CN114599378A - 用于肿瘤的治疗和/或预防的组合物 - Google Patents

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Abstract

在一实施方式中，本发明的课题是提供具有针对肿瘤的治疗和/或预防效果的新的细胞免疫疗法。在一实施方式中，本发明涉及用于受检体中的肿瘤的治疗和/或预防的、包含同种异体CD4+T细胞的组合物，所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子，并且(b)包含通过与抗原呈递细胞的离体(ex vivo)共培养而被激活的细胞，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。

Description

用于肿瘤的治疗和/或预防的组合物
技术领域
在一实施方式中，本发明涉及用于受检体中的肿瘤的治疗和/或预防的包含同种异体CD4+T细胞的组合物、该组合物的制造方法、或受检体中的肿瘤的治疗和/或预防方法。
背景技术
过去10年中提出的免疫/细胞疗法定位于针对难治性癌的有希望的治疗法，其中几个已经能够临床利用。但是，例如免疫检查点阻断疗法对多种癌/肿瘤的有效性为15％左右，对于大多数患者未获得效果(非专利文献1)。例如，嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor:CAR)T细胞疗法虽然是划时代的方法，但由于有希望的靶标抗原有限，不能向B细胞性血液肿瘤以外扩大适应性。另外，对缺失了CAR-T细胞的靶标抗原的肿瘤细胞无效。进而，是非常昂贵的个性化医疗，尚不能一般地广泛利用。
癌治疗的最终目的是压制癌并持续地防止复发，为了实现该目的，理想的是诱导宿主自身的强的抗肿瘤免疫。
利用Cancer associated multiple peptides(癌相关的多个肽，CAMPs)的疫苗接种或利用由CAMPs脉冲而产生的自身树突状细胞的疫苗接种是用于实现上述目的的理论上的方法。然而，到目前为止的临床试验显示，对于这些利用了自身的免疫系统的癌疫苗接种，作为目的的效果有限(非专利文献2和3)。
近年，报告了多个使用同种异体CD4+T细胞来诱导宿主的抗肿瘤免疫的方法。例如，使用经丝裂霉素C钝化的非特异性的同种异体CD4+T细胞、或经CD3/CD28抗体而特异性地激活的同种异体CD4+T细胞的方法等，但均不能通过单次给药获得效果，宿主的免疫激活需要多次给药。另外，任何方法均特异性地激活宿主免疫，为了付与充分的肿瘤特异性而需要与癌疫苗疗法联用。因此，原理上与一直以来的癌疫苗疗法没有大的改变。(非专利文献4～6)
如上所述，作为针对难治性癌的治疗法，细胞/免疫疗法受到关注，但已有疗法的有效性有限，要求开发新的治疗法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Pitt JM.et al.Resistance Mechanisms to Immune-CheckpointBlockade in Cancer:Tumor-Intrinsic and-Extrinsic Factors.Immunity,2016,44:1255-69.
非专利文献2：Bezu L.et al.,Trial watch:Peptide-based vaccines inanticancer therapy.,Oncoimmunol.,2018,7:e1511506
非专利文献3：Rosenberg SA.et al.Cancer Immunotherapy:Moving BeyondCurrent VaccinesNat Med.,2004,Sep；10(9):909-15.
非专利文献4：Tang Y.et al.A tritherapy combination of inactivatedallogeneic leukocytes infusion and cell vaccine with cyclophosphamide in asequential regimen enhances antitumor immunity.J Chin Med Assoc.,2018,81(4):316-323.
非专利文献5：Har-Noy M.et al.Allogeneic CD3/CD28 cross-linked Th1memory cells provide potent adjuvant effects for active immunotherapy ofleukemia/lymphoma.Leuk Res,2009,33(4):525-38.
非专利文献6：Janikashvili N.et al.Allogeneic effector/memory Th-1cellsimpair FoxP3_regulatory T lymphocytes and synergize with chaperone-rich celllysate vaccine to treat leukemia.Blood,2011,117(5):1555-64.
