JP2002335975A - 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ポリペプチドおよびそのＤＮＡの提供。 【解決手段】 本発明は、鎮痛ペプチドに類似構造を有
することを特徴とする新規ポリペプチドおよびその塩な
どに関する。 【効果】 本発明のタンパク質（ポリペプチド）、その
部分ペプチドまたはそれらの塩、およびそれらをコード
するＤＮＡは、抗体および抗血清の入手、本発明のタン
パク質（ポリペプチド）の発現系の構築、同発現系を用
いた医薬品候補化合物のスクリーニングなどとして用い
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒト由来の新規ペプ
チド、その部分ペプチドおよびそれらをコードするＤＮ
Ａなどに関する。特に鎮痛ペプチドに類似の構造を有す
ることを特徴とする新規のペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】１９７５年に最初の鎮痛ペプチドとして
Ｍｅｔ−エンケファリンとＬｅｕ−エンケファリンが単
離されて以来、現在までに、共通してＴｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ／Ｌｅｕのアミノ酸配列を持つ
多くの鎮痛ペプチドが単離同定されている。これらのペ
プチドはプレプロオピオメラノコルチン（ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２９７巻、３３５−３３９頁（１９
８２））、プレプロエンケファリンＡ、あるいはプレプ
ロエンケファリンＢの部分構造として同定されている
（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９７巻、４３１−４
３４頁（１９８２）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３
０６巻、６１１−６１４頁（１９８３）））。これらの
ペプチドは細胞膜上の特異的な受容体（オピエート受容
体）に結合することによりその情報を細胞に伝える。こ
れまでこのような鎮痛ペプチドの多くは、その生理活性
に基づいて組織抽出物等から単離されその構造が決定さ
れてきた。また最近では受容体を利用して組織抽出物等
からさまざまな生理活性物質やホルモンを単離すること
もなされるようになってきた。その一例としてオーファ
ン受容体ＯＲＬ−１の内因性リガンドとして同定された
ノシセプチン（nociceptin）が知られておりノシセプチ
ン前駆体から切り出されるペプチド、ノシセプチン（no
ciceptin：FGGFTGARKSARKLANQ）も鎮痛ペプチドと考え
られている。

【０００３】一方、最近のゲノムやｃＤＮＡの配列解析
の急速な進展により、膨大なＤＮＡ情報が入手可能にな
った。これらのＤＮＡの中にはこれまで未知であった生
理活性物質をコードするものが含まれているものと推定
される。しかしながらゲノムＤＮＡ配列やExpressed Se
quence Tag（ＥＳＴ）から、未知の生理活性物質を探そ
うとしても、類似した配列はまったく無関係なタンパク
の遺伝子や非翻訳領域のＤＮＡ配列にも見出され、さら
には偽遺伝子の存在の可能性もあるため、それらの中か
らどれが本当の生理活性物質であるかどうかを確定する
ことは困難であった。鎮痛ペプチドの受容体としては現
在までに、三種類δ、κ、μの受容体さらにnociceptin
受容体ＯＲＬ−１の四種類が知られている。これら四種
類はすべて七回膜貫通受容体でありその細胞内シグナル
はｃＡＭＰの低下であることが知られている。また四種
類の鎮痛ペプチド前駆体から切り出される多くの鎮痛ペ
プチドはこれらの受容体に交差反応性を示すことが知ら
れている。一方これらの鎮痛ペプチドの生理活性に関し
てはさまざまな報告がある。まず知覚機能としては鎮痛
作用が知られている。また運動機能および行動において
は無動（カタトニー状態）、角膜反射の消失、摂食行
動、グルーミングの亢進、学習効果の促進、性行動誘発
抑制が知られている。さらに内分泌機能においてはプロ
ラクチン分泌の促進、ＧＨ分泌の促進、ＬＨ分泌の抑
制、ＴＳＨ分泌の抑制、ＡＣＴＨ分泌の調節、バソプレ
ッシン分泌の調節、インスリン分泌の促進、ＭＳＨ作用
の増強等が知られている。その他にも自律機能において
は体温調節、血圧調節、呼吸調節、胃液分泌、胃運動、
腸の蠕動、睡眠などに関係していることが報告されてい
る。以上のように鎮痛ペプチドに関しては多くの非常に
重要な生理作用が報告されている。しかしプロオピオメ
ラノコルチン、プレプロエンケファリンＡ、あるいはプ
レプロエンケファリンＢの部分構造として同定されてい
る鎮痛ペプチド、さらにはオーファン受容体ＯＲＬ−１
の内因性リガンドとして同定されたノシセプチン（noci
ceptin）以外に哺乳動物では鎮痛ペプチドは知られてい
ない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、未知のヒト由
来の鎮痛ペプチドを見出し、それを利用した新たな生理
活性物質を含有してなる疾患の予防、治療、診断薬の開
発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者たちは上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プライマー
を作製し、ヒト精巣poly(A)⁺RNAを鋳型とするＲＴ−Ｐ
ＣＲにより、新規な塩基配列を有するｃＤＮＡをクロー
ニングすることに成功した。そして、本発明者らは、得
られたｃＤＮＡにコードされているポリペプチドが有用
な鎮痛ペプチドの前駆体であることを見出し、これらの
知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果本発明を完成
するにいたった。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００２１０７（配列
番号：５）に記載の塩基配列を有するＤＮＡを除く、上
記（１）記載のタンパク質または上記（２）記載の部分
ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有す
るＤＮＡ、（４）配列番号：２で表わされる塩基配列を
有する上記（３）記載のＤＮＡ、（５）上記（４）記載
のＤＮＡを含有する組換えベクター、（６）上記（５）
記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（７）上記（６）記載の形質転換体を培養し、上記
（１）記載のタンパク質または上記（２）記載の部分ペ
プチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、ま
たは上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩の製造方法、（８）
上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上
記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（９）上記（３）記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１０）鎮痛作用を有する上記（８）または上記（９）
記載の医薬、（１１）上記（１）記載のタンパク質もし
くはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対
する抗体、（１２）上記（１）記載のタンパク質もしく
はその塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用い
ることを特徴とするレセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法、（１３）上記（１）記
載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩を含有するレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング用キット、および（１
４）上記（１２）記載のスクリーニング方法または上記
（１３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
るレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、（１
５）上記（１４）記載のレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストを含有してなる医薬、（１６）鎮痛作用を
有する上記（１５）記載の医薬、（１７）上記（１４）
記載のレセプターアゴニストの有効量を哺乳動物に投与
することを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法、（１８）鎮
痛剤を製造するための上記（１４）記載のレセプターア
ゴニストの使用、（１９）上記（１）記載のタンパク質
もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチド
もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩
の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動
物の鎮痛方法、（２０）鎮痛剤を製造するための上記
（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩の使用、（２１）上記（３）
記載のＤＮＡの有効量を哺乳動物に投与することを特徴
とする哺乳動物の鎮痛方法、（２２）鎮痛剤を製造する
ための上記（３）記載のＤＮＡの使用等を提供する。

【０００７】さらには、本発明は、（２３）（ｉ）レセ
プターまたはその部分ペプチドに、上記（１）記載のタ
ンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩を接触させた場合と、（ii）レセプターまたは
その部分ペプチドに、上記（１）記載のタンパク質もし
くはその塩、または上記（２）項記載の部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩お
よび試験化合物を接触させた場合において、該レセプタ
ーまたはその部分ペプチドと上記（１）項記載のタンパ
ク質もしくはその塩、または上記（２）項記載の部分ペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩との結合量を測定し、比較することを特徴とする
上記（１２）記載のスクリーニング方法、（２４）
（ｉ）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分
に、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩を接触させた場合と、
（ii）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分
に、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を接
触させた場合において、該レセプターを含有する細胞ま
たはその細胞膜画分と上記（１）記載のタンパク質もし
くはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との
結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（１
２）項記載のスクリーニング方法、（２５）（ｉ）レセ
プターを含有する細胞に、上記（１）記載のタンパク質
もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチド
もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩
を接触させた場合と、（ii）レセプターを含有する細胞
に、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を接
触させた場合において、該レセプターを含有する細胞に
おけるレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度
の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパ
ク質のリン酸化、ｐＨの低下など）などの活性を測定し
て、比較することを特徴とする第（１２）項記載のスク
リーニング方法、

【０００８】（２６）上記（１２）および上記（２３）
〜（２５）のいずれかに記載のスクリーニング方法また
は上記（１３）記載のスクリーニング用キットを用いて
得られるレセプターアゴニストを含有してなる医薬、
（２７）鎮痛剤である上記（２６）記載の医薬、（２
８）上記（１２）および上記（２３）〜（２５）のいず
れかに記載のスクリーニング方法または上記（１３）項
記載のスクリーニング用キットを用いて得られるレセプ
ターアンタゴニストを含有してなる医薬、（２９）上記
（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）項記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩とレセプターとの結合後の
細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、（３０）（ｉ）レセプタ
ーを含有する細胞に、上記（１）記載のタンパク質もし
くはその塩、または上記（２）項記載の部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を
接触させた場合と、（ii）レセプターを含有する細胞
に、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）項記載の部分ペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を
接触させた場合において、上記（１）記載のタンパク質
もしくはその塩、または上記（４）記載の部分ペプチド
もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩
とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を測定
し、比較することを特徴とする上記（２９）記載のスク
リーニング方法、（３１）上記（１）記載のタンパク質
もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチド
もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩
を含有する上記（１）項記載のタンパク質もしくはその
塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩とレセプター
との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット、

【０００９】（３２）上記（２９）〜（３０）記載のス
クリーニング方法または上記（３１）記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られる上記（１）記載のタンパ
ク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促
進または阻害する化合物またはその塩等を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質は、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（好ましく
は、鎮痛ペプチド様タンパク質）である。本発明のタン
パク質は、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モルモッ
ト、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、ウマ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、
脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細
胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存
在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅
球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳
皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、
肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋
肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指腸）、血管、
心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵
巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタン
パク質であってもよく、また合成タンパク質であっても
よい。

【００１１】配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配
列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好
ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列などがあげられる。

【００１２】配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する本発明のタンパク質としては、上記のとお
り配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性
を有するタンパク質などが好ましい。以下、本明細書に
おいて、「配列番号：１で表されるアミノ酸と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質」または「配列番号：１で表されるアミノ酸と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質またはその塩」を単に「本発明のタンパク質」と略称
する場合がある。実質的に同質の活性としては、例え
ば、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の
変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛活性（作用）な
どがあげられる。実質的に同質とは、それらの活性が性
質的に同質であることを示す。したがって、レセプター
を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、
ｐＨの低下など）、鎮痛活性（作用）などが同等（例、
約０.５〜２倍程度）であることが好ましいが、これら
の活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異
なっていてもよい。また、本発明のタンパク質には、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２
個以上（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ
酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２０個
程度、好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数個
（１または２個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜
９個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含
有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されている
場合、その欠失または置換の位置としては、特に限定さ
れない。

