovacího vektoru a vloží se do expresního vektoru. Např. lze užít enzymů HindlII a Xbal k vyštěpení antisense fragmentu z TA klonovacího vektoru pCRTM-II (Invitrogen; San Diego, CA, USA).

Vhodné expresní vektory typicky obsahují 1) prokaryotické DNA elementy kódující bakteriální replikační počátek a markér rezistence k antibiotiku, které umožňují amplifikací a selekci expresního vektoru v bakteriálním hostiteli, 2) DNA elementy, které řídí iniciaci transkripce, jako je např. promotor a 3) DNA elementy, které řídí další zpracování transkriptu, jako je např. terminační/polyadenylační sekvence.

Pro savčího hostitele transkripční a translační regulační signály výhodně pocházejí z virových zdrojů, jako jsou adenoviry, hovězí papilloma virus, opičí viry apod., kde jsou tyto regulační signály spojeny s určitým genem, který je exprimován ve vysoké hladině. Vhodné transkripční a translační regulační signály lze také získat ze savčích genů, např. z genu pro aktin, kolagen, myosin a metalothionein. Transkripční regulační sekvence obsahují promotorový úsek dostatečný k iniciaci syntézy RNA. K vhodným eukaryotickým promotorům patří promotor myšího genu pro metalothionein I (Hamer a kol., J. Mol. Appl. Genes. 1:273 (1982)); TK promotor Herpes viru (McKnight, Cell 31:355 (1982)); časný promotor SV40 (Benoist a ·· ·»·· 44 ···· ·· • 4 · · 4 · · <í ·

4 4 4 4 4 4*44 « 44 4 4 44 444 kol., Nátuře 290:304 (1981); promotor viru Rousova sarkomu (Gorman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:6777 (1982)); a promotor cytomegaloviru (Foecking a kol., Gene 45:101 (1980)). Alternativně se může pro řízení exprese fúzního genu užít prokaryotický promotor jako je např. promotor T3 RNA polymerázy, jestliže tento prokaryotický promotor je regulován eukaryotickým promotorem (Zhou a kol., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990); Kaufman a kol., Nucl. Acids Res. 19:44-85 (1991).

Vektor, který slouží pro vnesení alespoň jednoho antisense polynukleotidu do buňky expresí z DNA je vektor pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, USA), který poskytuje vysokou hladinu konstitutivní exprese ze sekvence savčího promotoru s enhancerem (zesilovačem). Klonované APJ antisense vektory se namnoží v bakteriálním hostiteli, izolují se z buněk a analyzují se jak bylo již popsáno výše.

Jinou možností jak využít antisense sekvence je genová terapie. Vektory podobné virům, obvykle odvozené z retrovírů, jsou užitečné jako nosiče pro přenášení a expresi antisense konstruktů v lidských buňkách. Obecně jsou takové vektor nereplikující se in vivo, což vylučuje nechtěnou infekci buněk jiných než cílových. Pro tento účel existují pomocné (helper) buněčné linie, které poskytují chybějící replikační funkce in vivo a tím umožňují replikaci a sbalení antisense vektoru. Dalším opatřením proti náhodné infekci necílových buněk je použití regulačních sekvencí specifických pro cílové buňky. Pod vlivem těchto řídících sekvencí nedojed k expresi antisense konstruktu v normální tkáni.

Dvě předchozí studie ukázaly možnost využití antisense polynukleotidů k inhibici exprese růstového faktoru vázajícího heparin (Kouhara a kol., Oncogene 9:455-462 (1994); Morrision, J. Biol. Chem. 266:728 (1991). Kouhara a kol. ukázali, že růst myších buněk karcinomu prsu (SC-3) závislý na androgenu byl zprostředkován indukcí androgenem indukovaného heparin • ·· · vázajícího růstového faktoru (AIGF). Antisense polynukleotid velikosti 15 nukleotidů (15-mer) odpovídající místu iniciace translace AIGF byl hodnocen z hlediska schopnosti narušit androgenovou indukci buněk SC-3. Antisense polynukleotid v 5 pM koncentraci účinně inhiboval DNxA syntézu. Morrison ukázal, že antisense polynukleotidy zamířené proti bazickému fibroblastovému růstovému faktoru inhibovaly růst astrocytů v buněčné kultuře. Takže tím byla obecně definována možnost zaměření individuálního genového produktu v savčí buňce.

Antisense polynukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou odvozeny z otevřeného čtecího rámce APJ cDNA. Výhodně jsou zacíleny mRNA sekvence 1) v sousedství místa iniciace translace a 2) vytvářející smyčkové struktury. Statistické studie na základě velikostí lidského genomu ukázaly, že segment DNA velikostí 14 až 15 párů baží (bp) představuje v lidském genomu jedinečnou sekvenci. Pro zajištění specifičnosti zacílení na APJ mRNA je výhodné, když antisense polynukleotidy jsou dlouhé nejméně 15 nukleotidů. Nejkratší polynukleotidy přicházející v úvahu podle vynálezu odpovídají pozicím 1 až 14, 1 až 15, 1 až 16, 1 až 17, 1 až 18, 1 až 19, 2 až 16, 3 až 17 atd. ze sekvence cDNA APJ. Pozice 1 odpovídá prvnímu nukleotidu APJ kódujícího úseku.

Avšak ne každý antisense polynukleotid poskytne dostatečný stupeň inhibice nebo dostatečnou specifitu pro zacílení APJ. Tudíž je nezbytné provádět screening polynukleotidů ke stanovení jejich vhodných antisense vlastností. Výhodnými způsoby testování polynukleotidů je inhibice buněčné fúze mezi 1) buňkami obsahujícími CD4 a APJ a 2) buňkami obsahujícími env.

Podávání antisense polynukleotidů subjektu, buďto v nahé formě, jako syntetický polynukleotid nebo jako součást expresního vektoru, lze uskutečnit mnoha různými obvyklými způsoby podávání (perorálně, nazálně, bukálně, rektálně, • · 4» · · · • · • · · · · · · · · • « · · · · < · · · ··· · ♦ · · · · ♦· · «· ·· ·* · vaginálně nebo topicky) nebo subkutánní, íntramuskulární, intraperitoneální nebo intravenózní injekcí. Farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou výhodně podávány ve formě injikovatelných přípravků. Takový typický přípravek obsahuje farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo nebo ředidlo a další vhodné fyziologicky přijatelné složky. Přípravek např. obsahuje polynukleotid a 10 mg lidského sérového albuminu v 1 ml roztoku NaCI pufrovaném fosfátem. Až 700 mg antisense polynukleotidu bylo pacientovi podáno íntravenózně v průběhu 10 dnů (tj. 0,05 mg/kg/hodina) bez známek toxicity (viz Sterling, Systemic Antisense Treatment Reported, Genetic Engineering News 12:1, 28 (1992) .