发明内容
发明要解决的课题
在一实施方式中，本发明的课题是提供具有针对肿瘤的治疗和/或预防效果的新的细胞免疫疗法。
用于解决课题的手段
本发明者发现，同种异体CD4+T细胞诱导受检体的抗肿瘤免疫，能够对肿瘤发挥效果，所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子，并且是(b)通过与抗原呈递细胞离体(ex vivo)共培养而得的，所述抗原呈递细胞来自受检体或具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体，从而完成了本发明。
本发明包含以下实施方式。
(1)用于受检体中的肿瘤的治疗和/或预防的、包含同种异体CD4+T细胞的组合物，
所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子，并且(b)包含通过与抗原呈递细胞离体(ex vivo)共培养而得的细胞，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。
(2)根据(1)所述的组合物，所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
(3)根据(1)或(2)所述的组合物，用于肿瘤内给药。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的组合物的制造方法，包括将同种异体CD4+T细胞与抗原呈递细胞进行离体(ex vivo)共培养的工序，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。
本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-199195号的公开内容。
发明的效果
本发明的包含同种异体CD4+T细胞的组合物能够针对肿瘤发挥治疗和/或预防效果。
附图说明
图1显示将由BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行共培养，将该同种异体CD4+T细胞对皮下接种了肿瘤(B16F1、0.5×106个细胞)的C57BL/6小鼠的肿瘤内进行了给药的情况下的肿瘤体积(n＝5)。也显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝5)、和给药从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞的结果(自身)(n＝5)。箭头表示进行了CD4+T细胞的给药的肿瘤接种9天后(以下的图也同样)。
图2显示将由BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行共培养，将该同种异体CD4+T细胞对皮下接种了肿瘤(B16F1、0.5×106个细胞)的C57BL/6小鼠的肿瘤内进行了给药的情况下的生存率(n＝5)。也显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝5)、和给药从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞的结果(自身)(n＝5)。
图3显示将由BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行共培养，将该同种异体CD4+T细胞对皮下接种了肿瘤(B16F、0.5×106个细胞)的C57BL/6小鼠的肿瘤内进行了给药的情况下的体重变化率(n＝5)。也显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝4)。
图4显示将在第0天将B16F1对C57BL/6小鼠皮下接种1.0×106个细胞，在第8天用抗CD8抗体消耗宿主CD8+细胞，然后与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞共培养而得的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞对肿瘤内进行了给药的情况下的肿瘤体积(n＝4)。也显示未消耗宿主CD8+细胞的给药对照IgG抗体的对照的结果(n＝4)。
图5显示对初次将B16F1皮下接种0.5×106个细胞，给药与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞而生存下来的C57BL/6小鼠，在6个月后进行了第2次肿瘤接种(将B16F1皮下接种2.5×106个细胞)的情况下的肿瘤体积(n＝4)。也显示对过去未进行肿瘤接种和免疫疗法的原始态(naive)小鼠进行了肿瘤接种的对照的结果(n＝4)。
图6显示在C57BL/6小鼠的右侧腹部和左侧腹部皮下接种B16F1(分别1.0×106个细胞)，然后将与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞仅在左侧腹部的肿瘤内给药的情况下的各小鼠的左右分别的肿瘤体积(分别n＝5、A～E显示对照的各个体的结果，F～J显示给药了的各个体的结果)。
图7显示在C57BL/6小鼠的右侧腹部和左侧腹部皮下接种B16F1(分别1.0×106个细胞)，然后将与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞仅在左侧腹部肿瘤内给药的情况下的小鼠的生存率(分别n＝5)。
