ES2244456T3 - Anticuerpos monoclonales selectivos para vgf y su uso para tratar trastornos relacionados con vgf. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que fija específicamente a una secuencia de aminoácidos, seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, o una variante presente en la naturaleza de la misma.

Description

Anticuerpos monoclonales selectivos para VGF y su uso para tratar trastornos relacionados con VGF.

Campo del invento

Este invento se refiere a nuevos polipéptidos de VGF y a agentes de fijación selectiva. El invento se refiere también a células anfitrionas y a métodos para producir polipéptidos de VGF. El invento se refiere además a composiciones farmacéuticas de VGF para el tratamiento, el mejoramiento y/o la prevención de enfermedades, condiciones y trastornos que se asocian con los polipéptidos de VGF.

Antecedentes del invento

Un VGF es un polipéptido segregado que se encuentra en neuronas y células endocrinas. Canu y colaboradores, 1997, Genomics, 45:443-46. Un VGF se encuentra en el hipotálamo, y es regulado en el cerebro por una actividad eléctrica, una lesión y el reloj circadiano. Se ha mostrado que el hipotálamo desempeña un cometido importante en la regulación de la ingestión de alimentos y de la salida de energía, y se ha mostrado que un daño causado al hipotálamo afecta tanto al apetito como al peso corporal. Schwartz y colaboradores, 1995, Am. J. Physiol., 269:949-57. Se ha encontrado también que un VGF desempeña un cierto cometido en el metabolismo.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los VGF humanos y de ratas son conocidas y muestran una alta homología entre ellas, Canu y colaboradores, supra. El gen de VGF, que se había identificado originalmente como un fragmento de ADNc (cromosomal) de 2,7 kb, es transcrito in vitro por neurotrofinas en subpoblaciones de neuronas y células endocrinas.

La obesidad y la anorexia son roturas de la homeostasis de energía, que resultan de desequilibrios entre la ingestión y el gasto de energía. Existe una necesidad de medicamentos destinados al tratamiento eficaz de estas condiciones. Existe también una necesidad de medicamentos eficaces para el tratamiento de caquexia, esterilidad, condiciones hipermetabólicas, hiperactividad, hipoactividad, hiperproducción de insulina, así como de condiciones y trastornos afines.

Sumario del invento

El presente invento proporciona un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, que fija específicamente a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Un polipéptido aislado preferido es el de la SEQ ID NO: 2.

En el presente texto se describe un polipéptido aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, teniendo el fragmento una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Un polipéptido aislado preferido comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2, teniendo el fragmento una actividad del polipéptido que se expone en SEQ ID NO: 2.

También se describe un polipéptido aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos, seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 con al menos una sustitución conservativa de aminoácidos, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10;

(b) la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 con al menos una introducción o inserción de aminoácidos, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10;

(c) la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 con al menos una supresión o deleción de aminoácidos, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10;

(d) la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 que tiene una truncación en el extremo terminal de C y/o N, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; y

(e) la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 con al menos una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, una truncación en el extremo terminal de carboxilo y una truncación en el extremo terminal de amino, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

También se proporcionan polipéptidos de fusión, que comprenden por lo menos un polipéptido como se describe, fusionado a una secuencia heteróloga de aminoácidos.

El presente invento proporciona anticuerpos monoclonales, capaces de fijar específicamente a una secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

Los anticuerpos monoclonales del invento pueden estar fijados opcionalmente a una marca detectable.

Estos anticuerpos monoclonales son capaces de antagonizar una actividad biológica de un VGF.

Un anticuerpo monoclonal preferido, o un fragmento del mismo, es capaz de fijar específicamente a la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2, o a un fragmento de la misma.

El presente invento proporciona también composiciones farmacéuticas, que comprenden los anticuerpos monoclonales del invento, y también están abarcados por el invento uno o más agentes de formulación farmacéuticamente aceptables. El agente de formulación puede ser un apropiado vehículo, coadyuvante, solubilizante, estabilizante o antioxidante. Los anticuerpos monoclonales pueden ser modificados covalentemente con un polímero soluble en agua, tal como un poli(etilen-glicol) y un dextrano. Las composiciones farmacéuticas del presente invento se usan para proporcionar cantidades terapéuticamente eficaces de los anticuerpos monoclonales del presente invento. El presente invento proporciona también métodos para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades, condiciones o trastornos que se relacionan con un VGF.

El presente invento proporciona además el uso de los anticuerpos monoclonales que antes se definen, para la producción de un medicamento destinado a tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, condición o trastorno que se relaciona con un VGF. Las enfermedades, las condiciones y los trastornos que se relacionan con un VGF incluyen obesidad, esterilidad, caquexia, trastornos en la comida, un complejo relacionado con el SIDA, condiciones hipermetabólicas, hiperactividad, hipoactividad e hiperproducción de insulina. Los trastornos en la comida relacionados con un VGF incluyen bulimia y anorexia nerviosas. Se apreciará que el presente invento proporciona el uso de los anticuerpos monoclonales del presente invento para la producción de un medicamento destinado a tratar, prevenir o mejorar una enfermedad relacionada con un VGF.

También se proporciona el uso de los anticuerpos monoclonales del invento para determinar la presencia o la cantidad de expresión de un polipéptido de VGF en un fluido corporal y para diagnosticar la enfermedad, la condición o el trastorno que se relaciona con un VGF o la susceptibilidad a una enfermedad, una condición o un trastorno que se relaciona con un VGF, basándose en la presencia o en la cantidad de expresión del polipéptido de VGF en el fluido corporal.

En una realización preferida, el animal es un mamífero. En una realización incluso más preferida, el animal es un ser humano.

Estos y otros objetos del invento resultarán evidentes después de tomar en consideración la memoria descriptiva como un conjunto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra el peso corporal de ratones desactivados (del inglés knockout) con VGF después de una administración de VGF-1a (SEQ ID NO: 2). La administración del VGF-1a se hizo cesar en el día 5 (como se indica por la flecha);

la Figura 2 ilustra los niveles de títulos de anticuerpos de un conejo al que se ha inyectado VGF-1 (SEQ ID NO: 1);

la Figura 3 ilustra los niveles de títulos de anticuerpos de un conejo al que se ha inyectado VGF-2 (SEQ ID NO: 4).

Descripción detallada del invento

Los encabezamientos de secciones que aquí se usan se dan solamente con finalidades organizativas y no han de ser consideradas como limitadoras de la materia objetivo descrita.

Definiciones

El concepto de "polipéptido de VGF" se refiere a un polipéptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se exponen en la Tabla I, y a polipéptidos relacionados que aquí se describen. Los polipéptidos relacionados incluyen fragmentos, ortólogos, variantes y derivados de polipéptidos de VGF, que poseen por lo menos una característica de uno cualquiera de los polipéptidos de VGF que se exponen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Los polipéptidos de VGF pueden ser polipéptidos maduros, como aquí se definen, y pueden tener o no tener un residuo de metionina en el extremo terminal de amino, dependiendo del método por el que se preparen.

TABLA I Polipéptidos de VGF

1

\vskip1.000000\baselineskip

El concepto de "fragmento de polipéptido de VGF" se refiere a un polipéptido que comprende una truncación en el extremo terminal de amino y/o una truncación en el extremo terminal de carboxilo de uno cualquiera de los polipéptidos de VGF que se exponen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. El concepto de "fragmentos de polipéptidos de VGF" se refiere también a truncaciones en los extremos terminales de amino y/o terminales de carboxilo de ortólogos, variantes o derivados de polipéptidos de VGF. Los fragmentos de polipéptidos de VGF pueden resultar de un empalme con ARN alternativo o de una actividad de proteasa in vivo. Tales fragmentos de polipéptidos de VGF pueden comprender opcionalmente un residuo de metionina en el extremo terminal de amino. Se apreciará que dichos fragmentos se pueden usar, por ejemplo, con el fin de generar anticuerpos para polipéptidos de VGF.

El concepto de "ortólogo de polipéptido de VGF" se refiere a un polipéptido procedente de otra especie, que corresponde a uno cualquiera de los polipéptidos de VGF que se exponen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Por ejemplo, los polipéptidos de VGF de ratón y de ser humano se consideran ortólogos uno de otro.

El concepto de "variantes de polipéptidos de VGF" se refiere a polipéptidos de VGF que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen una o más sustituciones (conservativas, no conservativas o una combinación de ellas), deleciones (tales como deleciones internas y/o fragmentos de polipéptidos de VGF) y/o adiciones (tales como adiciones internas y/o polipéptidos de fusión de VGF) en la secuencia de aminoácidos, en comparación con uno cualquiera de los polipéptidos de VGF que se exponen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Las variantes pueden presentarse en la naturaleza (p.ej. variantes alélicas de polipéptidos de VGF u ortólogos de polipéptidos de VGF) o pueden ser construidas artificialmente.

El concepto de "derivados de polipéptidos de VGF" se refiere a cualquiera de los polipéptidos de VGF que se exponen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o a fragmentos, ortólogos o variantes de polipéptidos de VGF, como aquí se definen, que se han modificado químicamente. Las modificaciones químicas pueden realizarse, por ejemplo, por unión covalente de uno o más polímeros, incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros solubles en agua, hidratos de carbono enlazados a N o enlazados a O, azúcares, y fosfatos. Los derivados de polipéptidos de VGF están modificados de una manera que es diferente de la de un polipéptido de VGF que se presenta en la naturaleza, ya sea en el tipo o en la situación de las moléculas unidas al polipéptido. Los derivados de polipéptidos de VGF incluyen además polipéptidos de VGF que tienen una deleción de uno o más grupos químicos unidos de manera natural al polipéptido de VGF.

El concepto de "polipéptido de VGF maduro" se refiere a un polipéptido de VGF que carece de una secuencia conductora. Un polipéptido de VGF maduro puede incluir también otras modificaciones tales como un tratamiento proteolítico del extremo terminal de amino (con o sin una secuencia conductora) y/o del extremo terminal de carboxilo, una disociación de un polipéptido de menor tamaño a partir de un precursor de mayor tamaño, una glicosilación enlazada a N y/o enlazada a O, y similares.

El concepto de "polipéptido de fusión de VGF" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tales como un péptido o polipéptido heterólogo) en el extremo terminal de amino o de carboxilo de un polipéptido, fragmento, ortólogo, variante o derivado de VGF.

El concepto de "polipéptidos de VGF biológicamente activos" se refiere a polipéptidos de VGF que tienen por lo menos una actividad característica del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Además, un polipéptido de VGF puede ser activo como un inmunógeno; es decir que el polipéptido de VGF comprende por lo menos un epítopo para el que se pueden inducir anticuerpos.

El concepto de "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido del presente invento que (1) ha sido separado de al menos aproximadamente un 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los que es hallado de manera natural cuando se aísla a partir de la célula de fuente, (2) no está enlazado (por interacción covalente o no covalente) a la totalidad o a una parte de un polipéptido con el que está enlazado el "polipéptido aislado" en la naturaleza, (3) está enlazado operativamente (por interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el que no está enlazado en la naturaleza, o (4) no se presenta en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualesquiera otros polipéptidos contaminadores u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural, que pudieran interferir con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o para investigación.

El concepto de "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (p.ej., un ácido nucleico, plásmido o virus) que se usa para transferir información de codificación a una célula anfitriona.

El concepto de "vector de expresión" se refiere a un vector que es apropiado para la transformación de una célula anfitriona y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias heterólogas insertadas de ácidos nucleicos. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como los de transcripción, traducción, y empalme de ARN, si están presentes intrones.

El concepto de "célula anfitriona" se usa para referirse a una célula que ha sido transformada, o es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico, y luego es capaz de expresar un gen seleccionado que interese. El concepto incluye la progenie de la célula progenitora, independientemente de que la progenie sea idéntica o no al progenitor original en cuanto a morfología o en cuanto a constitución genética, siempre y cuando que esté presente el gen seleccionado.

El concepto de "identidad", como se conoce en la especialidad, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptidos o de dos o más moléculas de ácidos nucleicos, que se determina comparando las secuencias. En la especialidad, "identidad" significa también el grado de afinidad en cuanto a secuencias entre polipéptidos o moléculas de ácidos nucleicos, según sea el caso, tal como se determine por el apareamiento entre hebras de dos o más nucleótidos o de dos o más secuencias de aminoácidos. La "identidad" mide el tanto por ciento de apareamientos idénticos entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de lagunas (si las hay) a las que se dedica un particular modelo matemático o programa de ordenador (es decir, "algoritmos").

El concepto de "similaridad" es un concepto afín, pero, en contraste con la "identidad", la "similaridad" se refiere a una medida de la afinidad, que incluye tanto apareamientos idénticos como apareamientos de sustituciones conservativas. Si dos secuencias de polipéptidos tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto de ellos son en su totalidad sustituciones no conservativas, entonces el tanto por ciento de identidad y de similaridad sería en ambos casos de 50%. Si, en el mismo ejemplo, hay cinco posiciones más en las que hay sustituciones conservativas, entonces el tanto por ciento de identidad permanece siendo de 50%, pero el tanto por ciento de similaridad sería de 75% (15/20). Por lo tanto, en casos en los que hay sustituciones conservativas, el tanto por ciento de similaridad entre dos polipéptidos será mayor que el tanto por ciento de identidad entre estos dos polipéptidos.

El concepto de "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN ó ARN. El concepto abarca moléculas formadas a partir de los análogos a bases conocidas de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a 4-acetil-citosina, 8-hidroxi-N6-metil-adenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, dihidro-uracilo, inosina, N6-iso-pentenil-adenina, 1-metil-adenina, 1-metil-pseudouracilo, 1-metil-guanina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metil-adenina, 2-metil-guanina, 3-metil-citosina, 5-metil-citosina, N6-metil-adenina, 7-metil-guanina, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, beta-D-manosil-queosina, 5'-metoxicarbonil-metil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, 2-metiltio-N6-isopentenil-adenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tio-citosina, 5-metil-2-tio-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudo-uracilo, queosina, 2-tio-citosina y 2,6-diamino-purina.

El concepto de "que se presenta en la naturaleza" o "natural", cuando se usa en conexión con materiales biológicos tales como moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, células anfitrionas y similares, se refiere a materiales que son encontrados en la naturaleza y no han sido manipulados por un ser humano. Similarmente, el concepto de "que no se presenta en la naturaleza" o "no natural", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a un material que no es encontrado en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por un ser humano.

El concepto de "enlazado operativamente" se usa en el presente contexto para referirse a una disposición de secuencias flanqueadoras, estando las secuencias flanqueadoras así descritas configuradas o ensambladas de manera tal que realizan su función usual. Por lo tanto, una secuencia flanqueadora enlazada operativamente a una secuencia de codificación puede ser capaz de efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación. Por ejemplo, una secuencia de codificación está enlazada operativamente a un promotor, cuando el promotor es capaz de dirigir una transcripción de esa secuencia de codificación. Una secuencia flanqueadora no necesita estar contigua a la secuencia de codificación, siempre y cuando que funcione correctamente. Por lo tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas pero transcritas entre una secuencia promotora y la secuencia de codificación, y la secuencia promotora se puede considerar todavía como "enlazada operativamente" a la secuencia de codificación.

Los conceptos de "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" se refieren cada una a la cantidad de un polipéptido de VGF que se usa para soportar un nivel observable de una o más actividades biológicas de los polipéptidos de VGF que aquí se exponen.

El concepto de "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable" como se usa en el presente contexto, se refiere a uno o más materiales de formulación que son apropiados para realizar o intensificar el suministro del polipéptido de VGF o de un agente de fijación selectiva para VGF como una composición farmacéutica.

El concepto de "agente de fijación selectiva" se refiere a una molécula o varias moléculas que tiene(n) especificidad para un polipéptido de VGF. Como se usan en el presente contexto, los conceptos de "específico" y "especificidad" se refieren a la aptitud de los agentes de fijación selectiva para fijar a polipéptidos de VGF y para no fijar a polipéptidos que no son de VGF. Se apreciará, sin embargo, que los agentes de fijación selectiva pueden fijar también a ortólogos de VGF.

El concepto de "transducción" se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, usualmente por medio de un fago. La "transducción" se refiere también a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por los retrovirus.

El concepto de "transfección" se usa para referirse a la recogida de un ADN ajeno o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el ADN exógeno ha sido introducido en el interior de la membrana celular. Se conocen bien en la especialidad y se describen aquí un cierto número de técnicas de transfección. Véanse, p.ej. las citas de Graham y colaboradores, 1973, Virology 52:456;, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio] (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis y colaboradores, Basic Methods in Molecular Biology [Métodos básicos en biología molecular] (Elsevier, 1986); y Chu y colaboradores, 1981, Gene [Gen] 13:197. Dichas técnicas se pueden usar para introducir uno o más restos de ADN exógenos en apropiadas células anfitrionas.

El concepto de "transformación", como se usa en el presente contexto, se refiere a un cambio en unas características genéticas de una célula, y una célula ha sido transformada cuando ha sido modificada para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula está transformada cuando está modificada genéticamente desde su estado natural. A continuación de una transfección o transducción, el ADN en transformación puede recombinarse con el de la célula por integración física dentro de un cromosoma de la célula, puede ser mantenido transitoriamente como un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula ha sido transformada establemente, cuando el ADN es replicado con la división de la célula.

Afinidad de polipéptidos de VGF

Unas modificaciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF producirán un polipéptido que tendrá características funcionales y químicas similares a las del polipéptido de VGF. En contraste, unas modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de un polipéptido de VGF pueden conseguirse seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VGF que difieran de una manera significativa en cuanto a su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

Por ejemplo una "sustitución conservativa de un aminoácido" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido natural por un residuo no natural, de manera tal que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo natural en el polipéptido puede ser también sustituido por alanina, como se ha descrito con anterioridad para "mutagénesis por exploración con alanina".

Las sustituciones conservativas de aminoácidos abarcan también residuos de aminoácidos no presentes en la naturaleza, que se incorporan típicamente mediante síntesis químicas de péptidos en vez de por síntesis en sistemas biológicos. Éstas incluyen compuestos miméticos de péptidos, u otras formas inversas o invertidasde restos de aminoácidos.

Los residuos presentes en la naturaleza se pueden dividir en clases, basándose en propiedades comunes de cadenas laterales:

1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen sobre la orientación de las cadenas: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, unas sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituyentes pueden ser introducidos en regiones de un polipéptido de VGF que son homólogas con otros ortólogos de polipéptidos de VGF, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Al hacer dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobia y de cargas. Los índices hidropáticos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína / cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

La importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir una función biológica interactiva a una proteína, ha sido entendida generalmente en la especialidad (Kyte y colaboradores, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31). Es conocido que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático o una calificación hidropática similar y todavía retengan una actividad biológica similar. Al hacer cambios basándose en el índice hidropático, se prefiere la sustitución por aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de \pm 2, se prefieren particularmente los que están dentro de \pm 1 y se prefieren incluso más particularmente los que están dentro de \pm 0,5.

Se entiende también en la especialidad que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de una manera efectiva sobre la base de la hidrofilia, particularmente cuando la proteína o el péptido funcionalmente equivalente desde el punto de vista biológico, creado de esta manera, está destinado a usarse en realizaciones inmunológicas, tal como ocurre en el presente caso. La más grande hidrofilia media local de una proteína, como se gobierna por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y se antigenicidad, es decir con una propiedad biológica de la proteína.

Los siguientes valores de la hidrofilia han sido asignados a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); y triptófano (-3,4). Al hacer cambios basándose en similares valores de hidrofilia se prefiere la sustitución por aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de \pm 2, se prefieren particularmente los que están dentro de \pm 1 y se prefieren incluso más particularmente aquellos que están dentro de \pm 0,5. Se pueden identificar también epítopos procedentes de secuencias primarias de aminoácidos, sobre la base de la hidrofilia. Estas regiones son citadas también como "regiones de núcleos epitópicos".

Las deseadas sustituciones de aminoácidos (independientemente de que sean conservativas o no conservativas) se pueden determinar por los expertos en la especialidad en el momento en que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, se pueden usar sustituciones por aminoácidos para identificar residuos importantes del polipéptido de VGF, o bien para aumentar o disminuir la afinidad de los polipéptidos de VGF que aquí se describen. Sustituciones ilustrativas de aminoácidos se exponen en la Tabla II.