K dalším farmaceuticky přijatelným excipientům patří vodné a nevodné roztoky a netoxické sloučeniny jako jsou soli, konzervační látky, pufry apod. K příkladům nevodných roztoků patří propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje a injikovatelné organické estery jako je ethyloleát. K vodným roztokům patří voda, roztoky vody a alkoholu, solné roztoky, parenterální vehíkula jako je chlorid sodný, Ringerova dextróza atd. Intravenózní vehikula obsahují tekutinu a výživové doplňky. Ke konzervačním látkám patří antimikrobiáiní činidla, anti-oxidanty, chelatační činidla a inertní plyny. Hodnota pH a přesné koncentrace jednotlivých složek přípravku se upraví standardními metodami odborníkovi známými. Výhodným farmaceutickým přípravkem pro topické podávání je kožní krém nebo transdermální náplast.

Antisense polynukleotidy nebo jejich expresní vektory mohou být také podávány jako injekce nebo olejové suspenze. K vhodným lipofilním rozpouštědlům nebo nosičům patří mastné oleje jako např. sezamový olej, nebo estery syntetických mastných kyselin jako -je ethyloleát, nebo triglyceridy. Kromě toho se antisense polynukleotidy nebo jejich vektory mohou smíchat s lipofilními nosiči jako je kterýkoliv z mnoha sterolů ·· ···· · * ···· ·· • · · ·· · · · · • · Μ · · · ·<·· včetně cholesterolu, cholátu a deoxycholové kyseliny. Výhodným sterolem je cholesterol. Vodné suspenze pro injekci mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze jako je např. sodná sůl karbxymethylcelulózy, sorbitol a/nebo dextran. Suspenze případně obsahuje také stabilizátory.

Alternativním přípravkem pro podávání antisense APJ

Liposomové váčky představují podávání antisense APJ pólynukleotidů alternativní polynukleotidů jsou líposomy. přípravek pro a jejich expresních vektorů. Líposomy jsou mikroskopické váčky obsahující jednu nebo více lipídových dvojvrstev, které obklopují vodný kompartment (viz obecné přehledy Bakker-Woudenberg a kol., Eur. J. Clín. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), and Kim, Drugs 46:618 (1993)). Líposomy jsou svým složením podobné buněčné membráně, proto je jejich podávání bezpečné a jsou biologicky degradovatelné. V závislosti na způsobu přípravy jsou líposomy jednovrstvé nebo vícevrstvé a jejich velikost je od průměru 0,01 pm do více než 10 pm. Do liposomů lze zabalit celou řadu činidel: hydrofobní činidla se rozdělí do lipidové dvojvrstvy a hydrofobní činidla do vnitřního vodného prostředí (viz např. Machy a kol., Liposomes in Cell Biology And Pharmacology (John Libby 1987), a Ostro a kol., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989). Kromě toho je možné kontrolovat terapeutickou dostupnost v liposomech enkapsulovaných činidel tím, že lze měnit velikost liposomů, počet lipídových dvojvrstev, složení lipidů a také náboj a povrchové vlastnosti liposomů. Líposomy se mohou adsorbovat skutečně na jakoukoliv buňku a pak pomalu uvolňují enkapsulované činidlo. Alternativně jsou adsorbované líposomy pohlceny endocytózou do buňky, která má schopnost fagocytózy. Po endocytóze následuje intralysosomální degradace lipidů liposomů a dojde k uvolnění enkapsulovaného činidla (Scherphof a kol., Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368 (1985). Po intravenózním podání jsou konvenční líposomy především pohlceny • · · · · · * fagocytózou retikuloendoteliálním systémem, avšak tomu lze zabránit mnoha různými metodami, např. saturací velkými dávkami liposomových částic nebo selektivní inaktivací makrofágů farmakologickými prostředky (viz Claassen a kol., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984). Navíc bylo ukázáno, že inkorporace derivátů glykolipidů nebo polyethylenglykolu do liposomových membrán vedla k významnému snížení příjmu retikuloendoteliálním systémem (Allen a kol., Biochim. Biophys. Acta. 1068:133 (1991); Allen a kol., Biochim. Biophys. Acta 1 150:9 (1993). Tyto liposomy Stealth© měly zvýšenou dobu cirkulace a zlepšené cílení na nádory u zvířat (Woodle a kol., Proč. Ameri. Assoc. Cancer Res. 33:2672 (1992); Gregoriadis a kol., Drugs 45:15 (1993).

Antisense polynukleotidy a jejich expresní vektory mohou být enkapsulovány do liposomů standardnímu technikami. Celá řada různých liposomových přípravků a způsobů syntézy jsou odborníkům známy (viz např. patenty USA č. 4,844,904, 5,000,959, 4,863,740, a 4,975,282, které jsou vloženy formou odkazu).

Liposomy mohou být připraveny tak, aby byly zacíleny na určité buňky nebo orgány tím, že se změní složení fosfolipidů nebo se do liposomů vloží receptory nebo lígandy. Tak např. protilátky specifické pro antigeny asociované s nádory mohou být vloženy do liposomů společně s antisense polynukleotidy nebo jejich expresními vektory, aby byly liposomy účinněji zacíleny na nádorové buňky (viz např. Zelphati a kol., Antisense Research and Development 3:323-338 (1993), kde se popisují imunoliposomy obsahující antisense polynukleotidy pro použití v humánní terapii).

Obecně dávkování antisense polynukleotidů nebo jejich vektorů enkapsulopvaných v liposomech závisí na takových faktorech jako je věk pacienta, jeho hmotnost, výška, pohlaví, celkový zdravotní stav a anamnéza. Rozsah dávek může být

4444 ·· 4444 44 · • · · · 4 4 4 4 4 4 • · · 4 4 4 · · · • · · ··· 4 * · · 4 • 4 · 4 4 4 4 44 4

4 44 44 44 444 rutinně stanoven užitím vhodného zvířecího modelu.

Výše popsané přístupy lze užít nejen s antisense nukleovými kyselinami, ale také s ribozymy nebo troj řetězcovými činidly pro blokování transkripce nebo translace APJ specifické mRNA, a sice buďto pro maskování mRNA antisense nukleovou kyselinou nebo troj řetězcovými činidly nebo pro štěpení mRNA ribozymem. Použití oligonukleotidu k zablokování transkripce je známo pod termínem triplexová strategie, neboť oligonukleotid vytvoří s dvoj řetězovou DNA trojšroubovicovou strukturu (triplex). Tudíž triplexová činidla mohu být připravena tak, aby rozpoznávala jedinečná místa vybraného genu (Maher, a kol., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C.,

Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991 ).