图8显示将由BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6或129X1小鼠来源的树突状细胞进行共培养，将该同种异体CD4+T细胞给药到接种有肿瘤(B16F1、1.0×106个细胞)的C57BL/6小鼠的肿瘤内的情况下的肿瘤体积。图8A显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝3)。图8B显示给药了与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体CD4+T细胞的结果(n＝3)。图8C显示给药了与129X1小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体CD4+T细胞的结果(n＝3)。
图9显示将由BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行共培养，在接种有肿瘤(B16F1、1.0×106个细胞)的C57BL/6小鼠的肿瘤内给药了所述同种异体CD4+T细胞的情况下的肿瘤体积。图中，细胞源冷冻表示在从C57BL/6小鼠的骨髓分离出的c-kit阳性细胞的阶段、和从BALB/c小鼠分离出的CD4+T细胞的阶段，在-80℃冷冻，在使用时解冻。另外，细胞制剂冷冻表示在制备与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的CD4+T细胞之后，在-80℃冷冻保存，在给药前解冻。图9A显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝2)。图9B显示给药了不冷冻保存细胞源和细胞制剂而得的同种异体CD4+T细胞的结果(n＝2)。图9C显示给药了细胞源冷冻同种异体CD4+T细胞的结果(n＝3)。图9D显示给药了细胞制剂冷冻同种异体CD4+T细胞的结果(n＝4)。
图10显示将从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞与BALB/c小鼠来源的树突状细胞进行共培养，将该同种异体CD4+T细胞给药到接种有肿瘤(Colon-26)的BALB/c小鼠的肿瘤内的情况下的肿瘤体积。图10A显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝3)。图10B显示给药了同种异体CD4+T细胞的结果(n＝3)。
图11显示将从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞与BALB/c小鼠来源的树突状细胞进行了共培养，将该同种异体CD4+T细胞给药到接种有肿瘤(Colon-26、5×104个细胞)的BALB/c小鼠的肿瘤内的情况下的生存率(n＝3)。也显示不进行CD4+T细胞的给药的对照的结果(n＝3)。
具体实施方式
在一个方案中，本发明涉及用于受检体中的肿瘤的治疗和/或预防的包含同种异体CD4+T细胞的组合物。所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子。另外，所述同种异体CD4+T细胞(b)包含通过与抗原呈递细胞离体(ex vivo)共培养而得的细胞，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。同种异体CD4+T细胞可以是实质上包含所述细胞的、或仅由所述细胞构成的。
本说明书中，“受检体”的物种不限定，可列举例如哺乳动物，例如人和恒河猴等灵长类、大鼠、小鼠、和褐家鼠等实验动物、猪、牛、马、绵羊、和山羊等家畜动物、以及犬和猫等宠物动物，优选为人。受检体可以是具有肿瘤、或怀疑具有肿瘤的受检体。受检体是否具有肿瘤、另外是否怀疑具有肿瘤，可以通过常规方法调查。在一实施方式中，受检体可以是具有肿瘤但经治疗的(即，具有复发的风险的)个体。
“肿瘤”是指良性肿瘤和恶性肿瘤，但在本说明书中，特别是指恶性肿瘤(癌)。“肿瘤”的种类不限定，可列举例如，腺癌、鳞癌、小细胞癌和大细胞癌等。具体地，作为肿瘤的种类，可列举例如，恶性黑色素瘤、口腔癌、喉癌、咽癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大肠癌(包含结肠癌和直肠癌)、小肠癌、膀胱癌、前列腺癌、精巢癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、胰癌、胆道癌、胆囊癌、脑肿瘤、骨肉瘤、以成神经细胞瘤为代表的幼儿肿瘤、白血病、淋巴瘤等。从能够实现后述的肿瘤内给药的角度，优选为固体肿瘤。肿瘤可以是通过其他疗法难以治疗的难治性肿瘤。另外，也可以时具有转移病变的难治性肿瘤。
本说明书中，所谓“同种异体(allogeneic)”，也表达为“同种异型”或“同种异系”，是指除了同卵双胞胎以外的相同物种的不同个体。
本说明书中，“自身(autologous)”也表述为“自己”，是指同一个体。
本发明的组合物优选作为有效成分包含同种异体CD4+T细胞。获得同种异体CD4+T细胞的方法不限定，例如可以使用本领域技术人员公知的方法获得。例如，可以通过血浆去除术从血液获得淋巴细胞级分后，由该淋巴细胞级分，使用与微珠结合了的抗CD4抗体，或者通过利用抗CD4抗体的流式细胞术等，从与受检体同种异体的个体获得同种异体CD4+T细胞。或者也可以通过由淋巴细胞级分除去CD4+T细胞以外的细胞来获得同种异体CD4+T细胞。