TABLA II Sustituciones de aminoácidos

Residuos originales		Sustituciones ilustrativas		Sustituciones preferidas
Ala	\hskip0,5cm	Val, Leu, Ile	\hskip0,5cm	Val
Arg		Lys, Gln, Asn		Lys
Asn		Gln		Gln
Asp		Glu		Glu
Cys		Ser, Ala		Ser
Gln		Asn		Asn
Glu		Asp		Asp
Gly		Pro, Ala		Ala
His		Asn, Gln, Lys, Arg		Arg
Ile		Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina		Leu
Leu		norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe		Ile
Lys		Arg, ácido 1,4-diamino-butírico, Gln, Asn		Arg
Met		Leu, Phe, Ile		Leu
Phe		Leu, Val, Ile, Ala, Tyr		Leu
Pro		Ala		Gly
Ser		Thr, Ala, Cys		Thr
Thr		Ser		Ser
Trp		Tyr, Phe		Tyr
Tyr		Tpr.Phe, Thr, Ser		Phe
Val		Ile, Met, leu, Phe, Ala, norleucina		Leu

Un profesional experto será capaz de determinar apropiadas variantes de polipéptidos de VGF usando técnicas bien conocidas. Para identificar apropiadas zonas de la molécula, que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad biológica, un experto en la especialidad puede dirigirse hacia zonas que no se crea que son importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares procedentes de la misma especie o procedentes de otra especie, un experto en la especialidad puede comparar la secuencia de aminoácido de un polipéptido de VGF con la de dichos polipéptidos similares. Con dicha comparación, se pueden identificar residuos y partes de las moléculas que se hayan conservado entre polipéptidos similares. Se apreciará que sería menos probable que unos cambios en zonas de la molécula de VGF, que no están conservadas en relación con dichos polipéptidos similares, afectasen desfavorablemente a la actividad biológica y/o a la estructura de un polipéptido de VGF. Un experto en la especialidad podría conocer también que, incluso en regiones relativamente conservadas, se puede sustituir por aminoácidos químicamente similares a los residuos que se presentan en la naturaleza, mientras que se retiene la actividad (sustituciones conservativas de residuos de aminoácidos). Por lo tanto, incluso zonas que pueden ser importantes para una actividad biológica o para una estructura pueden ser objeto de sustituciones conservativas de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar desfavorablemente a la estructura de polipéptidos.

Adicionalmente, un experto en la especialidad puede recopilar estudios sobre funciones y estructuras que identifiquen residuos en polipéptidos similares que sean importantes para una actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, puede predecirse la importancia de los residuos de aminoácidos en un polipéptido de VGF que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para una actividad o estructura en polipéptidos similares. Un experto en la especialidad puede escoger sustituciones de aminoácidos químicamente similares por dichos residuos de aminoácidos importantes predichos de polipéptidos de VGF.

Un experto en la especialidad puede analizar también la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la especialidad puede predecir la alineación de residuos de aminoácidos de un polipéptido de VGF con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la especialidad puede escoger no hacer cambios radicales en residuos de aminoácidos que se prediga que estén sobre la superficie de la proteína, puesto que dichos residuos pueden estar implicados en importantes interacciones con otras moléculas. Además, un experto en la especialidad puede generar variantes de ensayos que contengan una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido. Las variantes podrían ser exploradas usando ensayos de actividad conocidos por los que poseen experiencia en la especialidad. Dichas variantes se podrían usar para recoger información acerca de variantes apropiadas. Por ejemplo, si se descubriese que un cambio por un residuo de aminoácido particular diese como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inapropiada, se deberían evitar las variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en la información recogida a partir de dichos experimentos rutinarios, un experto en la especialidad puede determinar con facilidad los aminoácidos en los que se deberían evitarse sustituciones adicionales, ya sea a solas o en combinación con otras mutaciones.

Se han dedicado cierto número de publicaciones científicas a la predicción de una estructura secundaria. Véanse las citas de Moult, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:422-27; Chou y colaboradores, 1974, Biochemistry 13:222-45; Chou y colaboradores, 1974, Biochemistry 113:211-22; Chou y colaboradores, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-48; Chou y colaboradores, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou y colaboradores, 1979, Biophys. J. 26:367-84. Además, actualmente están disponibles programas de ordenador para ayudar a predecir una estructura secundaria. Un método de predecir una estructura secundaria se basa en una modelación de homologías. Por ejemplo dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad entre secuencias mayor que 30% o una similaridad mayor que 40%, tienen con frecuencia similares topologías estructurales. El reciente crecimiento de las bases de datos estructurales de proteínas (PDB, de Protein Structural Database) ha proporcionado una capacidad aumentada de predicción de una estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase la cita de Holm y colaboradores, 1999, Nucleic Acids Res. 27:244-47. Se ha sugerido que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido dado o en una proteína dada, y que una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural resultará espectacularmente más exacta (Brenner y colaboradores, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:369-76).

Métodos adicionales de predecir una estructura secundaria incluyen "enhebrar" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87); Sippl y colaboradores, 1996, Structure 4:15-19), un "análisis de perfiles" (Bowie y colaboradores, 1991, Science, 253:164-70: Gribskov y colaboradores, 1990, Methods Enzymol. 183:146-59; Gribskov y colaboradores, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84:4355-58), y un "enlace evolutivo" (véanse las citas de Holm y colaboradores, supra y de Brenner y colaboradores, supra).

Preferidas variantes de polipéptidos de VGF incluyen variantes por glicosilación, en las que se han alterado el número y/o el tipo de sitios de glicosilación en comparación con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de VGF del presente invento. En una realización, las variantes de polipéptidos de VGF comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación enlazados en N que el de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de VGF del presente invento. Un sitio de glicosilación enlazado en N está caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, pudiendo el residuo de aminoácido designado por X ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de hidrato de carbono enlazado en N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia, retirarán una existente cadena de hidrato de carbono enlazado en N. También se proporciona una redisposición de cadenas de hidratos de carbono enlazadas en N, en la que se eliminen uno o más sitios de glicosilación enlazados en N (típicamente los que se presentan en la naturaleza) y se crean uno o más nuevos sitios enlazados en N. Adicionales variantes de VGF preferidas incluyen variantes con cisteína, en que uno o más residuos de cisteína han sido suprimidos o sustituidos por otro aminoácido (p.ej. serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de VGF del presente invento. Las variantes con cisteína son útiles cuando los polipéptidos de VGF deben ser replegados a una conformación biológicamente activa, tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes con cisteína tienen generalmente menos residuos de cisteína que la proteína natural, y típicamente tienen un número par de ellos, para minimizar las interacciones que resulten de cisteínas no
apareadas.

Además, los polipéptidos de VGF se pueden fusionar con un polipéptido homólogo para formar un homodímero, o con un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección y/o el aislamiento de polipéptido de fusión con VGF; una proteína de receptor transmembranal o una parte de la misma, tal como un dominio extracelular de un dominio transmembranal e intracelular; un ligando, o una parte del mismo, que se fija a una proteína receptora transmembranal; una enzima, o una parte de la misma, que es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido que favorece la oligomerización, tal como un dominio zipper (cierre de cremallera) de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente de la de los polipéptidos de VGF del presente invento.

Pueden hacerse fusiones junto al extremo terminal de amino o junto al extremo terminal de carboxilo de un polipéptido de VGF. Las fusiones pueden ser directas, sin ninguna molécula engarzadora o adaptadora, o se pueden realizar a través de una molécula engarzadora o adaptadora. Una molécula engarzadora o adaptadora puede tener uno o más residuos de aminoácidos, típicamente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. También se puede diseñar una molécula engarzadora o adaptadora con un sitio de disociación para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa, con el fin de permitir la separación de los restos fusionados. Se apreciará que una vez construidos, los polipéptidos de fusión pueden ser derivatizados de acuerdo con los métodos que aquí se describen.

En una realización adicional del invento, un polipéptido de VGF se fusiona con uno o más dominios de una región Fc de IgG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que fija a un antígeno, y un dominio constante conocido como "Fc", que está implicado en funciones efectoras tales como la activación del complemento y el ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una larga semi-vida en el suero, mientras que un Fab es de corta vida. Capon y colaboradores, 1989, Nature 337:525-31. Cuando se construye conjuntamente con una proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar una semi-vida más larga o incorporar funciones tales como la de fijación a receptores de Fc, la fijación a la Proteína A, la fijación del complemento, y posiblemente incluso una transferencia placentaria. Id. La Tabla III recopila el uso de ciertas funciones de Fc conocidas en la especialidad.

TABLA III Fusión de Fc con Proteínas Terapéuticas

2

En un ejemplo, una región charnela de IgG humana, una región CH2 y una región CH3 se puede fusionar en uno cualquiera de los extremos terminales de amino o extremos terminales de carboxilo de los polipéptidos de VGF usando métodos conocidos para un profesional experto. El resultante polipéptido de fusión de VGF se puede purificar por uso de una columna con afinidad para la Proteína A. Se ha encontrado que los péptidos y las proteínas que se han fusionado con una región de Fc exhiben in vivo una semi-vida sustancialmente mayor que el o la contrapartida que no se ha fusionado. También, una fusión con una región Fc permite una dimerización / multimerización del polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc presente en la naturaleza, o se puede alterar para mejorar ciertas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, período de tiempo de circulación, o aglomeración (agregación) reducida.

Una identidad y una similaridad de polipéptidos afines se pueden calcular con facilidad por métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology [Biología molecular computacional] (A.M. Lesk, coordinador de edición, Oxford University Press 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects [Biocomputación: Informática y Proyectos de Genoma] (D.W. Smithh, coordinador de edición, Academic Press 1993); Computer Analysis of Sequence Data [Análisis por Ordenador de Datos de Secuencias] (Parte 1, A.M. Griffin y H.G. Griffin, coordinadores de edición, Humana Press (1994); G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology [Análisis de Secuencias en Biología Molecular] (Academic Press 1987); Sequence Analysis Primer [Cebador para Análisis de Secuencias] (M. Gribskov y J. Devereux, coordinadores de edición, M. Stockton Press 1991); y Carillo y colaboradores, 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073.

Unos métodos preferidos para determinar una identidad y/o una similaridad se diseñan para dar el más amplio apareamiento entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar una identidad y una similaridad se describen en programas de ordenador disponibles públicamente. Unos preferidos métodos de programas de ordenador para determinar una identidad y una similaridad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas de GCG, incluyendo el GAP (Devereux y colaboradores, 1984, Nucleic Acids Res. 12:387; del Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, y FASTA (Altschul y colaboradores, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10. El programa BLASTX está disponible públicamente a partir del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y de otras fuentes (Altschul y colaboradores BLAST Manual (NCB NLM NTH, Bethesda, MD); Altschul y colaboradores, 1990, supra). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman se puede usar también para determinar una identidad.

Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el apareamiento de solamente una corta región de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad muy alta de secuencias, incluso aunque no haya ninguna relación significativa entre las dos secuencias de plena longitud. Correspondientemente, en una realización preferida, el método de alineación seleccionado (programa GAP) dará como resultado una alineación que franquea al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido reivindicado.

Por ejemplo, usando el algoritmo de ordenador GAP (del Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los que se ha de determinar el porcentaje de identidad de secuencias, se alinean para un apareamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (el "tramo apareado" tal como se determina por el algoritmo). Una sanción por apertura de laguna (que se calcula como 3 veces la diagonal media; la "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que se está usando; la "diagonal" es la calificación o el número que se asigna a cada apareamiento perfecto de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una sanción por prolongación de laguna (que usualmente es de 0,1 veces la sanción por apertura de lagunas), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62, se usan en conjunción con el algoritmo. Se usa por el algoritmo también una matriz de comparación patrón (véanse las citas de Dayhoff y colaboradores, 5 Atlas of Protein Sequence and Structure [Atlas de Secuencias y Estructuras de Proteínas] (suplemento 3 1978) (PAM 250 comparison matrix = matriz de comparación PAM 250); y de Henikoff y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89:10915-19 (BLOSUM 62 comparison matrix = matriz de comparación BLOSUM 62)).

Parámetros preferidos para una comparación entre secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-53

Matriz de comparación: BLOSUM 62 (Henikoff y colaboradores, supra);

Sanción por laguna: 12

Sanción por longitud de laguna: 4

Umbral de similaridad: 0

El programa GAP es útil con los anteriores parámetros. Los parámetros antes mencionados son los parámetros de omisión para comparaciones entre polipéptidos (juntamente con ninguna sanción por lagunas extremas) usando el algoritmo de GAP.

Se pueden usar otros algoritmos ejemplares, otras sanciones por apertura de lagunas, otras sanciones por prolongación de lagunas, otras matrices de comparación y otros umbrales de similaridad, incluyendo los que se exponen en el Manual de Programas, Paquete de Wisconsin, Versión 9, Septiembre de 1997. Las elecciones particulares que han de hacerse resultarán evidentes a los que poseen experiencia en la especialidad, y dependerán de la comparación específica que se ha de hacer, tal como de una proteína con otra proteína, de una proteína con un ADN; y adicionalmente, si la comparación se realiza entre pares dados de secuencias (en cuyo caso se prefieren generalmente el GAP o el BestFit) o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren el FASTA o el BLASTA).

Moléculas de ácidos nucleicos

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF, se pueden obtener con facilidad por una diversidad de maneras incluyendo, sin limitación, una síntesis química, un escrutinio de ADNc o de una biblioteca genómica, un escrutinio de una biblioteca de expresión, y/o una amplificiación por PCR de un ADNc.

Los métodos de ADN recombinantes, que aquí se usan, son generalmente los que se exponen en Sambroook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio] (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en Biología Molecular] (Ausubel y colaboradores, coordinadores de edición, Green Publishers Inc. y Wiley y Sons 1994).

Las moléculas de ácidos nucleicos, que codifican la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de VGF, se pueden identificar mediante una clonación con expresión, que emplea la detección de clones positivos basándose en una propiedad de la proteína expresada. Típicamente, se escrutan bibliotecas de ácidos nucleicos mediante la fijación de un anticuerpo u otro partícipe en la fijación (p.ej., un receptor o ligando) a proteínas clonadas, que son expresadas y visualizadas sobre una superficie de una célula anfitriona. El anticuerpo o partícipe en la fijación es modificado con una marca detectable para identificar las células que expresan el clon deseado.

Se pueden seguir técnicas de expresión recombinante, realizadas de acuerdo con las descripciones expuestas más adelante, para producir estos polinucleótidos y para expresar los polipéptidos codificados. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF dentro de un vector apropiado, un experto en la especialidad puede producir con facilidad grandes cantidades de la deseada secuencia de nucleótidos. Las secuencias se pueden usar entonces para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF se puede introducir dentro de un vector de expresión. Por introducción el vector de expresión dentro de un anfitrión apropiado, el polipéptido de VGF codificado se puede producir en grandes cantidades.

Otro método para obtener una apropiada secuencia de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de polymerase chain reaction). En este método, se prepara un ADNc (complementario) a partir de un poli(A) + ARN o el ARN total usando la enzima transcriptasa inversa. Dos cebadores, típicamente complementarios con dos regiones separadas de un ANDc que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF, se añaden luego al ADNc junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.

Otro medio de preparar una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF consiste en una síntesis química usando métodos bien conocidos para un profesional experto, tales como los descritos por Engels y colaboradores, 1989, Angew. Chem. Edición Internacional 28:716-34. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos del fosfotriéster, del fosforoamidito y del H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para dicha síntesis química es la síntesis soportada por un polímero usando una química clásica del fosforoamidito. Típicamente, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF tendrá una longitud de varios cientos de nucleótidos. Ácidos nucleicos mayores que aproximadamente 100 nucleótidos se pueden sintetizar en forma de varios fragmentos usando estos métodos. Luego los fragmentos se pueden ligar conjuntamente para formar la secuencia de nucleótidos de plena longitud de un gen de VGF. Usualmente, el fragmento de ADN que codifica el extremo terminal de amino del polipéptido tendrá un ATG, que codifica un residuo de metionina. Esta metionina puede estar o no estar presente en la forma madura del polipéptido de VGF, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula anfitriona ha sido diseñado para ser segregado a partir de esa célula. Se pueden usar igualmente otros métodos conocidos para un profesional experto.

En ciertas realizaciones, las variantes de ácidos nucleicos contienen codones que han sido alterados para realizar una expresión óptima de un polipéptido de VGF en una célula anfitriona dada. Las alteraciones particulares de codones dependerán del polipéptido de VGF y de la célula anfitriona que se seleccione para expresión. Dicha "optimización de codones" se puede llevar a cabo por una diversidad de métodos, por ejemplo, seleccionando codones que son preferidos para usarse en genes expresados en alto grado en una célula anfitriona dada. Se pueden usar algoritmos de ordenador, que incorporan tablas de frecuencias de codones tales como el "Eco_high.Cod" para preferencia de codones de genes bacterianos expresados en alto grado, y éstos son proporcionados por el Paquete de la Universidad de Wisconsin Versión 9.0 (del Genetics Compuiter Group, Madison, WI). Otras útiles tablas de frecuencias de codones incluyen las "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod" y "Yeast_high.cod".

En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de polipéptidos de VGF que codifiquen moléculas de ácidos nucleicos. Se pueden producir variantes que codifiquen moléculas de ácidos nucleicos usando una mutagénesis dirigida a un sitio, una amplificación por PCR, u otros métodos apropiados, en que el (los) cebador(es) tiene(n) las deseadas mutaciones puntuales (véanse las citas de Sambrook y colaboradores, supra y de Ausubel y colaboradores, supra, para tener descripciones de las técnicas de mutagénesis. Se pueden usar para preparar dichas variantes también métodos que usan síntesis químicas, descritos por Engels y colaboradores, supra. Se pueden usar asimismo otros métodos conocidos para un profesional experto.

Vectores y células anfitrionas

Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF se inserta en un apropiado vector de expresión usando técnicas de ligación clásicas. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula anfitriona particular empleada (es decir, que el vector es compatible con la maquinaria de la célula anfitriona de manera tal que puede producirse una amplificación del gen y/o una expresión del gen). Una molécula de ácido nucleico, que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de VGF, se puede amplificar /
expresar en células anfitrionas procarióticas, de levaduras, de insectos (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de la célula anfitriona dependerá en parte de si un polipéptido de VGF ha de ser modificado (p.ej. glicosilado y/o fosforilado) después de la traducción. Si es así, son preferibles las células anfitrionas de levaduras, insectos o mamíferos. Para una recopilación de vectores de expresión, véase la cita de Meth. Enz., volumen 185 (D.V. Goeddel, coordinador de edición, Academic Press 1990).

Típicamente, los vectores de expresión usados en cualesquiera de las células anfitrionas contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias exógenas de nucleótidos. Dichas secuencias, citadas colectivamente como "secuencias flanqueadoras" en ciertas realizaciones, incluirán típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias de intensificadores, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia completo de intrón que contiene un sitio de empalme de un donante y un aceptore, una secuencia que codifica una secuencia conductora para la secreción de un polipéptido, un sitio de fijación a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región poliengarzadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se ha de expresar, y un elemento marcador seleccionable. Se discute seguidamente cada una de estas secuencias.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica una "marca", es decir una molécula de oligonucleótido situada en el extremo 5' ó 3' de la secuencia de codificación del polipéptido de VGF; la secuencia de oligonucleótidos codifica un poliHis (tales como hexaHis) u otra "marca" tal como FLAG, HA (virus de influenza de hemaglutinina), o myc para las que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta marca se fusiona típicamente con el polipéptido después de la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para la purificación por afinidad del polipéptido de VGF a partir de la célula anfitriona. Una purificación por afinidad se puede realizar, por ejemplo, por cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la marca se puede retirar subsiguientemente desde el polipéptido de VGF purificado por diversos medios, usando ciertas peptidasas para la disociación.

Las secuencias flanqueadoras pueden ser homólogas (es decir, proceder de la misma especie y/o cepa que la célula anfitriona), heterólogas (es decir, proceder de una especie distinta de la especie o cepa de la célula anfitriona), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueadoras procedentes de más de una fuente), o sintéticas, o las secuencias flanqueadoras pueden ser secuencias naturales que funcionan normalmente para regular una expresión de polipéptidos de VGF. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueadora puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanqueadora ha de ser funcional en la maquinaria de la célula anfitriona, y puede ser activada por ella.

Se pueden obtener útiles secuencias flanqueadoras por uno cualquiera de varios métodos bien conocidos en la especialidad. Típicamente, las secuencias flanqueadoras que aquí son útiles - distintas de las secuencias flanqueadoras del gen de VGF - habrán sido previamente identificadas por cartografiado o y/o por digestión con endonucleasas de restricción, y de esta manera se pueden aislar a partir de la apropiada fuente de tejido usando las apropiadas endonucleasas de restricción. En algunos casos, puede ser conocida la plena secuencia de nucleótidos de una secuencia flanqueadora. Aquí, la secuencia flanqueadora se puede sintetizar usando los métodos descritos en la presente memoria para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.