Ribozymy jsou molekuly RNA, které mají schopnost specificky štěpit jiné jednořetězcové molekuly RNA způsobem analogickým k DNA restrikčním endonukleázám. Modifikací nukleotídových sekvencí, které kódují tyto RNA, je možné připravit molekuly, které rozpoznávají specifické nukleotidové sekvence v molekule RNA a štěpí je (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988). Hlavní výhodou takového přístupu je to, že vzhledem k sekvenční specifitě ribozymů jsou inaktivovány jen mRNA s konkrétní sekvencí. Existují dva základní typy riboyzmů, a sice typ Tetrahymena (Hassellhoff, Nátuře, 334:585, 1988) a typ kladivoun. Ribozymy typu Tetrahymena rozpoznávají sekvence délky 4 baží, zatímco ribozymy typu kladivoun rozpoznávají sekvence délky 11 až 18 baží. Čím delší je rozpoznávací sekvence, tím je větší pravděpodobnost, že sekvence se vyskytuje výlučně v cílové mRNA. Tudíž ribozymy typu kladivoun jsou výhodnější než ribozymy typu Tetrahymena pro inaktivaci specifické mRNA a rozpoznávací sekvence dlouhé 18 baží jsou výhodnější než kratší rozpoznávací sekvence.

Odborník může využít předkládaný popis vynálezu bez • · ··♦·

nepřiměřeného experimentování k využití vynálezu v plném rozsahu. Následující příklady mají ilustrativní funkci a předmět vynálezu nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test fúze buněk zjišťující, zda by APJ mohl působit jako koreceptor pro HIV-1 nebo SIV.

Byl použit test fúze buněk zjišťující, zda by APJ mohl působit jako koreceptor pro HIV-1 nebo SIV. Tento test byl detailně popsán v prácí Nussbauma a kol. (J. Virol., 68, 54115422, 1994) a Ruckera a kol. (Meth. Enzymol., 288, 118-133,

1997). Efektorové buňky byly připraveny infikováním křepelčích buněk QT6 rekombinantním virem vakcinie kódujícím polymerázu T7 (vTFl.l), a pak buď transfekcí buněk plazmidem nesoucím zkoumaný obalový gen pod kontrolu promotoru T7 nebo zavedením env konstruktů pomocí rekombinantního viru vakcinie. Do efektorových buněk byly zavedeny env konstrukty SIVmac251, SIVmac239, SIVmac316, SIVmac316mut, DH12, RF, BK132, ADA,

JR-FL, IIIB a HIV-2 ST raději pomocí rekombinantního viru vakcinie než transfekcí. Cílové buňky QT6 byly připraveny pomocí přechodné transfekce plazmidy kódujícími CD4, zkoumaný koreceptor pod kontrolu promotoru CMV, a luciferáza pod kontrolu promotoru T7. Efektorové a cílové buňky byly smíchány den po transfekci a fúze buněk byla kvantifikována měřením luciferázové aktivity v buněčných lyzátech 7 až 8 hodin po smíchání.

V tomto testu má fúze buněk za následek spojení cytoplazmy a produkci luciferázy, která může být snadno kvantifikována.

·· ···· • · · · · ·

Jak je ukázáno na obrázku 1, koexprese buď CCR5 nebo CXCR4 koreceptoru s CD4 má za následek účinnou fúzi zprostředkovanou R5 a X4 Env proteiny, v příslušném pořadí. R5-X4 env proteiny, jako například HIV-1 89.6, zprostředkovaly fúzi s buňkami nesoucími buď CCR5 nebo CXCR4 koreceptor. Fúze nebyla pozorována, když byl CD4 exprimován samotný. Když byl APJ koexprimován s CD4 v buňkách QT6, fúze buněk byla zprostředkována R5-X4 env proteinem 89.6 a několika X4 env proteiny v hladinách > 70 % hladin pozorovaných u CXCR4 (obrázek 1). U jednoho primárního X4 env proteinu, ZR001.3, byla fúze s buňkami exprimujícími APJ účinnější než s CXCR4. Většina R5 env proteinů zprostředkovávala fúzi s buňkami exprimujícími APJ, ale pouze ve velmi nízkých hladinách relativně k hladinám pozorovaným u CCR5 (obrázek 1 a tabulka 1). Ale ADA a primární izolát TH 22-4 projevovaly fúzi zprostředkovanou APJ na zhruba polovině úrovně pozorované při tom, když jako virový koreceptor sloužil CCR5. HIV-2 ST env protein také zprostředkovával velmi neúčinnou fúzi s buňkami exprimujícími jak CD4 tak APJ. Je pozoruhodná schopnost APJ podporovat fúzi u několika X4 a R5-X4 vírových env proteinů téměř tak účinně jako hlavní koreceptory, protože většina jiných alternativních HIV-1 koreceptorů typicky podporuje fúzi buněk mnohem méně účinně než CCR5 nebo CXCR4.

Byla také zkoumána schopnost xAPJ podporovat fúzí zprostředkovanou panelem SIV obalových proteinů. Na rozdíl od HIV-1, oba M- a T-tropní kmeny SIV používají jako koreceptor CCR5, zatímco CXCR4 buď není SIV používán nebo je používán vzácně (Chen a kol., J. Virol., 71, 2705-2714, 1997, Edinger a kol., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 94, 4005-4010, 1997, a Marcon a kol., J. Virol., 71, 2522-2527,

1997). Kromě toho mohou být jako koreceptory použity orphan receptory STRL33, GPR15 a GPR1, a to jak T- tak M-tropními SIV kmeny (Deng a kol., Nátuře, 388, 296300, 1997, a Farzan a kol., ·· ···· ·· ···· ·· ·· ··· · · · · ··· ··· · · · · • · · · · · · · · •· · ·· ·· ·· ·

J. Exp. Med., 186, 405-411, 1997). V předkládaných pokusech bylo zjišťováno, že APJ podporoval fúzi zprostředkovanou několika M- a T-tropními SIV env proteiny na úrovních, které byly méně účinné než ty pozorované u CCR5, s výjimkou Mtropního SIVmac316 a varianty tohoto env proteinu (316mut), které účinně používaly APJ jako koreceptor v testech fúze buněk (obrázek 2 a tabulka 1). Kromě toho APJ typicky podporoval fúzi méně účinně než orphan receptory GPR1, GPR15/BOB a STRL33/Bonzo. Nakonec, protože bylo dříve určeno, že mnoho kmenů SIV může infikovat buňky způsobem nezávislým na CD4, ale závislým na CCR5 (Edinger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 94, 14742-14747, 1997), byla testována schopnost HIV-1, HIV-2 a SIV env proteinů zprostředkovat fúzi s buňkami exprimujícími samotný APJ. Výsledky ukázaly, že aktivita APJ koreceptoru byla naprosto jasně závislá na CD4, protože buňky exprimující samotný APJ nepodporovaly fúzi buněk se žádným s testovaných env proteinů.

