KR20120093978A - 항원 특이적 ｔ 세포의 증식 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기 적합한 T 세포를 프라이밍 하는 시험관 내 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법으로 얻어지는 조성물 및 그 이용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 면역학 및 암 치료 분야에 관한 것으로서 보다 상세하게는 항원 특이적 T 세포의 활성화 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 T 세포에 관한 것이다.
T 세포는 종양 또는 감염 세포를 인식하고 이러한 표적 세포를 살해함으로써 발병을 막는다. 그러나, 특이적 T 세포의 존재 하에 발병하는 암이나 만성 감염으로 입증된 것처럼, 종양 또는 병원체와 면역체계의 상호작용은 복잡하기 때문에 병원체나 종양은 T 세포의 감시를 확실히 피할 수도 있다.
사실상 어떠한 병원성 침입자도 인식하는 T 세포의 능력은 놀라울 정도로 다양한 수용체 레퍼토리(repertoire)에 의해 인정되고, T 세포 풀(pool)은 주 조직적합 복합체(major histocompatibility complex: 이하 MHC) 분자에 의한 제시에 따라 다량의 펩티드를 인식할 수 있다. 그러나, T 세포 수용체(TCR)를 통한 시그널링(시그널 1)은 공동자극 분자(costimulatory molecules)가 세포 증식, 생존 및 분화를 위한 필수 시그널(시그널 2)을 제공하기 때문에 적절한 T 세포 활성화에 충분하지 않다. 사실, 시그널 2 없이 오직 시그널 1만을 수용하는 미접촉 T 세포(naive T cells)는 무력(무반응)해지거나 세포고사(apoptosis)를 통해 사멸한다. 시그널 1과 시그널 2의 통합은 T 세포의 완전한 활성화가 요구되고, 이 시그널의 강도는 뒤이은 T 세포 풀의 크기를 형성한다. 더욱이, 이펙터 T 세포(effector T cell)로의 완전한 분화는 일반적으로 세 번째 시그널에 의존하고, 이 시그널은 수용성 형태로 항원제시세포(APC)에 의해 공급되며 필요한 이펙터 T 세포 유형을 위한 유익한 시그널을 제공한다. 이 '3-시그널(three-signal)' 개념은 미접촉 T 세포의 활성화 및 그에 따른 이펙터 T 세포 형성을 위한 모델을 묘사한다. 그러나, 면역 체계는 다양한 공동자극 분자를 과잉 제공하고 이러한 시그널 2와 시그널 3의 다양한 유형은 모두 그들 특유의 방법으로 T 세포 반응의 특성에 기여한다. 공동자극 시그널과 시그널 3의 수용성 형태는 생존, 세포주기진전, 발현될 이펙터 세포의 유형 및 이펙터 세포나 기억 세포의 분화와 같은 T 세포 활성화의 특이한 양상에 작용할 수 있다. 현재, 수명이 긴 기억 CD8+ T 세포를 유도하기 위해 성숙한 항원제시 수지상 세포(DC)는 CD4+ T 세포, 천연킬러 세포(NK cell) 및 천연킬러 T 세포(NKT cell)를 포함하여, 다른 림프구에 의해 "도움(help)"을 받아야 하는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 이 "도움"은 성숙한 DC가 더 분화하도록 유도하는데, 이 과정은 라이센싱(licensing)이라고 알려져 있다. "헬퍼(Helper)" 시그널은 공동자극 분자의 상향조절(upregulation), 사이토카인(cytokine)의 분비 및 여러 항세포고사 분자의 상향조절을 포함하여, DC에 다중 효용을 미치고, 모든 시그널은 유사 T 세포, 특히 CD8+ T 세포를 최적으로 활성화시키기 위해 DC의 능력에 점증적으로 효력을 더한다. 또, "헬퍼" 림프구는 T 세포 생존, 세포주기진전, 발현될 이펙터 세포의 유형 및 이펙터 세포나 기억 세포의 분화에 직접적으로 영향을 주는 인자를 발현하거나 분비할 수 있다.
만성감염이나 공격적인 암을 예방하기 위한 한 가지 전략은 아답티브 티셀 테러피(adoptive T-cell therapy)이고, 그 치료는 숙주의 특이적 T 세포 반응을 회복시키기 위한 이펙터 T 세포의 전이를 수반한다. 원하는 특이성 T 세포를 얻기 위한 최근의 기술 개발은 상이한 임상 환경에서 아답티브 티셀 테러피의 사용에 대한 관심을 증가시켰다. 세포전달요법(adoptive cell transfer therapy)은 활성화되고 팽창된 자가조직의 종양 반응성 T 세포를 생체 외 투여하는 것이다. 암 치료에 있어서 세포전달요법의 사용에 대한 몇 가지 잠재적 이점이 있다. 종양 특이적 T 세포는 종양의 면역성과는 별도로, 활성화되어 생체 외에서 다수로 팽창될 수 있고, T 세포의 기능적 및 표현형 특질은 입양 전이(adoptive transfer)에 우선하여 선택될 수 있다.
입양 전이 후에, 진행된 종양의 소멸을 유발시키기 위해 T 세포에 대해 몇 가지 이벤트가 일어나야 한다. 더 자세하게는, T 세포가 항원 특이적 재자극을 통해 생체 내 활성화되어야 하고, 그 후 T 세포가 종양적하(tumor burdens)의 현저한 파괴를 유발시킬 수 있는 레벨로 팽창해야 하며, 항종양(antitumor) 세포가 모든 종양 세포의 박멸을 완료하기에 충분할 정도로 장기간 생존하여야 한다.
이전에는, 고형 종양이 있는 환자에게 입양 전이를 위한 세포를 선택했던 기준은 공동배양에 따라 인터페론-감마(IFN-γ)를 분비하고 종양 세포를 사멸시키는 항종양 T 세포의 능력이었다. 그러나, 현재 이러한 기준만으로 생체 내 효험을 예측하지 않는 것은 확실하다. Gattinoni (J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)) 등은 완전한 이펙터 특질을 획득하고 시험관 내 증가된 항종양 반응도를 보이는 CD8+ T 세포가 생체 내 종양 소멸 및 치료 시 덜 효과적이라는 것을 발견했다.
종래기술에 따른 방법은 임상적으로 종양 특이적 세포독성 T 세포의 적절한 수준에 도달하기 위해 1회 이상의 재자극을 필요로 한다. 이는 참고 문헌 Ho et al.(Journal of Immunological Methods, 310(2006), 40-50)과 Gritzapis et al.(J. Immunol., 2008: 181;146-154)의 실시예에서 확인할 수 있는데, 약 19%의 종양 특이적 CD8+ T 세포 수준에 도달하기 위해 1 내지 2회의 재자극이 필요했다.
결과적으로, 활성화 동안에 항원 특이적 T 세포의 증식 및 생존을 증가시키는 입양 면역 요법(adoptive immunotherapy)에서의 사용을 위해 T 세포 집단을 준비하는 방법이 요구된다.
요약
본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기 적합한 항원 특이적 1형 헬퍼T(Th1) 세포 또는 세포독성 T 세포(CTL)의 시험관 내 프라이밍 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료될 환자의 표적 T 세포를 자가 단핵구 유래 수지상 세포, 자가나 타가의 종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드 및 동종이계 림프구와 함께 공동배양하는 것으로 구성된다. 상기 동종이계 림프구는 환자의 항원제시세포(APC) 상의 I형 MHC 및/또는 II형 MHC 항원에 대해, 또는 치료가 필요한 환자의 항원제시세포(APC) 상에 발현되는 II형 MHC 항원과 동일한 하나 이상의 II형 MHC 항원을 발현하는 비혈연 공혈자의 항원제시세포(APC)에 대해 감작된다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 획득할 수 있는 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL와 그 이용에 관한 것이다.
