JP6588465B2 - 修飾ナチュラルキラー細胞、その組成物および用途 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１月３日に出願された米国特許出願第６１／９２３，３５４号の利益を主張する。その特許出願の開示内容の全ては、参照することによって本願に組み込まれるものとする。

本発明は修飾ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）および前記修飾ナチュラルキラー細胞を含む医薬物に関するもの。ディプリーションされたナチュラルキラー細胞の同定方法および修飾ナチュラルキラー細胞の培養方法を提供する。

免疫監視機構（Ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）は、抗がんにおいて重要な役割を果たすと共に、特にがんの管理における従来の外科手術、放射線や化学療法の多くの欠点に鑑みて、非常に魅力的な治療法である。

人体においてがんに対する防御の最前線に立つのは、表現型ＣＤ３⁻ ＣＤ１４⁻ ＣＤ１９⁻ ＣＤ５６^＋ ＣＤ１６^＋ ＮＧＫ２Ｄ^＋ ＣＤ１１ｃ^＋ ＨＬＡ−ＤＲ⁻ ＣＤ８６⁻ ＣＤ８３⁻を持つナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ， ＮＫ ｃｅｌｌ）である。ナチュラルキラー細胞は細胞傷害性リンパ球であり、積極的に体内で異常細胞を探し出し、異常細胞が実際のがん細胞になる前にそれらを破壊する。ナチュラルキラー細胞は、体内で巡回している際、活性型および阻害型の表面受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の配列を通じて、多くのタイプの細胞と相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔ）する。大部分のがん細胞はナチュラルキラー細胞の活性型受容体と結合し、ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー反応（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を起こす。

これらの発見により、ＮＫをベースとするがん治療法および臨床応用で治療効果を持つナチュラルキラー細胞の培養方法を開発するための理論が支持される。しかし、がんに対する効果的な治療法および／または予防法の需要はまだ満たされていない。本発明は、独特の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を持つ修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前述および他の需要を満足する。前記細胞は自己治療（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ）
または非自己治療（ｎｏｎ−ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ）で利用できる。

一つの実施形態では、本発明はＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞表現型と、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６から選ばれる一つまたは複数の樹状細胞表面抗原（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）とを含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明の修飾ナチュラルキラー細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、一つまたは複数の本発明の修飾ナチュラルキラー細胞を必要とする対象に投与することを含む、がん細胞の阻害方法を提供する。

他の実施形態では、有効用量の請求項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞を必要とする対象に投与して、がん細胞を阻害することを含む、がん細胞の阻害方法を提供する。

本発明の第四の実施形態では、サンプル中の単球細胞から一つまたは複数の細胞表面抗原ＣＤ１４、ＣＤ１９、またはＣＤ２５を除外（ディプリーション）し、サンプル中のディプリーションされたナチュラルキラー細胞を同定する方法を提供する。この際、ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞はＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない。

本発明の第五の実施形態では、１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインおよびＴ細胞の成長因子を含む組成物を提供する。

本発明の第六の実施形態では、ディプリーションされたナチュラルキラー細胞を、（ａ）１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインと、（ｂ）Ｔ細胞の成長因子とを含む組成物と接触させることを含む、修飾ナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。この際、ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞はＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない。

もう一つの実施形態では、（ａ）ディプリーションされたナチュラルキラー細胞を、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含む第一の組成物と接触させることと、（ｂ）ステップ（ａ）のディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞を、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む第二の組成物と接触させることとを含む、修飾ナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。この際、ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞はＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない。

本明細書に記載の同定および培養方法を通じて、一定量のサンプル（例えば、１０ｍｌの血液）から大量のナチュラルキラー細胞を分離することができる。

本特許または本特許出願は、少なくとも一枚のカラー図を含む。カラー図を含む本特許または本特許出願のコピーは、申請および必要な手数料を納入することで、特許庁より提供される。

以下の図面を参照し、以下で本発明の実施形態を詳細に説明する。

図１は、ディプリーションされたナチュラルキラー細胞の同定工程および修飾ナチュラルキラー細胞の培養工程を概略的に説明する図面である。 図２は、ディプリーション／同定工程の前後のナチュラルキラー細胞の細胞表面抗原ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５の発現量を説明する一組の画像である。パネルＡは、細胞をディプリーションする前に、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ， ＦＳＣ）および側方散乱光（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ， ＳＳＣ）検出システムを用いてＣＤ１４^＋、ＣＤ１９^＋、およびＣＤ２５^＋細胞をフローサイトメトリー分析した結果を示している。パネルＢは、細胞をディプリーションした後に、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１９^＋、およびＣＤ２５^＋細胞をフローサイトメトリー分析した結果を示している。 図３は、従来のナチュラルキラー細胞、米国特許出願第１３／９１８，５２９号のナチュラルキラー細胞、および本発明の修飾ナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリーの図面である。パネルＡ−ＣおよびパネルＪ−Ｌは、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＨＫＧ２Ｄ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ８３の従来のナチュラルキラー細胞フローサイトメトリー分析である。パネルＧ−ＩおよびＰ−Ｒは、本発明の修飾ナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリー分析である。パネルＤ−ＦおよびＭ−Ｏは米国特許出願第１３／９１８，５２９号のナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリー分析である。 図３は、従来のナチュラルキラー細胞、米国特許出願第１３／９１８，５２９号のナチュラルキラー細胞、および本発明の修飾ナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリーの図面である。パネルＡ−ＣおよびパネルＪ−Ｌは、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＨＫＧ２Ｄ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ８３の従来のナチュラルキラー細胞フローサイトメトリー分析である。パネルＧ−ＩおよびＰ−Ｒは、本発明の修飾ナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリー分析である。パネルＤ−ＦおよびＭ−Ｏは米国特許出願第１３／９１８，５２９号のナチュラルキラー細胞のフローサイトメトリー分析である。 図４は、修飾ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を説明するフローサイトメトリー分析画像である。パネルＡは、修飾ナチュラルキラー細胞が存在しない場合に、カスパーゼ６陽性標的細胞のパーセンテージを示している。パネルＢは、本発明の修飾ナチュラルキラー細胞が存在する場合に、カスパーゼ６陽性標的細胞のパーセンテージを示している。 図５は、修飾ナチュラルキラー細胞がＴリンパ球増殖に対する影響を説明する、フローサイトメトリー分析画像である。パネルＡは、インビトロにおいて、同種異系Ｔリンパ球が存在しない場合に修飾ナチュラルキラー細胞の増殖状況を示している。パネルＢは、インビトロにおいて、修飾ナチュラルキラー細胞が存在しない場合に同種異系Ｔリンパ球の増殖状況を示している。パネルＣは、インビトロにおいて、修飾ナチュラルキラー細胞が存在する場合に同種異系Ｔリンパ球の増殖状況を示している。 図６は、異なる濃度のインターロイキン１２が修飾ナチュラルキラー細胞に対する影響を説明するフローサイトメトリーの図である。 図６は、異なる濃度のインターロイキン１２が修飾ナチュラルキラー細胞に対する影響を説明するフローサイトメトリーの図である。 図７は、インターロイキン２を含む組成物（パネルＡ−Ｃ、パネルＧ−Ｉ、およびパネルＭ）またはインターロイキン１５を含む組成物（パネルＤ−Ｆ、パネルＪ−Ｌ、およびパネルＮ）が修飾ナチュラルキラー細胞の細胞表面抗原の発現に対する影響を説明するためのフローサイトメトリー分析画像である。 図７は、インターロイキン２を含む組成物（パネルＡ−Ｃ、パネルＧ−Ｉ、およびパネルＭ）またはインターロイキン１５を含む組成物（パネルＤ−Ｆ、パネルＪ−Ｌ、およびパネルＮ）が修飾ナチュラルキラー細胞の細胞表面抗原の発現に対する影響を説明するためのフローサイトメトリー分析画像である。

