CN1237909A - 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗 - Google Patents

联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN1237909A
CN1237909A CN97199908A CN97199908A CN1237909A CN 1237909 A CN1237909 A CN 1237909A CN 97199908 A CN97199908 A CN 97199908A CN 97199908 A CN97199908 A CN 97199908A CN 1237909 A CN1237909 A CN 1237909A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tumor
patient
lymphocyte
allogeneic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97199908A
Other languages
English (en)
Inventor
J·C·希斯罗德特
J·A·汤普森
G·A·戈兰格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN1237909A publication Critical patent/CN1237909A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明包括细胞疫苗和其在癌症免疫治疗的使用，特别是用于人类癌症免疫治疗的方法。该疫苗包括对于患者是同种异体的刺激的淋巴细胞和肿瘤相关抗原的来源。此同种异体淋巴细胞可通过将其与从待治疗患者或别的第三者供体获得的淋巴细胞混合或共培养而加以刺激。肿瘤抗原可以从患者中制备的原发肿瘤细胞、肿瘤细胞系或肿瘤提取物的形式加以提供。混合刺激的同种异体淋巴细胞和肿瘤抗原并且在远离原发肿瘤位点施用以引发或增强全身的细胞抗肿瘤免疫应答。此方法克服了免疫系统对肿瘤抗原刺激的天然不应答(naturalrefractory)性质，产生了宿主应答并且大大改善临床结果。

Description

联合使用肿瘤细胞与 混合淋巴细胞的癌症免疫治疗
本申请要求1996年10月11日提交而未决的临时美国专利申请60/028,548的优先权，其在此被引用以供全文参考。
本发明通常涉及细胞免疫学和癌症治疗领域。更为具体地，其涉及通过施用包括失活肿瘤细胞和刺激免疫细胞(如可以是在混合淋巴细胞培养中产生的细胞)的细胞疫苗在宿主(特别是人类)中产生抗肿瘤免疫应答。
尽管医学研究中的众多进展，癌症仍然为所有发达国家主要的死亡原因。癌症治疗的非特异性方法，如手术和全身化疗在治疗一些循环和慢速生长的实体瘤中是成功的。然而，许多实体瘤被认为对这些方法是具有抗性的，并且在这方面的进展相应缓慢(grave)。
 一个实例为脑癌。每年，在美国大约诊断出15,000例晚期(highgrade)星形细胞瘤。此数目在儿童和成人中仍在增长。标准的方法包括减细胞手术然后放疗或化疗。没有治愈且实际上所有病人最终复发或病情继续。Ⅳ期星形细胞瘤(多形成交织细胞瘤(glioblastomamultiforme))的总体存活率低，诊断出来1年内～50的病人死亡。由于这些肿瘤具有侵润性并且对标准的治疗方案具有高度抗性，故需要新的治疗方案。
癌症治疗的新生领域是免疫治疗。大体原理是赋予受治患者实际上产生排斥反应，特别是对恶性细胞的排斥反应的能力。正在发展许多免疫学策略，包括：1．用刺激的各种自身细胞的继承性免疫治疗(adoptive immunotherapy)；2．同种异体淋巴细胞的全身性转移；3．在肿瘤内部移植免疫学反应细胞；和4．在远处种痘从而产生全身性肿瘤特异性免疫应答。
上述的第1种策略，继承性免疫治疗是通过在体外刺激细胞且然后再将其施用至病人而导致病人免疫水平的增强。这些细胞与该患者是组织相容性的，并且一般是从先前的自体捐献得到。
一种方法是在体外以肿瘤相关抗原刺激自体的淋巴细胞以使它们为肿瘤特异性的淋巴细胞。Zarling等(1978)(自然274:269-71)在体外制备了抗人类自身白血病细胞的细胞毒淋巴细胞。Lee等(1996)(摘要胃肠病学)用失活的白血病母细胞和自体的淋巴细胞进行体外混合淋巴细胞培养，并且产生对自身母细胞上的肿瘤抗原具有细胞毒性的效应T淋巴细胞。认为MHC D-基因座不相容性对于在淋巴细胞培养中提供适当的帮助是必要的。Lesham等(1984)(癌症免疫学.免疫治疗17:117-23)通过同种异体致敏(allosensitization)而在体外产生对鼠胸腺瘤细胞的细胞毒应答。
Gately等(1982)(国立癌症研究所学报69:1245-54)发现9种人类神经胶质细胞系中有5种在体外培养中没有引发同种异体溶细胞性的淋巴细胞应答。然而，如果被失活，在培养中同种异体淋巴细胞作为刺激细胞而提供，从非刺激细胞系中产生出4种肿瘤特异性溶细胞性T淋巴细胞和非特异性非-T效应细胞。在美国专利No.5,192,537中，Osband建议通过在肿瘤细胞提取物和非特异性激活物如植物凝集素或IL-1存在下在体外培养肿瘤病人的单核细胞且然后处理该培养物以去除抑制细胞的活性而将其激活。
尽管有这些实验观察结果，全身性施用体外激活的自体肿瘤特异性淋巴细胞还没有成为标准癌症治疗的一部分。
自体淋巴细胞和杀伤细胞也可被非特异性刺激。在一个实例中，通过联合IL-2和IFN-r的培养制备可介导抗体依赖的细胞介导细胞毒反应的表达Fc受体淋巴细胞(美国专利No.5,308,626)。在另一个实例中，培养于IL-2中来源于外周血的淋巴细胞形成淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，它们对于多种瘤细胞是溶细胞性的，但对正常细胞不具溶细胞性。LAK主要来源于表达CD58抗原但不表达CD3抗原的自然杀伤细胞。可将外周血淋巴细胞通过IL-2诱导粘着到塑料上纯化这类细胞(A-LAK细胞；见美国专利No.5,057,423)。与高剂量的IL-2联合，LAK细胞在治疗转移的人类黑素瘤和肾细胞瘤中取得了一些成功。(Rosenberg(1987)新英格兰医学杂志.316:889-897)。此策略费力、费钱并且不适用于所有病人。Schwartz等(1989)(癌症研究49:1441-1446)显示在实验动物模型中A-ALK细胞在减少乳腺癌细胞在肺和肝脏中转移中优于LAK细胞，但这不是治愈性的并且没有长期存活者。
对于在治疗脑癌中使用LAK而进行试验的实例，参见Merchant等(1988)癌症62:665-671&(1990)神经-癌症学杂志8:173-198；Yoshida等(1988)癌症研究48:5011-5016；Barba等(1989)神经外科学杂志70:175-182；Hayes(1988)淋巴因子研究§:337-345；和Naganuma等Acta Neurochir(Wien)99:157-160。另有研究提出用自体丝裂原-激活和IL-2刺激(MAK)杀伤淋巴细胞结合IL-2治疗复发的晚期神经胶质瘤(Jeffes等(1991)淋巴因子研究10:89-94)。尽管这些试验中没有一个导致严重的临床紊乱，但其效应是罕见或短暂的。在接受该治疗的病人中诱导肿瘤特异性免疫性未被显示。
已根据肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)的观察结果提出另一种形式用自体细胞的继承性治疗。TIL通过收集侵润至肿瘤中的淋巴细胞群并且在体外将其与IL-2培养而获得。Finke等(1990)(癌症研究50:2363-2370)对CD4+和CD8+TIL在人类肾细胞瘤中的溶细胞活性进行了特征分析。TIL具有优于LAK细胞的活性和肿瘤特异性并且已经被实验上施用于，例如晚期黑素瘤病人中。(Rosenberg等(1990)新英格兰医学杂志323:570-578)。TIL中的效应细胞群可以是被引发成在宿主中为肿瘤特异性并且缺少溶解颗粒的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，并且当在培养中受到刺激时转移到溶细胞性淋巴母细胞中。(Berke等(1988)免疫学杂志129:303ff)。不幸的是，仅可制备出对有限数目肿瘤类型临床上有关的TIL。这些策略仍为实验性的，尤其在人类治疗中。
上述癌症免疫治疗的第2种策略为同种异体淋巴细胞的继承性转移。该实验策略的基本原理为产生全身水平的免疫刺激，并且继而克服阻止宿主免疫系统排斥肿瘤的不应性Strausser等(1981)(免疫学杂志127卷，第1期)描述了通过在体外对同种异体抗原致敏的自体细胞裂解人类实体瘤。Zarling等(1978)(自然274:269-71)证实了以同种异体淋巴细胞致敏后在人体内的抗淋巴瘤应答。Kondo等(1984)(医学假说15:241-77)观察到此策略在20-30％病人中的真实应答，并且将此效应归咎于抑制T细胞的缺失。对具有传染病或循环疾病的病人进行这类实验。尽管这些最初的实验在10年前进行，但此策略还没有被广泛接受，尤其是治疗实体瘤。
上述免疫治疗的第3种策略为肿瘤内移植。此策略涉及直接运送效应细胞至作用位点。由于该移植细胞不循环，故无需与宿主的组织相容性。肿瘤内移植同种异体细胞可能促进该移植细胞与肿瘤反应的能力，并且起始强有力的移植物对肿瘤的应答。
Kruse等(1990)(美国国家科学院院报87:9577-9581)证实了直接向生长于Fischer大鼠上的脑瘤中移植同种异体细胞毒性T淋巴细胞(CTL)导致较单独移植其它淋巴细胞群，包括同系的CTL、LAK细胞、粘附-LAK细胞或IL-2细胞更为显著的存活优势。Redd等(1992)(癌症免疫学免疫治疗34:349-354)在大鼠中开发出对同种异体脑瘤具有特异性的细胞毒T淋巴细胞。这些淋巴细胞仅对于肿瘤表达的决定蔟为特异性的并且预言其在体内治疗的目的中为有用的。Kruse等(1994)(神经肿瘤学杂志19:161-168)从4种MHC不相容性大鼠品系中制备CTL，并且用它们治疗具有确立9L脑瘤的Fischer大鼠。将CTL以2周一次施用，每次施用不同的MHC不相容性CTL制剂。无肿瘤的动物显示出最小的局部脑损伤。具有肿瘤的大鼠表现出下面2种情况中的一种：a)单核细胞侵润，治疗后2-4天大批肿瘤开始坏死，并且到15天整个肿瘤瓦解；或b)细胞侵润，早期肿瘤瓦解，且然后肿瘤重新生长导致动物死亡。肿瘤退化动物对于颅内重新接种的肿瘤细胞具有抗性。(Kruse等(1994))。肿瘤内CTL移植物可任选与用环磷酰胺的化疗结合。Kruse等(1993)(神经肿瘤学杂志15:97-112)。
尽管有肿瘤内移植技术的许诺，但是疑点仍然存在。一方面，通过外科技术频繁进行移植对于日常的保养可能是挑战太大。此外，此策略只产生局部应答，不产生通常对于保护免受转移必要的全身性应答。
上述免疫治疗的第4种方案是在宿主源中产生有活性全身性的肿瘤特异性免疫应答。此应答是通过在距肿瘤远处施用疫苗组合物而从患者自身的免疫系统中得到引发。由于这样而在宿主中引发的特异性抗体或免疫细胞将有望迁移到肿瘤并且然后根除体内任何位置的癌细胞。
已经提出多种疫苗，包括分离的肿瘤抗原疫苗和抗基因型疫苗。Michell等(1993)(纽约科学院年报690:153-166)用来自多种同种异体黑素瘤细胞系的机械裂解物联合佐剂DETOXTM治疗癌症病人。该方法完全基于这样的前提，即相关组织类型的肿瘤均具有相同的肿瘤相关抗原。对于具有在恶性转化期间没有获得抗原表达或后来分化从而不表达该抗原的肿瘤的病人，这些疫苗中没有一个将会成功。
抗肿瘤疫苗的替代方法是使用来自待治疗患者的肿瘤细胞或这些细胞的衍生物。对于综述，参见Schimmacher等(1985)(癌症研究临床肿瘤学杂志121:487-489)。在美国专利No.5,484,598中，HannaJr要求保护用于治疗可切除肿瘤以防止复发或转移的方法，包括外科切除肿瘤，用胶原酶分散细胞，照射这些细胞并且以大约107个细胞的至少3个连续剂量接种病人。可任选将这些细胞冷冻保存，并且可通过皮试监测免疫系统。此方法没有解决业已建立的许多肿瘤不是天然具有免疫原性的观察结果。许多被切除肿瘤的病人或者对其自身肿瘤抗原具有耐受性或对其不能够应答，甚至当其包括于疫苗制剂中也是如此。
已经出现了数种大大增强免疫原性的制备自身或同系肿瘤细胞的方法。肿瘤细胞可与卡介苗(BCG)提取物或A60分支杆菌抗原复合物结合或与痘苗病毒或新城疫病毒(NDV)病毒混合。Guo及其合作者(WO95/16775)建议将肿瘤细胞与第2种具有更强免疫原性的细胞如B细胞的膜成份融合。
在另一种方法中，在遗传上改变自体或同系肿瘤细胞从而制备共刺激分子。共刺激分子的实例包括细胞表面受体，如B7-1共刺激分子或同种异体组织相容性抗原。其它实例为分泌的活性物，包括细胞因子。对于综述，参见Pardoll等(1992)(当今免疫学观点4:819-23)；Saito等(1994)(癌症研究54:3516-3520)；Vieweg等(1994)(癌症研究54:1760-1765)；Gastl等(1992)(癌症研究52:6229-6236)。肿瘤细胞在遗传上已经被改变从而产生TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、INF-α、INF-γ以及GM-CSF。参见，例如，Santin等妇科肿瘤学58:230-239,1995b；国际妇科癌症5:401-410,1995c；美国妇产科杂志174:633-639,1996。
Golumbek等(1989)报导了插入有IL-4基因的小鼠肾脏肿瘤细胞对于全身性T细胞免疫性具有强烈的免疫原性，并且保护小鼠免受后来以未修饰母本肿瘤细胞的致命的接种。(Cavallo等1991&1992)。抗肿瘤免疫性通过同时产生GM-CSF和IL-4的癌症疫苗得到加强。(Wakimoto等(1996)癌症研究56:1828-33)。细胞因子或细胞因子组合可以恢复或刺激免疫系统细胞并且继而克服免疫性的一般障碍。一些细胞因子也影响癌细胞主要组织相容性分子或细胞内粘附分子的表达(Santin等1995a，国际癌症杂志65:688-694；Santin(1996)美国妇产科杂志)，从而大大提高了免疫原性。
以分泌细胞因子的组织相容性肿瘤细胞的实验主要在遗传限定的动物模型(不直接对应于异质的人类专门人群)中完成。(Colombo等1995癌症免疫学免疫治疗41:265-270)。不是所有的癌症类型对相同的细胞因子具有反应性。有给病人注射复制感受态的肿瘤细胞，特别是遗传改变后的细胞的考虑。此外，在待治疗病人中通常没有足够的时间产生遗传改变并且成熟足够的细胞。
Blumbach(WO 96/05866)建议将活体肿瘤细胞疫苗如下转导：a)编码免疫刺激蛋白的基因；b)细胞因子；和c)胸苷激酶基因。在组合物可作为可以在体内生长并且刺激应答的活细胞而提供并且然后通过胸苷激酶而被选择性杀死。Golumbek等(1992)(免疫治疗杂志12:224-230)显示具有自杀基因的增殖的肿瘤细胞当其暂时离开细胞周期或者被药物隔离时也可以活的毒素的处理。
作为选择，Cohen(WO 95/31107)建议癌症可以用包括遗传上被改变以表达一种或更多种细胞因子并且同时表达由自体基因组肿瘤DNA所编码肿瘤相关抗原的同种异体细胞的细胞免疫原加以治疗，对同种异体细胞(以小鼠LM细胞作为实例)进行遗传改变以表达：a)细胞因子；和b)对于待治疗患者是自体的肿瘤相关抗原。因此，该疫苗无需包括获得肿瘤细胞。
然而，应用Cohen的发明至人类患者将需要对由特定肿瘤表达的特定肿瘤相关抗原的每位病人的先前了解。临床上受到广泛注意的许多人类癌症没有可靠的共同标记。一旦对特定的病人鉴定出相关的标记，必须加工细胞系并且在治疗前培养至所需的浓度。这样，每位病人将成为其自身的研究和开发计划。由于免疫应答仅仅在集中于使用特定的肿瘤相关抗原处，故其可能没有针对由完整肿瘤细胞表达的抗原谱的免疫应答有效。此外，该疫苗包括遗传上改变的细胞系，因而产生前述的问题。Cohen仅仅证实了在动物研究中存活的改进并且未能够提供他的制剂对人类癌症患者将会同样有效的任何证据。
人类抗肿瘤雪白疫苗的合适的策略不得不与下面的问题产生争论：a)在显示肿瘤相关抗原中肿瘤(甚至是相同类型肿瘤)的异质性；b)不同个体同时对于抗原和细胞因子的免疫应答的异质性；c)关于可用于人类中的组合物的种族和制约的考虑；和d)在大多数临床环境中缺少时间，从而限制了加工新的细胞系或编辑每个病人疫苗的能力。
本发明提供了用于在需要抗肿瘤免疫反应的病人中诱发抗肿瘤免疫反应的组合物和方法。本发明组合物为于生理上相容的赋形剂中的细胞混合物并且在这里成为疫苗或免疫原性组合物。可将其施用至病人或者是为了治疗或者是为了减轻临床上可检测到的肿瘤或者是为了预防，特别是手术摘除(debulking)后的预防，或者对先前可检测到肿瘤的化疗或放疗。此组合物一般在远离原发肿瘤的位点施用，其目的是刺激全身性的抗原发肿瘤及其转移的反应性。此反应性反过来又根除原发位点或转移物中(如果有的话)或所有这二者当中的肿瘤细胞或延缓它们的形成。
本发明的疫苗最少包括2种成份。第1种为肿瘤抗原，优选为多种抗原来源，其与病人的癌症有关。肿瘤相关抗原的常规来源为先前从病人中，如手术切除期间而获得的肿瘤细胞。第2种成份为可以参与刺激病人的免疫系统从而产生抗肿瘤应答的刺激的淋巴细胞群。特别地，此刺激的淋巴细胞群包括对于病人是同种异体的淋巴细胞。它们优选通过在体外与刺激细胞如获自病人的淋巴细胞或获自对于赋予应答细胞为同种异体的第2种第3者供体的淋巴细胞共培养而被预先激活。包括在本发明中的组合物含有多种刺激或应答细胞或同时含有这二者，其中的刺激细胞能够在培养中同种异体激活应答细胞。
本发明的实施方案包括用于治疗癌症的组合物。一种实施方案是适于施用至人类或其它待治疗患者的细胞疫苗，包括在药物学上或生理上相容的赋性剂中混合下面的组分：a)来自人类或者第3者供体的淋巴细胞；b)对该淋巴细胞为同种异体并且优选被同种异体激活而抵抗它们的淋巴细胞；和c)失活的肿瘤细胞群，或者由获自人类的原发肿瘤细胞所组成，或者由这些细胞系细胞的子代所组成，或者由它们共同所组成。第1种成份是任选的，其中同种异体淋巴细胞在包括进此混合物中以前另被刺激。该失活的肿瘤细胞可由其它来源的肿瘤相关抗原，如肿瘤细胞匀浆物、去污剂裂解液或其纯化的衍生物如分离的蛋白而代替。
此失活的肿瘤细胞群优选主要由从所述人类切除的实体瘤而分离的原发肿瘤细胞构成，并且可选自神经胶质瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞、星形细胞瘤细胞和卵巢癌细胞。在其它实施方案中，可以使用非实体瘤，包括但不限于白血病和淋巴瘤。
同种异体淋巴细胞一般从适当供体的外周血中分离，并且可任选对其进行遗传改变从而以更高的水平表达细胞因子，特别是IL-2、IL-4、GM-CSF,TNF-α或M-CSF或其任何组合。在优选的实施方案中，在与所述肿瘤细胞群混合以前，以足以对淋巴细胞进行同种异体刺激或增殖的时间和条件培养白细胞和淋巴细胞。
本发明也包括单位剂量或试剂盒形式的本发明疫苗和免疫原性组合物。同时包括通过制备或混合该组合物的各种成份而制备本发明任何一种组合物的方法，包括共培养来自待治疗患者的白细胞与同种异体淋巴细胞和/或混合刺激的同种异体淋巴细胞与原发肿瘤细胞、子代或来自患者的肿瘤抗原。
也包括用于诱导、增强或另外刺激抗肿瘤免疫学应答，特别是细胞应答的方法，或用于治疗肿瘤疾病如癌症的方法，包括使用本发明的任何一种组合物或疫苗。进一步的实施方案为在需要该治疗的病人中诱导、增强或另外刺激抗肿瘤免疫学应答方法，或用于治疗肿瘤疾病的方法，包括下面步骤：a)在体外将肿瘤相关抗原(特别是肿瘤细胞群)与包括对人类为同种异体的刺激淋巴细胞的第二种细胞群混合到一起；和b)施用免疫原性量的细胞混合物至该患者。
由所包括方法的中任何一种所刺激的免疫学应答可以是初级应答或者是次级应答，并且事先可以任选通过施用同种异体淋巴细胞至该患者的实体瘤或至由于去除实体瘤或其一部分而在该患者中形成的腔中而加以治疗。优选地，此肿瘤细胞群包括获自所述患者的原发肿瘤细胞或来自获自所述患者原发肿瘤细胞的肿瘤细胞系并且被失活。在特定的实施方案中，此第2中细胞群也包括来自所述患者的白细胞，其优选被失活，并且一般从外周血中分离。优选地，在混合所述的肿瘤细胞群之前，将此白细胞和淋巴细胞在加入肿瘤细胞之前以足以对该淋巴细胞进行同种异体刺激或由于该淋巴细胞增殖的时间和条件共培养。在特定的实施方案中，来自该供体的淋巴细胞作为选择或额外被遗传改变从而以更高的水平表达细胞因子。
附图说明
图1为显示在肿瘤内移植2、4或6×109个细胞(分别为图板A、B或C)后于9个不同的特定标本(patent)中在不同时间通过磁共振成象(MRI)而测得的肿瘤相对大小的三个图板。移植细胞获自自体或同种异体白细胞的混合淋巴细胞培养物。下斜线表示肿瘤体积的逐渐减小，部分是由于移植物的局部免疫学反应所致。
图2为显示辐射对建立的分泌IL-4肿瘤细胞系效应的三个图板。图板A显示给以5,000(□)或10,000(■)辐射后细胞的生长模式。图板B和C显示辐射后在不同时间由ELISA培养基中检测到的表示为总浓度(图板B)或每个细胞(图板C)的IL-4。
图3为显示不同的同种异体激活的淋巴细胞制剂对提供Balb/c小鼠J588L淋巴瘤细胞的第二次接种提供的抗性效应的柱状图。用同系脾细胞或一些第3者脾细胞刺激的同种异体细胞均为有效的。
图4为显示在小鼠淋巴瘤模型中不同的细胞培养物对存活时间的比例的柱状图。
图5为显示在4个不同分析中测得的不同人类同种异体激活细胞制剂的功能活性程度的柱状图。
图6为显示人类同种异体激活细胞制剂对细胞因子IL-2和IFN-r分泌水平的柱状图。
图7为显示通过用多种不同的刺激细胞增强人类淋巴细胞同种异体激活的柱状图。