도 1은 종래의 MLR(= allo-sensitized allogeneic lymphocytes: 이하 ASAL)에서 방사선 조사된 동종이계 말초혈액 단핵세포(PBMC) 상에 발현되는 MHC 항원에 대해 감작된 림프구가 ASAL의 프라이밍에 사용되었던 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 공동배양된 성숙한 단핵구 유래 DC 상에 CD70의 발현을 현저하게 향상시키는 것을 도시한다.
도 2는 감마선 조사된 ASAL이 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 공동배양된 성숙한 단핵구 유래 DC 상에 CD70의 발현을 향상시키는 것을 도시한다.
도 3은 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IL-12의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 4는 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IFN-감마의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 5는 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IL-2의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 6은 성숙한 단핵구 유래 DC를 CD4+, CD8+ 또는 CD56+ 림프구가 대폭 감소된 ASAL와 공동배양한 결과로서, IL-2, IL-12 및 IFN-감마의 생성을 도시한다.
도 7은 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 감작되지 않은 동종이계 CD8+ T 세포의 증식 반응을 증가시키는 것을 도시한다.
도 8은 유동 세포 분석법(flow cytometry)으로 검출되는 바와 같이 종양 특이적 CD8+ T 림프구의 백분율을 도시한다. A: 상단 우측 코너는 HER-2 양성 유방암 환자의 HER-2 특이적 세포독성 림프구의 유도를 도시한다. 항원 로드된 (CD8+ 표적 세포에 대해) 자가조직의 DC와 방사선 조사된 ASAL를 공동배양하고 9일 후, 모든 CD8+ 표적 세포의 25.2%가 종양 특이적 CTL가 되었다. B: 상부 우측 코너는 Her2-펩티드로의 DC-로딩이 없는 대조 실험에서 Her2 특이적 세포독성 림프구의 빈도를 도시한다. 배양 9일 후 모든 CD8+ T 세포의 오직 0.4% 만이 종양 특이적 CTL가 되었다. (상부 우측 코너와 하부 우측 코너는 총 CD8 T 세포 집단을 제시한다.)
도 9는 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 CD27을 발현하는 동종반응성 CD8+ 표적 세포수의 증가를 이끌어냄을 도시한다.
도 10은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 방사선 조사된 PBMC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 세포고사 (아넥신-V-양성) 표적 세포수의 감소를 이끌어냄을 도시한다.
도 11은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 강한 (6배) 2차 증식 반응을 이끌어냄을 도시한다.
도 12는 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 IFN-감마 생성의 상당한 증가를 이끌어냄을 도시한다.
도 2는 감마선 조사된 ASAL이 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 공동배양된 성숙한 단핵구 유래 DC 상에 CD70의 발현을 향상시키는 것을 도시한다.
도 3은 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IL-12의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 4는 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IFN-감마의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 5는 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 상당한 IL-2의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 6은 성숙한 단핵구 유래 DC를 CD4+, CD8+ 또는 CD56+ 림프구가 대폭 감소된 ASAL와 공동배양한 결과로서, IL-2, IL-12 및 IFN-감마의 생성을 도시한다.
도 7은 ASAL를 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인 단핵구 유래 DC와 공동배양 하는 것이 감작되지 않은 동종이계 CD8+ T 세포의 증식 반응을 증가시키는 것을 도시한다.
도 8은 유동 세포 분석법(flow cytometry)으로 검출되는 바와 같이 종양 특이적 CD8+ T 림프구의 백분율을 도시한다. A: 상단 우측 코너는 HER-2 양성 유방암 환자의 HER-2 특이적 세포독성 림프구의 유도를 도시한다. 항원 로드된 (CD8+ 표적 세포에 대해) 자가조직의 DC와 방사선 조사된 ASAL를 공동배양하고 9일 후, 모든 CD8+ 표적 세포의 25.2%가 종양 특이적 CTL가 되었다. B: 상부 우측 코너는 Her2-펩티드로의 DC-로딩이 없는 대조 실험에서 Her2 특이적 세포독성 림프구의 빈도를 도시한다. 배양 9일 후 모든 CD8+ T 세포의 오직 0.4% 만이 종양 특이적 CTL가 되었다. (상부 우측 코너와 하부 우측 코너는 총 CD8 T 세포 집단을 제시한다.)
도 9는 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 CD27을 발현하는 동종반응성 CD8+ 표적 세포수의 증가를 이끌어냄을 도시한다.
도 10은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 방사선 조사된 PBMC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 세포고사 (아넥신-V-양성) 표적 세포수의 감소를 이끌어냄을 도시한다.
도 11은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 강한 (6배) 2차 증식 반응을 이끌어냄을 도시한다.
도 12는 동종이계 CD8+ 표적 세포의 최초 자극 동안 ASAL의 프라이밍에 이용되는 방사선 조사된 PBMC에 대해 자가조직인, 단핵구 유래 DC에 대한 방사선 조사된 ASAL의 첨가는 이 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 최초 표적 세포 자극에 이용된 DC에 대하여 자가조직인 B세포로 재자극될 때 IFN-감마 생성의 상당한 증가를 이끌어냄을 도시한다.
정의
본 발명을 상세히 기술하기에 앞서, 여기서 사용된 전문용어는 특정 실시예를 기술하기 위한 목적 이외에 제한적 의미로 의도되지 않은 것임을 이해하여야 한다. 때문에, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이다.
발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형도 포함하는 것임을 유념하여야 한다.
또한, "약"이라는 용어는 적용가능한 경우 주어진 값의 +/- 2% 편차, 바람직하게는 +/- 5%, 가장 바람직하게는 수치 값의 +/- 10% 편차를 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 문맥에서, "항원-특이적(antigen-specific)"이라는 용어는 자가 주 조직적합 복합체(MHC) 분자 상에 제시되는 짧고 독특한 펩티드 서열의 독특한 T 세포 수용체(TCR)에 의한 특이적 인식/결합에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, "프라이밍(priming)" 및 "활성화(activation)"라는 용어는 "헬퍼(helper)" 세포의 동시 발생 유무에 따라 항원제시세포에 의해 자극되는 비접촉 항원 특이적 T 세포에서 일어나는 프로그램된 활성화 과정에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, "반응세포(responder cells)"라는 용어는 활성화 및/또는 증식에 의해 공동배양된 동종이계 PBMC에 반응하는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하지만 그에 한정되지 않는 다른 림프구 소집단에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, "감작세포(sensitized cell)"라는 용어는 PBMC를 포함하여, 공동배양된 동종이계 세포에 의해 예비활성화된 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하는 다른 림프구 소집단에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, "표적 세포(target cell)"라는 용어는 동종이계 APC 또는 항원을 제시하는 자가조직의 APC에 의해 프라임/활성화되는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 환자 림프구(표적 세포) 수거의 위치는, 예를 들면, 말초혈액, 종양, 종양배액림프절(TDLN) 또는 골수일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 단핵구 유래 DC와 관련된 "성숙한(mature)"이라는 용어는 지다당류(lipopolysaccharide: LPS)와 같은 미생물제제나 TNF-알파 및/또는 IL-1 베타와 같은 또는 염증 매개체와 함께 미숙한 DC의 자극에 의해 유도되는 CD40, CD86, CD83 및 CCR7를 포함하지만 그에 한정되지 않는 "성숙기-표지자(maturity-marker)"의 발현에 관한 것이다.
