CN114306643A

CN114306643A - 一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在car-t细胞植活上的应用

Info

Publication number: CN114306643A
Application number: CN202111441283.XA
Authority: CN
Inventors: 李冰; 赵献军
Original assignee: Baioupai Tianjin Biotechnology Co ltd; Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Baioupai Tianjin Biotechnology Co ltd; Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR‑T细胞植活上的应用。利用25mg/(kg/d)环磷酰胺联合2.5mg/(kg/d)氟达拉滨对恒河猴进行预处理，建立与人类免疫抑制状况下的各项免疫指标变化趋势一致的疾病模型，血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)下降幅度都超过50％；流式细胞检测结果CD3下降了40％以上，免疫抑制动物模型造模成功；利用该模型进行CAR‑T细胞的植入用于研究CAR‑T免疫疗法。本发明可以快速准确建立恒河猴免疫抑制动物模型，动物在CAR‑T细胞植入中能够保证足够的免疫抑制，使CAR‑T细胞在恒河猴体内植活，为CAR‑T免疫疗法临床前研究提供了更为理想、可靠的非人灵长类实验动物模型及完善的评价体系。

Description

一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR-T细胞植活上的应用

技术领域

本发明属于构建动物模型领域，具体的涉及一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR-T细胞植活上的应用。

背景技术

当今肿瘤治疗手段与日俱增，除常规手术、放疗和化疗之外，肿瘤免疫疗法作为癌症治疗的“第四支柱”引起广泛关注，它将过去重复的症状控制转为一次性的治疗甚至治愈，给生物医学带来新的希望。其中，嵌合体抗原受体工程T(CAR-T)细胞治疗是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗手段，即通过体外对T细胞修饰使其能靶向肿瘤抗原并产生相应免疫反应，在多项临床研究中取得了巨大的成功。嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)指将T淋巴细胞从病人体内分离出来，在体外培养、改造并扩增后，把体外改造、扩增的T淋巴细胞回输到病人体内以治疗肿瘤。这里的CAR指的就是嵌合抗原受体，由胞外抗原结合域scFV、跨膜结构域和胞内信号转导结构域组成。其通过基因编辑技术，将能识别肿瘤相关抗原的抗体融合表达于自体T细胞的表面，被修改的T细胞因此具有对肿瘤细胞的靶向杀伤力。目前全球已有CAR-T药物相继获得批准上市，极大地促进了CAR-T产品的研发和应用热潮。

从细胞移植研究的结果来看，免疫排斥依然是影响移植物存活的重要因素。CAR-T细胞给予免疫功能正常的动物时会发生免疫应答，导致细胞被清除或者出现免疫排斥反应，从而无法获得对临床有充分预测意义的有效性和安全性信息。我们前期的实验证实，同种异体CAR-T细胞在没有进行免疫抑制剂处理的恒河猴体内难以成功植活。

在已有的模式动物中，非人灵长类与人类的亲缘性最高，而且其免疫系统与人的最为相似。因此，临床前研究用非人灵长类所得出的实验结果具有较高的可靠性。对于天然免疫系统，非人灵长类与人十分相似，而与啮齿类有很大不同。Ketloy等发现猕猴的血液树突状细胞(Dendritic cell，DC)以及单核细胞来源的DC(monocyte-derived dendriticcell，MDDC)表达与人类相同的TLR(参与非特异性免疫)，但与小鼠DC亚群基本不同，并且通过上调CD40和CD86的表面表达来响应4种TLR对应的激动剂。非人灵长类动物的免疫系统，理论上可交叉识别人和猴特异性抗原的CAR-T细胞，可以模拟CRS和神经毒性等临床上发现的毒性反应。同种异体CAR-T细胞体内存活周期较短，经过长期研究已经确定淋巴消耗性化疗是有效的T细胞体内扩增所必需的。T细胞在转移到淋巴细胞减少的宿主后，会经历一个称为稳态膨胀的过程。