Cuando se conoce la totalidad, o solamente una parte, de la secuencia flanqueadora, ésta se puede obtener usando una PCR y/o por escrutinio de una biblioteca genómica con un apropiado fragmento de secuencia de oligonucleótidos y/o flanqueadora procedente de la misma o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueadora, un fragmento de ADN, que contiene una secuencia flanqueadora, se puede aislar a partir de un trozo mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro u otros genes. El aislamiento se puede realizar por digestión con una endonucleasa de restricción para producir el apropiado fragmento de ADN, seguida por un aislamiento usando una purificación con un gel de agarosa, una cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos para un profesional experto. La selección de enzimas apropiadas para conseguir esta finalidad resultará fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la especialidad.

Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y este origen ayuda a realizar la amplificación del vector en una célula anfitriona. Una amplificación del vector a un cierto número de copias puede ser importante, en algunos casos, para la óptima expresión de un polipéptido de VGF. Si el vector a escoger no contiene un sitio de origen de replicación, uno de éstos se puede sintetizar basándose en una secuencia conocida, y ligar dentro del vector. Por ejemplo, el origen de replicación procedente del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es apropiado para la mayor parte de las bacterias gram negativas, y diversos orígenes (p.ej., de SV40, poliomas, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o virus de papilomas tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 se usa frecuentemente sólo puesto que contiene el promotor temprano).

Una secuencia de terminación de la transcripción está típicamente situada en 3' del extremo de una región de codificación de un polipéptido y sirve para terminar una transcripción. Usualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C, seguido por una secuencia de poli-T. Mientras que la secuencia es clonada con facilidad a partir de una biblioteca o incluso es adquirida comercialmente como parte de un vector, ésta también puede ser sintetizada usando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos, tales como los que aquí se describen.

Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula anfitriona que ha crecido en un medio de cultivo selectivo. Típicos genes marcadores de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencias a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células anfitrionas procarióticas; (b) complementan deficiencias auxótrofas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. Preferidos marcadores seleccionables son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina, y el gen de resistencia a tetraciclina. Se puede usar también un gen de resistencia a neomicina para una selección en células anfitrionas procarióticas y eucarióticas.

Se pueden usar otros genes de selección con el fin de amplificar el gen que será expresado. Una amplificación es el proceso en el que unos genes, que se encuentran en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento, son reiterados en tándem dentro de los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. Ejemplos de apropiados marcadores seleccionables para células de mamíferos incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina cinasa. Los transformantes de células de mamíferos se disponen bajo una presión de selección, en que solamente los transformantes están adaptados singularmente para sobrevivir, en virtud del gen de selección que está presente en el vector. Una presión se selección se impone cultivando las células transformadas en unas condiciones en las que se cambia sucesivamente la concentración de un agente de selección en el medio, conduciendo de esta manera a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica un polipéptido de VGF. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido de VGF a partir del ADN amplificado.

Usualmente, un sitio de fijación a ribosomas es necesario para la iniciación de la traducción de un ARNm (mensajero) y es caracterizado por una secuencia de Shine-Dalgarno (en procariotas) o por una secuencia de Kozak (en eurocariotas). El elemento está situado típicamente en 3' con relación al promotor y en 5' con relación a la secuencia de codificación de un polipéptido de VGF que se ha de expresar. La secuencia de Shine-Dalgarno es variada, pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede ser sintetizada con facilidad usando métodos aquí expuestos, y usada en un vector procariótico.

Una secuencia conductora, o de señal, se puede usar para dirigir un polipéptido de VGF fuera de la célula anfitriona. Típicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de señal es colocada en la región de codificación de una molécula de ácido nucleico de VGF, o directamente junto al extremo 5' de una región de codificación de un polipéptido de VGF. Se han identificado muchas secuencias de señal, y cualquiera de las que son funcionales en la célula anfitriona seleccionada se puede usar en conjunción con una molécula de ácido nucleico de VGF. Por lo tanto, una secuencia de señal puede ser homóloga (presente en la naturaleza) o heteróloga con respecto a la molécula de ácido nucleico de VGF. Adicionalmente, una secuencia de señal se puede sintetizar químicamente usando métodos que aquí se describen. En la mayor parte de los casos, la secreción de un polipéptido de VGF, procedente de la célula anfitriona, a través de la presencia de un péptido de señal dará como resultado la retirada del péptido de señal desde el polipéptido de VGF segregado. La secuencia de señal puede ser una componente del vector, o puede ser una parte de una molécula de ácido nucleico de VGF que se introduce en el vector.

Una secuencia de nucleótidos, que codifica una secuencia de señal de polipéptido de VGF natural, puede ser unida a una región de codificación de polipéptido de VGF, o una secuencia de nucleótidos, que codifica una secuencia de señal heteróloga, puede ser unida a una región de codificación de un polipétido de VGF. La secuencia de señal heteróloga seleccionada deberá ser una que sea reconocida y tratada, es decir, disociada por una peptidasa de señal, por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procarióticas que no reconocen ni tratan a la secuencia de señal de polipéptido de VGF natural, la secuencia de señal es reemplazada por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de las conductoras de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II estable frente al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal de polipéptido de VGF natural puede ser reemplazada por las directoras de invertasa de levadura, el factor alfa o de fosfatasa ácida. En una expresión de células de mamíferos es satisfactoria la secuencia de señal natural, aunque pueden ser apropiadas otras secuencias de señales de mamíferos.

En algunos casos, tal como cuando se desea una glicosilación en un sistema de expresión en células anfitrionas eucarióticas, se pueden manipular las diversas presecuencias con el fin de mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de disociación con una peptidasa de un péptido de señal particular, o añadir pro-secuencias, que pueden también afectar a la glicosilación. El producto proteínico final puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales concomitantes a una expresión, que pueden no haber sido retirados totalmente. Por ejemplo, el producto proteínico final puede tener unido(s) al extremo terminal de amino uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sitio de disociación de una peptidasa. Alternativamente, el uso de algunos sitios de disociación con enzimas puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del deseado polipéptido de VGF, si la enzima corta en dicha zona dentro del polipéptido maduro.

En muchos casos, una transcripción de una molécula de ácido nucleico es aumentada por la presencia de uno o más intrones en el vector, esto es particularmente cierto cuando un polipéptido se produce en células anfitrionas eucarióticas, especialmente células anfitrionas de un mamífero. Los intrones usados pueden estar presentes de manera natural dentro del gen de VGF, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genómica de plena longitud o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no se presenta de manera natural dentro del gen (tal como para la mayor parte de los ADNc) el intrón se puede obtener a partir de otra fuente. La posición del intrón con respecto a secuencias flanqueadoras y al gen de VGF es generalmente importante. puesto que el intrón debe ser transcrito para resultar eficaz. Así, cuando está siendo transcrita una molécula de ADNc de VGF, la posición preferida para el intrón es la de 3' con respecto al sitio de comienzo de la transcripción y la de 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción de poli-A. Preferiblemente, el intrón o los intrones estará(n) situado(s) en uno u otro de los lados (es decir en 5' ó 3') del ADNc, de manera tal que no interrumpa(n) a la secuencia de codificación. Se puede usar cualquier intrón procedente de cualquier fuente, incluyendo organismos víricos, procarióticos y eucarióticos (de plantas o animales) con la condición de que éste sea compatible con la célula anfitriona dentro de la cual se haya de introducir. También se incluyen aquí intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede usar más de un intrón en el vector.

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión y está enlazado operativamente con la molécula que codifica el polipéptido de VGF. Los promotores son secuencias no transcritas, situadas secuencia arriba (es decir en 5') con respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1.000 pb = pares de bases) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores están agrupados convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción desde un ADN bajo su control, en respuesta a un cierto cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, inician una producción continua de un producto génico; es decir, que hay poco o ningún control sobre la expresión de un gen. Se conocen bien un gran número de promotores, reconocidos por una diversidad de células anfitrionas potenciales. Un promotor apropiado es enlazado operativamente con el ADN que codifica un polipéptido de VGF retirando el promotor desde el ADN de fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la deseada secuencia de promotor dentro del vector. La secuencia natural de promotor de VGF se puede usar para dirigir la amplificación y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico de VGF. Se prefiere, sin embargo un promotor heterólogo, si éste permite una mayor transcripción y más altos rendimientos de la proteína expresada en comparación con el promotor natural, y si éste es compatible con el sistema de célula anfitriona que se ha seleccionado para el uso.

Los promotores apropiados para su uso con anfitriones procarióticos incluyen los sistemas de promotores de beta-lactamasa y lactosa; una fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp); y promotores híbridos tales como el promotor tac. Son apropiados también otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias han sido publicadas, permitiendo de esta manera que un experto en la especialidad las ligue con la deseada secuencia de ADN usando engarzadores o adaptadores, según se necesiten para suministrar cualquiera útiles sitios de restricción.

Se conocen también perfectamente en la especialidad promotores apropiados para su uso con anfitriones de levaduras. Se usan ventajosamente intensificadores de levaduras junto con promotores de levaduras. Se conocen bien promotores apropiados para su uso con células anfitrionas de mamíferos, e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos a partir de los genomas de virus tales como un virus del polioma, un virus de la viruela aviar, un adenovirus (tal como el Adenovirus 2), un virus de papiloma bovino, un virus de sarcoma aviar, un citomegalovirus, retrovirus, un virus de la hepatitis B y lo más preferiblemente el Simian Virus 40 = virus simio 40 (SV40). Otros apropiados promotores de mamíferos incluyen promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo los promotores del choque térmico y el promotor de actinas.

Promotores adicionales, que pueden ser interesantes para controlar la expresión de genes de VGF, incluyen, pero no se limitan a: la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-10); el promotor del CMV (citomegalovirus); el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores, 1980, Cell 22:787-97); el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner y colaboradores, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster y colaboradores, 1982, Nature 296:39-42); vectores procarióticos de expresión tales como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y colaboradores, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31); o el promotor tac (DeBoer y colaboradores, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). También presentan interés las siguientes regiones de control de la transcripción en animales, que exhiben una especificidad para tejidos y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de la elastasa I, que es activa en células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, 1984, Cell 38:639-46; Ornitz y colaboradores, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina, que es activa en presencia de células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región de control del gen de inmunoglobulinas, que es activa en células linfoides (Grosschedl y colaboradores, 1984, Cell 38:647-58; Adames y colaboradores, 1985, Nature 318:533-38; Alexander y colaboradores, 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la región de control del virus del tumor mamario de ratón, que es activa en células de testículos, de mama, linfoides y cebadas (Leder y colaboradores, 1986, Cell 45:485-95); la región de control del gen de la albúmina, que es activa en el hígado (Pinkert y colaboradores, 1987, Genes and Devel. 1:268-76); la región de control del gen de la alfa-feto-proteína, que es activa en el hígado (Krumlauf y colaboradores, 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer y colaboradores, 1987, Science 235:53-58); la región de control del gen de la alfa 1-antitripsina, que es activa en el hígado (Kelsey y colaboradores, 1987, Genes and Devel. 1:161-71); la región de control del gen de la beta-globina, que es activa en células mieloides (Mogram y colaboradores, 1985, Nature 315:338-40; Kollias y colaboradores, 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de la mielina, que es activa en células oligodendrocitos en el cerebro (Readhead y colaboradores, 1987, Cell 48:703-12); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina, que es activa en un músculo del esqueleto (Sani, 1985, Nature 314:283-86); y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina, que es activa en el hipotálamo (Mason y colaboradores, 1986, Science 234:1372-78).

Una secuencia de intensificador se puede introducir en el vector para aumentar la transcripción en eucariotas superiores de un ADN que codifica un polipéptido de VGF. Los intensificadores son elementos de ADN de acción en cis, usualmente con una longitud de alrededor de 10-300 pb, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición. Ellos se han encontrado en 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen diversas secuencias de intensificadores disponibles de genes de mamíferos (p.ej., las de globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador procedente de un virus. El intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de un citomegalovirus, el intensificador de un polioma y los intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores ilustrativos para la activación de promotores eucarióticos. Si bien un intensificador se puede empalmar dentro del vector en una posición 5' ó 3' con respecto a una molécula de ácido nucleico de VGF, típicamente está situado en un sitio 5' con respecto del promotor.

Se pueden construir vectores de expresión a partir de un vector de partida, tal como un vector disponible comercialmente. Dichos vectores pueden contener o no contener la totalidad de las deseadas secuencias flanqueadoras. Cuando ya no están presentes en el vector una o más de las secuencias flanqueadores aquí descritas, éstas se pueden obtener individualmente y ligar dentro del vector. Métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueadoras son bien conocidos para un experto en la especialidad.

Vectores preferidos son aquellos que son compatibles con células anfitrionas bacterianas, de insectos y mamíferos. Dichos vectores incluyen, entre otros, los pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFPN2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alfa (publicación de patente PCT WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).

Adicionales vectores apropiados incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados, pero se apreciará que el sistema de vector debe de ser compatible con la célula anfitriona seleccionada. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos tales como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en ColE1 con alto número de copias, de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), plásmidos de clonación por PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (p.ej., derivados de plásmidos, estuche TOPO® TA Cloning® Kit, PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA), y vectores de mamíferos, levaduras o virus tales como un sistema de expresión en baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA).

Después de que se ha construido el vector y se ha introducido en el sitio apropiado del vector una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido de VGF, el vector completado se puede introducir en una célula anfitriona apropiada para la amplificación y/o expresión de polipéptidos. La transformación de un vector de expresión para un polipéptido de VGF dentro de una célula anfitriona seleccionada, se puede conseguir por métodos bien conocidos, incluyendo métodos tales como los de transfección, infección, con cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, el método de DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de la célula anfitriona que se ha haya de usar. Estos métodos, y otros métodos apropiados, son bien conocidos para un profesional experto, y se exponen, por ejemplo, en la cita de Sambrook y colaboradores, supra.

Las células anfitrionas pueden ser células anfitrionas procarióticas (tales como una de E. coli) o células anfitrionas eucarióticas (tales como una célula de levadura, insecto o vertebrado). La célula anfitriona, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido de VGF que subsiguientemente se puede recoger a partir del medio de cultivo (si la célula anfitriona lo segrega dentro del medio) o directamente a partir de la célula anfitriona que lo produce (si no ha sido segregado). La selección de una célula anfitriona apropiada dependerá de diversos factores, tales como los deseados niveles de expresión, las modificaciones de polipéptidos que son deseables o necesarias para una actividad (tal como de glicosilación o fosforilación) y facilidad de plegamiento dentro de una molécula activa biológicamente.

Se conocen en la especialidad cierto número de células anfitrionas apropiadas, y muchas de ellas están disponibles a partir de la American Type Culture Collection (ATCC) = Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA. Ejemplos de ellas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO de Chinese Hamster Ovary), células de CHO DHFR(-) [= negativas en cuanto a dihidrofolatorreductasa] (Urlaub y colaboradores, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:4216-20), células de riñón embrionario humano (HEK de Human Embryonic Cell) 293 ó 293T, o células 3T3. La selección de apropiadas células anfitrionas de mamíferos y de los métodos para su transformación, cultivación, amplificación, escrutinio, producción de productos, y purificación, se conocen en la especialidad. Otros apropiados linajes celulares de mamíferos son los linajes celulares COS-1 y COS-7 de monos, y el linaje celular CV-1. Otras células anfitrionas de mamíferos ilustrativas adicionales incluyen linajes celulares de primates y linajes celulares de roedores, incluyendo linajes celulares transformadas. Se adecuan también células diploides normales, cepas celulares derivadas de la cultivación in vitro de un tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser deficientes genotípicamente en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otros apropiados linajes celulares de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, células N2A del neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, linajes 3T3 que se derivan de ratones Swiss, Balb-c o NIH, linajes celulares de hámster BHK o HaK. Cada uno de estos linajes celulares es conocido por los expertos en la especialidad de la expresión de proteínas, y está disponible para
ellos.

Son similarmente útiles como células anfitrionas apropiadas las células bacterianas. Por ejemplo las diversas cepas de E. coli (p.ej. HB101, DH5\alpha, DH10 y MC1061) son bien conocidas como células anfitrionas en el campo de la biotecnología. También se pueden emplear en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares.

Muchas cepas de células de levadura, conocidas para los expertos en la especialidad, están disponibles también como células anfitrionas para la expresión de polipéptidos de VGF. Preferidas células de levaduras incluyen, por ejemplo las de Saccharomyces cerivisiae y Pichia pastoris.

Adicionalmente, cuando se desee, se pueden usar para la expresión de polipéptidos de VGF sistemas de células de insectos. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en las citas de Kitts y colaboradores, 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72; y Lucklow y colaboradores, 1993, J. Virol., 67:4566-79. Preferidas células de insectos son las Sf-9 y Hi5 (de Invitrogen).

Se pueden usar también animales transgénicos para expresar polipéptidos de VGF glicosilados. Por ejemplo, se puede usar un animal transgénico productor de leche (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener el presente polipéptido glicosilado en la leche del animal. Se pueden usar también plantas para producir polipéptidos de VGF, pero, en general, la glicosilación que se presenta en plantas es diferente de la producida en células de mamíferos, y puede dar como resultado un producto glicosilado que no sea apropiado para un uso terapéutico humano.

Producción de polipéptidos

Las células anfitrionas, que comprenden un vector de expresión de polipéptidos de VGF, se pueden cultivar usando medios clásicos bien conocidos para un profesional experto. Los medios contendrán usualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Medios apropiados para cultivar células de E. coli incluyen, por ejemplo, el Caldo Luria = Luria Broth (LB) y/o el Caldo Terrífico = Terrific Broth (TB). Medios apropiados para cultivar células eucarióticas incluyen el medio del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), un Medio Esencial Mínimo = Minimal Essential Medium (MEM) y/o un Medio de Eagle Modificado por Dulbecco = Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), todos los cuales se pueden suplementar con un suero y/o con factores de crecimiento según sea necesario para el linaje particular de células que se esté cultivando. Un medio apropiado para cultivos de insectos es un medio de Grace suplementado con un yeastolato (extracto acuoso de levadura de panadero), un material hidrolizado de lactoalbúmina y/o un suero de ternero fetal, según sea necesario.

Típicamente, se añade como un suplemento para los medios un antibiótico u otro compuesto útil para un crecimiento selectivo de células transfectadas o transformadas. El compuesto que se haya de usar será dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se había transformado la célula anfitriona. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es una resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para un crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina.

La cantidad de un polipéptido de VGF producido por una célula anfitriona se puede evaluar usando métodos clásicos, conocidos en la especialidad. Tales métodos incluyen, sin ninguna limitación, un análisis por transferencia de borrón Western, una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, una electroforesis en gel no desnaturalizador, una separación por cromatografía en fase líquida de alto rendimiento = High Performance Liquid Chromatography (HPLC), una precipitación inmunológica (inmunoprecipitación), y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en un gel para fijación de ADN.

Si un polipéptido de VGF se ha diseñado para ser segregado a partir de las células anfitrionas, la mayoría del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo de células. Sin embargo si el polipéptido de VGF no es segregado a partir de las células anfitrionas, estará presente en el citoplasma y/o en el núcleo (para células anfitrionas eucarióticas) o en el citosol (para células anfitrionas de bacterias gram-negativas).

Para un polipéptido de VGF situado en el citoplasma y/o en el núcleo de células anfitrionas (para células anfitrionas eucarióticas) o en el citosol (para células anfitrionas bacterianas), el material intracelular (incluyendo los cuerpos de inclusión para bacterias gram-negativas) se puede extraer a partir de la célula anfitriona usando cualquier técnica clásica conocida para un profesional experto. Por ejemplo, las células anfitrionas pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma / citoplasma por una prensa French, homogeneización, y/o sonicación (tratamiento por ultrasonidos) seguida por una centrifugación.

Si un polipéptido de VGF ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden fijarse frecuentemente a las membranas celulares interiores y/o exteriores, y de esta manera se encontrarán principalmente en el material de sedimento después de una centrifugación. El material de sedimento se puede tratar a valores extremos del pH o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea, en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a un valor alcalino del pH o tris carboxietil fosfina a un pH ácido para liberar, desunir y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido de VGF solubilizado se puede analizar luego usando una electroforesis en gel, una inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el polipéptido de VGF, el aislamiento se puede conseguir usando métodos clásicos, tales como los descritos aquí y en la cita de Marston y colaboradores, 1990, Meth. Enz., 182:264-75.