Tabulka 1

ENV	Tropismus	CCR5	CXCR4	APJ
DH12	D	+++	+++	+
RF	(D)	4-4-4-	4_4_4_	-
YU2	M	4_4_4_	-	+
JR-FL	M	+++	-	-
SF162	M	+++	-	+
91US005.il		+ + +	-	+
93BR019.10		+++	-	+
92UG031.7		+++	-	-
93BR029.2		+++	-	-
UG37-8		+ + +	-	+
TH 22-4		+++	-	++
RW20-5		+++	-	+

·· ···· ·· ···» ·· · • · » · · • · · · · · « ·· ·· ·· ···

SIVmacBK28		XXX	-	+
SIV/17E-C1	M	+++	-	+
SIVmaclAlí	M	+++	-	+
SIVagmSabl.4		+++	-	+
SIVsm62A	T	+++	-	+
SIVsm62D	T	+++		+
SIVsm543-3	M	+ + +	-	++
SIVsm543-B10		+++	-	+
SIVsmPBj6		+++	-	+

Příklad. 2

Zjišťování schopnosti APJ podporovat virovou infekci

Byla zjišťována schopnost APJ podporovat virovou infekci, aby se přesněji určila schopnost APJ působit jako koreceptor. První testovací systém používal lucíferázový reportérovy- vírový test, ve kterém byly různé env proteiny pseudotypizovány na kostře luciferázového reportérového viru. Lucíferázové reportérové viry byly připraveny transfekcí lidských buněk HEK 293 plazmidem, který exprimoval env pod kontrolu promotoru CMV nebo SV40, a plazmidem obsahujícím provírový genom s ínaktívním env genem a íucíferázovým genem na místě nef (např. NL4-3 luciferázová virová kostra (pNL-Luc-E^_R^_) ) (Chen a kol., J. Viroi., 68, 654-660, 1994, a Connor a kol., Virology, 206, 935944, 1995). Cílové buňky pro infekci byly HEK 293 nebo buňky

CCCS s CD4 a koreceptory zavedenými kaicíumfosfátovou transfekcí. Infekce byly prováděny v médiích obsahujících 8 pg/ml DEAE dextranu. Buňky byly lyžovány 3 až 4 dny po infekci resuspendováním v 0,5% NP-40 v PBS a testovány na iucíferázovou aktivitu.

>· ···· ·· »·Λ· • 4

9 9 • · 4 • · · «

·· « « · · · ·

9 9 9 9

9 · 4 4 · « • 4 4 4 · ·

444» 444

Bohužel, většina env proteinů, které účinně katalyzovaly fúzi s buňkami exprímujícími CD4 a APJ (jako HIV-1 89.6), nemohla být úspěšně pseudotypizována. Vírové env proteiny, které by mohly být pseudotypizovány, jak bylo možné soudit pomocí infekce CCR5 nebo CXCR4 pozitivních buněk, buď selhaly infikovat buňky exprímující CD4 a APJ koreceptor nebo tak činily neúčinně (obrázek 3). V některých případech env proteiny, které zprostředkovávaly fúzi s buňkami exprímujícími APJ na intermediárni úrovni, selhaly v podpoře virové infekce. Například vírový pseudotyp s ADA env proteinem neínfíkoval APJpozitivní buňky, dokonce i když buňky exprímující ADA env protein zprostředkovávaly fúzi s APJ-pozitivními buňkami z poloviny účinně, jako s CCR5-pozitivnímí buňkami. Důvody těchto na testu závislých nesrovnalostí nejsou jasné, ale mohou odrážet účinnost, se kterou mohly být pseudotypizovány různé env proteiny.

Byl použit další testovací systém, aby se testovaly obalové proteiny, které nemohly být pseudotypizovány, ale které s buňkami které byly požadovaným byly schopné exprímuj ícími transfetovány účinně zprostředkovat fúzí buněk APJ. Cílové buňky HEK 293, plazmidy exprímujicimi CD4, koreceptorem a luciferázou pod kontrolu virového LTR, byly infikovány intaktním HlV-i 89.6 nebo HIV-1 IIIB (obrázek 4). Luciferázová aktivita byla měřena 2 dny po infekci. Výsledky ukázaly, že HIV-1 89.6 infikoval APJ pozitivní buňky téměř tak účinně, jako buňky exprimujicí CXCR4. HIV-1 IIIB (HxB3) také infikoval APJ pozitivní buňky na úrovni o hodně vyšší než pozadí.

Nakonec byl také použít vstupní test založený na PCR pro určení, zda by APJ mohl podpořit infekci pomoci HIV-1 89.6 a IIIB. Buňky QT6 trvale' exprimujicí lidský CD4 a přechodně exprimujicí požadovaný koreceptor byly infikovány s 50 ng p24 víru ošetřeného DNAázou, bez přítomností buněk (bezbuněčný • · c · · β · · * * ♦ • 9 · ·· ·· * · virový preparát). Po dvou dnech byly buňky promyty a lyžovány a byly detekovány HIV-1 specifické LTR DNA sekvence pomocí PCR s použitím primeru LTR-plus/LTR-mínus:

5'-ACAAGCTAGTACCCAGTTGAGCC-3' (sekvence id. č. 4),

5'CACACACTACTTGAAGCACTCA-3^r (sekvence id. č. 5).

Produkty byly rozděleny elektroforézou na 2% agarózovém gelu, přeneseny na membránu Hybond N+ (Amersham) a detekovány s použitím soupravy 3'-End Labeling Biotin Kit (DuPont; sonda 5'ATCTACAAGGGACTTTCCCGC-3' (sekvence id. č. 6), což bylo následováno expozicí. Jak je ukázáno na obrázku 5, oba HIV-1 IIIB a 89.6 mohly vstoupit do buněk QT6 exprimujících jak CD4 tak APJ, ačkoliv vstup byl méně účinný než u hlavních koreceptorů HIV-1.