本说明书中，同种异体CD4+T细胞具有与受检体的MHC(主要组织相容性基因复合物)II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子。本说明书中，“MHC”是指在移植免疫中引发移植物排斥反应的细胞表面的抗原群，在人中作为人白细胞抗原(HLA)已知，在小鼠中作为H-2抗原(histocompatibility-2)已知。MHC存在I类分子和II类分子，其中MHC II类分子参与由抗原呈递细胞进行的抗原呈递而激活CD4+T细胞。另一方面，MHC I类分子激活CD8+T细胞。由HLA不同的个体之间的同种异体造血干细胞移植的结果可知，例如，在人中通过属于MHC II类分子的HLA-DR、HLA-DP、和HLA-DQ的任意一种的不同，从而移植后的基于同种异体免疫反应的并发病(例如，急性移植物对宿主病)的发病风险比增加。这显示，只要MHC II类分子的至少一种不同，就能够激活同种异体免疫。因此，在使用受检体的MHC II类分子的至少一种不同的同种异体CD4+T细胞时，能够获得本发明的效果。根据以上，本说明书中，“MHC II类分子不同”包括例如在人中HLA-DR、HLA-DP、和HLA-DQ的至少一种不同，例如它们之中的二种不同，优选为三种全部不同。
同种异体CD4+T细胞被MHC II类分子激活，但不与MHC I类分子(例如，在人中为HLA-A、HLA-B、和HLA-C)反应。因此，关于本发明中的同种异体CD4+T细胞与受检体的MHC I类分子，不在意其一致或不一致，即完全一致、部分一致、或完全不一致都可以。
MHC的单体型的组合是多样的，在人HLA中其组合有数万种，因而只要是同种的不同的个体，通常MHC不一致。另一方面，父母MHC基因各一半遗传到子女，在兄弟姐妹之间以1/4的概率MHC完全一致。此外，在同卵双胞胎之间MHC完全一致。此外，MHC是否一致可以通过本领域技术人员公知的方法检查，作为这样的检查法的例子，可列举血清学的检查(通过MHC的特异性已知的抗血清与淋巴细胞的反应性而进行MHC的分型)和DNA型检查(例如，PCR-SSO法、PCR-SSP法、PCR-SBT法、利用新一代测序仪的分型等)。
同种异体CD4+T细胞与抗原呈递细胞离体(ex vivo)进行了共培养，所述抗原呈递细胞来自受检体或具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。通过所述共培养，与受检体的MHC II类分子反应的同种异体CD4+T细胞克隆能够更选择性地被激活。本说明书中，“具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体”除了具有与受检体完全相同的MHC II类分子的个体之外，还包含在MHC II类分子群中的一部分不同的情况下，具有与受检体实质上相同的MHC II类分子的个体。其中，“具有与受检体实质上相同的MHC II类分子的个体”，是指只要通过上述与抗原呈递细胞的离体(ex vivo)共培养而能够激起针对CD4+T细胞的受检体来源的抗原(MHC II类分子)的免疫应答，就允许在MHC II类分子之间存在少数氨基酸的不同(例如，1～5氨基酸、1～4氨基酸、1～3氨基酸、1～2氨基酸、或1氨基酸)。
本说明书中，用于与同种异体CD4+T细胞共培养的抗原呈递细胞或能够将抗原呈递细胞的细胞源提供到受检体外的“具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体”除了受检体的同卵双胞胎、MHC II类分子一致的受检体的血亲(例如兄弟姐妹)之外，还包含例如，偶然MHC II类分子一致或部分一致的同种的不同个体。通过将通过从具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体获得的抗原呈递细胞与同种异体CD4+T细胞的共培养而获得的同种异体CD4+T细胞对受检体给药，从而能够激发针对受检体来源的抗原(MHC II类分子)的强的免疫应答，伴随以此为开始的炎症反应，能够诱导受检体的抗肿瘤免疫。
本说明书中，“离体(ex vivo)共培养”是指生物体外的人工环境下的培养。CD4+T细胞与抗原呈递细胞的离体(ex vivo)共培养的条件不限定，可以为通常的培养条件。例如培养可以使用市售的培养基(例如，DMEM、MEM、BME、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM、IMDM、McCoy's 5A培养基或mTeSR1培养基)或经制备的培养基来进行。也可以在这些培养基中加入各种添加物(例如，血清或血清代替物、IL-2等免疫刺激因子、Notch配体等刺激扩增因子、L-谷氨酸、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、青霉素和链霉素等抗生素、以及碱性成纤维细胞生长因子等生长因子的至少一种)，和/或固相化成培养平板而使用。培养温度可以为约30℃～约40℃、约35℃～约39℃、约36℃～约38℃或约37℃。可以在CO2存在下进行培养，CO2浓度可以为约2％～约10％、约4％～约6％、或约5％。培养时间可以为例如12小时～2周、1天～1周、2天～4天、或约3天。另外，共培养中的CD4+T细胞与抗原呈递细胞的比不限定，例如以抗原呈递细胞作为1时的CD4+T细胞的比可以为0.25～16、0.5～8、1～6、或2～4。
CD4+T细胞可以在与抗原呈递细胞的离体(ex vivo)共培养之前和/或之后冷冻保存。冷冻保存的方法是本领域技术人员公知的，例如可以通过离心分离等分离细胞，在其中加入包含DMSO等细胞保存液的培养基等，将其用液氮等冷却，从而保存。作为细胞保存液，也可以使用市售的细胞保存液。
共培养后，CD4+T细胞可以从抗原呈递细胞进行分离。或者因为共培养中，CD4+T细胞增殖、抗原呈递细胞基本不增殖，因此也可以不从共培养物中分离CD4+T细胞，以包含抗原呈递细胞的状态直接使用。