【００１３】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ル基のＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロ
ピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6ア
ルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−
ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、
フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくは
α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキ
ル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステル
として汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用い
られる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシ
ル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カ
ルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも
のも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステ
ルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用
いられる。さらに、本発明のタンパク質には、上記した
タンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ
基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_{1- 6}アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生
体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン
酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例
えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、イ
ンドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ
る。

【００１４】本発明のタンパク質の部分ペプチド（以
下、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の
部分ペプチドのみならず、そのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩を総称して、本発明のタンパク質の部
分ペプチドと称する場合がある）としては、前記した本
発明のタンパク質と同質の活性、例えば、レセプターを
介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡ
ＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐ
Ｈの低下など）、鎮痛活性（作用）などを有するペプチ
ドであれば何れのものであってもよい。具体的には、配
列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１９番目（Ａｓ
ｐ）〜第７３番目（Ｌｙｓ）のアミノ酸配列を有する部
分ペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
第５０番目（Ｔｙｒ）〜７３番目（Ｌｙｓ）のアミノ酸
配列を有する部分ペプチドなどが好ましく用いられる。

【００１５】さらに、本発明の部分ペプチドとしては、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一
のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有
する部分ペプチドが好ましい。実質的に同質の活性とし
ては、例えば、レセプターを介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛活性
（作用）などがあげられる。実質的に同質とは、それら
の活性が性質的に同質であることを示す。したがって、
レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛活性（作用）が同
等（例、約０.５〜２倍程度）であることが好ましい
が、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量
的要素は異なっていてもよい。また、これら本発明の部
分ペプチドには、本発明のタンパク質の（拮抗）阻害型
である、すなわち、本発明のタンパクの有する活性を阻
害する活性を有するものも含まれる。

【００１６】さらに、本発明の部分ペプチドには、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と約４０％以上、好
ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さ
らに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有するタンパク質の部分ペプチドが用い
られ、より具体的には、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０個程
度、好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数個
（１または２個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または
２個以上（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個
程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０
個程度、好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分部分ペ
プチドなども含まれる。

【００１７】また、本発明の部分ペプチドのＣ末端は通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト(−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明のタンパク質
のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエス
テル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは前記と同意義を示す）であっ
てもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記し
た部分ペプチドにおいて、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基など
のＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側
が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタ
ミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基
（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール
基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基
（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_{1- 6}アシル
基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合し
たいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれ
る。本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩と
しては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま
しい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、
塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有
機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、
マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、
蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質また
はその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞、組織また
は血漿から公知のタンパク質の精製方法によって製造す
ることもできるし、後述するタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製
造することができる。また、後述のタンパク質合成法ま
たはこれに準じて製造することもできる。ヒトや温血動
物の細胞、組織または血漿から製造する場合、ヒトや温
血動物の細胞または組織のホモジナイズ上清および血漿
を硫安沈澱、エタノール沈澱、酸抽出、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、レクチンカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせ
ることにより精製単離することができる。

【００１８】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏ
ｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることがで
きる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能
基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質
の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮
合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出す
と同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分
子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパ
ク質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得
する。

【００１９】上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、
タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いるこ
とができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボ
ジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル
カルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミ
ノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これら
による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢ
ｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添
加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステル
あるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミ
ノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に添加することがで
きる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられ
る溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうること
が知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリド
ン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチル
スルホキシド、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、ピリジ
ン、クロロホルム、ジオキサン、塩化メチレン、テトラ
ヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、Ｎ-メチ
ルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などが用い
られる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され
得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約
−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化さ
れたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられ
る。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不
十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を
繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。
反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、
無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応ア
ミノ酸をアセチル化することができる。原料のアミノ基
の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリー
アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニ
ル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−
Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフ
ルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェ
ニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆ
ｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基の保護基とし
ては、例えばアルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペ
ンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオク
チル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジル
エステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシ
ベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベン
ズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジルオ
キシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカル
ボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが用いられ
る。

【００２０】セリンの水酸基は、例えば、エステル化ま
たはエーテル化によって保護することができる。このエ
ステル化に適する基としては、例えば、アセチル基など
の低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル
基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル
基などの炭素から誘導される基などが用いられる。ま
た、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例え
ば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂ
ｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。ヒスチ
ジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏ
ｓ、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニ
ル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、
Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。原料のカルボキシ
ル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸
無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、
ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノー
ル、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコー
ル、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ-ヒドロキシ
スクシミド、Ｎ-ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）
とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活
性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミ
ドが用いられる。保護基の除去（脱離）方法としては、
例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在
下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水
素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン
酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによ
る酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチル
アミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、
また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用い
られる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０
℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例
えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタ
クレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、
１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール
のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒ
スチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４
−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去
され、トリプトファンのインドール保護基として用いら
れるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、
１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。

【００２１】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手
段から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別
の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側
にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基
のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク
質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応
の詳細については上記と同様である。縮合により得られ
た保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべて
の保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることがで
きる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使し
て精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパ
ク質のアミド体を得ることができる。タンパク質のエス
テル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス
テルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所
望のタンパク質のエステル体を得ることができる。

【００２２】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る
部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の
〜に記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られるタンパク
質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩
に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、
公知の方法によって遊離体に変換することができる。

【００２３】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
ｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tran
scriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−
ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡ、配列番号：２で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性、例
えば、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度
の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパ
ク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、血管新生活性（作
用）、細胞増殖・遊走・分化活性（作用）などを有する
タンパク質をコードするＤＮＡなどが用いられる。配列
番号：２で表わされる塩基配列とハイブリダイズできる
ＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩
基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より
好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２４】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的に
は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００２５】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸
配列の第１９番目（Ａｓｐ）〜第７３番目（Ｌｙｓ）の
アミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列の
第５５〜２１９番目、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列の第５０番目（Ｔｙｒ）〜７３番目（Ｌｙｓ）の
アミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列
の第１４８〜２１９番目の塩基配列を有するＤＮＡなど
が用いられる。

【００２６】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ド（以下、本発明のタンパク質およびその部分ペプチド
を単に本発明のタンパク質と称する場合がある）をコー
ドするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の
タンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する
合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記
ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅する
か、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明
のタンパク質の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片
もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリ
ダイゼーションによって選別することができる。ハイブ
リダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook e
t al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載
の方法などに従って行なうことができる。また、市販の
ライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載
の方法に従って行なうことができる。クローン化された
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制
限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用す
ることができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳
終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有し
ていてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加するこ
ともできる。本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡの発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。

【００２７】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどがあげられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。

【００２８】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タ
ンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属
菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・
シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合
は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シ
グナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・
シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動
物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル
配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子
・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このように
して構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
を含有するベクターを細胞に導入することによって形質
転換体を製造することができる。

【００２９】宿主としては、例えばエシェリヒア属菌、
バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが
用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１
〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１
９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えばバチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２
４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵
母としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，Ｎ
Ａ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサ
ッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パ
ストチス（Pichia pastoris）などが用いられる。昆虫
細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合
は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperd
a cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭ
Ｇ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細
胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena ac
rea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰ
Ｖの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ
細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例え
ば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以
上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro）,13,
213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫としては、
例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチ
ャー（Nature）、３１５巻、５９２頁（１９８５）〕。

【００３０】動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯ
Ｓ−１、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆ
ｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記）、Ｌ細胞、ミエ
ローマ細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細
胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが用い
られる。これらの中でもＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ
^-）細胞、２９３細胞などが好ましい。エシェリヒア属
菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイ
ズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gen
e），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従
って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換する
には、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），
１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って
行なわれる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７(１９９１)に記載の方
法に従って行なわれる。昆虫細胞や昆虫を形質転換する
には、例えばバイオ／テクノロジー（Bio/Technolog
y）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なう
ことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、
細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール，２６
３−２６７(１９９５)（秀潤社発行）に記載の方法に従
って行なうことができる。

【００３１】発現ベクターの細胞への導入方法として
は、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham F. L. and v
an der Eb A. J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-46
7（1973）〕、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法〔Sompayrac
L.M. and Danna K.J. プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）7
8, 7575-7578, 1981〕、リポフェクション法〔Malone
R.W. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc.Natl. Acad. Sci. USA）86, 6077-608
1, 1989〕、電気穿孔法〔Nuemann E. et al. エンボ・
ジャーナル（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等があげ
られる。このようにして、本発明のタンパク質をコード
するＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形
質転換体を得ることができる。なお、動物細胞を用い
て、本発明のタンパク質を安定に発現させる方法として
は、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体
に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方
法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にし
て形質転換体を選択することができる。さらに、このよ
うに選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、
繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタン
パク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ること
ができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして
用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株
を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発
明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させ
て、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。上
記の形質転換体を本発明のタンパク質またはその部分ペ
プチドをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養
し、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを生
成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を製造することがで
きる。

【００３２】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられ
る。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など
を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Exp
eriments in Molecular Genetics），４３１−４３３，
Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく
働かせるために、例えば３β−インドリルアクリル酸の
ような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア
属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４
０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。

【００３３】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)」や０.
５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０
（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加
える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、
培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.
C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非働化し
た１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用
いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するの
が好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、
必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞であ
る形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約
５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス
（Science）、１２２巻、５０１(１９５２)〕、ＤＭＥ
Ｍ培地〔ヴィロロジー（Virology）、８巻、３９６(１
９５９)〕、ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Th
e Journal of the American Medical Association）１
９９巻、５１９(１９６７)〕、１９９培地〔プロシージ
ング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロ
ジカル・メディスン（Proceeding ofthe Society for t
he Biological Medicine）、７３巻、１(１９５０)〕な
どが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７２時間行な
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。特に、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカ
ーとして用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析
ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好まし
い。

【００３４】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用
い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタン
パク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、
^TMと略称する場合がある）などの界面活性剤が含まれて
いてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合に
は、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清
とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培
養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク
質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて
行なうことができる。これらの公知の分離、精製法とし
ては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、
透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の
差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなど
の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグ
ラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、疎水クロ
マトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かく
して得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場
合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産
生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後に適
当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に
修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去すること
もできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、
特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより
測定することができる。

【００３５】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタ
ンパク質と略記する場合がある）を認識し得る抗体であ
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れ
であってもよい。本発明のタンパク質に対する抗体（以
下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明の
タンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清
の製造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。用い
られる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際して
は、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗
体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に
脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合し
た標識剤の活性を測定することにより行なうことができ
る。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス
などがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２
０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００
〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加さ
れ、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０
分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を
実施できる。

【００３６】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着さ
せた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培
養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した
抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマ
ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタン
パク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが用いられる。モノクローナル抗体の選
別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうこ
とができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうこ
とができる。選別および育種用培地としては、ハイブリ
ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いて
も良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％
の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０
％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体
価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。 （ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。

【００３７】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（タンパク質抗原）とキャリアータンパク質との複合体
をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に
温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリ
クローナル抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行
なうことにより製造することができる。温血動物を免疫
するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質
との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類および
キャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋
させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ
ば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい
が、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリ
ン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約
０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で結合させる
方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプ
リングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グ
ルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エ
ステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性
エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物
に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通
常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なう
ことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免
疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液か
ら採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗
体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にし
て測定できる。抗体の分離精製は、上記のモノクローナ
ル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法
に従って行なうことができる。