En algunos casos, un polipéptido de VGF puede no ser biológicamente activo después de su aislamiento. Diversos métodos para el "replegamiento" o la conversión del polipéptido a su estructura terciaria y para la generación de enlaces de disulfuro, se pueden usar para restaurar la actividad biológica. Dichos métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH situado usualmente por encima de 7, y en la presencia de una concentración particular de un caótropo (agente caotrópico). La selección de un caótropo es muy similar a las elecciones usadas para la solubilización de cuerpos de inclusión, pero usualmente el caótropo se usa en una menor concentración y no es necesariamente el mismo que los caótropos usados para la solubilización. En la mayor parte de los casos, la solución de replegamiento / oxidación contendrá también un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una relación específica para generar un particular potencial redox, permitiendo que se produzca una barajadura (mezcladura) con disulfuro en la formación de puentes de cisteína de las proteínas. Algunos de los pares redox corrientemente usados incluyen los de cisteína / cistamina, glutatión (GSH) / ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol(DTT) / ditiano DTT, y 2-2-mercaptoetanol (bME) / ditio-b(ME). En muchos casos, se puede usar un disolvente concomitante (codisolvente) o se puede necesitar aumentar la eficiencia del replegamiento, y los reactivos más corrientes usados para esta finalidad incluyen glicerol, poli(etilen-glicoles) de diversos pesos moleculares, arginina y
similares.

Si no se forman cuerpos de inclusión en un grado significativo después de una expresión de un polipéptido de VGF, entonces el polipéptido se encontrará principalmente en el material sobrenadante después de una centrifugación del material homogeneizado de células. El polipéptido se puede aislar adicionalmente a partir del material sobrenadante, usando métodos tales como los aquí descritos.

La purificación de un polipéptido de VGF a partir de una solución se puede conseguir usando una diversidad de técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de manera tal que contenga una marca, tal como la de Hexahistidina (polipéptido de VGF / hexaHis) u otro péptido pequeño tal como el FLAG (de Eastman Kodak Co. New, Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) ya sea en su extremo terminal de carboxilo o de amino, se puede purificar en un proceso de una sola etapa haciendo pasar la solución a través de una columna de afinidad, en que la matriz de la columna tiene una alta afinidad para la marca.

Por ejemplo, una polihistidina se fija con gran afinidad y especificidad al níquel. Por lo tanto, se puede usar una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel Qiagen®) para la purificación de un polipéptido de VGF / poliHis. Véase, p.ej., la cita de Current Protocols in Molecular Biology & 10.11.8 (Ausubel y colaboradores, coordinadores de edición, Green Publishers Inc. y Wiley y Sons 1993).

Adicionalmente, los polipéptidos de VGF se pueden purificar mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que es capaz de reconocer específicamente y fijarse a un polipéptido de VGF.

En situaciones en las que es preferible purificar parcial o completamente un polipéptido de VGF de manera tal que esté libre parcial o sustancialmente de contaminantes, se pueden usar métodos clásicos conocidos para los expertos en la especialidad. Dichos métodos incluyen, sin ninguna limitación, una separación por electroforesis seguida por una electroelución, diversos tipos de cromatografía (por afinidad, afinidad inmunitaria, por.un tamiz molecular e intercambio de iones), HPLC, y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina / técnica "Isoprime", de Hoefer Scientific, San Francisco, CA). En algunos casos, se pueden combinar dos o más técnicas de purificación para conseguir una pureza aumentada.

Los polipéptidos de VGF se pueden preparar también por métodos de síntesis químicas (tales como una síntesis de péptidos en fase sólida) usando técnicas conocidas en la especialidad tales como las expuestas por Merrifield y colaboradores, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Houghten y colaboradores, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:5132; y por Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis [Síntesis de péptidos en fase sólida] (Pierce Comercial Co. 1984). Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en el extremo terminal de amino. Los polipéptidos de VGF sintetizados químicamente se pueden oxidar usando métodos expuestos en esas referencias para formar puentes de disulfuro. Se espera que los polipéptidos de VGF sintetizados químicamente tengan una actividad biológica comparable a de los polipéptidos de VGF correspondientes producidos por vía recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, y por consiguiente se puedan usar de manera intercambiable con un polipéptido de VGF recombinante o natural.

Otros medios de obtener un polipéptido de VGF consisten en pasar por una purificación a partir de muestras biológicas tales como tejidos y/o fluidos de fuente, en los que se encuentre de manera natural el polipéptido de VGF. Dicha purificación se puede realizar usando métodos para purificación de proteínas como los que aquí se describen. La presencia del polipéptido de VGF durante la purificación se puede vigilar, por ejemplo, usando un anticuerpo preparado contra un polipéptido de VGF producido por vía recombinante o fragmentos peptídicos del mismo.

Se conocen en la especialidad cierto número de métodos adicionales para producir polipéptidos, y los métodos se pueden usar para producir polipéptidos que tienen una especificidad para un polipéptido de VGF. Véase, p.ej., la cita de Roberts y colaboradores, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-303, que describe la producción de proteínas de fusión entre un ARNm (mensajero) y su peptído codificado. Véase también la cita de Roberts, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73.

Las patentes de los EE.UU. números 5.763.192; 5.814,476; 5.723.323 y 5.817.483 describen procedimientos para producir péptidos o polipéptidos. Esto se realiza produciendo genes estocásticos o fragmentos de los mismos, e introduciendo luego estos genes en células anfitrionas que producen una o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. Las células anfitrionas son luego escrutadas para identificar los clones que producen péptidos o polipéptidos que tienen la actividad deseada.

Otro método para producir péptidos o polipéptidos se describe en el documento PCT/US98/20094 (WO 99/15650) presentado por Athersys, Inc. Conocido como "activación aleatoria de expresión de genes para al descubrimiento de genes" (RAGE-CD, de "Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery"), el procedimiento implica la activación de una expresión de un gen endógeno o una sobreexpresión de un gen mediante métodos de recombinación in situ. Por ejemplo, una expresión de un gen endógeno es activada o aumentada por integración de una secuencia reguladora en la célula diana que es capaz de activar la expresión del gen por una recombinación no homóloga o ilegítima. El ADN diana es sometido en primer lugar a una radiación, y se introduce un promotor genético. El promotor sitúa finalmente una rotura en el frente de un gen, iniciando la transcripción del gen. Esto da como resultado la expresión del péptido o polipéptido deseado.

Se apreciará que estos métodos se pueden usar también para crear bibliotecas amplias de expresión de proteínas similares a la IL-17, que subsiguientemente se pueden usar para el escrutinio fenotípico con alto caudal de realización en una diversidad de ensayos, tales como ensayos bioquímicos, ensayos celulares y ensayos con organismos enteros (p.ej., una planta, un ratón, etc.).

Síntesis

Se apreciará por los expertos en la especialidad que las moléculas de polipéptidos de VGF que aquí se describen pueden ser producidas por medios recombinantes y de otros tipos.

Agentes de fijación selectiva

La expresión "agente de fijación selectiva" se refiere a una molécula que tiene una especificidad para uno o más polipéptidos de VGF. Apropiados agentes de fijación selectiva incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y derivados de ellos, polipéptidos, y moléculas pequeñas. Apropiados agentes de fijación selectiva se preparan usando métodos conocidos en la especialidad. Un ilustrativo agente de fijación selectiva para un polipéptido de VGF del presente invento, es capaz de fijar una cierta parte del polipéptido de VGF, inhibiendo con ello la fijación del polipéptido a un receptor del polipéptido de VGF.

El concepto de "antígeno" se refiere a una molécula o a una parte de una molécula capaz de ser fijada por un agente de fijación selectiva y adicionalmente capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de fijarse a un epítopo de ese antígeno. El antígeno puede tener uno o más epítopos.

El concepto de "epítopo" se refiere a la parte de cualquier molécula que es capaz de ser reconocida por un agente de fijación selectiva y fijada por éste a una o más regiones de fijación a antígenos del agente de fijación. Los epítopos consisten usualmente en agrupaciones de moléculas activas superficialmente de modo químico, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares que tiene específicas características estructurales tridimensionales así como específicas características de carga. Los conceptos de "epítopo inhibidor" y "epítopo neutralizador" se refieren a un epítopo que, cuando es fijado por un agente de fijación selectiva, da como resultado una pérdida de actividad biológica de la molécula que contiene el epítopo, in vivo, in vitro o in situ, más preferiblemente in vivo, incluyendo la fijación de polipéptidos de VGF a un receptor de polipéptidos de VGF.

Como se usa aquí, el concepto de "región de fijación a un antígeno" se refiere a la parte del agente de fijación selectiva que contiene el residuo de aminoácido que interactúa con un antígeno y confiere al agente de fijación su especificidad y afinidad para el antígeno. Preferiblemente, la región de fijación a un antígeno será de origen murino. En otras realizaciones, la región de fijación a un antígeno se puede derivar de otra especie de animal, en particular de roedores tales como conejos, ratas o hámsters. Por ejemplo, la región de fijación a un antígeno del agente de fijación selectiva del presente invento se deriva preferiblemente de un anticuerpo no humano que es específico para un polipéptido de VGF humano. Fuentes preferidas para el ADN que codifica dicho anticuerpo no humano incluyen linajes celulares que producen anticuerpos, tales como linajes celulares híbridos conocidos corrientemente como hibridomas.

Los agentes de fijación selectiva tales como anticuerpos y fragmentos de un anticuerpo que fijan a polipéptidos de VGF están dentro del alcance del presente invento. Los anticuerpos pueden ser policlonales, incluyendo policlonales monoespecíficos; monoclonales; recombinantes; quiméricos; humanizados tales como injertados con CDR (regiones determinantes de complementariedad); humanos; monocatenarios; y/o biespecíficos; así como fragmentos; variantes; o sus derivados. Los fragmentos de un anticuerpo incluyen aquellas partes del anticuerpo que se fijan a un epítopo situado en el polipéptido de VGF. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen los fragmentos Fab y F(ab'), generados por disociación enzimática de anticuerpos de plena longitud. Otros fragmentos de fijación incluyen los generados por técnicas de ADN recombinantes, tales como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos, que se derivan de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un antígeno es una molécula o una parte de una molécula capaz de ser fijada por un anticuerpo que adicionalmente es capaz de inducir a un animal a que produzca un anticuerpo capaz de fijarse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. Se entiende que la reacción específica antes citada indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo, y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados (llamados) por otros
antígenos.

Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido de VGF son producidos generalmente en animales (p.ej., conejos o ratones) por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales de un polipéptido de VGF y un coadyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido de VGF con una proteína portadora que sea inmunogénica en la especie que se haya de inmunizar, tal como hemocianina de lapa californiana (de bocallave), un suero, una albúmina, una tiroglobulina bovina, o un inhibidor de tripsina de soja. También se usan para intensificar la respuesta inmunitaria agentes de agregación (aglomeración), tales como un alumbre. Después de una inmunización, los animales son desangrados y el suero se ensaya en cuanto a su título de anticuerpos anti-VGF.

Los anticuerpos monoclonales contienen una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, cuya población contiene sitios de fijación a epítopos sustancialmente similares. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo las IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de ellas. Un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal del presente invento se puede cultivar in vitro, in situ o in vivo. La producción de altos títulos in vivo o in situ es un método preferido de producción.

Se producen anticuerpos monoclonales dirigidos hacia polipéptidos de VGF usando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por linajes celulares continuos en cultivo. Ejemplos de métodos apropiados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridomas de Kohler y colaboradores, 1975, Nature 256:495-97 y el método de hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications [Técnicas y aparatos para la producción de anticuerpos monoclonales] 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se proporcionan por el invento linajes celulares de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con polipéptidos de VGF.

Preferidos agentes de fijación selectiva anti-VGF incluyen anticuerpos monoclonales que inhibirán de manera competitiva in vivo la fijación a un polipéptido de VGF humano, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de fijación específica, así como a fragmentos y regiones de los mismos. Métodos preferidos para determinar una especificidad y una afinidad para anticuerpos monoclonales por inhibición competitiva, se pueden encontrar en las citas de Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual [Anticuerpos: Un manual de laboratorio] (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales en inmunología] (Colligan y colaboradores, coordinadores de edición, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, 1993); y Muller 1988, Meth. Enzymol. 92:589-601.

Los anticuerpos monoclonales del invento se pueden modificar para su uso como agentes terapéuticos. Una realización es un anticuerpo "quimérico" en el que una parte de la cadena pesada (H) y/o de la cadena ligera (L) es idéntica u homóloga con respecto a una secuencia correspondiente en anticuerpos que se derivan de una especie particular, o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es / son idéntica(s) a u homólogas con respecto a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenezcan a otra subclase o subclase de anticuerpos. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando que ellos exhiban la deseada actividad biológica. Véanse la patente de los EE.UU. Nº 4.816.567; y la cita de Morrison y colaboradores, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55.

Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la especialidad. Véanse las citas de Cabilly y colaboradores, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3273-77; Morrison y colaboradores, 1984; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55; Boulianne y colaboradores, 1984; Nature 312:643-46; Neuberger y colaboradores, 1985, Nature 314:268-70; Liu y colaboradores, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-43; y Harlow y Lane, supra.

Como se usa en el presente contexto, el concepto de "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena L quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H_{2}L_{2}) formado por dos dímeros HL asociados a través de por lo menos un puente de disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivalente se puede producir también, por ejemplo, empleando una región C_{H} que se aglomera o agrega (p.ej., a partir de una cadena H o cadena \mu de IgM).

Los anticuerpos quiméricos del presente invento pueden comprender cadenas de inmuglobulinas H y/o L individuales. Una cadena H quimérica preferida comprende una región de fijación a un antígeno, que se deriva de la cadena H de un anticuerpo no humano específico para un polipéptido de VGF, que está enlazado a por lo menos una parte de una región C de cadena H humana (C_{H}), tal como CH_{1} o CH_{2}. Una preferida cadena L quimérica comprende una región de fijación a un antígeno, que se deriva de la cadena L de un anticuerpo no humano específico para un polipéptido de VGF, que está enlazado a por lo menos una parte de una región C de cadena L humana (C_{L}).

Se pueden preparar también agentes de fijación selectiva, que tienen cadenas H y cadenas L quiméricas de la misma o diferente especificidad de fijación a regiones variables, por una asociación apropiada de las cadenas de polipéptidos individuales, de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad. Véase p.ej., la cita de Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular] (Ausubel y colaboradores, coordinadores de edición, Greene Publishers Inc. y Wiley y Sons 1994) y la cita de Harlow y colaboradores, supra. Usando este enfoque, células anfitrionas que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) se cultivan por separado a partir de células anfitrionas que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados), y las cadenas de inmunoglobulinas las se recuperan por separado y luego se asocian. Alternativamente, las células anfitrionas pueden ser cultivadas concomitantemente, y se puede permitir que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por una recuperación de la inmunoglobulina ensamblada.

El invento proporciona también anticuerpos monoclonales, fragmentos, regiones o derivados de los mismos, cuyo concepto incluye las proteínas codificadas por genes truncados o modificados para proporcionar especies moleculares que se asemejan funcionalmente a fragmentos de inmunoglobulinas. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias genéticas que codifican proteínas citotóxicas tales como toxinas de plantas y bacterianas. Los fragmentos y sus derivados se pueden producir a partir de cualesquiera de las células anfitrionas de este invento. Alternativamente, anticuerpos monoclonales anti-VGF, fragmentos y regiones de los mismos se pueden fijar in vitro a proteínas o compuestos de carácter citotóxico, para proporcionar anticuerpos anti-VGF citotóxicos que sean capaces de aniquilar selectivamente células que tengan receptores de polipéptidos de VGF.

Fragmentos apropiados incluyen, por ejemplo, los Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se despejan con mayor rapidez desde la circulación, y pueden tener menos fijación a tejidos no específicos que un anticuerpo intacto. Véase la cita de Wahl y colaboradores, 1983, J. Nucl. Med. 24:316-25. Estos fragmentos se producen a partir de anticuerpos intactos usando métodos bien conocidos en la especialidad, por ejemplo por disociación proteolítica con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}. La identificación de estas regiones de fijación a antígenos y/o de epítopos reconocidos por anticuerpos monoclonales del presente invento proporciona la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con similares características de fijación y con utilidad terapéutica o de diagnóstico, que son paralelos a las realizaciones de esta solicitud.

En otra realización, un anticuerpo monoclonal del invento es un anticuerpo "humanizado". Se conocen bien en la especialidad métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Véanse las patentes de los EE.UU. N^{os} 5.585.089 y 5.693.762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene introducidos en él uno o más residuos de aminoácidos procedente(s) de una fuente que no es humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando métodos descritos en la especialidad (Jones y colaboradores, 1986, Nature 321:522-25; Riechman y colaboradores, 1998, Nature 332:323-27; Verhoeyen y colaboradores, 1988, Science 239:1534-36), reemplazando por lo menos una parte de una región determinante de complementariedad (= complementarity-determining region = CDR) de roedor por las correspondientes regiones de un anticuerpo humano.

Las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de las regiones de fijación a antígenos de moléculas de anticuerpos (es decir fragmentos Fab o de regiones variables) que derivan la generación de anticuerpos monoclonales, están abarcadas dentro del alcance del presente invento. En esta técnica, moléculas de ARN mensajero, específicas para anticuerpos, son extraídas desde células del sistema inmunitario, tomadas a partir de un animal inmnunizado y transcritas dentro de un ANDc. El ADNc es luego clonado en un sistema de expresión en bacterias. Un ejemplo de dicha técnica, apropiada para la práctica de este invento, usa un sistema de vector de bacteriófago lambda que tiene una secuencia conductora que da lugar a que la proteína de Fab expresada migre al espacio periplasmático (entre la membrana de célula bacteriana y la pared celular) o que sea segregue. Se pueden generar y escrutar rápidamente grandes números de fragmentos Fab funcionales para descubrir los que fijan al antígeno. Tales moléculas de fijación a VGF (fragmentos Fab con especificidad para polipéptidos de VGF) están abarcados específicamente dentro del concepto de "anticuerpo" como se usa en el presente contexto.

También se encuentran dentro del alcance del invento las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos por empalme de los genes procedentes de una molécula de anticuerpo de ratón con una apropiada especificidad para antígenos, conjuntamente con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humano con una apropiada actividad biológica (tal como la capacidad para activar el complemento humano y mediar en una ADCC). Morrison y colaboradores, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55; Neuberger y colaboradores, 1984; Nature, 312:604-08. Agentes de fijación selectiva, tales como anticuerpos producidos por esta técnica, se encuentran dentro del alcance del invento.

Se apreciará que el invento no está limitado a anticuerpos monoclonales de ratón o rata; en efecto, se pueden usar anticuerpos humanos. Tales anticuerpos se pueden obtener usando hibridomas humanos. Véase la cita de Cote y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy [Anticuerpos monoclonales y terapia de un cáncer], 77 (1985). Son abarcados por lo tanto por el invento anticuerpos humanos completos que fijan a polipéptidos de VGF. Tales anticuerpos se producen inmunizando con un antígeno de VGF (opcionalmente conjugado con un vehículo o soporte) a animales transgénicos (p.ej., ratones) capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Véanse, p.ej. las citas de Jakobovits y colaboradores, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551-55; Jakobovits y colaboradores, 1993, Nature 362:255-58; Bruggermann y colaboradores, 1993, Year in Immuno. 7:33-40.

Un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce a determinantes singulares generalmente asociados con el sitio de fijación a un antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id se puede preparar inmunizando a un animal de la misma especie y el mismo tipo genético (p.ej., una raza de ratón), como la fuente del anticuerpo monoclonal, con el anticuerpo monoclonal para el que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizador produciendo un anticuerpo para esos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, p.ej., la patente de los EE.UU. Nº 4.699.880. El anticuerpo anti-Id se puede usar también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en todavía otro animal, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. El anticuerpo anti-anti-Id puede ser idéntico epitópicamente al anticuerpo monoclonal original que había inducido el anti-Id. Así, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un anticuerpo monoclonal, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos con especificidad idéntica.