共培养后的CD4+T细胞除了被抗原呈递细胞激活了的同种异体反应性的CD4+T细胞之外，还可以包含未被激活的同种异体非反应性CD4+T细胞。共培养后的CD4+T细胞既可以以包含未被激活的CD4+T细胞的状态直接使用，也可以仅分离出被激活了的CD4+T细胞而使用。在共培养后的CD4+T细胞包含被激活了的细胞和未被激活的细胞双方的情况下，被激活了的细胞的比例不限定，可以为例如3～90％、5～80％、10～70％、15～60％、20～50％。在分离被激活了的CD4+T细胞时，其方法不限定，例如可以以CD44等激活标志物为指标，通过利用流式细胞术等的分拣，从而分离被激活了的CD4+T细胞。
可以分离通过与抗原呈递细胞的共培养而被激活了的同种异体反应性的CD4+T细胞，由该CD4+T细胞制成iPS细胞，然后由该iPS细胞再生CD4+T细胞而使用。T细胞受体基因的再构成结束了的所述iPS细胞来源的再生CD4+T细胞全部成为具有与被同种异体反应性被激活了的原CD4+T细胞相同的T细胞受体特异性的CD4+T细胞。因此，通过将所述再生CD4+T细胞对受检体给药，从而能够激起针对受检体来源的抗原(MHC II类分子)的免疫应答，伴随以此为起点的炎症反应，能够诱导受检体的抗肿瘤免疫。
作为抗原呈递细胞的例子，可列举树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、和B细胞，优选为树突状细胞。
获得抗原呈递细胞的方法、细胞源是本领域技术人员公知的，不限定。例如如果是树突状细胞，则如后述的实施例所示，可以从通过骨髓采集而获得的骨髓血基于标志物(例如，对于小鼠为c-kit阳性，对于人为CD34阳性)分离造血干细胞，将其在特定的条件下培养，从而获得树突状细胞。或者，可以从脐带血分离造血干细胞，将其在特定条件下培养，从而获得树突状细胞。或者，使用以Ficoll-Hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)、Ficoll-Conray等作为比重液的密度梯度离心法，从外周血全血等获得外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclear cells；PBMC)，由其使树突状细胞成熟或分离树突状细胞。
树突状细胞可以在上述制备的各阶段、例如成熟之前或之后进行冷冻保存。冷冻保存的方法是本领域技术人员公知的，例如可以通过离心分离等分离细胞，在其中加入包含DMSO等细胞保存液的培养基等，将其用液氮等冷却，从而保存。
本发明的组合物除了本说明书中记载的CD4+T细胞以外可以包含其他成分，或者也可以实质上由本说明书中记载的CD4+T细胞组成。本发明的组合物可以是药物组合物。
关于本发明的组合物所包含的CD4+T细胞的量(例如治疗和/或预防有效量)，只要是本领域技术人员，就能够考虑受检体的性别、体重、年龄、以及疾患等的经过和症状等各种要素而适当确定。例如，本发明的组合物所包含的CD4+T细胞的量不限定，但例如可以调整为相对于被给药组合物的受检体的体重每1kg，为约1×104个细胞/kg～1×1010个细胞/kg、1×105个细胞/kg～1×109个细胞/kg、或1×106个细胞/kg～1×108个细胞/kg。
本发明的组合物除了上述CD4+T细胞之外，还可以包含其他成分，例如灭菌水、生理盐水、缓冲剂、稳定剂、细胞稳定剂、白蛋白等蛋白质的至少一种。
本发明的组合物可以通过常规方法而制剂化。制剂化可以参照例如，Remington’sPharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co.,Easton,Pa.)中记载的方法。
给药形态不特别限制，可以根据需要适当选择，例如可以作为注射剂或点滴剂给药。
本说明书中记载的CD4+T细胞的量或组合物的给药量(例如治疗和/或预防有效量)、给药间隔、和给药期间只要是本领域技术人员就能够考虑受检体的性别、体重、年龄、以及疾患等经过和症状等各种要素而适当确定。例如，CD4+T细胞的给药量可以为约1×104个细胞/kg～1×1010个细胞/kg、1×105个细胞/kg～1×109个细胞/kg、或1×106个细胞/kg～1×108个细胞/kg。另外，给药次数不限定，可以为1天3次、1天2次、1天1次、2天1次、3天1次、1周1次、2周1次、1个月1次等。另外，给药期间虽然不限定，但可以为1天、2天、3天、1周、2周、1个月、半年、一年、或一年以上。
本说明书中，组合物的给药形态不限定，例如可以为非经口给药。作为非经口给药的具体例，可列举静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、皮内给药、气管/支气管给药、胸腔内给药、腹腔内给药、直肠给药、肌肉内给药、硬膜外给药、所属淋巴结内给药、和肿瘤内给药。本发明的组合物可以是为了这些给药形态而制剂化而得的药剂。例如，可以以无菌、低内毒素、无病毒的至少一种、例如满足全部三种的方式进行制剂化。在一实施方式中，本发明的组合物用于肿瘤内给药，和/或为了肿瘤内给药而进行了制剂化。通过将本发明的组合物肿瘤内给药，从而被给药的同种异体CD4+T细胞与大量的同种异体抗原(例如，受检体中的MHCII类分子群)接触，能够在肿瘤局部引起炎症反应。由此，能够激发针对来源于肿瘤细胞的抗原(例如，受检体中的肿瘤抗原)的受检体的免疫应答，作为结果而提高本发明的效果。
本发明的组合物可以与其他抗肿瘤疗法、例如外科的切除、放射线疗法、化学疗法和其他免疫细胞疗法的至少一种组合。