【００３８】本発明のタンパク質または部分ペプチドを
コードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列を
有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のタンパク
質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａの塩基配列またはその一部の塩基配列に相補的な塩基
配列を有し、該タンパク質または部分ペプチドの発現を
抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその
誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであって
もよい。相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のタン
パク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡの全塩基配列または部分塩基配列と約４０％以
上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％
以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する
塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡまた
はｍＲＮＡの全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ
末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コ
ドン付近の塩基配列など）と約４０％以上、好ましくは
約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好
ましくは約９０％以上の相同性を有するアンチセンスＤ
ＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公
知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができ
る。

【００３９】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩は、例えば、レセプターを介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下な
ど）、鎮痛作用などの作用を有している。したがって、
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩はさまざまな用途に用いることができる。以下に、本
発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
（本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡ（本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）、本発明のタンパク質に対する抗体
（本発明の抗体と略記する場合がある）およびアンチセ
ンスＤＮＡの用途を説明する。

【００４０】（１）各種疾病の治療・予防剤などの医薬 本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、鎮痛剤等
の医薬として有用である。本発明のタンパク質または本
発明のＤＮＡを上記の医薬として使用する場合は、例え
ば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリ
キシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あ
るいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との
無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口
的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質あるいは
ＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、
ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に
認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和す
ることによって製造することができる。これら製剤にお
ける有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られ
るようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合
は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って投与することができる。錠剤、カ
プセル剤などに混和することができる添加剤としては、
例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラ
ビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦
形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよ
うな膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油
などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させ
るなどの通常の製剤実施に従って処方することができ
る。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブ
ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソ
ルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）
などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコー
ル（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例え
ば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
ど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油
性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、
リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに
充填される。

【００４１】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなどの哺乳動物）に
対して投与することができる。該タンパク質またはＤＮ
Ａの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき有効成分を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その
１回投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法など
によっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人
（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成
分を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。

【００４２】（２）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、温血哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モ
ルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、
イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡの異常（遺伝子異
常）を検出することができる。したがって、本発明のＤ
ＮＡは、本発明のタンパク質が関与する各種疾病の遺伝
子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上
記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダ
イゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ge
nomics）、第５巻、８７４〜８７９頁（１９８９年）、
プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Procee
dings of theNational Academy of Sciences of US
A）、第８６巻、２７６６〜２７７０頁（１９８９
年））などにより実施することができる。

【００４３】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識す
ることができるので、被検液中の本発明のタンパク質の
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使
用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発
明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパ
ク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化さ
れた本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴と
する被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および
標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反
応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する
ことを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法を提供する。上記（ii）の定量法においては、一方の
抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、
他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗
体であることが望ましい。

【００４４】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、モノクローナル抗体と称する場合
がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえる
ほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。こ
れらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、ま
た、抗体分子のＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ
画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のタ
ンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではな
く、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対
応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学
的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原
を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測
定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例え
ば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およ
びサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性
の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ま
しい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤とし
ては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光
物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例え
ば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕など
が、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
がそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００４５】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラスなどが用いられる。サンドイッチ法
においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反
応させ（１次反応）、さらに標識化したモノクローナル
抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標
識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタ
ンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次
反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよ
いし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不
溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明の
サンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法にお
いては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノ
クローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次
反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次
反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部
を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好まし
くはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いら
れる。

【００４６】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降
物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ
ーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００４７】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunoch
emical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunoche
mical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemi
cal Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同
書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monocl
onal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))
（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照するこ
とができる。以上のようにして、本発明の抗体を用いる
ことによって、本発明のタンパク質を感度良く定量する
ことができる。

【００４８】さらには、本発明の抗体を用いて本発明の
タンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタ
ンパク質が関与する各種疾病の診断を行なうことができ
る。さらに、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体
中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用
することができる。さらに、本発明のタンパク質を精製
するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画
中の本発明のタンパク質を検出するために使用すること
ができる。

【００４９】（４）医薬候補化合物のスクリーニング （Ａ）レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
クリーニング方法 本発明のタンパク質と該レセプターを用いたリガンド・
レセプター結合アッセイ系を構築することによって、本
発明のタンパク質と同様の作用を有する医薬候補化合物
のスクリーニングや、本発明のタンパク質の作用を阻害
する医薬候補化合物のスクリーニングを行なうことがで
きる。すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用い
るレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法を提供する。より具体的には、本発明は、
（１）（ｉ）レセプターまたはその部分ペプチドに、本
発明のタンパク質を接触させた場合と（ii）レセプター
またはその部分ペプチドに、本発明のタンパク質および
試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特
徴とするレセプターアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング方法、および（２）（ｉ）レセプターを
含有する細胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパ
ク質を接触させた場合と（ii）レセプターを含有する細
胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパク質および
試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特
徴とするレセプターアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング方法を提供する。

【００５０】具体的には、本発明のスクリーニング方法
においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、
レセプターまたはレセプターを含有する細胞等に対する
本発明のタンパク質の結合量、レセプターを介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、
細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下な
ど）、鎮痛作用などを測定して、比較することを特徴と
するものである。より具体的には、本発明は、（１ａ）
（ｉ）標識した本発明のタンパク質を、レセプターまた
はその部分ペプチドに接触させた場合と、（ii）標識し
た本発明のタンパク質および試験化合物を、レセプター
またはその部分ペプチドに接触させた場合における、標
識した本発明のタンパク質の該レセプターまたはその部
分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、
比較することを特徴とするレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、（２ａ）（ｉ）
標識した本発明のタンパク質を、レセプターを含有する
細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）
標識した本発明のタンパク質および試験化合物を、レセ
プターを含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させ
た場合における、標識した本発明のタンパク質の該細胞
またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較す
ることを特徴とするレセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法、および（２ｂ）（ｉ）
本発明のタンパク質を、レセプターを含有する細胞に接
触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質および試験
化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合
における、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺
濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用な
どを測定し、比較することを特徴とするレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提
供する。

【００５１】上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリー
ニング方法において、レセプターに結合して、本発明の
タンパク質とレセプターとの結合を阻害する化合物がレ
セプターアゴニストまたはアンタゴニストとして選択で
きる。上記（２ｂ）のスクリーニング方法において、レ
セプターに結合し、該レセプターを介する細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）を
促進する活性、鎮痛作用などを有する化合物をレセプタ
ーアゴニストとして選択することができ、一方、該細胞
刺激活性を抑制する活性を有する化合物をレセプターア
ンタゴニストとして選択することができる。また、上記
の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法におい
て、本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害す
る活性が認められた試験化合物の中で、レセプターを介
する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐ
Ｈの低下など）、鎮痛作用などの活性を有する化合物を
レセプターアゴニストとして選択することができ、これ
らの活性を有しない化合物をレセプターアンタゴニスト
として選択することができる。

【００５２】本発明のスクリーニング方法に用いられる
レセプターとしてはヒトあるいは温血動物由来の鎮痛ペ
プチド受容体（δ、κ、μ）などが好ましく用いられ
る。これらのレセプターおよび本発明のタンパク質に対
するレセプターは、公知のタンパク質の精製方法に従っ
て入手することができ、また、公知の遺伝子工学的手法
に従って該レセプターをコードするＤＮＡをクローニン
グした後、前記した本発明のタンパク質の発現方法に従
って目的とするレセプターを入手することもできる。該
レセプターの部分ペプチドとしては、全長レセプターを
適当に切断して得られる部分ペプチドを用いることがで
きる。標識した本発明のタンパク質としては、例えば、
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た本発明のタンパク質などを用いることができる。

【００５３】本発明のスクリーニング方法に用いられる
上記レセプターを含有する細胞としては、前記した本発
明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞とし
て列記したものと同様のものを用いることができるが、
なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含
有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用い
て、公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質
の発現方法などに従って製造することができる。また、
上記レセプターを含有する細胞として、ＣＬ８細胞株
（ボーン（BONE）, 18, 159-169, 1996）、ＯＫ細胞株
（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（AM
ERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY）253, E221-E227, 198
7）などの株化細胞を用いることもできる。本発明のス
クリーニング方法において、レセプターを含有する細胞
を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリ
ンなどで固定化することができる。固定化方法は、公知
の方法に従って行うことができる。

【００５４】上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画
分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる
細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方
法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞
を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン
（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フ
レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから
噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の
分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの
遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細
胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短
時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高
速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０
分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜
画分中には、発現したレセプターまたは本発明のタンパ
ク質と、細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成
分が多く含まれる。該レセプターを含有する細胞やその
細胞膜画分中のレセプターの量は、１細胞当たり１０³
〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子で
あるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当
たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度
なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、
同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。

【００５５】試験化合物としては、例えばタンパク質、
非タンパク質性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞
抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられ、
これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の
化合物であってもよい。本発明のスクリーニング方法に
おいて、本発明のタンパク質とレセプターとの反応は、
通常約３７℃で数時間行なうことができる。具体的に
は、上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方
法を実施するには、まず、本発明のレセプターを含有す
る細胞またはその細胞膜画分、あるいはレセプターまた
はその部分ペプチドを、スクリーニングに適したバッフ
ァーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。
バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約
６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファー
などの、本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻
害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非
特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅ
ｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキ
シコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えること
もできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリ
ガンドの分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチ
ン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（タンパク
質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤
を添加することもできる。一方、細胞が固定化細胞の場
合、培養器に固定化させたまま、つまり細胞を生育させ
た状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラホルムア
ルデヒドで固定した細胞を用いて、本発明のタンパク質
とレセプターを結合させることができる。

【００５６】この場合、該緩衝液は培地やハンクス液な
どが用いられる。そして、０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該
レセプター溶液に、一定量（例えば、２０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００００００ｃ
ｐｍ）の標識した本発明のタンパク質（例えば、〔¹²⁵
Ｉ〕で標識した本発明のタンパク質）を添加し、同時に
１０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特
異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本
発明のタンパク質を加えた反応チューブも用意する。反
応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０
分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行なう。
反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファ
ーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性
（例えば、〔¹²⁵Ｉ〕の量）を液体シンチレーションカ
ウンターまたはγ−カウンターで測定する。濾過には、
マニホールドやセルハーベスターを用いることができる
が、セルハーベスターを用いることが効率を上げるため
に望ましい。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀)
から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀
−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−Ｎ
ＳＢ）が、例えばカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）の５０％以
下になる試験化合物をアゴニストまたはアンタゴニスト
候補化合物として選択することができる。

【００５７】また、上記（２ｂ）のスクリーニング方法
を実施するためには、レセプターを介する細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、
鎮痛作用などの活性を公知の方法あるいはそれに準じる
方法に従って測定することができる。具体的には、ま
ず、レセプターを含有する細胞をマルチウェルプレート
等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前
もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な
バッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時
間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を
回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量
する。細胞刺激活性の指標とする物質（（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度
の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパ
ク質のリン酸化、ｐＨの低下など）の生成が、細胞が含
有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素
に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。
また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォル
スコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた
細胞に対する産生抑制作用として検出することができ
る。