图8为显示根据应答刺激细胞的比例，不同的人类同种异体激活细胞制剂功能活性的柱状图。
图9为显示包括20μg/ml组氨酸(黑阴影)或西脒替丁(浅阴影)进入人类细胞培养物中，或者仅仅应答物，或者仅仅刺激物，或者应答物∶刺激物(10∶1)混合培养物中的效应的柱状图。
图10为以混合淋巴细胞培养细胞和自体肿瘤细胞共同接种病人的半色调复制图，在4个注射位点显示出立即的超敏反应。剂量为：100×106(右上角)；50×106(左上角)；25×106(右下角)；10×106(左下角)。
图11为2天后采自相同病人的半色调复制图，显示在4个注射位点延迟的超敏反应。此反应证实了该病人对该疫苗组合物组分做出应答。
本发明细胞疫苗的主要特征为多组分一旦进入宿主体内便协调起作用从而产生所需效应。该疫苗的一种组分为肿瘤抗原，优选以表达与待治疗病人肿瘤相同的多肿瘤相关抗原的癌细胞形式而提供。以前建立的肿瘤细胞系可用于该目的，但是使用通过手术切除、活检、取血、或其它适当的技术而从待治疗病人中获得的细胞尤为方便。其它组分为包括被激活(或能够被激活)并且因此能够刺激宿主中增强免疫反应淋巴细胞的细胞混合物。在一些优选的实施方案中，该细胞混合物为用获自待治疗患者的细胞刺激的同种异体细胞的混合淋巴细胞培养物。
该策略明显与以前人类癌症免疫治疗方法不同。刺激的淋巴细胞已经用于实验性人类治疗，但是作为继承性治疗的一部分-此淋巴细胞最初获自患者或密切匹配的供体。在本发明中，刺激的淋巴细胞对于患者是同种异体的。该刺激的淋巴细胞提供了强有力的免疫刺激从而引发对同时注射肿瘤相关抗原的应答。结果，产生对肿瘤特异性的细胞免疫应答，并且较仅仅施用该病人的肿瘤细胞或其衍生物而可获得的应答更为强烈。
本发明是结合这样的观察结果，即直接移植到瘤床内的混合淋巴细胞限制或逆转肿瘤生长，从而被开发出来。这些实验和从这里获得的观察结果描述于下面的实施例1中，并且共同拥有未决的美国专利申请系列号08/616,880，系列号08/406,388的部分继续申请，两者在此被引作参考。对肿瘤体积的影响似乎至少部分地是由于宿主来源的有活性的免疫学反应。在一位病人中，没有残余同种异体淋巴细胞的证据，即使有广泛肿瘤坏死的组织学证据。此外，该影响似乎是长期的。一些给以单一移植的病人其病情好转数年。有人假设由移植体内同种异体淋巴细胞所刺激的移植抗原的增加的表达导致大批募集淋巴细胞靠近肿瘤位点。产生了局部的移植体-对-肿瘤、移植体-对-宿主、宿主-对-移植体或此类反应的数种组合，并且为其它有较少免疫原性的肿瘤抗原打开免疫学窗口从而起始抗肿瘤免疫应答。
已开发出用于移植方法和不同型肿瘤的动物模型。作为转移癌症的模型，用MADB 106L-1乳腺癌细胞系滴注Fisher大鼠中间肝叶中的原发肿瘤。一旦很好地建立了肿瘤以后，对其移植以1∶1比例预培养的同系刺激淋巴细胞和同种异体应答淋巴细胞。只要对其给以活的肿瘤细胞而不是移植物，被治疗的动物平均存活大约2周。长期存活的动物对再次接种正常致命剂量母本乳腺癌细胞具有免疫性。发现预培养混合的淋巴细胞对得到完全效应是重要的(参见下文的实施例3)。
这些研究的整合结果得出下面的结论：a)混合淋巴细胞移植策略在提高至少2种不同癌症(神经胶质瘤和转移乳腺癌模型)、存活并且在至少2个不同位点(大脑和肝脏)是有效的；b)存活者对再次接种母本肿瘤细胞具有抗性；和c)该效应可经过宿主抗肿瘤免疫性的免疫激活而介导。
以2次连续移植而治疗的个别成胶质细胞瘤病人应答不充分，并且需手术去除此移植物。然后用从手术过程中回收的冷冻保藏肿瘤细胞，混合以另一种制备的同种异体和自体淋巴细胞培养物来治疗该病人。此混合物不施用到瘤床，而施用到远离肿瘤的皮下(实施例4和8)。该实验方法在产生全身性抗肿瘤应答中出奇地奏效。尽管该病人没有瘤内移植物，她应答的与有移植物一样好。该结论是远距离施用自体肿瘤细胞加上混合的淋巴细胞是有效的癌症治疗方法，这可能是由于增加该肿瘤免疫原性的强大能力。
本发明细胞疫苗的特点是此效应实质上大于仅仅用肿瘤细胞或用混合以前所用的佐剂或辅助因子肿瘤细胞而获得的效应。肿瘤细胞与该疫苗刺激的淋巴细胞之间的相互作用也许是复杂的。尽管不希望为任何一种理论所限制，但是肿瘤细胞(或肿瘤相关抗原)在由激活的淋巴细胞所刺激的宿主中产生的免疫学反应中实际上为旁观者似乎也是可能的。激活的淋巴细胞可参与一种或更多种以下的方式中。首先，它们可提供在募集、激活、或刺激宿主免疫细胞相互作用中有效的细胞因子。产生的细胞因子混合物优于以分离形式或经过转导细胞而提供的细胞因子，部分是因为其为这些因子的鸡尾酒。该鸡尾酒中的单个细胞因子可协同或甚至协作刺激超越由单个细胞因子以可靠的方式而刺激的多种活性。该鸡尾酒也可包括还没有鉴定或分离的细胞因子。其次，该激活的淋巴细胞也可在肿瘤抗原存在中发挥直接作用。第三，激活的淋巴细胞(特别是同种异体淋巴细胞)可在刺激宿主免疫细胞中起到接触作用，在此期间，该肿瘤抗原可作为旁观者而参与。
由于施用该疫苗而产生的免疫学应答可能同时包括体液和细胞免疫应答，但是细胞应答是尤为优选的。认为细胞免疫性(或者是细胞毒淋巴细胞，或者是辅助因子-诱导物募集其它因子机制)在提供抗靶肿瘤细胞的特异性细胞中是重要的。免疫学应答的存在可以通过标准的免疫学技术加以监测。然而，在人类治疗中，主要的目的是改善病人的临床病情。因此当涉及癌症治疗时，临床结果是用于本发明组合物效应及方法的优先分析方法。
本发明优于以前使用或建议的策略。本发明疫苗组合物的优势包括以下几个方面：
·该疫苗改善癌症病人的临床病情或预后。此效应甚至在癌症病人中肿瘤细胞其本身显然具有较少免疫原性时仍然有效。
·尽管此应答可通过肿瘤相关抗原而介导，但是没有必要证实在治疗患者肿瘤上任何特定抗原的存在。病人自身肿瘤细胞的使用确保了相关的抗原谱。
·没有必要在遗传上改变病人的细胞，或者使用病人的DNA在遗传上改变该疫苗的细胞。实际上，遗传上改变的细胞无需活的应答(尽管它们可以包括进本发明特定的实施方案中，如下所述)。
·该策略旨在产生全身性的免疫应答，且因此不仅在抗原发肿瘤，而且在抗与原发肿瘤具有相同肿瘤抗原的转移细胞中是有效的。
·除了最初可能对肿瘤细胞取样外，该方法可以最小损害的步骤完成。该疫苗组合物优选在远离肿瘤的位点施用。皮下施用途径是优选的。
·此效应是长期的，持续至少约2个月。由于设计该接种方法是为了刺激宿主的免疫系统，故其应该至多需要偶尔的补充。这是较继承性转移方法巨大的进步。
以下部分提供了为了制备和使用本发明疫苗的优选方法的进一步描述。
定义
这里使用的“疫苗”、“免疫原”、“免疫原性组合物”是指当施用给人类或动物患者时能够赋予一定程度特异性免疫原性的适当化合物或组合物。在本文中所使用的“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指包括至少一种作为活性成分的任意失活的细胞群的组合物。本发明的疫苗、免疫原或免疫原性组合物为活性疫苗，意味着它们能够刺激至少部分由宿主免疫系统所介导的特异性免疫学应答(如抗-肿瘤抗原或抗癌症细胞应答)。该免疫学应答可包括抗体、免疫反应性细胞(如辅助细胞/诱导细胞或细胞毒细胞)、或其任何的组合并且优选针对存在于待治疗肿瘤上的抗原。通过施用单一剂量或多剂量可在患者中引发或重新刺激此应答。除非特别说明，为了成为合格的疫苗无需组合物的进一步成份。
如果其能够：a)在幼小个体中产生抗抗原(如肿瘤抗原)的免疫应答；b)在个体中再次产生、增强、或维持高于没有施用该化合物或组合物时的免疫应答，化合物或组合物是“免疫原性的”。当以单一剂量或多剂量施用时如果其能够达到此标准，那么该组合物具有免疫原性。
“刺激”免疫或免疫学应答指施用起始、增强、维持宿主免疫系统能力的化合物或组合物从而以高于其它情况发生的水平与靶物质，如外源分子、同种异体细胞或肿瘤细胞反应。刺激“初级”免疫应答在这里指由于缺乏暴露至靶抗原、对靶子的不应性或免疫抑制，在以前没有检测到反应性的患者中引发特异性免疫反应。刺激“二级”应答指在以前没有检测到反应性的患者中起始、增强、维持反应性；例如，由于天然免疫性、自发的免疫或用一种或数种组合物或方法的治疗。
“细胞系”或“细胞培养物”指在体外培养或维持的高等真核细胞。应该明白细胞的后代与母本细胞可能完全相同(或者形态上，基因型上或表型上)。
这里使用的细胞“失活”表示使细胞变得不能分裂以形成后代。不过该细胞可能能够对刺激、生物合成和/或分泌细胞产物如细胞因子做出应答。失活方法在本领域中是已知的。优选的失活方法为用毒素如丝裂霉素C或辐射处理。被固定或穿孔并且不能分裂的细胞也为失活细胞的实例。
“混合淋巴细胞细胞反应”、“混合淋巴细胞培养物”、“MLR”和“MLC”交互使用，是指包括最少2种不同的同种异型不同细胞群的混合物。至少一种同种异型不同的细胞为淋巴细胞。将这些细胞在适宜的条件下共同培养一段时间从而刺激该淋巴细胞。MLC频繁出现目的是提供同种异体刺激如可以起始淋巴细胞的增殖；但除非说明，在培养过程中的增殖是不必要的。在适当的上下文中，这些术语作为选择可指源自培养物的细胞混合物。当来自MLC的细胞作为丸剂给予人类时，特别是瘤床中时，其称为“细胞移植物”。
“遗传改变”指这样的过程，即不是通过有丝分裂或减数分裂将遗传元件导入细胞中。该元件对于此细胞可为异质的，或者其可以是已经存在于该细胞中元件的额外拷贝或改进的版本。例如，可以通过以重组质粒或其它多核苷酸经本领域任何方法，如电穿孔、磷酸钙沉淀、或与多核苷酸-脂质体复合物接触而转导细胞完成遗传改变。例如，也可通过以DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染而完成遗传改变。优选遗传改变在其后代细胞中是可以遗传的，但是这对于完成本发明不总是需要的，特别是当改变的细胞用于药物组合物而不进一步增殖时更是如此。
以单数或复数形式使用的术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指进行了恶性转化从而使其对于宿主有机体为病理性的细胞。原发癌细胞(即，在靠近恶性转化位点获得的细胞)可以通过成熟建立的技术，特别是组织化学检查而容易地与非癌细胞相区别。这里使用的癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括任何源自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞和源自癌细胞的体外培养物和细胞系。
这里使用术语的“肿瘤相关抗原”或“TAA”指由肿瘤细胞较相同组织类型非肿瘤细胞以更高频率或密度表达的分子或复合物。肿瘤相关抗原可以是由宿主非正常表达的抗原；可以对其进行突变、截短、修饰或对宿主正常表达的分子进行其它异常的改变；它们可以与正常表达的分子相同但也可以异常高的水平表达；或者它们可以在异常的周围环境中表达。例如，肿瘤相关抗原可以是蛋白或蛋白片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其它生物分子的任何组合。特定肿瘤相关抗原的存在形式或特征的知识对于本发明的实践不是必需的。
正如这里所使用的，“治疗”是指临床介入从而改变该患者或被处理的细胞的临床过程，并且可以是为了预防或为了解决临床病理学进行。理想的效果包括防止疾病的发生或复发，减轻症状，该疾病任何直接或间接病理学后果的减少，防止转移，降低疾病发展速度，改善或减轻病情，并且缓解或改善预后。
与病情有关的“病理学”是以下的任何一种情况，包括患者的健康、正常生理或生活质量。这可以包括(但不限于)破坏性侵入受损的组织到以前完好的组织中、以损害正常组织功能为代价的生长、不规则或受到抑制的生物学活性、加重或抑制炎症或免疫学应答、增加对其它病原有机体或试剂的易感性、和不理想的临床症状如疼痛、发烧、恶心、疲劳、情绪改变、和其它可以由值班医生确立的特征。
“有效量”为足以达到有利或所需的临床结果，特别是产生免疫应答或临床病情显著改善的量。免疫原性的量为足以在待治疗受试者(发病或为发病)中引发免疫学应答的量，该免疫学应答可以包括体液或细胞免疫或同时包括这二者。对于具有肿瘤患者的临床应答而言，有效量为足以减轻、改善、稳定、逆转或延缓疾病发展的量或其它减少该疾病病理学后果的量。用于有效量中优选的量和细胞比例在本文的别处列出。
“个体”或“患者”为脊椎动物，优选为哺乳动物，更为优选为人类。非人类哺乳动物包括但不限于农场动物、比赛动物和宠物。
一般方法
除非特别说明，否则本发明的实践将使用本领域分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在下列文献中有详细解释，如“分子克隆：实验指南”，第二版(Sambrook等，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait，编，1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney,编，1987)；“酶学方法”(学术出版公司)；“实验免疫学手册”(D.M.Weir & C.C.Blackwell，编)；“哺乳动物细胞基因转移载体”(J.M.Miller & M.P.Calos，编，1987)；“当前分子生物学方法”(F.M.Ausubel，编，1987)；“PCR：聚合酶链式反应”，(Mullis等编，1994)；“当今免疫学方法”(J.E.Coligan，编，1991)。关于混合淋巴细胞培养的实例也可参见Gately等，Lee等.,和Zarling等(下文)。
用于药物组合物的制备和施用的一般方法描述于E.W.Martin编，Mack出版公司出版的雷明顿药物科学，第18版(1990)中。
有许多可用于测试和调整本发明组合物的癌症动物模型。肿瘤可以与强有力的治疗组合物共注射，从而在治疗前开始建立，或者在接种幼小动物后一段时间进行施用接种。说明列于实施例部分。美国专利号5,663,481,5,602,305和5,476,993；欧洲申请379,554；和国际申请91/01760中描述的嵌合动物模型也是有用的。
在此上下文中提及的所有专利，专利申请，文章和出版物在此引入以供参考。
细胞疫苗的制备
本发明的细胞疫苗一般在施用至患者前通过以适当方式制备每种细胞群或其等价物，混合这些组分和任选共培养或储存细胞混合物而加以制备。
肿瘤相关抗原：肿瘤相关抗原的最常见来源为在表型上与待治疗病人接近的肿瘤细胞或细胞系。来自相同组织类型并且具有类似组织学特征的肿瘤趋于具有相同的肿瘤相关抗原。虽然该抗原全谱可随每个肿瘤而改变，但存在至少一种抗原为相同的可能性。优选地，此肿瘤细胞与待治疗的患者是组织相容性的。
一般地，当可能从病人来源获得肿瘤细胞时，优选这些细胞尽可能具有相关肿瘤相关抗原的所有补体。循环系统肿瘤如白血病和淋巴瘤可容易地从外周血进行取样。另外，一般通过手术方法取样肿瘤，包括但不限于活检或手术切除或摘除。也可从转移位点收集肿瘤细胞。可通过物理操作再任选结合用蛋白酶如胶原酶等的处理而解离实体瘤为分离的细胞。然后将这些细胞转移至新鲜的实例培养基中。例如，可将细胞冷冻于液氮中保存备用。任选地，并且特别是原发肿瘤体积较小时，可以扩展肿瘤细胞群以确保充足的供应。细胞在适于增殖的培养基中培养，并任选补充有生长因子。优选地，不需进一步转化获得包括肿瘤细胞特征的稳定细胞群，尽管也许需要转化。虽然其一般并非必要，但可任选克隆该细胞群以增强其稳定性或强化其特征。用于稳定地从多种细胞类型中建立短期培养物并且获得至少108个细胞的条件由Dlllman等(1993)在免疫治疗杂志14:65-69中描述过。如果可能的话，使用未增殖的原发肿瘤细胞，因为关键的肿瘤抗原经过增殖过程后将会丢失。
按所述获得的癌细胞或细胞系可直接与其它疫苗成份混合。然而，为了防止一旦施用至患者后的进一步增殖，失活癌细胞是优选的。可使用任何物理、化学或生物学失活方法，包括但不限于辐射(优选用至少约5,000cGy，更为优选至少约10,000cGy，更为优选至少约20,000cGy)；或用丝裂霉素-C(优选至少约10μg/mL；更为优选至少约50μg/mL)处理。
或者用作肿瘤抗原来源的癌细胞可以用试剂如戊二醛、多聚甲醛或福尔马林加以固定。也可将它们溶解于离子或非离子去污剂如脱氧胆酸盐或辛基葡糖苷中或者用例如痘苗病毒裂解。如果必要的话，可澄清此溶解的细胞悬液并且进行任何一种生化分离方法从而富集或分离特定的肿瘤相关抗原。在与该疫苗的其它组分混合前，去除用于处理该制剂的试剂；例如，通过离心并且清洗固定的细胞或裂解溶解的悬液而去除。除非特别要求，否则对该肿瘤细胞群，特别是未失活的肿瘤细胞群的这种处理可看作对于完成本发明实施方案是选择性的并且是非必需的。
同种异体细胞：本发明的细胞疫苗也包括第2种细胞群，其中至少有一部分为对待治疗患者讲为同种异体的并且能够与同种异体刺激物特异性反应的细胞。这一般指淋巴细胞或淋巴细胞系细胞，特别是T细胞。表达CD4抗原(CD4+细胞)的淋巴细胞和表达CD8抗原(CD8+细胞)的淋巴细胞均可以包括进T淋巴细胞的定义中，并且它们中的任何一个或二者可同时包括进该疫苗中。优选地，在第二种细胞群中的该同种异体细胞至少有10％CD4+细胞或10％辅助细胞/诱导物细胞；更为优选地，它们至少有大约20％CD4+细胞或10％辅助细胞/诱导物细胞；更为优选地，此部分至少有大约30％CD4+细胞或10％辅助细胞/诱导物细胞；更为优选地，此部分至少有大约50％CD4+细胞或10％辅助细胞/诱导物细胞。CD4+细胞可以用商业上可得到的特异性抗体如OKT4再结合荧光一活化计数器而方便地加以定量。
如果其具有足以刺激同种异体反应的表型差异，那么一般将这些细胞描述为同种异体的。在本文的上下文中，术语“同种异体”的使用限于主要组织相容性复合物(MHC)抗原表型的差异。在相同物种细胞间MHC同种异型特征的任何性质差异表示它们为同种异体细胞。在人类中，在HLA-A、B、C、D、DP、DQ和DR基因座的任何一处差异构成了本发明有关的特征异型差异。HLA-A、B、C、D、DP、DQ和DR的特征一般由细胞毒性或免疫荧光技术用同种异型特异性抗体加以测定。用于本发明目的的优选同种异型差异涉及HLAⅡ类抗原。比较推定同种异体细胞和待治疗患者的细胞之间的DP、DQ和DR基因座的Ⅱ类抗原，优选至少在1个基因座，并且依次更为优选2、3、4、5或甚至6个基因座可区别同种异体细胞的差异。Ⅱ类抗原也可在D基因座通过用分型的细胞进行的混合淋巴细胞反应加以测定。同种异体细胞的供体一般与待治疗患者无关，从而使MHC错配的数目最大化。
Ⅱ类区域错配的数目涉及但又屈从于同种异体性的功能测定。如果用待治疗患者失活的单核细胞作为刺激细胞证明其在单因素MLR中有强烈的增殖应答，那么此同种异体细胞特别适用于本发明。已知产生特别强烈的应答，特别是对与患者具有相同基因型的刺激细胞产生特别强烈应答的供体尤为合适。可以测定抗病人细胞的一组不同的同种异体细胞从而测定诱发最为强烈的应答的细胞。
该同种异体细胞群不一定限于获自单一供体的那些细胞群。可任选使用2个，3个或更多个供体以利于收集同种异体细胞，从而增加对同种异体细胞的刺激，进而最大限度地减少引发抗-同种异型应答，或另外增强该细胞疫苗的效应。
同种异体细胞优选在施用至患者前激活或刺激，或者一旦施用后能够激活或刺激。本文中的“活化”意为被诱导增殖。增殖可通过细胞计数或通过在过去的～18个小时培养中标准的[3H]-胸苷摄入分析而测定。用丝裂原如PHA刺激细胞显示出最大的增殖，并且没有诱导剂的培养细胞测到基线的增殖。实质上增殖的细胞将显示出高于基线水平的增殖。
本文中的“刺激”意为由外源试剂的诱导从而经历代谢改变，特别是生物学有关分子如细胞因子或其它可溶性介质分子的合成和/或分泌的增加，从静止淋巴细胞向淋巴母细胞形态上的改变，或细胞中生物反应性的增加，这些反应性增加包括但不限于内吞作用、外排作用、吞噬作用或外部分子在细胞内运输和加工的增加。许多生物学分析与活化和刺激的测定有关，包括增殖和细胞毒性分析、组织学检查、细胞表面标记密度的测定、由细胞合成和/或分泌介质分子(特别是细胞因子)的测定、或募集效应细胞如嗜中性细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜伊红性粒细胞和其它淋巴细胞能力的增加。当分析显示出被测的诱导特征较没有诱导时观察到的特征有改变时刺激便发生。特别相关的刺激形式为与在免疫学应答中具有该特征的细胞参与频率相关联的形式。这些特征包括在对特异性抗原做出应答的芽基发育、增殖或细胞毒性以及介质分子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、M-CSF或GM-CSF分泌的增加。用于测定刺激的一些分析列于实施例5中。
可从任何合适的组织来源收集淋巴细胞用于本发明，但其最为方便地是从同种异体供体中获得。优选预筛供体从而鉴定出具有足够白细胞数量的供体并且排除具有肿瘤或可传播感染的供体。可通过全血供应然后分离血液细胞群或更为方便地通过白细胞提取法进行收集。加工足够的血液以获得大约100-500mL白细胞提取悬液，优选至少约200mL白细胞提取悬液。用抗凝剂如柠檬酸盐或EDTA收集血液。例如，可以用Cobe2997(COBE SPECTRA,Lakewood CO)；Fenwall CS 300(Fenwall,Deerfield IL)；或Haemonetrics(Braintree MA)血细胞分离器进行白细胞分离。～40-50mL/min的流速2-4小时产生具有＜1mL红细胞的-200-250mL白细胞分离悬液，并且随着所用的单个个体及仪器而有变化。
通过任何合适方法制备的淋巴细胞一般通过清洗而去除血小板，并且再悬于适当的培养基如补充以2％失活胎牛血清的AIM V中。适当的方法包括离心适当的培养基如FICOLLTM或HISTOPAQUE，流经尼龙-羊毛柱，亲和分离方法如用抗有关细胞表面标记的抗体在荧光细胞分离器中筛选或分类。为了方便，减少操作步骤的数目是优选的。例如，更好的白细胞分离可以避开后来在FICOLLTM上分离的必要。