在一实施方式中，本发明能够具有针对肿瘤发挥高的治疗和/或预防效果这样的效果。在一实施方式中，本发明能够具有针对受检体的毒性等副作用(例如，体重减少)少或不存在这样的效果。
在一实施方式中，本发明的抗肿瘤效果主要通过激活受检体自身的免疫系统(CD8+细胞等)来发挥。因此，在一实施方式中，受检体不需要在移植物对肿瘤效果中典型地为必须的造血干细胞移植。在一实施方式中，受检体在本发明的组合物的刚刚给药之前、给药中、和/或刚刚给药之后不经过造血干细胞移植。
在一实施方式中，本发明能够具有针对复发性肿瘤和/或转移性肿瘤的治疗和/或预防效果。在一实施方式中，本发明的组合物是用于复发性肿瘤和/或转移性肿瘤的治疗和/或预防的组合物。
一个方案中，本发明涉及本说明书所记载的组合物的制造方法，包括将同种异体CD4+T细胞与抗原呈递细胞进行离体(ex vivo)共培养的工序，所述抗原呈递细胞来自受检体或具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。本方案中，同种异体CD4+T细胞、受检体、来源于受检体或具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体的抗原呈递细胞、和共培养等的详细如关于本发明的组合物所记载的那样。
一个方案中，本发明涉及受检体中的肿瘤的治疗和/或预防方法，包括将同种异体CD4+T细胞或本说明书所述的组合物对受检体给药，所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子，并且(b)包含通过与抗原呈递细胞离体(ex vivo)共培养而得的细胞，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。本方案中，受检体可以是需要该治疗法和/或预防法的受检体，另外给药量可以是治疗和/或预防有效量。本方案中，同种异体CD4+T细胞、受检体、来源于受检体或具有与受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体的抗原呈递细胞、和共培养等的详细如关于本发明的组合物所记载的那样。
实施例
＜实施例1：与自身来源的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞对恶性黑色素瘤的效果＞
(材料和方法)
(1)小鼠、细胞株、抗体(Abs)、试剂
C57BL/6(H-2b)、和BALB/c(H-2d)小鼠从CLEA Japan Inc.(Tokyo,Japan)购买。实验方案获得了福岛县立医科大学的动物实验委员会的承认。作为来源于C57BL/6的恶性黑色素瘤(melanoma)细胞株的B16F1从RIKEN BRC CELL BANK(Ibaraki,Japan)购买。在细胞的分离中使用的抗体只要不特别记载，就从BioLegend(San Diego,US)购买。结合了微珠的抗体和链霉抗生物素蛋白从Miltenyi-Biotech(Auburn,US)购买。重组小鼠GM-CSF、重组小鼠SCF、重组小鼠IL-4、和重组小鼠TNFα从R&DSystems(Minneapolis,US)购买。重组人IL-2从Shenandoah Biotech(Warwick,US)购买。
(2)造血干细胞的采集和树突状细胞的生成
树突状细胞的体外(in vitro)生成按照以前报告的方法进行(Mochizuki K.etal.,Blood,2016,23,127(25),3270-80)。简单而言，将从骨髓分离的c-kit阳性细胞在包含10％FBS和重组小鼠GM-CSF(10ng/ml)、重组小鼠SCF(10ng/ml)、重组小鼠IL-4(2.5ng/ml)、和重组小鼠TNFα(4ng/ml)的RPMI1640培养基中培养。在培养的第10天将树突状细胞用LPS(100ng/ml)(SIGMA-ALDRICH)和R848(100ng/ml)(InvivoGen)刺激6小时。然后，回收激活树突状细胞。
(3)在宿主为C57BL/6小鼠的情况下的同种异体T细胞的采集和与树突状细胞的离体(ex vivo)共培养
从BALB/c小鼠的脾脏使用微珠结合抗体(MiniMACS；Miltenyi Biotech,Germany)分离CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。纯度始终为92％以上。将分离出的T细胞使用包含10％FBS和重组人IL-2(200U/ml)的RPMI1640培养基在96孔U底板中，与如上所述在体外(in vitro)生成的宿主C57BL/6小鼠(自身)来源的树突状细胞共培养，从而进行刺激。共培养以5％CO2和37℃进行3天，T细胞与树突状细胞之比为2:1～4:1。将所得的T细胞在以下的体内(invivo)注射中使用。
(4)荷癌(恶性黑色素瘤)小鼠模型
对C57BL/6小鼠(宿主)，在第0天通过皮下注射接种恶性黑色素瘤细胞株B16F1(接种的肿瘤量在以下分别记载)。然后，将通过上述共培养而制备的来源于BALB/c小鼠的离体(ex vivo)共培养同种异体T细胞(2×106个细胞/小鼠)在肿瘤接种的第9天通过直接注射而给药至肿瘤内。对于肿瘤和全身的状态每隔2天～3天进行观察。使用游标卡尺测定肿瘤直径，由测定值通过以下式求出肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长径×短径2)/2。肿瘤长径超过18mm的小鼠出于伦理上的原因全部使其安乐死。另外，为了观察并发病，从给药离体(ex-vivo)共培养同种异体T细胞时开始每隔2天～3天测定小鼠的体重。