本明細書において、「一つ」とは一個、もしくは一個以上（つまり「少なくとも一個」）の本文で述べた主体のことをいう。例えば、「一つの修飾ナチュラルキラー細胞」とは、一個の修飾ナチュラルキラー細胞、もしくは、一個以上の修飾ナチュラルキラー細胞のことを指す。

本明細書において、「有効用量」とは、修飾ナチュラルキラー細胞、または医薬組成物の用量のことであり、その用量でがんの症状や病状を減少することができる。前記症状や病状は、体重軽減、痛み、もしくは検出されうる腫瘍塊（ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）にとどまらず、臨床的に明らかな塊もしくは各種の放射線映像装置に検出される塊も含まれる。

「対象」（ｓｕｂｊｅｃｔ）とは、がんに罹患した脊椎動物またはがん治療を受ける必要があると思われる脊椎動物のことである。対象には、温血動物、例えば哺乳類、例えば霊長類、特に人が含まれる。人でない霊長類もここでいう対象に含まれる。対象には、ペ
ット（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）、例えば猫や犬等が含まれ、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）と実験用動物（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ、例えばマウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）も含まれる。従って、獣医への使用や医学製剤も予測の範疇に含まれる。

発現量（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）、または細胞表面抗原の面密度（ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）、例えばナチュラルキラー細胞の表面のＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲは、陰性対照群（「−」と表示される）に比較して正偏差であれば、「＋」となる。

本明細書に全ての数値は「約」によって修飾されていると理解してもよい。

修飾ナチュラルキラー細胞
天然由来、または従来のナチュラルキラー細胞にはＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型がある。一つの実施形態では、天然由来、または従来のナチュラルキラー細胞には、表１に示されるＣＤ３⁻ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫＧ２Ｄ^＋ＣＤ１１ｃ^＋表現型がある。

一つの実施形態で、本発明はＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞の表現型と、表１に示されるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３もしくはＣＤ８６から選ばれる一つまたは複数の樹状細胞表面抗原（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）とを含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供する。本発明の修飾ナチュラルキラー細胞は天然由来なものではない。前記修飾ナチュラルキラー細胞には、一つもしくは複数の完全に活性化された樹状細胞表面抗原（例えばＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６）が含まれ、ナチュラルキラー細胞の機能および樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の両方の機能ならびに強化された抗がん活性を持つ。

一つの実施形態では、前記修飾ナチュラルキラー細胞がＣＤ１１ｃを実質的に持たない（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ１１⁻の表現型を有する）。もう一つの実施形態では、前記修飾ナチュラルキラー細胞はＣＤ１４⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ１６^＋、およびＮＫＧ２Ｄ^＋から選ばれる一つ以上のナチュラルキラー細胞の表現型（例えば、ＣＤ３⁻ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫＧ２Ｄ^＋の表現型）を持つ。さらに、もう一つの実施形態では、前記修飾ナチュラルキラー細胞はＣＤ１４および／またはＣＤ１９を実質的に持たない。

例示的な一実施形態では、本発明はＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞にはＣＤ８３細胞表面抗原をさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ８３^＋表現型を持つ）。もう一つの例示的な一実施形態では、本発明はＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナ
チュラルキラー細胞にはＣＤ８６細胞表面抗原をさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ８６^＋表現型を持つ）。もう一つの例示的な一実施形態では、本発明はＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞にはＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原をさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＨＬＡ−ＤＲ表現型を持つ）。

第四の例示的な実施形態では、一種のＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ８３細胞表面抗原とＣＤ８６細胞表面抗原とをさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ８６^＋ＣＤ８３^＋表現型を持つ）。第五の例示的な実施形態では、一種のＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ８６細胞表面抗原とＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原とをさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ８６^＋ＨＬＡ−ＤＲ^＋表現型を持つ）。第六の例示的な実施形態では、一種のＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞には、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原とＣＤ８３細胞表面抗原とをさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ８３^＋表現型を持つ）。