可以大大增强对有关肿瘤相关抗原免疫应答的任何方式刺激同种异体细胞。刺激同种异体细胞的定义包括LAK和TIL细胞。可根据本领域已知的技术制备和分离LAH和TIL细胞；用于本发明的主要差别在于它们对于目的受体是同种异体的。本发明包括对同种异体细胞的任何一种活化或刺激，包括但不限于与既非个体又非病人来源的细胞预培养，与活的(没有失活)肿瘤细胞预培养，与个体来源的饲养细胞预培养，与分离或重组的细胞因子或其混合物预培养，与丝裂原如ConA预培养或上述技术的任何组合。用于刺激免疫细胞的方法和用于测定刺激的方法可特别地参见美国专利号5,569,585。
特别优选的刺激方法为混合淋巴细胞培养，如本领域所已知的并且在此进一步加以描述。
刺激细胞：用于刺激同种异体淋巴细胞的优选方法是将其与能够提供适当刺激的细胞混合。这些细胞在此称为“刺激”细胞。当以这种方式而被刺激的同种异体淋巴细胞称为“应答”细胞。优选的刺激细胞为对于应答细胞是同种异体的细胞。
在本发明的一些实施方案中，刺激细胞的来源为在遗传上与待治疗患者类似的个体；更为优选地，这些细胞为患者自身的细胞。在有些情况，由于被肿瘤或以前治疗的刺激，该患者可能具有抗肿瘤相关抗原的以前的免疫应答。
在本发明其它的实施方案中，刺激细胞不是来自待治疗的患者，而是其它的供体或多个供体。使用患者细胞的优势在于在施用后，该应答者将继续接受来自患者同种异型抗原的刺激。然而，使用第三者刺激物有其自身的一套优势。例如，可以制备大批的刺激细胞用于几个不同的病人。根据说明方法，在足以刺激的条件下合并和共同培养来自几个不同供体的分离的白细胞而不是来自待治疗患者的细胞。然后，为了形成针对每位病人肿瘤相关抗原的编辑的细胞疫苗，将该培养的细胞馏分与来自每个病人的肿瘤细胞混合。
在本发明的进一步实施方案中，使用来自多个不同个体的刺激细胞，这些个体可包括或不包括待治疗的患者。
用作刺激细胞的适当细胞类型为具有高密度组织相容性抗原特别是Ⅱ类抗原的细胞。淋巴节细胞是合适的，但更为常见的细胞来源为外周血细胞。可以通过白细胞分离从患者循环系统中收集白细胞；然而，全血收集更为常见，并且通常更为方便因为所需刺激细胞的数目大大低于应答细胞的数目。通过静脉穿刺用适当的抗凝剂收集的200-400mL外周血提供足以制备疫苗的细胞。
上述的分离方法一般可用于从患者全血样品中回收刺激细胞。从人群中富集或至少不消耗表达Ⅱ类组织相容性抗原的细胞，如B细胞和单核细胞是理想的。对细胞广泛的次级分离通常是不必要的，并且简单的外周血单核细胞(PMBC)对大多数目的是足够的。
混合淋巴细胞培养：当被使用时，除了同种异体刺激将在体内发生外，就在施用至病人之前可混合供体同种异体淋巴细胞和刺激细胞。然而，在实施例3中提供的数据显示在施用之前共培养2种细胞会增强该组合物的效应。
本发明包括用2-维(two-way)混合淋巴细胞细胞培养物作为刺激同种异体细胞的方法。然而，当用肿瘤病人的白细胞作为刺激细胞时，进行一维MLC。为了进行一维MLC，例如通过以50μg/mL丝裂霉素C处理107个细胞/mL然后清洗而失活患者的刺激细胞。
将同种异体淋巴细胞与刺激细胞在适当的培养基，一般为补充以胎牛血清或其替代物并且任选包括其它生长因子的培养基中混合。应答∶刺激细胞的比例优选在大约100∶1到1∶10之间；更为优选大约在50∶1到1∶1之间；更为优选大约在20∶1到5∶1之间；更为优选大约为10∶1。只要在一维MLC中存在多种刺激或应答细胞，便维持大约相同的应答∶刺激细胞的比例。因此，当使用2种失活的刺激物时，该比例可大约为8∶(1∶1∶1)。类似地，当使用多种应答细胞时，该比例可为(5∶5)∶1或(3∶3∶3)∶1。如果一起培养，此多种应答组合物成为多维MLC。多种应答细胞的一维激活可通过以10∶1的比例对每种应答种群进行单独培养，且然后混合备用前的同种异体激活的细胞而完成。
一旦以所需的比例混合，将细胞以适当的浓度培养于合适的环境(如95％O2,5％CO2,37℃)中。培养时间优选至少约12小时，更为优选在24至72小时之间。通过培养3-5天可获得额外的刺激，尽管此方式一般不是优选的，因为在培养的头48到72小时细胞因子水平一般较高。实际者可按照前述或实施例5中所述对这些特性进行生物分析而测定是否条件对于应答细胞的增殖或刺激是充分的。在另一种方法中，在培养上清液中测定TNF-α、LT和/或INF-γ的水平。刺激以50-150U/mL或500-3500pg/mL TNF-α或LT的生物活性水平表示。优选的培养物为通过四唑还原分析(XTT)或流式细胞术(CD69或细胞内酯酶)或二者共同而测得的在头3天培养中显示出较未刺激供体对照值≥10％活性水平的那些培养物。
本文中引用的优选细胞来源、细胞比例、培养条件和其它特征意在帮助实践者而不是为了限制本发明的范围。对于任何单一的参数并没有限制，因为各种其它的参数组合将产生具有所需功能特性的细胞群。
一般在添加肿瘤细胞之前用同种异体应答细胞和患者的刺激细胞进行混合淋巴细胞培养。通常，该刺激细胞，尽管来自癌症病人，但其本身为非癌症性的。然而，在MLC期间存在肿瘤细胞是可能的。偶尔，如在治疗白血病中该刺激细胞和肿瘤细胞可以是相同的。
优化功能效应：在动物模型实验中的实践显示并非所有的第三者供体提供相同程度的同种异体激活，特别是当不同的第三者供体用作刺激细胞时。
在变化是供体细胞依赖性的程度上，无论就培养中观察到的同种异体激活还是临床结果而言均可根据实践挑选供体。根据临床经验，表示特定激活水平的功能标准，如四唑还原分析(XTT)，流式细胞分析或由ELISA测得的某些淋巴因子的分泌水平可足以预言结果。一旦鉴定出成功的供体，他们可构成一组规则的供体作为服务实验室提供免疫原性组合物的来源。
在变化依赖于供体和病人间匹配的程度上，也可使用其它几种筛选方法。由于某些供体-病人组合的效率根据组织相容性而改变，故如果必要的话，可根据组织匹配筛选供体。如果必要的话，可用前述一种嵌合动物模型以特定的肿瘤测试特定的人类组织相容性类型的供体。
可以用来自病人的PBL和来自体外分析中潜在供体筛选的PBL进行更为直接的供体鉴定测试。一种这样的分析为相反功能测试。在该分析中，用潜在供体的同种异体活化细胞作为失活的刺激物在活化淋巴细胞培养中将病人的细胞建立为应答细胞。由于认为该应答包括同种异体活化细胞的细胞因子分泌，故其它的标记培养(predictor)可以为二-期培养。在该方法中，用被测试用于制备培养物中的相同应答和刺激细胞建立应答：刺激培养物。在第3天，用丝裂霉素或亚致死辐射失活该培养物，从而该细胞仍然产生细胞因子而不复制。然后加入来自病人的白细胞，并且其应答后进行功能分析、细胞因子分泌或T细胞增殖。在该方法的变异中，也以第二期培养物提供失活的肿瘤细胞，并且在第二期培养后通过测定51Cr标记的肿瘤细胞的裂解而测定读数。
描述这些分析是为了方便希望以多种方法，特别是建立富集高应答者供体组使本发明组合物的读者受益。应该强调本发明可以在不利用在该部分中描述的其它提取方法而完成。
也可利用一种或更多种可得到的且适当的策略增强同种异体活化程度或潜在的治疗结果：a)在MLC中用多种供体细胞作为应答细胞或刺激细胞；b)在MLC中用来自待治疗病人的细胞作为刺激细胞；c)添加H2受体拮抗剂到MLC培养基中。优选的H2受体拮抗剂为西脒替丁，以5μg/mL到100μg/mL，典型为20μg/mL添加到培养基中。用西脒替丁或多种供体细胞的好处分别说明于实施例6和7中。
遗传上改变的细胞：用于该疫苗中的同种异体细胞可以促进对该疫苗应答的方式在遗传上对其加以改变。特别优选的是在遗传上被改变从而表达更高水平细胞因子的同种异体细胞。认识到淋巴细胞，特别是同种异体混合物中的淋巴细胞已经可以产生可检测到水平的细胞因子。由于遗传改变而发生的“更高水平的”表达高于没有以相同方式进行遗传改变而类似的细胞中观察到的表达水平。任何细胞因子，尤其是那些具有募集或刺激淋巴细胞或抗原存在细胞系或参与增强免疫应答能力的细胞因子均可用于此目的。优选的细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因子，如TNF-α；白细胞介素，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和IL-10；干扰素，如IFN-α和INF-γ；造血因子；和集落刺激因子，如GM-CSF和M-CSF。
在可用于本发明的可能细胞因子中，GM-CSF是特别优选的因为其在特异抗原呈递细胞成熟和功能中具有重要作用。这被认为是重要的因为许多肿瘤细胞，如上皮来源的细胞不表达可检测到的MHCⅡ类分子。IL-4也是特别优选的多功能细胞因子，其具有对B淋巴细胞和T淋巴细胞以及造血细胞广泛的刺激活性。其作用包括募集和活化CD4+抗原呈递细胞以及诱导细胞毒性T淋巴细胞。TNF-α是第三特别优选的细胞因子，部分是由于其在免疫和炎症应答中的广泛效应。
人类IL-4和TNF-α的蛋白和DNA编码序列是已知的并且包括编码序列的载体是可得到的。对于IL-4序列和载体，参见美国专利No.5,017,691和EP 230107。遗传上改变的CHO细胞描述于U.S.5,034,133中。IL-4在治疗实体瘤中使用(或者作为分离的重组物或者于遗传上改变的细胞中)描述于U.S.5,382,427中。TNF多肽、编码序列、载体和遗传上改变的宿主细胞描述于U.S.5,288,852、EP155549和U.S.4,879,226中。也可用于本发明中的TNF变异体描述于U.S.4,677,063中。包括TNF-α和干扰素的组合物描述于EP131789中。TNF和IL-4在抑制癌细胞生长中的协同作用描述于WO92/05805中。
遗传改变可通过本领域已知的任何一种方法完成。一般地，将所需细胞因子的编码序列可操作地连接到在靶细胞中具有组成性或诱导活性的启动子以及对于该蛋白转录和翻译所必需的其它控制元件和多聚-A序列上。将由此组成的表达盒用本领域已知的任何一种技术，如磷酸钙沉淀、用阳离子脂质体的插入或用对于该细胞为特异性的(tropic)病毒载体导入细胞中。遗传改变的方法描述于在前面章节中引用的专利文献中。遗传改变的一种优选的方法是使用包括适当表达盒的LXSN逆转录病毒载体，如实施例2中所说明的。另一种优选的方法是使用腺病毒(M.Graf等1994)。简言之，通过遗传加工商业上可得到的的质粒如加拿大Microbix所供应的质粒可制备的腺病毒重组表达载体。适当的感染条件和感染的多种性(MOI)可在预备实验中用报告基因如β-半乳糖苷酶加以测定，并且然后用于细胞因子转移中(Kammersheidt等)。使用病毒载体的优势为该载体可以首先复制，并且然后感染和改变整个细胞群。因此，可将遗传上改变的分泌细胞因子的细胞建成细胞系，或者就在使用本发明疫苗之前改变新鲜的白细胞分离制剂。在以后的实例中，疫苗制备还包括用包括特定目的细胞因子编码区的病毒载体对待治疗受体感染同种异体的细胞群的步骤。
进行同种异体淋巴细胞的遗传改变可用来自待治疗或者淋巴细胞的共培养替代或补充。赋予产生适当细胞因子或细胞因子混合物的能力可使同种异体淋巴细胞自我刺激，避开与白细胞共培养的需求。更为常见地，这2种效应将是互补或甚至是协同的，并且同时有此2种功能可能是优选的。例如，然后将改变产生重要细胞因子的淋巴细胞与白细胞共培养，那么其可激活以更少但重要的其它细胞因子产生。
可以用类似的方法在遗传上改变用于该疫苗组合物的原发肿瘤细胞或肿瘤细胞系，从而他们可产生细胞因子。此改变肿瘤细胞描述于实施例2中。一般地，在遗传上改变同种异体淋巴细胞而不是肿瘤细胞是优选的；部分地，是因为该肿瘤细胞在施用至患者之前一般要被辐射。不过，改变肿瘤细胞可能赋予某些优势。特别地，肿瘤细胞容易形成稳定的细胞系。该细胞系(特别是具有广谱肿瘤相关抗原的细胞系)可用于产生标准的分泌细胞因子的细胞系以用于治疗多种患者的疫苗中。如实施例2中所示，可以制备在一定剂量辐射一段时间后终止其增殖而由于遗传改变继续产生细胞因子的肿瘤细胞系。为了在本发明中的使用，就在制备该疫苗前在培养中形成和增殖或维持具有这些特性的细胞系。将所需数目的肿瘤细胞以正确的剂量辐射并与同种异体淋巴细胞混合；如果需要用于增强注射，同时保留活的改变过的细胞。
疫苗的制备：为了使种群中各种细胞的存活最多或维持其所需的功能，在接近施用时制备疫苗是优选的。可以预先收集各种细胞群并且根据疫苗中细胞的类型和功能对其进培养或冷冻保存。新鲜获得的细胞是优选的。来自混合淋巴细胞培养或整个疫苗的细胞也可作为混合物而冷冻保存。然而，进行MLC然后在施用至病人之前立即加入肿瘤细胞是优选的。
当通过MLC刺激同种异体细胞时，在疫苗中将通常有3个细胞群。刺激细胞的作用主要是在体外刺激同种异体细胞，并且其在最终疫苗中的存在可能是不必要的。这样，可以将其任选去除，尽管这通常不是必需的。
去除用于制备这些细胞中的任何添加成份是重要的，这些成份在患者中可能产生不必要的效应。特别地，通常去除培养基中的胎牛血清、牛清蛋白或其它生物学添加剂从而避免抵抗它们的免疫学副反应。一般地，如通过反复温和离心将清洗该疫苗的细胞组分加入到适当药物学上相容的赋性剂中。相容的赋性剂包括具有或不具有生理上相容的缓冲盐如磷酸盐或Hepes的等渗盐和营养物如葡萄糖、生理上相容的离子、或氨基酸以及适用于淋巴细胞群的各种培养基，特别是缺乏其它免疫原性组分的培养基。也可使用运载剂如清蛋白和血浆成份以及非反应性增稠剂。存在于此药物制剂中一定量的非活性生物学组分优选来自与待患者相同的种类，甚至更为优选地，其为以前获自该患者本人的成分。
本发明的疫苗组合物可以任选包括与肿瘤相关抗原和活化的同种异体细胞独立或起协同作用的其它活性成份。这些任选的成份包括但不限于分离或重组的细胞因子，特别是在本文中清晰地指出的那些细胞因子，佐剂或其它细胞类型。
本发明的疫苗组合物如果确保其本身将不会赋予受体其它主要疾病，便认为其“适于”施用至人类。副作用如局部炎症、硬结、或疼痛或发热反应可能是不可避免的并且如果治疗在很大比例病人中是成功的，那么它一般是可接受的。然而，该组合物应该没有：a)无关或病原性的感染或化学试剂，特别是那些来自同种异体淋巴细胞供体的试剂；b)在组织培养中可能产生或传播的不必要生长，如细菌或细菌毒素，分枝杆菌及病毒的生长；c)并非源自待治疗患者的不可接受水平的致癌剂或快速生长的癌细胞；和d)易于启动或形成不必要免疫反应，特别是过敏性休克的组分。可以使用的特别测试列于本文的实施例部分。
本发明的组合物及其次级组分可以单位剂量或试剂盒的形式提供。本发明的试剂盒包括细胞疫苗的各种组分或者药物组合物以分开的容器提供。这些容器可分别含有细胞或抗原，当混合到一起时构成了单位剂量或多剂量形式的本发明疫苗。优选的试剂盒在容器中含有：对所述的病人为同种异体的刺激的淋巴细胞，特别是获自同种异体淋巴细胞与自体白细胞共培养的白细胞；和来自该病人的肿瘤相关抗原，特别是来自该病人或其后代的原发肿瘤细胞。作为选择，这些试剂盒可以在一个容器内包括细胞混合物，在另一个容器内含有药物赋性剂。在此目录中优选的试剂盒在第一个容器中含有：对于待治疗的患者为同种异体的刺激的淋巴细胞，并且在第二只容器内含有药物赋性剂。使用者可以利用该赋性剂从患者制备其自己的肿瘤细胞；然后将这些细胞与施用到患者的刺激的同种异体淋巴细胞混合。本发明包装的组合物和试剂盒一般包括贮存说明书、该组合物的制备和施用。
细胞疫苗在癌症治疗中的应用
本发明组合物可施用到患者，尤其但不限于人类患者。它们对于抗肿瘤相关抗原的应答或治疗癌症特别有用。
治疗的目的：施用本疫苗的一个目的是引发免疫应答。该免疫应答可以包括体液或细胞免疫应答或者同时包括这二者。体液免疫性可通过对治疗个体血清样品中抗体的标准免疫测定加以测定。由于认为细胞免疫性在癌症的免疫监视中起重要作用，故产生细胞免疫应答经常是治疗的特别的目的。正如这里所使用的，“细胞免疫应答”为涉及T细胞并且可以在体内外观察到的应答。
一般的细胞免疫应答可测定为施用疫苗后从患者取样的细胞(特别是PBL)中T细胞增殖活性。优选来自患者的失活的肿瘤细胞用作刺激细胞。非特异性丝裂原如PHA用作阳性对照；与刺激细胞无关的赋予用作阴性对照。将PBMC与刺激细胞孵育适当的时间(一般5天)后，测定[3H]胸苷的掺入。如果必要，可以用流式细胞仪对T细胞亚类的增殖进行测定。也可测定T细胞的细胞毒性(CTL)。在此测试中，将从患者中富集的T细胞群在标准的51Cr释放分析中用作效应细胞。用大约200μCi Na2 51CrO4在37℃60将肿瘤细胞标记为靶子照射60分钟然后清洗。然后将T细胞和靶细胞以各种效应细胞-对-靶细胞的比例在96-孔U-底板中混合(-1×104/孔)。以100×g离心平板5分钟引发起始细胞接触并且在具有5％CO2中于37℃孵育4-16小时。测定上清液中51Cr的释放并且与在无T细胞(阴性对照)或与0.1％TRITONTM X-100(阳性对照)孵育的靶子比较。
施用该疫苗的另一个目的是治疗肿瘤肿瘤疾病，特别是癌症。除非特别需要，否则该疫苗的有利效应一般将至少部分为免疫介导，尽管为了使该组合物和治疗方法落在本发明范围之内，免疫应答无需被证明为阳性。
合适的患者：本发明组合物既可以施用至人类，也可以施用至非人类脊椎动物。它们提供了以前组合物所没有的优势，特别是在远缘杂交种群和自发肿瘤中。在人类患者中已经测定了细胞疫苗。这些疫苗可以由在职医生施用至任何病人。一般地，该患者或者具有癌症，或者具有患癌症的风险。
用于治疗的典型的人类或者包括两组，他们可以由临床标准划分。具有“晚期疾病”或“晚期荷瘤”的病人为那些具有临床上可检测到肿瘤的病人。临床上可检测到肿瘤为可根据肿瘤体积而检测到的肿瘤(例如，通过触诊、MRI、CAT扫描、X-射线、放射闪烁；其本身上的阳性生化或组织病理学标记不足以鉴定该人群)。
将本发明疫苗组合物施用至晚期病人以减轻其病情。理想地，出现了肿瘤体积的减小，但任何临床上的改善都构成优势。临床改善包括肿瘤风险或发展速度的下降或其病理学后果的减小。
第二组合适的患者在本领域称为“辅助组”。他们是具有癌症病史但对其它治疗方式产生应答的个体。以前的治疗可以包括(但不限于)手术切除、放疗、传统的化疗以及其它方式的免疫治疗。结果，根据上面给定的定义这些个体没有临床上可检测到的肿瘤。然而，他们被怀疑在靠近原发肿瘤位点或通过转移具有复发或发展疾病的风险。辅助组可以进一步分为高风险和低风险个体。此划分是根据开始治疗前后观察到的特征加以确定。这些特征在临床上是已知的并且对于每种不同的癌症而适当地加以定义。具有高风险亚组的典型特征为其中的肿瘤侵入邻近的组织并且显示有淋巴结参与的类群。
为了引发主要作为抗复发预防手段的抗癌症应答，将本发明的疫苗施用至辅助组的病人。理想地，该组合物延缓癌症的复发，或更为优选地，减少复发的风险(即，提高治愈率)。可以通过与其它病人类群和其它治疗方式测定这些参数。
当然，这两个病人组之间的交叉也会发生，并且将本发明的疫苗组合物在任何合适的时间施用。例如，治疗可以在对具有高瘤荷病人传统治疗之前或期间进行，并且在该肿瘤变得在临床上测不到时继续治疗。治疗可以在起始位于辅助组但显示复发迹象的病人中进行。
可通过本发明组合物和方法治疗的肿瘤的实例包括：胰腺瘤，如胰腺导管腺瘤；肺部肿瘤，如小细胞和大细胞腺瘤，鳞状细胞瘤和brionchoalevolar瘤；结肠瘤，如上皮腺瘤及其转移物；和肝部肿瘤，如肝细胞瘤和胆管癌。也包括乳腺瘤，如导管和小叶腺瘤；妇科肿瘤，如鳞状和宫颈腺瘤，及子宫和卵巢腺瘤；前列腺肿瘤，如前列腺腺瘤；膀胱肿瘤，如过渡(transtitional)鳞状细胞瘤，RES系统肿瘤，如节状或分散B细胞或T细胞淋巴瘤，浆细胞瘤以及急性或慢性白血病；皮肤肿瘤，如恶性黑素瘤；和软组织瘤，如软组织肉瘤及平滑肌肉瘤。特别感兴趣的为脑瘤，如星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤和原发性神经外胚层瘤。该目录包括神经胶质瘤，成胶质细胞瘤和胶质肉瘤。
个体的免疫状态可以为以下任何一种：该个体对于存在于组合物中一些肿瘤相关抗原可能为免疫学上新生的，其中施用该组合物可引发或促进抗肿瘤应答成熟。该个体目前可能不表达抗肿瘤-免疫性，但可具有免疫学记忆，特别是对于该疫苗中包括的肿瘤相关抗原的记忆，其中可以施用组合物以刺激记忆应答。该个体也可对包括于此疫苗中的肿瘤相关抗原具有免疫原性(或者为体液，或者为细胞的免疫性，或者同时拥有二者)，其中可施用组合物以维持、增强或成熟应答或募集免疫系统的其它目标。或者应该至少具有部分免疫活性从而使移植物对宿主反应的病理学范围降到最低。然而，已经认识到癌症病人经常显示出一定程度的免疫抑制，并且只要该组合物安全而有效地施用，那么此抑制不一定防碍本发明组合物的使用。患者的免疫活性可能是来源于宿主，或者可通过同时发生的继承性转移治疗而提供。
施用方式和剂量：本发明组合物可以在任何位点，特别是原发肿瘤的“远端”或“远侧”施用。
药物组合物的施用途径可以是胃肠外、肌肉内、皮下、皮内、腹膜内、鼻内、静脉内(包括通过Indwell导管)、经过传入淋巴管或通过对待治疗肿瘤和患者的病情适当的其它途径。由于在施用后数天可能发生低度的炎症或硬化，相对无损伤性的方法，特别是皮下途径是优选的。
无论是对免疫应答的刺激或者是在本文别处所定义的癌症治疗，施用的剂量为导致所需治疗效应的“有效的”量。对于本发明的药物组合物，有效的剂量一般位于105到1011个细胞的范围，包括同种异体淋巴细胞和(如果存在的话〕来自待治疗患者的肿瘤细胞和其它细胞。优选地，使用大约106到1010个细胞；更为优选地，使用大约1×107到2×109个细胞；更为优选地，使用大约5×107到2×109个细胞；更为优选地，使用大约1×108到1×109个细胞。当混合使用以达到所需效应时，多重剂量的每一种剂量也位于有效量的定义范围内。
细胞疫苗的各种组分以“有效的组合”存在，这意味着有足够量的每种组分时该疫苗有效。优选地，至少存在约106个，更为优选至少约107个但不超过1010个同种异体淋巴细胞。优选地，至少存在约105个，更为优选至少约106个并且更为优选至少约107个但一般少于108个并且典型地少于5×107个肿瘤细胞、肿瘤细胞后代或其等价物。如果存在自体或第三者刺激白细胞，优选它们为大约105到108个之间。同种异体淋巴细胞对刺激白细胞的比例一般在1∶1到100∶1之间，通常在5∶1到大约25∶1之间，并且典型地为大约10∶1。然而，只要该疫苗整体是有活性的，那么可以使用任何数目的活性细胞或其它组分。这也将依赖于用于制备该疫苗的方法，如是否在施用之前同种异体淋巴细胞与自体白细胞共培养过。