미숙한 DC는 높은 세포내 이입 활동 및 낮은 T 세포의 활성화 가능성으로 특징지어진 세포이다. 미숙한 DC는 바이러스와 박테리아와 같은 병원체를 찾아 주변 환경을 끊임 없이 조사한다. 미숙한 DC는 병원체를 대식(phagocytose)하고 병원체의 단백질을 작은 조각으로 분해하며 성숙에 따라 MHC 분자를 이용하여 병원체 세포 표면에 절편을 제시한다. 동시에, 그들은 T 세포를 활성화하는 능력을 매우 향상시키는 CD80, CD86 및 CD40과 같은 T 세포 활성화의 보조수용체로서의 역할을 하는 세포 표면 수용체를 상향조절한다. 그들은 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 림프계를 통해 림프절로 이동하도록 유도하는 화학주성 수용체인 CCR7을 상향조절한다. 여기서, 그들은 항원제시세포로서의 역할을 하는데, 비항원 특이적 공동자극 시그널과 함께 병원체에서 유래된 항원을 그들에게 제시함으로써 B 세포 뿐만 아니라 헬퍼 T 세포 및 살해 T 세포를 활성화시킨다. 성숙한 DC는 단핵백혈구, 즉 체내에서 순환하는 백혈구에서 유래될 수 있고, 우측 시그널에 의존하여, DC나 대식세포로 변할 수 있다. 단핵백혈구는 차례로(in turn) 골수의 줄기세포에서 형성된다. 단핵구 유래 DC는 말초혈액 단핵백혈구에서 시험관 내 생성될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 세포의 "비활성화(inactivation)"라는 용어는 자손을 형성하기 위한 세포분열이 불가능해진 세포를 가리킨다. 그럼에도 불구하고, 세포는 자극 또는 사이토카인(cytokine)과 같은 세포 생성의 생합성 및/또는 분비에 반응할 수 있다. 비활성화 방법은 공지된 기술이다. 비활성화의 바람직한 방법은 미토마이신 C(mitomycin C)와 같은 독소나 감마선 조사(gamma irradiation)와 같은 방사선요법으로 치료하는 것이다. 고정되거나 침투될 수 있게 되어 분열이 불가능한 세포 또한 비활성화된 세포의 예이다.
본 발명의 문맥에서, "혼합림프구반응(mixed lymphocyte reaction)", "혼합림프구배양(mixed lymphocyte culture)", "MLR" 및 "MLC"라는 용어는 동종이형으로 상이한 최소 두 개의 다른 세포 집단으로 구성되는 혼합체를 언급하기 위해 호환가능하게 사용된다. 하나 이상의 동종이형으로 다른 세포는 림프구이다. 상기 세포들은 림프구의 자극을 유발시키기 위해 한동안 적절한 조건 하에서 공동으로 배양된다. MLR의 빈번한 목적은 림프구를 증식시키는 것과 같은 동종이계 자극(allogeneic stimulation)을 제공하기 위함이다. 그러나, 표시되지 않는 한, 배양 과정에서 증식은 요구되지 않는다. 적당한 문맥에서, 상기 용어들은 대안적으로 그러한 배양에서 유래된 세포 혼합체를 의미할 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "치료(treatment)"라는 용어는 치료될 개인이나 세포의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에 있어서 임상적 개입을 의미하고, 예방이나 임상병리학 과정 중에 행해질 수도 있다. 바람직한 효과는 질병의 발병이나 재발 방지, 질병 증상의 완화, 직접 또는 간접적인 질병의 걷잡을 수 없는 결과 축소, 전이 방지, 질병 진행률의 저하, 질병 상태의 개선이나 일시적 완화, 차도 또는 개선된 예후를 포함한다.
"항원제시세포(antigen-presenting cell(s))", "APC" 또는 "APCs"라는 용어는 하나 이상의 항원, 바람직하게는 I형 MHC 분자와 관련 있는 항원의 제시를 유도할 수 있는 다른 분자 (모두 동종이계 유래) 뿐만 아니라 온전한 모든 세포 및 동종이계의 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 유형의 단핵 세포를 모두 포함한다. 바람직하게는, 독자 생존 가능한 모든 세포는 APC로 사용된다. 적합한 APC의 예는 단핵백혈구, 대식세포, DC, 단핵구 유래 DC, 대식세포유래 DC, B 세포 및 예를 들면, 세포주(cell line) THP-1, U937, HL-60 또는 CEM-CM3인 골수성 백혈병 세포와 같은 모든 세포이지만, 상기 세포들에 한정되지는 않는다. 골수성 백혈병 세포는 소위 예비-단핵백혈구를 제공한다고 말해진다.
"암(cancer)", "neoplasm(신생물)" 및 "종양(tumor)"이라는 용어는 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 단수형이나 복수형으로 통용될 수 있고, 숙주 개체에 병적인 악성 변환을 가져오는 세포를 의미한다. 최초의 암세포, 즉, 악성 변환 위치 근처에서 얻어진 세포는, 정착된 기술, 특히 조직학적 검사로 암에 걸리지 않은 세포와 쉽게 구별될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 암세포의 정의는 최초의 암세포 뿐만 아니라 암세포 조상에서 유래된 어떠한 세포도 포함한다. 이것은 전이된 암세포 및 시험관 내 배양 및 암세포에서 유래된 세포주를 포함한다. 보통 고형암으로 나타나는 암의 유형을 언급할 때, "임상적으로 감지할 수 있는" 종양은 종양덩어리를 기반으로 감지할 수 있는데, 예를 들어 씨티 촬영, 자기공명화상법(MRI), 엑스레이, 초음파검사 또는 촉지와 같은 과정에 의한 것이다. 본 발명에 관련된 종양/암의 예시적 예는 유방암(breast cancer), 신경교종(glioma), 교아 종(glioblastoma), 섬유모세포종(fibroblastoma), 신경성 육종(neurosarcoma), 폐암(lung cancer), 자궁암(uterine cancer), 림프종(lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 고환 종양(testicular tumors), 성상세포종(astrocytoma), 이소성 호르몬생산 종양(ectopic hormone-producing tumor), 난소암(ovarian cancer), 방광암(bladder cancer), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 골암(bone cancer), 직장암(colorectal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 질암(vaginal cancer), 활액막육종(synovial sarcoma), 위장췌장 신경내분비 종양(vasoactive intestinal peptide secreting tumors), 수모 세포종(medulloblastoma), 두경부 편평상피암(head and neck squamous cell cancer), 구강암(oral cancer), 구강백반(oral leukoplakia), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer) 또는 전이성 암, 즉, 백혈병(leukemia)이다. 특히, 전립선암 및 유방암이 바람직하다.
본 발명의 문맥에서 "배양(culturing)"이라는 용어는 다양한 종류의 배지에서의 세포 또는 유기체의 시험관 내 증식을 의미한다. 배양으로 성장된 세포의 후손은 친세포와 (형태상으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로) 완전히 동일하지 않을 수 있다고 믿어지고 있다. 적합한 배양 배지는 당업자에 의해 선택될 수 있고 그러한 배지의 예는 RPMI 배지 또는 EMEM(Eagles Minimal Essential Medium)이다.