いくつかの例示的な実施形態では、本発明は一種のＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋表現型ナチュラルキラー細胞を含む修飾ナチュラルキラー細胞を提供し、前記ＣＤ３⁻／ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞には、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原と、ＣＤ８３細胞表面抗原と、ＣＤ８６細胞表面抗原とをさらに含む（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ８６^＋ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ８３^＋表現型を持つ）。

一つの実施形態では、細胞表面抗原の発現量（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）または面密度（ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）は以下の方法で定量される。前記修飾ナチュラルキラー細胞を蛍光色素タグ付の特定抗ヒトモノクローナル抗体（例えばＣＤ８６−ＰＥ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ； カタログ番号： ＩＭ２７２９Ｕ）または抗ヒトＣＤ８３−ＰＥ−Ｃｙ５ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ； カタログ番号： ３０５３１０））に曝露し、その後フローサイトメーター（例えばＧａｌｌｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡから購入可能）で修飾ナチュラルキラー細胞の選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）を行う。

前記修飾ナチュラルキラー細胞は、単一の個体、すなわち自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）由来、または複数の個体（非自己の同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ））由来のものであってもよい。

医薬組成物
一つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾ナチュラルキラー細胞および薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、がん細胞を抑制するのに有効な量の本発明の修飾ナチュラルキラー細胞または本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、がん細胞を抑制する方法を提供する。いかなる特定の理論に限られず、本発明の修飾ナチュラルキラー細胞は、一つまたは複数のナチュラルキラー細胞／樹状細胞の機能によって、がん細胞を抑制することが考えられる。前記機能は、細胞傷害性を高め、がん特異性Ｔリンパ球の増殖またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を刺激することを含む。

本発明の医薬組成物または修飾ナチュラルキラー細胞の投与経路は、静脈内（ｉｎｔｒ
ａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口（ｏｒａｌ）、局部（ｔｏｐｉｃａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経直腸（ｒｅｃｔａｌ）、脊髄（ｓｐｉｎａｌ）、または表皮投与（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）を含み、ただし、これらに限定されない。一つの実施形態では、前記修飾ナチュラルキラー細胞は、静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によって投与される。

本発明の医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、または注射前に液体ビヒクル（ｌｉｑｕｉｄ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）中の溶液もしくは懸濁液に適する固体形態のいずれかとして、注射剤として製造することができる。本発明の医薬組成物はまた、固体形態、乳化形態、またはその他の特定の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）の中に製造され、持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に供されることができる。本発明の医薬組成物の可能な形態としては、油エマルジョン（ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、油中水型エマルション（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、水中油中水型エマルション（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、部位特異的エマルション（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、長期滞留エマルション（ｌｏｎｇ−ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、粘着性エマルション（ｓｔｉｃｋｙ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルション（ｍｉｃｒｏ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、ナノエマルション（ｎａｎｏ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ならびに種々の天然もしくは合成ポリマー、例えば、エチレン／酢酸ビニル共重合体およびＨｙｔｒｅｌ（登録商標）共重合体などの非吸収不透過性ポリマー、ヒドロゲルなどの膨潤性ポリマー、またはコラーゲン、および特定のポリ酸もしくはポリエステル（例えば、吸収性縫合糸を製造するための物）などの再吸収性ポリマーなどが挙げられる。これらは、本発明の医薬組成物の持続放出を可能にする。

本発明の修飾ナチュラルキラー細胞は、哺乳類動物対象に放出するための医薬組成物に製造される。前記医薬組成物は単独で投与、および／または薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤もしくは担体と混合し投与されることができる。好適なビヒクルとしては、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはその他の類似の物質およびそれらの組み合わせが挙げられる。また、ビヒクルには、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）などの少量の補助物質を含んでも良い。薬学的に許容される担体は、生理学的に許容される化合物を含んでも良い。前記生理学的に許容される化合物は、本発明医薬組成物の吸収速度またはクリアランス速度（ｃｌｅａｒａｎｃｅ
ｒａｔｅｓ）を安定、増加または減少させることができる。前記生理学的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、リポソーム担体、または賦形剤、またはその他の安定剤および／またはバッファが挙げられる。その他の生理学的に許容される化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または防腐剤が挙げられる。例えば、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．）」の第２１版を参照しても良い。本発明の医薬組成物はまた、薬理学的薬剤、サイトカイン、またはその他の生物学的応答調節剤などの補助物質を含んでも良い。

これらの剤形を実際に製造する方法は、当業者にとって周知であり、例えば、第２１版の「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）」の第２１版を参照しても良い。

修飾ナチュラルキラー細胞または本発明の医薬組成物は、単回投与治療しても良く、また、対象の年齢、体重および状態、投与された特定の組成物、投与経路、前記修飾ナチュラルキラー細胞もしくは医薬組成物の投与目的は予防か治療かなどの条件に応じて、計画的に一定期間にわたって複数回投与治療を行っても良い。例えば、一つの実施形態で、本発明に係る修飾ナチュラルキラー細胞または医薬組成物は、月一回、月二回、月三回、一週間おきに（ｑｏｗ）、週一回（ｑｗ）、週二回（ｂｉｗ）、週三回（ｔｉｗ）、週四回、週五回、週六回、一日おきに（ｑｏｄ）、一日一回（ｑｄ）、一日二回（ｑｉｄ）または一日三回（ｔｉｄ）に投与される。

本発明の修飾ナチュラルキラー細胞または医薬組成物の投与期間、例えば修飾ナチュラルキラー細胞または医薬組成物の投与される期間は、対象の反応等の様々な要因によって変えることができる。例えば、前記修飾ナチュラルキラー細胞は、一秒間または数秒間から一分間または数分間、一時間または数時間から一日間乃至一週間、約二週間から約四週間、約一ヶ月間から約二ヶ月間、約二ヶ月間から約四ヶ月間、約四ヶ月間から約六ヶ月間、約六ヶ月間から約八ヶ月間、約八ヶ月間から約一年間、約一年間から約二年間、約二年間から約四年間、またはそれ以上に投与されうる。

