JP4476623B2

JP4476623B2 - インスリン産生細胞移植片拒絶の処置または予防

Info

Publication number: JP4476623B2
Application number: JP2003502981A
Authority: JP
Inventors: フィリップ・レイク; クローディ・マロン
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2022-06-07
Also published as: US20110236382A1; CA2445605A1; PT1429845E; WO2002100148A3; US20060153842A1; CN1524002A; ATE424893T1; IL158384A0; US20030003099A1; ES2322442T3; PL364359A1; AU2002320828B2; US20080199465A1; US20140093502A1; RU2003136730A; WO2002100148A2; NZ529044A; DE60231522D1; ZA200307893B; BR0209319A

Description

発明の詳細な説明

本発明は、インスリン産生細胞移植片拒絶、特に膵島移植片拒絶の処置または予防方法に関する。

Ｉ型糖尿病は、膵島のインスリン産生β細胞の進行性、自己免疫性破壊により引き起こされる。現在では、１日に複数回のインスリン注射、またはインスリンポンプ治療が、大部分の糖尿病患者によく選択される治療である。徹底的なインスリン治療は、二次的な合併症の発生を減少させ得るが、その効果は絶対的なものではなく、そして、患者は、低血糖の深刻な症状の発現のリスクが増加する。

膵島移植(islet transplantation)は、膵器官移植よりも、有意により安全な、糖尿病において分泌が止まった腺組織を置きかえる方法であり、そして、徹底的なインスリン治療にもかかわらず不十分なグルコース制御を有する患者におけるＩ型糖尿病の処置として、１０年以上研究されてきた。

膵島移植手順の大部分は、抗リンパ球グロブリンでの抗体誘導、ならびにシクロスポリン、アザチオプリンおよびグルココルチコイドでの延命処置からなる免疫抑制レジメンを既に受けている腎移植片レシピエントにおいて行われてきた。Brendel et al., International Islet Transplant Registry report., Giessen, Germany, 1999, pp. 1-20参照。

しかしながら、膵島移植は、拒絶、自己免疫の再発、初期無機能(primary nonfunction; PNF)、および慣用的免疫抑制薬の糖尿病誘発性にために、このような免疫抑制レジメンを用いて達成することが困難であった。特に、膵島の点滴後に、活性化された肝内のマクロファージおよび内皮細胞により産生されたプロ炎症性メディエーターは、膵島の機能に有害であり、そして、早期の膵島喪失または移植片の初期無機能化をもたらし得る。

したがって、レシピエントの体重(ｋｇ)あたり１０,０００以上の膵島当量(ＩＥＱ)が、非ヒト霊長類(ヒヒ、アカゲザルおよびカニクイザル)(Kenyon et al, Diabetes, 48, pp. 8132-8137, 1999参照)およびヒト(Shapiro et al, The New England J. of Med., 343 (4), pp. 230-238, 2000参照)においてインスリン非依存性を再現性よく達成するために必要とされると見積もられている。

Ｙａｍａｓａｋｉおよび協力者らは、移植の前および移植の日に、ＦＴＹ７２０の前投与によりストレプトゾトシンで高血糖にした雄性ラットにおいて２０日まで延長された膵島同種移植片生存が達成されることを報告した(Cell Transplantation, Vol. 7, No. 4, pp. 403-406 (1998))。

Ｋｅｎｙｏｎおよび協力者らは、膵島移植は、抗−ＣＤ１５４からなる免疫抑制レジメンを用いて、ヒトにおいて、ならびにげっ歯類、イヌ、カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒを含むいくつかの糖尿病動物モデルにおいて、高血糖および長期間のインスリン非依存性の反転をもたらし得ることを示した(Kenyon et al., Diabetes, 48, pp. 8132-8137, 1999)。

Ｓｈａｐｉｒｏおよび協力者らは、近年、ラパマイシン(すなわち、シロリムス)、タクロリムスおよびダシリツマブ(daclizumab, すなわち、ＩＬ−２レセプターに対するヒト化抗体)からなるグルココルチコイドフリーの免疫抑制レジメンとともに膵島移植を受けた、Ｉ型糖尿病を有し、そして重症の低血糖および代謝的不安定の病歴を有する患者において好ましい結果が得られることを報告した。膵島同種移植を受けた７の患者のうち７名が、インスリン非依存性になった。報告された最長の患者追跡は、移植後１７ヵ月であった(Shapiro et al., NEJM 343: 230-238 (2000)参照)。