(结果)
将从BALB/c小鼠(同种异体)分离的CD4+T细胞与C57BL/6小鼠(自身)来源的树突状细胞共培养而进行刺激，将该同种异体CD4+T细胞给药至接种有肿瘤(B16F1)的C57BL/6小鼠的肿瘤内的情况下的肿瘤体积、生存率、和体重变化率分别示于图1～3。
如图1(第0天皮下接种B16F1：0.5×106个细胞)所示，同种异体CD4+T细胞的给药使肿瘤体积显著减少。与此相对，不进行CD4+T细胞的给药的对照、和自身来源的(从C57BL/6小鼠分离出的)CD4+T细胞的给药没有使肿瘤体积减少。此外，与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的、BALB/c小鼠来源的(同种异体)CD8+T细胞的给药也没有使肿瘤体积减少(数据未显示)。另外，未与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞共培养的BALB/c小鼠来源的(同种异体)CD4+T细胞的给药没有使肿瘤体积减少(数据未显示)。
另外，如图2所示，给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠，与对照和给药了自身来源的CD4+T细胞的小鼠相比，生存率显著改善。
另一方面，如图3所示，在给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠与对照之间体重变化率没有发现大的差异。这显示通过同种异体CD4+T细胞的给药没有产生伴随体重变化的毒性。
这些结果显示，同种异体CD4+T细胞能够不伴随毒性地发挥显著的肿瘤退缩效果。
＜实施例2：宿主CD8+细胞枯竭时的同种异体CD4+T细胞的效果＞
(材料和方法)
按照实施例1中记载的方法，在第0天将B16F1对C57BL/6小鼠皮下接种1.0×106个细胞。将通过如实施例1中记载那样的方法制备的与C57BL/6小鼠(自身)来源的树突状细胞共培养而得的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞在第9天进行给药。使用抗小鼠CD8a抗体(BioXcel,New Haven,US，在肿瘤接种的第8天腹腔内注射500μg，在第10天和第12天分别腹腔内注射250μg)使宿主CD8+T细胞枯竭。对照中将IgG(BioXcel,New Haven,US)进行腹腔内给药。
(结果)
如图4所示，在通过抗CD8抗体使宿主CD8+细胞枯竭了的情况下，不能发现由同种异体CD4+T细胞产生的肿瘤退缩效果，肿瘤增大。
该结果显示，由同种异体CD4+T细胞引起的肿瘤退缩主要依赖于宿主CD8+细胞。
＜实施例3：同种异体CD4+T细胞的肿瘤复发预防效果(长期效果)＞
(材料和方法)
对C57BL/6小鼠在第0天皮下接种B16F1 0.5×106个细胞，将与C57BL/6小鼠(自身)来源的树突状细胞共培养而得的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞在第9天给药。对生存的C57BL/6小鼠，在6个月后进行第2次肿瘤接种(将B16F1皮下接种2.5×106个细胞)，测定该情况下的肿瘤体积。以过去未接受肿瘤接种和细胞疗法的原始态(naive)C57BL/6小鼠作为对照。此外，同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞的制备方法依照实施例1中记载的方法。
(结果)
如图5所示，在给药与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体CD4+T细胞之后，在生存的小鼠中，即使在6个月后再接种肿瘤的情况下，也抑制了肿瘤的发生。该结果显示，通过给药针对肿瘤的同种异体CD4+T细胞的给药，从而宿主的肿瘤特异性的免疫被诱导，该抗肿瘤免疫具有长期的复发预防效果。
＜实施例4：对同种异体CD4+T细胞的给药部位以外的肿瘤的效果＞
(材料和方法)
在与实施例1所记载的同样的条件下，对C57BL/6小鼠的右侧腹部和左侧腹部通过皮下注射而接种等量(分别为1.0×106个细胞)的B16F1，然后，将与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞进行了共培养的同种异体(BALB/c小鼠来源的)CD4+T细胞(2×106个细胞/小鼠)对左侧腹部的肿瘤内通过注射而给药。
(结果)
将肿瘤体积示于图6，将生存率示于图7。如图6(A～E：对照、F～J：给药)所示，在给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠中，5只中的4只小鼠中不仅给药了的左侧腹部，右侧腹部中的肿瘤也退缩。另外，如图7所示，在给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠中，生存率显著上升。这些结果显示，同种异体CD4+T细胞的给药诱导宿主全身的抗肿瘤免疫，对给药部位以外的肿瘤也能够发挥效果。
＜实施例5：与来源于具有与宿主相同的MHC II类分子的个体的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞对肿瘤的效果＞
(目的)
验证是否即使在使用来自MHC II类分子相同的其他个体的树突状细胞的情况下也能够确认肿瘤退缩效果。
(材料和方法)