投与および投与量の均一性を容易にするため、投与単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ
ｆｏｒｍ）で非経口用医薬組成物または修飾ナチュラルキラー細胞を調整することが有利である。本発明において、投薬単位形態とは、被験対象の単位用量として適した物理的な不連続単位（ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｕｎｉｔｓ）である。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータから、ヒトに投与する用量を策定することができる。一つの実施形態では、このような修飾ナチュラルキラー細胞の投与量は、 ＥＤ_５０（５０％有効投与量）を含む特定の循環範囲内にあり、ほとんど無毒性または無毒性である。前記投与量は、用いられる剤形と投薬経路に応じてこの範囲内で変化することができる。もう一つの実施形態では、治療上有効な投与量は、細胞培養アッセイによって最初に推定することができる。投与量は、細胞培養において測定されたＩＣ_５０（即ち、症状の最大阻害効果の半分に達する修飾ナチュラルキラー細胞の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｓｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ２５： ３５−４５， ２００３． Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈａｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ４（１２）： １２３−５３， ２０００。

前記医薬組成物は、前記修飾ナチュラルキラー細胞の有効投与量を含むように配合され、前記投与量は、治療される動物と治療される症状に依存する。任意の特定の対象に対する具体的な投与量レベルは、修飾ナチュラルキラー細胞の活性、年齢、体重、一般的健康状況（ｇｅｎｅｒａｌ ｈｅａｌｔｈ）、性別、飲食、投薬時間、投薬経路、排出速度、薬物の組合や現在治療中の病気の深刻さを含む様々な要因に依存する。本発明の修飾ナチュラルキラー細胞の治療的または予防的有効量についての例示的な非限定的範囲は、少なくとも投与量あたり約１×１０^３個の細胞から投与量当たり約１×１０^９個の細胞である。他の投与量も可能であり、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、または１×１０^９を含むが、それらに限定されない。

前記修飾ナチュラルキラー細胞または前記医薬組成物は、単独で、または他の治療薬とあわせて投与することができる。例えば、化学療法、放射線療法、標的療法またはがんワクチン等がある。

修飾ナチュラルキラー細胞の同定および培養方法
一つの実施形態では、ディプリーションしたチュラルキラー細胞を同定する方法および修飾ナチュラルキラー細胞を培養する方法は、図１に示されている。修飾ナチュラルキラー細胞の培養は、最初の細胞群としてディプリーションしたチュラルキラー細胞（ディプリーションしたＣＤ１４−ＣＤ１９−ＣＤ２５−単球細胞）を使用して増殖培養を行う。

一つの実施形態では、図１に示すように、ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞（ディプリーションしたチュラルキラー細胞）の高度に精製された画分を得る同定／ディプリーション手順は以下のとおりである。

（ａ）対象由来のサンプルを採取する。サンプルは、例えば、末梢血、臍帯血又は骨髄試料などの１つまたは複数の単球細胞を含む任意の体液を含むが、これらに限定されない。

（ｂ）遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標） ＰＲＥＭＩＵＭ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ）を利用し、ステップ（ａ）のサンプル中の単球細胞を他種類の血液細胞から分離する。他の単球細胞を分離する方法は、当業者において周知である。

（ｃ）ＭＡＣＳ細胞分離機（ＭＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇ； Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｇｅｒｍａｎｙ）等を利用し、ステップ（ｂ）の他の単球細胞から、ＣＤ２５細胞表面抗原（例えば単球細胞表現型ＣＤ２５^＋ＣＤ３⁻およびＣＤ２５^＋ＣＤ３^＋）、ＣＤ１４細胞表面抗原細胞、またはＣＤ１９細胞表面抗原細胞を含む一つまたは複数の単球細胞をディプリーションする。

（ｄ）ステップ（ｃ）のＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞（またはディプリーションしたナチュラルキラー細胞）を培養するために採取する。

本発明の一つの実施形態では、サンプルからディプリーションしたナチュラルキラー細胞を同定する方法を提供する。前記方法は、前記サンプル中の単球細胞から一つまたは複数の細胞表面抗原ＣＤ１４、ＣＤ１９、またはＣＤ２５をディプリーションする方法を含む。その中、前記ディプリーションしたナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない。

一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ２５を含む単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１４を含む単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１９を含む単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１４を含む一つまたは複数の単球細胞およびＣＤ２５を含む一つまたは複数の単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１４を含む一つまたは複数の単球細胞およびＣＤ１９を含む一つまたは複数の単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１９を含む一つまたは複数の単球細胞およびＣＤ２５を含む一つまたは複数の単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、ステップ（ｂ）のＣＤ１９を含む一つまたは複数の単球細胞、ＣＤ２５を含む一つまたは複数の単球細胞およびＣＤ１４を含む一つまたは複数の単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。

一つの実施形態では、実質的にＣＤ２５を含む全ての単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、実質的にＣＤ１４を含む全ての単球細胞はサ
ンプル中でディプリーションされた。もう一つの実施形態では、実質的にＣＤ１９を含む全ての単球細胞はサンプル中でディプリーションされた。

一つの実施形態では、図１に示すように、ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞（またはディプリーションしたナチュラルキラー細胞）の高度に精製された画分は、Ｔ細胞の成長因子および１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインを含む培地組成物と接触している。もう一つの実施形態では、ステップ（ｃ）のＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞（またはディプリーションされたナチュラルキラー細胞）は、Ｔ細胞の成長因子、１型ヘルパーＴ細胞のサイトカイン、およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を含む培地組成物と混合される。Ｔ細胞の成長因子の非限定的な例はインターロイキン１５である。１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインの非限定的な例はインターフェロンγが挙げられる。もう一つの実施形態で、前記組成物はさらに造血細胞の培地を含む。造血細胞の培地の非限定的な例はＸ−ｖｉｖｏ ２０を含む（Ｌｏｎｚａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入可能）。

