CN102597222A - 用于增殖抗原特异性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于体外激发适合施用于肿瘤患者的T细胞的方法。本发明也涉及通过所述方法获得的组合物及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和癌症治疗领域，以及更具体地涉及一种活化抗原特异性T细胞的方法及由所述方法制备的T细胞。
背景技术
T细胞识别肿瘤或感染细胞并且通过杀死这些靶细胞防止疾病的发生。然而，肿瘤或病原与免疫系统的相互作用是复杂的，其通过在存在特异性T细胞时癌症或慢性传染病发展，因此病原体或肿瘤明显地可以逃避T细胞监视得到证实。
事实上T细胞检测任何致病入侵者的能力是其非常多样的受体库产生的，其允许T细胞池识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子递呈的大量的肽。而且，通过T细胞受体(TCR)(信号1)的信号转导不足以产生充分的T细胞活化，因为共刺激分子提供了用于增殖、存活和分化的不可缺少的信号(信号2)。实际上，仅接受信号1而没有信号2的原初T细胞被认为是无能(非反应)的或通过细胞凋亡而死亡。完全的T细胞活化需要信号1和2共同起作用，并且这些信号的强度决定了接着发生的T细胞池的大小。而且，完全分化为效应T细胞通常依赖于第三信号，其由抗原提呈细胞(APC)以可溶性形式提供，并提供用于需要的效应T细胞类型的指导性信号。这个“三个信号”的概念描述了用于活化原初T细胞以及随后形成效应T细胞的模型。然而，免疫系统提供了大量多种共刺激分子并且这些多种类型的信号2和3均以其独特的方式有助于T细胞反应的质量。共刺激分子和可溶性形式的信号3可作用于T细胞活化，如存活、细胞周期进展、待发展的效应细胞的类型和效应细胞或记忆细胞的分化的特定方面。
现在普遍接受了抗原提呈树突细胞(DC)的成熟需要由其它淋巴细胞，包括CD4+T细胞、NK细胞和NKT细胞的“辅助”，以诱导长期生存的记忆CD8+T细胞。这种“辅助”诱导所述成熟DC进一步分化，这个过程称为限制(licensing)。“辅助”信号对DC有多种作用，包括上调共刺激分子、分泌细胞因子和上调多种抗细胞凋亡分子，其累积性地增强DC最佳活化同源T细胞，特别是CD8+T细胞的能力。而且，“辅助”淋巴细胞也可表达或分泌直接影响T细胞存活、细胞周期进展、待发展的效应细胞类型和效应细胞或记忆细胞分化的因子。
用于对抗慢性传染病或侵袭性癌症的一个策略是过继T细胞治疗，其涉及将效应T细胞转移以恢复宿主中的特异性T细胞反应。最近获得需要的特异性的T细胞的技术发展对于在不同临床环境下使用过继T细胞治疗已经引起了越来越大的兴趣。过继细胞转移治疗是施用体外活化并扩增的自体肿瘤反应性T细胞。在癌症治疗中使用过继细胞转移治疗有几个潜在优点。肿瘤特异性T细胞可以被在体外活化并扩增至大的数量，而不依赖于肿瘤的免疫原性，并且在过继转移前可以对T细胞的功能和表型性质进行选择。
过继转移后，对于T细胞必需发生几个事件以引起确定的肿瘤的衰退。更具体而言：-T细胞必需通过抗原特异性再刺激在体内被活化，-然后T细胞必需被扩增至能引起显著的肿瘤负荷破坏的水平，-抗肿瘤细胞必需存活足够长时间以完成所有肿瘤细胞的消除。
以前，用于选择过继转移至实体瘤患者的细胞的标准是在共培养后抗肿瘤T细胞释放IFN-γ并杀死肿瘤细胞的能力。然而，现在明白了仅仅这些标准不能预测体内效力。Gattinoni等，J.Clin.Invest.115：1616-1626(2005)发现获得完全效应子性质并且在体外显示增强的抗肿瘤反应性的CD8+T细胞，在体内引发肿瘤衰退和治愈中效果较差。
根据现有技术的方法需要一次或多次再刺激以达到肿瘤特异性细胞毒性T细胞的临床相关水平。参见例如Ho等(Journal of ImmunologicalMethods，310(2006)，40-50)和Gritzapis等(J.Immunol.，2008；181；146-154)，其中需要再刺激1-2次以达到约19％的肿瘤特异性CD8+T细胞水平。再刺激使得细胞活性降低并接近细胞凋亡。
因此，需要制备在活化时增加抗原特异性T细胞增殖和存活的用于过继免疫治疗的T细胞群的方法。
发明内容
本发明涉及一种用于体外激发适合施用于肿瘤患者的抗原特异性T辅助1(Th1)细胞或细胞毒性T细胞(CTL)的方法。所述方法包括共培养来自待治疗的患者的靶T细胞、自体单核细胞来源的树突细胞、自体或同种异体肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或肽和同种异体淋巴细胞。所述同种异体淋巴细胞针对来自患者的抗原提呈细胞(APC)上的MHC I类和/或MHC II类抗原致敏，或者针对来自非相关血液供者的APC致敏，所述非相关血液供者表达至少一种与来自待治疗的患者的APC上表达的MHC II类抗原相同的MHC II类抗原。
本发明也涉及通过所述方法可获得的抗原特异性TH1细胞和/或CTL及其用途。
附图说明
图1说明，在常规MLR中照射的同种异体外周血单核细胞(PBMC)上表达的MHC抗原致敏的淋巴细胞(＝同种异体致敏的同源异体淋巴细胞；ASAL)显著增强了在共培养的相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上CD70的表达。
图2说明，γ射线照射的ASAL增强了共培养的相对于用于引发ASAL的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上CD70的表达。