从临床试验反馈得到的诸如疗效、安全性的问题，需要通过临床前的基础研究以及动物试验等进行改进和优化，再反馈回临床以制定优化的治疗方案。而在CAR-T产品的临床前研究中，免疫抑制动物模型是不可或缺的关键性工具。如何成功构建契合各种研究需求的免疫抑制动物模型已经成为亟待解决的课题。去除胸腺、辐射损伤、基因敲除和免疫抑制剂应用等各种实验动物免疫抑制模型构建方式中，免疫抑制剂模型因其成本较低、操作简单而在目前的免疫学研究中应用广泛。

免疫抑制剂是一类可抑制或降低机体免疫系统强度的药物。目前常用的免疫抑制剂药物主要有环孢菌素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(FK506)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和环磷酰胺(Cy，CTX)等。在相关文献中，单独使用环磷酰胺构建灵长类动物、啮齿类动物等不同物种免疫抑制模型的剂量一般是15-100mg/kg；单独使用氟达拉滨构建啮齿类动物等不同物种免疫抑制模型的文献比较少，剂量使用范围在1-100mg/kg之间。理想的免疫抑制剂应该是靶向性强、作用快速、效果显著、副作用小、停药后机体免疫系统功能可逆及不损伤机体正常免疫功能的药物。

发明内容

我们要建立一种恒河猴免疫抑制模型，可以保证CAR-T细胞在体内存活，为进一步研究CAR-T细胞在体内的分布、靶点器官，及其对靶器官的作用等打基础。本发明就是通过恒河猴免疫抑制模型的建立，解决回输的CAR-T细胞可以在恒河猴体内存活的问题。

本发明通过对相关免疫指标的检测，评价该免疫抑制剂对恒河猴免疫抑制作用的有效性，从而判断抑制剂对恒河猴的抑制效果和确定相应剂量的免疫抑制剂对恒河猴免疫系统的抑制作用程度，最终筛选出这几种免疫抑制剂的有效给药剂量和给药时间。构建联合用药免疫抑制模型，通过对恒河猴猴免疫指标、血液学指标、血液生化指标等检测评估联合用药方案的有效性。

为解决上述技术问题，本发明专利所采用的技术方案为：

一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法，包括利用20-30mg/(kg/d)环磷酰胺联合2.0-3.0mg/(kg/d)氟达拉滨对恒河猴进行预处理,造成恒河猴免疫抑制的典型免疫指标明确大幅下降，血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)下降幅度都超过50％；流式细胞检测结果CD3下降了40％以上,说明运用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理，达到了清除恒河猴淋巴细胞的实验目的，由此达到本发明快速准确高效建立恒河猴免疫抑制模型的目的，免疫抑制动物模型造模成功。

进一步的，环磷酰胺的给药剂量为25mg/(kg/d),氟达拉滨的给药剂量为2.5mg/(kg/d)。

进一步的，恒河猴给药周期和频率为七天一个周期，每天1次，连续给药三天后停药观察。

进一步的，预处理给药方式为静脉连续快速注射。

一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及该方法在CAR-T细胞植活上的应用：

1)具体包括将环磷酰胺与氟达拉滨联合静脉注射于恒河猴进行预处理，构建恒河猴免疫抑制模型，注射剂量为：环磷酰胺25mg/(kg/d)、氟达拉滨2.5mg/(kg/d)，连续注射三天后停药观察四天。

2)Day 8静脉移植特定剂量的CAR-T细胞。

3)用恒河猴免疫抑制模型评价CAR-T细胞植活。

其中，步骤3)用于评价造模是否成功及CAR-T细胞是否植活的指标主要是通过血液生化、血常规、流式细胞术得到的相关指标。

本发明的工作原理介绍：

连续给予恒河猴氟达拉滨(2.5mg/kg/d)联合环磷酰胺(25mg/kg/d)3天，停药4天后，也就是在给药后的D8天，造成恒河猴免疫抑制的典型免疫指标明确大幅下降，血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)下降幅度都超过50％；流式细胞检测结果CD3下降了40％以上。说明运用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理，达到了清除恒河猴淋巴细胞的实验目的，由此达到本发明快速准确高效建立恒河猴免疫抑制模型的目的，免疫抑制动物模型造模成功。给与恒河猴CAR-T细胞产品，开展CAR-T细胞产品临床前研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)该联合免疫抑制剂首次运用于恒河猴，弥补了动物模型的空白；