しかしながら、改善されたインスリン産生細胞移植、例えば、改善されたクオリティーオブライフを有する膵島移植、を達成するための改善された治療に対する要求が今なお存在する。

今回、膵島移植片レシピエントに対する、ＡＬＨ剤と異なるメカニズムを介して作用する１またはそれ以上の免疫抑制剤との、促進型リンパ球ホーミング(ＡＬＨ)剤の共投与は、膵島細胞移植拒絶の有効な処置または予防を提供し、そして特に、Ｉ型糖尿病移植患者の延長されたインスリン非依存性の達成を可能にすることが見出された。

特定の実施態様において、本発明は、インスリン産生細胞移植片レシピエントにおけるインスリン産生細胞移植片拒絶の処置または予防方法を含んでなり、該方法は、該レシピエントに、有効量の促進型リンパ球ホーミング(ＡＬＨ)剤ならびにＩＬ−２に対する抗体、免疫抑制大環状ラクトン、および可溶性ヒト補体インヒビターからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物を共投与することを含んでなる。好ましくは、本発明の共投与治療は、グルココルチコイドを使用しない。

好ましくは、本発明は、ＡＬＨ剤、ＩＬ−２レセプターに対する抗体および免疫抑制大環状ラクトンの組合せ投与を含んでなる。所望により、このような処置は、追加的に、可溶性ヒト補体インヒビターの投与を含んでもよい。

本発明の併用療法は、移植、持続されたインスリン非依存性、およびインスリン産生細胞同種または異種移植片の長期生存を促進する。本発明の療法の特定の利点は、患者において機能的インスリン産生細胞塊を提供することが必要な移植細胞の数を効果的に減少させることにより、単一ドナー移植(これは、複数のドナー移植片ほど臨床的に困難ではない。)を促進することである。例えば、本発明の療法は、膵島当量(ＩＥＱ)の必要な数を、レシピエントあたり５,０００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下に減少させることができる。

「インスリン非依存性」なる用語は、対象が通常のグルコース耐性を有することを条件として、静脈内グルコース耐性試験後に測定された内因性インスリン産生を意味する。

「インスリン産生細胞」なる用語は、(同種または異種由来の)ランゲルハンス島および適当なインスリン分泌細胞または細胞株、例えば幹細胞由来またはクローン化インスリン分泌細胞のような他の細胞を意味する。

上記の代わりに、本発明は、また、下記のものを提供する：
１．インスリン産生細胞移植片拒絶を処置または予防するための、
ＩＬ−２レセプターに対する抗体、免疫抑制大環状ラクトン、および可溶性ヒト補体インヒビターからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物と組み合せた、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、ＡＬＨ剤の使用。

２．(a)遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態のＡＬＨ剤、ならびに(b)ＩＬ−２レセプターに対する抗体、免疫抑制大環状ラクトン、および可溶性ヒト補体インヒビターからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物、を含んでなる組合せ医薬。

本明細書において使用される「組合せ医薬」なる用語は、好ましくは、固定されていない組合せ剤を含み、例えば、活性構成成分は、患者に、特に制限なく同時的(simultaneously)、同時(concurrently)または連続的に個別の物質として投与され、このような投与は、患者の体内において治療上有効レベルの構成成分を提供する。個々の活性構成成分は、医薬組成物の形態で投与され得、例えば、活性構成成分は、１またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合せられる。

３．上で開示されたような方法における、上記の組合せ医薬の使用。

４．インスリン産生細胞移植片レシピエントにおいてインスリン産生細胞移植片拒絶の処置または予防において使用するための医薬の製造における、ＩＬ−２レセプターに対する抗体、免疫抑制大環状ラクトン、および可溶性ヒト補体インヒビターからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物と組み合せた、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、ＡＬＨ剤の使用。

好ましくは、ＡＬＨ剤は、免疫抑制大環状ラクトンと組み合せて、所望により可溶性ヒト補体インヒビターとともに、投与される；代わって、ＡＬＨ剤は、免疫抑制大環状ラクトンおよびＩＬ−２レセプターに対する抗体と組み合せて、所望により可溶性ヒト補体インヒビターとともに投与されてもよい。