【００５８】鎮痛作用の測定は公知の方法に準じて測定
することができる。上記（２ｂ）のスクリーニング方法
において、試験化合物を添加した際にレセプターを含有
する細胞が、該レセプターを介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用
の上昇などを示した場合、該試験化合物をレセプターア
ゴニスト候補化合物として選択することができる。一
方、試験化合物を添加した際にレセプターを含有する細
胞が、該レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃
度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タン
パク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用の低下
などを示した場合、該試験化合物をレセプターアンタゴ
ニスト候補化合物として選択することができる。

【００５９】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、好ましくはさらに、レセプターを含有
する細胞もしくはその細胞膜画分等を含有するものであ
る。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次
のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 レセプター標品 本発明のタンパク質に対するレセプターなどを含有する
ＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継
代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養
したもの。 標識した本発明のタンパク質標品 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩を〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標
識したもの。 本発明のタンパク質標準液 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む
ＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保
存したもの。

【００６０】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養した組換え型レセ
プターを含有するＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで
２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加
える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、５ｎＭの標識した本発明のタンパク質を５μｌ加
え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知る
ためには試験化合物のかわりに１０^-4Ｍの本発明のタン
パク質を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識した本発明のタンパク質を０．
５ｍｌの０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４
ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合す
る。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式で求める。なお、〔¹²⁵Ｉ〕で標識
されている場合は、液体シンチレーターと混合すること
なしに直接ガンマーカウンターで測定できる。

【００６１】 ＰＭＢ＝１００×（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ） ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の結合量 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００６２】以上のとおり、本発明のタンパク質はレセ
プターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニン
グするための試薬として有用である。本発明のスクリー
ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら
れる化合物またはその塩は、本発明のタンパク質とレセ
プターとの結合を阻害する化合物であり、具体的には、
該レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用などの作用を
有する化合物またはその塩（いわゆる、レセプターアゴ
ニスト）、あるいは該レセプターを介する細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、
鎮痛作用を有しない化合物またはその塩（いわゆる、レ
セプターアンタゴニスト）である。

【００６３】レセプターアゴニストは、本発明のタンパ
ク質が有する生理活性の全部または一部を有しているの
で、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用
である。例えば、鎮痛剤などの医薬として有用である。
一方、レセプターアンタゴニストは、本発明のタンパク
質が有する生理活性の全部または一部を抑制することが
できるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬
として有用である。上記レセプターアンタゴニストまた
はレセプターアゴニストを上記の医薬として使用する場
合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経
口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し
得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の
形で非経口的に使用できる。例えば、上記レセプターア
ンタゴニストまたはレセプターアゴニストを生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な用量が得られるようにするもので
ある。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添
加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、ト
ラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロ
ースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アル
ギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウム
のような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのよう
な甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーの
ような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセ
ルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよ
うな液状担体を含有することができる。注射のための無
菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡
麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解ま
たは懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方する
ことができる。注射用の水性液としては、例えば、生理
食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤
は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例え
ば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ト
リ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど
の哺乳動物）に対して投与することができる。該レセプ
ターアゴニストの投与量は、症状などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に通常成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき有効成分を約０.１ｍｇ〜
１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する
場合は、その１回投与量は投与対象、対象組織、症状、
投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形
では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日
につき有効成分を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。該レセプターアンタゴニストの
投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に通常成人（６０ｋｇとして）においては、
一日につき有効成分を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回
投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法などによ
っても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（体
重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を
約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０
ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静
脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場
合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することがで
きる。

【００６４】（Ｂ）本発明のタンパク質を分解するプロ
テイナーゼ阻害剤のスクリーニング方法およびスクリー
ニング用キット 本発明のタンパク質またはその塩は生体内に存在するプ
ロテイナーゼによって切断され、失活すると考えられ
る。したがって、本発明のタンパク質および本発明のタ
ンパク質を分解するプロテイナーゼを用いることによっ
て、本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼを阻
害する活性を有する化合物を選択することができる。該
プロテイナーゼを阻害する活性を有する化合物は、生体
内における本発明のタンパク質の失活を防ぐことによ
り、細胞間接触に依存しない発明のタンパク質の活性を
促進することができるので、例えば、鎮痛剤などの医薬
として期待できる。すなわち、本発明は、本発明のタン
パク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質を
分解するプロテイナーゼを阻害する活性を有する化合物
またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

【００６５】より具体的には、本発明は、（１）（ｉ）
本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼと本発明
のタンパク質とをインキュベートした後、レセプターを
含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタン
パク質を分解するプロテイナーゼおよび試験化合物と本
発明のタンパク質とをインキュベートした後、レセプタ
ーを含有する細胞に接触させた場合との比較を行なうこ
とを特徴とする本発明のタンパク質を分解するプロテイ
ナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。具体的には、本発明のス
クリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合に
おける、例えば、レセプターを介する細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作
用などの活性を測定して、比較することを特徴とするも
のである。

【００６６】より具体的には、本発明は、（１ａ）
（ｉ）本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼと
本発明のタンパク質とをインキュベートした後、レセプ
ターを含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明
のタンパク質を分解するプロテイナーゼおよび試験化合
物と本発明のタンパク質とをインキュベートした後、レ
セプターを含有する細胞に接触させた場合における、レ
セプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸
遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用などの活性を測定
し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質を分
解するプロテイナーゼを阻害する活性を有する化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法を提供する。

【００６７】上記のスクリーニング方法において、該レ
セプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸
遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用などの活性を促進
する試験化合物を本発明のタンパク質を分解するプロテ
イナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩と
して選択することができる。本発明のスクリーニング方
法に用いられるレセプターとしては、ヒトあるいは温血
動物の鎮痛ペプチド受容体（δ、κ、μ）が用いられ
る。本発明のタンパク質に対するレセプターは、公知の
タンパク質の精製方法に従って入手することができ、ま
た、公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコ
ードするＤＮＡをクローニングした後、前記した本発明
のタンパク質の発現方法に従って目的とするレセプター
を入手することもできる。

【００６８】本発明のスクリーニング方法に用いられる
上記レセプターを含有する細胞としては、前記した本発
明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞とし
て列記したものと同様のものを用いることができるが、
なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含
有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用い
て、公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質
の発現方法などに従って製造することができる。また、
上記レセプターを含有する細胞として、ＣＬ８細胞株
（ボーン（BONE）, 18, 159-169, 1996）、ＯＫ細胞株
（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（AM
ERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY）253, E221-E227, 198
7）などの株化細胞を用いることもできる。

【００６９】本発明のスクリーニング方法において、レ
セプターを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタ
ルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができ
る。固定化方法は、公知の方法に従って行うことができ
る。上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画分として
は、前記したものと同様のものを用いることができる。
試験化合物としては、例えばタンパク質、非タンパク質
性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物
抽出液、動物組織抽出液などがあげられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。本発明のスクリーニング方法において、プロ
テイナーゼと本発明のタンパク質とのインキュベート
は、通常数時間、約３７℃で行なうことができる。ま
た、この反応混合物とレセプターを含有する細胞との反
応は、通常数時間、約３７℃で行なうことができる。レ
セプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸
遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用などの測定は前記
と同様にして行なうことができる。

【００７０】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質および本発明のタンパク質を分解するプ
ロテイナーゼを、好ましくはさらに、レセプターを含有
する細胞を含有するものである。本発明のスクリーニン
グ用キットの例としては、次のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 レセプター標品 本発明のタンパク質に対するレセプターなどを含有する
ＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継
代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養
したもの。 本発明のタンパク質標品 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩 本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ標品 本発明のタンパク質を分解するプロテナーゼ

【００７１】〔測定法〕 本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼと本発
明のタンパク質とを約３７℃で数時間インキュベートす
る。 本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼおよび
試験化合物と本発明のタンパク質とを約３７℃で数時間
インキュベートする。 上記およびで得られる反応混合物を、それぞれ本
発明のタンパク質に対するレセプターを含有する細胞と
約３７℃で数時間培養する。 次いで、該レセプターを介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用
などを前記の方法に従って測定する。

【００７２】以上のとおり、本発明のタンパク質は本発
明のタンパク質を分解するプロテイナーゼを阻害する活
性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするた
めの試薬として有用である。本発明のスクリーニング方
法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合
物またはその塩は、本発明のタンパク質を分解するプロ
テイナーゼを阻害し、該プロテイナーゼによる本発明の
タンパク質の失活を抑制する化合物である。したがっ
て、該化合物は、細胞間接触に依存しない本発明のタン
パク質による該レセプターを介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）、鎮痛作用
などの活性を促進することができ、例えば鎮痛剤などの
安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のスクリ
ーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得
られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場
合、前記したレセプターアゴニスト／アンタゴニストと
同様にして実施することができる。

【００７３】（Ｃ）本発明のタンパク質とレセプターと
の結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法 本発明のタンパク質は、温血動物（ヒトなどの哺乳動
物）の鎮痛ペプチド受容体（δ、κ、μ）（以下、レセ
プターと略記する）に特異的に結合することができるの
で、本発明のタンパク質と該レセプターを用いたリガン
ド・レセプター結合アッセイ系を構築することによっ
て、本発明のタンパク質が該レセプターに結合した後の
細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物または
その塩のスクリーニングを行なうことができる。すなわ
ち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴
とする本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細
胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。より具体的に
は、本発明は、（１）（ｉ）レセプターを含有する細胞
に、本発明のタンパク質を接触させた場合と（ii）レセ
プターを含有する細胞に、本発明のタンパク質および試
験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴
とする本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細
胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはそ
の塩のクリーニング方法を提供する。

【００７４】具体的には、本発明のスクリーニング方法
においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば本
発明のタンパク質とレセプターが結合した後の細胞内シ
グナル伝達などを測定して、比較することを特徴とする
ものである。より具体的には、本発明は、（１ａ）
（ｉ）本発明のタンパク質を、レセプターを含有する細
胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質およ
び試験化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させ
た場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）を測定
し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質とレ
セプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提
供する。

【００７５】上記（１ａ）のスクリーニング方法におい
て、本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害せ
ず、本発明のタンパク質による該レセプターを介する細
胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリ
ン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低
下など）を促進する化合物を、本発明のタンパク質とレ
セプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化
合物またはその塩として選択することができる。一方、
本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害せず、
本発明のタンパク質による該レセプターを介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下な
ど）を阻害する作用を有する化合物を、本発明のタンパ
ク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を阻
害する化合物またはその塩として選択することができ
る。すなわち、本スクリーニング方法は、本発明のタン
パク質とレセプターとの結合に影響を与えず、レセプタ
ー結合後の細胞内シグナル伝達を調節（促進または抑
制）する化合物を選択する方法であるので、本スクリー
ニング方法に用いる試験化合物としては、前記したレセ
プターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方
法において、レセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トとして選択されなかった化合物を用いるのが望まし
い。