"주 조직적합 복합체(major histoompatibility complex)" 및 "MHC"라는 용어는 T 세포에 대한 항원 제시 및 빠른 이식편 거부반응(graft rejection)이 요구되는 세포 표면 분자를 인코딩하는 유전자 복합체를 의미한다. 인간에 있어서, MHC 복합체는 또한 HLA 복합체라고도 공지되어 있다. MHC 복합체에 의해 인코드 되는 단백질은 "MHC 분자"라고 공지되어 있고 I형 MHC 분자와 II형 MHC 분자로 구분된다. I형 MHC 분자는 베타2-마이크로글로불린(ß2-microglobulin)과 공유 결합 없이 연관되는 MHC에서 인코드되는 사슬로 구성되는 막 이종이량체 단백질을 포함한다. I형 MHC 분자는 거의 모든 유핵세포에서 발현되고 CD8+ T 세포에 항원 제시의 기능을 보여주었다. I형 분자는 인간에 있어서 HLA-A, -B, 및 -C를 포함한다. I형 분자는 일반적으로 8 내지 10개의 아미노산 길이의 펩티드를 결합한다. II형 MHC 분자 또한 막 이종이량체 단백질을 포함한다.
II형 MHC 분자는 CD4+ T 세포에 대한 항원 제시에 참여하는 것으로 알려져 있고, 인간에 있어서 HLA-DP, -DQ, 및 DR을 포함한다. II형 분자는 일반적으로 12 내지 20개의 아미노산 잔기 길이의 펩티드를 결합한다. "MHC 제한(MHC restriction)"이라는 용어는 T 세포가 항원이 분화된 후에만 항원을 인식하도록 하는 T 세포의 특성을 의미하고 그에 따른 항원성 펩티드는 자가 I형 또는 자가 II형 MHC 분자와 연관되어 제시된다.
"백신(vaccine)", "면역원(immunogen)", 또는 "면역원성 조성물(immunogenic composition)"이라는 용어는 여기서 피험자나 동물체에 투여될 때 특이한 면역성을 부여할 수 있는 복합체나 조성물을 의미할 때 사용된다. 본 발명에서 이용된 바와 같이 "세포 백신(cellular vaccine)"이나 "세포 면역원(cellular immunogen)"은 하나 이상의 세포 집단으로 구성되는 조성물을 의미하고, 유효성분으로서 선택적으로 비활성화된다. 본 발명의 면역원 및 면역원성 조성물은 활동적이고, 이는 면역원 및 면역원성 조성물이 숙주의 면역 체계에 의해 최소한 부분적으로 매개되는 (항종양 항원 또는 항암 세포 반응과 같은) 특이적 면역 반응을 자극할 수 있음을 의미한다. 면역 반응은 항체, (헬퍼/유도 또는 세포독성 세포와 같은) 면역 반응성 세포, 또는 그 조성물로 구성될 수 있고, 바람직하게는 치료가 행해지는 종양 상에 존재하는 항원에 대해 행해진다. 상기 반응은 일회 또는 반복 투여함으로써 개체에서 유도되거나 재자극될 수 있다.
복합체 또는 조성물은 a)미접촉 개체의 (종양 항원과 같은) 항원에 대해 면역 반응을 생성하거나, b)복합체 또는 조성물이 투여되지 않았을 경우 일어날 수 있는 것 이상으로 개체의 면역 반응을 재구성, 활성화 또는 유지할 수 있는 경우 "면역원성(immunogenic)"이다. 조성물은 일회 또는 반복 투여될 때 이러한 기준에 이를 수 있는 경우 면역원성이다.
설명
본 발명은 수지상 세포(DC)를 포함하여 자가조직의 항원제시세포에 의한 활성화 동안 항원 특이적 T 세포의 증가된 증식 및 생존을 촉진하기 위한 동종감작된(allo-sensitized) 동종이계 림프구(ASAL)의 생성에 관한 것이다.
본 발명은 항원 특이적 인간 CD8+ T 세포 반응의 유도에 있어서 ASAL에 대한 양성 조절자 역할이 입증되었던 건강한 공혈자와 유방암 환자로부터의 PBMC 및 그 부분 모집단을 이용하는 시험관 내 연구에 기초한다. 동종이계의 시험관 내 모델을 이용할 때 ASAL의 존재 하에서 동종반응성 CD8+ T 세포의 증식 및 생존을 지켜보면, 증식 능력은 5배 증가했고 세포고사(apoptotic cell death)는 10%에서 5%로 감소했다.
ASAL의 첨가는 항원 제시 DC 상에 공동자극 분자 CD70의 강력히 상향 조절된 발현을 유발하고, 1형 CD4+ 및 CD8+ T 세포 내 T 세포 투입에 공지된 긍정적 효과를 갖는 두 인자인 IL-12 및 IFN-감마의 생성을 이끌어낸다. 또, ASAL의 첨가는 T 세포에 대해 공지된 성장인자인 IL-2의 발현을 이끌어냈다. 특히, CD70 매개된 상호작용은 최근 연속적인 라운드 분할(rounds of division)을 통해 활성화된 T 세포의 생존을 촉진하는 것을 보여주었고 그럼으로써 이펙터 T 세포의 축적에 공헌한다.
본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기 적합한 항원 특이적 1형 헬퍼 T(Th1) 세포 또는 세포독성 T 세포(CTL)의 시험관 내 프라이밍 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료될 환자로부터의 표적 T 세포를 자가조직의 단핵구 유래 DC, 자가나 타가의 종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드 및 동종이계 림프구와 함께 공동 배양하는 것으로 구성된다. 상기 동종이계 림프구는 환자로부터의 항원제시세포(APC) 상의 I형 MHC 및/또는 II형 MHC 항원에 대해, 또는 치료될 환자로부터의 APC 상에 발현되는 II형 MHC 항원과 동일한 하나 이상의 II형 MHC 항원을 발현하는 비혈연 공혈자로부터의 APC에 대해 감작된다.
ASAL는 단핵구 유래 DC 및 표적 세포와 함께 배양되는 혼합림프구반응에서 얻어지는 반응세포(responder cell)이다. ASAL는 환자에 대해 동종이계이고, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 천연킬러(NK) 세포를 포함하여 말초 혈액 림프구로 구성되는 군에서 선택된다. 표적 세포는 단핵구 유래 DC에 대해 자가조직인 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 단핵구 유래 DC는 종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드 또는 바이러스 유래된 항원과 함께 로드(load)된다.
ASAL의 첨가는 고 수준의 CD27을 발현하는 표적 CD8+ T 세포 집단의 강화를 더 이끌어낸다. CD27+ CD8+ T 세포는 증식을 위한 항원 유래 오토크라인(autocrine) 시그널을 제공할 수 있기 때문에 입양면역요법(adoptive immunotherapy)에 대해 잠재적으로 더 효과적인 CTL(cytotoxic T cell)를 나타낸다. 그렇기 때문에, 보조세포 비의존형(helper-independent) CD8 T 세포는 생존이나 팽창을 위해 IL-2 또는 CD4+ T 세포 형태의 외인성 도움을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명은 IL-2와 같은 부가적 사이토카인이나 CD4+ T 세포의 부재 또는 감소된 존재 하에서 강력한 세포독성 활성화를 위해 프로그램된 CD4+ T 세포 집단을 개체에게 제공함으로써 면역 매개성 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 특히 세포용해성 항원 특이적 CD8+ T 세포의 생체 외 팽창에 유용하지만, 또한 종양 특이적 CD4+ T 세포의 팽창에도 이용된다.
총 CD8+ T 림프구 수에 대한 백분율로 표현되는 세포용해성 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 바람직하게는 약 5% 이상이고, 더 바람직하게는 약 10% 이상이고, 더 바람직하게는 약 15% 이상이고, 더 바람직하게는 약 20% 이상이며, 가장 바람직하게는 약 25% 이상이다.