本発明のＡＬＨ剤は、スフィンゴシンキナーゼによりリン酸化され得る化合物であり、そしてＳ１Ｐレセプターにて、リン酸化された形態で、強力なアゴニストであり、その結果、リンパ球の移動(trafficking)を調節し、これは、例えば、ミリオシンまたはＩＳＰ−１の合成アナログ、ascomycete Isaria sinclairiiの天然代謝産物である。ＡＬＨ剤の例としては、例えば、２−アミノプロパン−１,３−ジオール化合物、例えば、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、式(Ｉ)

[式中、
Ｒ_１は、所望により置換されていてもよいフェニレンで所望により中断されていてもよい１２〜２２個の炭素原子を有する、所望により置換されていてもよい直鎖−または分枝鎖の炭素鎖であり、
Ｒ_２は、Ｈまたは式

〔式中、Ｒ_６はＨ、または所望により１、２もしくは３個のハロゲン原子により置換されていてもよいＣ_１〜４アルキルであり、そしてＲ_７はＨ、または所望によりハロゲンにより置換されていてもよいＣ_１〜４アルキルである。〕
の基であり、
Ｒ_３は、ＨまたはＣ_１〜４アルキルであり、そして
Ｒ_４およびＲ_５は、それぞれ独立して、Ｈ；所望によりハロゲンにより置換されていてもよいＣ_１〜４アルキル；またはアシルである。]
で示される化合物が挙げられる。

Ｒ_１の炭素鎖が置換されている場合、それは、好ましくは、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシにより置換されている。炭素鎖が所望により置換されていてもよいフェニレンにより中断されている場合、炭素鎖は、好ましくは、非置換である。フェニレン部分が置換されている場合、それは、好ましくは、ハロゲン、ニトロ、アミノ、メトキシ、ヒドロキシまたはカルボキシにより置換されている。アシルは、ＲがＣ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、フェニルまたはフェニル−Ｃ_１〜４アルキルである、Ｒ−ＣＯ−であり得る。

好適な式(Ｉ)で示される化合物は、Ｒ_１が、所望によりニトロ、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシにより置換されていてもよい、１３〜２０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、好ましくは直鎖である化合物、ならびにさらに好ましくは、Ｒ_１が、所望によりハロゲンにより置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ_６〜１４アルキル鎖により置換されたフェニルアルキルであり、そしてそのアルキル部分が、所望によりヒドロキシにより置換されていてもよいＣ_１〜６アルキルである、化合物である。さらに好ましくは、Ｒ_１は、フェニルが直鎖または分枝鎖、好ましくは直鎖のＣ_６〜１４アルキル鎖により置換されたフェニル−Ｃ_１〜６アルキルである。該Ｃ_６〜１４アルキル鎖は、オルト位、メタ位またはパラ位、好ましくはパラ位であり得る。

好ましくは、Ｒ_２〜Ｒ_５は、それぞれ、Ｈである。

式(Ｉ)で示される化合物が、分子中に１またはそれ以上の不斉中心を有する場合、本発明は、さまざまな光学異性体を包含すると理解されるべきであり、ならびにラセミ体、ジアステレオ異性体およびこれらの混合物が包含される。

式(Ｉ)で示される化合物の薬学的に許容される塩の例としては、無機酸との塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩および硫酸塩、有機酸との塩、例えば酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩およびベンゼンスルホン酸塩、または、適当な場合には、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびアルミニウムのような金属との塩、アミン、例えばトリエチルアミンとの塩、および二塩基性アミノ酸、例えばリジンとの塩が挙げられる。本発明の方法の化合物および塩は、水和物および溶媒和物の形態を包含する。

式(Ｉ)で示される好適な化合物は、２−アミノ−２−テトラデシル−１,３−プロパンジオールである。本発明において使用するための、特に好適なＡＬＨ化合物は、ＦＴＹ７２０、すなわち、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、２−アミノ−２−[２−(４−オクチルフェニル)エチル]プロパン−１,３−ジオール、例えば、

〔式中、Ｒ_２はＨである。〕
で示される塩酸塩またはその対応するリン酸化合物〔式中、Ｒ_２は、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、