【００７６】本発明のスクリーニング方法に用いられる
レセプターとしては、温血動物（ヒトなどの哺乳動物）
の鎮痛ペプチド受容体（δ、κ、μ）などが用いられ
る。本発明のタンパク質に対するレセプターは、公知の
タンパク質の精製方法に従って入手することができ、ま
た、公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコ
ードするＤＮＡをクローニングした後、前記した本発明
のタンパク質の発現方法に従って目的とするレセプター
を入手することもできる。該レセプターの部分ペプチド
としては、全長レセプターを適当に切断して得られる部
分ペプチドを用いることができる。本発明のスクリーニ
ング方法に用いられる上記レセプターを含有する細胞と
しては、前記した本発明のタンパク質を発現させるため
に用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用
いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ま
しい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコー
ドするＤＮＡを用いて、公知の方法、例えば、前記した
本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造するこ
とができる。また、上記レセプターを含有する細胞とし
て、ＣＬ８細胞株（ボーン（BONE）, 18, 159-169, 199
6）、ＯＫ細胞株（アメリカン・ジャーナル・オブ・フ
ィジオロジー（AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY）253,
E221-E227, 1987）などの株化細胞を用いることもでき
る。

【００７７】本発明のスクリーニング方法において、レ
セプターを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタ
ルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができ
る。固定化方法は、公知の方法に従って行うことができ
る。上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画分として
は、前記と同様のものが用いられる。試験化合物として
は、例えば、タンパク質、非タンパク質性化合物、合成
化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組
織抽出液などがあげられ、これら化合物は新規な化合物
であってもよいし、公知の化合物であってもよい。本発
明のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質
とレセプターを含有する細胞との反応は、通常約３７℃
で数時間行なうことができる。上記（１ａ）のスクリー
ニング方法において、本発明のタンパク質による該レセ
プターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細
胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン
酸化、ｐＨの低下など）の測定は前記と同様にして行な
うことができる。上記（１ａ）のスクリーニング方法に
おいて、試験化合物を添加した際に、本発明のタンパク
質によるレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃
度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タン
パク質のリン酸化、ｐＨの低下など）が促進された場
合、該試験化合物をレセプター結合後の細胞内シグナル
伝達を促進する化合物またはその塩として選択すること
ができる。一方、試験化合物を添加した際に、本発明の
タンパク質によるレセプターを介する細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内タンパク質のリン酸化、ｐＨの低下など）が阻害さ
れた場合、該試験化合物をレセプター結合後の細胞内シ
グナル伝達を促進する化合物またはその塩化合物として
選択することができる。

【００７８】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質を、好ましくはさらに、レセプターを含
有する細胞を含有するものである。本発明のスクリーニ
ング用キットの例としては、次のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 レセプター標品 本発明のタンパク質に対するレセプターを含有するＣＨ
Ｏ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代
し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養し
たもの。 本発明のタンパク質標品 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩 〔測定法〕細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ ²⁺濃度の変動、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸
化、ｐＨの低下など）を前記の方法に従って測定する。

【００７９】以上のとおり、本発明のタンパク質はレセ
プター結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害す
る化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬
として有用である。本発明のスクリーニング方法または
スクリーニング用キットを用いて得られる化合物または
その塩は、本発明のタンパク質とレセプターが結合した
後のレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の
変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、ｐＨの低下など）を促進する化合物また
はその塩、あるいは該細胞刺激活性を阻害する化合物ま
たはその塩である。本発明のタンパク質とレセプターが
結合した後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物また
はその塩は、例えば、鎮痛剤などの安全で低毒性な医薬
として有用である。

【００８０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、前記したレセプターアゴ
ニスト／アンタゴニストと同様にして実施することがで
きる。

【００８１】（４）アンチセンスＤＮＡ 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ
に相補的に結合し、該ＤＮＡもしくはｍＲＮＡや本発明
のタンパク質の発現を抑制することができるアンチセン
スＤＮＡは、生体内において上記の作用を発揮する本発
明のタンパク質またはそれをコードするＤＮＡの機能を
抑制することができる。該アンチセンスＤＮＡを上記の
治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のタ
ンパク質またはＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防
剤と同様にして実施することができる。さらに、該アン
チセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡ
の存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌク
レオチドプローブとして使用することもできる。

【００８２】（５）ＤＮＡ導入動物の作製 さらに本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはそ
の変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場
合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すなわ
ち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその
変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺乳
動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、 （３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）
記載の動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる
組換えベクター、および（５）第（４）記載の組換えベ
クターを含有してなる遺伝子治療用医薬などを提供する
ものである。

【００８３】本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮ
Ａを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入
動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびそ
の始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、
非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好
ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に
８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス
法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェク
ション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法などにより目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入
することによって作出することができる。また、該ＤＮ
Ａ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞など
に目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合
させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出するこ
ともできる。

【００８４】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。な
かでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７
ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６
Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
あげられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に導入させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現
させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンスト
ラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本
発明のヒトＤＮＡを導入させる場合、これと相同性が高
い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモータ
ーの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精
卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導
入哺乳動物を作出することができる。

【００８５】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、ウ
ィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィル
ス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィ
ルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥
類（ニワトリなど）由来のものとしては、アルブミン、
インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エ
リスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナー
ゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ
１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ
型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサ
ブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフ
ォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセ
プターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略され
る）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素
（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽
鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティ
ナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−
２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵
素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド
鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよび
βミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基
礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロ
ブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコン
ポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αア
クチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなど
のプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で
高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモー
ター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）
のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモ
ーターなどを用いることができる。

【００８６】上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物にお
いて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する
配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有しているこ
とが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物お
よび鳥類由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好
ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターな
どが用いられる。その他、目的ＤＮＡをさらに高発現さ
せる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハ
ンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロ
モーター領域の５´上流、プロモーター領域と翻訳領域
間あるいは翻訳領域の３´下流に連結することも目的に
より可能である。正常な本発明のタンパク質の翻訳領域
は、各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モル
モット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由来
のＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよ
りゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または各種
哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、
ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由来のＲＮＡ
より公知の方法により調製されたｃＤＮＡを原料として
取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、
上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の
翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を
作製することができる。該翻訳領域はＤＮＡ導入動物に
おいて発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記の
プロモーターの下流および所望により転写終結部位の上
流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡ
の導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべ
てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動
物の胚芽細胞において、本発明のＤＮＡが存在すること
は、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細
胞のすべてに本発明のＤＮＡを保持することを意味す
る。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽
細胞および体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを有する。

【００８７】本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非
ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持するこ
とを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階における
本発明のＤＮＡの導入により、対象哺乳動物の胚芽細胞
および体細胞の全てに本発明のＤＮＡが過剰に存在する
ように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞
において本発明のＤＮＡが過剰に存在することは、作出
動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本
発明のＤＮＡを過剰に有することを意味する。ＤＮＡを
受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮ
Ａを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫
が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することがで
きる。本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、
本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の
正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明
のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その
病態モデル動物として利用することができる。例えば、
本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパ
ク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾
患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検
討を行なうことが可能である。また、本発明の外来性正
常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタ
ンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパ
ク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試
験にも利用可能である。

【００８８】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持する
ことを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で継代飼育することが出来る。さらに、目的ＤＮＡを前
述のプラスミドに組み込んで原科として用いることがで
きる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常
のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受
精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対
象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するよ
うに確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞に
おいて本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物
の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明
の異常ＤＮＡを有することを意味する。ＤＮＡを受け継
いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞
の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常
ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの
機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質
の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデ
ル動物として利用することができる。例えば、本発明の
異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機
能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治
療方法の検討を行なうことが可能である。また、具体的
な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物
は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における
本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻
害（dominant negative作用）を解明するモデルとな
る。また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動
物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有する
ことから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に
対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。

【００８９】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ導入哺乳動物の組織中のＤＮＡもしく
はＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現さ
れたタンパク質組織を分析することによる、本発明のタ
ンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパ
ク質との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。さらに、本発明のＤＮＡ導入動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を
含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を
調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連す
る疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見
が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患に
よる二次的疾患の研究および治療に貢献することができ
る。また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出
し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素処理
により、遊離したＤＮＡ導入細胞を取得し、その培養ま
たはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。
さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、または
それらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常
を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびそ
の作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、本
発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の
機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連
する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法
および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬
のスクリーニング法を提供することが可能となる。ま
た、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮ
Ａ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連す
る疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能であ
る。

【００９０】（６）ノックアウト動物の作出 さらに、本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非
ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非
ヒト哺乳動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細
胞、（２）レポーター遺伝子として大腸菌由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を有する細胞である第（１）項記
載の胚幹細胞、（３）ネオマイシン耐性である第（１）
項記載の胚幹細胞、（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物
である第（１）項記載の胚幹細胞、（５）ゲッ歯動物が
マウスである第（４）項記載の胚幹細胞、（６）本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）レポーター遺
伝子が本発明のタンパク質のプロモーターの制御下で発
現しうる第（６）項記載の動物、（８）レポーター遺伝
子が大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子である第
（７）項記載の動物、（９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動
物である第（６）項記載の動物、（１０）ゲッ歯動物が
マウスである第（９）項記載の動物、および（１１）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のタ
ンパク質のプロモーター活性を促進する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。

【００９１】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡ
を挿入または置換させることによって行なうことができ
る。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠
をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を
破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製
すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲ
ＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子
を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得ら
れたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近
傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ
ーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本
発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマー
としたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥ
Ｓ細胞を選別することにより得ることができる。

【００９２】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹
立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場
合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されて
いるが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これ
に代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細
胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との
交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６と
ＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好
に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、
卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞
は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７
ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用
い得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精
後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞
期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率
よく多数の初期胚を取得することができる。また、雌雄
いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞
の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。ま
た、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早
く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄
の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体
上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その
１例としてあげることができる。この方法を使用すれ
ば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要
していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約
５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一
次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ
り、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初
期の手間は大幅に削減できる。

【００９３】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第78
巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナ
ル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメン
タル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発
明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現
不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知
の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較する
ことにより、正常動物と区別することが可能である。該
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。

【００９４】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。

【００９５】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１、
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のタン
パク質発現不全マウスは、本発明のタンパク質により誘
導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタ
ンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデ
ルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法
の検討に有用である。

【００９６】また、本発明のタンパク質の構造遺伝子を
レポーター遺伝子で置換された本発明のタンパク質発現
動物では、レポーター遺伝子が本発明のタンパク質のプ
ロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子
がコードする物質の発現をトレースすることにより、本
発明のタンパク質のプロモーターの活性を検出すること
ができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明の
タンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代
わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例え
ば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガ
ラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクト
シダーゼの基質となる試薬を用いて染色することによ
り、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発
現状態を観察することができる。具体的には、本発明の
タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルア
ルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩
液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室
温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた
後、組織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄する
ことによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、
呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺを
コードするｍＲＮＡを検出してもよい。このような本発
明のタンパク質発現不全動物は、本発明のタンパク質の
プロモーターを活性化または不活化する物質をスクリー
ニングする上で極めて有用であり、本発明のタンパク質
発現不全に起因する各種疾患の原因究明または治療薬の
開発に大きく貢献することができる。