一つの実施形態で、前記培地組成物は、幹細胞因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３ ｌｉｇａｎｄ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、およびニコチンアミドより選択される一つまたは複数の成長因子を実質的に含まない。もう一つの実施形態では、幹細胞因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、インターロイキン２、インターロイキン７、インターロイキン２１、またはニコチンアミドが培地組成物内の含有量は２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、および０．５重量％未満である。

一つの実施形態で、Ｔ細胞の成長因子および１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインを含む組成物は、３７℃、５％の二酸化炭素の存在下で、修飾ナチュラルキラー細胞を培養するために使用される。

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、修飾ナチュラルキラー細胞の増殖を促すことができる。一つの実施形態では、組成物は、完全に活性化された樹状細胞マーカー（例えば、修飾ナチュラルキラー細胞のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６細胞表面抗原）の発現を増加させた。もう一つの実施形態では、組成物は、修飾ナチュラルキラー細胞のＣＤ１１ｃ細胞表面抗原の発現を実質的に減少させた。修飾ナチュラルキラー細胞の増殖速度は、ＣＤ３⁻ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ５６^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞の信号強度に基づいてＦＡＣＳによって測定された。その他の細胞増殖アッセイは、当分野で周知であり、例えば、クローン形成法（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）、代謝アッセイ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｓｓａｙ）、および直接増殖アッセイ（ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ））である。

ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞および組成物の接触時間の例示的な非限定的範囲は、約１分間から約１時間、約１時間から約２４時間、約１日から約３日、約１日から約６日、約１日から約９日、約３日から約６日、または少なくとも１日である。一つの実施形態では、接触時間が約３日である。もう一つの実施形態では、接触時間が約６日である。

一つの実施形態では、ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻単球細胞（またはディプリーションされたナチュラルキラー細胞）がインターロイキン１５、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、およびインターロイキン１２を含む第一の組成物と接触し；その後、インターロイキン１５およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む第二の組成物と接触する。もう一つの実施形態で、第一の組成物および第二の組成物は造血細胞の培地、例えばＸ−ｖｉｖｏ ２０、をさらに含む。

インターロイキン１２はナチュラルキラー細胞にとって毒性を持つ。そのため、生存しているナチュラルキラー細胞を培養および増殖する際、前記組成物内のインターロイキン１２の濃度は重要な要素である。比較的高いインターロイキン１２の濃度は生存している修飾ナチュラルキラー細胞の生産量を低下させるためである（図６参照）。一つの実施形態で、インターロイキン１２の有効濃度は１５ｎｇ／ｍＬ以下であり、例えば１４．５、１４、１３．５ｎｇ／ｍＬである。もう一つの実施形態で、インターロイキン１２の有効濃度は０．１ｎｇ／ｍＬより大きく、例えば０．１５、０．２、０．２５ｎｇ／ｍＬである。もう一つの実施形態で、インターロイキン１２の有効濃度は約０．１から約５ｎｇ／ｍＬであり、または０．１ｎｇ／ｍＬ単位で前記範囲内に存在する任意の値または範囲である（例えば、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約４．３ｎｇ／ｍＬなど）。もう一つの実施形態で、インターロイキン１２の有効濃度は約５から約１０ｎｇ／ｍＬであり、または０．１ｎｇ／ｍＬ単位で前記範囲内に存在する任意の値または範囲である（例えば、約６．５ｎｇ／ｍＬ、約８．２ｎｇ／ｍＬなど）。もう一つの実施形態で、インターロイキン１２の有効濃度は約１０から約１５ｎｇ／ｍＬ、または０．１％単位で前記範囲内に存在する任意の値または範囲である（例えば、約１３．７ｎｇ／ｍＬ、約１２．８ｎｇ／ｍＬなど）。

本発明の以下の具体的な実施例は、本発明を説明するためのものであり、発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：修飾ナチュラルキラー細胞の同定
健康なボランティアから４０ｍＬの末梢血を採取し、Ｋ２ＥＤＴＡを含む真空チューブの中に入れた。血液サンプルを同じ体積の予熱されたリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｓｒａｅｌ）と混合した。希釈した末梢血のアリコート４０ｍＬを５０ｍＬの遠心分離管に入れて、さらに予熱したＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標） ＰＲＥＭＩＵＭ １０ｍＬを入れた。遠心分離管を３０分間室温で、２０００ｒｐｍで遠心分離した。界面層にある単球細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄した。細胞ペレットを１０^６／１００ｍＬ濃度のＭＡＣＳバッファ液に再懸濁した。

ＣＤ１４^＋細胞、ＣＤ１９^＋細胞、およびＣＤ２５^＋細胞をディプリーションするため、製造業者の説明書に従ってＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ分離機（ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ； Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ， Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、単球細胞に対して免疫磁気ビーズ分離（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を行った。簡単に言えば、単球細胞は、ビオチン−抗ＣＤ１４、ビオチン−抗ＣＤ１９、およびビオチン−抗ＣＤ２５と反応し、磁性分離器で分離され、その後、ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻の細胞画分は洗浄により未結合の細胞から精製された。濃縮された単球細胞画分は、ＣＤ１４^＋細胞、ＣＤ１９^＋細胞、およびＣＤ２５^＋細胞（ディプリーションされたナチュラルキラー細胞）を実質的に含まない。

図２に示すように、ＣＤ１４^＋細胞、ＣＤ１９^＋細胞、およびＣＤ２５^＋の信号強度は、ディプリーション後（パネルＢ）のものよりもディプリーション前（パネルＡ）がはるかに高かった。

実施例２：修飾ナチュラルキラー細胞の培養
陰性ディプリーション（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）後、実施例１で得られた精製されたＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻ＣＤ２５⁻ナチュラルキラー細胞（ディプリーショ
ンされたナチュラルキラー細胞）画分を、次のように培養した：
（ａ）０日目に、１×１０^６個のＣＤ１４⁻／ＣＤ１９⁻／ＣＤ２５⁻ナチュラルキラー細胞（ディプリーションされたナチュラルキラー細胞）と、１ｍＬ Ｘ−ｖｉｖｏ ２０培地、１ｍＬインターロイキン１５（濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、１ｍＬインターロイキン１２（濃度４ｎｇ／ｍＬ）、および１ｍＬインターフェロンγ（濃度は２０ｎｇ／ｍＬ）を含む組成物とを接触させた。