También se describen anticuerpos humanos que fijan a polipéptidos de VGF. Usando animales transgénicos (p.ej., ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas, dichos anticuerpos se producen por inmunización con un antígeno de polipéptido de VGF (es decir, que tiene por lo menos 6 aminoácidos contiguos), opcionalmente conjugado con un soporte o vehículo. Véanse, p.ej., las citas de Jakobovits y colaboradores, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551-55; Jakobovits y colaboradores, 1993, Nature 362:255-58; Bruggermann y colaboradores, 1993, Year in Immuno. 7:33-40. En un método, dichos animales transgénicos se producen incapacitando a los lugares (loci) endógenos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas en ellos, e introduciendo en el genoma de los mismos unos lugares (loci) que codifican las proteínas de cadenas pesadas y ligeras humanas. Animales parcialmente modificados, es decir los que tienen menos que el complemento entero de modificaciones, se cruzan luego para obtener un animal que tenga la totalidad de las deseadas modificaciones en el sistema inmunitario. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos, humanas (en vez de, p.ej., murinas), incluyendo regiones variables que son inmunitariamente específicas para estos antígenos. Véanse las solicitudes PCT N^{os} PCT/US96/05928 y PCT/US93/06926. Métodos adicionales se describen en la patente de los EE.UU. Nº 5.545.807, las solicitudes PCT N^{os} PCT/US91/245 y PCT/GB89/01207, y en las publicaciones de patentes europeas N^{os} 546073 B1 y 546073 A1. Se pueden producir también anticuerpos humanos mediante la expresión de un ADN recombinante en células anfitrionas, o por expresión en células de hibridomas como aquí se describen.

En una realización alternativa se pueden producir también anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de exhibición de fagos (Hoogenboom y colaboradores, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks y colaboradores, 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Estos procedimientos imitan a una selección inmunitaria mediante la exhibición de repertorios de anticuerpos sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso, y subsiguiente selección del fago por su fijación a un antígeno selecto. Una de dichas técnicas se describe en la solicitud PCT Nº PCT/US98/17364, que describe el aislamiento de anticuerpos agonísticos con alta afinidad y funcionales para receptores de MPL y de msk, usando tal enfoque.

Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados se producen típicamente por métodos recombinantes. Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se introducen en células anfitrionas y se expresan usando materiales y procesos aquí descritos y conocidos en la especialidad. En una realización preferida, los anticuerpos se producen en células anfitrionas de mamíferos, tales como células CHO. Anticuerpos monoclonales (p.ej. humanos) se pueden producir por expresión de un ADN recombinante en células anfitrionas, o por expresión en células de hibridomas como aquí se describen.

Los anticuerpos monoclonales anti-VGF del invento se pueden emplear en cualquier conocido método de ensayo, tales como ensayos de fijación competitiva, ensayos en emparedado directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques [Anticuerpos monoclonales: Un manual de técnicas] 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) para la detección y cuantificación de polipéptidos de VGF. Los anticuerpos fijarán a polipéptidos de VGF con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se está empleando.

Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VGF se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un isótopo radiactivo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{125}I, ^{99}Tc, ^{111}In o ^{67}Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina; o una enzima, tal como una fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano rusticano (picante) (Bayer y colaboradores, 1990, Meth. Enz. 184:138-63).

Los ensayos de fijación competitiva recurren a la capacidad de un patrón marcado (p.ej. un polipéptido de VGF, o una parte del mismo capaz de reaccionar inmunológicamente) para competir con el analito (un polipéptido de VGF) en la muestra de ensayo para fijarse con una cantidad limitada de un anticuerpo anti-VGF. La cantidad de un polipéptido de VGF en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que resulta fijado a los anticuerpos. Con el fin de facilitar la determinación de la cantidad de patrón que resulta fijado, los anticuerpos son típicamente insolubilizados antes o después de la competición, de manera tal que el patrón y el analito, que están fijados a los anticuerpos, se pueden separar de una manera conveniente con respecto del patrón y del analito que permanecen sin fijar.

Los ensayos en emparedado implican típicamente el uso de dos anticuerpos, cada uno de ellos capaz de fijarse a una diferente parte inmunogénica, o a un epítopo, de la proteína que se ha de detectar y/o cuantificar. En un ensayo en emparedado, el analito de la muestra de ensayo es fijado típicamente por un primer anticuerpo que esta inmovilizado sobre un soporte sólido, y después de ello un segundo anticuerpo se fija al analito, formando de esta manera un complejo insoluble de tres partes. Véase, p.ej. la patente de los EE.UU. Nº 4.376.110. El segundo anticuerpo puede ser marcado por sí mismo con un resto detectable (ensayos en emparedado directos) o puede ser medido usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayos en emparedado indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo en emparedado es un ensayo de inmunosorbente enlazado con enzimas = enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), en cuyo caso el resto detectable es una enzima.

Los anticuerpos monoclonales anti-VGF son también útiles para la reproducción en imágenes in vivo. Un anticuerpo marcado con un resto detectable se puede administrar a un animal, preferiblemente en el torrente sanguíneo, y se puede ensayar la presencia y la situación del anticuerpo marcado en el anfitrión. El anticuerpo puede ser marcado con cualquier resto que sea detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología, o por otros métodos de detección conocidos en la especialidad.

Los anticuerpos monoclonales del invento se pueden usar como agentes terapéuticos. Estos agentes terapéuticos son generalmente agonistas o antagonistas, por el hecho de que o bien intensifican o reducen, respectivamente, por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido de VGF. En una realización, los anticuerpos antagonistas del invento son anticuerpos o fragmentos de fijación de los mismos, que son capaces de fijarse específicamente a un polipéptido de VGF y que son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido de VGF in vivo o in vitro. En realizaciones preferidas, el agente de fijación selectiva, p.ej. un anticuerpo antagonista, inhibirá la actividad funcional de un polipéptido de VGF por al menos aproximadamente un 50% y preferiblemente por al menos aproximadamente un 80%. En otra realización, el agente de fijación selectiva puede ser un anticuerpo anti-polipéptido de VGF que sea capaz de interactuar con un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF (un ligando o un receptor) inhibiendo o eliminando con ello una actividad de polipéptido de VGF in vitro o in vivo. Los agentes de fijación selectiva, incluyendo anticuerpos anti-polipéptidos de VGF agonistas y antagonistas, son identificados por ensayos de escrutinio que son bien conocidos en la especialidad.

El invento se refiere también a un estuche que comprende anticuerpos monoclonales selectivos para VGF y otros reactivos útiles para detectar niveles de polipéptidos de VGF en muestras biológicas. Dichos reactivos incluyen una marca detectable, un suero de bloqueo, muestras testigos positivas y negativas, y reactivos de detección.

Derivados químicos

Derivados modificados químicamente de polipéptidos de VGF se pueden preparar por un experto en la especialidad, considerándose dadas las divulgaciones aquí descritas. Los derivados de polipéptidos de VGF son modificados de una manera que es diferente - o bien en el tipo o en la situación de las moléculas unidas de manera natural al polipéptido. Los derivados pueden incluir moléculas formadas por la deleción (supresión) de uno o más grupos químicos unidos de manera natural. Los polipéptidos de VGF pueden ser modificados por la unión por enlaces covalentes de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de manera tal que la proteína a la que éste está fijado no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Se incluye dentro del alcance de los polímeros apropiados una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para un uso terapéutico de la preparación o formulación de un producto final, el polímero será aceptable farmacéuticamente.

Los polímeros pueden ser de cualquier peso molecular y pueden ser ramificados o sin ramificar. Cada uno de los polímeros tiene típicamente un peso molecular medio comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el concepto de "aproximadamente" indica que en preparaciones (formulaciones) de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algo menos que el peso molecular señalado). El peso molecular medio de cada polímero está situado de manera preferible entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, de manera más preferible entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa, y de manera sumamente preferible entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa.

Apropiados polímeros solubles en agua o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan, a hidratos de carbono enlazados en N o enlazados en O, azúcares, fosfatos, poli(etilen-glicoles) (PEG) (incluyendo las formas de PEG que se han usado para derivatizar proteínas, incluyendo un mono-alcoxi (C_{1}-C_{10}) o ariloxi-poli(etilen-glicol)), monometoxi-poli(etilen-glicol), un dextrano (tal como un dextrano de bajo peso molecular que tiene, por ejemplo, aproximadamente 6 kD), una celulosa, u otros polímeros basados en hidratos de carbono, una poli-(N-vinil-pirrolidonas) poli(etilen-glicol), homopolímeros de propilen glicol, co-polímeros de poli(óxido de propileno y óxido de etileno), polioles polioxietilados (p.ej., glicerol) y un poli(alcohol vinílico). También se abarcan por el presenten invento moléculas reticuladoras bifuncionales que se pueden usar para preparar multímeros de polipéptidos de VGF unidos por enlaces covalentes.

En general, una derivatización química se puede realizar bajo cualquier condición apropiada usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de un polímero activado. Los métodos para preparar derivados químicos de polipéptidos comprenderán generalmente las operaciones de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con la molécula de un polímero activado (tal como un derivado de éster reactivo o aldehído de la molécula de polímero) en unas condiciones en las que un polipéptido de VGF resulta unido a una o más moléculas de un polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones óptimas de reacción serán determinadas basándose en parámetros conocidos y en el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de las moléculas de polímeros a la proteína, tanto mayor será el porcentaje de la molécula de polímero unida. En una realización, el derivado de polipéptido de VGF puede tener un único resto de molécula de polímero en el extremo terminal de amino. Véase, p.ej. la patente de los EE.UU. Nº 5.234.784.

La "pegilación" (reacción con PEG) de un polipéptido se puede llevar a cabo específicamente usando cualesquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la especialidad. Tales reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes citas de referencia: Francis y colaboradores, 1992, Focus on Growth Factors [Foco en factores de crecimiento] 3:4-10; las publicaciones de patentes europeas N^{os} 154316 y 401384; y la patente de los EE.UU. Nº 4.179.337. Por ejemplo, una pegilación se puede llevar a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de un poli(etilen-glicol) (o un polímero soluble en agua y reactivo análogo) tal como aquí se describe. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado deberá tener un único grupo de éster reactivo. Para una alquilación en condiciones reductoras, un polímero seleccionado deberá tener un único grupo de aldehído reactivo. Un aldehído reactivo es, por ejemplo, un poli(etilen-glicol) propionaldehído, que es estable en agua, o derivados con mono alcoxi C_{1}-C_{10} o ariloxi de los mismos (véase la patente de los EE.UU. Nº 5.252.714).

En otra realización, los polipéptidos de VGF se pueden acoplar químicamente con biotina. Las moléculas de biotina y un polipéptido de VGF se permiten luego fijarse a avidina, dando como resultado moléculas tetravalentes de avidina / biotina / y un polipéptido de VGF. Los polipéptidos de VGF pueden también ser acoplados covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los resultantes conjugados se pueden precipitar con una IgM anti-DNP o anti-TNP para formar conjugados decámeros con una valencia de 10.

Generalmente, las condiciones que se pueden aliviar o modular por la administración de los presentes derivados de polipéptidos de VGF incluyen las aquí descritas para polipéptidos de VGF. Sin embargo, los derivados de polipéptidos de VGF que aquí se describen pueden tener actividades adicionales, una actividad biológica intensificada o reducida, u otras características, tales como una semi-vida aumentada o disminuida, en comparación con las moléculas no derivatizadas.

Ensayo para detectar otros moduladores de la actividad de polipéptidos de VGF

En algunas situaciones, puede ser deseable identificar moléculas que sean moduladoras, es decir agonistas o antagonistas, de la actividad de un polipéptido de VGF. Las moléculas naturales o sintéticas, que modulan a un polipéptido de VGF, se pueden identificar usando uno o más ensayos de escrutinio, tales como los que aquí se describen. Dichas moléculas se pueden administrar ya sea de una manera ex vivo o de una manera in vivo por inyección, o por suministro por vía oral, con un dispositivo de implantación, o por medios similares.

Una "molécula en ensayo" se refiere a una molécula que está sometida a evaluación en cuanto a la capacidad para modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de un polipéptido de VGF. Lo más corrientemente, una molécula en ensayo interactuará directamente con un polipéptido de VGF. Sin embargo, también se considera que una molécula en ensayo puede también modular indirectamente una actividad de polipéptido de VGF, por ejemplo afectando la expresión de un gen de VGF, o por fijación a un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF (p.ej., un receptor o ligando). En una realización, una molécula en ensayo fijará a un polipéptido de VGF con una afinidad constante de al menos aproximadamente 10^{-6} M, de manera preferible de aproximadamente 10^{-8} M, de manera más preferible de aproximadamente 10^{-9} M y de manera incluso más preferible de aproximadamente 10^{-10} M.

Un agonista o antagonista de un polipéptido de VGF puede ser una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, un lípido o una molécula de bajo peso molecular, que interactúa con un polipéptido de VGF para regular su actividad. Las moléculas que regulan la expresión de un polipéptido de VGF incluyen ácidos nucleicos que son complementarios a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de VGF, o son complementarios a secuencias de ácidos nucleicos que dirigen o controlan la expresión de un polipéptido de VGF, y que actúan como reguladores anti-sentido de la expresión.

Una vez que una molécula en ensayo ha sido identificada como que interactúa con un polipéptido de VGF, la molécula puede ser evaluada adicionalmente en cuanto a su capacidad para aumentar o disminuir la actividad de un polipéptido de VGF. La medición de la interacción de una molécula en ensayo con un polipéptido de VGF se puede llevar a cabo en diversos formatos, incluyendo ensayos de fijación basados en células, ensayos de fijación en membranas, ensayos en fase de solución y ensayos inmunitarios. En general, una molécula es incubada con un polipéptido de VGF durante un período especificado de tiempo, y la actividad del polipéptido de VGF se determina mediante uno o más ensayos destinados a medir la actividad biológica.

La interacción de moléculas en ensayo con polipétidos de VGF se puede ensayar también directamente usando anticuerpos policlonales o monoclonales en un ensayo inmunitario. Alternativamente, formas modificadas de polipéptidos de VGF que contienen marcas con epítopos como aquí se describen, se pueden usar en solución y en ensayos inmunitarios.

En el caso de que los polipéptidos de VGF presenten una actividad biológica a través de una interacción con un partícipe en la fijación (p.ej., un receptor o un ligando), se puede usar una diversidad de ensayos in vitro para medir la fijación de un polipéptido de VGF al correspondiente partícipe en la fijación (tal como un agente de fijación selectiva, un receptor o un ligando). Estos ensayos se pueden usar para explorar moléculas en ensayo con el fin de determinar su aptitud para aumentar o disminuir la velocidad y/o la extensión de fijación de un polipéptido de VGF a su partícipe en la fijación. En un ensayo, un polipéptido de VGF es inmovilizado en los pocillos de una placa de microtitulación. Un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF marcado radiactivamente (por ejemplo, un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF yodado) y una molécula en ensayo se pueden luego añadir o bien uno cada vez (en cualquier orden) o simultáneamente a los pocillos. Después de una incubación, los pocillos se pueden lavar y recontar para determinar la radiactividad, usando un contador de escintilación, con el fin de determinar la extensión en la que el partícipe en la fijación está fijado al polipéptido de VGF. Típicamente, una molécula será ensayada a lo largo de un intervalo de concentraciones, y se pueden usar una serie de pocillos testigos que carecen de uno o más de los elementos de los análisis de ensayo, para obtener exactitud en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método implica invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, inmovilizar un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF junto a los pocillos de la placa de microtitulación, incubar con la molécula en ensayo y el polipéptido de VGF marcado radiactivamente, y determinar la extensión de la fijación del polipéptido de VGF. Véase, p.ej. la cita de Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], capítulo 18 (Ausubel y colaboradores, coordinadores de edición, Green Publishers Inc. y Wiley y Sons 1995).

Como una alternativa a la marcación radiactiva, un polipéptido de VGF o su partícipe en la fijación se puede conjugar con biotina, y luego se puede detectar la presencia de una proteína biotinilada usando estreptavidina enlazada con una enzima, tal como peroxidasa de rábano rusticano (picante) (HRP, de horse radish peroxidase) o una fosfatasa alcalina (AP, de alkaline phosphatase), que se puede detectar colorimétricamente o por marcación fluorescente de estreptavidina. Un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido de VGF o hacia un partícipe en la fijación con un polipéptido de VGF, y que está conjugado con biotina, se puede usar también con finalidades de detección, a continuación de la incubación del complejo con estreptavidina enlazada con una enzima, es decir enlazada a AP o HRP.

Un polipéptido de VGF o un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF se puede inmovilizar también por fijación a perlas de agarosa, perlas acrílicas, u otros tipos de tales substratos inertes en fase sólida. El complejo de substrato y proteína se puede disponer en una solución que contiene la proteína complementaria y el compuesto en ensayo. Después de una incubación, las perlas se pueden precipitar por centrifugación, y se puede averiguar la cantidad de fijación entre un polipéptido de VGF y su partícipe en la fijación, usando los métodos que aquí se describen. Alternativamente, el complejo de substrato y proteína se puede inmovilizar en una columna, pasando la molécula en ensayo y la proteína complementaria a través de la columna. La formación de un complejo entre un polipéptido de VGF y su partícipe en la fijación se puede averiguar luego usando cualesquiera de las técnicas que aquí se describen (p.ej., de marcación radiactiva o fijación a anticuerpos).

Otro ensayo in vitro que es útil para identificar una molécula en ensayo que aumenta o disminuye la formación de un complejo entre una proteína de fijación de un polipéptido de VGF y un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF, lo constituye un sistema detector de resonancia de plasmones en superficies, tal como el sistema de ensayo BIAcore (de Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema BIAcore se utiliza tal como se especifica por el fabricante. Este ensayo implica esencialmente la fijación por enlaces covalentes o bien de un polipéptido de VGF o de un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF con un chip sensor revestido con dextrano, que está situado dentro de un detector. El compuesto en ensayo y la otra proteína complementaria se pueden inyectar luego, ya sea de manera simultánea o consecutiva, dentro de la cámara que contiene el chip sensor. La cantidad de proteína complenentaria que se fija puede ser averiguada basándose en el cambio en la masa molecular, que está asociado físicamente con el lado revestido con dextrano del chip sensor, siendo medido por el sistema detector el cambio en la masa molecular.

En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos en ensayo conjuntamente en cuanto a su capacidad para aumentar o disminuir la formación de un complejo entre un polipéptido de VGF y un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF. En estos casos los ensayos que aquí se exponen se pueden modificar con facilidad añadiendo dicho(s) compuesto(s) en ensayo adicional(es) o bien simultáneamente con, o subsiguientemente a, el primer compuesto en ensayo. El resto de las operaciones en el ensayo son tal como se expone en el presente texto.

Unos ensayos in vitro, tales como los que aquí se describen, se pueden usar ventajosamente para explorar grandes números de compuestos con el fin de determinar un efecto sobre la formación de un complejo entre un polipéptido de VGF y un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF. Los ensayos se pueden automatizar para escrutar compuestos generados en la visualización de fagos, péptidos sintéticos y bibliotecas de síntesis químicas.

Los compuestos que aumentan o disminuyen la formación de un complejo entre un polipéptido de VGF y un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF se pueden explorar también en un cultivo celular usando células y linajes celulares que expresan o bien un polipéptido de VGF o un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF. Las células y los linajes celulares se pueden obtener de cualquier mamífero, pero preferiblemente procederán de fuentes humanas o de otros animales primates, caninos, o roedores. La fijación de un polipéptido de VGF a células, que expresan un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF en la superficie, se evalúa en la presencia o ausencia de moléculas en ensayo y se puede determinar la extensión de la fijación por ejemplo mediante una citometría de flujo, usando un anticuerpo biotinilado a un partícipe en la fijación de un polipéptido de VGF. Se pueden usar ventajosamente ensayos en cultivos de células para evaluar adicionalmente compuestos que se califican de modo positivo en ensayos de fijación de proteínas que aquí se describen.

Los cultivos celulares se pueden usar también para explorar el impacto de un candidato a fármaco. Por ejemplo, unos candidatos a fármacos pueden disminuir o aumentar la expresión del gen de VGF. En ciertas realizaciones, la cantidad que se produce de un polipéptido de VGF o de un fragmento de polipéptido de VGF, puede ser medida después de una exposición del cultivo celular al candidato a fármaco. En ciertas realizaciones, se puede detectar el impacto real del candidato a fármaco sobre el cultivo celular. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede tener un impacto particular sobre el cultivo celular. En dichos casos, se puede ensayar una capacidad de un candidato a fármaco para aumentar o disminuir la expresión del gen o su capacidad para evitar o inhibir un impacto particular sobre el cultivo celular. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular, tal como un fragmento de un polipéptido, puede dar como resultado, o puede asociarse con, una enfermedad o condición patológica. En dichos casos, se puede ensayar una capacidad de un candidato a fármaco para disminuir la producción de dicho producto metabólico en un cultivo celular.