である。〕である。

化合物、置換基および変形物の開示は、本発明のＡＬＨ−化合物を含み、該化合物の製造方法は、米国特許番号第５,６０４２２９号および第６,００４,５６５号において、ＥＰ−Ａ−１,００２,７９２において、およびＷＯ０２／１８３９５Ａにおいて見出すことができ、それらの全体を、参照により本明細書の一部とする。

免疫免疫調節剤である、ＦＴＹ７２０は、ホーミングケモカインに対するリンパ球の応答性を増加させる。ナイーブ細胞を取っておき；血液からＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞およびＢ細胞を刺激してリンパ節(ＬＮ)およびパイエル板(ＰＰ)に移動させ、移植された器官への細胞の湿潤を阻害する。しかしながら、ＦＴＹ７２０は、リンパ系内でのリンパ球の活性化、増殖および記憶を害することなく、したがって、全身性感染に対する免疫を抑制しない。

本発明の抗−ＩＬ−２レセプター抗体は、好ましくは、ＩＬ−２への親和性が高いレセプターに対する抗体、すなわちＣＤ２５である。適当な抗体は、天然または組換え抗体を含んでなり、そして組換えキメラ型またはヒト化抗体、ならびに天然抗体結合(すなわち、Ｆｖ)ドメインからなる組換え一本鎖ポリペプチド、例えばバシリキシマブ(Ｓｉｍｕｌｅｃｔ(商標)、これはネズミモノクローナル抗体ＣＨＩ−６２１の可変領域およびヒトＩｇＧ１領域を含んでなるキメラ抗体である(ＥＰ４４９,７６９参照。参照により本明細書の一部とする。)またはダシリズマブ(Ｚｅｎａｐａｘ(登録商標)、ＷＯ９０／０７,８６１参照。参照により本明細書の一部とする。)を含む。特に好適な抗体は、バシリキシマブである。

「免疫抑制大環状ラクトン」なる語は、ラパマイシン、すなわちシロリムスおよびそれらの免疫抑制誘導体を意味する。特に興味深いものは、４０位(または、使用された命名法に依存して４２位もしくは４３位)が置換されたラパマイシン誘導体、例えば米国特許第５,２５８,３８９号およびＷＯ９４／０９０１０に記載された４０−Ｏ−置換ラパマイシン誘導体、とりわけ４０−Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体(例えば、４０−Ｏ−置換基がヒドロキシアルキル化されている。)、例えば４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシン、すなわちエベロリムス、または分子の４０位および／または他の位置、例えば２８位および／または１６位が置換された誘導体、およびそれらのエピマー、および所望によりさらに水素化されたもの、例えばＷＯ９５／１４０２３および９９／１５５３０において記載されたもの、例えばＡＢＴ５７８、またはＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７において記載されたもの、ＡＰ２３５７３である。４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)ラパマイシンが特に好適である。

適当な可溶性補体インヒビターとしては、例えばＣ３／Ｃ５インヒビター、例えば、Ｉ型可溶性補体レセプター(ＣＲ１)、ＴＰ−１０が挙げられ、これは、補体系の強力な全身性インヒビターである組換えタンパク質である。その理由は、それは、３つすべての活性化経路(古典的経路、第二経路およびレクチン経路)によるＣ３およびＣ５の両方の活性をブロックするからである；Ｃ３活性化の後に、補体依存性エフェクターメカニズムの大部分が補充される。特に、ＴＰ−１０は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合し、補体系のフラグメントが活性化され、補体カスケードにおける他のタンパク質との相互作用がブロックされ、その後、補体の生物学的に活性なタンパク質フラグメントを産生する多分子酵素複合体が形成される。ＴＰ−１０は、また、それらの不活性形態に対するＣ３ｂおよびＣ４ｂの酵素的分解におけるコファクターとしても作用する。

ＴＰ−１０は、例えば、ＷＯ８９／０９２２０(参照により本明細書の一部とする。)において開示されたような、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く修飾ＣＲ１分子である。ＴＰ−１０は、無血清培地におけるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により発現され、そして抗−ＣＲ１アフィニティーカラムで、およびＨＰＬＣにより精製される。膵島移植レシピエントへのＴＰ１０の投与は、Bennett, et al., Diabetes 2000により報告された。