Příklad 3

Vyšetřování distribuce APJ v lidském mozku analýzou Northern blot

APJ byl původně klonován z lidské genomové DNA a analýza tkání laboratorního potkana s použitím sondy založené na potkaním homologu odkryla, že APJ je v mozku hodně exprimován (0'Dowd a kol., Gene, 136, 355-360, 1993). Bylo také ukázáno, že APJ je exprimován v některých oblastech lidského mozku (Matsumoto a kol., Neurosci. Lett., 219, 119-122, 1996).

Protože APJ je účinně používán některými virovými kmeny jako koreceptor, byla distribuce APJ v lidském mozku dále vyšetřována analýzou Northern blot.

Membrány obsahující póly A⁺ RNA z různých oblastí lidského mozku byly získány od firmy Clontech. Byla použita souprava Prime-It II Random Primer Labeling Kit (Stratagene, La Jolla, CA) ke značení sondy cDNA s a-³²P-dATP (3 000 Ci/mmol) s použitím Klenowova enzymu. cDNA sonda značená a-^JZP byla ···· • « · · · · » « · · β · 9 · « ··· ···· · 1 •« t ·« * * · · purifikována s použitím kolon Quick Spin (Boehringer Mannheim, Indianapoiis, IN) . Membrány byly hybridizovány přes noc s 10⁷ cpm značené sondy v hybridizačním pufru obsahujícím 25mM Na/Na₂P0₄, 50mM Trís pH 7,4, 6x SSPE, 0.1% SDS, 100 pg/ml jednovláknové DNA a Ix Denhardtův roztok. Membrány byly promyty dvakrát v Ix 25 SSPE, 0.1 % SDS ve 42°C po dobu 10 minut a roztok byl změněn na promývací roztok s vysokou stringencí 0.2x SSPE, 0.1% SDS ve 42°C po 10 minut. Membrána pak byla exponována proti stínítku Fuji Imaging po dobu 4 hodin. Obrazy ze stínítka byly zachyceny na přístroji BASlOOOMac Bio-Imaging Analyzer (Fuji) a zpracovány pomocí programu Mac BAS. Obrazy byly vytištěny na digitální tiskárně Pictography 3000 (Fuji).

Výsledky ukázaly, že vysoké hladiny transkriptů APJ se vyskytovaly v corpus callosum, páteřní míše a prodloužené míše. Nižší hladiny transkriptů APJ byly detekovány v dalších oblastech lidského mozku (obrázek 6). V periferních tkáních byl transkrípt APJ snadno detekován ve slezině, ale nevyskytoval se v PBL (obrázek 7). Nižší hladiny transkriptů byly detekovány v jiných periferních tkáních.

Aby se prozkoumala distribuce APJ buňkách obecně používaných pro propagaci HIV-1, byla prováděna analýza pomocí RT-PCR na velkém počtu buněčných linií a některých primárních buněčných typech. Byla vytvořena buněčná linie U87, která trvale exprimuje APJ a použita jako pozitivní kontrola.

Primární buňky byly izolovány takto. Mononukleární buňky lidské krve (PBMC) byly izolovány z krve zdravých dobrovolníků s použitím Fikol-Hypaque, zbaveny monocytů periodickou adherencí na umělou hmotu, stimulovány 3 dny fytohemaglutíninem (PHA-L, 5 pg/ml, Sigma), a pak resuspendovány s interleukinem 2 (20 U/ml, Boehringer Mannheim Biochemicals). RNA byla izolována po 3 dnech PHA stimulace' a také po 1 týdnu v IL-2. Monocyty byly purifikovány od PBMC pomocí selektivní adherence na želatinu, po které následovala adherence na umělou hmotu, a pak · · · · · «

udržovány ve tkáňové kultuře, aby se umožnila diferenciace na makrofágy pocházející z monocytů (MDM), jak popsáno dříve (Collman a kol., J. Exp. Med., 170, 1149-1163, 1989). RNA byla izolována z nediferenciovaných monocytů okamžitě po purifikaci a z MDM po 1 týdnu v kultuře.

Pro izolaci celkové buněčné RNA pro RT-PCR, bylo resuspendováno 5-10 x 10⁶ buněk v 1 ml Trizolu (GIBCO-BRL) a zpracováno podle doporučení výrobce. Celková RNA pak byla ošetřena s 1 μΐ (10-50 jednotek) DNAse (RNAse-free) (Boehringer Mannheim) na 10 gg RNA 30 min ve 37°C v přítomnosti 5mM MgCl₂ s následnou inaktivací v 65°C po 10 minut v přítomnosti 5mM EDTA, RNA koncentrace byla vypočítána na základě OD₂₆₀ · Pro vyhodnocení charakteru RNA exprese byl použit systém Titan RT-PCR (Boehringer Mannheim). Byly použity specifické vnitřní primery po směru a v protisměru, které měly za následek amplifikovaný produkt o velikosti 481 párů baží. Použité primery byly: přímý primer 5'-TACACAGACTGGAAATCCTCG-3' (sekvence id. č. 7) a reverzní primer 5'-TGCACCTTAGTGGTGTTCTCC3' (sekvence id. č. 8). Aby se kontrolovalo, zda není vzorek RNA kontaminován genomovou DNA i navzdory ošetření DNAse, byly všechny vzorky RNA také amplifikovány enzymovým mixem Titan, ve kterém byla zničena aktivita enzymu pro provádění RT, ale ne pro provádění PCR, ošetřením v 95°C po dobu 10 minut (bylo zjištěno, že tento inaktivační protokol eliminuje schopnost amplifikovat RNA templát, ale ne DNA templát) . V každé reakci RT-PCR byla zahrnuta RNA izolovaná z U87-APJ trvale transfekovaných buněk jako pozitivní RNA kontrola a plazmidová DNA byla zahrnuta jako druhá pozitivní kontrola.

Výsledky vyhledávání distribuce APJ v buněčných liniích a buněčných typech ukázaly, že APJ byl exprimován v buňkách C8166, 'ale APJ-specifické reakční produkty nebyly detekovány v jiných vyšetřovaných buněčných liniích, včetně buněk Jurkat, Hut7 8, CEMxl74 a PM1. Navíc exprese APJ nebyla detekována • · · · · · v PBMC stimulovaných PHA, PHA s IL-2 nebo anti-CD3 a IL-2 nebo v monocytech (obrázek 8) .

Co se polypeptídů, či makrofázích pocházejících monocytů týče dalších protilátek apod.

aspektů nukleových kyselin, se odkazuje na standardní učebnice molekulární biologie, výzkumu proteinů a imunologie. (Viz např. Davis a kol., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, lne., New York, 1986; Hames a kol., Nucleic Acid Hybridization, IL,Press, 1985, Sambrook a kol., Molecular Cloning, Current Protocols in Molecular Biology, vyd. F.M. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, lne; Current Protocols in Human Genetlcs, vyd. Nicholas C. Dracopoli a kol., John Wiley & Sons, lne., Current Protocols in Protein Science, vyd. John E. Coligan a kol., John Wiley & Sons, lne., Current Protocols in Immunology, vyd. John E. Coligan a kol., John Wiley & Sons, lne.).