Proteínas internalizadoras

La secuencia de la proteína tat (procedente de HIV) se puede usar para internalizar proteínas dentro de una célula. Véase, p.ej., la cita de Falwell y colaboradores, 1994, Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A. 91:664-68. Por ejemplo, se ha descrito que una secuencia de 11 aminoácidos (Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SEQ ID NO: 11) de la proteína tat de HIV (denominada el "dominio de transducción de proteína", o TAT PDT [de protein transduction domain]) que media en el suministro a través de la membrana citoplasmática y la membrana nuclear de una célula. Véanse las citas de Schwarze y colaboradores, 1999, Science 285:1569-72; y Nagahara y colaboradores, 1998, Nat. Med. 4:1449-52. En estos procesos, se preparan unas construcciones artificiales de FITC (G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R marcada con FITC; SEQ ID NO: 12), que penetran en tejidos a continuación de una administración por vía peritoneal, y se detecta la fijación de dichas construcciones artificiales a células mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, de fluorescence-activated cell sorting). Las células tratadas con una proteína de fusión tat-\beta-gal demostrarán una actividad de \beta-gal. Después de una inyección, la expresión de dicha construcción artificial se puede detectar en un cierto número de tejidos, incluyendo tejidos de hígado, riñón, pulmón, corazón y cerebro. Se cree que dichas construcciones artificiales experimentan un cierto grado de desplegamiento con el fin de entrar en la célula, y en tal estado, pueden requerir un replegamiento a continuación de la entrada en la célula.

Se apreciará por lo tanto que la secuencia de la proteína tat se puede usar para internalizar un deseado polipéptido en una célula. Por ejemplo, usando la secuencia de la proteína tat, un antagonista de VGF (tal como un agente de fijación selectiva anti-VGF, una pequeña molécula, un receptor soluble, o un oligonucleótido antisentido) se puede administrar por vía intracelular para inhibir la actividad de una molécula de VGF. Como se usa en el presente contexto, el concepto de "molécula de VGF" se refiere tanto a moléculas de ácidos nucleicos de VGF como a polipéptidos de VGF como aquí se definen. Cuando se desea, la propia proteína de VGF se puede administrar también internamente a una célula usando estos procesos. Véase también la cita de Strauss, 1999, Science 285:1466-67.

Usos terapéuticos

Los anticuerpos monoclonales del presente invento se pueden usar para preparar un medicamento destinado al tratamiento, el mejoramiento o la prevención de cierto número de enfermedades o condiciones agudas y crónicas, incluyendo las que aquí se han citado.

Enfermedades, condiciones y trastornos relacionados con los VGF incluyen obesidad, esterilidad, caquexia, trastornos en la comida, un complejo relacionado con el SIDA, condiciones hipermetabólicas, hiperactividad, hipoactividad e hiperproducción de insulina.

Otras enfermedades causadas o mediadas por niveles indeseables de polipéptidos de VGF están abarcadas dentro del alcance del invento. Unos niveles indeseables incluyen unos niveles excesivos de polipéptidos de VGF y niveles inferiores a los normales de polipéptidos de VGF.

Composiciones de polipéptidos de VGF y administración

Las composiciones terapéuticas están comprendidas dentro del alcance del presente invento. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal del invento, en mezcla con un agente de formulación aceptable farmacéutica o fisiológicamente, seleccionado en cuanto a su idoneidad con el modo de administración.

Los materiales aceptables para formulación son preferiblemente no tóxicos para organismos receptores en las dosificaciones y concentraciones que se emplean.

La composición farmacéutica puede contener materiales para formulación destinados a modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción, o la penetración de la composición. Apropiados materiales para formulación incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), agentes antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio), tampones (tales como los de borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes de voluminosidad (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina - tetraacético (EDTA)), agentes formadores de complejos (tales como cafeína, una poli(vinil-pirrolidona), beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), materiales de carga y relleno, monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saboreantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como una poli(vinil-pirrolidona)), polipéptidos de bajo peso molecular, iones de signo contrario que forman sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerol, propilen-glicol o poli(etilen-glicol), alcoholes de azúcares (tales como manitol o sorbitol), agentes suspendedores, tensioactivos o humectantes (tales como los Pluronics; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como el Polisorbato 20 o Polisorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes intensificadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes intensificadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos - preferiblemente cloruro de sodio o potasio - o manitol sorbitol), vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticos. Véase la obra Remington's Pharmaceutical Sciences, (18ª edición, A.R. Gennaro, coordinador de edición, Mack Publishing Company 1990).

La óptima composición farmacéutica será determinada para un profesional experto dependiendo, por ejemplo, de la pretendida ruta de administración, del formato de suministro y de la deseada dosificación. Véase, p.ej. la obra Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Dichas composiciones pueden influir sobre el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento (clearancia) in vivo de la molécula de VGF.

El vehículo o soporte primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza ya sea acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un apropiado vehículo o soporte para inyección puede ser agua, una solución salina fisiológica, o un fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales corrientes en composiciones para la administración por vía parenteral. Una solución salina tamponada neutra o una solución salina mezclada con una albúmina de suero son otros vehículos ilustrativos. Otras composiciones farmacéuticas ilustrativas comprenden un tampón Tris de pH de aproximadamente 7,0-8,5 o un tampón de acetato de pH de aproximadamente 4,0-5,5, que puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustitutivo apropiado. En una realización del presente invento, las composiciones de polipéptidos de VGF se pueden preparar para su almacenamiento por mezclamiento de la composición seleccionada, que tiene el deseado grado de pureza, con opcionales agentes para formulación (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o de una solución acuosa. Además, el producto de polipéptido de VGF se puede formular como un material liofilizado, usando apropiados excipientes tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas del invento se pueden seleccionar para su suministro por vía parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para su inhalación o para su suministro a través del tracto digestivo, por ejemplo por vía oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la especialidad.

Los componentes para formulación están presentes en unas concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, situado típicamente dentro de un intervalo de valores del pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Cuando se considera una administración por vía parenteral, las composiciones terapéuticas destinadas a usarse en este invento pueden estar en la forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente, exenta de pirógenos, que comprende la deseada molécula de VGF en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente apropiado para inyección por vía parenteral es agua destilada estéril en la que una molécula de VGF se formula como una solución isotónica estéril, apropiadamente conservada. Todavía otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como un poli(ácido láctico) o un poli(ácido glicólico)), perlas, o liposomas, que proporciona la liberación controlada o prolongada del producto, que luego se puede suministrar a través de una inyección de depósito (liberación retardada). Se puede usar también ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto de favorecer una duración prolongada en la circulación. Otros medios apropiados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos implantables para suministro de fármacos.

Se considera también que ciertas formulaciones se pueden administrar por vía oral. Los polipéptidos de VGF que se administran de esta manera se pueden formular con o sin estos soportes habitualmente usados en la formulación y composición de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, se puede diseñar una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el sitio del tracto gastrointestinal en donde se hace máxima la biodisponibilidad y se reduce al mínimo la degradación pre-sistémica. Agentes adicionales se pueden incluir para facilitar la absorción del polipéptido de VGF. Se pueden emplear también agentes diluyentes, aromatizantes, saboreantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes suspendedores, agentes desintegrantes de tabletas y agentes aglutinantes.

Se describe una cantidad eficaz de polipéptidos de VGF en una mezcla con excipientes no tóxicos que son apropiados para la producción de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, o en otro vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en una forma de dosis unitarias. Apropiados excipientes incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Adicionales composiciones farmacéuticas de polipéptidos de VGF resultarán evidentes para los expertos en la especialidad, incluyendo formulaciones que implican polipéptidos de VGF en formulaciones de suministro prolongado o controlado. Se conocen también por los expertos en la especialidad técnicas para formular una diversidad de otros medios de suministro prolongado o controlado, tales como soportes de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, p.ej. el documento PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas.

Ejemplos adicionales de formulaciones de liberación prolongada incluyen matrices de polímeros semipermeables en la forma de artículos conformados, p.ej. películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (véanse la patente de los EE.UU. Nº 3.773.919 y la publicación EP Nº 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-glutamato de etilo (Sidman y colaboradores, 1983, Biopolymers 22:547-56), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer y colaboradores, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), un polímero de etileno y acetato de vinilo (Langer y colaboradores, supra) o un poli(ácido D(-)-3-hidroxibutírico) (publicación EP Nº 133988). Las composiciones de liberación prolongada pueden incluir también liposomas, que se pueden preparar por uno cualquiera de varios métodos conocidos en la especialidad. Véanse, p.ej., la cita de Eppstein y colaboradores, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-92; y las publicaciones EP N^{os} 036676, 088046 y 143949.

La composición farmacéutica de VGF, que se ha de usar para una administración in vivo debe típicamente ser estéril. Esto se puede conseguir por filtración a través de membranas estériles de filtración. Cuando la composición es liofilizada, una esterilización usando este método se puede realizar ya sea antes, o a continuación, de una liofilización y una reconstitución. La composición para administración por vía parenteral se puede almacenar en una forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales se disponen generalmente dentro de un recipiente que tiene una lumbrera de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial para soluciones intravenosas, que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, ésta se puede almacenar en viales estériles en forma de una solución, una suspensión, un gel, una emulsión, un sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma presta para el uso o en una forma (p.ej., liofilizada) que requiere una reconstitución antes de la administración.

Se describen estuches para producir una unidad de administración de una única dosis. Cada uno de los estuches puede contener tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Se describen también estuches que comprenden jeringas previamente llenadas de una sola cámara y de múltiples cámaras (p.ej., jeringas con líquidos y liojeringas (jeringas liofilizadas)).

La cantidad eficaz de una composición farmacéutica de VGF que se ha de emplear terapéuticamente'', dependerá, por ejemplo, del contexto y de los objetivos terapéuticos. Un experto en la especialidad apreciará que los apropiados niveles de dosificación para un tratamiento variarán por lo tanto dependiendo, en parte, de la molécula suministrada, de la indicación para la que se está usando la molécula de VGF, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, área de superficie corporal, o tamaño de órganos) y la condición (la edad y la salud general) del paciente. Correspondientemente, el técnico clínico puede valorar (titular) la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede fluctuar entre aproximadamente 0,1 \mug/kg y aproximadamente 100 o más mg/kg, dependiendo de los factores antes mencionados. En otras realizaciones, la dosificación puede fluctuar entre 0,1 \mug/kg y aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o de 5 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de VGF en la formulación que se esté usando. Típicamente, un profesional clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una única dosis, como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o de un catéter. Un refinamiento adicional de la dosificación apropiada se realiza rutinariamente por los que poseen experiencia ordinaria en la especialidad, y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. Las dosificaciones apropiadas se pueden averiguar mediante el uso de apropiados datos de dosis y respuestas.

La ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, p.ej. por vía oral; mediante inyección por las rutas intravenosas, intraperitoneales, intracerebrales (intraparenquimales), intracerebroventriculares, intramusculares, intraoculares, intraarteriales, intraportales o intralesionales; por sistemas de liberación prolongada, o mediante dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolos o de una manera continua por infusión, o mediante un dispositivo de implantación.

De manera alternativa o adicional, la composición se puede administrar localmente a través de una implantación de una membrana, una esponja u otro material apropiado, en que se haya absorbido o encapsulado la deseada molécula. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado dentro de cualquier apropiado tejido u órgano, y el suministro de la molécula deseada puede realizarse mediante difusión, un bolo de liberación temporizada, o una administración continua.

En algunos casos, puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de polipéptidos de VGF de una manera ex vivo. En dichos casos, células, tejidos u órganos, que se han extraido del paciente, se exponen a composiciones farmacéuticas de polipéptidos de VGF, después de lo cual las células, los tejidos y los órganos se implantan subsiguientemente de retorno dentro del paciente.

En otros casos, un polipéptido de VGF se puede suministrar implantando ciertas células que han sido tratadas por ingeniería genética, usando métodos tales como los que aquí se han descrito, para expresar y segregar el polipéptido de VGF. Dichas células pueden ser células de animales o o seres humanos, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogeneicas. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas para evitar una infiltración en tejidos circundantes. Los materiales para encapsulación son típicamente recintos o membranas de carácter polimérico semipermeables y biocompatibles, que permiten la liberación del (de los) producto(s) proteínico(s) pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales procedentes de los tejidos circundantes.

Como aquí se describe, puede ser deseable tratar poblaciones de células aisladas (tales como células troncales, linfocitos, glóbulos rojos de la sangre, condrocitos, neuronas y similares) con uno o más polipéptidos de VGF. Esto se puede conseguir exponiendo las células aisladas al polipéptido directamente, cuando está en una forma que es permeable para la membrana celular.

Las realizaciones adicionales que aquí se describen se relacionan con células y métodos (p.ej., métodos de recombinación homóloga y/o otros métodos de producción por vía recombinante) tanto para la producción in vitro de polipéptidos terapéuticos como para la producción y el suministro de polipéptidos terapéuticos por una terapia génica o una terapia celular. Se pueden usar métodos de recombinación homóloga y de otro tipo para modificar una célula que contiene un gen de VGF normalmente mudo para transcribir, o un gen infraexpresado, y producir de esta manera una célula que exprese cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptidos de VGF.

La recombinación homóloga es una técnica originalmente desarrollada para dirigir genes a dianas, con el fin de inducir o corregir mutaciones en genes activos para transcribir. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucl. Acid. Res. & Mol. Biol. 36:301. La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de un mamífero (Thomas y colaboradores, 1986, Cell 44:419-28; Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503-12; Doetschman y colaboradores, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8583-87) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman y colaboradores, 1987, Nature 330:576-78). Técnicas de recombinación homólogas ilustrativas se describen en la patente de los EE.UU. Nº 5.272.071; y en los documentos de publicación EP N^{os} 9193051 y 505500; PCT/US90/07642 y en la publicación PCT Nº WO 91/09955).

Mediante una recombinación homóloga, la secuencia de ADN que se he de insertar en el genoma puede ser dirigida hacia una región específica del gen que interese, uniéndola a un ADN a dirigir hacia la diana. El ADN a dirigir hacia la diana es una secuencia de nucleótidos que es complementaria (homóloga) con una región del ADN genómico. Pequeños trozos de un ADN a dirigir hacia la diana, que son complementarios con una región específica del genoma, se ponen en contacto con la cepa progenitora durante el proceso de replicación de ADN. Una propiedad general de un ADN que ha sido insertado en una célula es la de que se hibrida y, por lo tanto, se recombina con otros trozos de un ADN endógeno mediante regiones homólogas compartidas. Si esta hebra complementaria es unida a un oligonucleótido que contiene una mutación o bien una secuencia diferente o un nucleótido adicional, además es incorporada todavía en la cepa recientemente sintetizada como un resultado de la recombinación. Como un resultado de la función de corrección de pruebas, es posible que una nueva secuencia de ADN sirva como plantilla o molde. De esta manera, el ADN transferido se incorpora en el genoma.

Están unidas a estos trozos de ADN a dirigir hacia la diana unas regiones de ADN que pueden interactuar con, o controlar la expresión de, un polipéptido de VGF, p.ej. secuencias flanqueadoras. Por ejemplo, un elemento promotor /
intensificador, un supresor o un elemento endógeno modulador de la transcripción, se introduce en el genoma de la célula anfitriona considerada en una proximidad y una orientación suficientes para influir sobre la transcripción de un ADN que codifica el deseado polipéptido de VGF. El elemento de control controla una parte del ADN que está presente en el genoma de la célula anfitriona. Por lo tanto, la expresión del deseado polipéptido de VGF se puede conseguir, no por transfección del ADN que codifica el gen de VGF propiamente dicho, sino en vez de esto por el uso de un ADN a dirigir hacia la diana (que contiene regiones de homología con el gen endógeno que interesa) acoplado con segmentos reguladores de ADN, que proporcionan a la secuencia del gen endógeno señales reconocibles para la transcripción de un gen de VGF.

En un método ilustrativo, la expresión de un deseado gen dirigido hacia la diana en una célula (p.ej., un deseado gen celular endógeno) es alterada por medio de una recombinación homóloga dentro del genoma celular en un sitio previamente seleccionado, mediante la introducción de un ADN que incluye por lo menos una secuencia reguladora, un exón, y un sitio de donante de empalme. Estos componentes se introducen en el ADN cromosomal (genómico) de tal manera que esto, en efecto, da como resultado la producción de una nueva unidad de transcripción (en que la secuencia reguladora, el exón, y el sitio de donante de empalme, presentes en la construcción artificial de ADN, se enlazan operativamente al gen endógeno). Como resultado de la introducción de estos componentes en el ADN cromosomal, se altera la expresión del deseado gen endógeno.

Una expresión alterada de un gen, como aquí se describe, abarca la activación (o dar lugar a la expresión) de un gen que normalmente está mudo (no expresado) en la célula, tal como se ha obtenido, así como aumentar la expresión de un gen que no ha sido expresado a niveles fisiológicamente significativos en la célula, tal como se ha obtenido. Las realizaciones abarcan además cambiar la pauta de regulación o inducción de manera tal que sea diferente de la pauta de regulación o inducción que se presenta en la célula que se ha obtenido, y reducir (inclusive eliminar) la expresión de un gen que es expresado en la célula, tal como se ha obtenido.

Un método mediante el cual se puede usar una recombinación homóloga para aumentar, o provocar, la producción de un polipéptido de VGF a partir de un gen de VGF que es endógeno de la célula, implica usar primeramente una recombinación homóloga para situar una secuencia de recombinación procedente de un sistema de recombinación específica para un sitio (p.ej., Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225:890-900) situado secuencia arriba de (es decir en 5' con respecto a) la región genómica de codificación del polipéptido de VGF, endógeno de la célula. Un plásmido, que contiene un sitio de recombinación que es homólogo con el sitio que se había situado justamente secuencia arriba de la región genómica de codificación del polipéptido de VGF, se introduce en el linaje celular modificado juntamente con la apropiada enzima recombinasa. Esta recombinasa da lugar a que el plásmido se integre, a través del sitio de recombinación del plásmido, dentro del sitio de recombinación situado justamente secuencia arriba de la región genómica de codificación del polipéptido de VGF en el linaje celular (Baubonis y Sauer, 1993, Nucleic Acids Res. 21:2025-29: O'Gorman y colaboradores, 1991, Science 251:1351-55). Cualesquiera secuencias flanqueadoras, de las que se conozca que aumentan la transcripción (p.ej., intensificadores / promotores, intrones, intensificadores de la traducción), si están colocadas apropiadamente en este plásmido, se integrarían de esta manera de forma tal que se crease una unidad de transcripción nueva o modificada, dando como resultado una producción de novo o aumentada de un polipéptido de VGF a partir del gen de VGF endógeno de la célula.

Un método adicional de usar el linaje celular en el que la secuencia de recombinación específica para un sitio se ha dispuesto justamente secuencia arriba de la región genómica de codificación del polipéptido de VGF endógeno de la célula, consiste en usar una recombinación homóloga para introducir un segundo sitio de recombinación en un lugar cualquiera en el genoma del linaje celular. La apropiada enzima recombinasa se introduce luego en el linaje celular con dos sitios de recombinación, dando lugar a un suceso de recombinación (deleción, inversión y translocación) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225:890-900) que podría crear una unidad de transcripción nueva o modificada, dando como resultado una producción de novo o aumentada del polipéptido de VGF a partir del gen de VGF endógeno de la célula.

Un enfoque adicional para aumentar, o provocar, la expresión de un polipéptido de VGF a partir de un gen de VGF endógeno de la célula implica aumentar, o provocar, la expresión de un gen o de varios genes (p.ej., factores de transcripción) y/o disminuir la expresión de un gen o varios genes (p.ej., represores de la transcripción) de una manera tal que de como resultado una producción de novo o aumentada de un polipéptido de VGF a partir del gen de VGF endógeno de la célula. Este método incluye la introducción de un polipéptido que no se presenta en la naturaleza (p.ej., un polipéptido que comprende un dominio de fijación de ADN, específico para un sitio, fusionado con un dominio de factor de transcripción) dentro de la célula. de manera tal que resulte una producción de novo o aumentada de un polipéptido de VGF a partir del gen de VGF endógeno de la célula.