本発明における使用に適した可溶性補体レセプターインヒビターの他の実施態様は、ＴＰ−２０、すなわち、単一分子中で、ｓＣＲ１(可溶性補体レセプター１)をｓＬｅｘ(シアリルルイスｘ)炭水化物と統合した、組み合せられた補体およびセレクチンインヒビター；およびＴＰ−１８、すなわち、セレクチン−(レセプター)−ブロッキング炭水化物へと挿入されたｓＣＲ１誘導体を含んでなる。

本発明の方法の実施において必要とされる治療剤の１日投与量は、例えば、使用されるＡＬＨ剤、宿主、投与様式、処置されるべき病状の重症度、および組合せ投与において使用されるさらに選択された治療剤に依存して変動する。

本明細書において使用される「共投与」または「組合せ投与」などの用語は、単一の移植レシピエントへの、選択された治療剤の投与を包含することを意味し、そして、該剤が、必ずしも、同一の投与経路または同一の時間に投与されるわけではない処置レジメンを含むことを意図する。

好ましくは、ＡＬＨ剤、例えばＦＴＹ７２０の投与は、手術前に開始される。一般に、化合物は、移植手術が行われた日(すなわち、「第０日目(Day 0)」)の直前から、例えば「第−１日目(Day -1)」に投与を開始され、そしてその後、無期限に継続する。化合物は、例えば経口的に、または注射により投与され得る。

ＡＬＨ剤、例えば式(Ｉ)で示される化合物(例えば、ＦＴＹ７２０)の好適な１日投与量の範囲は、単回投与または分割投与として、おおよそ、１日あたり０．０３〜２．５ｍｇ／ｋｇ、特に１日あたり０．１〜２．５ｍｇ／ｋｇ、例えば１日あたり０．５〜２．５ｍｇ／ｋｇである。患者に適した１日投与量は、経口投与で、例えば０．２５〜１００ｍｇのオーダーである。式(Ｉ)で示される化合物の経口投与に適した単位投与形態は、１またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤または担体とともに、約０．１２５〜１０ｍｇを含んでなる。代わって、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の式(Ｉ)で示される化合物は、また、例えば上に示した投与量で、週に２または３回投与され得る。ＡＬＨ剤、例えば式(Ｉ)で示される化合物は、任意の慣用的経路、特に経腸的、例えば経口、例えば内用液、錠剤またはカプセル剤の形態で、あるいは非経腸的、例えば注射可能な溶液または懸濁液の形態で、投与され得る。式(Ｉ)で示される化合物を含んでなる医薬組成物は、慣用的方法、例えば米国特許第５,６０４,２２９号において記載されたように、製造され得る。

抗ＩＬ−２レセプター抗体、例えば、バシリキシマブは、好ましくは、１回目の投与が「第０日目」(すなわち、移植の日)および２回目の投与がだいたい「第４日目」に投与される、２回投与レジメン(two-dose regimen)で投与される。さらに、所望により、「第４日目」の後に、例えば、２〜４週間にわたって、週に１回投与されてもよい。ヒトを含む霊長類に関して、それぞれの投与量は、一般に、約１〜５０ｍｇ、および好ましくは約５〜２０ｍｇである。

免疫抑制大環状ラクトン、例えば、４０−Ｏ−２−(ヒドロキシエチル)−ラパマイシンは、好ましくは、移植の日またはその直前(例えば「第−１日目」)に開始して、そして移植後無期限に継続して、基本的に毎日投与される。ヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類に関して、適当な投与量は、０．２５〜７ｍｇ／日、およびさらに好ましくは０．５〜５ｍｇ／日の範囲である。該化合物は経口的に、または代わりに皮下注射により、投与され得る。

可溶性補体レセプター、例えばＴＰ−１０は、約３０分にわたる静脈内点滴として、約５〜１５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇの単回投与量で投与され得る。

最も好ましくは、本発明は、インスリン産生細胞移植、例えば膵島細胞移植に関連して使用するための、グルココルチコイドを使わない併用療法を目的とし、該療法は、バシリキシマブ、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよび可溶性組換えヒト補体インヒビター、ｓＣＲ１(「ＴＰ１０」)の１またはそれ以上と組み合せた、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、ＡＬＨ剤、たとえば特に式(Ｉ)で示される化合物、例えば２−アミノ−２−[２−(４−オクチルフェニル)エチル]プロパン−１,３−ジオール、好ましくはその塩酸塩の共投与を含んでなる。