구체적으로 말하면, 본 발명에 따른 방법은 종양이 있는 환자에게 투여하기 적합한 항원 특이적 Th1 세포 또는 CTL의 시험관 내 프라이밍 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 환자로부터의 비활성화된 항원제시세포를 건강한 공여자로부터의 말초혈액 단핵세포와 함께 배양하는 단계; b) DC를 성숙시키기 위해 단핵백혈구를 성숙시키는 조성물에서 환자로부터의 단핵백혈구를 배양하는 단계(조성물은 이하에서 더 기술된다.); 및 c) b)단계에서 얻어진 성숙한 DC와 함께 a)단계에서 얻어진 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및/또는 천연 킬러(NK)세포를 포함하지만 그에 한정되지 않는 동종감작된 림프구를 배양하는 단계로 구성된다.
단핵구 유래 DC는, 약 2 내지 7일 동안 GM-CSF 및 IL-4로 구성되는 조성물에서 단핵백혈구를 먼저 배양하여 미숙한 DC를 얻고, 이어서 제2 조성물을 첨가하여 적어도 약 12시간 이상 내지 72시간 동안, 바람직하게는 약 24 내지 48시간 동안 배양함으로써 상기 미숙한 DC가 성숙한 DC가 될 수 있도록 함으로써 얻어진다. 제2 조성물은 미숙한 DC를 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화하는데 이용될 수 있는 성숙한 단핵구 유래 DC로 만드는 성분으로 구성된다. 일 실시예에서, 제2 조성물은 TNF 알파, IL-1 베타, 인터페론 감마, 인터페론 베타 및 폴리-I:C와 같은 TLR3 리간드로 구성된다(Mailliard et al., Alpha-type-1 polarized DCs: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res. 2004;64:5934-5937). 또 다른 실시예에서, 제2 조성물은 인터페론 감마, TLR3 및/또는 TLR4 리간드 및 TLR7 및/또는 TLR8 리간드 및/또는 TLR9 리간드로 구성된다. TLR3 리간드의 비제한적 예는 폴리-I:C이고, TLR7/8 리간드의 비제한적 예는 R848이며, TLR9 리간드의 비제한적 예는 CpG이다.
동종이계 림프구의 감작(sensitization)은 비활성화된 동종이계 항원제시세포를 건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포(PBMC)와 함께 배양하는 단계로 구성되는 종래의 혼합림프구반응(MLR 또는 MLC - mixed leukocyte culture(혼합림프구배양))으로 유도된다. MLR의 실행은 당업자에게 공지되어 있다(Jordan WJ, Ritter MA. Optimal analysis of composite cytokine responses during alloreactivity. J Immunol Methods 2002:260:1-14). MLR에서 두 사람의 PBMC(주로 림프구)는 며칠 동안 조직 배양에서 혼합된다. 배합할 수 없는 림프구는 현저하게 증식(예를 들면, 티미딘으로 측정)하기 위해 서로 자극하는 반면에, 배합가능한 림프구는 그렇지 않을 것이다. 일방향 MLC에서, 한 사람의 림프구는 (보통 마이토마이신과 같은 독소 또는 감마선 조사와 같은 방사선요법에 의한 치료에 의해) 비활성화되고, 그럼으로써 치료되지 않고 남아있는 세포 집단만이 외래 조직 적합 항원에 반응하여 증식하게 한다.
MLR에 이용되는 항원제시세포는 PBMC와 단핵구 유래 DC로 구성되는 군에서 선택된다. 단핵구 유래 DC는 환자 또는 환자의 HLA-DR 항원을 매칭(match)하는 II형 MHC(HLA-DR) 항원을 갖는 건강한 공여자로부터 얻는다.
종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드는 환자로부터의 사멸된 종양 세포, 환자의 종양과 같은 유형의 동종이계 종양 세포 및 분리되고 정제된 종양 단백질이나 펩티드로 구성되는 군에서 선택된다. 분리되고 정제된 종양 단백질이나 펩티드는 당업자에게 공지되어 있다. 일 실시예에서, 종양 물질은 종양 단백질을 인코딩하는 mRNA와의 트랜스펙션(transfection)에 의해 단핵구 유래 DC 내에 로드되는 종양 단백질이다.
종양 관련 펩티드의 예는 (유방암과 관련되는) HER-2 단백질, PSA(전립선암과 관련되는 전립선 특이적 항원), (악성 흑색종과 관련되는) MART-1 단백질에서 유래된 펩티드 및 "일반적인" 종양 관련 단백질인 서비빈(survivin)과 p53에서 유래된 펩티드이다. 종양 관련 펩티드/단백질의 추가 예는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서 세포는 약 20일 동안 공동배양되고, 바람직하게는 약 4 내지 20일, 더 바람직하게는 약 6 내지 20일, 더 바람직하게는 약 7 내지 14일 및 가장 바람직하게는 약 9 내지 14일 동안 공동배양된다.
진보적 방법에 따른 일 실시예에서 외인성 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21은 세포 증식과 생존을 최적화하기 위해 세포 배양에 첨가된다.
또한, 상기 세포를 신생 단핵구 유래 DC, 신생 감작된 동종이계의 림프구와 함께, 선택적으로 외인성 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21을 상기 세포 배양에 첨가하여, 배양함으로써 프라임된 항원 특이적 Th1 세포 또는 CTL의 재자극이 가능하다.
본 발명은 또한 상기에서 기술된 방법으로 얻을 수 있는 항원 특이적 Th1 세포 및/또는 CTL 뿐만 아니라 상기에서 기술된 방법으로 얻을 수 있는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
항원 특이적 Th1 세포 및/또는 CTLs는 환자에게 투여하기 적합하고 바람직하게는 하나 이상의 하기 기술된 특징을 갖는다.
- 증식 능력
- 기억 표지자 CD45 RO를 발현
- 저 수준의 세포고사 표지자 아넥신-V(Annexin-V)를 발현 (즉, 세포의 40% 이하, 바람직하게는 20% 이하가 FACS 측정에 의한 아넥신-V에 대해 양성 염색을 나타냄)
- 세포 표면에 CD27 및/또는 CD28을 발현
본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL의 또 다른 능력은 시험관 내 종양 세포를 사멸시키는 능력이다.
또, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL의 이용에 관한 것이고, 또는 상기에서 정의된 바와 같이, 종양 치료를 위한 약제의 제조 또는 인간에게 항종양 면역학적 반응을 유도하기 위한 이용 뿐만 아니라, 종양 치료에 이용 또는 인간에게 항종양 면역학적 반응을 유도하기 위한 이용에 관한 것이다. TH1 세포 및/또는 CTL는 제1 자극 후, 또는 선택적으로 재자극 후에 투여될 수 있다. 일 실시예에서 TH1 세포 및/또는 CTL는 암 치료용 백신과 함께 투여된다.
피험자의 치료 시에 아답티브 셀 테러피(adoptive cell therapy)를 위한 T 세포 집단을 이용하는 방법은 당업계 임상의에게 공지되어 있다. 여기 기술되고 공지된 방법에 따라 준비되는 T 세포 집단은 상기 방법으로 이용될 수 있다. 예를 들면, MART-I 항원 특이적 T 세포로 종양 침윤 림프구를 이용하는 아답티브 셀 테러피가 병원에서 시험되어 왔다(Powell 등, Blood 105:241-250, 2006). 신세포암이 있는 환자는 방사선 조사된 자가조직의 종양 세포로 접종되었다. 채취된 세포는 이차적으로 항CD3 단일 클론 항체 및 IL-2로 활성화되었고, 그 후 환자에게 투여되었다(Chang et al., J. Clinical Oncology 21:884-890, 2003).