Celý popis všech patentových přihlášek, patentů a publikací zde citovaných je zahrnut formou odkazu.

Z výše uvedeného popisu může odborník snadno zjistit základní vlastnosti tohoto vynálezu a bez odchýlení se od původní vynálezecké myšlenky může provést různé změny a modifikace vynálezu, aby ho přizpůsobil pro různé použití a podmínky.

• · · ·

SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (199!··(1338) <400> 1 caggagacag ccttcctcca ggctctggag aacccacagg cagctcctcc tgagtgctgg 60 gaaggactct gggcatcttc agcccttctt actctctgag gctcaagcca gaaattcagg 120 ctgcttgcag agtgggtgac agagccacgg agctgctgtc cctgggaccc tctgcccgtc 180

ttctctccac tccccagc

atg gag gaa ggt ggt

gat Asp

ttt Phe

gac Asp

aac Asn

tac Tyr 10

tat Tyr

231

Met 1

Glu

Glu Gly Gly 5

ggg

gca

gac

aac

cag

tet

gag

tgt

gag

tac

aca

gac

tgg

aaa

tcc

tcg

279

Gly

Ála

.Asp

Asn

Gin

Ser

Glu

Cys

Glu

Tyr

Thr

Asp

Trp

Lys

Ser

Ser

15

20

25

ggg

gcc

ctc

atc

cct

gcc

atc

tac

atg

ttg

gtc

ttc

ctc

ctg

ggc

acc

327

Gly

Ala

Leu

Ile

Pro

Ala

Ile

Tyr

Met

Leu

Val

Phe

Leu

Leu

Gly

Thr

30

35

40

acg

gga

aac

ggt

ctg

gtg

ctc

tgg

acc

gtg

ttt

cgg

age

age

cgg

gag

375

Thr

Gly

Asn

Gly

Leu

Val

Leu

Trp

Thr

Val

Phe

Arg

Ser

Ser

Arg

Glu

45

50

55

aag

agg

cgc

tca

gct

gat

atc

ttc

att

gct

age

ctg

gcg

gtg

gct

gac

423

Lys

Arg

Arg

Ser

Ala

Asp

Ile

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ala

Asp

60

65

70

75

ctg

acc

ttc

gtg

gtg

acg

ctg

ccc

ctg

tgg

gct

acc

tac

acg

tac

cgg

471

Leu

Thr

Phe

Val

Val

Thr

Leu

Pro

Leu

Trp

Ala

Thr

Tyr

Thr

Tyr

Arg

80

85

90

gac

tat

gac

tgg

ccc

ttt

ggg

acc

ttc

ttc

tgc

aag

ctc

age

age

tac

519

Asp

Tyr

Asp

Trp

Pro

Phe

Gly

Thr

Phe

Phe

Cys

Lys

Leu

Ser

Ser

Tyr

95

100

105

ctc

atg

ctc

gtc

aac

atg

tac

gcc

age

gtc

ttc

tgc

ctc

acc

ggc

ctc

567

Leu

Met

Leu

Val

Asn

Met

Tyr

Ala

Ser

Val

Phe

Cys

Leu

Thr

Gly

Leu

• · · · · · • · * · · · • ·

110

115

120

agc

ttc

gac

cgc

tac

ctg

gcc

atc

gtg

agg

cca

gtg

gcc

aat

gct

cgg

615

Ser

Phe

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ala

lle

Val

Arg

Pro

Val

Ála

Asn

Ala

Arg

125

130

135

ctg

agg

ctg

cgg

gtc

agc

ggg

gcc

gtg

gcc

acg

gca

gtt

ctt

tgg

gtg

663

Leu

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Trp

Val

140

145

150

155

ctg

gcc

gcc

ctc

ctg

gcc

atg

cct

gtc

atg

gtg

tta

cgc

acc

acc

ggg

711

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu

Ala

Met

Pro

Val

Met

Val

Leu

Arg

Thr

Thr

Gly

160

165

170

gac

ttg

gag

aac

acc

act

330

gtg

cag

tgc

tac

atg

cac

tac

tcc

atg

759

Asp

Leu

Glu

Asn

Thr

Thr

Lys

Val

Gin

Cys

Tyr

Met

A.sp

Tyr

Ser

Met

175

180

185

gtg

gcc

act

gtg

agc

tca

gag

tgg

gcc

tgg

gag

gtg

ggc

ctt

ggg

gtc

807

Val

Ala

Thr

Val

Ser

Ser

Glu

Trp

Ala

Trp

Glu

Val

Gly

Leu

Gly

Val

190

195

200

tcg

tcc

acc

acc

gtg

ggc

ttt

gtg

gtg

ccc

ttc

acc

atc

atg

ctg

acc

8 55

Ser

Ser

Thr

Thr

Val

Gly

Phe

Val

Val

Pro

Phe

Thr

lle

Met

Leu

Thr

205

210

215

tgt

tac

ttc

ttc

atc

gcc

caa

acc

atc

gct

ggc

cac

ttc

cgc

aag

gaa

903

Cys

Tyr

Phe

Phe

lle

Ala

Gin

Thr

lle

Ala

Gly

His

Phe

Arg

Lys

Glu

220

225

230

235

cgc

atc

gag

ggc

ctg

cgg

aag

cgg

cgc

cgg

ctg

ctc

agc

atc

atc

gtg

951

Arg

lle

Glu

Gly

Leu

A.rg

Lys

Arg

Arg

Arg

Leu

Leu

Ser

lle

lle

Val

240

245

250

gtg

ctg

gtg

gtg

acc

ttt

gcc

ctg

tgc

tgg

atg

ccc

tac

cac

ctg

gtg

999

Val

Leu

Val

Val

Thr

Phe

Ala

Leu

Cys

Trp

Met

Pro

Tyr

His

Leu

Val

255

260

265

aag

acg

ctg

tac

atg

ctg

agc

agc

ctg

ctg

cac

tgg

ccc

tgt

gac

ttt

1047

Lys

Thr

Leu

Tyr

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Trp

Pro

Cys

A.sp

Phe

270

275

280

gac

ctc

ttc

ctc

atg

aac

atc

ttc

ccc

tac

tgc

acc

tgc

atc

agc

tac

1095

Asp

Leu

Phe

Leu

Met

Asn

lle

Phe

Pro

Tyr

Cys

Thr

Cys

lle

Ser

Tyr

285

290

295

gtc

aac

agc

tgc

ctc

aac

ccc

ttc

ctc

tat

gcc

ttt

ttc

gac

ccc

cgc

1143

Val

Asn

Ser

Cys

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Tyr

Ala

Phe

Phe

Asp

Pro

Arg

300

305

310

315

ttc

cgc

cag

gcc

tgc

acc

tcc

atg

ctc

tgc

tgt

ggc

cag

agc

agg

tgc

1191

Phe

Arg

Gin

Ala

Cys

Thr

Ser

Met

Leu

Cys

Cys

Gly

Gin

Ser

Arg

Cys

320

325

330

gca

ggc

acc

tcc

cac

agc

agc

agt

ggg

gag

aag

tca

gcc

agc

tac

tet

1239

Ala

Gly

Thr

Ser

His

Ser

Ser

Ser

Gly

Glu

Lys

Ser

Ala

Ser

Tyr

Ser

335

340

345