(2)氟达拉滨联合环磷酰胺作为免疫抑制剂靶向性强、作用快速、效果显著、副作用小、停药后机体免疫系统功能可逆及不损伤机体正常免疫功能；

(3)氟达拉滨联合环磷酰胺作为同种异体CAR-T细胞的预处理方案可以保证CAR-T细胞的植活，而且没有发生急性GVHD反应，建立了一种适用于CAR-T细胞产品临床前研究的高效精准恒河猴免疫抑制模型，降低CAR-T细胞进入临床研究中的风险。

附图说明

图1为实验一血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)平均值折线图；

图2为实验一血液生化检测指标及结果平均值折线图；

图3为实验一流式细胞检测指标及结果平均值折线图；

图4为实验一恒河猴体重变化折线图；

图5为实验一恒河猴体温变化折线图；

图6为实验二血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)平均值折线图；

图7为实验二血液生化检测指标及结果平均值折线图；

图8为实验二流式细胞检测指标及结果平均值折线图；

图9为实验二恒河猴体重变化折线图；

图10为实验二恒河猴体温变化折线图；

图11为实验三血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)平均值折线图；

图12为实验三血液生化检测指标及结果平均值折线图；

图13为实验三恒河猴体重变化折线图；

图14为实验三恒河猴体温变化折线图；

图15为实验四血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)平均值折线图；

图16为实验四血液生化检测指标及结果平均值折线图；

图17为实验四恒河猴体重变化折线图；

图18为实验四恒河猴体温变化折线图；

图19为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)平均值折线图；

图20为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后血液自动分析仪检测恒河猴血液学中的淋巴细胞绝对数(LYM)平均值折线图；

图21为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后血液生化分析仪检测恒河猴血液生化指标中的总胆红素(TBIL)值的平均值折线图；

图22为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后体重变化折线图；

图23为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后温度变化折线图；

图24为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后流式细胞检测CD3值折线图；

图25为实验五给予CAR-T细胞及溶媒前后流式细胞检测CAR-FITC阳性表达率折线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1：构建一种新的恒河猴免疫抑制模型

1、实验动物信息

来源：中国科学院昆明动物研究所灵长类研究中心。

实验动物生产许可证号：SCXK(滇)K2017-0003(发证机构：昆明市科学技术局)。

国家重点保护野生动物驯养繁殖许可证号：滇昆驯繁201602号(发证机构：昆明市林业局)。

实验动物使用许可证：SYXK(滇)K2017-0008；发证单位：昆明市科学技术局。

动物性别、年龄、体重范围信息：

表1动物情况一览表

2、环境条件及饲养管理

1)饲养环境：普通环境(本机构猴普通级动物实验室)。

环境条件指标

温度：16～26℃(日温差≤4℃)；湿度：40％～70％；换气次数：≥8次/h；气流速度：≤0.2m/s；氨浓度：≤14mg/m³；噪音：≤60dB；工作照度：≥200lx；动物照度：100～200lx；照明：12h：12h明暗交替。

2)饲养管理

动物饲养笼具：不锈钢双层猴笼，单笼饲养。笼具大小：80×80×80cm(长×宽×高)。

饲料：饲喂饲料分为两类：①猴生长繁殖饲料(颗粒饲料)；来源：北京科奥协力饲料有限责任公司(饲料生产许可证号：SCXK(京)2017-0010)，饲料由供应商提供相应采购批次的质量检测报告，本中心不再进行检测。②青饲料：市售应季水果或蔬菜，饲喂前使用食品级消毒剂进行清洗消毒。