图3说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养诱导大量IL-12产生。
图4说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养诱导大量IFN-γ产生。
图5说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养诱导大量IL-2产生。
图6说明，IL-2、IL-12和IFN-γ的产生，以及作为成熟单核细胞来源的DC与去除CD4+、CD8+或CD56+淋巴细胞的ASAL共培养的结果。
图7说明，ASAL与相对于用于引发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养，增加了非致敏的同种异体CD8+T细胞的增殖反应。
图8显示，通过流式细胞术确定的肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞的百分数。A：右上角显示，来自HER-2阳性乳腺癌患者的HER-2特异性细胞毒性淋巴细胞的诱导。与抗原负载自体(相对于CD8+靶细胞)DC和照射的ASAL共培养9天后，25.2％的总的CD8+靶细胞成为肿瘤特异性CTL。B：右上角显示，在没有DC负载Her2肽的对照实验中，Her2-特异性细胞毒性淋巴细胞的频率。培养9天后，仅0.4％的总的CD8+T细胞成为肿瘤特异性CTL。(右上角加上右下角代表总的CD8T细胞群。)
图9说明，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为自体的B细胞再刺激这些CD8+靶细胞时，向相对于在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间用于激发ASAL的照射PBMC为自体的单核细胞来源DC加入照射的ASAL，导致CD27表达同种异体反应CD8+靶细胞数目增加。
图10说明，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为自体的B细胞再刺激这些CD8+靶细胞时，向相对于在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间用于引发ASAL的照射PBMC为自体的照射PBMC加入照射的ASAL，导致细胞凋亡(膜联蛋白-V-阳性)靶细胞数目降低。
图11说明，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为自体的B细胞再刺激这些同种异体反应CD8+靶细胞时，向相对于在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间用于引发ASAL的照射PBMC为自体的照射单核细胞来源DC加入照射的ASAL，导致更强的(6倍)二次增殖反应。
图12说明，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为自体的B细胞再刺激这些同种异体反应CD8+靶细胞时，向相对于在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间用于引发ASAL的照射PBMC为自体的照射单核细胞来源DC加入照射的ASAL，导致IFN-γ产生大量增加。
定义
在描述本发明前，应该理解由于本发明的范围仅限于所述权利要求和其等同物，文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的而不意受到限制。
必需注意，除了上下文清楚指明外，在这个说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
并且，术语“约”用于指给定值的+/-2％的误差，优选+/-5％，适当时，最优选+/-10％的数值。
本发明的上下文中，术语“抗原特异性”涉及由在自身MHC分子上存在的短的独特肽序列的独特T细胞受体(TCR)的特异的识别/结合。
本发明的上下文中，术语“激发”和“活化”涉及通过用有或没有同时存在“辅助”细胞的抗原提呈细胞刺激的原初抗原特异性T细胞中发生的程序性活化过程。
本发明的上下文中，术语“应答细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括但不限于通过活化和/或增殖应答共培养的同种异体PBMC的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
本发明的上下文中，术语“致敏细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括通过共培养的同种异体细胞，包括PBMC的预活化的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
本发明的上下文中，术语“靶细胞”涉及通过同种异体APC或抗原提呈自体APC激发/活化的CD4+或CD8+T细胞。患者淋巴细胞(靶细胞)收集的部位可以，例如为外周血、肿瘤、肿瘤引流淋巴结或骨髓。
本发明的上下文中，与单核细胞来源的DC相关的术语“成熟”涉及用微生物产物(如LPS)或炎性介质(如TNF-α和/或IL-1β)刺激未成熟DC诱导的“成熟标记物”(包括但不限于CD40、CD86、CD83和CCR7)的表达。