【００９７】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００９８】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００９９】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ₂−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【０１００】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のヒト由来タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のヒト由来タンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーＯＰＦの塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーＯＰＲの塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００２１
０７に記載の塩基配列を示す。

【０１０１】実施例１で得られた形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli） JM109/pTAOPI5は、財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２０００年７月４日から寄
託番号ＩＦＯ １６４５１として、独立行政法人産業技
術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に２
０００年７月１７日から寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２
２９として、寄託されている。

【０１０２】

【実施例】以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。

【０１０３】実施例１ ヒト精巣ｃＤＮＡ画分からのＰ
ＣＲ法による新規鎮痛ペプチド前駆体ｃＤＮＡの取得 クローンテック社より購入したヒト精巣ｃＤＮＡを鋳型
として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲに
よる増幅を行った。 OPF:5'-CTCAGTGGCTGAAGGCACATGCGTCAC-3' （配列番号：３） OPR:5'-GGGAGGCTTAGGCTTGGCTCATTTGAA-3' （配列番号：４） ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液２μｌ、0.5μｌ OPF（1
0 μM）、0. 5μｌ OPR（１０ μＭ）、2.5μｌ添付の
１０ｘ反応液、2.5μｌ dNTP（10mM）、0.5μlKlen Taq
（クローンテック社）、16.5μl 蒸留水を加えて合計２
５μｌにした。反応液をThermal Cycler 9600を用いて
ＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変
性の後、９８℃・１０秒、６５℃・２０秒、７２℃・２
０秒のサイクルを３８回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部
を用いて電気泳動で約２５０ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を
確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purification Ki
tを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図１で
示す配列が得られた（配列番号：２）。図１のＤＮＡ配
列から予測されるアミノ酸配列は図２に示すものであっ
た（配列番号：１）。得られた配列を既知の配列と比較
したところ、下垂体由来の鎮痛ペプチドで高い保存性を
示すアミノ酸配列、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕを見出した（図３）。また、得られたＤＮＡを調
製しＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）をも
ちいてｐＣＲ２ベクターに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換してE.coli JM109/pTAOPI5を得た。

【０１０４】

【発明の効果】本発明のタンパク質およびそれをコード
するＤＮＡは、鎮痛剤などの医薬として有用である。ま
た、本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡ
は、本発明のタンパク質の活性を促進もしくは阻害する
化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬とし
て有用である。さらに、本発明のタンパク質に対する抗
体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することがで
きるので、被検液中の本発明のタンパク質の検出、定
量、中和等に使用することができる。