一旦施用至患者，该组合物的效应可接近于刺激的淋巴细胞和肿瘤抗原。虽然在施用之前预混合各组分是最为方便的，但是容易地认识到通过施用至患者中大致相同的位点可得到类似的效应。因此，本发明的实施方案不仅包括其中被预混合的组分，而且包括含有刺激淋巴细胞(如对于人类病人为同种异体激活的淋巴细胞)和肿瘤抗原(如人类病人或其后代的原发肿瘤细胞)的混合制剂用于同时、分别或连续使用于手术治疗病人的方法或治疗中，特别是用于治疗患者中的肿瘤或引发抗肿瘤应答。
本发明的药物组合物可以在涉及患者中产生免疫应答或治疗癌症的其它治疗之后、之前或同时施用。例如，该患者可以在之前或同时通过化疗、放疗或其它形式的免疫治疗和继承性转移加以治疗。使用这些方式的地方，优选以不干扰本发明组合物免疫原性的方式或时间利用它们。为了刺激免疫应答，该患者也可施用另一种疫苗或其它组合物。其它的这些组合物可以包括肿瘤抗原疫苗、编码肿瘤抗原的核酸疫苗、抗遗传型疫苗和其它细胞疫苗，包括表达细胞因子的肿瘤细胞系。本发明的一些实施方案涉及组合治疗，包括施用这里所述的细胞疫苗组合与旨在提供抗肿瘤免疫学应答的其它策略。在一种优选的组合治疗中，在远离肿瘤位点以包括刺激的同种异体淋巴细胞和自体肿瘤细胞的组合物治疗之前，期间或之后，给病人施以刺激的同种异体淋巴细胞的肿瘤内移植物。在另一种优选的组合治疗中，在远离肿瘤位点以包括刺激的同种异体淋巴细胞和自体肿瘤细胞的组合物治疗之前，期间或之后，给病人施以其它细胞疫苗组合物。用于该目的的其它组合物包括与已经在遗传上改变以表达更高水平细胞因子的同种异体细胞(特别是肿瘤细胞)混合的自体肿瘤细胞。在整个治疗期间利用多种不同的组合物或施用模式时，筛选每种治疗成份的顺序和时间以优化免疫刺激或抗肿瘤效应。
本发明组合物施用时间的选择依据临床医生的判断，并且依赖于病人的临床病情、治疗的目的和同时施用的其它治疗。一般地，在病人治疗的适当时间施用第一种剂量然后监测病人的免疫学或临床反应，通常是同时监测这二者。适当的免疫学监测方法包括用病人PBL作为应答细胞并且用引发肿瘤细胞作为刺激细胞的一维MLR。免疫学应答也可通过注射位点延迟的炎症反应来显示。监测肿瘤的适当方法根据肿瘤的类型和特征加以选择，并且可以包括CT扫描、磁共振成象(MRI)、用适当成象剂的放射闪烁、监测循环系统的肿瘤标记抗原以及病人的临床反应。可以施用其它的剂量，如每月一次或每周一次直到达到所需的效应。之后，并且特别是当免疫学或临床效应似乎减退时，可以按需要施用其它的增强剂量或维持剂量。
当将多重细胞疫苗的剂量施用至同一病人时，应该注意到该疫苗中同种异体淋巴细胞可能产生抗-同种异体型的应答。使用来自多个供体的同种异体细胞的混合物或在每种剂量中使用不同的同种异体细胞群均为可最大限度减小抗-同种异体型应答发生的策略。
在治疗期间，规则地评价患者注射位点的副作用或一般的副作用，如发热反应。用适当的支持性临床护理处理副作用。
下面列出的实施例是为了进一步引导本领域普通的技术人员而不是意为以任何方式限定本发明。
实施例
实施例1：使用混合淋巴细胞移植物的癌症治疗
该实施例描述了将其中的以混合淋巴细胞培养而刺激的同种异体淋巴细胞移植到晚期脑癌的瘤床中的人类研究。结果，该局部区域同时包括刺激的淋巴细胞和任何残余的自体肿瘤细胞。该治疗在限制或逆转肿瘤发展并且提高一些治疗患者的存活中是有效的。一致性的观察结果支持了本发明；特别是积极参与病人具有明显的抗肿瘤应答。
对具有复发晚期星形细胞瘤的病人进行临床实验以评价与直接肿瘤内移植通过混合淋巴细胞培养而激活的抗病人同种异体抗原的同种异体淋巴细胞的可行性、耐受性和毒性。结果显示在具有复发晚期神经胶质瘤病人中直接肿瘤内移植MLC-活化的同种异体淋巴细胞是可行而安全的并且获得了临床效应。
随机选定活检证明具有晚期星形细胞瘤(Daumas-DuportⅢ或Ⅳ期)的9个病人在其星形细胞瘤复发或发展后经标准治疗后用于肿瘤内移植MLC-活化的同种异体淋巴细胞。此试验得到Good Samaritan(络杉玑，加州)医院立法监督委员会的授权。所有病人被通知同意而登记。病人年龄从24到67岁(平均50岁〕并且4男5女。8位病人具有Ⅳ期星形细胞瘤(多形成胶质细胞瘤，GBM)并且一位病人具有Ⅲ期星形细胞瘤(退行性星形细胞瘤)。所有病人在以前的摘除手术、放疗、化疗及免疫治疗(自体LAK细胞加IL-2)中均遭失败，并且具有正在生长的肿瘤。免疫治疗时的Kamofsky效率得分为60到80。病人特征列于表1中：
表1
病人 年龄 性别 Dx* 位点** 研究前的治疗*** KPS****
BTP-001 67 m AA LTL RT,CT,GK(4mo) 80
BTP-002 53 f GBM LFL RT,GK(0.5mo) 70
BTP-003 40 m GBM RTL GK,RT,CT,GK,ITx,GK(0.5mo) 70
BTP-004 45 f GBM RTL DBS,RT,CT,RT,GK(2mo) 60
BTP-005 61 m GBM LOL DBS,RT,GK,GK(05.mo) 70
BTP-006 24 f GBM ROL CT,GK(7mo) 80
BTP-007 56 m GBM LTL RT,DBS,CT,GK(1.5mo) 70
BTP-008 48 f GBM LOL RT,CT,GK(0.5mo) 80
BTP-009 51 f GBM RPL DBS,RT,CT,GK(0.5mo) 70
*GBM=多形成胶值细胞瘤(星形细胞瘤，Daumas-Duport Ⅳ期)；AA=退行性星形细胞瘤(星形细胞瘤，Daumas-Duport Ⅲ期)**LFL=左额叶；RFL=右额叶；RPL=右顶骨叶；LTL=左颞叶；ROL=右枕叶；LOL=左枕叶***DBS=摘除手术；RT=外部射线放疗；CT=化疗；Itx=以前的免疗治疗(LAK细胞+IL-2)；GK=γ刀治疗(在同种异体移植前数月)****KPS=kamofsky效率计分(在免疫治疗时)
按如下进行制备规模的混合淋巴细胞培养。移植前三天，鉴定遗传上未改变的供体并且进行白细胞分离以获得所需数量的白细胞。进行大约2.5小时的白细胞分离一般提供达10×109个单核细胞。同时，从病人获取单位量的血液，并且通过离心获得浅黄色层。然后通过在FIC0LLTM-Hypaque梯度(密度=1.077)中离心而从供体及病人中获取单核细胞。通过以丝裂霉素-C(MC,Mutamucin)以10μg/ml于37℃处理1小时而失活病人的单核细胞，并且清洗以去除多余的药物。然后在AIM V培养基中以10∶1到20∶1的比例混合供体单核细胞与MC-处理的病人单核细胞(总细胞密度=2×106个细胞/ml)。将细胞分散于塑料培养袋(Baxter)中并且于37℃置于潮湿，5％CO2/95％空气的孵化箱中。孵化3天后，通过离心回收存活细胞、计数，悬于4-5ml无菌病人的血浆中并且运送至操作间。
移植时，加入葡萄糖酸钙以开始凝集。然后在无菌金属盘中切碎此凝集块。切除可能的肿瘤，形成由瘤床包围的腔。将含有刺激同种异体淋巴细胞的切碎的凝集块置于该腔中和所残余的肿瘤内或其附近。
与肿瘤内移植MLC-活化的同种异体淋巴细胞有关的临床毒性记录于表2中。在每个剂量水平，一些病人经历了1期和2期毒性。然而，这些为短暂的效应，并且还不清楚是否这些效应为此免疫治疗或手术反应的效应。通过连续数月施用适当剂量的地塞米松(8到24mg/天)在每个剂量水平控制大脑水肿的程度。
表2
 病人编号   细胞剂量           地塞米松剂量(mg/天)
  1周   1个月    3个月    6个月
  BTP-001BTP-002BTP-003    2×1082×1092×108    2416    202415     69648     16-96
  BTP-004BTP-005BTP-006    2×1082×1082×109    16168    2246     4-8     16-8
  BTP-007BTP-008BTP-009    2×1082×1082×109    16249    141416     241424     -810
高达6×109个细胞的细胞移植剂量似乎没有增加毒性。由于在从供体获取淋巴细胞中的物理限制，移植的最大剂量不超过6×109个细胞。
通过三个标准评价临床反应：a)用最大增强直径的三轴测定以对比增强的系列MRI扫描；b)Kamofsky计分；和c)存活。登记试验9位病人系列MRI扫描的肿瘤体积显示于图1中。(通过钇增强的，T1加重的MRI成象而测定的)肿瘤对同种异体移植物反应的MRI证据在9位病人中的3位中见到。在10到130周的观察期内2位病人具有完全的肿瘤抑制并且一位病人具有部分的肿瘤抑制(＞50％的收缩)。在5位病人中，系列MRI扫描显示肿瘤大小稳定，在8到20周的观察期内基本上没有肿瘤的生长。
仅仅一位病人在同种异体移植后显示出进行性肿瘤生长。从免疫治疗开始对每种剂量水平测得的病人的总体存活为2×109个细胞时为24周(18-24周)，4×109个细胞时为64周(10-135周)，并且6×109个细胞时为72周(20-140周)。重要地，有2位长期存活者；一位为4×109个细胞剂量(BTP-006,＞125周)，并且另一位为6×109个细胞剂量(BTP-006,＞135周)。
与肿瘤内细胞移植物有关的临床毒性列于表3中。根据下面的标准对毒性进行分级：0级=无头痛，无发烧，无疾病发作；1级=适当头痛；2级=头痛，适当水肿(MRI)；3级=严重头痛，中度水肿(MRI)；4级=严重头痛，严重水肿(MRI)，神经学改变。不可逆的3级或4级毒性为剂量限制性的。
表3
病人编号 细胞剂量 观察到的毒性 存活*(周数) 应答**
 BTP-001BTP-002BTP-003    2×1092×1082×108 1级2级1级 7731113 SDPRSD
 BTP-004BTP-005    4×1094×109 2级1级 7575 SDSD
表3(续)
BTP-006 4×108 2级 184+ CR
   BTP-007BTP-008BTP-009    6×1096×1096×108 2级2级2级 130160+48 SDCRPD
*从开始疹断出来时存活(周数)；+表示目前活着的病人**对免疫治疗的应答；CR=完全应答；PR=部分应答；SD=稳定的疾病；PD=正在进行中的疾病
这些病人中每位的Kamofsky计分从80(移植前)上升到100。2位病人目前仍然活着并且过着高质量的生活。对病人BTP-006的系列MRI扫描显示在24个月内连续的肿瘤退化。对病人BTP-008的系列MRI扫描也显示在24个月观察期内肿瘤体积缓慢持续的减小。
对移植60天后死亡的病人进行尸体解剖后检测移植位点的组织学。对在10％中性缓冲福尔马林中固定的组织切片进行免疫组织化学检测。在硅化的玻片上制备5μm的切片并且采用包括抗生物素蛋白-生物素复合物和DAB作为生色剂的TECHMATETM自动免疫染色系统(Biotech solutions,Inc.,Santa Barbara,CA)用抗不同细胞抗原的一级抗体加以染色。使用的一级抗体包括抗-CD68(HAM 56，巨噬细胞)，L26(CD 20，B细胞)，UCHL-1(T-细胞)和GFAP(神经胶质细胞)。免疫染色后，用苏木精负染组织切片并且用显微镜检查免疫阳性细胞。通过用标准苏木精/署红染色组织切片的组织学标准同样测定炎症细胞类型和组织坏死的程度。
靠近放置同种异体移植物的操作位点，发现有囊腔，仅仅填充有纤维和组织血块。通过显微镜，没有残余移植的淋巴样细胞存在的迹象。然而，取自肿瘤周围的切片，距离移植位点1.5厘米处显示出有CD68+巨噬细胞和分散淋巴细胞的大量侵入以及广泛肿瘤细胞坏死的现象。令人感兴趣的是鉴定到众多的CD68+巨噬细胞(小神经胶质细胞)，显然它们是从正常大脑实质的邻近导管迁移至死亡肿瘤组织区域。
此研究证实肿瘤内移植MLC-活化的同种异体淋巴细胞是易行的并且为病人很好地耐受。与同种异体移植有关的毒性包括偶尔的头痛，低度发烧和大脑水肿，这些可通过使用糖皮质激素得到控制。长期存活的病人在移植后用类固醇维持数月并且最终降至很低的维持水平。通过在系列MRI扫描上所注意到的肿瘤应答测定的显著量应答与该方法有关并且最为重要地是延长了病人存活。
实施例2：遗传改变细胞表达细胞因子
在本发明的一些实施例中，在遗传上改变一种或另一种细胞群以表达更高水平的细胞因子。此实施例提供了细胞群如何被遗传改变以表达细胞因子的非限定性说明。该说明或者使用来自Maloney鼠白血病病毒的pLXSN质粒，或者使用LNCX逆转录病毒表达载体。制备甚至在细胞分裂或辐射后仍然以稳定方式表达所需产物的遗传上改变的细胞。
分泌IL-4的细胞系：用包括编码IL-4构建体的逆转录病毒载体在遗传上改变人类卵巢癌细胞系以分泌IL-4。该细胞系稳定并且甚至能够在失活剂量的辐射后仍然能够IL-4的生物合成。该细胞系表达MHCⅠ类和Her-2/neu抗原，但不表达MHCⅡ类抗原，ICAM-1,CA-125或IL-4受体。
用于制备此细胞系的细节在别处有描述(Santi等，1995 b&c)。简言之，从具有Ⅲ期严重卵巢乳头状腺瘤的以前没有治疗过的病人中建立UCI-107细胞系。UCI-101和UCI-107细胞系以前已经由Gamboa-Vujicic等进行过特征描述并且由Alberto Manetta博士(加州大学，伊文医学中心)惠赠。将细胞维持于37℃,5％CO2中的完全培养基(CM)中，其中含有RPMI 1640(Gibco Life Technologies),10％胎牛血清(FBS,Gemini,Calabassas,CA)和1％青霉素/链霉素硫酸盐(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)。
按如下构建逆转录病毒载体：pLXSN质粒由A.Dusty Miller博士(Fred Hutchinson癌症中心，西雅图，华盛顿)惠赠。来自Maloney鼠白血病病毒(MMLV)的该质粒含有新的磷酸转移酶基因，由SV40增强子/启动子驱动其组成性表达，该整合载体的5’逆转录病毒LTR驱动插入基因的表达。人类IL-4 cDNA获自Okaiama的ATCC和Berg pCD克隆载体，并且用BamHⅠ限制酶加以切割。然后将该cDNA克隆入pLXSN多克隆区域中的BamHⅠ限制位点。通过诊断性限制核酸内切酶消化测定该cDNA的合适方向。一旦构建后，通过CsCl梯度离心纯化逆转录病毒质粒DNA。
通过磷酸钙方法用纯化的转录病毒质粒DNA(LXSN/IL-4)转导鼠内单嗜包装细胞系GP-E86。48小时后用这些细胞的上清感染鼠兼嗜性包装细胞系，PA317。此PA-317-包装细胞系获自ATCC并且维持于CM中。筛选对G418抗性的转导的PA-317细胞系。扩增，等分分离的细胞并且将其冷冻于在主细胞库中的液氮中。用含有感染而无复制能力逆转录病毒的来自PA-317的上清液感染人类癌症细胞系。简言之，将人类卵巢癌细胞系以在10ml CM中1×105个细胞的密度接种于100-mm的组织培养盘中并且于37℃ 5％CO2中孵育4小时以使其粘附。孵育后，翻新培养基并用于磷酸缓冲盐(PBS)中5ml 2％的1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Aldrich.,化学公司.,Milwaukee,WI)代替。于37℃ 5％CO2中30分钟后，加入10ml逆转录病毒上清液并且通过过夜孵育完成逆转录病毒介导的基因转移。然后翻新培养基并用CM代替。于37℃ 5％CO2的CM中再孵育48小时后，通过在含有0.075％G418(遗传霉素，Gibco Life Technologies)的CM中培养而完成对转导克隆的筛选。14天后用无菌的8×8-mm克隆柱(BelcoGlass,Inc.,Vineland,NJ)分离克隆并且于含有G418的CM中扩增3周。将母本细胞系用作G418抗性的阳性对照。
在CM中以0.5×106个细胞/10ml的密度在100-mm的组织培养盘中建立细胞。每12,24,48,72和96小时进行细胞计数，用台盼蓝排除法测定存活细胞的数目。进行实验以比较非-转导(母本)和转导肿瘤细胞系的生长并且评价一段时间细胞因子产生的水平。收集上清液并且保于-20℃活存(用于随后细胞因子的ELISA评价)并且用胰酶消化培养盘以测定细胞数目和存活。
 将母本、IL-4转导子和载体对照细胞以1×106个细胞/ml的密度种植于100-mm的组织培养盘(Coming)中的10ml CM中。于37℃5％CO2中孵育48小时后，更新上清液并且以1,500rpm离心10分钟去除细胞，然后储存于-20℃。然后用商业上可得到的的试剂盒(研究&诊断系统，Minneapolis,Minnesota)通过ELISA测定IL-4浓度。表4显示了由遗传上改变的人类严重乳头状卵巢癌细胞的单个克隆分泌白细胞介素-4的水平。
表4
        UC1-101克隆        UC1-107克隆
    名称ABCDEGHILMNO平均值   IL-4pg/ml140(未测到)4940879338934232(未测到)(未测到)51.1     名称ABCDEFGHLMNPOXY平均值  IL-4pg/ml32839035130030805131702972653306157968265.8
正如所预期的，每种母本细胞系和仅仅以载体转导的细胞没有产生可检测到的IL-4水平。扩增和使用产生IL-4的称为UCI 107E IL-4GS的最佳克隆以形成主细胞库从而用于进一步测试和广泛的特征分析。
母本细胞系UCI107具有体外培养卵巢上皮细胞的特征性形态。仅仅以LXSN载体或含有IL-4基因的LXSN转导的UCI107细胞的形态与母本107细胞的形态难以区分。测得母本、载体对照和UCI 107E IL-4GS细胞的加倍时间分别为15.3、15.7和18.6小时。
经过35次传代和6个月的培养后在体外没有观察到这些细胞生长速率的变化。在6个月的传代中产生IL-4的水平始终在900到1300pg/ml/105个细胞/48小时的范围内。对UCI 107E IL-4 GS主细胞库(MCB)进行的广泛测试显示此细胞系没有分支杆菌、细菌和感染性病毒。
用NeoR基因进行Southern分析以检测UCI 107E IL-4和母本UCI107细胞系。简言之，在含有0.5％SDS的TNE缓冲液(10nM Tris,100mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5)中裂解组织培养细胞的浓缩悬液，以50μg/ml蛋白酶K于37℃处理过夜，然后以酚和氯仿提取。在100％乙醇中沉淀DNA溶液，取出并且重悬于10mM Tris,0.1mM EDTA(pH8)中。用Sstl(GIBCO/BRL,Grand Island，纽约)消化10μg高分子量的DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离并且转移至Gene Screen Plus(Dupont NEN,Boston,Massachusetts)。根据制造商的说明进行转移、杂交和洗涤。通过Tabor Struhl的方法(1988)(当前分子生物学方法1卷pp2.2.1-2.2.3)制备随机引物IL-4探针。此结果证实，经过20次传代后，UCI 107E IL-4仍然含有载体DNA。
按如下测试辐射后IL-4分泌的稳定性：在15ml锥形管中CM中于室温以200拉德/分钟剂量的伽玛射线(137Cs)辐射细胞。辐射后立即将细胞以10ml CM中1×106个细胞的密度种植于Petri培养盘中。应用1,000到10,000拉德的测试剂量。将辐射的细胞于37℃培养于5％CO2中并且在所有培养盘中每4天完全更新培养基。每48小时，从培养盘中收集上清液用于细胞因子制备并且通过台盼蓝排除法用光学显微镜测定活细胞数目。
该实验结果显示于图2中。以2,500到10,000拉德辐射的细胞存活大约8天但是所有细胞到3周时均死亡。以10,00拉德辐射的细胞复原并且继续增殖。在所有剂量中在8天均有可检测到的细胞因子产生的水平并且具有非常接近的活细胞数目。图版B显示在三个单独实验中以5,000拉德(□)或10,000拉德(■)辐射后IL-4的产生。图版C显示在两个单独实验中以5,000拉德(□)或10,000拉德(■)辐射在由UCI 107E IL-4 GS产生的IL-4，用pg/ml/106个细胞/48小时表示。在第2天(p=0.72)，第4天(p=0.14)，第6天(p=0.10)和第8天(p=0.3)以2,500、5,000和10,000拉德辐射的细胞中未见到细胞存活中有统计学显著的差异。
总之，这些结果表明UCI 107E IL-4 GS细胞构成分泌IL-4的稳定的细胞系。可辐射这些细胞以有效地终止复制，但IL-4的产生可维持一周。
分泌TNF-α的细胞系：用人类TNF-α的编码序列在遗传上改变大鼠成胶质细胞系，并且显示出对数种神经胶质瘤细胞系的保护(Graf等.(1994)Soc.Neuroscience(abstract))。
简言之，用LNCX逆转录病毒表达载体通过逆转录病毒-介导的基因转导将TNF-α编码序列插入到TNF不敏感的Fischer大鼠T9成胶质细胞系中。分离命名为T9/LNCT2的克隆，其以2,000pg/106个细胞/48小时的水平分泌生物活性的TNF。该转导的细胞，T9母本细胞和仅仅以该载体转导的细胞(称为T9/LNCX)的生长速率相同。T9/LNCX细胞系可被维持一整年而不丢失TNF的分泌活性。
当将母本或载体对照T9细胞皮下注射至Fisher大鼠的腹侧时，建立了肿瘤并且长大后杀死该动物。相反，皮下注射的T9/LNCT2细胞开始生长，并且在3-4周内40-50％的动物受到抑制。在此期间由皮下的T9/LNCT2细胞分泌TNF。存活者甚至在1年后，对颅内再次接种母本T9细胞具有完全抗性。此外，这些动物也对同系神经胶质瘤细胞系，9L的接种具有抗性。