（ｂ）３日目に、ステップ（ａ）で得たディプリーションされたナチュラルキラー細胞の半数を収穫し、スピンダウンした後、Ｘ−ｖｉｖｏ ２０培地、１０ｎｇ／ｍＬインターロイキン１５、４ｎｇ／ｍＬインターロイキン１２、および２０ｎｇ／ｍＬインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む組成物で細胞ペレットを再懸濁させた。細胞ペレットを懸濁させるのに用いるＸ−ｖｉｖｏ ２０および各種の成長因子の体積は、細胞ペレットの体積と同様であった。

（ｃ）６日目に、ステップ（ｂ）で得たディプリーションされたナチュラルキラー細胞の半数を収穫し、スピンダウンした後、Ｘ−ｖｉｖｏ ２０培地、１０ｎｇ／ｍＬインターロイキン１５、および２０ｎｇ／ｍＬインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む組成物で細胞ペレットを再懸濁させた。細胞ペレットを懸濁させるのに用いるＸ−ｖｉｖｏ ２０および各種の成長因子の体積は、細胞ペレットの体積と同様であった。

（ｄ）９日目に、ステップ（ｃ）で得たディプリーションされたナチュラルキラー細胞を全部集めた。

Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ， １０ ＣＯＬＯＲＳ／３ ＬＡＳＥＲＳ， シリアルナンバー： ＡＵ１８４１９， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）、Ｋａｚｕｌａソフトウェアバージョン１．２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）、および表２に記載の抗体を用いて、ステップ（ｄ）で培養して得たディプリーションされたナチュラルキラー細胞の表現型を分析した。

本実施例において、ＦＡＣＳ／フローサイトメーター分析を用いて得た細胞表面抗体発現量もしくは表面密度は表３に定義されている。表３の異なる発現量に対する解釈は、細胞表面抗原発現量を定義する例である。また、フローサイトメーターで得た信号強度は、フローサイトメーター、ソフトウェア、および使用した抗体の異なるバッチによって変化する。

結果：図３Ｇ−３Ｉおよび図３Ｐ−３Ｒで示されたように、培養したナチュラルキラー細胞はＣＤ３⁻ ＣＤ１９⁻ ＣＤ１４⁻ ＣＤ５６^＋ ＣＤ１６^＋ ＮＫＧ２Ｄ^＋ ＣＤ１１ｃ⁻ ＣＤ８６^＋ ＨＬＡ−ＤＲ^＋ ＣＤ８３^＋の表現型を持つ。図３Ａ−３Ｃおよび図３Ｊ−３Ｌは、ＣＤ３⁻ ＣＤ１９⁻ ＣＤ１４⁻ ＣＤ５６^＋ ＣＤ１６^＋ ＮＫＧ２Ｄ^＋ ＣＤ１１ｃ^＋ ＣＤ８６⁻ ＨＬＡ−ＤＲ⁻ ＣＤ８３⁻表現型を持つ従来
のナチュラルキラー細胞を示している。図３Ｄ−３Ｆおよび図３Ｍ−３Ｏは、米国特許出願第１３／９１８，５２９号のナチュラルキラー細胞フローサイトメーター分析を示している。

従来のナチュラルキラー細胞の表現型と修飾ナチュラルキラー細胞の表現型との違いは以下に概説する。

・図３ＡでＣＤ１１ｃ^＋表現型を持つ従来のナチュラルキラー細胞を示し、図３ＧでＣＤ１１ｃ⁻表現型を持つ修飾ナチュラルキラー細胞を示す。

・図３ＪでＨＬＡ−ＤＲ⁻表現型を持つ従来のナチュラルキラー細胞を示し、図３ＰでＨＬＡ−ＤＲ^＋表現型を持つ修飾ナチュラルキラー細胞を示す。

・図３ＫでＣＤ８６⁻表現型を持つ従来のナチュラルキラー細胞を示し、図３ＱでＣＤ８６^＋表現型を持つ修飾ナチュラルキラー細胞を示す。

・図３ＬでＣＤ８３⁻表現型を持つ従来のナチュラルキラー細胞を示し、図３ＲでＣＤ８３^＋表現型を持つ修飾ナチュラルキラー細胞を示す。

実施例３：ナチュラルキラー細胞の機能性測定
細胞傷害試験（“ｋｉｌｌｉｎｇ”ａｓｓａｙ）：実施例２で得た修飾ナチュラルキラー細胞と、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識Ｋ５６２白血病標的細胞とを、１：１の比率で３０分間培養した。標的細胞の死滅状況は、ＡＰＣ標識標的細胞でフローサイトメトリー・セルソーティング（ＦＡＣＳ）で検出したカスパーゼ６（Ｃａｓｐａｓｅ ６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，死滅した細胞）の比率によって測定された。カスパーゼ６のパーセンテージが高いほど、細胞傷害の効果が良いことを示す。

結果：図４Ａに示すように、カスパーゼ陽性標的細胞（修飾ナチュラルキラー細胞なし）は８．３％であり、一方、図４Ｂに示すように、カスパーゼ陽性標的細胞（修飾ナチュラルキラー細胞あり）は５７．８％であった。この結果は、修飾ナチュラルキラー細胞は白血病標的細胞に対し比較的に高い細胞傷害効果を有することを示した。

Ｔリンパ球の増殖試験
実施例２で得た修飾ナチュラルキラー細胞をＣＦＳＥで標識した同種異系Ｔリンパ球と共に培養した。Ｔリンパ球の増殖はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカインの分泌をもたらした。同種異系Ｔリンパ球の増殖は、ＦＡＣＳによってＣＦＳＥ標識単球細胞の数で評価された。