【０１０５】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Polypeptide and its DNA <130> P2001-172 <150> JP 2000-215886 <151> 2000-07-12 <150> JP 2000-227553 <151> 2000-07-24 <160> 5 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Arg His Ser Gln Glu Ala Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Leu Leu 5 10 15 Leu Ala Asp Pro Gly Glu Ala Ile His Ala Glu Leu Gln Lys Gly His 20 25 30 Tyr Ser Leu Cys Ala Ala Leu Thr Arg Arg Ile Arg Glu Leu Leu Gln 35 40 45 Arg Tyr Gly Gly Phe Leu Glu Glu Leu Thr Glu His Ala Gly Val Thr 50 55 60 Pro Gln Ser Ala Leu Lys Ser Phe Lys 65 70 73 <210> 2 <211> 219 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGCGTCACA GCCAGGAAGC CCTGGTTTTC GCTCTGACCC CACTGCTTCT GGCTGACCCT 60 GGAGAAGCCA TCCACGCTGA GCTGCAGAAG GGCCACTACA GCCTGTGTGC AGCCCTCACA 120 AGGCGTATAC GGGAATTACT GCAGCGATAC GGGGGATTCC TCGAGGAGCT CACTGAGCAT 180 GCAGGTGTTA CACCCCAGAG CGCGCTGAAA TCATTCAAA 219 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 CTCAGTGGCT GAAGGCACAT GCGTCAC 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 GGGAGGCTTA GGCTTGGCTC ATTTGAA 27 <210> 5 <211> 39265 <212> DNA <213> Human <400> 5 gatccacccg ccttgacttc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ctgagcccag 60 ctgtaaggtt cttatactag atgaaggtag actgtgataa attaaagaca tactataaac 120 cctaaagcac ctgttaaagt caacaaacaa acaagaaaac aaaagactgt cagtgaataa 180 gacaacaaat aaactgaaaa gattgtttta aaaactaaat tcaaaagaag accagtaaga 240 gggaaagggg cctggcgcag tggctcacgc ctgtaatccc aacactttgg gaggctgagg 300 tgggcagatc actttaggtc aggagttcaa gaccagcctc accaagatgg tgaaaccctg 360 tctctaccaa aaatacaaaa attatccagg catcgtggca tgcacctgta gtcccagcca 420 ctcaggaggc tgaggcagga gaatcactta agcctgggag gcggaggttg cagtgagccg 480 agactgtgcc actgcactcc agcctgggcg acagagtgag actctgtctc aaaaagaaaa 540 gaaagaaaaa aaaatccatg gcagacagag gccctgcagt gggatcgggg tgaaagtcca 600 gcatctgtga cctcagacgt gtcacatcct tgctcatcac agcttcagca tcgatcacac 660 tggcattcat tcattcaaga gacatttgct ggctgggcgc agaggctcac acctgtaatc 720 ccagcacttt gggaggccaa gaccagtgga tcacctgaag tcaggagttc aagaccagcc 780 tgcccaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aaatgttagc tgggcgtggt 840 gtcaggcacc tgtaatccca gctactcggg aggctgaggc aggagaatca cttgatcctg 900 ggaggtggag gttgcagtga gccaagatag caccattgca ctccagcctg ggcaacgaga 960 gcgaaactct gtcttaaaaa aaaaaaagag agagagagaa ttgctgaacg cccactaagt 1020 gccaggcacc attctggttg cggcctcatt gctgaataat gcgggcagaa accccaactc 1080 cgtggagtgc ctgcttggtg agaagactcc cttgtagaac tctgtgaggg tcagagacga 1140 tggatgggag gtcctgccag gaggaggcgc tcaggaagtt tcttcgctgc tcctccccac 1200 tccttcactc ctttcttgtt gctcctcttt caggcctggg tgtttgggga gcttcattct 1260 ctcattccac agatatgcct gcagtgcccc gcctggcctg tgctgagcct ggtccaggtt 1320 tgttgaatgc agacgtgctc agagaggtca ttccggctgc tggtcactgg gaactccgtt 1380 gcatctgcct cgggcccagg tgcccccctt tcactggagc atcagcgaag agcagtcacc 1440 cccctccccg ccctgggtat ggcaggccca ggctgcagag ctttcttcgt gaaacaggag 1500 ctaaacatga tcaagatctt gccacgtccc aggcaggagt ctcaccacac tgctggtgtc 1560 atctcatgag actgcacaac aaaccttcgc agcaggtccc cgagtgtacc ctttcacagc 1620 tatggacagg acccaaaagt ctgagtcgag cgtgtgtgtc actaccctgt atgtggattc 1680 acagcctctg gctatcttag aaggtccttc ccccatggcc tggctctgcc cgtgaaccgt 1740 tgaatgtctc tgctcccttt gccacttccg ccttcctgat actggggaac caggtcatct 1800 ctctactctt tcctggaatc ttctcttttc caaggatcat ggtgactgag aaactgagga 1860 gctgcacagg cccaagacaa gccctctccc accagcccac aaatgtactg cccatgggcc 1920 gggcatggtg gctcatgcct ataatcccag cactttggga ggccgaggcg ggcggatcac 1980 ctgaggtcag gagttcgaga ccagcctggc caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa 2040 atataaaaat tagccgggtg tggtggtgtg cacctgtaat agccactcgg gaggctgagg 2100 caggagcatc gcttgcacct gggagacaga ggttgcagtg agctgagatc gcaccactgc 2160 actccattct gggtgacaga acaagagtcc atttcaaaaa aataaaaaat gtactgtcca 2220 tgtttactga tgactttatg tagttagtgg atcctgccag cacagccaca gttcctgctg 2280 atctctgtcc cgcagttgac caccccgtct gtgtttttgc cccagcctgt attgctgggc 2340 ttgagtcttc tgtcctcacg accctcaccg gggactcaga cacagccctt ctgctctggg 2400 gacatgtcag tccttggcct gagcgtccag gctctgcgcg gccccgttgt ccttacaggg 2460 actccgtccc tggggaaact tcccacgtgt cagaaccttc ccttcctttg tttgagaaaa 2520 caaaaaattc ttcctctctt gaccaggagc agtggctcac gctggtaatc ccagcacttt 2580 gggaggccga gacaggagaa ttgcttgagg ccaggagttc aagaccaaca tagcaagatc 2640 ccatctgttt atagatctat atctatgtat catctctcta tatagtacat gtaatatgta 2700 tataatatat aataatcata tatataattc ttcctttttt gcggggggag ggggttggag 2760 tctcactctg tcacccaggc tggagtgcag tggcatgatc taggctcact gcaacctccc 2820 cgtcctggtt caagcgattc tcctgtctca gcctcccaag tagctggaac tacaggcatg 2880 tgccaccgca tctggctaat ttttgtatct tttttttttt tttttttttt gagatggagt 2940 ttcactctgt cgcccaggct ggagtgcaat ggtgggatct cagctcactg caacttccgc 3000 ctccctggtt caagtgattc tcctgcctca gtctcccaag cagcagggat taggcgcctg 3060 ccaccacacc tggctaattt tttgtatttt cagtagagat ggggtttcac catgttagcc 3120 aggctggtct tgaactcctg acctcaggtg atccgcccgc ctcggcctcc ccaagtgttg 3180 ggattacagg cgtgagccac tgtgcctggc caattcttcc tttcttgaat gcccttttct 3240 gccatcctaa ttttcccatc gttcagggtc aaggttgatg ctcaccttcc ccagtaagcc 3300 ctccctgatg tcttcccaat tcctgtgggg taagcagggc agctcagtgg ctgaaggcac 3360 atgcgtcaca gccaggaagc cctggttttc gctctgaccc cactgcttct ggctgaccct 3420 ggagaagcca tccacgctga gctgcagaag ggccactaca gcctgtgtgc agccctcaca 3480 aggcgtatac gggaattact gcagcgatac gggggattcc tcgaggagct cactgagcat 3540 gcaggtgtta caccccagag cgcgctgaaa tcattcaaat gagccaagcc taagcctccc 3600 taccgcctcg cccaccccct cccatggaaa ccacattacg ggcttcaccc acagttctgc 3660 cctctcctgc ctcctgaccg actccagcac ttccccgtgt ggccctgtgt ggcttggggt 3720 accccttctc ctggaaactg tcgtaaacta tcctttcaat ggcaattatc tcctgatctg 3780 gtggccttac tgaacctcaa attttcaata aatacgttgt tttttaagcc aggcttaata 3840 gcatgcactt gtggtctcag ctacttggga ggctgaggtg ggaggatcgc ttgaggccag 3900 gagtttgtgg ccgcagtgca gtataattgc acctgtgaag agccactgca ctccagcctg 3960 ggcaacgcag ggagaccctg tgtccaaaaa ataattatta tattttaaag acaagcagac 4020 tatgcatgga gtcccgaggg tgaacaggtg tcggggggca gcgggagcgt ggagaaagcc 4080 gggaggaggt gggaacagga aaccctcagg gtcacacccc agaaggagaa ggccctagcc 4140 tgaatgggac tgctgggaag gggctgaaca ccagcaggga gtggagctgc ggaaacacac 4200 acggaagtgg ggcatgggtg ctgggtggac actccacttc cagataagag gggatcttgt 4260 ggatggtggt ggaggcgctc ctggccctac tgggctccgg cactcagcct gccctgccac 4320 agaggcagcc catactagag gctactgcac gtcaggagag gggcaggctc aaaaccagaa 4380 aagttatact ctgggctctg ccagccccac cctcccaatc caggaaaccc aattcatcca 4440 aatatgagta tcaatatcca cccaaagata ccagagggaa aaaagaaacc taaaaggagc 4500 gggtggccag tgcagtgctc actcctgaat cccagcactt tgggaggctg aggcgggagg 4560 atcgcttaag cccaggaggt caagactgca gtgagttgtg actatgtcac tgcactccag 4620 cccaggcaac aaagcaagac cctgtctcaa aaacaaacaa acaaaaaggg aacagcaaga 4680 cttccctgca gatgaagaaa acacagagaa aaccactgcc acaaagccaa gtgaaagtgg 4740 caagccagcg ggcagcccca tgatgcagct ggggaagtgg ccaggggagt ggctgcagcg 4800 gaaatggcca tggggaactc tgcggcccca ggaagaacag gtggacaggt gctggtggaa 4860 cttaggaagg actggaagca aaggccacag acacaagtct agagatgctg tggaaagtgc 4920 agccaggaag aaacagggac gtgaagaggc acaacagcag cagagcaagc aggcaggaga 4980 ggcggtggcg ggggaggcag cagcagggga agcagcggtg gggaggcagc agcaggcagg 5040 tccttggctg gcagggcaga gccaagacag gacagactcc aaggtagaag tccagacaac 5100 tttgctaaaa caaacgaatt gaggcggagc attactgctg agctttgcct cctgtcagat 5160 cagcggtggc attagatctt catagaagtg caaaccctac tgtgaactgc gcatgcgagg 5220 gatctaggtt gctcactcct aatgaaaatc taatgcctga tgatctgaag tggcacagtt 5280 tcatccccaa accatccctc ccaccacccc tactgtccat ggaaaaattg tcttccaaga 5340 aaccagtcac tggggcaaaa aatgttggtc aaaagtaccg ctgtactaga gtgaatttta 5400 gttaactgag agatgatcac agatagtaag aggaacaggg agtgagcact cacatattca 5460 actagaggac agggaccgag ataaaaacag cagcaagttg tgatgggtac gtacggtgtg 5520 ttccctgcca aatccacaca ctgatgtctt aaccccaagc accacagaac gtgaccttgt 5580 ttggaaatgg tgtcactgca aatgttatta gttaagatga ggtcactaag gtgggctcta 5640 atccaatgtg actggtgtcc ttattataag aagaggcaat caggacccac agacaggcac 5700 agggggaaga tgagaggatg ctgtttgcag gccaaggaca gcacccagga acagccttca 5760 ctcagggtcc tcagaagaaa ccaaccctgc tgatgtctgg actggacccc tgccctccag 5820 agctgtgaac aatgaattcc tctcacctaa gctgctctgc ggtgctttgt taatggcagc 5880 cctagcaaac tcatacacaa aggtaacaga atgtgtaaaa aaacaatttt acaaaggcag 5940 ctataacagt atgagacaag aaagcagaga gaggatggaa aatagaatcg ccctgctgat 6000 tccttcatat tatagttgga ttctaaagac atcacttaat gctgacaaac tgagaagttt 6060 agcatattaa agaggacaga ggcaaatact aagaaatata atagtattca ttcaaaaaat 6120 gggtgggccg ggcatggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag gccgaggcag 6180 gtggatcacc tgaggtcagg agttcgagac cagcctggcc aacatggtga aatccatctc 6240 tactaaaaat acaaaaatta gccaggcttg gtggcgcgca tctgtaatcc cagctactag 6300 ggaggctgga gcaggagaat cgcctgaacc tgggaggtag aggttgcagt gagctgagat 6360 ggcgccattc cactccagcc tgggtgacag agcgaggcct gtctcaaaaa aaaaaaacaa 6420 aaaaaaccat gggtggtaga aaagagagag aagggagaga ggggaaaggt ttacaaatta 6480 tttcatagta gggaactatg agaactcttt taaaggttga ggggactaaa gatattattt 6540 aagggtatga acagtaagta gcaactagac ccaaaaaaaa tcaagccttc ctaaaaacca 6600 gaagagctac attttttaag agcaaatgca gattaagtaa tgactatatg tagtaaatgt 6660 gaaataaaac aatttcaaaa agaacaaagt tggaagactc atgctacccg atttcaacac 6720 ttactataga gctgcagtga ttaagacggt gtggcgctgg cgaaaggttc aggggaacag 6780 aacacacagt ttagaaatag acctacacag atttatggcc aattgatttc agatgaaggt 6840 acaagggcaa ttctacgaag acagtctttt cagcaactgg tcctggaaca ctggacatct 6900 ttatgcaaaa acgaaccttc aaaatggtta tgccatttta tttatttatt tatttactat 6960 tttttgagat ggagtcttgc tctgtcttcc aggctggagt gcagtggcga cagctcggct 7020 cactgcaacc tccgtttccc aggttcaagt gattctcctg tctcagcctc ccaagtagct 7080 gggattacag gcacctgcca ccacgcccgg ctaattttta tatttttagt agagatggat 7140 ttcaccatct tggtcgggct ggtcttgaac tcctgagctc aagtgatcca cctgcctcgg 7200 cctcccaaag tgctgggatt acaggagtga ggcaccacgc ccggccacaa gtcctttatt 7260 atactgtatg ttttacaaat attttctccc actgtgagcc tttttatctg ttttcctaat 7320 ttttaatttt tgatgaagtg caataattga cagaatgaat agatagaaaa ttggcaccag 7380 gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggaagg cagatcacct 7440 gaggtcggga gttcgagacc agcctgacca acatggagaa accccatctc tattaaaaat 7500 acaaaattag ccgggcatgg tggcgcatgc ctgtaatctc agctactcag gaggctgaca 7560 ggagaactgc ttgaacccag gagacagagg ttgcagtgag ccaagaccgc gccattgcac 7620 tccagcctgg gcaacaagag caaaactctg tctcaagaaa aaaaaaagaa agaaagaaag 7680 aaaaaagaaa agaaaattgg caaggataca gaacttgaac tccactggac ctgacattaa 7740 aacacttgac tcaacaagag cagaaaacat tcttctcgag cacacacaga acatttacca 7800 ggagagacca cagtctgggc tatgaaacaa accctgttaa cttcaaaaag attcaagtgg 7860 ttttttgttg ttttttgata cacggtctca ctctgttgcc caggctggag tgcagtggca 7920 ggaacatggc tcactgcagc ctcaacctcc tgggctcaag tgatcctccc acctcagctt 7980 tctgagtagc tgggactata ggcataggcg tgggcaaccg ccccagggtg attttttaaa 8040 tttttttgta gagacagggt ctcgctgcat tgcccaggct gacctcaatc tcctgggctc 8100 aaatgatcct cctgcctcag cctcccagta tcgggattac aggtgtgagc caccacgccc 8160 cagccaagga ctcaagttat acaaagtatg ttctctgacc acaatgaaat tcaactagaa 8220 atcagtaaca gaaagatctc tggtaaattc ccaaatattt ggaaactaaa tgacatacct 8280 ttaaataact cattagccaa agaataaatc aaagggaaat tagcaagtat tttgaactga 8340 atgaaaacac aacatatgaa aattcgtcag gtatcacaaa agcagactga actttttaga 8400 ccttacaaat gcatgactgt cccccttgcc tctgatcttc tgcctggggt ctgcctttcc 8460 ccaatctttg ttcactatac tgaatcctac atgacacagt caacctatga agaaatccag 8520 agatagactc tctaaaataa atggatttgg gaatagcagc ttatctggaa tactgcaacc 8580 gttgaggatg gtcttgcagt gagtcctgtt attggtctgt ttgtagaaat gtcttgtggt 8640 aagtcctgtt gcaggaatgt gtgcgtgagg gctgcttcat cacctccaac tgttttagtt 8700 tgacataagt gactccattt tggtaccggc aacgttcaca actttccatg tgacttcagc 8760 accctgcacc ccgatccttt ccctggccac tttgcaggac cactacctat gagactatgg 8820 gttccttgag agctagggct gggtctcatt cgctcctgaa actttcaccc agcagagtga 8880 tggcccacgc catgcatgac atgcgttgct caatgactgc atccactcag ccagtatgcc 8940 agtccccact gagcctcact ctcaacctcc ctggctggca taggttcctt gtgcagacat 9000 ccagtggcag taaaatattg ctgggttctc agcttccccc acctgcagcc ctcactggcc 9060 cacccagttg tcctgtctct gctcaggacg agaccccccc ccgcctcttc agtctctgta 9120 gccaggtgat ggcagtggcc ttttccagac cctcactggc cccttagttc actatgatga 9180 cttcacctct tgggaaccca tggggatgtc tttccctcca atacatctac atttgcctga 9240 cccagaatgt agtttcaaga tgggtccatg cctggctcca aatcccctta tcagagtaag 9300 gaaatacctt aattcctagt ttgctaaaaa ctcgttataa atggctgtcg cgtcatttac 9360 tgtgttcctg ttctgcaacc attgagatgg tcacgtgggt tttgctcctt taatctattg 9420 atatgaatta cactcttgat tctctggcat tgaaactgct ttgcaattct gaattaaatc 9480 cagtgtggca ctttgctaaa cttggtttat tattgtctaa aatcttgaca ttggtatttg 9540 tagggaccag ccccacaggg tccgtgggtc tctccctccc tgtgtgcagc aatgagagag 9600 tgtagaaata cacacacaag acaaagagat aaaagaaaag gcagctgggc ccgggagacc 9660 actactacca atgctcggag accggtagtg gccccgaatg tctggctgca ttgttattta 9720 ttggatacaa agcaaaaggg gcagggtaaa gagtgtgagt catctccaat gataggtaag 9780 gtcacgtgga tcacgtgtcc actggacagg gtgcccttcc ctgcctggca gccgaggcag 9840 agagagagag gagacagaga gaaagacagc ttatgccatt acttctgcat atcagagact 9900 tttagtactt tcactaattt actactgcta tctagaaggc agagccaggt gtacaggatg 9960 gaacatgaag gcggactagg agcgtgacca ctgaagcaca gcatcacagg gagacggtta 10020 ggcctccaga taactgcggg caggcctgcc ggatgtcagg ccctccacaa gaggtggaag 10080 agcagagtct tctctaaact cctccaggga aagggacact ccctttcccg gtctgctaag 10140 tagcgggtgt tgttccttga tactttttgc tactgctaga ccatggtcca cctggcaacg 10200 ggcgtcttcc cagacgctgg cgtcaccgct agaccaagga gccctctggt ggccctgtcc 10260 gggcataaca gaaggctcgc actcttgtct tctggtcaca cctatgtccc ctcagctcct 10320 atctctgtat ggcctggttt ttcctaggct atgattatag agcgaggatt attataatat 10380 tggaataaaa ggtaattgct acaaactaat gattaatgat attcatatgt aatcatatct 10440 aagatctata tctgctgtaa ctattcttgt tttatatttt attatactgg aacagctcgt 10500 gtcctctgtc tcttgcctcg gcgcctgggt ggcttgccgc ccacaggtat ttggtaactt 10560 ccctttctct tacctagttt tggtatcaaa gctaagttca cgaatgaagt gttctctcaa 10620 ttgattctgt tagaatttgt ctacgtctgg aattacctgt tctctatatc gtggaacttc 10680 cctgtaaaac cgtctagggg aacattctta actactgact caatttcatc agtgattaca 10740 actcaggctt tctattactt ttagtcagtt ttggagattt ttcttccatt tactttgagt 10800 tgttccaact taagctgcat gcttattttt ctttagcttt aaaaatacag acatacagcg 10860 tatgtgtgta taaatggcac tatttatctg tagatgcaca tacatttagg ggctatgttt 10920 ttttgtgctg ctttagctct gttccacaaa tcttaaattt tttctttttg agacagtctt 10980 gctctgtcac ccaggctgga gtgcagcggc tcgatcttgg ctcactgcag cctctacctc 11040 ctgggttcaa gtgattctcc cgcctcagcc tcccaagcag ctgggactac aggtttgcac 11100 caccacaccc agctaatttt ttatttttaa tagagatggg gttttatcat gttgtccagg 11160 ctagccttga actcctgatc tcaagtgatc cacccgcctc ccaaagagct gggattgaca 11220 gcatgagcca ccatgccagg ccctgttcca caaattttaa tacgtagcat tttcattatc 11280 ctttagtccc aaatatttct aatagccatt cggaattctt taactcatag gtaatttata 11340 agtgtgtttt aaaaattcca aatatgaaat gccactgcac tccagcctga gtgacagagc 11400 aagactctat ctaaaaaaca aaaaaaaata gctcaaattt tttttaatga cattgggata 11460 cggtcagata acgacactga ttccttgaaa tatcttaaga cttcttttct ggacaaagta 11520 ggtggtcagt ttccatccat gttccatata tgcatggaaa gagtatgtat tcttttcaga 11580 tactgttgtg tctgtctctc agctcaagct catgctcacc tcacatccta tctttcacag 11640 ggctttttca tcagttgcct ctgtctggta acagtcacac cagctcctgt tcagttacag 11700 tctttgtctc ataaccggag agtttcatca aaagaatttt atttacagct ttatcatcca 11760 tatgccacta aaattcacct gttttctttc aacctgcact cattttgatt gcctggaact 11820 ctggatttaa ttcttccatc ccactttgta tcttgcattc acttcactct ctctccagct 11880 tttattcttt ctttctcttt ccctaggtcc aatgcacttg acccaactca catgcgtgga 11940 ctccgggaag gtactgctcc ctccctccaa attctgagca gtaaaatgcc gccccggggc 12000 actggggaac agaaaggaat gagaccccaa caggcagaag ccaagagagc ggggaggagc 12060 catggcgttc tgccccagga tgcaccacgc ctggacgtgc tcccccgact cccagtgcca 12120 ggtgcccata tgccacacct cagggttgtc ctctgttcgg gtgagctgcg gactaacgtg 12180 gcccggcagc agaggccacc gtcttctgtc ccgtggctcc tgcgaacaca ggcagtgggg 12240 aacaggcagt gactgcccac ccccaccgtt cctcctccct gaccctgcaa acctcgggga 12300 agctttcagg cccgggaaag cagaccaggc cccagtctcc ctcacccttt ccctgggtct 12360 gaaggtcccg gatcctgcgt tcaaggatga cgctgaaact ctctctttct cacatgggat 12420 ctgtgatctg ggccctcaca actcagcaga gcaccactgt gtccccctca catggagagg 12480 ccgaggtctg tggagatcct gggacagagc cagcgtcaag gactcagagg gtgtcctgga 12540 gtctcctagg acggaagacg gcggccccag gtgggaaaga ctcagaccag gcctgcgcgc 12600 tccaggtcct gcggcaggat gcggcccttc ttgcgggctc tgagcaggcg gcgctcggcg 12660 cgggccgcct tcttcctgcg caggttctgc cgccgccggt cctggcgctg ctgcatcttc 12720 tccaccacgc cggccgtgcg cttctcccac cggcgctgcc gctgcgccct gcgcttctcc 12780 ttgcgcttca gggcctcctg cagcaggcgt tcgtcgtcac ggatcttcac gccctccgcc 12840 ttgtagagga ggttggtcca cttcatcttc gcctccagct cctgcgcctt cccctcatcc 12900 tggccgcgca gctcgtccag ccggctctgc cgtgcctgca ggcgctccag cagctgccgg 12960 tagttcctcc cggtcagcgg cgtgaggttc cccttcaccc tctgcctctt ctcttttctg 13020 cgctgcgcct tgctggccgg ctcgtcttcg ctcacctcca cctgggagga aggtatgaca 13080 tcagctcatg ccagccctgc actaggcccc agccttggcc agtaccctaa gggacctgcg 13140 aggtccccgt caccacctta cagacatgat ggggttcgga gagagatcat gaagctaaca 13200 aggggcaacg ctgaggcctg aagccgaccc agcccgccca aggacccagc tcccgctcac 13260 cttattgaag atcagcccgg 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tgcatgaact catcctggag cagtcagtga ggctgccatg 38220 cgtgcttttc cggtaaacat taagaggctg cagtcggcct gggtcagacg gttccccacc 38280 cagcttcaga gtggaattgc tccgggagcc tttaaaagcc cgatgtccaa gccgcatggt 38340 agactgtcca gggatgagtc caagacacag ccaccagtct gaatccttgc tgtgaactgt 38400 ccctacaaat ttggtctctc tgctctgtag gcaccagttg ttctgcaaac tcaccctgcg 38460 gcacatcaac aagtgcccag aacacgtgct gaggcacacc cagggccggc ggtaccagcg 38520 agctctgtgt aaatgtaagt cccagtggac ccccatcagt gcatcgccat ctgagtgcat 38580 gcccgccttg ccccagatgg agcgtgcttg aaggcaggtc gtccttcagc gatccgtgtt 38640 gatgcatcag gcctgttttt tggcacagtg aagagaggga tgatggcccc tgaccccaca 38700 gcttttagtg caggcaggca cagagccaga agcaggctcg ggagtgagtg agtgtgcgtg 38760 gcaatgcgag gtgtgaaaga aactgggcga gggatgtggg gtgggcttgc ggagacagga 38820 gggctgggga gactcgctga gggattcgct cgaggctgag gctggaggga tgtggtggca 38880 gtggggtcgg gggaacagca ccccagggag aagccagggt ccatggaagt ctgaggcaaa 38940 aatgtgttgg ctgaggtagg ctccaaagga ctggctgggc tagtgtgcac agcccggatg 39000 acccagagac caggccagga gcactgcagt gggtgtgtgg agagggttgg gtgggggctg 39060 catggacagt gtgcatggtt gagaagggag gactccttga ctgcggtcat ccaggaaaag 39120 acggtgggtt ttggggggag aattcagagt ccctttgaag gttttaagct tgagctgtat 39180 taggaaaggt gtgtattagg gaagtatcgg gcttttgaaa cagggacacc cgtgctggat 39240 gaaggagatg gttgcaccgt ggatc 39265