实施例3：用细胞移植物治疗后对再次接种的抗性
通过将转移的乳腺癌细胞系MADB106L-1注射至Fisher近交大鼠品系的肝脏中叶中而建立用于癌症治疗的大鼠模型。肿瘤通过常规测定并且在治疗之前建立14天。
用失活的Fisher 344刺激淋巴细胞和Wistar-Furth(W/F)同种异体应答淋巴细胞以1∶1比例制备混合淋巴细胞培养物。培养开始后三天，将80×106个细胞直接注射入已经建立的进行性生长的肿瘤中。按如下处理5只大鼠一组的各个组：第1组不接受注射；第2组以未钝化的同种异体W/F淋巴细胞直接注射到该肿瘤中，第3组同样以获自混合淋巴细胞反应的细胞注射。MLC治疗对存活的影响显示于表5中：
                       表5
             第1组            第2组            第3组
            (未处理)    (未钝化的淋巴细胞)     (MLC)中度存活(天)    38               51               68*
范围(天)    17-62            32-63            55-300+长期存活者     0％              0％               20％
        *Log Rank Sum测试组 1&2:p＜0.02
MLC-处理组为具有长期存活者的唯一组。这些存活者对再次以母本肿瘤细胞系接种具有抗性。总结出直接肿瘤内移植经过混合淋巴细胞培养而刺激的同种异体淋巴细胞赋予显著的存活优势。此效应可以通过免疫激活宿主对刺激淋巴细胞和在局部肿瘤微环境中产生的细胞因子应答中的抗-肿瘤免疫性而介导。
实施例4：在远离肿瘤位点的细胞接种
该实施例建立了包括与同系肿瘤细胞混合的刺激的同种异体淋巴细胞的细胞疫苗在小鼠模型中的使用，并且鉴定出产生免疫学应答和赋予肿瘤抗性的有效量。
常规的材料和方法如下。通常从单个小鼠胰脏中回收大约1到2×106个脾脏细胞。将应答和刺激脾脏细胞混合并且在CO2培养箱中于37℃在补充有10％胎牛血清和1mM BME的1mLRPMI培养基中培养3天。通过ELISA分析上清液中的IL-2、TNF、IFN-γ和IL-4。通过流式细胞分析测定培养细胞表明的CD标记。通过形态学方法监测细胞以测定小淋巴细胞、肥大细胞和凋亡体的数目。将所需数目的混合淋巴细胞培养物与肿瘤细胞在大约100μL终注射体积的磷酸缓冲盐中混合。通过皮下注射将该组合物施用至右腹侧。检查注射位点的炎症迹象，并且定期收集脾脏细胞用于免疫学标准的测定。通过标准的形态学标准和免疫组织学检测活检和尸检样品。
J588L为来自Balb/c小鼠自发肿瘤的浆细胞瘤细胞系。在处理约12天内的100％组织相容性的小鼠中皮下注射106个存活的J588L细胞形成大于直径5mm的可触摸到的肿瘤，同时有组织坏死。在该实验中，在肿瘤达到～10mm直径时杀死小鼠。
在一个实验中，将Balb/c小鼠皮下注射混合有106个细胞移植细胞的106个J588L浆细胞瘤细胞。通过以10∶1的比例共培养C57BL/6脾脏细胞与Balb/c脾脏细胞3天以制备用于细胞移植的细胞。在以该细胞混合物处理的小鼠中在注射位点测定肿瘤的生长，并且与作为对照的仅仅混有106个C57BL/6脾脏细胞的106个J588L细胞的小鼠作比较。对照组的所有15只小鼠在14天内均具有至少1cm直径的肿瘤。然而，在前者组中的15只小鼠的11只没有肿瘤生长；其它4只具有生长慢于对照组的肿瘤。在该组中存活的小鼠随后在相反的一侧以另一团J588L细胞接种以检测是否现在还存在全身性抗该肿瘤-的免疫学应答。10只小鼠中的7只对再次接种具有抗性，没有表现出肿瘤生长，或有限的生长然后受到抑制。
通过测定显示于表6中的组合进行细胞移植细胞和获得的应答之间相互关系的进一步特征分析。
                  表6
混合淋巴细胞培养(细胞移植细胞)         预期的起始效应
刺激细胞      应答细胞          比例Balb/c(H2d,IAd) C57BL/6 H2b     1∶1     移植体对宿主
                                1∶10    移植体对肿瘤
(同系的)     (同种异体的)       1∶20    宿主对移植体
                                         细胞因子分泌
              C3H/He H2k       1∶1     移植体对宿主Ralb/c(H2d,IAd)
                                1∶10    移植体对肿瘤
(同系的)     (同种异体的)       1∶20    宿主对移植体
                                         细胞因子分泌C57BL/6(H2b)     C3H/He H2k      10∶1
                                1∶1     细胞因子分泌(同种异体的)   (同种异体的)       1∶10Balb/c(H2d,IAd) DBA/2 H2d       1∶1     移植体对宿主
            不相容的次要组织    1∶10    移植体对肿瘤
(同系的)      相容性抗原        1∶20    宿主对移植体
                                         细胞因子分泌
   无         C3H/He H2b                同种异体刺激
             (同种异体的)
将106个培养的细胞与106个J588L细胞混合并且注射至小鼠，并且按以前监测其应答。测试存活小鼠目前对随后来仅仅以106个J588L细胞接种的免疫性和肿瘤抗性。第2套实验旨在测定在该疫苗组合物中包括调节剂时的效应。T辅助细胞在功能上可分为2个亚类。TH1细胞在IL-2、IFN或IL-12存在时产生，并且认为促进体内的细胞毒性。TH2细胞在IL-4、IL-5或IL-10存在时产生，并且认为促进B细胞分泌。TH1细胞由于IL-2的存在可在典型的体外混合淋巴细胞培养中占优势。TH2细胞可通过产生IgE和参与嗜酸性细胞介导的肿瘤细胞裂解在强抗肿瘤免疫中起作用。
进行这样的实验，即将用于提供该疫苗组合物刺激的同种异体淋巴细胞的混合淋巴细胞培养物补充有关调节剂，特别是IL-2,IL-4或强的松。首先通过Piccini等(1995)(免疫学杂志155:128)和Spits等(1988)(免疫学杂志141:29-36)使用的方法测试调节剂的水平。在培养第0天开始补充每种测试调节剂的培养基中以10∶1的比例共培养C57BL/6脾脏细胞和Balb/c脾脏细胞。与未补充的培养基相比，预计IL-2增强TH1细胞的比例，而IL-4或强的松增强TH2细胞的比例。通过免疫测定或生物分析测定上清液中的细胞因子水平而测定每种培养物的特征：例如，测定IL-2(由TH1细胞分泌)，IL-4,IL-5(由TH2细胞分泌)，INF-γ或TNF-α。也通过流式细胞计测定细胞表明标记物而测定每种培养物的特征：例如测定，CD45RB(TH1细胞高于TH2细胞)；CD-69，和IL-2受体(在活化细胞中升高)。
按照如下进行保护实验：将106个培养的细胞与106个J588L细胞混合并且注射到Balb/c小鼠中，并且按照以前监测其应答。通过随后仅仅以106个J588L细胞接种而测定存活小鼠目前的免疫性和肿瘤抗性。通过以无关肿瘤细胞系接种免疫小鼠测试免疫学应答的特异性。将从TH1细胞富集的培养物中制备的疫苗效应与从TH2细胞富集的培养物中制备的疫苗效应进行比较。进行其它的实验，即其中的动物用包括这两种培养物的细胞再加上J588L浆细胞瘤细胞的组合物处理。
实施例5：同种异体活化程度的测定
为了确保产生高质量有效的MLC细胞，可以利用测定同种异体活化细胞活性的方法。仅仅是具有超过或高于对照细胞活性的细胞培养物应该用于临床。比较此活性与未刺激对照的活性是有利的，因为来自不同个体单核细胞的基本活性差异较大。
可有数种方法用于测定淋巴细胞活化。与未刺激的单核细胞相比，同种异体活化的细胞还原更多的甲染料并且具有更多的酯酶活性。XTT(甲染料)的更新可容易地通过在470nm(参照650nm)处用比色分光光度计在96-孔板中加以显示。活化的细胞一般较对照显示出更高的吸收。淋巴细胞活化也可用酯酶底物，荧光素二乙酸盐(FDA)，通过流式细胞计测定而显示。具有高酯酶的T细胞用FDA和藻红蛋白标记的CD3抗体不能被测定。酯酶活性可通过用更高浓度的FDA和通过在494nm(参照650nm)处用比色分光光度计在96-孔板中测定酯酶活性而准确地加以测定。通过添加竞争性酯酶抑制剂(～10mM)，精氨酸甲基酯而抑制含有血清培养基中固有的背景酯酶活性。对于大多数情况，这些方法相互间以及与芽基发育之间显示出良好的相关性。
Ⅰ：MTT甲还原分析
此分析通过培养样品中MTT还原为蓝绿色甲染料的能力而用于计数活细胞，并且对于区别活化与失活细胞也是有用的。其实际上可用于在实际中任何培养基中的任何细胞。有用的细胞浓度在105个到5×106个每mL之间。
试剂：
·平底96孔板(不是ELISA平板)
·PBS中5mg/mL MTT(Sigma)(冷冻)
·45％DMF,0.2N HCl中的20％SDS(预温至37℃)
方法：
以2份或3份将100μL带细胞的培养基置于96孔板中。用100μL仅是培养基的作为对照。将第1栏留为空白。
添加10μL MTT至每孔中。轻拍平板以混合。覆盖平板并且于37℃孵育4小时。
添加50μLSDS溶液，避免气泡。轻拍以混合。如果存在气泡，吹一吹表面。在570nm(参照650nm)处读数平板。
Ⅱ:MTT甲还原分析
此分析用于通过培养样品中MTT还原为桔红色甲染料的能力而计数活细胞，并且对于区别活化与失活细胞也是有帮助的。其实际上可用于在实践中任何培养基中的任何细胞。有用的细胞浓度在105个到5×106个每mL之间。
试剂：
·平底96孔板(不是ELISA平板)
·(新鲜)PBS中1mg/mL MTT(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基-苯基-2H-四钠-carboxanilinide盐)(Sigma)(冷冻)
·1.53mg/mL PMS(苯甲基磺酰氟，Sigma)(冷冻避光保存)
方法：
以2份或3份将100μL带细胞的培养基置于96孔板中。用100μL仅是培养基的作为对照。将第1栏留为空白。
临用前预混合PMS与XTT(每mL XTT5μL)。添加50μL XTT至每孔中。轻拍平板以混合。
覆盖平板并且于37℃孵育4小时。在470nm(参照650nm)处读数平板。
Ⅲ：用于CD3/CD69或CD3/FDA的流式细胞计
在混合淋巴细胞同种异体活化后测定T淋巴细胞活化。活性如CD69表达或酯酶活性与细胞因子分泌相关联并且可用作淋巴细胞活性的替代测定。未刺激的淋巴细胞不表达表面CD69并且仅具有低水平的非特异性酯酶。一旦被同种异体抗原或非特异性丝裂原活化，在48小时内(24小时峰出现)出现CD69的表达。刺激后酯酶活性立即增加，并且持续数天。不是所有同种异体刺激的淋巴细胞反应都以相同的动力学进行，优选测定培养第1,2或3天的活化。
样品：
将供体和病人细胞的样品在2％FCS-RPMI中以0.5×106个细胞/mL混合于小量培养物中。将这些培养物于37℃ 5％CO2培养箱中维持直到测试。
试剂：
·单克隆抗体；
·CD3-PE(Coulter)
·CD69-FITC(Becton-Dickinson)。不用时冰箱避光保存。
·荧光素二乙酸盐(Sigma)：以10mg/mL DMSO制备储备液，避光保存，并且冷冻保存每份测试等份试样。通过在DMSO中以1∶100稀释储备液而每周制备工作液，冰箱避光保存工作液。
·D-PBS,PBS中0.5％多聚甲醛-0.05％TRITONTMX-100
方法：
 根据需要制备内参照未刺激且活化的单克隆细胞样品。在10％DMSO冷冻培养基中于250μL等分液中冷冻大批测试馏份。
用来自正常供体的单核细胞制备活化的对照标本。将这些细胞以0.5×106个细胞/mL置于多达100mL的2％FCS-RPMI中。在0.2μg/mLPHA凝集素存在或不存在下于37℃培养细胞2天，并且以10∶1的比例与第2种供体群混合。通过以350×g离心5分钟收集细胞。去除培养基并且用1/10体积的DMSO冷冻培养基代替然后冷冻。当需要时，可快速融化未刺激和刺激的细胞并且通过添加9体积的PBS以原来的体积再重悬。
根据以下方法用测试培养物的样品分析对照细胞。使用二份对照标本进一步保证测量质量。CD69或酯酶活性阳性的淋巴细胞百分比应该在5％的变化内。在0.5mL PBS中(每个样品)稀释5μL CD3-PE抗体(每个样品)。加入10μLCD69(每个样品)或1μLFDA工作液(每个样品)。
向12×15mm标记的聚苯乙烯管中加入0.5mL稀释的抗体。加入100μL混合好的样品至每管中，包括对照，未刺激的供体细胞和同种异体活化的细胞。于室温中轻轻摇晃并且孵育30分钟。加入0.5mμL0.5％-多聚甲醛-0.05％TRITONTMX-100并且混合。
在适当的流式细胞仪，如EPICS XL Coulter流式细胞仪中进行读数。两种方法的直方图1(正向扩散对CD3)在CD3+单核细胞周围具有通用的通道(general gate)。A区应该为T-淋巴细胞的大约％并且应该通至直方图2。在直方图2中，使用侧向扩散对CD3来区分淋巴细胞(低的侧向扩散水平)与未裂解的RBS,RBS血影，血小板聚集物，残余的粒细胞和/或其它废物。在淋巴细胞周围绘制通道(例如参见实施例直方图2)。第2通道通至直方图3，其中显示了CD3+CD69+细胞或CD3+FDA+细胞。首先读取对照值以设立通道(未刺激对照)。放置直方图的quad stat游标从而CD69或FDA高值(Quad2)为2％。当分析刺激样品时设置此通道。
计取每种样品至少5,000个通过的细胞以获得97％的置信区间。
Ⅳ:FDA平板分析
此分析用于通过培养样品更新酯酶底物，荧光素二乙酸盐的能力而例举活细胞，并且对于区别活化与失活细胞也是有帮助的。其实际上可用于在实践中任何培养基中的任何细胞。有用的细胞浓度在105个到5×106个每mL之间。
试剂：
·平底96孔板(不是ELISA平板)
·DMSO中10mg/mLFDA(Sigma)(避光保存)
·DMSO中10mg/mL精氨酸甲基酯(Sigma)
方法：
以2份或3份将100μL带细胞的培养基置于96孔板中。用100μL仅是培养基的作为对照。
通过添加10μL每mL的FDA PBS储备液加上50μL每mL的AME储备液制备新鲜工作液。
添加20μL FDA工作液至每孔中。轻拍平板以混合。
覆盖平板并且于37℃孵育1小时。在494nm(参照650nm)处读数平板。
Ⅴ：分析酸产生
该分析用于定量在培养中有关有机酸的产生。这与细胞的活化状态有关。此分析需要使用含有不高于2％血清的培养基。实际的细胞范围为孵育24-48小时1-5×106个细胞/mL。
试剂：
·平底96孔板(不是ELISA平板)
·酸分析试剂。这可批量制备并且于4℃保存。在蒸馏水中加入0.1mg/mL的溴酚蓝。加入足量的浓盐酸直至达到适当的滴定点。进行滴定直至在加入75μL试剂至96孔板中的100μL RPMI 2％FCS后获得黄绿色为止。
方法：
以2份或3份将100μL带细胞的培养基置于96孔板中。用100μL仅是培养基的作为对照。
添加75μL试剂至每孔中。轻拍平板以混合。在470nm(参照650nm)处读数平板。
Ⅵ：原始化的定量
此分析用于定量7天后培养物中产生的淋巴母细胞的绝对数目。该分析在实践中可用于任何培养基的外周血单核细胞。有用的细胞范围在每mL1×105到5×106个细胞之间。
试剂：
·瑞氏染液或Diff-Quick染液
方法：
将1-2滴7天培养物置于细胞离心器中并且进行离心。以瑞氏染液或Diff-Quick染液染色干燥的玻片。用油侵入100×的显微镜目镜计数淋巴母细胞和其它细胞。计数超过300个细胞。
实施例6：进一步的动物模型实验
用第3者刺激细胞制备同种异体激活细胞的效率
制备细胞组合物，其由未刺激同种异体细胞，同种异体活化的同系细胞，同系活化的同种异体细胞或同种异体活化的同种异体细胞(两种分开的同种异体细胞)所组成。用来自小鼠的脾脏细胞通过以10∶1的应答细胞∶刺激细胞的比例培养制备同种异体活化的细胞。在加有10％胎牛血清(FCS)并且补充有青霉素-链霉素的RPMI中于37℃培养脾脏细胞组合物3天。将1×106个活的J588L淋巴瘤细胞与10×106个培养的小鼠脾脏细胞混合，然后注射至Balb/c小鼠的右腹侧皮下组织。观察处理小鼠肿瘤的生长3周。
无肿瘤的小鼠在1个月后再次以仅仅是1×106个活的淋巴瘤细胞在左腹侧皮下注射，并且观察肿瘤的生长。
图3显示了这些实验的结果。活化同种异体细胞的存在与随后的体内抗肿瘤宿主应答相关。为了诱导抗肿瘤应答，可以用从对于待处理动物为同种异体的2个供体制备的细胞群代替同系或自体的细胞。然而，并非所有的活化同种异体供体：供体细胞群组合均为同样有效。
应答细胞：刺激细胞的比例对效应的影响
用C57脾脏细胞作为应答细胞并且用Balb/c脾脏细胞作为刺激细胞，制备由多种同系刺激细胞活化的同种异体细胞所组成的细胞群。将这些细胞与活的淋巴瘤细胞(J558L细胞)混合并且注射到Balb/c小鼠的腹侧。观察处理小鼠肿瘤的生长3周。
图4显示在原发肿瘤接种后没有肿瘤小鼠的百分比(每组6只小鼠)。较低的细胞比例在小鼠中诱导抗肿瘤应答有时会更好。
使用荷瘤小鼠的脾脏细胞对抗肿瘤效应的影响
从新生C57小鼠或Balb/c小鼠或者在右腹侧具有1cm淋巴瘤的小鼠中采集脾脏细胞。在RPMI-10％FCS中以0.5×106个细胞/mL的浓度单独培养该细胞3天或与Balb/c细胞以10∶1比例混合后进行培养。通过流式细胞计分析CD3+/酯酶的高种群百分比从而评定淋巴细胞活化。用健康Balb/c供体的刺激细胞，FDA阳性细胞的百分比为～3.5％，但是使用荷瘤供体的刺激细胞，FDA阳性细胞的百分比仅仅为～2.5％。
将用新生Balb/c小鼠或者带J588L肿瘤小鼠的刺激物同种异体活化的细胞群与淋巴瘤细胞(J588L细胞)混合并且注射到新生Balb/c小鼠的腹侧。观察处理小鼠肿瘤的生长3周。无肿瘤的小鼠接着再次单独以1×106个活的淋巴瘤细胞在左腹侧接种，并且观察肿瘤的生长。在两个组中，经过2次肿瘤接种后而无肿瘤的小鼠百分比在30％到40％之间。
以同种异体活化的淋巴细胞和辐射的肿瘤细胞免疫的小鼠对随后肿瘤接种的抗性
该实验测定含有同种异体活化淋巴细胞并且混合有失活肿瘤细胞的细胞疫苗的免疫原性效应。
仅仅以混合有107个Balb/c×C57同种异体活化淋巴细胞，或者混合有106个分泌IL-4(对于C57为同种异体)的J588L淋巴瘤细胞的106个辐射的黑素瘤细胞皮下注射C57/BL6小鼠(每组3只)。通过在RPMI-10％FCS中以3×106个细胞/mL的浓度及以10∶1比例培养Balb/c脾脏细胞与C57脾脏细胞3天而制备同种异体活化的细胞。
在PBS中清洗细胞，并且皮下注射至新生C57小鼠的腹侧。3周后，再次在相反的一侧将小鼠接种5×105个B16活的黑素瘤细胞。观察小鼠肿瘤的形成并且在肿瘤达到1cm时将其杀死。
以同种异体活化的细胞处理的小鼠存活显著长于其它组。2只存活最长的小鼠最终形成圆锥形的肿瘤，它们均形成溃疡。其它小鼠没有形成溃疡。溃疡出现后2天，2只小鼠均死亡。对这些小鼠的尸体解剖显示极端坏死肿瘤细胞的存在，其证据为新的肿瘤细胞中有大批DNA沉积物。此坏死伴随有炎症侵入，主要由淋巴细胞所组成。在体内任何别的地方没有观察到其它形式的感染。没有见到肺部转移。这与在腹侧带B16黑素瘤的对照小鼠中有大量的肺部转移形成对照。2只小鼠的两侧肾脏显示肾小球性肾炎，表明死于肿瘤裂解综合症。其它小鼠没有显示出这些变化。
这些结果与以同种异体活化细胞疫苗处理的小鼠相一致，即随后接种后，形成特异性应答从而导致活的癌细胞的大批裂解。
在用不同肿瘤类型的另一个实验中，单独混合有107个Balb/c×C57同种异体活化淋巴细胞，或者混合有106个分泌IL-4(对于C57为同种异体)的J588L淋巴瘤细胞的106个Lewis肺癌细胞皮下注射C57/BL6小鼠(每组3只)。通过在RPMI-10％FCS中以3×106个细胞/mL的浓度及以10∶1比例培养混合Balb/c脾脏细胞与C57脾脏细胞3天而制备同种异体活化的细胞。观察小鼠肿瘤的形成并且在肿瘤直径达到1cm时将其杀死。以分泌IL-4的细胞处理的小鼠存活显著长于其它组，其中3组中有2组长期存活者。仅仅以同种异体活化的细胞处理的组没有长期存活者。
功能标记与抗肿瘤效应的相关性
为了测定体外功能分析结果与潜在的治疗效应之间的相关性，在小鼠淋巴瘤治疗模型中，测试显示不同程度活化的培养物。用多种近交小鼠品系的脾脏细胞以10∶1应答细胞∶刺激细胞的比例建立混合淋巴细胞培养物。或者，用特定的应答细胞：刺激细胞株组合但以不同的细胞比例建立培养物。培养3天后，用XTT甲分析和酯酶分析测定该活性。
就在注射前，按照需要，将培养的细胞补充其它脾脏细胞以规范细胞比例，并且与1×106个活的或辐射的J588L淋巴瘤细胞混合。将该制剂注射至Balb/c小鼠并且测定对存活的影响。将该小鼠随后再次以以一定剂量的活的淋巴瘤细胞接种以测定仍然存在的免疫学应答。然后，将存活数据与培养期间测得的功能活性进行相关分析。
同种异体活化细胞组合物对抗肿瘤效应的影响
如本文其它地方所述，通过功能分析测定到在淋巴细胞培养期间，组织胺损害同种异体活化。西脒替丁，一种H2受体拮抗剂促进同种异体活化。在该研究中，在20μg/mL组织胺或西脒替丁存在或不存在下制备同种异体活化培养物，在XTT甲分析和酯酶分析中测定该活性，并且然后与J588L淋巴瘤细胞注射至Balb/c小鼠中以与效果相互关联。