tcg

ggg

cac

agc

cag

ggg

ccc

ggc

ccc

aac

atg

ggc

aag

ggt

gga

gaa

1287

• * • · · · • · ·

Ser Gly His

Ser

Gin

Gly

Pro Gly Pro Asn Met Gly Lys Gly Gly Glu

350

355

360

cag

atg

cac

gag

aaa

tcc

atc

ccc

tac

agc

cag

gag

acc

ctt

gtg

gtt

1335

Gin

Met

His

Glu

Lys

Ser

Ile

Pro

Tyr

Ser

Gin

Glu

Thr

Leu

Val

Val

365 370 375 gac tagggctggg agcagagaga agcctggcgc cctcggccct ccccggcctt 1388

Asp

380 tgcccttgct ttctgaaaat caggtagtgt ggctactcct tatcctatgc acatccttta 1448 actgtcccct gattct 1464 <210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met 1

Glu Glu

Gly Gly Asp 5

Phe A.sp Asn Tyr Tyr Gly Ala Asp Asn

Gin

10

15

Ser

Glu

Cys

Glu

Tyr

Thr

Asp

Trp

Lys

Ser

Ser

Gly

Tkla

Leu

Ile

Pro

20

25

30

Ala

Ile

Tyr

Met

Leu

Val

Phe

Leu

Leu

Gly

Thr

Thr

Gly

Asn

Gly

Leu

35

40

45

Val

Leu

Trp

Thr

Val

Phe

Arg

Ser

Ser

Arg

Glu

Lys

Arg

A.rg

Ser

Ala

50

55

60

Asp

Ile

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ala

Asp

Leu

Thr

Phe

Val

Val

65

70

75

80

Thr

Leu

Pro

Leu

Trp

Ala

Thr

Tyr

Thr

Tyr

Arg

Asp

Tyr

Asp

Trp

Pro

85

90

95

Phe

Gly

Thr

Phe

Phe

Cys

Lys

Leu

Ser

Ser

Tyr

Leu

Met

Leu

Val

Asn

100

105

110

Met

Tyr

Ala

Ser

Val

Phe

Cys

Leu

Thr

Gly

Leu

Ser

Phe

Asp

Arg

Tyr

115

120

125

Leu

Ala

Ile

Val

Arg

Pro

Val

Ala

Asn

Ala

Arg

Leu

Aurg

Leu

Arg

Val

130

135

140

Ser

Gly

Ala

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Trp

Val

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

Ala

Met

Pro

Val

Met

Val

Leu

Arg

Thr

Thr

Gly

Asp

Leu

Glu

Asn

Thr

165

170

175

Thr

Lys

Val

Gin

Cys

Tyr

Met

Asp

Tyr

Ser

Met

Val

Ala

Thr

Val

Ser

180 185 190

Ser Glu Trp Ala Trp Glu Val Gly Leu Gly Val Ser Ser Thr Thr Val • · ·»·· • · · · » · · • · · · · · ·· ·« ·· ·

195 200 205

Gly Phe Val

Val

Pro

Phe

Thr Ile Met Leu Thr Cys

Tyr Phe Phe

Ile

210

215

220

Ala

Gin

Thr

Ile

Ala

Gly

His

Phe

Arg

Lys

Glu

Arg

Ile

Glu

Gly

Leu

225

230

235

240

Arg

Lys

Arg

Arg

Arg

Leu

Leu

Ser

Ile

Ile

Val

Val

Leu

Val

Val

Thr

245

250

255

Phe

Ala

Leu

Cys

Trp

Met

Pro

Tyr

His

Leu

Val

Lys

Thr

Leu

Tyr

Met

260

265

270

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Trp

Pro

Cys

Asp

Phe

Asp

Leu

Phe

Leu

Met

275

280

285

Asn

Ile

Phe

Pro

Tyr

Cys

Thr

Cys

Ile

Ser

Tyr

Val

Asn

Ser

Cys

Leu

290

295

300

Asn

Pro

Phe

Leu

Tyr

Ala

Phe

Phe

Asp

Pro

Arg

Phe

Arg

Gin

Ala

Cys

305

310

315

320

Thr

Ser

Met

Leu

Cys

Cys

Gly

Gin

Ser

Arg

Cys

A-la

Gly

Thr

Ser

His

325

330

335

Ser

Sex*

Ser

Gly

Glu

Lys

Ser

Ala

Ser

Tyr

Ser

Ser

Gly

His

Ser

Gin

340

345

350

Gly

Pro

Gly

Pro

A.sn

Met

Gly

Lys

Gly

Gly

Glu

Gin

Met

His

Glu

Lys

355

360

365

Ser

Ile

Pro

Tyr

Ser

Gin

Glu

Thr

Leu

Val

Val

Asp

370

375

380

<210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Asn Tyr Tyr Gly 1 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 acaagctagt acccagttga gcc <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens £1

<400> 5 cacacactac ttgaagcact ca <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atctacaagg gactttcccg c <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo <400> 7 tacacagact sapiens ggaaatcctc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tgcaccttag tggtgttctc

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (původní)

   1. Rekombinantní eukaryotická buňka transformovaná polynukleotidem kódujícím polypeptid APJ nebo polynukleotidem kódujícím polypeptid CD4, přičemž buňka koexprimuje polypeptidy APJ a CD4.
2. 2. Rekombinantní eukaryotická buňka transformovaná polynukleotidem kódujícím polypeptid APJ nebo polynukleotidem kódujícím polypeptid CD4, přičemž buňka koexprimuje polypeptidy APJ a CD4 .
3. 3. Rekombinantní eukaryotická buňka podle nároku 1, kterážto buňka je trvale transformovaná.
4. 4. Rekombinantní eukaryotická buňka podle nároku 2, kterážto buňka je trvale transformovaná oběma polynukleotídy.
5. 5. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kterážto buňka je lidská buňka.
6. 6. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kterážto buňka je jiná než lidská buňka.
7. 7. Protilátka, která se specificky váže na extracelulární doménu APJ, kterážto protilátka inhibuje infekci HIV cílové buňky, která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4.
8. 8. Protilátka, která se specificky váže na extracelulární doménu APJ, kterážto protilátka inhibuje membránovou fúzi mezi první buňkou současně exprimující polypeptidy APJ a CD4 a druhou buňkou exprimující protein env z HIV.