Se describe también una terapia celular con polipéptidos de VGF, p.ej., la implantación de células que producen polipéptidos de VGF. Esta realización implica implantar células capaces de sintetizar y segregar una forma biológicamente activa de un polipéptido de VGF. Dichas células productoras de polipéptidos de VGF pueden ser células que sean productoras naturales de polipéptidos de VGF o pueden ser células recombinantes, cuya capacidad para producir polipéptidos de VGF ha sido aumentada por transformación con un gen que codifica el deseado polipéptido de VGF o con un gen que aumenta la expresión de un polipéptido de VGF. Dicha modificación se puede conseguir por medio de un vector apropiado para suministrar el gen, así como para favorecer su expresión y secreción. Con el fin de reducir al mínimo una potencial reacción inmunológica en pacientes a los que se administra un polipéptido de VGF, como puede suceder con la administración de un polipéptido de una especie ajena, se prefiere que las células naturales, que producen el polipéptido de VGF, sean de origen humano y produzcan un polipéptido de VGF humano. Similarmente, se prefiere que las células recombinantes que producen un polipéptido de VGF sean transformadas en un vector de expresión que contiene un gen que codifica un polipéptido de VGF humano.

Las células implantadas se pueden encapsular con el fin de evitar la infiltración en un tejido circundante. Células de seres humanos o de animales no humanos se pueden implantar en pacientes en recintos o membranas de carácter polimérico, semipermeables y biocompatibles, que permiten la liberación de un polipéptido de VGF, pero que impiden la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales procedentes del tejido circundante. Alternativamente, las células propias del paciente, transformadas para producir polipéptidos de VGF ex vivo, se pueden implantar directamente en el paciente sin dicha encapsulación.

Se conocen en la especialidad técnicas para la encapsulación de células vivas, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes se pueden realizar de una manera rutinaria. Por ejemplo, Baetge y colaboradores (véanse la publicación PCT Nº WO 95/05452 y el documento PCT/US94/09299) describen cápsulas con membranas que contienen células tratadas por ingeniería genética para el suministro efectivo de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las cápsulas encapsulan a células transfectadas con moléculas de ADN recombinante, que comprenden secuencias de ADN que codifican moléculas biológicamente activas enlazadas operativamente a promotores que no son objeto de una regulación decreciente in vivo después de una implantación en un anfitrión mamífero. Los dispositivos proporcionan el suministro de las moléculas procedentes de células vivas a sitios específicos dentro de un organismo receptor. Además, véanse las patentes de los EE.UU. N^{os} 4.892.538; 5.011.472 y 5.106.627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en la publicación PCT Nº WO 91/10425 (Aebischer y colaboradores). Véanse también la publicación PCT Nº WO 91/10470 (Aebischer y colaboradores); y las citas de Winn y colaboradores, 1991, Exper. Neurol. 113:322-29; Aebischer y colaboradores, 1991, Exper. Neurol. 111:269-75; y Tresco y colaboradores, 1992, ASAIO 38:17-23.

Se describe también el suministro de polipéptidos de VGF para realizar una terapia génica in vivo e in vitro. Un ejemplo de una técnica de terapia génica consiste en usar un ácido nucleico (ya sea un ADN genómico, un ADNc y/o un ADN sintético) que codifica un polipéptido de VGF, que puede estar enlazado operativamente con un promotor constitutivo inducible para formar una "construcción artificial de ADN para terapia génica". El promotor puede ser homólogo o heterólogo para el gen de VGF endógeno, con la condición de que ha de ser activo en la célula o en el tipo de tejido en el que se haya de introducir la construcción artificial. Otros componentes de la construcción artificial de ADN para terapia génica pueden incluir opcionalmente moléculas de ADN diseñadas para una integración específica para un sitio (p.ej., secuencias endógenas útiles para una recombinación homóloga), promotores específicos para tejidos, intensificadores o silenciadores, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva con respecto a la célula progenitora, moléculas de ADN útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de fijación específica para las células (tales como por ejemplo, para dirigir células hacia dianas), factores de internalización específicos para células, factores de transcripción que intensifican la expresión a partir de un vector, y factores que hacen posible la producción de vectores.

Una construcción artificial de ADN para terapia génica se puede introducir dentro de células (ya sea ex vivo o in vivo) usando vectores víricos o no víricos. Un medio para introducir la construcción artificial de ADN para terapia génica consiste en hacerlo por medio de vectores víricos, como aquí se describen. Ciertos vectores, tales como vectores retrovíricos, suministrarán la construcción artificial de ADN al ADN cromosomal de las células, y el gen se puede integrar en el ADN cromosomal. Otros vectores funcionarán como episomas, y la construcción artificial de ADN para terapia génica permanecerá dentro del citoplasma.

Todavía en otras realizaciones, se pueden incluir elementos reguladores para la expresión controlada del gen de VGF en la célula diana. Dichos elementos son acometidos como respuesta a un efector apropiado. De esta manera, un polipéptido terapéutico puede ser expresado cuando se desee. Un medio convencional de control implica el uso de pequeños dimerizadores de moléculas o "rapalogos" [compuestos análogos a rapamicina] para dimerizar proteínas quiméricas que contienen un pequeño dominio de fijación de moléculas y un dominio capaz de iniciar un proceso biológico, tal como una proteína de fijación de ADN o una proteína para la activación de la transcripción (véanse las publicaciones PCT N^{os} WO 96/41865, WO 97/31898 y WO 97/31899). La dimerización de las proteínas se puede usar para iniciar una transcripción del transgén.

Una tecnología alternativa de regulación usa un método de almacenar proteínas expresadas a partir del gen que interesa dentro de la célula como un aglomerado o racimo. El gen que interesa es expresado como una proteína de fusión que incluye un dominio de aglomeración condicional, que da como resultado la retención de la proteína aglomerada en el retículo endoplasmático. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas dentro de la célula. Las proteínas se pueden poner en libertad, sin embargo, por administración de un fármaco (p.ej., un ligando de molécula pequeña) que retira el dominio de aglomeración condicional y de esta manera desune específicamente los aglomerados o racimos, de manera tal que las proteínas puedan ser segregadas desde la célula. Véanse las citas de Aridor y colaboradores, 2000, Science 287:816-17 y de Rivera y colaboradores, 2000, Science 287:826-30.

Otros apropiados medios de control, o conmutadores génicos, incluyen, pero no se limitan a, los sistemas aquí descritos. Se usa mifepristona (RU486) como un antagonista de progesterona. La fijación al antagonista de progesterona de un dominio de fijación a un ligando de receptor de progesterona modificado activa la transcripción formando un dímero de dos factores de transcripción, que luego pasan dentro del núcleo para fijar el ADN. El dominio de fijación a un ligando es modificado para eliminar la capacidad del receptor para fijarse al ligando natural. El sistema modificado de receptor de hormona esteroide se describe adicionalmente en la patente de los EE.UU. Nº 5.364.791 y en las publicaciones PCT N^{os} WO 96/40911 y WO 97/10337.

Todavía otro sistema de control usa ecdisona (una hormona esteroide de mosca de la fruta) que se fija, y activa, a un receptor de ecdisona (receptor citoplasmático). El receptor se transloca luego al núcleo para fijar a un elemento de respuesta a ADN específico (promotor procedente del gen que responde a ecdisona). El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivación, un dominio de fijación a ADN, y un dominio de fijación a un ligando para iniciar una transcripción. El sistema de ecdisona se describe adicionalmente en la patente de los EE.UU. Nº 5.514.578 y en las publicaciones PCT N^{os} WO 97/38117, WO 96/37609 y WO 93/03162.

Otros medios de control usan un transactivador positivo controlable por tetraciclina. Este sistema implica un dominio de fijación a ADN de la proteína represora de tet mutada (cambios de aminoácidos en R-4 tet mutada, que dan como resultado una proteína transactivadora inversa, regulada por tetraciclina, es decir, que ésta se fija a un operador de tet en la presencia de tetraciclina) enlazado a un polipéptido que activa la transcripción. Dichos sistemas se describen en las patentes de las patentes de los EE.UU. N^{os} 5.464.758, 5.650.298 y 5.654.168.

Adicionales sistemas de control de la expresión y construcciones artificiales de ácidos nucleicos se describen en las patentes de los EE.UU. N^{os} 5.741.679 y 5.834.186, cedidas a Innovir Laboratories Inc.

Una terapia génica in vivo se puede conseguir introduciendo una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido de VGF, dentro de células mediante inyección local o por otros apropiados vectores de suministro víricos o no víricos. Hefti, 1994, Neurobiology 25:1418-35. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de VGF, puede estar contenida en un vector de virus adeno-asociado (AAV, de adeno-associated virus) para suministro a las células dirigidas a una diana (véanse, p.ej., Johnson, publicación PCT Nº WO 95/34670; solicitud PCT Nº PCT/US95/07178). El genoma de AAV recombinantes contiene típicamente repeticiones terminales invertidas de AAV que flanquean a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de VGF enlazado operativamente a secuencias promotoras funcionales y de poliadenilación.

Alternativos vectores víricos apropiados incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus del herpes simple, lentivirus, virus de la hepatitis, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus, y vectores de virus del papiloma. La patente de los EE.UU. Nº 5.672.344 describe un sistema de transferencia de genes mediado por virus in vivo que implica a un vector de HSV-1 neurotrófico recombinante. La patente de los EE.UU. Nº 5.399.346 proporciona ejemplos de un procedimiento para proporcionar a un paciente una proteína terapéutica mediante el suministro de células humanas que han sido tratadas in vitro para insertar un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica. Métodos y materiales adicionales para la práctica de técnicas de terapia génica, se describen en las patentes de los EE.UU. N^{os} 5.631.237 (que implican a vectores adenovíricos), 5.672.510 (que implican a vectores retrovíricos), 5.635.399 (que implican a vectores retrovíricos que expresan citocinas).

Los métodos de suministro no vírico incluyen, pero no se limitan a, una transferencia mediada por liposomas, un suministro de ADN desnudo, es decir sin ningún tipo de aditivo (por inyección directa), una transferencia mediada por receptores (con un complejo de un ligando y ADN), una electroporación, una precipitación con fosfato de calcio, y un bombardeo de micropartículas (p.ej., con un cañón de genes). Los materiales y métodos de terapia génica pueden incluir también promotores inducibles, promotores intensificadores específicos para tejidos, secuencias de ADN diseñadas para una integración específica para ciertos sitios, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva con respecto a la célula progenitora, marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa y sistemas de control de la expresión (medidas de seguridad), agentes de fijación específicos para células (para dirigir células hacia dianas), factores de internalización específicos para células, y factores de transcripción para intensificar la expresión por un vector, así como métodos de producción de vectores. Dichos métodos y materiales adicionales para la práctica de técnicas de terapia génica se describen en las patentes de los EE.UU. N^{os} 4.970.154 (que implican técnicas de electroporación), 5.679.559 (que describen un sistema que contiene lipoproteínas, para el suministro de genes), 5.676.954 (que implican soportes de liposomas), 5.593.875 (que describen métodos para la transfección con fosfato de calcio) y 4.945.050 (que describe un procedimiento en el que se propulsan partículas biológicamente
activas hacia células a una velocidad con la que las partículas penetran en la superficie de las células y resultan incorporadas en el interior de las células), y la publicación PCT Nº WO 96/40958 (que implica a ligandos nucleares).

Se considera también que una terapia génica o terapia celular con VGF puede incluir además el suministro de uno (o más) polipéptido(s) adicional(es) en las mismas células o en células diferentes. Dichas células pueden ser introducidas por separado en el paciente, o las células pueden estar contenidas en un único dispositivo implantable, tal como la membrana de encapsulación arriba descrita, o las células pueden ser modificadas por separado por medio de vectores víricos.

Un medio de aumentar la expresión de polipéptidos de VGF endógenos en una célula por medio de una terapia génica, consiste en insertar uno o más elementos intensificadores dentro del polipéptido de VGF, donde los elementos intensificadores pueden servir para aumentar la actividad para transcripción de un gen de VGF. Los elementos intensificadores usados se seleccionarán basándose en el tejido en el que se desea activar el gen - se seleccionarán elementos intensificadores de los que se conozca que confieren activación con promotores en ese tejido. Por ejemplo, si un gen que codifica un polipéptido de VGF ha de ser "desviado" en células T, se puede usar el elemento promotore intensificador lck. Aquí, la parte funcional del elemento de transcripción que se ha de añadir se puede insertar en un fragmento de ADN que contiene el promotor de polipéptidos de VGF (y opcionalmente, insertar en un vector y/o en secuencias flanqueadoras en 5' y/o 3') usando técnicas clásicas de clonación. Esta construcción artificial, conocida como una "construcción artificial para recombinación homóloga" se puede introducir luego en las deseadas células ya sea ex vivo o in vivo.

Una terapia génica se puede usar también para disminuir la expresión de polipéptidos de VGF por modificación de la secuencia de nucleótidos del promotor endógeno. Dicha modificación se realiza típicamente a través de métodos de recombinación homóloga. Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene la totalidad o una parte del promotor del gen de VGF seleccionado para su desactivación se puede tratar por ingeniería genética para eliminar y/o reemplazar trozos del promotor que regula la transcripción. Por ejemplo, la caja TATA y/o el sitio de fijación a un activador de la transcripción del promotor se pueden suprimir (delecionar) usando técnicas clásicas de biología molecular; dicha deleción puede inhibir la actividad del promotor, reprimiendo de esta manera la transcripción del correspondiente gen de VGF. La deleción de la caja TATA o del sitio de fijación a un activador de la transcripción en el promotor se pueden conseguir por generación de una construcción artificial de ADN que comprende la totalidad o la parte relevante del promotor de polipéptidos de VGF (procedente de la misma especie o de una especie afin que el gen de VGFque se ha de regular) en que uno o más de los nucleótidos de la caja TATA y/o del sitio de fijación a un activador de la transcripción es (son) mutado(s) por sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos. Como resultado, la caja TATA y/o el sitio de fijación a un activador tiene una actividad disminuida o se vuelve completamente inactivo. Esta construcción artificial, que también contendrá típicamente por lo menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las secuencias de ADN en 5' y 3' naturales (endógenas) adyacentes al segmento del promotor que ha sido modificado, se puede introducir en las apropiadas células (ya sea ex vivo o in vivo) ya sea directamente o a través de un vector vírico como aquí se describe. Típicamente, la integración de la construcción artificial en el ADN genómico de las células se realizará a través de una recombinación homóloga, en que las secuencias de ADN en 5' y 3' en la construcción artificial del promotor pueden servir para ayudar a integrar la región de promotor modificado a través de una hibridación con el ADN cromosomal endógeno.

Usos de polipéptidos de VGF

Los polipéptidos de VGF se pueden usar (simultánea o consecutivamente) en combinación con uno o más de los agentes seleccionados entre citocinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios y/o quimioterapéuticos según sea apropiado para el estado que se esté tratando.

Se pueden emplear también otros métodos, cuando sea deseable inhibir la actividad de uno o más polipéptidos de VGF. Dicha inhibición se puede efectuar mediante moléculas de ácidos nucleicos que son complementarias, y se hibridan, con secuencias de control de la expresión (formación de una triple hélice) o con un ARNm de VGF. Por ejemplo, se pueden introducir en la célula moléculas de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria con por lo menos una parte de un gen de VGF. Las sondas antisentido se pueden diseñar por medio de técnicas disponibles usando la secuencia del gen de VGF que aquí se describe. Típicamente, cada una de dichas moléculas antisentido será complementaria con el sitio de iniciación (extremo 5') de cada gen de VGF seleccionado. Cuando la molécula antisentido se hibrida luego con el correspondiente ARNm de VGF, se impide o reduce la traducción de este ARNm. Los inhibidores antisentido proporcionan una información en relación con la disminución o la ausencia de un polipéptido de VGF en una célula o un organismo.

Alternativamente, se puede emplear una terapia génica para crear un inhibidor dominante - negativo de uno o más polipéptidos de VGF. En esta situación el ADN que codifica un polipéptido mutante de cada polipéptido de VGF seleccionado se puede preparar e introducir dentro de las células de un paciente usando métodos ya sea víricos o no víricos, como aquí se describen. Cada uno de dichos mutantes se diseña típicamente para competir con un polipéptido endógeno en su cometido biológico.

Además, un polipéptido de VGF, independientemente de que sea biológicamente activo o no, se puede usar como un inmunógeno, es decir que el polipéptido contiene por lo menos un epítopo frente a los cuales se pueden inducir anticuerpos. Agentes de fijación selectiva, que se fijan a un polipéptido de VGF (como aquí se describe) se pueden usar para finalidades de diagnóstico in vivo e in vitro, incluyendo, pero sin limitarse a, un uso en forma marcada para detectar la presencia de un polipéptido de VGF en una muestra de fluido corporal o de células. Los anticuerpos se pueden usar también para preparar un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de enfermedades y trastornos, que incluyen los que aquí se han citado. Los anticuerpos pueden fijarse a un polipéptido de VGF de manera tal que se disminuya o bloquee por lo menos una actividad característica de un polipéptido de VGF, o se pueden fijar a un polipéptido para aumentar por lo menos una actividad característica de un polipéptido de VGF (incluyendo el aumento de las propiedades farmacocinéticas del polipéptido de VGF).

Los polipéptidos de VGF aquí descritos se pueden usar para clonar receptores de polipéptidos de VGF, usando una estrategia de clonación con expresión. Un polipéptido de VGF marcado radiactivamente (con 125-yodo) o un polipéptido de VGF etiquetado por afinidad / actividad (tal como una fusión con Fc o una fusión con fosfatasa alcalina) se puede usar en ensayos de fijación para identificar un tipo de células o un linaje celular o un tejido que exprese receptores de polipéptidos de VGF. Un ARN aislado a partir de tales células o tejidos se puede convertir en un ADNc, clonar dentro de un vector de expresión de mamífero, y transfectar dentro de células de mamíferos (tales como células COS ó 293) para crear una biblioteca de expresión. Un polipéptido de VGF marcado radiactivamente o etiquetado se puede usar entonces como un ligando de afinidad para identificar y aislar a partir de esta biblioteca el subconjunto de células que expresan los receptores de polipéptidos de VGF en su superficie. Un ADN se puede aislar luego a partir de estas células y transfectar dentro de células de mamífero para crear una biblioteca de expresión secundaria, en que la fracción de células que expresan receptores de polipéptidos de VGF es muchas veces mayor que en la biblioteca original. Este proceso de enriquecimiento se puede repetir reiteradamente hasta que se aísle un único clon recombinante que contenga un receptor de polipéptido de VGF. El aislamiento de los receptores de polipéptidos de VGF es útil para identificar o desarrollar nuevos agonistas y antagonistas de la trayectoria de señalización de los polipéptidos de VGF. Dichos agonistas y antagonistas incluyen receptores de polipéptidos de VGF solubles, anticuerpos anti-receptores de polipéptidos de VGF, pequeñas moléculas o bien oligonucleótidos antisentido, y se pueden usar para preparar un medicamento
destinado al tratamiento o a la prevención de una o más de las enfermedades o trastornos que aquí se han descrito.

Los siguientes ejemplos están concebidos solamente para finalidades de ilustración y no deberán ser considerados como que limiten el alcance del invento de ninguna de las maneras.

Ejemplo 1 Producción de anticuerpos anti-polipéptidos de VGF

Se produjeron anticuerpos contra polipéptidos de VGF por inyección en conejos de polipéptidos de VGF sintetizados por el grupo Amgen Boulder Peptide Technology, usando protocolos clásicos de síntesis de péptidos. Después de una síntesis de péptidos, se agruparon y liofilizaron polipéptidos de VGF procedentes de diferentes tandas. El contenido de péptidos para cada polipéptido de VGF se determinó por hidrólisis con HCl.

Para preparar anticuerpos policlonales anti-polipéptidos de VGF a partir de polipéptidos de VGF (VGF-1; SEQ ID NO: 1 ó VGF-2; SEQ ID NO: 4; Tabla I) que carecen de residuos de cisteína, 5 mg de un polipéptido de VGF y 0,5 ml de un Tampón para Conjugación con EDC Imject® (Pierce, Rockford, IL) se transfirieron a un vial de 2 ml, y la mezcla se trató con vórtice. Un vial con 20 mg de Hemocianina de Lapa Californiana Imject® (de Pierce) se diluyó en 2 ml de agua esterilizada y se añadieron 0,5 ml de esta solución a la solución del polipéptido de VGF. A continuación de la adición de la Hemocianina de Lapa Californiana, se añadieron 0,1 ml de EDC [etil-dimetilaminopropil-carbodiimida] (10 mg de EDC (de Pierce) en 1 ml de agua esterilizada) al polipéptido de VGF y esta solución se incubó a la temperatura ambiente durante al menos 2 horas.