항원 프라임된 T 세포는 시험관 내 최초 DC 매개된 프라이밍 동안에 ASAL에 노출될 때 재자극에 따라 증가된 증식 및 감소된 세포고사를 겪는다. 따라서, 접종 전 및/또는 접종 동안 환자에게 입양으로 되돌려져 전이될 경우 접종에 따른 이차적 T 세포 반응을 향상시키는 방법 또한 본 발명에 의해 고려된다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체나 표적 항원을 인식하는 키메릭(chimeric) T 세포 수용체를 발현하기 위해 (바이러스성 형질 도입, 형질 감염, 전기천공법 또는 유전자 물질을 도입하는 기타 방법에 의해) 유전자 조작된 T 세포; 상기 유전자 조작된 T 세포를 감작된 동종이계 림프구의 존재 하에 항원 로드된 DC와 함께 활성화하는 단계; 배양 시 상기 세포를 팽창시키는 단계 및 상기 세포를 환자에게 재도입하는 단계로 구성되는 입양면역치료에서의 이용을 위해 T 세포 집단을 준비하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암 백신 치료를 개선하는 방법을 제공한다. 다수의 종양은 면역 체계에 의한 파괴에 대해 잠재적으로 표적의 역할을 할 수 있는 외래 항원을 발현한다. 암 백신은 체액 성분과 세포 성분을 모두 구성하는 피험체에서 침투성의 종양 특이적 면역 반응을 발생시킨다. 상기 반응은 종양으로부터 먼 위치 또는 국한성 종양의 위치에 백신 조성물을 투여함으로써 피험체의 자가 면역 체계로부터 유도된다. 항체 또는 면역 세포는 종양 항원을 결합하고 종양 세포를 용해한다. 그러나, 아직 암 환자의 접종에 따른 증가된 T 세포 대응성이 필요하다. 접종 전 또는 접종 시에 고 증식 가능성이 있는 예비활성화된 세포고사 저항성 종양 특이적 T 세포의 입양전이는, 따라서 생체 내 백신 매개된 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 항암 백신과 결합하여 투여될 수 있다. 그러한 항암 백신의 비제한적 실시예는 생체 외 번식되어 종양이 로드된 DC, 종양 세포를 생성하는 사이토카인, DNA 백신 및 종양 항원과 결합하여 TLR 리간드를 이용하는 백신이다.
본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 세포는 활성화 동안 항원 특이적 T 세포의 증식 및 생존을 증가시키기 위해 인간과 같은 유기체에 직접적으로 투여될 수 있다. 이런 세포의 투여는 종종 약학적으로 적합한 담체와 함께 어떠한 경로로든 세포를 포유동물이나 조직세포와 최후 접촉하는데 일반적으로 이용된다.
비경구 투여에 적합한 제제, 예를 들면, 정맥주사, 근육내, 피내, 복강내, 피하 및 종양내 경로에 의해서와 같은 비경구 투여에 적합한 제제 및 담체는 수성의 등삼투압 멸균 주사 용액을 포함하고, 상기 주사 용액은 산화방지제, 완충제, 세균 발육 저지제, 예정된 수신자의 혈액과 함께 제제를 수성으로 만드는 용질 및 현탄제, 용해제, 농후제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비수성 멸균 현탁액을 함유할 수 있다. 정맥주사 투여는 본 발명의 TH1 세포 및 CTL 투여의 바람직한 방법이다.
환자에게 투여되는 TH1 세포 및 CTL의 투여량은 본 발명에서 환자의 면역 반응을 향상시키기에 충분해야한다. 따라서, 종양 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 유도 및/또는 질병의 증상 및/또는 합병증을 완화, 경감, 치료하거나, 최소한 부분적으로 저지하기 위한 충분한 량의 세포가 환자에게 투여된다. 이를 달성하기 위해 적합한 량은 "치료상으로 효과적인 투여량"으로 정의된다. 투여량은 치료가 필요한 환자의 체중 또는 표면적 뿐만 아니라 생성된 세포의 활동 및 환자의 상태에 의해 결정될 것이다. 암과 같은 질병의 치료나 예방 시 투여될 효과적인 세포량을 결정할 때, 의사는 질병의 진행 및 종양 항원에 대한 면역 반응 유도의 진행을 평가해야 한다.
선행 기술의 방법과 비교되는 본 발명의 주요 이점이 있다. 본 발명은 재자극할 필요 없는 고 수준의 종양 특이적 CD8+ T 세포를 제공한다. 재자극은 세포를 덜 활동적으로 만들고 세포고사에 이르게 한다. 따라서, 본 발명의 이점은 재자극할 필요 없는 종양 특이적 T 세포를 효과적으로 팽창시키는 방법이다. 게다가, 세포를 재자극할 필요 없이, 종양 특이적 T 세포는 더 짧은 기간 내에 환자에게 되돌려질 수 있고, 이는 비용면에서 효율적이다. 또, 본 발명에 따른 방법의 이용으로, 억제세포의 소모 또는 많은 비용이 드는 외인 성장 요인의 첨가가 필요하지 않다.
본 발명은 이하의 비제한적 실시예에서 더 기술된다.
실시예
실시예
1
재료 및 방법:
동종감작된 동종이계 림프구(ASAL)는 약 5 내지 7일 동안 조직배양 플라스크의 무혈청 X-VIVO 15 배지에서 1대1의 비율로 건강한 공혈자로부터의 감마선 조사된 PBMC를 (건강한 공혈자에 대하여) 동종이계 공여자로부터의 방사선 조사되지 않은 PBMC와 함께 공동 배양함으로써 표준의 일방향 혼합림프구반응(MLR)에서 생성되었다. 미숙한 DC의 증식을 위해, 건강한 공혈자로부터 얻은 말초혈액 단핵세포(PBMC)가 밀도구배(density gradients)로 분리되었다(Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norway). 분리된 PBMC는 AIM-V 배지에서 재부유되었고(Invitrogen, Paisley, UK), 웰 당 2.5 x 106 셀의 24홈 배양판에서 플레이트되었고, 부착을 위해 2시간 방치되었다. 비흡착세포는 제거되었고 남아있는 부착 단핵백혈구는 recombinant human GM-CSF 및 IL-4로 보강된 AIM-V 배지에서 4 내지 6일 동안 배양되었다(R&D Systems, Abingdon, UK; 모두 1,000U/mL). 미숙한 DC의 성숙은 마지막 24시간의 배양시간 동안 배양 배지를 IFN-알파(3,000U/mL), IFN-감마(1,000U/mL), TNF-알파(50ng/mL), IL-1베타(25ng/mL)(모두 R&D Systems) 및 폴리-I:C(Sigma-Aldrich; 20μg/mL)로 보강함으로써 유도되었다.
성숙한 DC 집단은 FACS 분석에 의해 검출된 바와 같이 모두 70% 이상의 CD83+ DC를 함유하였다.
세척 후, 성숙한 DC는 24시간 동안 X-VIVO 15 배지에서 방사선 조사되지 않거나 감마선 조사된 (25 Grey) ASAL와 함께 배양되었고 FACS로 분석되었다. 동종반응성 림프구의 감작은 자극세포인 감마선 조사된 PBMC와 반응세포인 방사선 조사되지 않은 PBMC와 함께 5 내지 6일 동안 비혈청 배양 배지(X-VIVO 15)에서 최초 일방향 MLR을 행함으로써 실시되었다. PE 컨쥬게이트(conjugate)된 항인간 CD70은 FACS 연구에 이용된다.