在另一个研究中，测试具有多种不同刺激或应答细胞的效果。含有下面成份的培养物在小鼠淋巴瘤模型中与含有C57:Balb/c脾脏细胞(10∶1)培养物进行效应比较：a)C57∶Aj∶Balb/c脾脏细胞(9∶1∶1或5∶5∶1)；b)C57∶Aj∶C3H脾脏细胞(9∶1∶1或5∶5∶1)；c)C57:Aj∶C3H∶Balb/c脾脏细胞(8∶1∶1∶1或3∶3∶3∶1)。
实施例7：用培养的人类细胞进行实验
同种异体活体细胞功能的标准
可以根据在实施例5中祥述的功能分析测定同种异体活化(治疗中潜在活性的反映)的程度。该实施例说明了由这些分析所揭示的活化程度。
从采自众多无关自愿者样品中分离人外周血中单核细胞，并且按照在本文其它地方所述以10∶1的应答细胞∶刺激细胞的比例建立一维混合淋巴细胞培养物。培养2-3天后进行此分析。
结果显示于图5和6中。每个个体以单独的字母表示，并且应答细胞表示在刺激细胞之前。因此，名称A×B表示将个体A的细胞与个体B的失活细胞培养。
与未刺激的单核细胞比较，同种异体活化的细胞具有更高的酯酶活性并且还原更多的XTT(甲染料)。酯酶活性也可用酯酶底物，荧光素二乙酸盐(FDA)通过流式细胞计加以测定。可通过与FDA交联的藻红蛋白-标记的CD3抗体鉴定具有高酯酶活性的T细胞。此方法与(培养一周后测得的)芽基培养，或在上清液中的IL-2或IFN-γ的水平相关联。
使用多种同种异体刺激细胞的效应
用来自1个，2个，3个或4个无关的供体的细胞制备同种异体活化的人类淋巴细胞培养物。将3×106个细胞/mL于37℃培养于2％FCS-RPMI中。通过以10∶1的比例混合应答细胞与刺激细胞制备两-供体种群。通过以9∶1∶1或8∶1∶1∶1的比例混合应答细胞与2种或3种不同的刺激细胞制备含有3种或4种供体的种群。
图7显示了由流式细胞计测得的细胞特征。所有值代表在CoulterEPICS XL细胞计数器中计数4000个细胞后明亮荧光细胞的百分比。
该结果显示在一定条件下从多种供体的刺激细胞制备的培养物达到更高水平的活化。
改变应答：刺激细胞比例的影响
用比例10∶1,5∶1或1∶1的同样两种无关供体的细胞制备由同种异体活化的人外周血单核细胞组成的混合淋巴细胞培养物。细胞以0.5×106细胞/ml在2％FCS-RPMI中培养3天。用XIT甲原理分析测定这些培养物的强度。
结果见图8
组织胺或西脒替丁对同种异体活化的影响。
已知组织胺诱导T抑制细胞的活化。因为T抑制细胞可以在控制MLR活性中起作用，所以在同种异体反应的细胞培养物中测试组织胺，组织胺2型(H2)受体阻断药物和西脒替丁的效应。用无关供体的细胞制备由同种异体活化人类外周血单核细胞所组成的细胞群。所有培养物含有0.5×106个细胞/mL浓度的10∶1比例的应答∶刺激单核细胞。在有些培养物中，在第0天加入20μg/mL组织胺或20μg/mL西脒替丁。
图9显示了用甲还原(XTT)分析测得的结果。组织胺诱导抑制并且降低同种异体活化的强度。西脒替丁可通过组织抑制的形成而增强活性。
实施例8：细胞疫苗的临床应用
此部分提供了显示皮下施用的包括活化的淋巴细胞和自体癌症细胞的免疫学组合物在引发的人类受体中成功刺激免疫学应答的实例。
癌症病人JT具有侵入性的多形成胶质细胞瘤，其已经经过传统的癌症治疗。于1995年8月和9月按实施例1对她进行肿瘤内移植治疗。
之后进行研究以测定是否JT已经形成可检测到的肿瘤特异性的免疫性。首先，从她的肿瘤中建立稳定的细胞系。将来自手术切除肿瘤的活的肿瘤细胞转移至实验室并且培养于含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中。将此细胞系命名为PGA-95。同时从后来切除的枕叶中回收活的肿瘤细胞并且用于产生第2细胞系，命名为PGA-96。这2种细胞系具有不完全相同但具有类似的特征。
以下面的方式进行MLTC(混合淋巴细胞-肿瘤培养)：用活的生长的PGA-95以不同的比例在RPMI-1640/10％FCS中培养在8月细胞移植时收集和冷冻保存的外周血淋巴细胞(PBL)达8天。没有检测到抗肿瘤活性。然而，将在1996年1月获自该病人的PBL与PGA-95以相同的方式一起培养时，观察到强烈的抗-肿瘤细胞活性。实际上，通过在分析结束以结晶紫染色附着的肿瘤细胞时而测得在以100∶1的PBL∶PGA-95比例共培养7-8天中，100％的肿瘤细胞被杀死。以50∶1的比例获得了类似的结果，并且以10∶1的比例，大约杀死50％的肿瘤细胞。重要的是，当无关的(第3者)PBL用于该共培养而作为替代时没有发生PGA-细胞的杀死。
在MLTC的头5天，产生高水平的IL-2(1000-1500pg/mL)，并且然后到第8天时降至低得多的水平。在8天的培养中没有检测到IL-4。仅仅6天后产生了显著水平的TNF，并且到第8天时继续增加至400-500pg/mL。通过流式细胞分析测定应答细胞的表型，并且发现为CD4+和CD8+细胞的混合物。CD4+细胞在培养早期增殖，然后CD8+细胞增殖。CD8+细胞不产生IL-2。因此，在培养基中补充200U/的mL重组IL-2(Hoffman-LaRoche)，并且在大约30天，产生大约1×109个CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)。
通过标准的51Cr释放分析测定产生的CTL的特异性。产生的抗PGA-96细胞的CTL有效地同时杀死PGA-95和PGA-96(在4-6小时中30-50％裂解)，或者冷冻保存未预前培养的肿瘤细胞。CTL没有杀死自体PBL或自体成纤维细胞；或者它们没有杀死无关的癌症细胞系：具体讲，为神经胶质瘤细胞(U373或ACBT)，前列腺癌细胞(LNCAP)，膀胱癌细胞(BLT-2)；卵巢癌细胞(UCI-107)或白血病细胞(K562)。
随着时间的流逝用MLTC监测病人JT全身性的抗-肿瘤细胞免疫性。从1996年1月开始，每2-3周收集血液样品。在MLTC分析中，以100∶1和50∶1的PBL∶PGA比例杀死了100％的肿瘤细胞，以更低的比例杀死率适当减少。在4月，该活性剧烈下降到以100∶1比例时仅仅杀死25％的肿瘤细胞，并且以50∶1的比例时没有杀死。就在此时，病人形成复发，需要枕叶切除。
随后，决定通过给她由混合淋巴细胞与肿瘤细胞组成的免疫而试图增强其全身性的抗-肿瘤活性。用10,000cGy灭活冷冻保存的原发肿瘤细胞。根据实施例1，用病人的刺激细胞与同种异体供体应答细胞进行混合淋巴细胞培养而制备细胞移植物细胞。通过混合100,50,25,或10×105个细胞移植细胞与1×107个辐射的肿瘤细胞制备该疫苗。剂量范围根据实施例5中所述的动物实验外推。注射在背部的4个不同位点进行。在所有4个位点，观察到皮肤反应，并且病人形成了发热反应：
表6
   位点及剂量     特征          接种后的天数(涉及的面积以cm×cm表示)
   0    1    2    3    4    5
     RUQ100×106     红斑 2.5×2.2       1.5×1.3       1.4×1.2       0.4×0.3       无            无
    硬结    无          0.5×0.4       1.0×1.1       1.0×1.0       1.4×1.7      1.3×1.6
     LUQ50×106     红斑 2.3×2.4       1.5×1.1       1.1×0.9       0.3×0.3       无            无
    硬结     无         0.5×0.3       0.7×0.6       0.8×0.8       1.4×1.8      1.2×1.2
     RLQ25×106     红斑 1.3×1.3       1.1×1.0       0.4×0.3       0.4×0.4       无             无
    硬结     无         0.2×0.2       0.3×0.3       0.3×0.4       1.0×0.9       1.0×1.0
     LLQ10×106     红斑 0.7×0.7       0.3×0.3          无             无            无            无
    硬结     无            无          0.1×0.1       0.3×0.4       0.8×0.7        1.0×1.0
   临床特征   发烧(°F) 从无到99         102            104          99-100.5       99-100.5        99-100.5
   类固醇(mg/天)      6            0             10            10              10             10
图10为在4次注射后立即拍摄的病人背部照片的复制图。在每个注射位点红斑明显；很可能对可溶性介质的应答在MLC中刺激的细胞中已经存在。
图11为在2天后拍摄的病人背部照片的复制图，显示硬结的迹象。该标记显示有关区域测得的大小。此延迟性超敏反应性的证据特别重要，因为其表明淋巴细胞和/或抗原呈递细胞通过刺激的同种异体细胞被募集到注射位点。预计该同种异体细胞刺激募集的宿主细胞，其反过来又应该与也在该位点存在的自体肿瘤细胞起反应。
病人的病历显示于表7中：
                          表7日期                              观察结果
          7岁右撇的白人女性10/93    ·复发后活检证实有多形成胶质细胞瘤。进行部分切除11/93    ·肿瘤发展。进行部分切除11/93    ·肿瘤发展。进行完全切除11/93    ·化疗：2期环磷酰胺2/94     ·外部射线放疗6/94     ·该剂量化疗：环磷酰胺+米尔法兰，然后自体骨髓移植8/95     ·肿瘤复发。进行部分切除；在脑室壁有残余肿瘤8/95     ·进行第一次细胞移植9/95     ·通过MRI检测到损伤扩大。进行切除。病理学显示炎症变化、坏死
      和少量残余的肿瘤10/95    ·进行第二次细胞移植12/95    ·进行二次伽玛刀治疗2/96     ·以多聚IC:LC治疗4/96     ·肿瘤发展。进行枕叶切除。观察到肿瘤具有交叉的中线；不可切除5/96     ·皮下施用疫苗
     ·观察到局部即刻的超敏反应和延迟性超敏反应。病人有发烧反应。6/96     ·病人稳定并且神经学上得到改善。肿瘤不生长。浮肿减少50％。
     ·抗-肿瘤活性的MLTC分析为阳性，与宿主来源的抗-肿瘤免疫反应相
      一致在皮肤施用该疫苗后12天进行的MLTC分析显示免疫应答剧烈恢复到以前在1-3月观察到的水平。在1996年6月1日进行的测定过程中MLTC结果维持在大约该水平。该病人死于大约1996年9月。
进行进一步的试验以证实该接种方法的参数。同在实施例1中同样的立法委员会主办下收进具有Ⅲ期或Ⅳ期星形细胞瘤的病人进行研究。所有病人被通知同意而登记，并且随机分成不同的治疗组。
冷冻保存每位病人手术时的肿瘤细胞，并且如果必要时在体外增殖以获取足够的细胞用于预期的疗程。将融化或培养的肿瘤细胞以10,000拉德伽玛辐射。基本上按照实施例1中所述用失活病人的刺激细胞和供体的白细胞进行制备规模的混合淋巴细胞培养。
在一个试验中，每2周接种病人2次。用于制备每种细胞疫苗的单核细胞获自2位健康无关的供体。预筛供体以使感染性疾病的风险降到最低，并且排除测试为阳性的供体。筛选包括测试对HIV-1,HIV-2,HTLV-1,HTLV-Ⅱ，肝炎C或肝炎B核心特异性的抗体；HIV抗原，HBsAg,RPR，或者肝脏标记如ALT的升高。进行HLA-A,-B,-C和-DR的分型以筛选出对于病人和相互间为同种异体的供体。通过使用遗传上无关的供体，降低第二次施用过急性排斥的可能性。此外，每次注射之前测试(供体细胞和病人血清的)主要交叉匹配而用于测定预先形成抗体的存在。除了可能的话避免施用Rh阳性供体的细胞至Rh阴性育龄期或更为年轻的女性外，血型的匹配一般是不必要的。
通过以10∶1的比例混合供体和失活病人的外周血单核细胞，并且在补充2％胎牛血清的AIMV中以3×106个细胞/mL的浓度在37℃培养3天而进行混合淋巴细胞培养。需要用于单次接种的单核细胞的总数不超过1×109个。收集刺激的细胞并且通过离心清洗，然后悬于无菌可注射盐水中。制备活化细胞的质控包括细胞计数和存活，测试支原体和内毒素，并且用早期活化标记监测淋巴细胞活化。
在用于治疗之前，也根据功能释放标准评价同种异体活化的细胞制剂。在细胞样品中进行四唑氮还原分析(XTT)。用荧光抗体通过流式细胞计测定细胞表面CD69的表达，或用荧光素二乙酸盐测定细胞内酯酶的活性。在培养的任何一天中，(第1,2或3天)如果在这些分析中任何一个(但是优选两个)测得的水平≥上述未刺激值的10％，则认为培养的细胞被足够活化。一旦该培养物达到该标准，无需在以后再测试。于第3天收获细胞，并且与所需数量的原发或培养的肿瘤细胞混合并且制备用于人类治疗。
第一次收进研究中的病人在2周内分2次接受1-3级剂量注射(108个MLC细胞：108个肿瘤细胞)：组1给予1×108个MLC细胞；组2给予5×108个MLC细胞；组3给予1×109个MLC细胞。根据可得到的数目，将MLC细胞与1×106个肿瘤细胞至1×107个肿瘤细胞混合，并且可能的话趋向与1×107个肿瘤细胞混合。用20-21号针头在前中大腿腹股沟韧带下10厘米处皮下施用该接种物。按如下测定最大耐受剂量：接受给定细胞组合的3位病人中至少有1位形成可逆的Ⅲ期或不可逆的Ⅱ期毒性，最多达3位额外的病人达到相同剂量。如果第2位病人形成相同程度或更高程度的毒性，将该细胞组合定义为MTD。另外，将这些剂量分级直到达到最大剂量。
通过数种标准监测临床应答：包括局部硬结、瘙痒或注射位点的坏死；全身性反应如发烧，头痛和改变的血液学或肾脏参数；和通过这样的标准如MRI测得的肿瘤体积。仔细解释MRI的结果。正在生长的肿瘤体积(正在发展疾病的特征)或局部的白细胞硬结(成功治疗的可能特征)二者在MRI中均可表现为扩大的区域。然而，面积的减小与缩小的肿瘤体积和成功的治疗是一致的。
通过数种标准监测治疗患者中细胞免疫应答的存在。每次接种前后获得的病人淋巴细胞与辐射的供体或第三者(用于抗同种异体应答)来源的同种异体细胞或辐射的病人肿瘤细胞或第三者肿瘤细胞(用于特异性抗肿瘤应答)培养。通过用MTT还原或一种其它功能分析作为细胞分裂的替代标记而测定培养中淋巴细胞的应答。通过用PE-标记抗体的免疫荧光计测定CD69的表达。
任选地，将应答T细胞与CD4,CD8或CD31共染色以鉴定辅助或抑制亚类，或与CD45R共染色以区分TH1与TH2细胞。通过ELISA定量分泌至培养基中的IL-2,IL-4,IFN-γ和TNF-α。IL-2和IFN-γ与TH1活性相关，IL-4与TH2活性相关，并且TNF-α与二者活性均有关。
按照该实施例中前面所述也测试病人PBL对自体肿瘤细胞应答的能力。在有无肿瘤细胞存在下培养PBL。可通过实施例6中所述的功能分析，[3H]胸苷掺入或原始化测定一般的T细胞活化。细胞毒性T细胞活性可测定为51Cr标记肿瘤细胞的裂解。通过比较肿瘤内施用5×105个自体肿瘤细胞，流行性腮腺炎，毛藓菌或PPD抗原48小时的应答与治疗前相同的情况测定治疗病人中有效的延迟性超敏(DTH)抗肿瘤应答。
在随后的试验中，将疫苗治疗与移植治疗结合。在上述手术摘除时，按照实施例1中所述将以自体刺激细胞刺激的同种异体淋巴细胞移植物置于瘤床中。冷冻和/或培养用于制备细胞疫苗的去除的肿瘤细胞。筛选出对患者是同种异体的两个供体，并且优选相互间是同种异体的且细胞供体用作对移植。按照该实施例中前面所述用每个供体的细胞制备疫苗的MLC组分，然后与病人的肿瘤细胞混合。在移植后4周施用一种疫苗；6周后施用另一种疫苗。筛选出等于或低于在以前试验中建立的MDD的剂量。按以前监测临床和免疫学标准。
比较经过联合治疗与仅仅接受颅内移植病人的应答以测定预前接种增强移植效应的程度。
对Ⅳ期(转移的)结肠癌病人进行另一项研究。病人以通知同意的方式登记入研究中，并且经历了标准的结肠切除术。大约1周后(他们出院的时间)，他们开始4次疫苗注射的疗程。
该疫苗组合物基本上由混合有肿瘤细胞的同种异体活化的细胞群所组成。病人接受3种不同剂量中的一种。1×108个MLC细胞；3×108个MLC细胞或者1×109个MLC细胞，根据可利用度与最多1×107个失活肿瘤细胞混合。
最初的研究主要是测定最大耐受剂量(MTD)。在注射位点不需的临床副作用包括不可接受水平的硬结、炎症或溃疡。
一旦测定MTD，比较仅仅4周的接种治疗和由直接移植到肿瘤块内而起始的接种治疗。结肠切除后，用超声引导注射针至肝脏中可测定大小的转移肿瘤内而处理移植组2天至一星期。在移植位点注射悬浮于最小体积盐水中的仅为10×109个MLC同种异体活化细胞的制剂。从一周后开始，该组病人也接受4周MLC-肿瘤细胞疫苗的疗程。
治疗后监测病人临床和免疫学应答的程度至少3个月。免疫学标准按照前面所述。临床标准部分按照跟踪肝脏中存在的肿瘤转移的体积。以规则的间隔进行CT扫描，计算每个转移位点的体积，并且比较这些体积与以前获得的测量结果。疾病的发展以转移体积的增加或转移位点数目的增加来表示。与具有同期结肠癌病人典型结果相比疾病逆转或发展速度降低表示成功的结果。
实施例9：同种异体活化相比组合物的商业制备
该方法描述制备活化淋巴细胞培养物的完整方法。该方法学的涉及考虑到商品制造(GMP)和商品实验室(GLP)的实践，并且包括美国联邦法21则的规定。
通过修改的白细胞分离法从待治疗病人中收集至少2×109个细胞。用干细胞收集方法在Baxter Fenwall分离器或相当的设备上进行细胞的分离。细胞在Baxter-型组分袋中于冰上(4-10℃)进行运输。用MONITOR-MARKTM Time/Temperature Tags监测运送温度。
通过修改的白细胞分离法从健康供体中收集至少10×109个供体外周血单核细胞。用干细胞收集方法在Baxter Fenwall分离器或相当的设备上进行细胞的分离。供体为无关匿名的并且为从预筛出潜在供体的名录中随机挑选的个体。
预筛供体应该显示出HIV，肝炎，海绵状脑炎或结核病的阴性风险因素。测试每种细胞组分为阴性，包括HIV 1/2Ab.HIV Ag,CMV Ab,HTLVⅠ/Ⅱ Ab,HCV Ab,HBcAb,HBsAg和RPR。细胞在Baxter-型组分袋中于冰上(4-10℃)进行运输。
对受体测试每种组分的无菌性，适当的细胞数量和存活。于4-10℃维持组分备用，并且使用或收集的72小时内冷冻。在2小时内使用冻融的材料并且不再冷冻。临床前的研究显示于4℃在ACD抗凝集血浆中储存的组分或冷冻于DMSO培养基中的材料适用于制备有效的细胞组分。
通过离心从供体和病人组分中取出血浆。可以收集和加热失活供体血浆而用作培养基补充物。在小体积的PBS中悬浮组分细胞并且混合适当体积的每种悬液以在AIMV培养基中以10∶1或20∶1(供体∶病人细胞)的比例制备含有3×106个单核细胞的培养物。加入加热失活的供体血浆至2％的终浓度。通过用Fenwall溶液泵和无菌设备将混合的细胞泵至Fenwall3升可透气的培养袋中。也可在小培养管中建立组分细胞的样品用于测试淋巴细胞的活化。将功能活性的测试与仅含有未刺激供体细胞的培养物比较。
将细胞混合物于37℃培养于5％湿度并且HEPA滤过的CO2的ISO-09000 Forma培养箱中3天并且密切地加以监测。培养后通过离心收获细胞。收集样品用于质量保证分析。测试每种制剂最终的无菌性，足够的细胞数量，足够的存活和功能活性。
将细胞制剂悬于25％无菌的人类清蛋白中，并且置于无菌可注射的小瓶中用于运输。包装后30小时标记上每个制剂的过期日期和时间，并且附上适当的说明、释放限定结果和MONITOR-MARKTMTime/Temperature Tag。包装细胞制剂并且通过过夜快递运输。如果不是立即使用，将细胞保存于4-10℃冰箱中。丢弃到期而未移植的任何制剂。
在生产测试中测试产品一致性的方法中包括：
·预筛选感染性疾病的测试；
·中间和终产品无菌性测试
·终产品支原体和内毒素
·中间和终产品细胞计数；中间和终产品存活(≥85％)
细胞必须达到满意的功能标准。没有达到这些标准中任何一个标准的制剂不能用于治疗病人。
            表8：供体和病人筛选
            (在白细胞分离方法时)
测试                方法               说明
               (每个医院血库SOPS)
预筛风险因子         HIV             仅仅是报告
                     肝炎
                  海绵状脑炎
                     结核
危险剂的筛选        HIV1和2          所有阴性*
                    HIVAg
                    HBs-Ag
                    Hbc Ab*
                    HCV Ab
                  HTLV1和2Ab
                    CMV Ab*
                     RPR
*病人可能为HBcAb或CMV Ab阳性，并且组分如表中所标记。如果不CMV阴性供体组分不能得到，甚至对CMV阴性病人讲可以使用CMV Ab阳性供体组分。
表9：治疗前测试供体和病人的单核细胞
(在医院接受时，辐射病人单核细胞之前)