本発明の治療方法は、所望により、さらに他の免疫調節薬または抗炎症剤の共投与を含んでもよく、これらの例には、カルシニューリンインヒビター、例えばシクロスポリン類またはアスコマイシン類、およびそれらの免疫抑制アナログ、例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６；シクロホスファミド；アザチオプレン(azathioprene)；メソトレキサート；ブレキナール；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルガリンまたはアナログ；免疫抑制モノクローナル抗体、例えば白血球レセプターに対する、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、またはＣＤ５８に対する、またはそれらのリガンドに対する、モノクローナル抗体；あるいは他の免疫調節化合物、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはそのホモログもしくは変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ、またはＬＦＡ−１インヒビターを含み得る。

本発明の方法は、インスリン産生細胞同種または異種移植片拒絶の予防または処置として使用され得る。

実施例：
ＦＴＹ７２０、エベロリムス、バシリキシマブおよびＴＰ１０で抑制されたカニクイザルへの同種移植片膵島の移植
治療剤：
ＦＹＴ７２０：
該化合物は、６０ｍＬの透明ガラス乳鉢に、カプセル内容物(１ｍｇ／カプセル)を移すことにより、投与のために調製される。３０ｍＬの滅菌水を加え、そして、粉末が均一な懸濁液になるまで、カプセル内容物と混合する。ＦＴＹ７２０は、シリンジおよび鼻腔胃管を用いて、経口的に投与される。

バシリキシマブ：
該物質は、バイアル中に２０ｍｇの粉末を含有し、そして第２のバイアルに５ｍＬの希釈剤を含有する、パッケージとして、得られる。それぞれのバイアルは、製造者の指示にしたがって製剤化され、そして静脈内にしかるべく投与される。

エベロリムス：
該化合物は、密封されたアンプル中に２０ｍｇ／ｍｌの濃縮物として得られる。１ｍｌの濃縮物を、８．５ｍｌのビヒクル(５０％のクレモフォーおよび５０％のエタノール)と混合すると、２．１ｍｇ／ｍｌ(ｐＨ６．０)の最終濃度を得、そして該混合物を２時間以内に使用する。

ＴＰ１０：
該物質は、５０ｍｇ複数回投与バイアルとして得られる(さらなる製剤化は必要とされない)。

(a)ドナー動物の膵切除
ドナー動物は、雄性または雌性の、４ｋｇ以上の成体カニクイザルである。膵切除の前に、空腹時血清グルコース分析およびアルギニン刺激を、通常の内分泌膵機能を確かめるために行う。アルギニン刺激に関して、０．０７ｍｇ／ｋｇアルギニンを静脈注射し、そしてアルギニン注射後の−５、−１、２、３、４、および５分に血液を回収する。血漿を回収し、そして−８０℃で冷凍保存する。血漿インスリンおよびＣ−ペプチドレベルが、通常の範囲内であることを確認する。

０．５〜２％イソフルランでの全身麻酔下で、膵切除を行い、そして膵臓を回収する。リンパ節および脾臓も、また、ドナーリンパ球単離および凍結保存のために回収する。器官および組織回収後、ドナーを、１５０ｍｇ／Ｋｇのペントバルビタールナトリウムの静脈注射で安楽死させ、そして目視検査により心停止を確認する。

(b)膵島単離
膵島単離を、Ricordi et al., Diabetes, 38, (Suppl. 1): 140-142, 1989; Kenyon et al., Diabetes, 48, pp. 8132-8237, 1999; および、Ranuncoli et al., Cell Transplantation 2000.に記載されたように、ヒト膵島単離のための自動化された方法の改良法を用いて、行われる。

膵島の収量、純度および生存度の測定を含む、膵島の品質評価を、国際的基準{Ricordi, Gray, et al. 1990 13/id}にしたがって行う。得られた膵島の数は、膵島当量(ＩＥＱ)として報告され、これは、粒子がすべて１５０μｍの直径であると仮定した場合に存在するであろう膵島の数である。この目的のために、異なるサイズカテゴリー(５０〜１００μｍ、１００〜１５０μｍ、１５０〜２００μｍなど)のジチゾン(ＤＴＺ)陽性膵島の数を計測し、そして、そのデータをコンピュータープログラムに入力して、該情報をＩＥＱに翻訳する。純度は、調製物中に存在するＤＴＺ陽性粒子の百分率に基づいて推測され、そして生存度は、ＦＤＡ／ＰＩ染色に基づいて推測される。インビトロ機能的能力を、静置培養におけるグルコース刺激インスリン遊離の評価を介して測定する(Ranuncoli et al., Cell Transplantation, 2000)。