饮水：动物由饮水器自由饮水，饮用水为本机构水处理净化设备供应的净化自来水。本机构每年送第三方检测机构检验1次，按照《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)检测并获得检测合格报告，检测指标包括自来水浊度、嗅、味、肉眼可见物、pH、余氯(mg/L)、菌落总数(CFU/ml)、总大肠菌群(MPN/100ml)等。

动物饲喂：动物饲喂遵循定时定量、少食多餐原则。饲喂量依据动物体重大小酌情增减，一般情况下猴生长繁殖饲料饲喂量160～240g/日/只，青饲料饲喂量100～120g/日/只；猴生长繁殖饲料每日分2次喂饲：上午(8:00-9:00)和下午(16:00-17:00)各1次；青饲料于中午(13:00-14:00)饲喂。因试验操作、样本采集等情况影响，喂饲时间可适当提前或延后。

清洁消毒：动物试验期间：饲养区域(检疫室或饲育间)、笼具、托盘每日清洁1次，每周至少消毒两次；动物实验室公共区域及功能间每周清洁两次，每周至少消毒两次；消毒剂应交替使用，同一种消毒剂使用时间不可超过2周。

3、主要仪器设备及用途

试验涉及的主要仪器设备及用途参见表2。

表2主要仪器设备及用途

4、实验方法

采用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理。预处理之前(D0)，以及预处理后，通过血常规和FACS检测等指标分析预处理是否成功。给与免疫抑制剂当天，称取需要量的环磷酰胺和磷酸氟达拉滨，在洁净工作台中加入所需量的0.9％氯化钠注射液至所需浓度，涡旋至溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后保存在灭菌容器中。给药途径是静脉快速注射(前后肢静脉)，给药频率和给药期限是Day 1起每天1次，连续3天给药(day1，day2，day3注射一次)。根据动物最近体重调整给药量。每次给药后观察40～60分钟，动物是否出现呕吐或其他异常反应。每天观察并记录恒河猴体重、进食、大小便、行为活动、精神状况等。

(一)实验一

经大量查阅文献，以及前期预实验的积累，确定环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射初步剂量和使用时间、间歇时间。本实验使用了三只恒河猴，采用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理。

1、预处理剂剂量信息如下表

连续给予免疫抑制剂三天，停药四天。在给药前(D0天)，给药后D7天、D8天进行血液学检测、血液生化检测、流式分析，日常监测体温和体重情况。

2、血液学检测指标及结果(如图1)。

利用血液自动分析仪检测血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)等免疫指标。

WBC值，三只恒河猴在给药后D7天平均下降了73.4％，在给药后D8天平均下降了70.6％；

LYM值，三只恒河猴在给药后D7天平均下降了65.4％，在给药后D8天平均下降了69.2％；

RBC(平均下降11.9％)和PLT(平均下降21.1％)也有所下降，但不十分显著。

3、血液生化检测指标及结果(如图2)。

总胆红素(TBIL)平均值没有明显改变。

4、流式细胞检测及结果(如图3)。

CD3值，三只恒河猴在给药后D8天平均下降了49.9％。

5、体重(如图4)

体重在给药后D8天内有下降趋势，但不是很明显。

6、体温(如图5)。

体温在给药后D4-D7天有上升趋势，D8天有所下降。

7、日常观察

在注射免疫抑制剂的几天，动物出现呕吐反应，停药后消失。从给药两周以后，三只动物均出现不同程度脱毛，有的全身脱毛严重。

(二)实验二因实验一动物出现严重脱毛，本实验对环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射剂量进行了调整。本实验使用了三只恒河猴，采用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理。

1、预处理剂剂量信息如下表

2、血液学检测指标及结果(如图6)。

WBC值，三只恒河猴在给药后D7天平均下降了38.3％，在给药后D8天平均下降了56.8％；

LYM值，三只恒河猴在给药后D7天平均下降了57.4％，在给药后D8天平均下降了60.5％；

RBC(平均下降13.6％)和PLT也有所波动，但不显著。

3、血液生化检测指标及结果(如图7)。

总胆红素(TBIL)值没有明显改变。

4、流式细胞检测及结果(如图8)