未成熟DC是表征为高内吞活性和低T细胞活化潜力的细胞。未成熟DC经常取样(sample)于周围环境的病原体如病毒和细菌。未成熟DC吞噬病原体并将它们的蛋白质降解成小碎片，在成熟时使用MHC分子将那些片段提呈给它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中作为共受体的细胞表面受体，如CD80、CD86和CD40，极大增强了它们活化T细胞的能力。它们也上调CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞经过血流进入脾或通过淋巴系统进入淋巴结的趋化因子受体。在此，它们作为抗原提呈细胞：通过与非抗原特异性共刺激信号一起，向其提呈源自病原体的抗原，它们活化辅助性T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。成熟的DC可能由单核细胞产生，所述单核细胞为身体中循环的白细胞，并且依赖于正确的信号，可以转变成DC或巨噬细胞。而单核细胞由骨髓中的干细胞形成。单核细胞来源的DC可以从外周血单核细胞体外产生。
本发明的上下文中，术语细胞的“失活”用于指使细胞不能进行细胞分裂以形成子代。然而，细胞能够对刺激物应答，或生物合成和/或分泌细胞产物(如细胞因子)。失活方法是本领域已知的。优选的失活方法为用毒素(如丝裂霉素C)处理或照射，如γ射线照射处理。固定或透性化并且不能分裂的细胞也是失活细胞的实例。
本发明上下文中，术语“混合淋巴细胞反应”、“混合淋巴细胞培养”、“MLR”和MLC可互换使用，指的是包含同种异型不同的最低两个不同细胞群的混合物。至少一个同种异型不同的细胞是淋巴细胞。将所述细胞在合适的条件下一起培养一段时间以产生淋巴细胞的刺激。MLR的惯常的目的是提供同种异体刺激，如可引发淋巴细胞的增殖；但是除非特别指明，在培养期间的增殖是不需要的。在适当的上下文中，这些术语或者可以指源自这种培养的细胞混合物。
如文中使用的，术语“治疗”指的是试图改变待治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。期望的效果包括防止疾病的发生或重发，缓解症状和减少疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改进或减轻疾病状态和缓解或改善预后。
术语“抗原提呈细胞”、“APC”包括能够诱导一个或多个抗原提呈，优选与I类MHC分子相关的完整、完全细胞以及其它分子(所有同种异体来源)，以及能诱导同种异体免疫应答的所有类型单核细胞。优选完全活细胞用作APC。合适的APC的实例包括但不限于，全细胞如单核细胞、巨噬细胞、DC、单核细胞来源的DC、巨噬细胞来源的DC、B细胞和髓性白血病细胞，例如细胞系THP-1、U937、HL-60或CEM-CM3。据说髓性白血病细胞提供所谓的前单核细胞。
术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”互换使用，并且为单数或复数形式，如在本说明书和权利要求书中出现的，指的是进行恶性转化使其对宿主生物体致病的细胞。原代癌细胞(即，自恶性转化部位附近获得的细胞)可以通过良好建立的技术，特别是组织学检查可以容易的与非癌细胞区分开。如文中使用的，癌细胞的定义不仅包括原代癌细胞，还包括任何源自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，和源自癌细胞的体外培养物和细胞系。当指通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是例如，通过如CAT扫描、磁共振成像(MRI)、X-射线、超声或触诊过程在肿瘤团的基础上可检测的肿瘤。与本发明相关的肿瘤/癌症的非限制性实例为乳腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成纤维细胞瘤、神经肉瘤、肺癌、子宫癌、淋巴瘤、前列腺癌、黑色素瘤、睾丸肿瘤、星形细胞瘤、异位激素产生肿瘤，卵巢癌、膀胱癌、韦姆氏瘤、胰腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、阴道癌、滑膜肉瘤、血管活性肠肽分泌肿瘤、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、头和颈鳞状细胞癌、口腔癌、口腔白斑、食管癌、胃癌或转移性癌症、白血病。特别优选前列腺癌和乳腺癌。
本发明的上下文中，术语“培养”指的是在多种培养基中体外增殖细胞或生物体。应该理解，在培养中生长的细胞后代可以与亲代细胞不完全相同(形态、遗传或表性的)。合适的培养基可以由本领域技术人员选择，以及这种培养基的实例为RPMI培养基或Eagles最低基础培养基(EMEM)。
术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”指的是编码需要用于抗原提呈至T细胞和用于快速移植物排斥的细胞表面分子的基因复合体。在人中，MHC复合体也已知为HLA复合体。由MHC复合体编码的蛋白质被称为“MHC分子”并且被分类为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括由与β2-微球蛋白非共价连接的MHC中编码的链组成的膜异二聚化蛋白质。I类MHC分子由几乎所有有核细胞表达，并且显示在抗原提呈至CD8+T细胞中起作用。I类分子包括人中的HLA-A、-B和-C。I类分子通常结合长度为8-10个氨基酸的肽。II类MHC分子也包括膜异二聚化蛋白质。