测试             说明
无菌性           无菌
细胞计数
病人：           ≥2×108个细胞
供体：           ≥10×109个细胞
          表10：同种异体活化细胞的中间测试
测试                    分析                   说明淋巴细胞活化的生物    四唑氮还原分析       在测试的任何一天≥10％活性                      (XTT)              未刺激的供体对照值(于培养的第1,2和/或3天的测试)
                    流式细胞计           在测试的任何一天≥10％
                (通过荧光抗体测得细胞表  未刺激的供体对照值
                面CD69的表达；或通过荧光
                素二乙酸盐测得的细胞内酯
                酶活性的增加)
                  表11：终产物测试
测试          说明
无菌性        无菌
细胞计数      9×109个细胞(±10％)
存活          ≥85％存活的细胞
支原体        阴性(直到移植后才得到结果)
内毒素        ≥350EU/整个身体
尽管为了清晰和理解的目的，通过说明和实施例描述了前面的发明，但是，对于本领域的技术人员来说，显然可以进行一些改变和修饰。因此，这些描述和实施例不应构成对由附属权利要求所定义的本发明范围的限定。

Claims (42)

1．适用于施用于人类的免疫原性的组合物，包括以下有效的组合：
a)对人类同种异体的刺激的淋巴细胞；和
b)来自人类的肿瘤相关抗原。
2．权利要求1的免疫原性组合物，其中所述的肿瘤相关抗原包括来自所述人类的原发肿瘤细胞，或通过在体外培养该肿瘤细胞而获得的子代细胞。
3．权利要求1的免疫原性组合物，其中所述的肿瘤相关抗原包括来自所述人类的原发肿瘤细胞或所述病人原发肿瘤细胞的子代细胞的提取物或其组合。
4．权利要求1-3的免疫原性组合物，其中所述的刺激的淋巴细胞通过培养对该淋巴细胞为同种异体的白细胞而受到刺激。
5．权利要求1-3的免疫原性组合物，其中所述刺激的淋巴细胞通过与重组制备的细胞因子、丝裂原或与遗传上被改变从而以更高水平分泌细胞因子的细胞一起培养而受到刺激。
6．适用于施用于人类的免疫原性的组合物，包括以下有效的组合：
a)对人类为同种异体的淋巴细胞；
b)对该淋巴细胞为同种异体的白细胞；和
c)基本上由获自人的原发肿瘤细胞或该细胞子代所组成的失活肿瘤细胞群。
7．权利要求6的免疫原性组合物，其中所述的白细胞是人自体的细胞。
8．权利要求6的免疫原性组合物，其中所述的白细胞是对人同种异体的细胞。
9．权利要求6的免疫原性组合物，包括来自至少3个不同人类供体的白细胞。
10．权利要求6的免疫原性组合物，其中所述失活肿瘤细胞群选自黑素瘤、胰腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞。
11．权利要求6的免疫原性组合物，其中的白细胞被失活。
12．权利要求6的免疫原性组合物，其中所述的淋巴细胞包括在遗传上被改变从而以更高的水平表达细胞因子的细胞。
13．权利要求6的免疫原性组合物，其中将所述的白细胞和所述的淋巴细胞在与所述肿瘤细胞种群混合之前在足以对该淋巴细胞同种异体刺激的时间和条件下共培养。
14．权利要求6的免疫原性组合物，其中所述的共培养是足以刺激该淋巴细胞分泌更高水平细胞因子的时间和条件。
15．根据权利要求6-14的免疫原性组合物的单位剂量，其中的对白细胞为同种异体的所述淋巴细胞的数目在大约1×108到2×109之间。
16．根据权利要求6-14的免疫原性组合物的单位剂量，其中该剂量失活肿瘤细胞群由大约1×106到5×107个细胞所组成。
17．用于制备权利要求1的免疫原性组合物的方法，包括混合：
a)对人为同种异体的刺激淋巴细胞；与
b)来自人的肿瘤相关抗原。
18．用于制备权利要求1的免疫原性组合物的方法，包括混合：
a)从对人为同种异体的淋巴细胞和对该淋巴细胞为同种异体的白细胞的共培养物中获得的细胞；与
b)来自人的原发肿瘤细胞或其后代。
19．用于制备权利要求1的免疫原性组合物的试剂盒，其在分离的容器中含有：
a)对人为同种异体的刺激的淋巴细胞；和
b)来自人的肿瘤相关抗原。
20．用于制备权利要求1的免疫原性组合物的试剂盒，其在分离的容器中含有：
a)从对人为同种异体的淋巴细胞和对该淋巴细胞为同种异体的白细胞的共培养物中获得的细胞；与
b)来自人的原发肿瘤细胞或其后代。
21．用于在人类中诱导抗-肿瘤免疫学应答的方法，包括对病人施用免疫原性量的权利要求1-5中任一项权利要求的免疫原性组合物。
22．用于在人类中诱导抗-肿瘤免疫学应答的方法，包括对病人施用免疫原性量的权利要求6-14中任一权利要求的免疫原性组合物。
23．用于在人类中刺激抗-肿瘤免疫学应答的方法，包括以下步骤：
a)在体外混合包括肿瘤细胞的第一种细胞群和包括对该淋巴细胞为同种异体的淋巴细胞的第二个细胞群以制备细胞混合物；和
b)对病人施用免疫原性量的该细胞混合物。
24．权利要求23的方法，其中所述的肿瘤细胞包括选自黑素瘤、胰腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞。
25．权利要求23的方法，其中所述的第二个细胞群进一步包括对该淋巴细胞为同种异体的白细胞。
26．权利要求23的方法，其中所述的第二个细胞群含有来自至少三位不同病人供体的白细胞。
27．权利要求23的方法，其中所述的白细胞为该病人自体的白细胞。
28．权利要求23的方法，其中所述的白细胞为该病人同种异体的白细胞。
29．权利要求23的方法，其中所述的免疫学应答为初级应答。
30．权利要求23的方法，其中所述的免疫学应答为次级应答。
31．权利要求23的方法，其中所述的病人以前通过施用同种异体活化的同种异体淋巴细胞至该病人的实体瘤内或至去除实体瘤或其一部分的位点周围而治疗过。
32．用于治疗人类神经胞质疾病的方法，包括对病人施用有效量的权利要求1-14中任一权利要求的免疫原性组合物。
33．用于治疗人类神经胞质疾病的方法，包括以下步骤：
a)在体外混合包括肿瘤细胞的第一种细胞群和包括对该淋巴细胞为同种异体的淋巴细胞的第二个细胞群以制备细胞混合物；和
b)对病人施用有效量的该细胞混合物。
34．权利要求33的方法，其中所述的第二个细胞群进一步包括对该淋巴细胞为同种异体的白细胞。
35．用于通过手术或治疗对病人治疗方法中的含有以下成份的细胞群：
a)对该病人为同种异体的同种异体活化的淋巴细胞；和
b)该病人的原发肿瘤细胞或其后代。
36．根据权利要求35的细胞群，其中的淋巴细胞已经被同种异体活化而抗该病人的白细胞。
37．根据权利要求35的细胞群，其中的淋巴细胞已经被同种异体活化而抗对该病人为同种异体的白细胞。
38．含有以下成份的细胞群在制备治疗该病人肿瘤或在该病人中引发抗-肿瘤免疫学应答的药物中的用途：
a)对该病人为同种异体的同种异体活化的淋巴细胞；和
b)来自该病人的原发肿瘤细胞或其后代。
39．根据权利要求38的用途，其中的淋巴细胞已经被同种异体活化而抗该病人的白细胞。
40．根据权利要求38的用途，其中的淋巴细胞已经被同种异体活化而抗对该病人为同种异体的白细胞。
41．用于同时、分别或连续用于通过手术或治疗而对病人的治疗方法中的含有以下成份的混合制剂：
a)对该病人为同种异体的同种异体活化的淋巴细胞；和
b)该病人的原发肿瘤细胞或其后代。
42．应用同时、分别或连续用于治疗该病人的肿瘤或在该病人中引发抗-肿瘤免疫学应答中的含有以下成份的混合制剂：
a)对该病人为同种异体的同种异体活化的淋巴细胞；
b)该病人的原发肿瘤细胞或其后代。
CN97199908A 1996-10-11 1997-10-10 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗 Pending CN1237909A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2854896P 1996-10-11 1996-10-11
US60/028,548 1996-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1237909A true CN1237909A (zh) 1999-12-08

Family

ID=21844058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97199908A Pending CN1237909A (zh) 1996-10-11 1997-10-10 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6207147B1 (zh)
EP (1) EP0930887B1 (zh)
JP (1) JP2001509135A (zh)
KR (1) KR20000049096A (zh)
CN (1) CN1237909A (zh)
AR (1) AR004445A1 (zh)
AT (1) ATE229810T1 (zh)
AU (1) AU743855B2 (zh)
BR (1) BR9712988A (zh)
CA (1) CA2267157C (zh)
DE (1) DE69718029T2 (zh)
NO (1) NO991691L (zh)
WO (1) WO1998016238A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597222A (zh) * 2009-10-27 2012-07-18 因缪尼卡姆股份公司 用于增殖抗原特异性t细胞的方法
CN105873639A (zh) * 2013-09-27 2016-08-17 万科斯诺晋国际合作有限公司 自体肿瘤疫苗和方法
CN107921065A (zh) * 2015-06-26 2018-04-17 纪念斯隆-凯特林癌症中心 通过t细胞疗法治疗cmv视网膜炎的方法
CN111286537A (zh) * 2011-05-24 2020-06-16 生物技术Rna制药有限公司 用于癌症的个体化疫苗
CN112334143A (zh) * 2018-06-21 2021-02-05 麦丁制药公司 来自巨噬细胞和经辐射白细胞共培养物的上清液，用于控制肿瘤的进展或恢复抗肿瘤免疫力

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7361332B2 (en) 1995-03-17 2008-04-22 The Regents Of The University Of California Treating tumors using implants comprising combinations of allogeneic cells
US6368593B1 (en) 1997-10-10 2002-04-09 The Regents Of The University Of California Enhanced immunogenic cell populations prepared using H2 receptor antagonists
US20080220025A1 (en) * 1995-03-17 2008-09-11 James Thompson Treating Tumors Using Implants Comprising Combinations of Allogeneic Cells
WO1998048000A2 (en) * 1997-04-23 1998-10-29 The Regents Of The University Of California A cell strain with activated anti-cancer cytotoxic activity
ATE359080T1 (de) 1997-10-10 2007-05-15 Univ California Allogene zellkombination enthaltende implantate zur krebsbehandlung
WO1999018980A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 Meyer Pharmaceuticals, Llc Cancer immunotherapy using allostimulated cells in a multiple sequential implantation strategy
JP4389039B2 (ja) * 1998-04-09 2009-12-24 株式会社リンフォテック アロジェニックな活性化ｃｄ４陽性細胞を主成分とする医薬組成物、およびその製造方法、ならびに該医薬組成物調製用キット
US7666609B1 (en) 1998-12-01 2010-02-23 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co. Ltd. Method and composition for diagnosis of melanocytic lesions
EP1159967B1 (en) * 1999-02-09 2008-09-10 Riken Tumor vaccines
DE60144515D1 (de) 2000-04-01 2011-06-09 Onyvax Ltd Prostata zellinien und deren verwendung
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US20080194022A1 (en) * 2000-08-03 2008-08-14 Clarke Michael F Isolation and use of solid tumor stem cells
DE10043437A1 (de) * 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
US7723111B2 (en) * 2001-03-09 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use
IL157504A0 (en) * 2001-05-11 2004-03-28 Wellstat Biologics Corp Oncolytic virus therapy
US7658926B2 (en) * 2001-09-14 2010-02-09 Opexa Pharmaceuticals, Inc. Autologous T-cell vaccines materials and methods
EP1293205A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-19 G2M Cancer Drugs AG Valproic acid and derivatives thereof for the combination therapy of human cancers, for the treatment of tumour metastasis and minimal residual disease
CN100422334C (zh) * 2001-11-27 2008-10-01 内克西特股份有限公司 秀丽新杆线虫中真核生物蛋白质和核酸分子的生产
KR20020060643A (ko) * 2002-06-04 2002-07-18 김진경 타인의 면역시스템을 이용하는 암의 치료 방법
AU2003258090B2 (en) * 2002-08-08 2010-07-22 Baylor College Of Medicine Isolation and identification of T cells
US7571817B2 (en) * 2002-11-06 2009-08-11 Varco I/P, Inc. Automatic separator or shaker with electromagnetic vibrator apparatus
WO2004075855A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Biomed Solutions, Llc Process for in vivo treatment of specific biological targets in bodily fluid
WO2004096244A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Md Bioalpha Co. Ltd. Method of preparing tumor vaccine for the inducement of anti-tumor activity and a pharmaceutical composition containing the same
US7807784B2 (en) 2003-06-11 2010-10-05 The University Of Chicago Increased T-cell tumor infiltration by mutant LIGHT
US7811983B2 (en) * 2003-06-11 2010-10-12 The University Of Chicago Increased T-cell tumor infiltration and eradication of metastases by mutant light
US20050019336A1 (en) 2003-07-23 2005-01-27 Dalgleish Angus George Human prostate cell lines in cancer treatment
US7696322B2 (en) * 2003-07-28 2010-04-13 Catalent Pharma Solutions, Inc. Fusion antibodies
AU2004280616A1 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Vet-Stem Inc. Methods of preparing and using stem cell compositions and kits comprising the same
US8029454B2 (en) 2003-11-05 2011-10-04 Baxter International Inc. High convection home hemodialysis/hemofiltration and sorbent system
US20050112684A1 (en) * 2003-11-21 2005-05-26 Eric Holzle Class I and Class II MHC Profiling for Social and Sexual Matching of Human Partners
EP2369014A1 (en) 2004-02-03 2011-09-28 The Regents Of The University Of Michigan Office Of Technology Transfer Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing and treating cancer
US7858323B2 (en) 2004-06-09 2010-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Phage microarray profiling of the humoral response to disease
US8257715B1 (en) 2004-08-26 2012-09-04 University Of Notre Dame Tissue vaccines and uses thereof
US9155789B2 (en) * 2005-04-25 2015-10-13 New York University Use of allogenic or syngenic major histocompatibility complex (MHC) molecules as universal adjuvants for vaccines against neoplastic disease, infection and autoimmune disease
US20090162405A1 (en) * 2006-12-14 2009-06-25 Yong Qian Proteinase-engineered cancer vaccine induces immune responses to prevent cancer and to systemically kill cancer cells
US8778360B2 (en) * 2005-10-27 2014-07-15 University Of Notre Dame Extracellular matrix cancer vaccine adjuvant