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で得られた本発明の鎮痛ペプチド様
タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。

【図２】 実施例１で見出された本発明の鎮痛ペプチド
様タンパク質のアミノ酸配列を示す。

【図３】 本発明の新規鎮痛ペプチド様タンパク質と既
知の鎮痛ペプチドとのアミノ酸配列の比較を示す。図
中、「新規鎮痛ペプチド」は配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列の第５０番目（Ｔｙｒ）〜第７３番目（Ｌｙ
ｓ）からなる部分アミノ酸配列からなるペプチドを意味
する。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月１７日（２００１．８．１
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０１】実施例１で得られた形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli） JM109/pTAOPI5は、財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２０００年７月４日から寄
託番号ＩＦＯ １６４５１として、茨城県つくば市東１
丁目１番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に２０００年
７月１７日から寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２２９とし
て、寄託されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BB20 DA12 DA13 DA14 DA36 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 AA11 BA05 BA41 CA01 GA11 4B064 AG01 CA19 CC24 DA08 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA18 BA19 BA20 CA18 CA53 DB01 DB70 NA14 ZA08 ZC42 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 EA20 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質またはその塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質の部分ペプチ
   ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
   塩。
3. 【請求項３】 請求項１記載のタンパク質または請求項
   ２記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤ
   ＮＡを含有するＤＮＡ。但し、配列番号：５で表される
   塩基配列を有するＤＮＡを除く。
4. 【請求項４】 配列番号：２で表わされる塩基配列を有
   する請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡを含有する組換え
   ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターで形質転
   換された形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養し、請
   求項１記載のタンパク質または請求項２記載の部分ペプ
   チドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
   する請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、または
   請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
   はそのエステルまたはその塩の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載のタンパク質もしくはその
   塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのア
   ミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる
   医薬。
9. 【請求項９】 請求項３記載のＤＮＡを含有してなる医
   薬。
10. 【請求項１０】 鎮痛作用を有する請求項８または９記
    載の医薬。
11. 【請求項１１】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
    の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
    アミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗
    体。
12. 【請求項１２】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
    の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
    アミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いること
    を特徴とするレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
    トのスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
    の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
    アミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有するレ
    セプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニ
    ング用キット。
14. 【請求項１４】 請求項１２記載のスクリーニング方法
    または請求項１３記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られるレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
    ト。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載のレセプターアゴニス
    トまたはアンタゴニストを含有してなる医薬。
16. 【請求項１６】 鎮痛作用を有する請求項１５記載の医
    薬。
17. 【請求項１７】 請求項１４記載のレセプターアゴニス
    トの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳
    動物の鎮痛方法。
18. 【請求項１８】 鎮痛剤を製造するための請求項１４記
    載のレセプターアゴニストの使用。
19. 【請求項１９】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
    の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
    アミドもしくはそのエステルまたはその塩の有効量を哺
    乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の鎮痛方
    法。
20. 【請求項２０】 鎮痛剤を製造するための請求項１記載
    のタンパク質もしくはその塩、または請求項２記載の部
    分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
    たはその塩の使用。
21. 【請求項２１】 請求項３記載のＤＮＡの有効量を哺乳
    動物に投与することを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法。
22. 【請求項２２】 鎮痛剤を製造するための請求項３記載
    のＤＮＡの使用。