CD3值，三只恒河猴在给药后D7天平均下降了65.3％，D8天平均下降了94.2％。

5、体重(如图9)。

体重在给药后D8天内波动不是很明显。

6、体温(如图10)。

体温在给药后D6-D7天略有上升。

7、日常观察

在注射免疫抑制剂的几天，动物出现呕吐反应，停药后消失。没有出现动物脱毛的现象。

(三)实验三

为进一步验证实验二的免疫抑制效果，达到快速检测的目的，本实验对前期实验中没有明显改变的检测数据不再进行检测，只选取了几个典型指标进行检测。本实验选取了两只恒河猴，采用与实验二相同剂量环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理。

1、预处理剂剂量信息如下表

连续给予免疫抑制剂三天，停药四天。在给药前(D0天)，给药后D7天、D8天进行血液学检测、血液生化检测，日常监测体温和体重情况。

2、血液学检测指标及结果(如图11)。

利用血液自动分析仪检测血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)等免疫指标。

WBC值，两只恒河猴在给药后D7天平均下降了61.9％，在给药后D8天平均下降了66.9％；

LYM值，两只恒河猴在给药后D7天平均下降了61.9％，在给药后D8天平均下降了76.2％；

3、血液生化检测指标及结果(如图12)。

总胆红素(TBIL)值没有明显改变。

4、体重(如图13)。

体重在给药后8天内有所下降

5、体温(如图14)。

体温在给药后有个别上升情况

7、日常观察

在注射免疫抑制剂的几天，动物出现呕吐反应，停药后消失。

(四)实验四

为进一步验证实验三的快速检测指标的稳定性和重现性，本实验选取了两只恒河猴，采用与实验二及实验三相同剂量环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理。

1、预处理剂剂量信息如下表

2、血液学检测指标及结果(如图15)。

WBC值，两只恒河猴在给药后D7天平均下降了52.4％，在给药后D8天平均下降了55.9％；

LYM值，两只恒河猴在给药后D7天平均下降了73.2％，在给药后D8天平均下降了67.6％；

3、血液生化检测指标及结果(如图16)。

总胆红素(TBIL)值没有明显改变。

5、体重(如图17)。

体重在给药后8天内有所下降。

6、体温(如图18)。

体温在给药后有个别上升情况。

7、日常观察

实验二到实验四，在对恒河猴使用一定剂量和时间免疫抑制剂的实验中，通过对免疫学相关指标的检测，证明使用本发明的实验方法，获得了较好的实验结果，不但达到了恒河猴免疫抑制效果，而且重现性好。经前期实验的重复验证，判断免疫抑制的典型指标为白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)，二者在给与免疫抑制剂后第8天，下降50％以上即为免疫抑制成功。CD3指标波动较大，比免疫抑制前下降40％，即判断免疫抑制成功。其它指标作为参考监测指标，不出现大幅波动，即为没有异常情况。

实施例2：为进一步验证本实验建立的免疫抑制模型是否能够植活CAR-T细胞，本实验选取了三只恒河猴，采用与实验二至实验四相同剂量环磷酰胺和磷酸氟达拉滨注射对猴子进行预处理，D-7天开始给予动物免疫抑制剂，连续给予免疫抑制剂三天，停药四天。

本实验在进行免疫抑制预处理之前，采集猴子外周血20-30ml外周血，分选PBMC，之后制备猴源CAR-T。对猴子按照前述方法进行免疫抑制预处理，采用血液学和FACS检测预处理是否成功。检测指标均符合免疫抑制成功的标准之后，溶媒对照组一只恒河猴，细胞组选取两只恒河猴。溶媒对照组恒河猴静脉注射细胞溶媒，细胞组恒河猴静脉移植特定剂量的CAR-T细胞。