已知II类MHC分子也参与抗原提呈至CD4+T细胞，并且在人中，包括HLA-DP、-DQ和DR。II类分子通过结合长度为12-20个氨基酸的肽。术语“MHC限制”指的是允许T细胞仅识别在被加工后的抗原，并且产生的抗原肽在与自身I类或自身II类MHC分子相关展示的特性。
文中使用的术语“疫苗”、“免疫原”或“免疫原性组合物”指的是，当施用于人或动物受试者时能赋予一定程度特异免疫力的化合物或组合物。如本公开中所使用的，“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指的是包含至少一个细胞群，任选失活的细胞群，作为活性成分的组合物。本发明的免疫原和免疫原性组合物是有活性的，这表示它们能刺激至少部分由宿主的免疫系统介导的特异性免疫学反应(如抗肿瘤抗原或抗癌细胞反应)。免疫学反应可以包含抗体、免疫反应性细胞(如辅助/诱导或细胞毒性细胞)或其任意组合，并且优选针对在治疗针对的肿瘤上存在的抗原。可以通过施用单剂量或多剂量在受试者中引起或再刺激所述反应。
如果能a)在首次被试验的个体中产生针对抗原(如肿瘤抗原)的免疫反应；或b)如果没有施用所述化合物或组合物，将不发生个体中重组、增强或维持免疫应答，那么化合物或组合物是“免疫原性的”。当施用单剂量或多剂量时，如果能达到这些标准的任一个，组合物是免疫原性的。
具体实施方式
本发明涉及同种异体致敏的同种异体淋巴细胞(ASAL)的制备，以促进抗原特异性T细胞在其通过自体抗原提呈细胞，包括树突细胞(DC)的活化期间的增殖和存活的增加。
本发明基于体外研究，所述体外研究使用来自人健康血液供者和乳腺癌患者的PBMC和其亚群，证实在诱导抗原特异性人CD8+T细胞应答中ASAL的阳性调节作用。使用体外模型中的同种异体，追踪在ASAL存在下同种异体反应性CD8+T细胞的增殖和存活，增殖能力增加5倍以上，而且细胞凋亡性细胞死亡降低10-5％。
加入ASAL导致强烈上调抗原提呈DC上共刺激分子CD70的表达和IL-12和IFN-γ的产生，所述IL-12和IFN-γ两个因子对T细胞发展成为1型CD4+和CD8+T细胞有公知的积极影响。此外，加入ASAL也导致产生T细胞的公知生长因子IL-2。特别地，最近显示，CD70介导的相互作用在连续轮的整个分裂过程中促进活化T细胞的存活，从而有助于效应T细胞的累积。
本发明涉及用于体外激发适合施用于肿瘤患者的抗原特异性T辅助1(Th1)细胞或细胞毒性T细胞(CTL)的方法。所述方法包含共培养来自待治疗患者的靶T细胞和自体单核细胞来源的DC、自体或同种异体肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或肽和同种异体淋巴细胞，所述同种异体淋巴细胞针对来自患者的抗原提呈细胞(APC)上的MHC I类和/或MHC II类抗原致敏，或针对来自非相关血液供者的APC致敏，所述非相关血液供者表达至少一种与来自待治疗患者的APC上表达的MHC II类抗原相同的MHC II类抗原。
ASAL为获得自混合淋巴细胞反应并且与单核细胞来源的DC和靶细胞一起培养的应答细胞。所述ASAL是与所述患者同种异体的，并且选自外周血淋巴细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞。靶细胞为单核细胞来源的DC自体的CD4+和/或CD8+T细胞。单核细胞来源的DC负载有肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或多肽或病毒来源抗原。
进一步加入ASAL导致表达高水平CD27的靶CD8+T细胞群的富集。CD27+CD8+T细胞由于其提供用于增殖的抗原驱动自分泌信号，其代表潜在的用于过继免疫治疗的更有效的CTL(细胞毒性T细胞)。这种辅助性非依赖CD8T细胞不需要IL-2形式的外源辅助或CD4+T细胞以存活和扩增。因此，本发明通过向受试者提供CD8+T细胞群，提供了用于治疗免疫介导疾病的方法，所述CD8+T细胞群在没有或少量存在额外的细胞因子(如IL-2)或CD4+T细胞时，被程序化用于强细胞毒性活性。所述方法特别用于在体扩增细胞溶解性、抗原特异性CD8+T细胞，但是也用于扩增肿瘤特异性CD4+T细胞。
以CD8+T淋巴细胞总数的百分数表示的细胞溶解性抗原特异CD8+T细胞的百分数优选至少约5％更优选至少约10％，更优选至少约15％更优选至少约20％和最优选至少约25％。
更具体而言，本发明的方法涉及用于体外激发适合用于施用于肿瘤患者的抗原特异Th1细胞或CTL的方法，所述方法包含下述步骤：
a)将来自患者的失活抗原提呈细胞与来自健康供者的外周血单核细胞一起培养，
b)在允许单核细胞成熟为成熟DC的组合物中培养来自患者的单核细胞(下面进一步描述所述组合物)，和
c)将同种异体致敏淋巴细胞，包括但不限于来自步骤a)的CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞与来自步骤b)的成熟DC一起培养。