Después de una incubación, el polipéptido de VGF conjugado se transfirió a una tubería para diálisis Spectra/Por 6 (de Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA), que tiene un corte de pesos moleculares de 1.000, y se dializó en 2 l de una PBS (solución salina tamponada con fosfato) durante una noche a 4ºC para eliminar el EDTA, que es un anticoagulante conocido, desde la muestra. La solución dializada del polipéptido de VGF conjugado se transfirió a un tubo cónico de 15 ml de capacidad, y se añadió PBS para llevar hasta 4 ml el volumen de la solución. Partes alícuotas de 1 ml cada una se transfirieron a tubos con una capacidad de 2 ml, con parte superior roscada, cada parte alícuota se introdujo en una jeringa de vidrio con una capacidad de 2 ml, y luego se introdujo 1 ml del adyuvante de investigación Titermax® Research Adjuvant (CytRx, Norcross, Georgia).

La jeringa se conectó con una aguja mezcladora de calibre 18 y la solución se mezcló para emulsionarla. La mezcla se transfirió luego a dos jeringas con una capacidad de 1 ml para efectuar inyecciones intramusculares a conejos. A los conejos se les inyectaron 0,1 ml de una solución de polipéptido de VGF y coadyuvante en dos sitios de inyección, y luego los conejos se reinyectaron a las 4 semanas y 6 semanas después de esto. Se extrajo sangre de los conejos para ensayarla (sacando aproximadamente 5 ml) a continuación de la segunda reinyección y luego se extrajo de nuevo sangre después de dos semanas para ensayo. Si las extracciones de sangre de producción se estimaron aceptables, los conejos se reinyectaron de nuevo y luego se les extrajo sangre una vez por semana durante seis semanas (sacando aproximadamente 40 ml) dos semanas después de esta reinyección. Las Figuras 1 y 2 ilustran los niveles de títulos de anticuerpos de conejos a los que se inyectó o bien VGF-1 o VGF-2.

Para preparar anticuerpos policlonales anti-VGF a partir de polipétidos de VGF que poseen residuos de cisteína, se transfirieron 5 mg de un polipéptido de VGF y 0,5 ml de un Tampón de Conjugación con Maleimida Imject® (de Pierce) a un vial con una capacidad de 2 ml, y la mezcla se sometió a un vórtice. Un vial con 20 mg de Hemocianina de Lapa Californiana Imject® (Pierce) se diluyó en 2 ml de agua esterilizada, y se añadieron 0,5 ml de esta solución a la solución de polipéptido de VGF. A continuación de la adición de Hemocianina de Lapa Californiana, la solución de polipéptido se incubó a la temperatura ambiente durante por lo menos 2 horas.

A continuación de la incubación, un polipéptido de VGF conjugado se transfirió a una tubería de diálisis Spectra/Por 6 y se dializó en 2 l de un PBS durante una noche a 4ºC para eliminar el EDTA desde la muestra. La solución dializada de polipéptido de VGF conjugado se transfirió a un tubo cónico con una capacidad de 15 ml y se añadió PBS para llevar hasta 4 ml el volumen de la solución. Se transfirieron partes alícuotas de 1 ml de cada a tubos con una capacidad de 2 ml, con parte superior roscada, cada parte alícuota se introdujo en una jeringa de vidrio con una capacidad de 2 ml y luego se introdujo 1 ml del adyuvante de investigación Titermax® (CytRx).

La jeringa se conectó con una aguja mezcladora de calibre 18 y la solución se mezcló para emulsionarla. La mezcla se transfirió luego a dos jeringas con una capacidad de 1 ml para efectuar inyecciones intramusculares a conejos. A los conejos se les inyectaron 0,1 ml de una solución de polipéptido de VGF y de adyuvante en dos sitios de inyección, y luego los conejos se reinyectaron a las 4 semanas y 6 semanas después de esto. Se extrajo sangre de los conejos para ensayarla (sacando aproximadamente 5 ml) a continuación de la segunda reinyección y luego se extrajo de nuevo sangre después de dos semanas para ensayo. Si las extracciones de sangre de producción se estimaron aceptables, los conejos se reinyectaron de nuevo y luego se les extrajo sangre una vez por semana durante seis semanas (sacando aproximadamente 40 ml) dos semanas después de esta reinyección.

Ejemplo 2 Actividad biológica de un polipéptido de VGF en ratones desactivados inmunológicamente

La actividad biológica de polipéptidos de VGF en ratones desactivados inmunológicamente se analizó usando polipéptidos de VGF sintetizados por el grupo Amgen Boulder Peptide Technology, usando protocolos clásicos de síntesis de péptidos. A continuación de la síntesis de los péptidos, polipéptidos de VGF procedentes de diferentes tandas se
agruparon y liofilizaron. El contenido de péptidos para cada polipéptido de VGF se determinó por hidrólisis con HCl.

Ratones desactivados inmunológicamente con genes de VGF se obtuvieron de Steve Salton de Mt. Sinai Scholl of Medicine, Nueva York, NY. Antes de la administración de un polipéptido de VGF, los ratones desactivados inmunológicamente se alojaron en condiciones de luz y oscuridad LO 12:12 (es decir, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad). A las veinticuatro horas antes de la inyección del polipéptido de VGF, ratones desactivados inmunológicamente se enjaularon individualmente y se movieron a una habitación de alojamiento provisional en donde los ratones se mantuvieron durante el resto del experimento en condiciones de LO 12:12.

El polipéptido de VGF se administró a ratones desactivados inmunológicamente dos veces por día (a las 9:00 de la mañana y a las 6:00 de la tarde) por inyección intraperitoneal de 2 mg de VGF-1a (SEQ ID NO: 2; Tabla 2). Antes de la inyección, el polipéptido de VGF-1a se diluyó hasta 16% en un Tampón de Solución de aCSF (NaCl 126,6 mM, KCl 2,6 mM, MgCl_{2} 2,0 mM y CaCl_{2} 1,4 mM, NaPO_{4} 10 mM, de pH 7,4). A ratones desactivados inmunológicamente se les administró el polipéptido de VGF-1a durante cinco días y se midió diariamente el peso corporal de cada ratón. El peso corporal de los ratones tratados se midió diariamente durante tres días a continuación de la retirada del polipéptido de VGF-1a.

La Figura 3 ilustra el peso corporal de ratones desactivados inmunológicamente con VGF a continuación de la administración de VGF-1a. Tres de los cuatro ratones tratados ganaron un 10-15 por ciento en cuanto a peso corporal. A partir de este experimento no fue posible determinar si el aumento de peso era un resultado de una ingestión aumentada de alimento o de agua.

Ejemplo 3 Proteínas de fusión de polipéptidos de VGF y Fc

Los polipéptidos de VGF se expresan como proteínas de fusión con una región Fc de cadena pesada de inmunoglobulina IgG humana en sus extremos terminales de carboxilo o amino. Usando apropiados cebadores de la PCR y procedimientos clásicos de amplificación por PCR, se preparan construcciones artificiales de fusión de polipéptidos de VGF y Fc fusionando en marco una secuencia de ADN que codifica la región Fc de IgG1 humana con la que codifica un polipéptido de VGF-1 (SEQ ID NO: 1), VGF-1b (SEQ ID NO: 3) o VGF-2 (SEQ ID NO: 4).

Los productos de fusión de polipéptidos de VGF y Fc, generados por una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se digieren con las endonucleasas de restricción Nde I y Bam HI, se ligan dentro del vector pAMG21 y luego se transforman dentro de células competentesde la cepa 2596 de E. coli usando técnicas clásicas. Los clones se escrutan en cuanto a su capacidad para producir el producto de proteína recombinante y para que posean la fusión de gen que tenga la correcta secuencia de nucleótidos.

Cultivos bacterianos que contienen las construcciones artificiales de fusión con Fc en la cepa GM221 de E. coli se hacen crecer a 37ºC en un medio de Caldo Luria que contiene 50 mg/ml de kanamicina. La inducción de la expresión del producto génico a partir del promotor luxPR se consigue a continuación de la adición de la autoinductor sintético N-(3-oxohexanoíl)-lactona de DL-homoserina al medio de cultivo, hasta una concentración final de 20 ng/ml. Los cultivos se incuban a 37ºC durante 3 horas adicionales. A continuación de esta incubación, los cultivos bacterianos se examinan con un microscopio para determinar la presencia de cuerpos de inclusión y luego se recogen por centrifugación. Los sedimentos celulares se lisan directamente por resuspensión en un tampón de muestra de Laemmli, que contiene 10% de \beta-mercaptoetanol, y se analizan por SDS-PAGE.

Las proteínas de fusión de polipéptidos de VGF y Fc se purifican primero rompiendo las células en agua usando una homogeneización a alta presión (es decir, 2 pasadas a 14.000 PSI = 980 kg/cm^{2}). Se cosechan cuerpos de inclusión por centrifugación a 4.200 RPM en J-6B durante 1 hora, y los cuerpos de inclusión se solubilizan en guanidina 6 M, Tris 50 mM, DTT 8 mM, de pH 8,7 durante 1 hora a una relación 1/10. Luego, la mezcla solubilizada se diluye a 20 veces en urea 2 M, Tris 50 mM, arginina 160 mM, cisteína 3 mM, de pH 8,5. La mezcla se agita durante una noche en frío, se concentra a aproximadamente 10 veces por ultrafiltración y luego se diluye a 3 veces con Tris 10 mM, urea 1,5 M, de pH 9. Luego, el pH de esta mezcla se ajusta con ácido acético a un valor del pH de 5. El precipitado se retira por centrifugación y el material sobrenadante se carga en una columna con SP-Sepharose Fast Flow equilibrada en NaAc 20 mM, NaCl 100 mM, de pH 5 (carga con proteína 10 mg/ml; temperatura ambiente). La proteína se eluye a partir de la columna utilizando un gradiente de 20 volúmenes de columna en el mismo tampón que fluctúa entre NaCl 100 mM y NaCl 500 mM. La fracción agrupada procedente de la columna se diluye a 3 veces y se carga en una columna con SP-Sepharose HP en NaAc 20 mM, NaCl 150 mM, de pH 5 (carga con proteína 10 mg/ml; temperatura ambiente). La proteína se eluye usando un gradiente de 20 volúmenes de columna en el mismo tampón que fluctúa entre NaCl 150 mM y NaCl 400 mM. El pico se agrupa y
filtra.

La actividad de la proteína de fusión de un polipéptido de VGF y Fc se comprueba usando métodos aquí descritos o conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la especialidad.

Ejemplo 4 Expresión de un polipéptido de VGF murino en ratones transgénicos

Para averiguar la actividad biológica de un polipéptido de VGF, se preparó una construcción artificial que codificaba un polipéptido de VGF murino bajo el control del promotor de sinapsina, usando protocolos clásicos. Se espera que el suministro de esta construcción artificial cause cambios patológicos que sean informativos en cuanto a la función del polipéptido de VGF. Similarmente, se preparó una construcción artificial que contenía el polipéptido de VGF de plena longitud bajo el control del promotor de beta actina, usando protocolos clásicos. Se espera que el suministro de esta construcción artificial dé como resultado una expresión ubicua.

Para generar estas construcciones artificiales, se usó una PCR para amplificar secuencias de ADN de molde, que codifican un polipéptido de VGF murino, usando unos cebadores que corresponden a los extremos 5' y 3' de la deseada secuencia y que incorporan sitios para enzimas de restricción con el fin de permitir la introducción del producto amplificado dentro de un vector de expresión. A continuación de la amplificación, los productos de la PCR se purificaron en gel, se digirieron con las apropiadas enzimas de restricción, y se ligaron dentro de un vector de expresión usando técnicas clásicas de ADN recombinante. Véanse las citas de Graham y colaboradores, 1997, Nature Genetics, 17:272-74 y Ray y colaboradores, 1991, Genes Dev. 5:2265-73.

Después de la ligación, las mezclas de reacción se usaron para transformar una cepa anfitriona de E. coli por electroporación y se seleccionaron transformantes en cuanto a la resistencia a fármacos. Un ADN de plásmido, procedente de colonias seleccionadas, se aisló y se sometió a secuenciación del ADN para confirmar la presencia de una inserción apropiada y la ausencia de una mutación. Los vectores de expresión del polipéptido de VGF se purificaron a través de dos rondas de centrifugación con un gradiente de densidades de CsCl, se disociaron con una apropiada enzima de restricción, y el fragmento linealizado que contenía el transgén del polipéptido de VGF murino se purificó por electroforesis en gel. El fragmento purificado se volvió a suspender en Tris 5 mM, de pH 7,4 y EDTA 0,2 mM en una concentración de 2 \mug/ml.

Embriones de una sola célula procedentes de ratones criados BDF1 x BDF1 se inyectaron tal como se ha descrito (en la publicación PCT Nº WO 97/23614). Los embriones se cultivaron durante una noche en una incubadora con CO_{2} y 15-20 embriones de dos células se transfirieron a los oviductos de una ratona hembra CD1 pseudoembarazada. Los descendientes obtenidos a partir de la implantación de embriones microinyectados se exploraron por amplificación por PCR del transgén integrado en muestras de ADN genómico, de la siguiente manera. Trozos de oreja se digirieron en 20 ml de un tampón para orejas (Tris 20 mM, de pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS al 0,5% y proteinasa K 500 mg/ml) a 55ºC durante una noche. Luego la muestra se diluyó con 200 \mul de TE y se usaron 2 \mul de la muestra de oreja en una reacción de PCR, usando cebadores apropiados.

Animales fundadores transgénicos se identificaron y usaron para generar ratones F1. Para hacer esto, se extraen partes del bazo, del hígado y del cerebro total procedentes de ratones F1 y se determinan por RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa) el ARN celular total aislado a partir de los bazos usando el Estuche de Extracción de ARN Total (de Qiagen) y la expresión del transgén. El ARN recuperado a partir de los bazos se convierte en un ADNc usando el Sistema de Preamplificación SuperScript® (Gibco-BRL) de la siguiente manera. Un cebador apropiado, situado en la secuencia del vector de expresión y en 3' con respecto al transgén del polipéptido de VGF, se usa para cebar la síntesis de ADNc a partir de los transcritos del transgén. Diez mg del ARN total preparado a partir de los tejidos de hígado, cerebro y bazo de fundadores transgénicos y de testigos, se incuban con 1 mM de un cebador durante 10 minutos a 70ºC y se colocan sobre hielo. Luego la mezcla de reacción se suplementa con Tris-HCl 10 mM, de pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, dNTP10 mM de cada, DTT 0,1 mM y 200 U de transcriptasa inversa SuperScript II. Después de una incubación durante 50 minutos a 42ºC, la reacción se detiene por calentamiento durante 15 minutos a 72ºC y se digiere con 2 U de RNsa H durante 20 minutos a 37ºC. Luego las muestras se amplifican por una PCR, usando cebadores específicos para el polipéptido de VGF
murino.

Las camadas procedentes de ratones F1 positivos transgénicos se crían de modo cruzado para generar ratones homocigóticos F2. El nivel de expresión del ARNm de VGF en ratones F2 se determina como aquí se describe.

Ejemplo 5 Actividad biológica de un polipéptido de VGF murino en ratones transgénicos F2

Antes de someterse a eutanasia, animales transgénicos F2 obtenidos en el Ejemplo 4 se pesan, se anestesian mediante isofluorano y se les extrae sangre por punción cardíaca. Las muestras se someten a análisis hematológicos y químicos del suero. Una radiografía se realiza después de una exsanguinación terminal. Después de una disección grosera, los órganos viscerales de mayor tamaño se someten a un análisis del peso.

Después de la disección grosera, se extraen tejidos (a saber, de hígado, bazo, páncreas, estómago, todo el tracto gastrointestinal, riñones, órganos reproductores, piel y glándulas mamarias, hueso, cerebro, corazón, pulmón, timo, tráquea, esófago, tiroides, glándulas adrenales, vejiga urinaria, nodos linfáticos y músculos del esqueleto) y se fijan en Zn-formalina tamponada al 10% para su examen histológico. Después de la fijación, los tejidos se elaboran dentro de bloques de parafina, y se obtienen secciones de 3 mm. Todas las secciones se tiñen con hematoxilina y eosina y luego se someten a un análisis histólogico.

El hígado, el nodo linfático y las placas de Peyer tanto de los ratones transgénicos como de los testigos, se someten a un análisis inmunohistológico con anticuerpos específicos para células B y células T, de la siguiente manera. Las secciones embebidas en parafina y fijadas con formalina se desparafinan y se hidratan en agua desionizada. Las secciones se enfrían rápidamente con peróxido de hidrógeno al 3%, se bloquean con un Bloque de Proteína (de Lipshaw, Pittsburgh, PA), y se incuban en anticuerpos B220 y CD3 anti-ratón monoclonales de rata (de Harlan, Indianapolis, IN). Se detecta la fijación de anticuerpos por inmunoglobulinas anti-rata de ratón, biotiniladas y con estreptavidina conjugada con peroxidasa (de BioGenex, San Ramón, CA) con DAB como un cromógeno (BioTek, Santa Bárbara, CA). Las secciones se contratiñen con hematoxilina.

Después de una necrosia, se rextraen las MLN y secciones de bazo y timo de camadas de animales transgénicos y testigos. Se preparan suspensiones de una sola célula triturando suavemente los tejidos con el extremo plano de una jeringa contra el fondo de un colador de células de Nylon de 100 mm (de Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las células se lavan dos veces, se recuentan, y aproximadamente 1 x 10^{6} células procedentes de cada tejido se incuban luego durante 10 minutos con 0,5 \mug de un bloque de CD16/32(Fc\gammaIII/II) Fc en un volumen de 20 \mul. Luego las muestras se tiñen durante 30 minutos a 2-8ºC en un volumen de 100 \mul de PBS (que carece de Ca^{+} y Mg^{+}), 0,1% de albúmina de suero bovino, y 0,01% de aziduro de sodio, con 0,5 \mug de anticuerpos monoclonales, conjugados con FITC o PE, contra CD90.2 (Thy-1.2), CD45R (B220), CD11b(Mac-I), Gr-I, CD4 o CD8 (PharMingen, San Diego, CA). Después de la fijación a los anticuerpos, las células se lavan y luego se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (de Becton Dickinson).

Aunque el presente invento se ha descrito en términos de las realizaciones preferidas, se entiende que variaciones y modificaciones se les ocurrirán a los expertos en la especialidad. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anejas cubran todas aquellas variaciones equivalentes que entren dentro del alcance del invento, tal como se reivindica.

<110> Yan, Hai

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Agentes de fijación selectiva de VGF y métodos para tratar trastornos relacionados con VGF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 00-423-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/144,743

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-07-21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patentln Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Arg Leu Gln Glu Gln Glu}

\sac{Glu Leu Glu Asn Tyr Ile Glu His Val Leu Leu His Arg Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Glu Gln Glu Glu Leu Glu Asn Tyr Ile Glu His Val Leu Leu}

\sac{His Arg Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Gly Ser Phe Leu Gly Gly Ser Glu Ala Gly Glu Arg Leu Leu}

\sac{Gln Gln Gly Leu Ala Gln Val Glu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Glu Glu Ala Pro Gly His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Phe His His Ala Leu Pro Pro Ala Arg His His Pro Asp Leu Glu}

\sac{Ala Gln Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Glu Asp Glu Val Gly Glu Glu Asp Glu Glu Ala Ala Glu}

\sac{Ala Glu Ala Glu Ala Glu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Gln Asn Ala Leu}

\sac{Leu Phe Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala Gly Ala Glu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

5

Claims (18)

1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que fija específicamente a una secuencia de aminoácidos, seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, o una variante presente en la naturaleza de la misma.

2. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se fija específicamente a la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2.

3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo humanizado.

4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

5. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.

6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo injertado con una CDR, o un fragmento del mismo.

7. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo antiidiotípico, o un fragmento del mismo.

8. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que es un fragmento de región variable.

9. El fragmento de región variable de la reivindicación 8, que es un fragmento Fab o un fragmento Fab'.

10. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad con especificidad para la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 10.

11. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, que está fijado a una marca detectable.

12. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la producción de un medicamento destinado a antagonizar una actividad biológica de un polipéptido de VGF.

13. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la producción de un medicamento destinado a tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, un trastorno o una condición que se relaciona con un polipéptido de VGF.

14. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la producción de un medicamento destinado al tratamiento, la prevención o el mejoramiento de la obesidad.

15. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la producción de un medicamento destinado al tratamiento, la prevención o el mejoramiento de esterilidad, caquexia, trastornos en la comida, un complejo relacionado con el SIDA, condiciones hipermetabólicas, hiperactividad, hipoactividad o hiperproducción de insulina.

16. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la producción de un medicamento destinado al tratamiento, la prevención o el mejoramiento de bulimia o anorexia nerviosa.

17. Un anticuerpo monoclonal producido por inmunización de un animal con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 10.

18. Un hibridoma que produce un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2.