在D1天给与CAR-T细胞。在给免疫抑制剂前的D-7天，给CAR-T细胞当天D1天(给药前)，D2、D4、D8、D15、D22、D29、D36天分别进行血液学检测、血液生化检测、流式分析，日常监测体温和体重情况。

图19～25中，曲线M1代表溶媒对照组指标；曲线M2代表给予CAR-T细胞组两只恒河猴指标的平均值。

实验五

1、预处理剂剂量信息如下表

2、血液学检测指标及结果(如图19、20)。

WBC值，三只恒河猴在给CAR-T细胞当天(D1天)比免疫抑制前(D-7天)平均下降了82.3％；在给予CAR-T细胞及溶媒后逐渐恢复性上升。

LYM值，三只恒河猴在给CAR-T细胞当天(D1天)比免疫抑制前(D-7天)平均下降了80.6％；在给予CAR-T细胞及溶媒后逐渐恢复性上升。

3、血液生化检测指标及结果(如图21)。

总胆红素(TBIL)值在给予免疫抑制剂后上升，在给予CAR-T细胞及溶媒后逐步下降，并接近给予免疫抑制剂之前的水平。

5、体重(如图22)。

体重在给予免疫抑制剂后下降，在给予CAR-T细胞及溶媒后有逐步恢复的趋势。

6、体温(如图23)。

体温在给予免疫抑制剂、给予CAR-T细胞及溶媒后都有所波动，以后逐步恢复正常。

7、流式细胞检测及结果(如图24、25)。

CD3值，三只恒河猴在给CAR-T细胞当天(D1天)比免疫抑制前(D-7天)平均下降了51.8％；在给予CAR-T细胞及溶媒后逐渐恢复性上升。

利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，通过高速分析型流式细胞仪检测CAR阳性表达率。CAR-T细胞组两只恒河猴在D8天CAR-T细胞阳性表达率分别为1.13％，1.596％；D15天分别为3.28％，4.036％。在D15达到峰值，之后的时间点基本检测不到。说明CAR-T细胞在本发明的方法建立的免疫抑制的恒河猴体内能够植活，存活时间大概为2周。

7、日常观察

在注射免疫抑制剂的几天，动物出现呕吐反应，停药后消失。给予CAR-T细胞没有观察到GVHD。

本实验结果中，白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)、CD3等免疫指标在给予CAR-T细胞及溶媒后都出现逐渐恢复性上升，证明了利用环磷酰胺和磷酸氟达拉滨制备的恒河猴免疫抑制模型在停止给予免疫抑制剂后都出现免疫指标好转的可逆性。

对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项。本实验在回输CAR-T细胞后，检测到了CAR-T细胞阳性表达，实验证实了CAR-T细胞在免疫抑制的恒河猴体内植活，存活时间大概2周。

下表3为上述各项实验中血液学指标中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)以及CD3指标在D8天下降的百分比。

	WBC	LYM	CD3
				实验1	70.6	69.2	49.9
实验2	56.8	60.5	94.2
				实验3	66.9	76.2	未测
实验4	55.9	67.6	未测
				实验5	82.3	80.6	51.8

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims

1.一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法，其特征在于，包括利用20-30mg/(kg/d)环磷酰胺联合2.0-3.0mg/(kg/d)氟达拉滨对恒河猴进行预处理,所述预处理造成恒河猴血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)下降幅度都超过50％，并且流式细胞检测结果CD3下降40％以上。

2.根据权利要求1所述的一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法，其特征在于，恒河猴给药七天为一个周期，每天给药1次且连续给药三天后停药观察。

3.根据权利要求1或2所述的一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法，其特征在于，环磷酰胺的给药剂量为25mg/(kg/d),磷酸氟达拉滨的给药剂量为2.5mg/(kg/d)。

4.根据权利要求1或2所述的一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法，其特征在于，预处理给药方式为静脉快速注射。

5.一种根据权利要求1-4任意一项所述的一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法在CAR-T细胞植活上的应用。