   44 4444 44 ···· ·· • 4 4 4 4···

   444 «444 44

   44 4 44 44 44
9. 9. Protilátka podle nároku 7 nebo 8, která je monokolonální protilátka.
10. 10. Protilátka podle nároku 9, kterážto protilátka rozpoznává epitop obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je částí první extracelulární domény APJ.
11. 11. Protilátka podle nároku 10, kde aminokyselinová sekvence odpovídající části první extracelulární domény APJ obsahuje aminokyselinovou sekvenci Asn-Tyr-Tyr-Gly (sekvence id. č. 3).
12. 12. Protilátka podle nároku 9, kterážto protilátka rozpoznává epitop obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je částí druhé extracelulární domény APJ.
13. 13. V podstatě purifikovaný peptidový fragment APJ, kterýžto peptíd inhibuje infekci HIV cílové buňky, která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4.
14. 14. V podstatě purifikovaný peptidový fragment APJ, kterýžto peptíd inhibuje buněčnou fúzí mezí první buňkou současně exprimující polypeptidy APJ a CD4 a druhou buňkou exprimující protein env z HIV.
15. 15. V podstatě purifikovaný peptidový fragment APJ podle nároku 13 nebo 14, kterýžto peptidový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je částí první extracelulární domény APJ.
16. 16. V podstatě purifikovaný peptidový fragment APJ podle nároku 13, kde -aminokyselinová sekvence odpovídající části první extracelulární domény APJ obsahuje aminokyselinovou sekvenci Asn-Tyr-Tyr-Gly (sekvence id. č. 3) .

    • φφ · φφφ φφφ φφφφ • · · φφφφ · φ • Φ φ φ· φφ φ ·
17. 17. V podstatě purifikovaný peptidový fragment APJ podle nároku 13 nebo 14, kterýžto peptidový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je částí druhé extracelulární domény APJ.
18. 18. Způsob identifikace sloučeniny, která moduluje interakci mezi virem HIV a receptorem APJ vyznačující se tim, že obsahuje inkubaci první lidské buněčné linie, která koexprimuje polypeptidy APJ a CD4, s druhou lidskou buněčnou linií, která exprimuje protein env v podmínkách, které podporují buněčnou fúzi, a to za přítomnosti či absence testované sloučeniny, a stanovení toho, zda přítomnost testované sloučeniny inhibuje buněčnou fúzi mezi první lidskou buněčnou linií a druhou lidskou buněčnou linií.
19. 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že fúze se stanoví detekcí reportérové molekuly.
20. 20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že reportérové molekula je vybrána ze skupiny obsahující radioizotop, fluorescenční sloučeninu, bioluminiscenční sloučeninu, chemiluminiscenční sloučeninu, činidlo chelatující kov nebo enzym.
21. 21. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že reportérové molekula je β-galaktosidáza nebo luciferáza.
22. 22. Způsob identifikace sloučeniny, která moduluje interakci mezi virem HIV a receptorem APJ vyznačující se tím, že obsahuje inkubaci první lidské buněčné linie, která exprimuje polypeptidy APJ a CD4, s testovacím virem nesoucím protein env, a to za přítomnosti či absence testované φφ φφφ* • φ ·φφ φ • •Φ · · · φ φ • ΦΦ φφφ φφφφ • ·β φφφφ φφ • Φ φ φφ φφ φφ ’ 55 sloučeniny, a stanovení toho, zda přítomnost testované sloučeniny inhibuje infekci lidské buněčné linie testovacím virem.
23. 23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že infekce se stanoví detekcí reportérové molekuly.
24. 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že reportérova molekula je vybrána ze skupiny obsahující radioizotop, fluorescenční sloučeninu, bioluminiscenční sloučeninu, chemiluminiscenční sloučeninu, činidlo chelatující kov nebo enzym.
25. 25. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že reportérové molekula je β-galaktosidáza nebo luciferáza.
26. 26. Způsob inhibice infekce HIV cílové buňky exprimující polypeptid APJ a CD4 vyznačující se tím, že se cílová buňka přivede do kontaktu s účinným množstvím činidla vázajícího nebo blokujícího APJ.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že činidlo je protilátka anti-APJ nebo její fragment vázající epitop.
28. 28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální nebo polyklonální protilátka.

    29 že . Způsob podle nároku 26 vyznaču jící podáním se t subj ektu. i m, uvedení do kontaktu se provede in vivo 30 . Způsob podle nároku 26 v y z n a č u j ící se t i m, že činidlo je peptidový fragment APJ .

    ·· ··♦· «· ····
29. 31. Způsob léčení subjektu majícího nemoc související s HIV spojenou s expresí APJ vyznačující se tím, že se subjektu podává činidlo potlačujícího APJ.
30. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že činidlo je protilátka anti-APJ.
31. 33. Použití podle nároku 31 vyznačující se tím, že činidlo je antisense polynukleotid, který hybridizuje s polynukleotidem APJ.
32. 34. Způsob podle nároku 31 vyznačuj í c í činidlo se vnáší do buňky pomocí přenašeče.

    s e tím, že
33. 35. Způsob přenašečem podle nároku 31 v y je vektor.

    nač u jící se tím, že
34. 36. Použití terapeuticky účinného množství protilátky anti-APJ nebo peptidového fragmentu APJ pro výrobu léku k léčení subjektu, u kterého je riziko infekce HIV nebo související nemoci, podáváním léku.
35. 37. Použití podle nároku 36, kdy subjektem je fetus.
36. 38. Transgenní živočich vyjma člověka, který má fenotyp charakterizovaný expresí polypeptidu APJ a polypeptidu CD4, který není pro živočicha přirozený, přičemž tento fenotyp je způsoben transgenem obsaženým v somatických buňkách a zárodečných buňkách živočicha a transgen obsahuje polynukleotid kódující polypeptid APJ a polynukleotid kódující polypeptid CD4 .