결과:
도 1에 도시된 바와 같이, ASAL는 ASAL를 프라이밍 하는데 이용되는 방사능 조사된 PBMC에 대하여 자가조직인 성숙한 단핵구 유래 DC 상에 CD70의 발현을 현저하게 향상시킨다.
도 2에 도시된 바와 같이, 감마선 조사된 ASAL는 ASAL를 프라이밍 하는데 이용되는 방사능 조사된 PBMC에 대하여 자가조직인 성숙한 단핵구 유래 DC 상에 CD70의 발현을 유사하게 향상시킨다.
도 3, 4 및 5에 도시된 바와 같이, ASAL를 프라이밍 하는데 이용되는 방사능 조사된 PBMC에 대하여 자가조직인 성숙한 DC를 ASAL와 공동배양 하는 것은 상당한 IL-12, IFN-감마 및 IL-2의 생성을 유도한다.
실시예
2
재료 및 방법:
ASAL는 자극기인 방사선 조사된 동종이계 PBMC를 이용하여 7일 동안 종래의 MLR 동안 생성되었다(실시예 1 참고). 채취 및 방사능 조사 후, 대부분의 ASAL("MLR") 집단 또는 CD4+, CD8+ 또는 CD56+(NK/NKT) 세포가 대폭 감소된 ASAL는 (ASAL를 프라이밍 하는데 이용되는 PBMC에 대하여 자가조직인) 성숙한 동종이계 단핵구 유래 DC와 함께 공동배양되었다. 공동배양 상청액은 24시간 동안 수거되었고, 그 후 IL-2, IL-12 및 IFN-감마 생성을 측정했다.
결과:
IL-2의 생성은 절대적으로 CD-4 의존적이 되도록 발생했고(도 6A), 반면에 IL-12의 생성(도 6B)은 ASAL 의존성을 전혀 보이지 않았고, IFN-감마의 생성(도 6C)은 ASAL 집단 내에서 공동배양되었고 동종 프라임된 CD4+, CD8+ 및 CD56+(NK/NKT)에 대해 부분적 의존성을 보였다.
실시예
3
재료 및 방법:
미숙한 DC는 단핵백혈구의 플라스틱 접착(plastic adherence)에 의해 생성되었다. 단핵백혈구는 각각 1,000U/mL의 IL-4 및 GM-CFS로 보강된 CellGro® DC에서 7일 동안 배양되었다. DC의 성숙은 마지막 2일의 인큐베이션 동안 50ng/mL의 TNF-알파, 25ng/mL의 IL-1베타, 50ng/mL의 IFN-감마, 3,000U/mL의 IFN-알파 및 20㎍/mL의 폴리-I:C의 첨가에 의해 유도되었다.
ASAL은, 7일 동안 X-VIVO 15에서 1대1의 비율로, DC 공여자에 대하여 감마선 조사된 동종 PBMC 및 방사선 조사되지 않은 자가조직의 PBMC를 공동배양함으로써 일방향 혼합림프구반응(MLR)에서 생성되었다.
CD8+ T 림프구는 7일 동안 최종 농도 0.5 x 106 림프구/mL로 50ng/mL IL-15로 보강된 X-VIVO 15에서 배양되었던 자가조직의 PBMC에서 양성선택(positive selection)에 의해 분리되었다. PBMC는 원심분리되어 최종 농도 1 x 107/80μL로 PBS-0.5% BSA-2M EDTA에서 재부유되었다. PBMC는 4℃에서 15분 동안 CD8+ MicroBeads (Miltenyi Biotec)과 함께 인큐베이트되었고, 세척되고 재부유되었으며, LS MACS 칼럼 상에 놓여졌다. 분류되지 않은 세포는 세척되었고 CD8+ 림프구를 포함하는 총 용출액이 수거되었다. 분리된 CD8+ 림프구는 최종 농도 1 x 106mL로 예열된 PBS-1% BSA에서 재부유되었고 37℃에서 10분 동안 10μM CFSE(Molecular probes Invitrogen)로 염색되었다. 염색(staining)은 5mL의 아주 찬 X-VIVO 15 배지의 첨가에 의해 종료되었고 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이트되었다. 세포는 배지에서 두 번 세척되었고 최종 농도 1 x 106mL로 재부유되었다. 염색된 CD8+ 림프구는 방사선 조사된 동종감작된 동종이계 PBMC 및 성숙한 자가조직의 DC와 함께 4대4대1의 비율로 4 내지 7일 동안 공동배양되었다. 배양 후, 림프구가 채취되었고 CD3-APC-H7, CD8-PerCP, CD27-APC 및 아넥신-V로 염색되었다. 증식하는 CD8+ T 림프구의 백분율은 유동 세포 분석법에 의해 검출되었고 총 림프구 수에 대한 백분율로 표현되었다.
결과:
도 7에 도시된 바와 같이, 방사선 조사된 "AlloHelpers"(ASAL)의 첨가는 CD8+ T 세포 분열을 강력하게 증가시킨다(저 형광 강도를 갖는 많은 세포). 따라서, ASAL는 동종반응성 CD8+ T 세포에서 증식 반응을 유도하기 위한 단핵구 유래 DC의 능력을 증가시킨다.
실시예
4
재료 및 방법:
미숙한 DC는 단핵백혈구의 플라스틱 접착에 의해 생성되었다. 단핵백혈구는 7일 동안 각각 1,000U/mL의 IL-4 및 GM-CFS로 보강된 CellGro® DC에서 배양되었다. DC의 성숙은 마지막 2일의 인큐베이션 동안 50ng/mL의 TNF-알파, 25ng/mL의 IL-1베타, 50ng/mL의 IFN-감마, 3,000U/mL의 IFN-알파 및 20㎍/mL의 폴리-I:C의 첨가에 의해 유도되었다. 비흡착 세포, 즉, CD8+ 림프구는 세척되었고 최종 농도 0.5 x 106mL로 7일 동안 50ng/mL의 IL-15로 보강된 X-VIVO 15에서 배양되었다. 동종감작된 동종 림프구는 DC 공여자에 대하여 7일 동안 X-VIVO 15에서 1대1의 비율로 감마선 조사된 자가조직의 PBMC 및 방사선 조사되지 않은 동종 PBMC를 공동배양 함으로써 일방향 혼합림프구반응(MLR)에서 생성되었다.
성숙한 DC는 37℃에서 1시간 동안 X-VIVO 15에서 20㎍/mL의 HER-2 펩티드(KIFGSLAFL)와 함께 채취되었고 로드되었다. 성숙한 DC가 로드된 펩티드는 DC를 방사선 조사된 MLR 및 비흡착 PBMC와 함께 1대4대4의 비율로 공동배양 함으로써 자가조직의 HER2 특이적 세포독성 T 림프구를 유도하였다. 세포는 9일 동안 50U/mL의 IL-2 및 10ng/mL의 IL-7이 있는 경우와 없는 경우 CellGro® DC에서 배양되었다. 배양 후, 세포가 채취되었고, 세척되었으며, 어두운 실온에서 10분 동안 HER-2 특이적 PE 컨쥬게이트된 펜타머(A*0201 KIFGSLAFL)와 함께 인큐베이트되었다. 세포는 세척되었고 그 후 CD3-FITC 및 CD8-APC를 이용한 염색이 행해졌다. HER-2 양성의 세포독성 T 림프구에 대한 백분율은 유동 세포 분석법에 의해 검출되었고 총 CD8+ T 림프구 수에 대한 백분율로 표현되었다.