結果：実施例２で得たナチュラルキラー細胞と共に培養すると、同種異系Ｔリンパ球の分裂比率が比較的高かった（図５Ｃ）；単独で培養すると、即ち実施例２のナチュラルキラー細胞が存在しないと、同種異系Ｔリンパ球は殆どまたは全く分裂しなかった（図５Ｂ）。

実施例４：インターロイキン１２の濃度が修飾ナチュラルキラー細胞の培養に及ぼす影響
インターロイキン１２は潜在的に毒性である。組成物中のインターロイキン１２の濃度のインビトロ評価は、ＦＡＣＳ／フローサイトメーターを用いて行った。

実施例２のナチュラルキラー細胞を培養するため、組成物中で以下のインターロイキン１２の濃度が使用された：０ｎｇ／ｍＬ（インターロイキン１２を含まない）、０．１８
ｎｇ／ｍＬ、０．５５ｎｇ／ｍＬ、１．６６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、および１５ｎｇ／ｍＬ。

結果：図６に示すように、実施例２における生存ナチュラルキラー細胞の数は、インターロイキン１２の濃度が高くなるほど減少した。インターロイキン１２の濃度が５ｎｇ／ｍＬのとき、約１４．１３％の培養ナチュラルキラー細胞が生存した；一方、インターロイキン１２の濃度が１５ｎｇ／ｍＬのとき、わずか７．３１％の培養ナチュラルキラー細胞が生存した。

実施例５：インターロイキン２が修飾ナチュラルキラー細胞の培養に対する影響
インターロイキン２組成物およびインターロイキン１５組成物がナチュラルキラー細胞の培養に対する影響のインビトロ評価は、ＦＡＣＳ／フローサイトメーターを用いて行った。

図７Ｈおよび７Ｉに示すように、ＣＤ８６細胞表面抗原およびＣＤ８３細胞表面抗原は、インターロイキン２を含む組成物と共に培養したナチュラルキラー細胞上で発現されなかった。一方、図７Ｋおよび７Ｌに示すように、ＣＤ８６細胞表面抗原およびＣＤ８３細胞表面抗原の両方は、インターロイキン１５を含む組成物と共に培養したナチュラルキラー細胞上で発現された。

本発明の特定の態様を説明、および図示してきたが、これらの態様は、単に本発明の例示であり、添付の特許請求の範囲を制限するためのものではない。本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願は、本明細書にあらゆる目的のためにその全体を参考として援用される。

前述の発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によって一定程度で詳しく説明されてきたが、本技術分野の知識を持つ技術者により、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更を施しても、本発明の請求の範囲内である。
［付記事項］
［付記事項１］
ＣＤ３ ^- ／ＣＤ５６ ⁺ ナチュラルキラー細胞表現型、並びに
ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６から選ばれた一つまたは複数の樹状細胞表面抗原、
を含む修飾ナチュラルキラー細胞。
［付記事項２］
ＣＤ１１ｃ細胞表面抗原を実質的に含まない、付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞。
［付記事項３］
ＣＤ１４ ^- 、ＣＤ１９ ^- 、ＣＤ１６ ⁺ 、およびＮＫＧ２Ｄ ⁺ から選ばれた一つまたは複数のナチュラルキラー細胞表現型を含む、付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞。
［付記事項４］
（ａ）付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む医薬組成物。
［付記事項５］
前記修飾ナチュラルキラー細胞がＣＤ１１ｃ細胞表面抗原を実質的に含まない、付記事項４に記載の医薬組成物。
［付記事項６］
前記修飾ナチュラルキラー細胞がＣＤ１４ ^- 、ＣＤ１９ ^- 、ＣＤ１６ ⁺ 、およびＮＫＧ２Ｄ ⁺ から選ばれた一つまたは複数のナチュラルキラー細胞表現型を含む、付記事項４に記載の医薬組成物。
［付記事項７］
有効用量の付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞を、必要とする対象に投与して
、がん細胞を阻害する、がん細胞の阻害方法。
［付記事項８］
前記修飾ナチュラルキラー細胞がＣＤ１１ｃ細胞表面抗原を実質的に含まない、付記事項７に記載の方法。
［付記事項９］
前記修飾ナチュラルキラー細胞がＣＤ１４ ^- 、ＣＤ１９ ^- 、ＣＤ１６ ⁺ 、およびＮＫＧ２Ｄ ⁺ から選ばれた一つまたは複数のナチュラルキラー細胞表現型を含む、付記事項７に記載の方法。
［付記事項１０］
前記有効用量は一回投与量あたり約１×１０ ³ から約１×１０ ⁹ 個のナチュラルキラー細胞である、付記事項１に記載の方法。
［付記事項１１］
１型ヘルパーＴ細胞のサイトカイン、および
Ｔ細胞の成長因子、
を含む組成物。
［付記事項１２］
前記１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）である、付記事項１１に記載の組成物。
［付記事項１３］
前記Ｔ細胞の成長因子はインターロイキン１５（ＩＬ−１５）である、付記事項１１に記載の組成物。
［付記事項１４］
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）をさらに含む、付記事項１１に記載の組成物。
［付記事項１５］
前記インターロイキン１２の濃度は約０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、付記事項１４に記載の組成物。
［付記事項１６］
さらに造血細胞の培地を含む、付記事項１１に記載の組成物。
［付記事項１７］
前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０である、付記事項１１に記載の組成物。
［付記事項１８］
ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない、ディプリーションされたナチュラルキラー細胞を、（ａ）１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインと、（ｂ）Ｔ細胞の成長因子とを含む組成物と接触させることを含む、
付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞を培養する方法。
［付記事項１９］
前記１型ヘルパーＴ細胞のサイトカインはインターフェロンγである、付記事項１８に記載の方法。
［付記事項２０］
前記Ｔ細胞の成長因子はインターロイキン１５である、付記事項１８に記載の方法。
［付記事項２１］
前記組成物はインターロイキン１２をさらに含む、付記事項１８に記載の方法。
［付記事項２２］
前記インターロイキン１２の濃度は約０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、付記事項２１に記載の方法。
［付記事項２３］
前記組成物は造血細胞の培地をさらに含む、付記事項１８に記載の方法。
［付記事項２４］
前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０である、付記事項２３に記載の方法。
［付記事項２５］
前記ディプリーションされたナチュラルキラー細胞は、前記組成物と約１日から約３日接触する、付記事項１８に記載の方法。
［付記事項２６］
前記ディプリーションされたナチュラルキラー細胞は、前記組成物と約１日から約３日接触する、付記事項２１に記載の方法。
［付記事項２７］
（ａ）ディプリーションされたナチュラルキラー細胞を、インターフェロンγおよびインターロイキン１５を含む第一の組成物と接触させること、および
（ｂ）ステップ（ａ）のディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞を、インターロイキン１５、インターロイキン１２、およびインターフェロンγを含む第二の組成物
と接触させること、
を含み、この際、前記ディプリーションされたナチュラルキラー細胞はＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を実質的に含まない、付記事項１に記載の修飾ナチュラルキラー細胞を培養する方法。
［付記事項２８］
前記インターロイキン１２の濃度は約０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、付記事項２７に記載の方法。
［付記事項２９］
前記第一の組成物および前記第二の組成物が造血細胞の培地をさらに含む、付記事項２７に記載の方法。
［付記事項３０］
前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０である、付記事項２９に記載の方法。
［付記事項３１］
ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞は、前記第一の組成物と約１日から約６日接触する、付記事項２７に記載の方法。
［付記事項３２］
ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞は、前記第二の組成物と約１日から約３日接触する、付記事項２７に記載の方法。