(b)レシピエント動物への膵島同種移植片の移植
レシピエント動物は、雄性または雌性の、＞１．５ｋｇの若年性カニクイザルである。レシピエント動物は、Theriault Thistlethwaite et al., 1999, 16/idに記載されたように、１５０ｍｇ／ｋｇで静脈へのストレプトゾトシン(ＳＴＺ)の点滴により糖尿病にされ、続いて腎毒性の副作用を予防するために静脈内水分補給(３０分かけて２０ｍｌ／ｋｇの０．９％ＮａＣｌ)する。結果として生ずるケトアシドーシスを伴う重傷の低血糖または高血糖を避けるために、ストレプトゾトシンの投与後最初の４８時間、頻繁に血中グルコースレベルをモニターする。その後、血糖レベルを１日に２〜３回モニターし、そして皮下注射または必要なら静脈内インスリンドリップ(insulin-drip)を介して、Regular, NPH, Lente, Ultralente、またはHumalogインスリンで補正する。糖尿病の誘発を、毎日の血中グルコースの測定、インスリン要求の評価、およびアルギニン刺激後のネガティブＣ−ペプチド値により、確認する。糖尿病が誘発されたことを確認するために、アルギニン刺激試験を、免疫抑制の開始前に行う。

アルギニン刺激に関して、０．０７ｍｇ／ｋｇのアルギニンを静脈注射し、そしてアルギニン注射後の−５、−１、２、３、４、および５分に血液を回収する。血漿を回収し、そして−８０℃で冷凍保存する。血漿グルコースを、ＣｏｂａｓＭｉｒａグルコースアナライザー(Roche Diagnostic Systems, Montclair, NJ)を用いて測定する。二重抗体法(Diagnostic Products, Corp., Los Angels, CA)を利用して、血漿インスリンおよびＣ−ペプチドレベルを評価する。Ｃ−ペプチドの検出の下限は、０．２０ｎｇ／ｍｌであり、インスリンのそれは、５μＵ／ｍｌである。標準曲線、ならびに陽性および陰性対照のサンプルを、評価に組み込む。

平静かつ麻酔されたレシピエント動物を手術台にあおむけに配置し、そして腹部を用意しそして無菌布で覆う。低体温症を避けるために特別の注意を払い、そしてヒートランプおよび電気座布団を使用する。小さく中心正中切開(central midline incision)し、そして、新たに単離した最低１０,０００膵島当量／ｋｇ(体重)を、２０ｍｌの移植培地中に再懸濁し、そして２４−ゲージの静脈内カテーテルを経由して、門脈の腸間膜に注ぐ。止血するために、血管を結紮するか、または指で圧力を加える。腹壁を、通常の方法で縫合する。血中グルコースを１日２回モニターし、そして、アルギニン刺激試験を、糖尿病の状態の反転を証明するために行う。

４レシピエントの３つの群に、それぞれ、異なる免疫抑制レジメンおよび膵島投与量で、次のように投与する：
グループ１：ＦＴＹ７２０＋エベロリムス＋バシリキシマブ、１０,０００ＩＥＱ／ｋｇ(体重)。
グループ２：ＦＴＹ７２０＋エベロリムス＋バシリキシマブ、５,０００ＩＥＱ／ｋｇ(体重)。
グループ３：ＦＴＹ７２０＋エベロリムス＋バシリキシマブ＋ＴＰ１０、５,０００ＩＥＱ／ｋｇ(体重)。

示された群におけるレシピエント動物に、以下に詳述されるように、移植の日(「第０日目」)の前および後に、次の処置を行う：
ＦＴＹ７２０を「第−１日目」〜「第＋３０日目」に、０．３ｍｇ／ｋｇにて経口投与する。
バシリキシマブを、「第０日目」および「第４日目」に、１０ｍｇにて静脈内注射により投与する。
１５〜３０ｎｇ／ｍｌのトラフレベルを標的として、エベロリムスを、「第−１日目」〜「第＋３０日目」にわたって１日１回皮下注射により投与する。推奨される投与量は、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
ＴＰ１０は、「第−１日目」に４０ｍｇ／ｋｇ、「第０および１日目」に２０ｍｇ／ｋｇ、および「第２〜７日目」に１７ｍｇ／ｋｇの投与レベルにて静脈内注射により投与される。