通过首先在包含GM-CSF和IL-4的组合物中培养单核细胞约2-7天，优选约5天以获得未成熟DC，获得单核细胞来源的DC，随后加入能使未成熟DC成为成熟DC的第二组合物，通过培养至少约12-72小时，以及优选约24-48小时。所述第二组合物包含能使未成熟DC成为成熟单核细胞来源的DC的组分，所述成熟单核细胞来源的DC可用于活化CD4+和CD8+T细胞。在一个实施方式中，所述第二组合物包含TNFα、IL-1β、干扰素γ、干扰素β和TLR3配体，如聚-I:C(Mailliard等，Alpha-type-elpolarized DCs：a novel immunization tool with optimized CTL-inducingactivity.Cancer Res.2004；64：5934-5937.)。在另一个实施方式中，第二种组合物包含干扰素γ、TLR3和/或TLR4配体和TLR7和/或TLR8配体和/或TLR9配体。TLR3配体的非限制性实例是聚-I:C，TLR7/8配体的非限制性实例是R848，以及TLR9配体的非限制性实例是CpG。
同种异体淋巴细胞的致敏作用是通过传统的混合淋巴细胞反应(MLR或MLC-混合淋巴细胞培养物)诱导的，所述传统的混合淋巴细胞反应包含培养失活的同种异体抗原提呈细胞与来自健康供者的外周血单核细胞(PBMC)。进行MLR是本领域技术人员公知的(Jordan WJ，RitterMA.Optimal analysis of composite cytokine responses during alloreactivity.JImmunol Methods 2002；260：1-14)。在MLR中，来自两个个体的PBMC(主要是淋巴细胞)在组织培养中混合在一起数天。来自不相容个体的淋巴细胞将相互刺激以显著增殖(例如通过氚胸腺嘧啶摄取进行测定)，而来自不相容个体的淋巴细胞则不相互刺激。在单向MLC中，来自个体之一的淋巴细胞被失活(通过用毒素，如丝裂霉素或照射，如γ射线照射处理)从而仅使未处理的剩余细胞群应答外源组织相容性抗原而增殖。
在MLR中使用的抗原提呈细胞选自PBMC和单核细胞来源DC。单核细胞来源DC来自患者或来自具有与患者的HLA-DR抗原匹配的MHCII类(HLA-DR)抗原的健康供者。
肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或肽选自来自患者的杀死的肿瘤细胞、与患者肿瘤相同类型的同种异体肿瘤细胞和分离和纯化的肿瘤蛋白质或肽。分离和纯化的肿瘤蛋白质或肽是本领域技术人员公知的。在一个实施方式中，肿瘤材料是通过转染编码肿瘤蛋白质的mRNA负载至单核细胞来源DC中的肿瘤蛋白质。
肿瘤相关肽的实例是源自HER-2蛋白(与乳腺癌相关)、PSA(与前列腺癌相关的前列腺特异抗原)、MART-1蛋白(与恶性黑色素瘤相关)的肽和源自“通用”肿瘤相关蛋白质存活素和p53的肽，肿瘤相关肽/蛋白质的进一步的实例是本领域技术人员公知的。
在本发明的方法中，细胞共培养约20天，优选约4-20天，优选6-20天，更优选7-14天，以及最优选约9-14天。
在本发明的一个实施方案中，向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗-IL-4和/或IL-21，以优化细胞增殖和存活。
通过一起培养所述细胞和新单核细胞来源DC、新致敏的同种异体淋巴细胞和任选地向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗-IL-4和/或IL-21，也可以再刺激激发的抗原特异性Th1细胞或CTL。
本发明也涉及通过上述方法可获得的免疫原性组合物以及通过上述方法可获得的抗原特异性Th1细胞和/或CTL。
抗原特异性TH1细胞和/或CTL适合施用于患者，并且优选具有至少以下特征之一：
-能增殖
-表达记忆标记物CD45RO
-表达低水平的细胞凋亡标记物膜联蛋白-V(即，通过FACS测定，至多40％，优选至多20％的细胞对膜联蛋白-V表现出阳性染色)
-在细胞表面表达CD27和/或CD28
通过本发明的方法可获得的抗原特异性TH1细胞和/或CTL进一步的能力是体外杀死肿瘤细胞的能力。
此外，本发明涉及通过本发明或如上所限定的方法可获得的抗原特异性TH1细胞和/或CTL的用途，用于治疗肿瘤或用于引发人中的抗肿瘤免疫学反应，以及用于制备用于治疗肿瘤或用于引发人中的抗肿瘤免疫学反应的药物。可以在第一次刺激后或可选择地再刺激之后，施用所述TH1细胞和/或CTL。在一个实施方式中，TH1细胞和/或CTL与治疗性癌症疫苗组合施用。
在人受试者的治疗中使用用于过继细胞治疗的T细胞群的方法是本领域临床医生已知的。根据文中描述的和本领域中已知的方法制备的T细胞群可以用于这种方法。例如，使用肿瘤浸润淋巴细胞与MART-1抗原特异T细胞的过继细胞治疗已经在临床上试验过(Powell等，Blood105：241-250，2005)。肾细胞癌患者已经被接种经照射的自体肿瘤细胞。将收获的细胞继而用抗CD3单克隆抗体和IL-2活化，然后再施用于患者(Chang等，J.Clinical Oncology 21：884-890，2003)。
在初始体外DC介导的激发期间暴露于ASAL时，在再刺激后，抗原激发T细胞经历增殖增加和细胞凋亡降低。因此，本发明也涉及如果在疫苗接种前和/或疫苗接种期间过继转移回患者，疫苗接种后用于增强次级T细胞应答的方法。
本发明也提供了制备用于过继免疫治疗的T细胞群的方法，包括(通过病毒转导、转染、电穿孔或其它引入遗传材料的方法)将T细胞改造以表达识别靶抗原的T细胞受体或嵌合T细胞受体；在致敏同种异体淋巴细胞存在下，用抗原负载的DC活化这些改造的T细胞；在培养物中扩增这些细胞，以及将这些细胞再引入回患者。
本发明也提供用于改善癌症疫苗治疗的方法。许多肿瘤表达可以潜在作为用于被免疫系统破坏的靶的外源抗原。癌症疫苗在包含体液和细胞组分的受试者中产生全身肿瘤特异性免疫反应。所述反应通过在远离肿瘤的部位或局部性肿瘤的部位施用疫苗组合物由受试者自身免疫系统引发。抗体或免疫细胞结合肿瘤抗原并裂解肿瘤细胞。然而，在疫苗接种癌症患者时，仍然需要增加T细胞应答。因此，在疫苗接种前或疫苗接种时，过继转移预活化的具有高增殖潜力的细胞凋亡抗性肿瘤特异性T细胞可以增强体内疫苗介导的免疫反应。
根据本发明的组合物可以与治疗性癌症疫苗组合施用。这种治疗性癌症疫苗的非限制性实例是体外增殖的和荷瘤的DC、细胞因子生成肿瘤细胞、DNA疫苗和使用与肿瘤抗原组合的TLR-配体的疫苗。
通过本发明的方法可获得的细胞可以直接施用于生物体，如人，以增加抗原特异性T细胞在其活化时的增殖和存活。这些细胞，常常与药学可接受的载体通常以用于将细胞引入最终与哺乳动物血液或组织细胞接触的任何途径施用。
适合用于肠胃外施用，如，例如通过静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下和肿瘤内途径施用的制剂和载体包括含水等渗无菌注射溶液以及含水和非含水无菌悬浮液，所述含水等渗无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述制剂与接受者的血液等渗的制剂的溶质，所述含水和非含水无菌悬浮液可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。静脉内施用是施用本发明的TH1细胞和CTL的优选方法。
在本发明的上下文中，施用于患者的TH1细胞和CTL的剂量应当足以增强患者的免疫反应。因此，向患者施用足以引起对肿瘤抗原有效的免疫反应和/或减轻、降低、治愈或至少部分阻止疾病的症状和/或并发症的量的细胞。足够达到所述效果的量被定义为“治疗有效量”。所述剂量通过产生的细胞的活性和患者的状况，以及待治疗的患者的体重或表面积确定。在治疗或预防疾病(如癌症)中确定待施用的细胞的有效量时，医生需要评价疾病的进展和针对任何相关肿瘤抗原免疫反应的诱导。
与现有技术的方法相比，本发明具有几个主要优点。本发明提供不需要再刺激的高水平肿瘤特异性CD8+T细胞。再刺激使细胞活性降低并且使其接近细胞凋亡。因此，有效扩增肿瘤特异性T细胞而不需要再刺激的方法是有利的。此外，不需要再刺激所述细胞，肿瘤特异性T细胞可以使患者在较短时间恢复，因此更节省成本。此外，使用根据本发明的方法，不需要消耗抑制细胞或加入外源性生长因子(其是非常昂贵的过程)。
本发明通过下述非限制性实例进行进一步说明。
实施例
实施例1
材料和方法：在组织培养瓶中通过在无血清X-VIVO 15培养基中以1∶1的比例，将来自健康血液供者的γ射线照射的PBMC与来自同种异体供者(相对于健康供者)的未照射的PBMC共培养5-7天，在标准单向混合淋巴细胞反应(MLR)中产生同种异体致敏的同种异体淋巴细胞(ASAL)。对于未成熟DC的增殖，在密度梯度(Lymphoprep，Nycomed公司，挪威奥斯陆)上分离获自健康血液供者的外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC在AIM-V(Invitrogen公司，英国佩斯里)培养基上重新悬浮，以2.5×106个细胞每孔铺在24孔塑料培养板中，并使其粘附2小时。除去非粘附的细胞，并将剩余的粘附的单核细胞在添加有重组人GM-CSF和IL-4(R&D Systems，Abingdon，UK；均为1,000U/mL)的AIM-V培养基中培养4-6天。在孵育的最后24小时，通过添加IFN-α(3,000U/mL)、IFN-γ(1,000U/mL)、TNF-α(50ng/mL)、IL-1β(25ng/mL)(均来自R&D Systems公司)和p-I:C(Sigma-Aldrich公司；20μg/mL)的培养基诱导未成熟DC的成熟。
通过FACS分析确定，成熟的DC群均含有70％以上的CD83+DC。
洗涤后，成熟的DC与未照射的或γ射线照射(25Grey)的ASAL在X-VIVO 15培养基中共培养24小时，并通过FACS进行分析。
通过在无血清培养基(X-VIVO 15)中用γ射线照射的PBMC作为刺激细胞和未照射的PBMC作为应答细胞进行原代单向MLR，进行同种异体淋巴细胞的致敏。使用PE-结合的抗人CD70用于FACS研究。
结果：如图1所示，ASAL显著增强了相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟单核细胞来源DC上CD70的表达。
如图2所示，类似地，γ射线照射的ASAL增强了相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟单核细胞来源DC上CD70的表达。
如图3、4和5所示，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟DC共培养，诱导大量产生IL-12、IFN-γ和IL-2。
实施例2
材料和方法：使用照射的同种异体PBMC作为刺激物，在常规MLR7天期间产生ASAL(参见实施例1)。收获和照射后，将ASAL(“MLR”)或去除CD4+、CD8+或CD56+(NK/NKT)的ASAL混合群与成熟的同种异体单核细胞来源DC(相对于用于引发ASAL的PBMC为自体的)共培养。24小时后收集共培养的上清液，随后测定IL-2、IL-2和IFN-γ的产生。
结果：发现IL-2的产生为严格的CD4依赖性(图6A)，而IL-12产生(图6B)显示完全没有ASAL-依赖性，并且IFN-γ产生(图6C)显示在ASAL群中部分依赖共培养的和同种异体激发的CD4+、CD8+和CD56+(NK/NKT)。
实施例3
材料和方法：通过塑料粘附单核细胞产生未成熟DC。在添加均为1000U/mL的IL-4和GM-CFS的
DC中培养单核细胞7天。在孵育的最后2天期间，通过加入50ng/mL TNF-α、25ng/mL IL-1β、50ng/mLIFN-γ、3000U/mL IFN-α和20μg/mL聚I:C诱导DC的成熟。
以1∶1的比例在X-VIVO 15中共培养γ射线照射的PBMC与未照射的相对于DC供体的自体PBMC 7天，在单向混合淋巴细胞反应中产生ASAL。
从在添加50ng/mL IL-15(终浓度为0.5×106淋巴细胞/mL)的X-VIVO15中培养7天的自体PBMC中通过阳性选择分离出CD8+T淋巴细胞。离心PBMC，并在PBS-0.5％BSA-2M EDTA中重新悬浮至终浓度为1×107/80μL。将PBMC与CD8+微珠(Miltenyi Biotec公司)于4℃下孵育15分钟，洗涤，重新悬浮并置于LS MACS柱上。未标记的细胞洗涤通过并收集含有CD8+淋巴细胞的流出物。在预温的PBS-1％BSA中重新悬浮分离的CD8+T淋巴细胞至浓度1×106/mL，并于37℃下用10μM CFSE(Molecular probes Invitrogen公司)染色10分钟。通过加入5ml冰冷的X-VIVO 15培养基终止染色并在冰上孵育5分钟。在培养基中洗涤细胞2次，并重新悬浮至终浓度1×106/ml。以4∶4∶1的比例将染色的CD8+T淋巴细胞与照射的同种异体致敏同种异体PBMC和成熟的自体DC共培养4-7天。培养后，收获淋巴细胞，并用CD3-APC-H7、CD8-PerCP、CD27-APC和膜联蛋白V染色。通过流式细胞术确定增殖的CD8+T淋巴细胞的百分数，并用总淋巴细胞百分数表示。
结果：如图7所说明的，加入照射的“同种异体辅助体”(＝ASAL)强烈增加了CD8+T细胞的分裂(更多细胞具有低荧光强度)。因此ASAL增加了单核细胞来源DC诱导同种异体CD8+T细胞增殖反应的能力。
实施例4
材料和方法：通过塑料粘附单核细胞产生未成熟DC。在添加均为1000U/mL的IL-4和GM-CFS的
DC中培养单核细胞7天。在孵育的最后2天期间，通过加入50ng/mL TNF-α、25ng/mL IL-1β、50ng/mLIFN-γ、3000U/mL IFN-α和20μg/mL聚I:C诱导DC的成熟。洗涤不粘附的细胞，即CD8+淋巴细胞，并以0.5×106/mL终浓度在添加50ng/mLIL-15的X-VIVO 15中培养7天。以1∶1的比例在X-VIVO 15中，将γ射线照射的自体PBMC与未照射的相对于DC供体的同种异体PBMC共培养7天，在单向混合淋巴细胞反应中(MLR)产生同种异体致敏的同种异体淋巴细胞。
收获成熟DC，并于37℃下在X-VIVO 15中负载20μg/mL HER-2肽(KIFGSLAFL)1小时。以1∶4∶4的比例通过共培养DC与照射的MLR和非粘附PBMC，负载肽的成熟DC用于诱导自体HER2特异细胞毒性T淋巴细胞。将细胞在含有或不含有50U/mL IL-2和10ng/mL IL-7的
DC中培养9天。培养后，收获淋巴细胞，洗涤，并与HER-2特异PE-结合的五聚体(A*0201KIFGSLAFL)于室温下黑暗孵育10分钟。将细胞洗涤，并随后用CD3-FITC和CD8-APC进行染色。通过流式细胞术确定HER-2阳性细胞毒性T淋巴细胞的百分数，并用CD8+T淋巴细胞总数的百分数表示。
结果：图8显示了用自体DC、本发明的同种异体致敏的同种异体淋巴细胞以及含有Her-2肽(A)和不含有HER-2肽B刺激的肿瘤特异性CTL的扩增。在各散点图的右上部分显示Her2+/CD8+细胞(没有负载Her2肽的DC的同种异体激发PBMC为0.4％以及负载Her2肽的DC的同种异体致敏PBMC为25.2％)。
与现有技术中肿瘤特异性CTL的扩增相比，在仅一次刺激后获得这个水平的扩增是非常不一般的。参见例如Ho等(Journal ofImmunologicalMethods，310(2006)，40-50)，其中，需要两次再刺激以获得18.8％的肿瘤特异性CD8+细胞的扩增。类似地，Gritzapis等(J.Immunol.，2008；181；146-154)需要再刺激以功能性地达到扩增肿瘤特异性CD8+细胞。
实施例5
材料和方法：参见实施例1的材料和方法。
在共培养DC、照射的ASAL(对于DC为同种异体)6天后分离CD8+淋巴细胞(使用抗体包被的磁珠阴性选择)，随后用B细胞(对于在初次刺激期间使用的DC是自体的)再刺激，并进行用于表达CD27和膜联蛋白-V的染色。用FACS进行随后的分析。
结果：如图9显示，在用B细胞再刺激CD8+细胞时，在初次刺激期间加入ASAL极大地增加了CD27的表达。
在用B细胞再刺激CD8+细胞时，初次刺激期间加入ASAL极大地降低了膜联蛋白-V的表达(参见图10)。
实施例6
材料和方法：参见实施例5中的材料和方法。
在用B细胞再刺激前，致敏的和分离的CD8+细胞用3H-胸苷脉冲。
结果：如图11所示，再刺激后，在初次刺激期间加入ASAL强烈地增加了同种异体反应性CD8+细胞的增殖反应(通过掺入3H-胸苷cpm/min，第3天测定)。
实施例7
材料和方法：参见实施例5的材料和方法。
在将B细胞和预活化的CD8+细胞共培养2天后，收集培养上清液并通过常规ELISA(R&D Systems公司)分析IFN-γ的产生。
结果：图12显示，再刺激后，在初次刺激期间加入ASAL极大地增加了由同种异体反应性CD8+细胞的增加的IFN-γ的产生。
虽然文中详细公开了特定实施方式，其已经通过实施例方式仅用于说明目的完成，并且不意于限制随后所附权利要求的范围。具体而言，本发明人预期可以对本发明进行多种替代、改变和修饰而不背离权利要求所限定的本发明的实质和范围。
Claims (21)
1.一种用于体外激发适合施用于肿瘤患者的抗原特异性T辅助1(Th1)细胞或细胞毒性T细胞(CTL)的方法，所述方法包含共培养来自待治疗患者的靶T细胞、自体单核细胞来源的树突细胞、自体或同种异体肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或肽，以及同种异体淋巴细胞，所述同种异体淋巴细胞针对来自患者的抗原提呈细胞(APC)上的MHC I类和/或II类抗原致敏，或针对来自不相关血液供者的APC致敏，所述不相关血液供者表达至少一种与来自待治疗患者的APC上表达的MHC II类抗原相同的MHC II类抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将包含培养失活的同种异体抗原提呈细胞与来自健康供者的外周血单核细胞(PBMC)进行混合淋巴细胞反应诱导所述致敏作用。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述抗原提呈细胞选自PBMC和单核细胞来源的树突细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述单核细胞来源的树突细胞来自患者或来自具有与所述患者HLA-DR抗原匹配的MHC II类(HLA-DR)抗原的健康供者。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过首先在包含GM-CSF和IL-4的组合物中培养单核细胞约1-7天以获得未成熟树突细胞，以及随后加入能使未成熟树突细胞成为成熟树突细胞的第二组合物通过培养至少约12小时，可获得单核细胞来源的树突细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二组合物包含TNFα、IL-1β、干扰素γ、干扰素α或β和TLR3配体，如聚-I:C和/或TLR4配体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二组合物包含TNFα、干扰素γ、TLR3配体和/或TLR4配体和TLR7和/或TLR8激动剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述TLR3配体是聚-I:C，以及TLR8激动剂是R848。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤材料或肿瘤相关蛋白质或肽选自来自患者的杀死的肿瘤细胞、与患者肿瘤相同类型的同种异体肿瘤细胞和已知的分离和纯化的肿瘤蛋白质或肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤相关肽是源自HER-2蛋白、PSA蛋白、MART-1蛋白、p53蛋白和/或存活素的肽。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤材料是通过编码肿瘤蛋白质的mRNA转染的负载在成熟树突细胞中的肿瘤蛋白质。
12.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述细胞培养约4-20天。
13.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗-IL-4和/或IL-21。
14.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，通过将所述细胞与新单核细胞来源的树突细胞、新致敏的同种异体淋巴细胞一起培养和任选地向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗-IL-4和/或IL-21再刺激，激活抗原特异性Th1细胞或CTL。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法获得的抗原特异性TH1细胞和/或CTL。
16.适合施用于患者的抗原特异性TH1细胞和/或CTL，其中，所述TH1细胞和/或CTL：
-具有增殖能力
-至多40％的细胞应该表现膜联蛋白-V阳性染色，和/或
-在其细胞表面表达CD45RO和CD27和/或CD28。
17.根据权利要求15或16所述的抗原特异性TH1细胞和/或CTL，用于治疗肿瘤或用于在人中引发抗肿瘤免疫学反应。
18.根据权利要求15或16所述的抗原特异性TH1细胞和/或CTL在用于制造用于治疗肿瘤或用于在人中引发抗肿瘤免疫学反应的药物的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述TH1细胞和/或CTL与治疗性癌症疫苗组合施用。
20.根据权利要求18-19任一项所述的用途，其中，在第一次刺激后施用TH1细胞和/或CTL。
21.根据权利要求18-19任一项所述的用途，其中，在再刺激后施用所述TH1细胞和/或CTL。
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