Claims (26)

1. ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１１ｃ^-ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺表現型を含む、培養されたヒトナチュラルキラー細胞。
2. ＣＤ１４^-およびＣＤ１９^-から選ばれた一つまたは複数の表現型を含む、請求項１に記載の培養されたヒトナチュラルキラー細胞。
3. （ａ）請求項１に記載の培養されたヒトナチュラルキラー細胞、および
   （ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤、
   を含む医薬組成物。
4. 前記培養されたヒトナチュラルキラー細胞がＣＤ１４^-およびＣＤ１９^-から選ばれた一つまたは複数の表現型を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養されたヒトナチュラルキラー細胞を含有することを特徴とする、抗がん剤。
6. 前記培養されたヒトナチュラルキラー細胞がＣＤ１４^-およびＣＤ１９^-から選ばれた一つまたは複数の表現型を含む、請求項５に記載の抗がん剤。
7. 前記抗がん剤は１×１０³から１×１０⁹個の前記培養されたヒトナチュラルキラー細胞を含む、請求項５に記載の抗がん剤。
8. ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺表現型を含む培養されたヒトナチュラルキラー細胞の調製のためのヒト末梢血単球細胞培養用組成物の使用であって、
   前記組成物は、インターロイキン１５、インターロイキン１２、およびインターフェロンγを含む、使用。
9. 前記インターロイキン１２の濃度は０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項８に記載の使用。
10. 前記組成物はさらに造血細胞の培地を含む、請求項８に記載の使用。
11. 前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０（商標）である、請求項１０に記載の使用。
12. ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺表現型を含む培養されたヒトナチュラルキラー細胞を培養する方法であって、
    （ａ）対象から得られたヒト末梢血単球細胞とインターフェロンγ、インターロイキン１５、およびインターロイキン１２を含む第一の組成物とを接触させて、少なくとも１日培養する工程；
    （ｂ）ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺細胞マーカーで前記培養されたヒトナチュラルキラー細胞を単離する工程、
    を含む、方法。
13. 前記（ｂ）工程において、前記培養されたヒトナチュラルキラー細胞はＣＤ１１ｃ^-表現型をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記（ａ）工程において、前記接触の前に、
    （ｚ１）ＣＤ１４⁺細胞、ＣＤ１９⁺細胞およびＣＤ２５⁺細胞をディプリーションして、ＣＤ１４^-ＣＤ１９^-ＣＤ２５^-細胞を得る工程、
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記（ａ）工程において、前記接触の前に、
    （ｚ２）ＣＤ１４⁺細胞およびＣＤ１９⁺細胞をディプリーションして、ＣＤ１４^-ＣＤ１９^-細胞を得る工程、
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
16. 前記インターロイキン１２の濃度は０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１２に記載の方法。
17. 前記第一の組成物は造血細胞の培地をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
18. 前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０（商標）である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記細胞を１日から９日培養する、請求項１２に記載の方法。
20. 前記（ａ）工程と前記（ｂ）工程との間に、
    （ｘ１）前記第一の組成物を除去し、前記細胞とインターフェロンγおよびインターロイキン１５を含む第二の組成物とを接触させる工程、
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
21. （ａ）ディプリーションされたナチュラルキラー細胞とインターフェロンγ、インターロイキン１５およびインターロイキン１２を含む第一の組成物とを接触させること、
    （ｂ）前記（ａ）のディプリーションされたナチュラルキラー細胞とインターロイキン１５およびインターフェロンγを含む第二の組成物とを接触させること、および
    （ｃ）ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺細胞マーカーで培養されたヒトナチュラルキラー細胞を単離すること、
    を含み、この際、前記ディプリーションされたナチュラルキラー細胞はＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５から選ばれる一つまたは複数の細胞表面抗原を含まない、ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫＧ２Ｄ⁺ＣＤ８６⁺ＨＬＡ−ＤＲ⁺ＣＤ８３⁺表現型を含む培養されたヒトナチュラルキラー細胞を培養する方法。
22. 前記インターロイキン１２の濃度は０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第一の組成物および前記第二の組成物が造血細胞の培地をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
24. 前記造血細胞の培地はＸ−ｖｉｖｏ ２０（商標）である、請求項２３に記載の方法。
25. ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞は、前記第一の組成物と１日から６日接触する、請求項２１に記載の方法。
26. ディプリーションされた前記ナチュラルキラー細胞は、前記第二の組成物と１日から３日接触する、請求項２１に記載の方法。