薬物モニタリングは以下の通りである：
ＦＴＹ７２０ − 週に１回。エベロリムス − 週に２回。ＳＣ５ｂ−９は、ＴＰ１０の効力の証明のためにモニターされる。

レシピエント動物は、投与される場合には、それぞれの朝および午後のほぼ同じ時間に投与される。血液グルコースレベルは、低血糖の症状の発現を予防するために、移植後の最初の４〜５時間にわたって頻繁に測定される。このような症状の発現は、必要ならば、経静脈的に５〜１０％のデキストロースで処置される。３つ連続して空腹時血液グルコースレベルが１５０ｍｇ／ｄｌ以上に上昇するか、または２００ｍｇ／ｄｌ以上の３つの夕食後血液グルコースレベルが記録される場合には、拒絶の存在が疑われる。これらのレベルが３日続けて存在する場合には、拒絶が推定される。その後、空腹時および夕食後血液グルコース(空腹時血液グルコース、夕食後グルコース)レベルは、ヒールスティック(heel stick)を介して１日２〜３回モニターされる。

毎日の血液グルコース測定ならびに移植後「第１４および３０日目」の断続的なアルギニン刺激試験(ヒトインスリンおよびＣ−ペプチド)を、グルコース制御を証明するために使用する。移植後の外因性インスリン要求もモニターされる。移植後の最初の１４日間、血液グルコースレベルは、個別化されたスライディングスキーム(sliding scheme)にしたがって、皮下注射でのRegular, NPH, Lente, またはUltralente Humalogインスリンで補正される。アルギニン刺激試験は、移植後の１４日目および１ヵ月目に、およびその後のさらなる時点で行われる。

(c)死亡前の血液および組織のサンプリング
移植レシピエントを、ケタミン(５〜１０ｍｇ／ｋｇ)により鎮静させ、挿管し、そして死亡前の血液サンプリングを、０．５〜２％イソフルランでの全身麻酔下で行う。サルをあおむけにし、そして脚の付け根および腹部を用意し、そして滅菌的に布で覆う。大腿部静脈、上大静脈、または大動脈を単離し、カテーテルを配置し、そして８０〜１６０ｍｌの血液を採取する。肝臓および脾臓のサンプルを回収し、ＲＮＡ分析のために液体窒素中で冷凍する。滅菌的なサンプリングの終了後、該動物を１５０ｍｇ／Ｋｇの投与量でのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により安楽死させる。死体解剖サンプルを、既知の手順にしたがって採取および固定する。移植片および器官サンプル以外に、膵臓のサンプルを、インスリン抽出のために瞬間冷凍する。

器官移植片の病状を評価する。通常のＨ＆Ｅ染色切片を組織学的に評価する。このモデルにおいて、ＦＴＹ７２０、エベロリムスおよびバシリキシマブでの組合せ処置は、膵島同種移植片拒絶を予防する。

Claims

インスリン産生細胞移植片拒絶の処置または予防において使用するための、（ａ）遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１,３−ジオール、（ｂ）バシリキシマブおよび（ｃ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含む、組合せ医薬。
レシピエント体重のｋｇあたり５０００ＩＥＱまたはそれ以下で移植されたレシピエントにおいて機能的インスリン産生細胞塊を提供する薬剤の製造のための、請求項１に記載の組合せ医薬。
さらに可溶性ヒト補体インヒビターを含む、請求項１に記載の組合せ医薬。
２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１,３−ジオールが、遊離の形態または塩酸塩の形態である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組合せ医薬。
インスリン産生細胞移植片拒絶の処置または予防用薬剤の製造のための、（ａ）遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態の、２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１,３−ジオール、（ｂ）バシリキシマブおよび（ｃ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含む組合せ医薬の使用。
該組合せ医薬がさらに可溶性ヒト補体インヒビターを含む、請求項５に記載の組合せ医薬の使用。
２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１,３−ジオールが、遊離の形態または塩酸塩の形態である、請求項５または６に記載の使用。