129X1(H-2b)小鼠从Japan SLC,Inc.(Shizuoka,Japan)购买。将从BALB/c小鼠分离的CD4+T细胞与C57BL/6或129X1小鼠(具有与C57BL/6小鼠相同的MHC II类分子)来源的树突状细胞共培养，将该同种异体CD4+T细胞对接种有肿瘤(B16F1)的C57BL/6小鼠的肿瘤内进行了给药，测定了该情况下的肿瘤体积。其他方法如实施例1所记载。
(结果)
如图8(第0天皮下接种B16F1：1.0×106个细胞)所示，与129X1小鼠来源的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞的给药，与给药C57BL/6小鼠来源的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞的情况同样地，使肿瘤体积显著减少(图8B和C)。与此相对，不进行CD4+T细胞的给药的对照的给药没有使肿瘤体积减少(图8A)。
这些结果显示，与用自身来源的树突状细胞激活的同种异体CD4+T细胞同样地，与来源于具有与宿主相同的MHC II类分子的个体的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞也发挥显著的肿瘤退缩效果。
＜实施例6：细胞源冷冻同种异体CD4+T细胞和细胞制剂冷冻同种异体CD4+T细胞对肿瘤的效果＞
(材料和方法)
作为细胞保存液，使用STEM-CELLBANKER(注册商标)DMSO Free GMP grade(Zenoaq Resource,Fukushima,Japan)。细胞源冷冻中，在从C57BL/6小鼠的骨髓分离后的c-kit阳性细胞的阶段和从BALB/c小鼠分离后的CD4+T细胞的阶段，分别使用STEM-CELLBANKER(注册商标)DMSO FreeGMP grade(ゼノアックリソース)在-80℃冷冻保存，在使用时解冻。其他方法如实施例1中所记载。
在细胞制剂冷冻中，通过如实施例1中记载那样的方法制备与C57BL/6小鼠来源的树突状细胞共培养而得的CD4+T细胞(细胞制剂)，将其使用STEM-CELLBANKER(注册商标)DMSO Free GMP grade(ゼノアックリソース)在-80℃冷冻保存。给药前将其解冻而离心，再悬浮于PBS(磷酸缓冲盐水)，将此在体内(in vivo)注射中使用。
(结果)
如图9(第0天皮下接种B16F1：1.0×106个细胞)所示，即使在将细胞源(c-kit阳性细胞和与树突状细胞共培养之前的CD4+T细胞)或细胞制剂(通过与树突状细胞的共培养而得的CD4+T细胞)的情况下，同种异体CD4+T细胞的给药也与不冷冻保存细胞源或细胞制剂的情况同样地，使肿瘤体积显著减少(图9B～D)。与此相对，不进行CD4+T细胞的给药的对照的给药没有使肿瘤体积减少(图9A)。
这些结果显示，即使在将细胞源或细胞制剂冷冻保存的情况下，同种异体CD4+T细胞的肿瘤退缩效果也不丧失。
＜实施例7：与自身来源的树突状细胞共培养而得的同种异体CD4+T细胞对其他肿瘤(结肠癌)的效果＞
(材料和方法)
作为来源于BALB/c的结肠癌细胞株的Colon-26从Cell Resource Center forBiomedical Research,Institute of Development,Aging and Cancer,TohokuUniversity(Sendai,Japan)获得。
宿主为BALB/c小鼠，接种的癌细胞株为Colon-26(5×104个细胞/小鼠)，给药的同种异体CD4+T细胞为与从BALB/c小鼠分离的树突状细胞进行了共培养的从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞。除此以外的方法如实施例1所记载。
(结果)
将从C57BL/6小鼠分离出的CD4+T细胞与BALB/c小鼠来源的树突状细胞共培养，将该同种异体CD4+T细胞对接种有肿瘤(Colon-26)的BALB/c小鼠的肿瘤内给药，将这种情况下的肿瘤体积和生存率分别示于图10和11。
如图10(第0天皮下接种Colon-26：5×104个细胞)所示，在给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠中，与不进行CD4+T细胞的给药的对照相比，肿瘤体积的增加速率显著减少。
另外，如图11所示，给药了同种异体CD4+T细胞的小鼠，与给药了对照的小鼠相比，生存率也改善。
这些结果显示，同种异体CD4+T细胞对黑色素瘤以外的恶性肿瘤也发挥显著的肿瘤退缩效果。另外显示，本发明的效果并不是通过特定的小鼠种来源的抗原呈递细胞与特定的小鼠种来源的CD4+T细胞的组合而偶然被诱导的。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接通过引用而纳入本说明书中。

Claims (4)

1.用于受检体中的肿瘤的治疗和/或预防的、包含同种异体CD4+T细胞的组合物，
所述同种异体CD4+T细胞(a)具有与所述受检体的MHC II类分子全部或一部分不同的MHC II类分子，并且(b)包含通过与抗原呈递细胞离体(ex vivo)共培养而得的细胞，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，用于肿瘤内给药。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的组合物的制造方法，包括将同种异体CD4+T细胞与抗原呈递细胞进行离体(ex vivo)共培养的工序，所述抗原呈递细胞来自所述受检体或具有与所述受检体的MHC II类分子完全一致或部分一致的MHC II类分子的个体。
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