결과:
도 8은 자가조직의 DC, 본 발명의 동종 감작된 동종이계 림프구, 및 Her-2 펩티드(A)로, 그리고 Her-2 펩티드(B) 없이, 자극된 종양 특이적 CTL의 팽창을 도시한다. HER2+/CD8+ 세포는 각 도트 플롯의 상단 우측에 도시되었다(0.4%(동종프라임된 PBMC은 있으나, Her2 펩티드로의 DC-로딩은 없음) 및 25.2%(동종프라임된 PBMC 및 Her2 펩티드로의 DC-로딩 있음(KIFG)).
선행기술의 종양 특이적 CTL의 팽창과 비교했을 때, 한 번의 자극만으로 이 수준의 팽창을 얻은 것은 주목할 만하다. 이는 Ho et al.(Journal of Immunological Methods, 310(2006), 40-50)의 실시예에서 확인할 수 있는데, 종양 특이적 CD8+ 세포의 18.8% 팽창을 얻기 위해 두 번의 재자극이 요구되었다. 유사하게, Gritzapis et al.(J. Immunol., 2008; 181;146-154)은 기능적으로 팽창된 종양 특이적 CD8+ 세포를 얻기 위해 재자극을 해야 했다.
실시예
5
재료 및 방법: 실시예 1의 재료 및 방법 참조
CD8+ 림프구는 6일 동안 DC 및 방사선 조사된 (DC에 대해 동종이계인) ASAL의 공동배양 이후 (항체로 피복된 자성입자를 갖는 음성선택을 사용하여) 분리되었고, 그 후 (최초 자극 동안에 이용되는 DC에 자가조직인) B세포로 재자극되었으며, CD27 및 아넥신-V의 발현을 위해 염색되었다. 그 후 분석은 FACS로 행해졌다.
결과:
도 9에 도시된 바와 같이, 최초 자극 동안에 ASAL의 첨가는 CD8+ 세포가 B세포로 재자극될 때 CD27의 발현을 상당히 증가시켰다. 최초 자극 동안에 ASAL의 첨가는 CD8+ 세포가 B세포로 재자극될 때 아넥신-V(세포고사 표지자)의 발현을 상당히 감소시켰다(도 10 참조).
실시예
6
재료 및 방법: 실시예 5의 재료 및 방법 참조
B세포로 재자극 전에, 프라임되고 분리된 CD8+ 세포는 3H-티미딘(3H-Thymidine)으로 펄스되었다.
결과:
도 11에 도시된 바와 같이, 최초 자극 동안에 ASAL의 첨가는 재자극 후 동종반응성 CD8+ 세포의 증식 반응을 강력하게 증가시켰다.
실시예
7
재료 및 방법: 실시예 5의 재료 및 방법 참조
2일 동안 B세포와 예비활성화된 CD8+ 세포를 공동배양 한 후, 배양 상청액이 수거되었고 종래의 ELISA(R&D Systems)에 의한 IFN-감마의 생성에 대해 분석하였다.
결과:
도 12는 최초 재자극 동안에 ASAL의 첨가가 재자극 후 동종반응성 CD8+ 세포에 의한 IFN-감마의 생성을 상당히 증가시킨 것을 도시한다.
특정 실시예들이 본 발명에서 상세히 기술되었지만 예시적 실시예로서만 이해되어야 하고, 이하 첨부되는 특허청구범위에 대해 제한적으로 의도되지는 않는다. 특히, 당업자에게는 의해 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 다양한 대체, 변경 및 수정이 가능하다는 것이 고려될 것이다.
Claims (21)
- 종양이 있는 환자에게 투여하기 적합한 항원 특이적 1형 헬퍼 T(Th1) 세포 또는 세포독성 T 세포(CTL)를 프라이밍 하는 시험관 내 방법으로서,
치료될 환자로부터의 표적 T 세포, 자가 단핵구 유래 수지상 세포, 자가 또는 타가의 종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드, 및 환자로부터의 항원제시세포(APC) 상의 I형 MHC 및/또는 II형 MHC 항원에 대해, 또는 치료될 환자로부터의 APC 상에 발현되는 II형 MHC 항원과 동일한 하나 이상의 II형 MHC 항원을 발현하는 비혈연 공혈자로부터의 APC에 대해 감작되는 동종이계 림프구를 공동배양하는 것으로 구성되는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 감작은 불활성화된 동종이계 항원제시세포를 건강한 공여자로부터의 말초혈액 단핵세포(PBMC)와 배양하는 것으로 구성되는 혼합된 백혈구 반응에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 항원제시세포는 PBMC 및 단핵구 유래 수지상 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 단핵구 유래 수지상 세포는 환자로부터, 또는 환자의 HLA-DR 항원을 매칭하는 II형 MHC(HLA-DR) 항원을 갖는 건강한 공여자로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 단핵구 유래 수지상 세포는, 약 1 내지 7일 동안 GM-CSF 및 IL-4로 구성되는 조성물에서 단핵백혈구를 먼저 배양하여 미숙한 수지상 세포를 얻고, 이어서 제2 조성물을 첨가하여 적어도 약 12시간 동안 배양함으로써 상기 미숙한 수지상 세포가 성숙한 수지상 세포가 될 수 있도록 함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 제2 조성물은 TNF 알파, IL-1 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파 또는 베타 및 폴리-I:C와 같은 TLR3 리간드 및/또는 TLR4 리간드로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 제2 조성물은 TNF 알파, 인터페론 감마, TLR3 및/또는 TLR4 리간드 및 TLR7 및/또는 TLR8 아고니스트(agonist)로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 TLR3 리간드는 폴리-I:C이고 상기 TLR8 아고니스트는 R848인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 종양 물질 또는 종양 관련 단백질이나 펩티드는 환자로부터의 사멸한 종양 세포, 환자의 종양과 동일한 유형의 동종이계 종양 세포 및 공지된 분리 정제된 종양 단백질이나 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 종양 관련 펩티드는 HER-2 단백질, PSA 단백질, MART-1 단백질, p53 단백질 및/또는 서비빈(survivin)으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 종양 물질은 종양 단백질을 인코딩하는 mRNA와의 트랜스펙션에 의해 상기 성숙한 수지상 세포 내에 로딩되는 종양 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 약 4 내지 20일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21이 상기 세포 배양에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라임된 항원 특이적 Th1 세포 또는 CTL는 상기 세포를 신생 단핵구 유래 수지상 세포, 신생 감작된 동종이계 림프구와 함께, 선택적으로 외인성 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21을 상기 세포 배양에 첨가하여, 배양함으로써 재자극되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL.
- TH1 세포 및/또는 CTL가
증식 능력을 갖고,
40% 이하의 세포가 아넥신-V에 대해 양성 염색을 나타내고, 및/또는
세포 표면에 CD45RO 및 CD27 및/또는 CD28을 발현하는 것을 특징으로 하는, 환자에게 투여하기 적합한 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL. - 청구항 15 또는 16에 있어서, 종양의 치료에 이용하거나 또는 인간에게 항종양 면역학적 반응을 유도하기 위한 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL.
- 종양 치료용 약제의 제조 또는 인간에게 항종양 면역학적 반응을 유도하기 위하여, 청구항 15 또는 16에 따른 항원 특이적 TH1 세포 및/또는 CTL의 이용.
- 청구항 18에 있어서, 상기 TH1 세포 및/또는 CTL는 항암 백신과 결합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 이용.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 TH1 세포 및/또는 CTL는 최초 자극 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 이용.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 TH1 세포 및/또는 CTL는 재자극 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 이용.
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