US9308252B2 (en) * 2005-10-27 2016-04-12 Cook Biotech, Inc. Extracellular matrix materials as vaccine adjuvants for diseases associated with infectious pathogens or toxins
US8778362B2 (en) 2005-10-27 2014-07-15 University Of Notre Dame Anti-tumor/cancer heterologous acellular collagenous preparations and uses thereof
US8802113B2 (en) * 2005-10-27 2014-08-12 University Of Notre Dame Extracellular matrix cancer vaccine adjuvant
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
US7723112B2 (en) * 2005-10-31 2010-05-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
HUE031122T2 (en) 2005-10-31 2017-07-28 Oncomed Pharm Inc Preparations and methods for the treatment of cancer based on human FZD receptors
US20070243192A1 (en) * 2006-02-21 2007-10-18 Regents Of The University Of Michigan Growth hormone receptor antagonist cancer treatment
WO2008121102A2 (en) * 2006-02-21 2008-10-09 The Regents Of The University Of Michigan Hedgehog signaling pathway antagonist cancer treatment
DK2016414T3 (en) * 2006-05-05 2015-12-07 Opexa Therapeutics T-cell vaccine
WO2008019290A2 (en) 2006-08-04 2008-02-14 Astrazeneca Ab Human antibodies to erbb 2
US7972594B2 (en) * 2006-11-13 2011-07-05 Immunovative Therapies Ltd. Ablative immunotherapy
WO2008061392A1 (fr) * 2006-11-22 2008-05-29 Hua Liu Procédé de préparation de populations cellulaires présentant une réponse immunitaire antitumorale
US20080147007A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-19 Toby Freyman Delivery device with pressure control
US8148147B2 (en) 2007-01-24 2012-04-03 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing pancreatic cancer
AU2008207735B2 (en) 2007-01-26 2013-10-03 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
WO2008098183A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 The University Of Chicago Combination therapy for treating cancer
EP2650018A3 (en) 2007-05-14 2014-09-03 The University of Chicago Antibody-LIGHT fusion products for cancer therapeutics
EP2195650B1 (en) * 2007-09-12 2016-07-06 Yeda Research And Development Company Ltd. Methods of treating tumors in immune-privileged sites
US8114276B2 (en) 2007-10-24 2012-02-14 Baxter International Inc. Personal hemodialysis system
US9283266B2 (en) * 2008-02-28 2016-03-15 University Of Notre Dame Metastasis inhibition preparations and methods
BRPI0919473A2 (pt) 2008-09-26 2017-08-29 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligação frizzled e usos dos mesmos
AU2009308707A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
HUE032623T2 (hu) 2008-11-11 2017-10-30 Univ Michigan Regents Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek
CU23740A1 (es) * 2009-09-29 2011-12-28 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método de obtención de una formulación de antígenos del virus de la hepatitis b
JP6047403B2 (ja) * 2009-12-08 2016-12-21 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバシティ オブ イリノイズＴｈｅ Ｂｏａｒｄ Ｏｆ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ 幹細胞免疫変調の使用方法及び装置
US8846059B2 (en) 2009-12-08 2014-09-30 University Of Notre Dame Extracellular matrix adjuvant and methods for prevention and/or inhibition of ovarian tumors and ovarian cancer
US20110150934A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 University Of Notre Dame Ovarian Tumor Tissue Cell Preparations/Vaccines for the Treatment/Inhibition of Ovarian Tumors and Ovarian Cancer
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
EP2548025A4 (en) * 2010-03-17 2013-09-25 Univ Michigan USE OF PHOTOEPITOPES FOR PROFILING AN IMMUNE REACTION
MX347515B (es) 2010-04-01 2017-04-28 Oncomed Pharmaceuticals Inc * Agentes que se unen al receptor encrespado y usos de los mismos.
WO2011129348A1 (ja) * 2010-04-13 2011-10-20 株式会社Ｒｅｉメディカル 癌組織由来細胞塊または癌細胞凝集塊から得られる癌治療用組成物およびそれを用いた免疫療法剤の製造方法ならびに免疫療法効果評価方法
EP2704741B1 (en) * 2011-05-03 2017-08-23 Immunovative Therapies, Ltd. Methods for handling biological drugs containing living cells
CN104284680A (zh) 2011-12-15 2015-01-14 芝加哥大学 使用对受体的亲和力增加的突变型light分子用于癌症治疗的方法和组合物
CA2887711A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
WO2014121196A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a wnt pathway inhibitor
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
US11173205B2 (en) 2014-11-05 2021-11-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of selecting T cell line and donor thereof for adoptive cellular therapy
US20180055920A1 (en) * 2015-03-12 2018-03-01 University Of Iowa Research Foundation Vaccine, therapeutic composition and methods for treating or inhibiting cancer
WO2017023801A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Regents Of The University Of Minnesota Intracellular genomic transplant and methods of therapy
US11219645B2 (en) 2015-11-18 2022-01-11 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
GB2605540B (en) 2016-10-18 2022-12-21 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
WO2018138682A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Immune Therapeutics Methods and compositions useful for treating cancer
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
KR102256337B1 (ko) * 2017-10-17 2021-05-26 (주)노터스생명과학 조직이식을 위한 세포배양액을 포함하는 면역억제제
US11446329B2 (en) 2017-11-01 2022-09-20 Restem Llc Natural killer cell adoptive transfer therapy for the elimination of senescent PBMCs, reduction of inflammatory cytokines and treatment of IBS
IL259392A (en) 2018-05-15 2018-08-01 Yeda Res & Dev Vaccination with cancer neo-antigens
WO2023196232A1 (en) * 2022-04-04 2023-10-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method of characterizing tumors
CN114984199A (zh) * 2022-04-19 2022-09-02 苏州尔生生物医药有限公司 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5192537A (en) 1984-03-30 1993-03-09 Cellcor Inc. Method of treating renal cell carcinoma using activated mononuclear cells, renal tumor antigen and cimetidine
US4828991A (en) 1984-01-31 1989-05-09 Akzo N.V. Tumor specific monoclonal antibodies
JP2639835B2 (ja) * 1988-11-30 1997-08-13 有限会社ジオリサーチ 免疫記憶細胞懸濁液の調製方法
US5229115A (en) * 1990-07-26 1993-07-20 Immunex Corporation Adoptive immunotherapy with interleukin-7
JPH06121672A (ja) * 1992-10-13 1994-05-06 Cellcor Inc 免疫反応性細胞の製造
US5820872A (en) * 1992-11-18 1998-10-13 Yale University Methods and compositions for improving the effectiveness of X-irradiation therapy for the treatment of an internal solid tumor
WO1994020120A1 (en) 1993-03-12 1994-09-15 Cellcor, Inc. In vitro assay measuring degree of activation of immune cells
CA2178950A1 (en) 1993-12-14 1995-06-22 Yajun Guo Tumor cell fusions and methods for use of such tumor cell fusions
US5759535A (en) 1994-05-13 1998-06-02 Research Corporation Technologies, Inc. Immunotherapeutic strategies for the treatment of cancer
JPH10504284A (ja) * 1994-06-14 1998-04-28 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 抗原パルス化樹状細胞によるｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化法
DE4431401A1 (de) 1994-08-24 1996-02-29 Max Delbrueck Centrum Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen
CA2214503C (en) * 1995-03-17 2002-05-07 The Regents Of The University Of California Method for treating tumors
US6277368B1 (en) 1996-07-25 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597222A (zh) * 2009-10-27 2012-07-18 因缪尼卡姆股份公司 用于增殖抗原特异性t细胞的方法
CN102597222B (zh) * 2009-10-27 2015-07-15 因缪尼卡姆股份公司 用于增殖抗原特异性t细胞的方法
CN111286537A (zh) * 2011-05-24 2020-06-16 生物技术Rna制药有限公司 用于癌症的个体化疫苗
CN105873639A (zh) * 2013-09-27 2016-08-17 万科斯诺晋国际合作有限公司 自体肿瘤疫苗和方法
CN107921065A (zh) * 2015-06-26 2018-04-17 纪念斯隆-凯特林癌症中心 通过t细胞疗法治疗cmv视网膜炎的方法
CN112334143A (zh) * 2018-06-21 2021-02-05 麦丁制药公司 来自巨噬细胞和经辐射白细胞共培养物的上清液，用于控制肿瘤的进展或恢复抗肿瘤免疫力

Also Published As

Publication number Publication date
US6207147B1 (en) 2001-03-27
CA2267157C (en) 2005-05-31
EP0930887A2 (en) 1999-07-28
WO1998016238A3 (en) 1998-09-11
DE69718029D1 (de) 2003-01-30
NO991691L (no) 1999-06-09
AR004445A1 (es) 1998-12-16
DE69718029T2 (de) 2003-10-16
EP0930887B1 (en) 2002-12-18
JP2001509135A (ja) 2001-07-10
ATE229810T1 (de) 2003-01-15
AU743855B2 (en) 2002-02-07
BR9712988A (pt) 2000-10-24
WO1998016238A2 (en) 1998-04-23
CA2267157A1 (en) 1998-04-23
KR20000049096A (ko) 2000-07-25
NO991691D0 (no) 1999-04-09
AU4824297A (en) 1998-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1237909A (zh) 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗
CN1250285C (zh) 被称作胞外体的细胞囊泡,其制备方法及在免疫刺激中的用途
CN101052709A (zh) 装载热激黑素瘤细胞体的树突细胞
CN1103431A (zh) 测定富集于肿瘤反兴性细胞中的淋巴结的方法
Zaft et al. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells
CN1253551C (zh) 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌
CN1173745C (zh) 化学修饰的蛋氨酸酶及其在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用
CN1254272C (zh) 免疫系统的激活和抑制
Gao et al. Regulation of antigen‐expressing dendritic cells by double negative regulatory T cells
CN1646147A (zh) 用于将系统性免疫应答靶向于特定器官或组织的方法和组合物
CN1090204A (zh) 白细胞介素-4/或白细胞介素-10的新用途及其抗体
US20010038841A1 (en) Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine
CN1805758A (zh) 核酸和细胞疫苗的组分
CN101039700A (zh) 包含能结合人树突细胞的单克隆抗体和β人绒毛膜促性腺激素的疫苗缀合物
CN1270630A (zh) 处理白细胞的方法、白细胞组合物及其应用方法
CN1630529A (zh) 用于诊断和治疗b细胞恶性肿瘤的b细胞淋巴瘤特异性抗原
CN1541113A (zh) 利用激活的t细胞使抗原提呈细胞成熟
CN1784488A (zh) 在存在gm－csf,缺少另外的细胞因子下,由单核细胞性树突细胞前体细胞产生树突细胞
CN1656216A (zh) 耐受抗原呈递细胞
CN1537161A (zh) 抗原呈递细胞、其制备方法及其用于癌症疫苗的用途
CN1454215A (zh) 树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞
CN101080420A (zh) 胸腺特异性蛋白质
CN1489471A (zh) 训导的nkt细胞及其在免疫相关病症的治疗中的用途
CN1671424A (zh) 治疗和预防炎症性疾病的诱饵组合物
CN1929855A (zh) 诱导或调节免疫反应的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication