CN101039700A - 包含能结合人树突细胞的单克隆抗体和β人绒毛膜促性腺激素的疫苗缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的抗体疫苗缀合物及使用所述缀合物诱导细胞毒性T细胞(CTL)应答的方法。在一个具体的实施方案中，该疫苗缀合物包含与抗甘露糖受体(MR)抗体连接的人绒毛膜促性腺激素β亚基(βhCG)抗原。

Description

包含能结合人树突细胞的单克隆抗体和β人绒毛膜促性腺激素的疫苗缀合物
相关申请
本申请要求于2004年7月30日申请的美国临时专利申请号10/903,191的优先权。上述申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
发明背景
免疫应答起始于专门的抗原呈递细胞(APC)水平，此类细胞包括存在于机体组织中的树突细胞(DC)和巨噬细胞(Mg)。DC表达高水平的细胞表面分子和补体受体，它们与T淋巴细胞相互作用，因此能够诱导有效的免疫应答。DC也分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶，它们能够启动免疫应答并使细胞免疫和体液免疫的扩增达到顶点。
DC在其表面表达结合抗原片段的主要组织相容性复合体(MHC)分子。表达能识别这类抗原-MHC复合物的T细胞受体(TCR)的T细胞被激活并启动免疫级联。一般而言，有I类和II类MHC分子两类MHC分子。I类MHC分子将抗原呈递给特定的CD8+T细胞，而II类MHC分子将抗原呈递给特定的CD4+T细胞。
为了有效治疗许多疾病，特别是癌症，疫苗必须引发有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，亦称细胞毒性T细胞应答。细胞毒性T细胞主要包括在I类MHC情况下识别抗原的CD8+T细胞。与I类MHC分子有关的抗原加工明显与II类MHC分子不同。外源性递送到APC的抗原主要与II类MHC分子一起加工。相比之下，由于I类MHC分子位于胞内，内源性递送到APC的抗原主要与I类MHC分子一起加工。这不仅对APC如此，对所有表达I类MHC分子并在其表面连续展示与I类MHC分子相关的内源产生的抗原的有核细胞也是如此。
因此，当病毒或肿瘤抗原作为与I类MHC分子相结合的肽被展示时，CTL可以靶向表达独特蛋白的感染病毒的细胞或肿瘤细胞。然而在特定条件下，DC具有独特能力，也能使外源抗原进入内部区室以结合I类MHC分子，致使它们经由I类和II类MHC两种途径呈递给T细胞。此过程称为交叉敏化或交叉呈递。
因此，尽管抗体介导应答已经证明，当直接针对特定的分泌抗原或细胞表面抗原时，对特定疾病具有一定保护性或治疗性功效，但是针对多种疾病的最有效的免疫疗法看来都需要T细胞介导的免疫应答，尤其是CTL应答。由于有效的CTL应答并不限于胞外抗原，所以有可能开发出基于抗原的治疗性疫苗，所述疫苗并非有效的抗体靶标。因此，响应疾病相关抗原而发生的CTL新方法具有重大意义，因为，通常认为这些细胞对许多疫苗功效来说是至关重要的，并对大多数治疗性癌症疫苗来说是必不可少的。
目前测试的一种疫苗方法使用抗原性肽进行免疫。此免疫方法绕过了对抗原摄取和加工的需求，而是依赖于肽与APC表面已经表达的I类MHC分子的直接结合能力。尽管此方法已经清楚证明患者体内的CTL诱导，但是该方法有些局限性。抗原性肽必须事先建立，不同MHC单体型的个体需要不同肽，而且肽在体内寿命短。
另一种测试的方法是采用抗体-抗原复合物。Paul等(62)表明，对给定抗原具有特异性的抗体能增加小鼠针对所述抗原的体液免疫应答，推测是通过将免疫复合物传递给APC上表达的IgG的Fc受体(FcγR)。Wernersson及其同事(63)使用免疫复合物，研究了各FcγR在增强体内免疫应答中的作用。他们的研究证明FcγRI足以介导增强的免疫应答。然而，这类免疫复合物并不特异性靶向APC，因为它们也与许多并不参与抗原呈递的细胞上的Fc受体结合，因而降低了抗原递送效率。
随后的研究使用抗体，以将抗原选择性靶向APC上的各种受体，并且已经证明这类选择性呈递能够诱导体液应答(66，67)。此外，已经知道，在I类MHC的情况下，与DC上的FcR结合的免疫复合物被加工和呈递(64，65)。此外，许多这类靶向FcR的方法受到限制，因为FcR在许多非APC例如血小板和嗜中性白细胞上表达。理想条件下，特异性靶向APC并能诱导有效的I类MHC限制性CTL应答以及诱导有效的II类MHC限制性TH应答的疫苗，在治疗某些疾病方面可以提供增强的功效。
同样，已经知道，甘露糖基化抗原能诱导体液免疫应答和T细胞介导免疫应答，例如CTL应答。然而，甘露糖基化抗原并不特异性靶向APC，因为其它甘露糖结合蛋白含量丰富。而且，甘露糖基化蛋白由未成熟DC通过大胞饮机制而内化。因此，通过抗原甘露糖基化而产生的免疫应答机制和性质，与通过用抗体将抗原特异性靶向甘露糖受体的机制和特性截然不同。
由于现有方法不能有效而特异性靶向APC，所以许多治疗用疫苗都需要从患者中纯化DC，接触抗原后再回输给该患者。
因此，需要能有效靶向APC并产生抗原特异性T细胞介导免疫应答(包括抗原特异性CTL应答)的改进型疫苗，用于有效治疗多种疾病。
发明概述
本发明提供基于抗体的疫苗和方法，用于产生有效治疗多种疾病所需的抗原特异性T细胞介导免疫应答。具体地说，使用能结合APC上表达的特定受体的抗体，通过将一种或多种蛋白质抗原靶向抗原呈递细胞(APC)而诱导有效的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。优选的受体包括C-凝集素受体，尤其是树突细胞(DC)和巨噬细胞上表达的人甘露糖受体。正如本发明所证明，采用抗体-抗原缀合物靶向甘露糖受体，使得抗原通过I类和II类MHC途径而加工。因此，诱导抗原特异性CTL(例如CD8+T细胞)及其它重要的效应T细胞，包括辅助T细胞(例如CD4+T细胞)。
因此，一方面，本发明通过形成抗原与结合人APC的单克隆抗体(例如结合人APC上表达的人甘露糖受体的单克隆抗体)的缀合物，提供一种诱导或增强针对抗原的CTL应答的方法。然后，使缀合物在体内或离体与APC接触，使抗原以诱导或增强针对抗原的CTL应答(例如由CD8+细胞毒性T细胞介导的应答)的方式被内化、加工并呈递给T细胞。在一个优选实施方案中，这也用来诱导针对抗原的辅助T细胞应答(例如由CD4+辅助T细胞介导的应答)。因此，免疫应答经由I类和II类MHC两种途径而诱导。也可以使APC与佐剂或免疫刺激剂例如细胞因子接触，所述免疫刺激剂刺激树突细胞增殖，以进一步增强免疫应答。上述免疫刺激剂可以与分子缀合物单独接触或者与分子缀合物连接。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供疫苗缀合物，其包含与抗原和免疫刺激剂连接的单克隆抗体，其中单克隆抗体能结合人APC。免疫刺激剂可以与缀合物共价或非共价连接。或者，免疫刺激剂可以与缀合物用基因工程技术融合(例如与缀合物共同表达为一个融合蛋白)。可以使用各种合适的免疫刺激剂，包括但不限于：CD40配体；细胞因子，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体；toll受体激动剂(例如鞭毛蛋白和MALP-2(巨噬细胞活化脂肽-2)；LPS(内毒素)；R837(3MPharmaceuticals，St.Paul，MN)；R848(3M Pharmaceuticals，St.Paul，MN)；聚肌胞苷酸(polyI：C，肌苷：胞苷多核苷酸)；ssRNA；dsRNA；卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。
本发明的缀合物中可以使用各种合适的抗体，包括但不限于来源于任何物种(例如人、鼠、兔等)的抗体和/或经基因工程和重组表达的抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)。优选的抗体包括人单克隆抗体。用于本发明的抗体也可包含任何抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE，尽管优选的抗体为IgG同种型。抗体可为全抗体或其抗原结合片段，包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv片段。
用于本发明的优选抗体包括与人甘露糖受体结合的人单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体由人重链和人κ轻链核酸编码，该核酸在其可变区中包含分别示于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7同源性足够高的核苷酸序列，致使抗体保持与树突细胞结合的能力。
另一些优选的人抗体包括具有以下特性的抗体：与人甘露糖受体结合并且具有人重链和人κ轻链可变区的抗体，可变区包含分别示于SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8同源性足够高的氨基酸序列，致使抗体保持与树突细胞结合的能力。
本发明其它具体的人抗体包括具有人重链和轻链CDR1区、人重链和轻链CDR2区及人重链和轻链CDR3区的互补决定区(CDR)的抗体，其中
(a)人重链区CDR1、CDR2和CDR3包含选自图8所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NO：13、14或15)及其保守序列修饰(conservative sequence modification)；和
(b)人轻链区CDR1、CDR2和CDR3包含选自图9所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NO：16、17或18)及其保守序列修饰。
本发明也包括得自特定的种系序列的抗体，例如用人免疫球蛋白序列从系统中获得的抗体，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者通过筛选人免疫球蛋白基因文库获得的抗体。
用于本发明的人抗体可在宿主细胞中重组产生，例如含有抗体重链和轻链编码核酸的转染瘤(例如由无限增殖化CHO细胞或淋巴细胞组成的转染瘤)，或者直接得自表达抗体的杂交瘤(例如其中包含得自转基因非人类动物如转基因小鼠的B细胞，其基因组包含编码抗体的人重链转基因和人轻链转基因，并且与无限增殖化细胞融合)。在一个具体的实施方案中，抗体由杂交瘤产生，或者由含有人重链和人轻链核酸的宿主细胞(例如CHO细胞)转染瘤产生，所述人重链和人轻链核酸分别包含核苷酸序列SEQ ID NO：3和7及其保守修饰。
用于本发明的合适抗原包括任何抗原或其抗原部分，其为保护性或治疗性免疫应答所必需的，包括例如各种肿瘤抗原和感染性疾病抗原。具体的抗原可选自人绒毛膜促性腺激素β亚基(βhCG)、Gp100、前列腺相关抗原(PSA)、Pmel-17、来源于结肠、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖细胞的肿瘤细胞抗原、病毒蛋白、细菌蛋白、糖类和真菌蛋白。根据本发明，这类抗原能与抗体连接，形成强效抗体疫苗缀合物。
另一方面，本发明提供具体的抗体疫苗缀合物，其包含与抗体连接的βhCG，其中抗体能结合人甘露糖受体。在一个实施方案中，缀合物包含与βhCG连接的人重链，例如本文所述的其重链包含SEQID NO：10所示的氨基酸序列的B11-βhCG缀合物。也提供单链形式的B11-βhCG缀合物，其包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
本发明还提供含有一种或多种本发明抗体疫苗缀合物的组合物(例如药物组合物)。
所述组合物还可包含一种或多种佐剂或已知能增强免疫应答和/或增加APC活性的其它试剂。
根据下面的发明详述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
附图简述
图1显示分子缀合物(SEQ ID NO：11和12)的图谱(pB11sfv-βhCG)，编码含有与βhCG抗原连接的单链B11抗体的融合蛋白。
图2显示分子缀合物(SEQ ID NO：9和10)的图谱(βhCG-B11构建体)，编码含有与βhCG抗原连接的完整B11抗体的融合蛋白。
图3是分子缀合物的示意图。抗原与完整抗体的重链用基因工程技术融合在一起。
图4是流式细胞术研究图，显示βhCG-B11构建体与培养的表达MR的人DC特异性结合。
图5是曲线图，显示βhCG-B11构建体诱导βhCG特异性细胞毒性T细胞。
图6是柱状图，显示βhCG-B11构建体诱导βhCG特异性细胞毒性T细胞。
图7是柱状图，显示βhCG-B11构建体诱导T辅助细胞应答。
图8显示带有指定CDR区(SEQ ID NO：13、14和15)的人单克隆抗体B11的重链V区核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图9显示带有指定CDR区(SEQ ID NO：16、17和18)的人单克隆抗体B11的轻(κ)链V区核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图10是根据运用基于网络的预测算法(BIMAS&SYFPEITHI)分析，显示βhCG-B11构建体的预测T细胞表位的示意图。发现T细胞表位能潜在结合HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子。根据βhCG-B11的B11区段，也预测了一些表位。在长37个氨基酸的C端肽中没有鉴定出T细胞表位。
图11是曲线图，显示对βhCG-B11构建体具有特异性的CTL识别由DC呈递的scFv形式的抗原B11sfv-βhCG。
图12显示人单克隆抗体B11重链V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与种系序列(SEQ ID NO：30)即VH5-51种系序列的比较。
图13显示人单克隆抗体B11重链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)与种系序列(SEQ ID NO：29)即VH5-51种系序列的比较。
图14显示带有指定CDR区的人单克隆抗体B11轻(κ)链V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与种系序列(SEQ ID NO：32)即Vκ5-L15种系序列的比较。
图15显示带有指定CDR区的人单克隆抗体B11轻(κ)链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)与种系序列(SEQ ID NO：31)即Vκ5-L15种系序列的比较。
图16显示在表达人甘露糖受体的转基因小鼠(huMR-tg小鼠)中，间质树突细胞和淋巴结以及周围组织的巨噬细胞对B11-βhCG抗原的靶向摄取。
图17是曲线图，显示与对照小鼠相比以及与非靶向βhCG相比，huMR-tg小鼠针对B11-βhCG的抗原特异性体液应答增强。
图18是柱状图，显示与对照小鼠相比以及与非靶向βhCG相比，huMR-tg小鼠针对B11-βhCG的抗原特异性细胞应答增强。
发明详述
本发明基于这样的发现：用针对特定细胞受体的抗体将抗原靶向抗原呈递细胞(APC)，可产生重要的T细胞介导的免疫应答。具体地说，为了有效治疗癌症和感染性疾病等多种疾病，疫苗必须诱发有效的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，在I类MHC情况下主要由识别抗原的CD8+T细胞介导。为了优化免疫，优选伴有其它重要的效应T细胞功能，包括诱导抗原特异性辅助T细胞，例如在II类MHC途径的情况下识别抗原的CD4+T细胞。因此，有效的疫苗应当诱导抗原特异性CTL，优选与其它T细胞介导免疫应答一起通过多种MHC途径诱导抗原特异性CTL。
因此，本发明提供新的基于抗体的疫苗缀合物和用于诱导或增强抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答的新方法。本发明疗法使用分子缀合物，该分子缀合物包含与抗原连接的抗体，其中抗体能结合抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞(DC)和巨噬细胞。分子缀合物可以单独给予或者与其它免疫刺激剂和/或佐剂一起给予，以进一步增强针对抗原的免疫应答。在一个实施方案中，免疫刺激剂与分子缀合物共同给予。在另一个实施方案中，免疫刺激剂在给予分子缀合物之前或之后给予。在又一个实施方案中，免疫刺激剂与分子缀合物连接(例如共价连接、非共价连接或重组连接)。例如，可以通过缀合物的抗体部分的重链和/或轻链，将免疫刺激剂用基因工程技术或者用化学方法与分子缀合物融合或连接在一起。
靶向APC的抗体是本领域已知的，包括例如靶向APC上I类或II类主要组织相容性(MHC)决定簇的抗体(78，79，81，83)。其它抗体包括靶向APC上Fc受体的抗体(77，79，80，81，82，83)，以及B细胞上的表面免疫球蛋白(84)。
在一个本文示例性的具体实施方案中，分子缀合物包括与βhCG抗原连接的抗体，其中抗体能结合人DC上的甘露糖受体(MR)。这类缀合物可与APC在体内或离体接触，以产生所需的CTL应答。
为使本发明更易于理解，首先定义一些术语。其它定义在发明详述中给出。
本文所用的术语“抗原呈递细胞(APC)”是指一类免疫细胞，该类细胞能够以能被免疫系统识别的方式内化并加工抗原，致使抗原决定簇作为MHC相关复合体呈递在细胞表面(例如I类MHC限制性细胞毒性T淋巴细胞和/或II类MHC限制性辅助T淋巴细胞)。让细胞起到APC作用的两个必要性质为加工吞入细胞的抗原的能力和表达MHC基因产物的能力。APC的实例包括树突细胞(DC)、单核吞噬细胞(例如巨噬细胞)、B淋巴细胞、皮肤朗格汉斯细胞(Langerhanscell)和人体的内皮细胞。
本文所用的术语“树突细胞(DC)”，包括未成熟DC和成熟DC以及能够分化成DC的相关骨髓样祖细胞或相关抗原呈递细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)。DC表达高水平的细胞表面分子和与T淋巴细胞相互作用的补体受体(例如C型凝集素受体，诸如甘露糖受体)，因此能够诱导有效的免疫应答。DC也分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶，它们能够启动免疫应答并使细胞免疫和体液免疫的扩增达到顶点。DC也在其表面表达能结合抗原片段的主要组织相容性复合体(MHC)分子。识别这些抗原-MHC复合体的T细胞被激活并启动免疫级联。在一个优选实施方案中，本发明分子缀合物的抗体部分与树突细胞结合，导致所述缀合物被树突细胞内化。
术语“巨噬细胞甘露糖受体”或“MR”是指C型凝集素受体家族成员，其特征在于胞外部分重复的糖识别域(CDR)和含有两种推定的网格蛋白靶向序列的短胞质尾区(34，35，37)。此外，MR含有N端丰富的半胱氨酸和纤连蛋白域。甘露糖受体的不同域具有特异性结合各种配体的能力，包括溶酶体酶、微生物、垂体激素、糖胺聚糖和硫酸化血型抗原(38-40)。
“MHC分子”包括I类MHC和II类MHC两类分子。I类MHC分子将抗原呈递给特异性CD8+T细胞，而II类MHC分子将抗原呈递给特异性CD4+T细胞。外源性递送到APC的抗原主要与II类MHC分子一起加工。相比之下，内源性递送到APC的抗原主要与I类MHC分子一起加工。然而，在特定条件下，DC具有独特能力，除II类MHC分子以外，也使外源抗原进入内部区室以结合I类MHC分子。这一过程称为“交叉敏化”或“交叉呈递”。
本文所用的术语“免疫刺激剂”是指能够刺激APC(例如DC和巨噬细胞)的化合物。例如用于本发明的合适免疫刺激剂能够刺激APC，加速APC的成熟过程，增加APC的增殖，和/或上调共刺激分子(例如CD80、CD86、ICAM-I、MHC分子和CCR7)以及促炎细胞因子(例如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ)的募集或释放。合适的免疫刺激剂也能增加T细胞增殖。这类免疫刺激剂包括但不限于CD40配体；细胞因子，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体；toll受体激动剂(例如鞭毛蛋白和MALP-2(巨噬细胞活化脂肽-2)；LPS(内毒素)；R837(3MPharmaceuticals，St.Paul，MN)；R848(3M Pharmaceuticals，St.Paul，MN)；聚肌胞苷酸(polyI：C，肌苷：胞苷多核苷酸)；ssRNA；dsRNA；卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。
本文所用的术语“连接”是指两个或多个分子的结合。连接可以是共价连接，或者是非共价连接。连接也可以通过基因工程连接(即重组融合)。可以采用化学缀合和重组蛋白制备等本领域公知的诸多技术，来完成这样的连接。
本文所用的术语抗原“交叉呈递”是指经由APC上的I类和II类MHC分子将外源蛋白抗原呈递给T细胞。
本文所用的术语“T细胞介导的应答”是指所有由T细胞、包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)介导的应答。T细胞介导的应答包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
本文所用的术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
本文所用的术语“抗体”包括完整抗体或其抗原结合片段，包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv片段。合适的抗体包括任何形式的抗体，例如鼠抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体和任何类型的抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同种型。本文所用“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别。
完整抗体含有通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个CL区组成。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为“互补决定区(CDR)”，该区散布在更保守的构架区(FR)内。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
优选的本发明抗体包括人抗体，例如具有IgG1(例如IgG1k)重链和κ轻链的人抗体。其它优选的本发明抗体结合人DC，例如结合人DC上C型凝集素受体(如人DC上的MR)的抗体。在一个具体的实施方案中，抗体为人单克隆抗体，该抗体能结合人巨噬细胞甘露糖受体(经SDS-PAGE测定，其分子量约为180kD，在本文中亦称“人B11抗原”)。这类抗体的制备方案在WO 01/085798有记载，所述专利文献的公开内容通过引用结合到本文中。具体的人抗体包括分别由SEQ ID NO：2和6所示的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体，或者与SEQ ID NO：2或6同源性足够高的氨基酸序列，致使抗体保持与树突细胞结合的能力。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称“抗体部分”)，是指一种或多种保持与抗原(例如树突细胞上的抗原)特异性结合能力的抗体片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL区和VH区组成的Fv片段，(v)由VH区组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature  341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的VL和VH两个区由独立的基因编码，但是它们可以用重组方法连接在一起，通过合成接头使它们以单一蛋白链形式产生，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science  242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85：5879-5883)。这类单链抗体也意指包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同方式筛选出所述片段的用途。
本文所用的术语“人抗体”，是用来包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不为人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如随机或体外定点诱变或由体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”，并不包括来源于另一种哺乳动物(例如小鼠)的CDR序列已经移植到人构架序列中的抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一结合特异性和结合亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其可变区和恒定区来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合并得自转基因非人类动物例如转基因小鼠的B细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因。
本文所用的术语“重组人抗体”，包括所有用重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，例如(a)从带有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞中分离出的抗体，例如，从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过任何涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的其它方法制备、表达、创建或分离的抗体。这类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可对这类重组人抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，当得自和涉及人种系VH和VL序列时，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列可以不是天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
本文所用的“特异性结合”是指抗体与预定抗原相结合。通常，抗体与预定抗原结合的解离常数(KD)为10-7M以下，并且抗体与预定抗原结合的KD比其与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)而不是预定抗原或密切相关抗原结合的KD值至少低两倍。“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”与“特异性结合抗原的抗体”在本文中可以互换使用。
本文所用的术语“高亲和性”，对于IgG抗体而言，是指抗体的KD为10-8M以下，更优选为10-9M以下，甚至更优选为10-10M以下。然而，“高亲和性”结合可因其它抗体同种型而变化。例如，“高亲和性”结合，对于IgM同种型而言，是指抗体的KD为10-7M以下，更优选为10-8M以下。
本文所用的术语“K缔合”或“Ka”，是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“K解离”或“Kd”，是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文所用的术语“KD”，是指解离常数，其得自Kd与Ka之比(即Kd/Ka)并用摩尔浓度(M)表示。
本文所用的术语“βhCG”是指人绒毛膜促性腺激素的β亚基，并且包括任何得自βhCG序列(SEQ ID NO：20)的完整抗原、其抗原性片段、其等位变异体和任何多态变异体。βhCG是妊娠成功建立所必需的激素。除妊娠之外，这种抗原的表达主要局限于生殖细胞肿瘤以及多种腺癌。
本文所用的术语“核酸分子”，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。
本文所用的术语“分离的核酸分子”，是指编码本发明分子缀合物或其部分的核酸，例如SEQ ID NO：9和11或其部分，诸如抗原或抗体部分(即VH、VL或CDR)。分离的核酸分子是指编码分子缀合物的核苷酸序列中不含其它污染核苷酸序列(例如不编码分子缀合物任何部分的核苷酸序列)的核酸分子。
如本文所公开和所要求，SEQ ID NO：1-28所示的序列可包括“保守序列修饰”，即核苷酸和氨基酸序列修饰，所述修饰并不显著影响或改变由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的分子缀合物的功能特征，例如构建体抗体部分的结合性质或抗原部分的免疫原性。这类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸的取代、添加和缺失。可通过定点诱变和PCR介导的诱变等本领域已知标准技术，将修饰引入SEQID NO：1-28中。保守氨基酸取代包括氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域定义。这些家族包括带碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、带酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、带β-分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，人抗DC抗体中预测的非必需氨基酸残基优选用相同侧链家族的其它氨基酸残基替代。
或者，在另一个实施方案中，在所有或部分分子缀合物编码序列中随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且所得修饰的分子缀合物可用来筛选合适的功能活性。
因此，由本文公开的核苷酸序列编码的分子缀合物和/或含有本文公开的氨基酸序列的分子缀合物(即SEQ ID NO：1-28)，包括由经过保守修饰的类似序列编码的基本类似缀合物或含有所述类似序列的基本类似缀合物。具体地说，下面提供可产生何等基本类似抗体用于基于部分(即重链可变区和轻链可变区)序列(即SEQ ID NO：3、4、7和8)的分子缀合物的讨论。
就核酸而言，术语“基本同源”表示两个核酸或其指定序列，当优化比对和比较时是相同的，在至少约80％的核苷酸中，通常至少约90％-95％，更优选至少约98％-99.5％的核苷酸中带有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下与互补链杂交时，则是基本同源的。
两个序列之间的百分同一性为由所述序列共享的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)，其中考虑到两个序列最佳比对需要引入空位的空位数，以及每个空位的长度。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可运用数学算法完成，如以下非限制实例所述。
两个核苷酸序列之间的百分同一性可用GCG软件包中GAP程序(在http://www.gcg.com上提供)确定，该软件包使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位加权为40、50、60、70或80，长度加权为1、2、3、4、5或6。两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的百分同一性也可用E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))确定，该算法已经结合到ALIGN程序(2.0版)中，采用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分同一性可用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法确定，该算法已结合到GCG软件包中GAP程序(在http://www.gcg.com上提供)，该软件包使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位加权为16、14、12、10、8、6或4，长度加权为1、2、3、4、5或6。
例如，本发明核酸序列和蛋白质序列还可用作“查询序列”搜索公共数据库，以鉴定相关序列。这类搜索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序进行，分值＝100、字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序进行，分值＝50、字长＝3，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得以比较为目的的带空位的比对，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述，利用Gapped BALST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用相应程序的缺省参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物或部分纯化的或基本纯化的形式中。当用标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域众所周知的方法，从其它细胞组分或其它污染物如其它细胞核酸或蛋白中纯化出核酸时，则该核酸为“分离的”或变成“基本纯的”。参见F.Ausubel等(编辑)， Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
当将核酸置于与另一核酸序列功能性关系中时，则该核酸与另一核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列有效连接。就转录调节序列而言，有效连接是指所连接的DNA序列是相邻的，并且必要时是指连接两个蛋白编码区相邻并符合读框。就开关序列而言，有效连接是指序列能够有效开关重组。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其为环状双链DNA环，其中可以接入额外DNA区段。另一类载体为病毒载体，其中额外DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可整合到宿主细胞基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简称“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括这类其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们发挥等效功能。
本文所用的术语“重组宿主细胞”(或者简称“宿主细胞”)，是指已经导入了重组表达载体的细胞。应当理解，这类术语不仅指具体研究的细胞，也指这类细胞的子代。因为某些修饰可因突变或环境影响而发生于后代中，实际上，这类子代可能与亲代细胞不同，但仍包括与本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如CHO细胞和淋巴细胞。
本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本发明的各方面在以下各小节作更详细的描述。
I.抗原
用于本发明的合适抗原包括例如保护性或治疗性免疫应答所必需的感染性疾病抗原和肿瘤抗原，例如肿瘤细胞或病原生物体表达的抗原或感染性疾病抗原。例如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶、MUC-1抗原和生殖细胞来源的肿瘤抗原。肿瘤相关抗原也包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，本发明的抗原-抗体构建体中可包括不止一种抗原。例如，MAGE抗原可与其它抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶和gp100)以及佐剂(例如GM-CSF或IL-12)组合，并连接到抗APC抗体上。
其它合适的抗原包括用于预防或治疗病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1gag、HIV-1env、HIV-1nef、HBV核心、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。细菌抗原的实例包括但不限于鼠弓形体(Toxoplasma gondii)或苍白密螺旋体(Treponema pallidum)。本发明的抗体-细菌抗原缀合物可用于治疗或预防各种细菌性疾病，例如炭疽、肉毒中毒、破伤风、衣原体病、霍乱、白喉、莱姆病、梅毒和结核病。
在一个本文示例性的具体实施方案中，本发明使用包含βhCG的抗原。该抗原包括完整βhCG序列(SEQ ID NO：20)或该序列的任何免疫原性(例如含T细胞表位)部分。如下所述，这类免疫原性部分可用本领域已知的T细胞表位作图技术鉴定，包括算法和已知的T细胞表位作图技术。来自βhCG的免疫原性肽的具体实例包括包含SEQ IDNO：21、22、23、24、25、26、27或28及其保守修饰的肽。来自βhCG的额外的免疫原性肽以及这类肽的鉴定方法，描述于美国专利号US6,096,318和6,146,633中，其内容通过引用结合到本文中。
蛋白质的抗原性肽(即含有T细胞表位的肽)可以用各种本领域众所周知的方法鉴定。例如，可用基于网络的预测算法(BIMAS &SYFPEITHI)，通过分析蛋白质序列，预测T细胞表位，来产生潜在I类和II类MHC结合肽，该肽与10,000个此前由CTL界定的明确表征的MHC结合肽的内部数据库匹配。高打分肽可根据与给出的MHC分子的高亲和性进行排列并选择为“有意义”。如图10所示，用βhCG-B11缀合物的序列(SEQ ID NO：10)，两种算法都用于鉴定来自βhCG部分(芥子)的抗原性肽，合成型可由其形成，并可检测它们在体外引发T细胞应答的能力。因此，发现了与HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子潜在结合的T细胞表位。一些表位也根据βhCG-B11缀合物的抗体(B11)片段预测(结果未显示)。此外，在长37个氨基酸的C端肽(CTP)中没有鉴定出T细胞表位。
含有T细胞表位的抗原性肽的另一种鉴定方法为：将蛋白质分成所需长度的非重叠肽，或者所需长度的重叠肽，它们可通过重组、合成或在某些限制性位点用化学裂解蛋白质而产生，然后测试免疫原性质，例如引发T细胞应答(即增殖或淋巴因子分泌)。
例如，为用精细作图技术精确确定蛋白质的T细胞表位，具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽(用T细胞生物学技术来测定)，可通过在所述肽的氨基端或羧基端添加或缺失氨基酸残基而修饰，然后进行测试以确定T细胞对所修饰肽的反应性的变化。如果发现在天然蛋白质序列中重叠区共享的两种或更多种肽具有人T细胞刺激活性(用T细胞生物学技术来测定)，可以产生包含全部或部分这类肽的额外肽，并且可以通过类似的方法对这些额外肽进行测试。按照这一技术，对肽进行选择并用重组或合成方法来生产。根据包括对所述肽的T细胞应答强度(例如刺激指数)在内的多种因素对肽进行选择。随后对这些所选肽的理化性质(例如溶解性、稳定性)进行检测以确定该肽是否适用于治疗用组合物中，或者是否需要进行修饰。
II.抗体疫苗缀合物
本发明提供各种治疗性疫苗缀合物，其包含肿瘤抗原或病毒抗原等抗原，其中所述抗原与抗体连接，所述抗体能结合APC，例如所述抗体通过甘露糖受体(MR)结合到APC上。这使得抗原被靶向APC(例如树突细胞)，以增强加工、呈递并最终增强针对所述抗原的免疫应答，例如CTL应答。
另外，疫苗缀合物可包含一种或多种免疫刺激剂，它们也可增强针对抗原的免疫应答。本发明的抗体-抗原疫苗缀合物可通过基因工程方法或化学方法制备。在这两种情况下，缀合物的抗体部分都可由完整抗体或部分抗体(例如Fab片段或单链Fv)组成。此外，该缀合物中可包含不止一种抗原和/或免疫刺激剂。
在一个实施方案中，疫苗缀合物包含能结合人APC的人抗体重链以及能结合人APC的人抗体轻链，其中该人抗体的任一条或两条链都能与抗原和免疫刺激剂连接。在另一个实施方案中，抗原和免疫刺激剂分别连接在这两条链的其中一条链上。在一个具体的实施方案中，抗原为βhCG。
遗传构建的抗树突抗体-抗原缀合物(例如作为单一重组融合蛋白表达的缀合物)可通过将所选抗原和/或免疫刺激剂(在蛋白质和肽免疫刺激剂的情况下)结合抗体的不同位置而制备。本发明具体的基因工程方法产生的缀合物(融合构建体)包括例如βhCG-B11构建体，如图2所示。βhCG-B11构建体包含人抗树突细胞抗体B11，其与肿瘤相关抗原βhCG融合。编码该构建体的核苷酸序列示于SEQ ID NO：9。
例如，在一个实施方案中，βhCG-B11抗原和/或免疫刺激剂可以与人抗体重链CH3区的末端融合。抗原和/或免疫刺激剂也可融合在Fab-融合构建体中抗体重链铰链区，或者在单链融合构建体(ScFv构建体)中带有可变轻链和重链(VH和VL)的序列中。或者，抗原和/或免疫刺激剂可以与抗体轻链而不是抗体重链融合。可以使用免疫刺激剂、抗原和抗体之间的其它融合点，只要遗传融合构建体可引发CTL应答。完整βhCG-B11构建体和单链B11构建体的详细图谱(pB11sfv-βhCG)分别见表1和表2。这类遗传融合缀合物可以包含以任何顺序连接抗体的抗原和免疫刺激剂(例如抗体-抗原-免疫刺激剂缀合物或抗体-免疫刺激剂-抗原缀合物)。
                表1：βhCG-B11特征图谱
CDS(共3个)
BUsfr-bHCG
开始：921结束：2153neo
开始3375结束：4169新霉素抗性基因
Amp
开始：5671结束：6531(互补)氨苄青霉素抗性基因
其他特征(共5个)
启动子
开始：863结束：882启动子
信号序列
开始：921结束：977 B11 VL
开始：978结束：1296 B11 VH
开始：1344结束：1691 βHCG
开始：1712结束：2164
聚腺苷酸化信号(共2个)
聚腺苷酸
开始：2267结束：2491聚腺苷酸
聚腺苷酸
开始：4343结束：4473 SV40聚腺苷酸化信号
真核启动子(共1个)
启动子
开始：232结束：819真核启动子
原核启动子(共1个)
启动子
开始6566结束：6572(互补)启动子
复制起点(共3个)
SV40启动子和起点
开始1结束：1复制起点
F1起点
开始：2537结束：2965复制起点
pUC起点
开始4856结束：5526(互补)起点
             表2：pB11sfv-βhCG特征图谱
CDS(共4个)
轻链
开始735结束：1433 B11轻链
Cκ
开始：1113结束：1433 AMP
开始：7810结束：8670(互补)amp
起始位点说明：互补的1..6871)
DHFR
开始：8921结束：9484 dhfr
起始位点说明：7122-7685
其他特征(共9个)
B11VL
开始：792结束：1112 SV40启动子/Ori
开始2298结束：2622
SV40启动子和复制起点
Neo
开始：2658结束：3452新霉素抗性基因
βHCG
开始：4015结束：4467(互补)bHCG
CHS
开始：4470结束：4790(互补)重链恒定区3
CH2
开始：4791结束：5120(互补)重链恒定区2
CH1
开始5166结束：5459(互补)重链恒定区1
B11VH
开始：5460结束：5807(互补)启动子
开始：5905结束：6559(互补)
聚腺苷酸化信号(共3个)
聚腺苷酸
开始：1526结束：1757聚腺苷酸
开始：3744结束：3975(互补)聚腺苷酸化信号2
开始10282结束：10411SV40聚腺苷酸
起始位点说明：8483..8612
真核启动子(共1个)
启动子
开始9结束：655
化学方法构建的抗体-抗原缀合物可用各种众所周知和易于获得的交联剂制备。这些交联剂可为同官能化合物或杂官能化合物，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sulfo-SMCC)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，它们与抗树突抗体和所选抗原上不同反应性氨基酸或糖侧链形成共价键。其它偶联剂和交联剂也可用于产生共价键，例如A蛋白、碳二亚胺和N，N′-二马来酰(邻苯二)亚胺(oPDM)；(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括以下文献中介绍的方法：Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)229：81-83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，这两种都得自Pierce ChemicalCo.(Rockford，IL)。也可采用与上述方法相同的连接方法，将免疫刺激剂与本发明的分子缀合物进行化学连接。
免疫刺激剂和分子缀合物也可通过非共价方法连接，例如使用结合分子，例如链霉抗生物素和生物素。用于本发明的其它合适的结合分子是本领域众所周知的。在本发明的一方面，将编码链霉抗生物素分子的核苷酸序列掺入到编码分子缀合物的序列中，再将其与生物素化免疫刺激剂连接。
可选择任何可被克隆和表达或纯化的抗原用于本发明。获得这类抗原的技术是本领域众所周知的。例如，肿瘤相关抗原可直接从癌细胞纯化，并用理化技术例如串联质谱进行鉴定。或者，可用肿瘤特异性T细胞克隆测试抗原阴性细胞，该细胞已经通过用质粒DNA克隆转染获得抗原，以分离表达抗原的克隆。然后可构建合成肽以精确鉴定抗原位点或表位。
如上所述，本发明的分子疫苗缀合物可以与一种或多种免疫刺激剂一起给予，或者包括一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂可以单独给予，或者按照上述结合技术，与缀合物结合，结合可以是共价结合、非共价结合、用基因工程方法结合或它们的组合。或者，免疫刺激剂可以单独共同给予(co-administered separately)，例如该免疫刺激剂可以与分子缀合物同时给予，或在给予分子缀合物之前给予，或在给予分子缀合物之后给予。各种合适的免疫刺激剂是本领域众所周知的，包括例如CD40配体；细胞因子，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体；toll受体激动剂(例如鞭毛蛋白和MALP-2(巨噬细胞活化脂肽-2)；LPS(内毒素)；R837(3M Pharmaceuticals，St.Paul，MN)；R848(3MPharmaceuticals，St.Paul，MN)；聚肌胞苷酸(polyI：C，肌苷：胞苷多核苷酸)；ssRNA；dsRNA；卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。
在本发明的另一方面，疫苗构建体的部分抗体序列可用于表达完整抗体。包括在本发明疫苗缀合物中的抗体如抗APC抗体(如B11)，主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基，与靶抗原(例如C型凝集素受体，例如MR)相互作用。为此，CDR中的氨基酸序列在各抗体之间比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体而表达模拟特定天然存在抗体性质的重组抗体，所述表达载体包含从不同性质的不同抗体上移植到构架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列(参见例如Riechmann，L等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为它们不包含完全装配的可变基因，这类基因在B细胞成熟期间由V(D)J连接形成。种系基因序列也不同于个体中高亲和性第二抗体所有组成成分的序列，该序列均匀分布于可变区。例如，体细胞突变在构架区氨基端部分比较少见。例如，体细胞突变在构架区1氨基端部分和构架区4羧基端部分比较少见。此外，许多体细胞突变并不显著改变抗体的结合性质。为此，没有必要获得特定抗体的完整DNA序列，以重建具有与原始抗体结合性质类似的完整重组抗体(参见WO 99/45962，其通过引用结合到本文中，用于所有的目的)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列一般足以达到此目的。所述部分序列用于确定哪个种系可变基因和连接基因区段对重组抗体可变基因产生影响。然后，种系序列用来填补可变区的缺少的部分。重链和轻链前导序列在蛋白成熟期间被切割，并且不会影响最终抗体的性质。为此，有必要使用相应的种系前导序列，用于表达构建体。为了添加缺少的序列，克隆cDNA序列可通过连接或PCR扩增与合成寡核苷酸结合。或者，完整可变区可合成为一套短的重叠寡核苷酸并经PCR扩增结合，以产生完整合成可变区克隆。这一过程具有某些优点，例如消除或包含特定限制位点，或者优化特定密码子。
杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列用来设计一套重叠的合成寡核苷酸，以创建其氨基酸编码能力与天然序列相同的合成V序列。合成的重链和κ链序列在以下三个方面与天然序列不同：间插成串重复核苷酸碱基，以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则(Kozak(1991)J.Biol.Chem.266：19867-19870)加入优化翻译起始位点；HindIII位点经基因工程改造置于翻译起始位点的上游。
就重链可变区和轻链可变区两者而言，优化的编码链序列和相应的非编码链序列大约在相应的非编码寡核苷酸正中间被断裂成30-50个核苷酸。因此，对于每条链来说，寡核苷酸可装配成跨越150-400个核苷酸区段的重叠双链组。然后，该混合物(pool)用作模板，产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常，将一组可变区寡核苷酸再分成两组，这两组分别进行扩增，得到两种重叠PCR产物。这些重叠产物再通过PCR扩增结合形成完整的可变区。也可望在PCR扩增中包括重链恒定区或轻链恒定区重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点，或者γ重链的AgeI位点)，以产生容易克隆到表达载体构建体中的片段。
然后，重建的重链可变区和轻链可变区与克隆的启动子、翻译起点、恒定区、3’非翻译聚腺苷酸化和转录终止序列结合，形成表达载体构建体。重链和轻链表达载体构建体可结合单一载体，共同转染、依次转染或独立转染到宿主细胞中，然后融合，以产生表达这两条链的宿主细胞。
下面描述用于构建人IgGκ的表达载体的质粒。构建质粒，使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用来重建完整重链和轻链小基因。这些质粒可用来表达完整的人或嵌合IgG1κ和IgG4κ抗体。可构建类似的质粒，表达其它重链同种型，或者表达包含λ轻链的抗体。
因此，在本发明另一方面，本文所述的疫苗缀合物抗体部分如B11的结构特征，用来创建保留至少一种本发明B11抗体功能性质(例如结合APC)的结构相关抗体。更具体地说，B11的一个或多个CDR区可与已知的人构架区和CDR重组结合，以创建用于本发明疫苗缀合物的额外的重组工程的抗APC抗体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供制备包含抗DC抗体的疫苗缀合物的方法，所述方法包括制备包含以下部分的抗体：(1)人重链构架区和人重链CDR，其中至少一种人重链CDR包含选自图8所示的CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：13、14或15)的氨基酸序列；和(2)人轻链构架区和人轻链CDR，其中至少一种人轻链CDR包含选自图9所示的CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：16、17或18)的氨基酸序列；其中抗体保留与APC结合的能力。
抗体与APC结合的能力可用例如实施例所述的标准结合试验(如ELILSA)来测定。因为本领域众所周知，抗体重链和轻链CDR3区在抗体对抗原的结合特异性/亲和性上起特别重要的作用，所以如上制备的本发明重组抗体优选包含B11的重链和轻链CDR3。抗体还包含B11的CDR2。抗体还可包含B11的CDR1。因此，本发明还提供包含以下部分的抗APC抗体：(1)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区和人重链CDR3区，其中人重链CDR3区为图8所示的B11的CDR3(SEQ ID NO：15)；和(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区，人轻链CDR2区和人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区为图9所示的B11的CDR3(SEQ ID NO：18)，其中抗体结合DC。抗体还包含B11的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体还可包含B11的重链CDR1和/或轻链CDR1。
优选上述工程抗体的CDR1、CDR2和/或CDR3包含本文公开的B11的准确氨基酸序列。然而，普通技术人员将会认识到，在仍保留抗体有效结合DC的能力的同时，B11的准确CDR序列的某些改变(例如保守取代)是可行的。因此，在另一个实施方案中，工程抗体可由一个或多个CDR组成，这些CDR与B11的一个或多个CDR至少具有例如90％、95％、98％或99.5％同一性。
除了或撇开简单结合APC外，如上所述的工程抗体可以根据其保留本发明抗体的其它功能性质进行选择，例如：
(1)以高亲和力与APC结合；
(2)与APC上的独特表位结合(当结合使用时，可消除具有补体活性的单克隆抗体竞争结合同一表位的可能性)；
(3)诱导针对抗原而产生的T细胞介导的免疫应答；和/或
(4)诱导T细胞应答，包括CD4+和CD8+T细胞介导应答。
在另一个实施方案中，转化表达目标抗原如βhCG的完整细胞，以表达抗APC抗体(例如抗MR抗体)，致使抗原和抗体由细胞共表达。例如，通过用编码含有跨膜域和抗APC抗体的融合蛋白的核酸转染靶细胞的方式，可以做到这一点。表达疫苗缀合物的细胞可接着用于靶向APC(例如DC)，以诱导CTL应答。
这类核酸、融合蛋白和表达这类融合蛋白的细胞的制备方法描述于美国专利申请顺序号09/203,958，该专利文献通过引用全部结合到本文中。
或者，可以通过使用化学接头、脂质标记或者其它相关方法，使抗体连接到细胞或病原体上(deKruif，J.等(2000)Nat.Med.6：223-227；Nizard，P.等(1998)FEBS Lett.433：83-88)。表达目标抗原并具有表面锚定抗体的细胞可用于诱导特异性免疫应答，例如CTL应答，以对抗细胞，例如肿瘤细胞或微生物病原体。
III.药物组合物
另一方面，本发明提供治疗用组合物如药物组合物，其含有一种或组合的本发明疫苗缀合物以及免疫刺激剂。在一个实施方案中，免疫刺激剂与疫苗缀合物连接。本发明的组合物还可包含一种或多种佐剂和/或药学上可接受的载体。给予本发明的疫苗缀合物，以导入受试者血流中，用于与受试者的T细胞相互作用。可以通过在体内或离体直接使用缀合物或通过使用先前已经用疫苗缀合物靶向的细胞，完成这类T细胞的靶向。
本发明组合物还可包含其它治疗药，例如其它抗体、细胞毒素或药物(例如免疫抑制剂)，并可单独给予或者与其它疗法例如放疗联合给予。例如，由APC快速内化的疫苗缀合物可与增强树突细胞抗原呈递细胞活性(例如释放免疫刺激性细胞因子)的单克隆抗体组合。
本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等生理相容物质。优选的载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮给药(例如注射或输注)。根据给药途径，疫苗缀合物可包在材料中以保护化合物免受酸和其它可使化合物失活的自然条件的作用。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物所需生物活性并且不产生任何不良毒性效应的盐(参见例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括得自无毒无机酸的盐，例如盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、亚磷酸盐等，以及得自无毒有机酸的盐，例如脂肪族一和二羧酸盐、苯基取代的烷酸盐、羟基烷酸盐、芳族酸盐、脂族和芳族磺酸盐等。碱加成盐包括得自碱土金属的盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等，以及得自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的组合物可通过本领域已知的各种方法给予。本领域技术人员将会认识到，给药途径和/或给药方式将取决于所需结果。活性化合物可与防止化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递药系统。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的许多制备方法取得了专利或为本领域技术人员公知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过某些给药途径给予本发明疫苗缀合物，可能有必要用材料包裹化合物或者与将化合物与材料一起给予以防止其失活。例如，化合物可在合适载体(例如脂质体或稀释剂)中给予受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂，以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时配制成无菌注射液或分散液的无菌粉末。这类介质和药物活性物质的用途是本领域已知的。除任何与活性化合物不相容的常规介质或药物的情况外，考虑了将其用于本发明药物组合物。组合物中也可以加入补充活性化合物。
治疗用组合物一般在生产和储藏条件下必须是无菌的，而且是稳定的。组合物可制备成溶液剂、微型乳剂、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可保持合适的流动性，例如，通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂等。在许多情况下，会在组合物中优选包含等渗剂，例如糖、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)而达到注射用组合物的延长吸收。
无菌注射液可通过将活性化合物按所需量加入到上述带有一种或组合成分的合适溶剂中制备，如果需要，再进行微滤除菌。一般而言，分散体通过将活性化合物加入到无菌溶媒中制备，该无菌溶媒中含有碱性分散介质和来自以上的所需其它成分。就用于制备无菌注射液的无菌粉针剂而论，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，可得到活性成分的粉末外加任何来自此前无菌过滤溶液的额外所需成分。
调整剂量方案以提供优化所需反应(例如治疗反应)。例如，可给予一次大剂量，可在某时间段内给予几个分次剂量或根据治疗情况的紧迫性的指示按比例减少或增加剂量。尤其有利的是，为了便于给药和剂量的一致性，将胃肠外组合物配制成剂量单位形式。本文所用的剂量单位形式是指适于用作待治疗受试者单一剂量的物理分离单位；每单位含有经计算与所需药用载体一起产生所需疗效的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格按照和直接根据(a)活性化合物的独特特征和所要达到的具体疗效，和(b)制备该活性化合物领域固有的限制，以治疗敏感个体。
药学上可接受的抗氧剂的实例包括：(1)水溶性抗氧剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
就治疗用组合物而言，本发明制剂包括适用于口服和/或胃肠外给药的制剂。制剂可以适当的单位剂型存在，并可由药学领域任何已知方法制备。可与载体物质混合以制备单一剂型的活性成分的量，将根据待治疗受试者和具体的给药方式而变动。可与载体物质混合以得到单一剂型的活性成分的量，一般会是组合物产生疗效的量。一般而言，以百分之百计，此量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。
本文所用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外给予”是指并非肠道和局部给药的给药方式，通常通过注射，包括并不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和输注。
可用于本发明药物组合物的合适的水和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油，以及注射用有机酯如油酸乙酯。可通过例如使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体情况下保持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。
这些组合物也可含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过如上所述的灭菌程序，并通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)，确保防止微生物的存在。组合物中包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)也是可取的。此外，也可通过包含延长吸收剂(如单硬脂酸铝和明胶)而达到延长注射用药物形式吸收的目的。
当本发明化合物作为药物给予人和动物时，可单独给予或作为含有例如与药学上可接受的载体混合的0.01-99.5％(更优选0.1-90％)的活性成分的药物组合物给予。
不管所选的给药途径如何，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可在合适的水合形式中使用的本发明化合物，和/或本发明药物组合物，配制成药学上可接受的剂型。
本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变动，以获得对具体患者能有效取得所需治疗反应的适量的活性成分、组合物和给药方式，而不引起对患者的毒性。所选剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括本发明所用具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用具体化合物的排泄率、疗程、与所述具体组合物联用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和先前就医史，以及医疗领域熟知的类似因素。
具有本领域普通技能的医师或兽医可轻易确定所需药物组合物的有效量并开出处方。例如，医师或兽医在药物组合物中可从低于达到所需疗效的所需量的本发明化合物开始，并逐渐增加剂量直到取得所需效果。一般而言，本发明组合物的合适日剂量，是所述化合物有效地产生疗效的最低剂量。这类有效剂量通常会取决于上述因素。优选给药途径为静脉内、肌内、腹膜内或皮下，优选在靶部位附近给药。如果需要，治疗用组合物的有效日剂量可在全天适当时间间隔内以2、3、4、5、6次或更多分次剂量分别给予，任选以单位剂型给予。虽然可以单独给予本发明化合物，但优选以药物制剂(组合物)给予化合物。
治疗用组合物可以用本领域已知的医疗装置给予。例如，在一个优选实施方案中，本发明治疗用组合物可用无针皮下注射装置给予，例如公布于以下美国专利号的装置：5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556。用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，该专利公开了以可控速率分配药物的可植入微量输液泵；美国专利第4,486,194号，该专利公开了通过皮肤给药的治疗装置；美国专利第4,447,233号，该专利公开了以精确输注速率给药的医用输液泵；美国专利第4,447,224号，该专利公开了连续给药用流速可变的可植入输液装置；美国专利第4,439,196号，该专利公开了具有多室隔间的渗透给药系统；和美国专利第4,475,196号，该专利公开了渗透给药系统。这些专利通过引用结合到本文中。许多其它这类植入物、给药系统和模块都是本领域技术人员已知的。
组合物必须是无菌的，流动性要满足组合物用注射器递送的要求。除了水以外，载体可为等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。可通过例如使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体情况下保持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，以保持适当的流动性。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)和氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收剂(如单硬脂酸铝和明胶等)以达到注射用组合物的长期吸收。
当活性化合物如上所述得到适当保护时，化合物可与例如惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服给予。
IV.本发明的用途和方法
本发明的疫苗缀合物可用于治疗和/或预防(例如免疫)各种疾病和病症。
主要的适应症之一为癌症。这包括但不限于结肠癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、肥大细胞瘤、乳腺癌、白血病或类风湿性成纤维细胞瘤。另一主要的适应症为感染性疾病，包括但不限于HIV、肝炎(例如甲型、乙型、丙型)、流行性感冒、疱疹、贾第虫病、疟疾、利什曼原虫病、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)病、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病。另一种主要的适应症为自身免疫病。
在一个具体的实施方案中，疫苗缀合物用于治疗或预防由βhCG或表达βhCG的细胞介导的疾病和病症，βhCG为半胱氨酸环生长因子超家族的成员。有证据表明，βhCG作为生长因子、血管生成和/或转移促进因子，或者作为免疫功能抑制剂，在癌症的建立或发展中起作用(73)。因此，本发明可用于治疗癌症和其它涉及血管生成的疾病的进程。本发明也可通过抑制βhCG和/或表达βhCG的细胞在妊娠中的作用而用于预防或终止意外妊娠。
就治疗用途而言，可以将本发明的疫苗缀合物单独或者与免疫刺激剂一起直接给予受试者(即体内)。一方面，免疫刺激剂与缀合物连接。或者，可以将缀合物间接给予受试者，即首先通过使缀合物与APC例如树突细胞接触(例如通过培养或孵育)，然后将细胞给予受试者(即离体)。缀合物的接触与递送到APC，致使它们在给药前被加工并由APC呈递，亦称抗原或细胞“负载”。将抗原加载到APC的技术是本领域众所周知的，并且包括例如Gunzer和Grabbe，Crit RevImmunol 21(1-3)：133-45(2001)和Steinman，Exp Hematol 24(8)：859-62(1996)。
在所有情况下，疫苗缀合物和免疫刺激剂都以有效量给予，以发挥其所需疗效。术语“有效量”是指必需或足以实现所需生物效应的量。例如，有效量可为消除肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染的必需量。任何具体应用的有效量可根据待治疗疾病或病症、待给予的具体缀合物、受试者体型或疾病或病症的严重程度等各种因素而变化。本领域普通技术人员无需进行过多的实验，凭经验就可确定具体多特异性分子的有效量。
疫苗缀合物的优选给药途径包括例如注射(例如皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、鞘内)。注射可为快速浓注或连续输注。其它给药途径包括口服给药。
本发明的疫苗缀合物也可与辅料和其它治疗剂例如免疫刺激剂共同给予。缀合物通常与一种药学上可接受的载体或载体的组合配制在一起。这类载体的实例包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳剂等。用于药物活性物质的这类介质的用途是本领域众所周知的。任何其它适合与所述分子联用的常规载体在本发明范围之内。
与疫苗缀合物共同给予的合适的治疗剂包括其它抗体、细胞毒素和/或药物。在一个实施方案中，治疗剂为已知能帮助或诱导免疫应答的抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，治疗剂为化疗药。疫苗缀合物也可与放疗一同给予。
通过以下实施例进一步描述本发明，以下实施例不得解释为对本发明的进一步限制。本申请全篇所引用的所有数据和所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容，全都通过引用结合到本文中。
                       实施例
方法与材料
从全血或leukopak制备DC：通过将肝素化全血或带有Ficoll-Paque的单采血液成分制剂进行密度梯度离心，获得人外周血单核细胞(PBMC)。然后，通过粘附塑料培养皿或淘析分离单核细胞，并通过向培养基中添加细胞因子(10ng/ml GM-CSF和2ng/ml IL-4)，使单核细胞分化成未成熟DC。在第5天和第7天之间收获DC，用流式细胞术进行分析。以这种方式制备的DC为CD14-、HLA-DR+、CD11c+甘露糖受体+并且高水平表达I类和II类MHC、CD80和CD86。
肿瘤抗原βhCG的选择：βhCG是人绒毛膜促性腺激素(妊娠成功建立所必需的激素)的亚基。此糖蛋白亚基具有若干特点使其成为癌症免疫治疗中值得关注的抗原(有关综述参见Triozzi P.L.和Stevens V.(1999)Oncology Reports 6：7-17)。首先，除妊娠外，此抗原的表达主要局限于生殖细胞肿瘤，以及大量腺癌(表3)。其次，hCG为半胱氨酸环生长因子超家族的成员，并可作为生长因子、血管生成和/或转移促进剂，或者作为免疫功能抑制剂在癌症的建立或发展中起作用。因此，限制功能性hCG表达的免疫疗法可提供额外的治疗益处。
                  表3
通过免疫组织化学测定的对βhCG呈阳性的肿瘤百分率
(Triozzi P.L.和Stevens V.(1999))
  结肠(52％)   膀胱(21％)
  肺(34％)   卵巢(19％)
  胰腺(31％)   子宫颈(18％)
  食管(28％)   胃(18％)
  乳腺(24％)
增殖试验：在96孔平底微量板中，效应T细胞(5×104)与有或没有荷载抗原(MDX-1307或其它的)的自身DC(5×103)共同培养，终体积为0.2ml。该混合物于37℃共同培养。第4天，培养物用3H-胸苷(1μCi/孔)进行脉冲，18小时后，直接在滤器(Millipore)上收获细胞。滤器用水洗涤三次，再用乙醇洗涤一次，最后在通风橱中干燥5-10分钟。随后将闪烁液(Packard，20μl/孔)加入到滤器中。在Wallacβ计数器上计数以确定滤器结合的放射性。结果表示为用抗原刺激的对未用抗原或用对照抗原刺激的CTL的刺激指数(S.I.)值(cpm)。就MHC阻断分析而言，标记的靶与HLA-特异性mAb W6/32和L243(20μg/ml)一起在室温下预孵育30分钟，其中W6/32用于阻断所有I类HLA分子，L243用于阻断所有II类HLA分子。通过离心除去未结合的mAb。
流式细胞术：通过在GM-CSF和IL-4中培养5天，用单核细胞制备人DC。将DC与10μg/mlβhCG抗原/抗MR抗体疫苗缀合物或同种型对照一起在冰上孵育。疫苗缀合物直接用FITC-标记或用FITC-标记的抗βhCG第二单克隆抗体进行检测。用LSR流式细胞仪测定结合荧光的细胞。
细胞毒性试验：靶细胞(3×106)、对照和荷载抗原(βhCG-B11)用RPMI培养基洗涤两次，将沉淀重悬于200μl培养基中并用100μCi51Na2CrO4于37℃标记60分钟。标记的靶用RPMI培养基洗涤三次，沉淀重悬浮，使细胞浓度为3×104细胞/ml。抗原特异性CTL在96孔V-形底板中进行滴定，得出比值为100∶1(效应T细胞(E)∶靶(T))直到12.5∶1或更低。加入恒定数目的标记靶(100μl/孔或3,000靶细胞/孔)，将板以低速(180xg)离心并于37℃孵育。4小时后，收获100-120μl上清液，用γ-计数器(Wallac Instruments，Perkin-Elmer)测定释放的放射性。CTL活性用以下方程计算并表示为％特异性裂解(杀伤)：
Figure A20058003242700441
其中实验性释放(cpm)，是指含有CTL(E)和靶(T)的孔的放射性(释放的铬)；自发释放(cpm)，是指在0.1ml培养基中只有靶(即没有添加CTL)的孔的放射性；而最大释放是指在0.1ml去污剂溶液(IgepalCA 630；syn.NP-40；RPMI培养基中的5％溶液)中有靶孔的放射性。在孔-控制的实验条件下，自发释放值应为最大释放的10％以下。就MHC阻断分析而言，将标记的靶与HLA-特异性mAb W6/32和L243(20μg/ml)一起在室温下预孵育30分钟，其中W6/32用于阻断所有I类HLA分子，L243用于阻断所有II类HLA分子。通过离心除去未结合的mAb，将mAb-包被靶加到CTL上。用同种型匹配的mAb作为对照。
还有另一种方法来检查细胞介导的免疫应答，该方法对抗原-驱动的T细胞的增殖能力进行研究。当事先暴露的抗原存在于II类MHC和程度较低的I类分子时，抗原敏化的T细胞往往优先增殖。因此，分裂细胞摄取放射性示踪物的计数提供了刺激的度量。
体内抗原分布：给小鼠两个前爪的每侧经皮下(s.c.)注射5μgB11-βhCG/5μl PBS。通过同样途径给予同样数量的无关人IgG1(Sigma-Aldrich)作为无靶对照。24小时后，收获注射部位周围和远端的皮肤，并收获近端(腋窝)和远端(腹股沟)淋巴结、脾、肝和肺。将这些器官快速冷冻并切片，用抗hCG(抗原)抗体或人IgG进行免疫组织化学染色(以检测B11)。
免疫：对于体液应答而言，每只8-12周龄的小鼠用B11-βhCG/100μl PBS经i.p.免疫，间隔2周，共免疫3次。在用于比较的另一侧肢体，注射等量的无βhCG(United States Biological，Swampscott，MA)，注射制剂和时间进程均同上。每次研究都包括5-6只转基因(tg)小鼠和相同数量的年龄、性别相匹配的野生型(Wt)小鼠。第0天(作为基线)和每次注射后1周，在麻醉条件下从眼眶窦(orbital sinus)采集血样，分离血浆并贮存于-20℃，用于ELISA。
对于T细胞应答，通过i.p.给予8-12周龄小鼠1-2μg B11-βhCG/100μl佐剂(CPG和Poly：IC)一次。每次研究都分别包括2-3只tg小鼠和Wt小鼠。重复这些研究中的某些工作，以证实结果。注射后14天，从这些小鼠采血和脾脏。从这些血中分离出的血浆贮存于-20℃，用于抗体亚类的分析。
ELISA：通过标准ELISA，用固定化βhCG或B11进行捕获，用碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗小鼠IgG Fcγ抗体(JacksonImmunoResearch Lab，West Grove，PA)进行检测，测定抗βhCG和抗B11效价。从1∶100开始，连续稀释血浆样本，通过计算在OD405所得到的吸光度比未免疫小鼠血清对照高出两倍的各样本稀释度，测定其效价。通过ELISA方法，用SBA Clonotyping System/AP(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)对抗体亚类进行测定。
ELISOPT：用ELISPOT装置(BD Biosciences)，按照制造商的方案进行测定。研磨脾脏并裂解红细胞，制备单脾细胞悬液。在包被了抗IFNγ或IL-4抗体的96孔滤板中，在RPMI 1640完全培养基中进行培养，浓度为0.5×106细胞/孔或1×106细胞/孔。向培养物中加入15-mer βhCG重叠肽混合物(涵盖整个βhCG序列，由SynpepCorporation(Dublin，CA)合成)，终浓度为1.7μg/ml，在37℃孵育40小时。不含肽混合物的各孔(空白)作为非特异性背景对照。含有10ng/ml PMA外加1μg/ml伊屋诺霉素(Sigma-Aldrich)的各孔作为阳性对照，用于斑点显色试验和小鼠的免疫活性。每份样品的每种处理条件都一式三份。由ZellNet Consulting，Inc.(Fort Lee，NJ)分析各板。各样品的抗原βhCG特异性斑点数是减去空白对照的数目后的肽处理小孔的三次重复的平均值±SD。
实施例1：βhCG-B11的产生
疫苗缀合物的设计：通过将βhCG抗原与B11即结合树突细胞上的人巨噬细胞甘露糖受体的完整人抗体连接，产生该构建体。通过遗传融合方法，使抗原与抗体的重链通过共价结合完成键合，如图3所示。
βhCG-B11疫苗缀合物的重组表达：如图2所示，产生含有新霉素基因和二氢叶酸还原酶基因的质粒，其含有与抗体B11在重链CH3区融合的βhCG编码序列(SEQ ID NO：9和10)。采用标准化方案(Qiagen Inc，Valencia，CA)，将所得质粒构建体转染到CHO细胞中。将转染细胞在含有抗生素G418的培养基中进行选择。让细胞在浓度逐渐增高的甲氨蝶呤中生长，进一步扩增表达。扩增后，通过有限稀释克隆细胞，稳定的克隆系用来产生细胞库供进一步研究用。为了确证βhCG-B11构建体的表达，在还原性条件下，通过SDS-PAGE对蛋白质进行蛋白质印迹分析。观察到该融合蛋白具有预期分子量并适当装配(即既含有重链融合物又含有轻链)。准确地说，疫苗缀合物和抗体单独通过SDS-PAGE用变性条件进行分析，用蛋白质印迹分析进行检测。然后所述印迹分别用山羊抗人IgG重链和轻链和βhCGC端肽特异性的mAb(Sigma)进行探测。结果证明，转化的CHO细胞特异性表达B11-βhCG疫苗缀合物，证据为融合产物的合适的大小和组成。
实施例2：B11scfv-βhCG的产生
疫苗缀合物的设计：通过使βhCG抗原与B11单链融合体(ScFv)连接产生第二构建体，B11单链融合体(ScFv)是能与树突细胞上的人巨噬细胞甘露糖受体结合并且含有完整人B11抗体VL和VH片段的单链抗体。通过遗传融合方法，使抗原与B11 ScFv的羧基端通过共价结合完成键合，如图1所示(称为B11sfv-βhCG构建体)。
B11sfv-βhCG疫苗缀合物的重组表达：如图1所示，产生含有B11sfv-βhCG构建体(SEQ ID NO：11和12)的质粒。采用标准化方案(Qiagen Inc，Valencia，CA)，将所得质粒构建体转染到哺乳动物细胞中。将转染细胞在含有抗生素G418的培养基中进行选择。进行ELISA以证实B11sfv-βhCG构建体的表达。
实施例3：疫苗缀合物的功能特征
抗体-靶向疫苗对其在APC表面的关联受体的识别是此递药平台的第一步。用流式血细胞计数研究已证实βhCG-B11和B11sfv-βhCG构建体与表达MR的培养人DC特异性结合(图4)。
用抗MR抗体作为探针，检查人皮肤DC和各种人体组织切片中巨噬细胞上MR的原位染色。人体组织冷冻切片用抗MR人抗体B11染色。存在于皮肤表皮层的DC用B11抗体清楚地标记(数据未显示)。注意到在皮肤表皮层有与DC的结合。而且，用所有组织中的抗MR B11 HuMAb染色的树突细胞进行的免疫组织化学实验，检验并显示没有意外的交叉反应性(结果未显示)。这些研究已经用βhCG-B11重复进行，得到相同的结果。
实施例4：将βhCG抗原/抗MR抗体疫苗缀合物交叉呈递给T细胞
评价了βhCG-B11构建体被DC加工以将βhCG抗原经由DC上的I类和II类MHC分子呈递给T细胞(交叉呈递)的能力。具体地说，通过将正常T细胞库与暴露给疫苗的DC一起培养，用βhCG-B11构建体引发抗原特异性T细胞(应答)。然后，分析所得“敏化”T细胞的活性(增殖和杀伤)和特异性。通过将响应具有βhCG抗原的靶细胞的T细胞活性与抗原阴性对照进行比较，可以证明T细胞的特异性。细胞毒性T细胞(CTL)，如果存在，应当只杀伤呈递βhCG相关抗原的那些靶，而放过缺乏所述抗原或呈递无关抗原的对照靶。因为CTL介导的抗原识别总是发生在带有所述肽的给定MHC分子的情况下，阻断MHC：肽-CTL与MHC特异性mAb的相互作用，从而证实I类或II类呈递。
抗原特异性效应T细胞的诱导：通过将贴壁单核细胞与25ng/ml重组人GM-CSF(R&D systems，MN)和100ng/ml重组人IL-4一起培养5天，由正常供体外周血单核细胞(PBMC)产生树突细胞。第5天，收获DC(未成熟)并将其重悬于AIM-V(无血清)培养基中。将βhCG-B11免疫缀合物(20μg/ml)加入到1.2×106DC中并于37℃孵育45分钟。让荷载抗原的DC在CD40L(Peprotech，NJ；20ng/ml)存在下成熟至少24小时。洗涤成熟的DC(1×106)一次，并以1×106细胞/ml(DC∶T细胞比值，20)加入到预先接种到24孔板的T细胞(2×107；总量)中。采用以下培养条件：先在第0天加入10ng/ml IL-7，再在第1天(在24小时)加入10ng/ml IL-10，最后在第2天(在48小时)加入20U/ml IL-2。在第7、14和21天如上所述重新刺激，只是βhCG-B11的浓度减半(分别为10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml)。检验T细胞(以大量或用纯化T细胞亚群)对51Cr标记的未荷载DC、51Cr标记的荷载βhCG-B11、B11sfv-βhCG或B11的DC的反应性。在HLA-特异性mAb存在下确定MHC-特异性。
如图5所示，βhCG-B11构建体诱导βhCG-特异性细胞毒性T细胞。如果T细胞与不呈递βhCG的靶一起培养，则不能保证杀伤力。这些实验中使用的靶细胞是用βhCG-B11构建体或对照抗原处理过的HLA-匹配的DC。仅用抗MR抗体(B11)处理的靶细胞对细胞毒活性不敏感，这证明了只有疫苗的抗原部分才能引发CTL活性。这些结果表明，βhCG-B11构建体能诱导有效的CTL活性，准确地说，CTL活性是针对βhCG抗原而不是靶向抗体(B11)。
而且，呈递βhCG抗原的靶的有效杀伤力用纯化的CD8+T细胞再现，在抗I类MHC抗体存在下，该杀伤力被阻断(图6)。具体地说，βhCG-B11构建体用来由两个供体的外周血单核细胞产生βhCG-特异性T细胞。用免疫磁珠从大量培养物中纯化CD8+和CD4+T细胞。细胞毒性试验如上所述进行，效应物∶靶比值设在40∶1。靶细胞(未成熟DC)未经处理(对照)或负载βhCG-B11构建体。为了证明I类MHC特异性，通过与HLA特异性抗体预孵育来阻断靶细胞杀伤力(W6/32)。
总起来说，这些数据(图6和图7)证实βhCG-B11构建体诱导有效的βhCG-特异性CTL的能力，也证实CTL活性由CD8+T细胞以HLA-依赖性方式介导。用纯化的CD4+T细胞没有观察到杀伤活性。
如图7所示，βhCG-B11构建体引起的T细胞在响应靶向DC的βhCG-B11构建体时增殖。具体地说，用βhCG-B11构建体处理DC，由外周血单核细胞产生βhCG-特异性T细胞。检测来自大量培养物的T细胞(CD4+和CD8+T细胞)在响应抗原刺激时的增殖。在有或没有HLA阻断抗体存在下，将T细胞与未经处理DC(对照)或荷载βhCG-B11构建体的DC共同培养。为了测量增殖，培养5天后，用3H-胸苷分析DNA合成。数据表示为相对于对照的增殖的增加倍数(刺激指数)。就CTL活性来看，当T细胞被DC单独刺激(即无抗原)时，没有发现合适的应答。只用未缀合的抗体(抗MR B11 mAb)靶向的DC不能诱导由βhCG-B11构建体引起的T细胞的增殖。T细胞的增殖能力在抗I类以及II类MHC-特异性mAb存在下被有效阻断，证明CD4+和CD8+T细胞是有反应的。这些数据显示，由DC对βhCG-B11构建体的摄取，使得疫苗可以进入I类和II类MHC的加工途径，该途径与带有MHC区室的MR的共区域化是一致的。
实施例5：DC对抗MR抗体B11的内化较之于DC对甘露糖基化抗原的内化(对网格蛋白介导的内化的抑制)
未成熟DC可通过胞饮或受体介导的胞吞机制吸收可溶性抗原(55)。抗原内化机制决定其细胞内命运并可影响对它的免疫应答质量(54，55，56)。通过MR的内化被描述为快速、网格蛋白介导的内化事件(57，58)。MR本身在其胞质尾区内具有两个推定的网络蛋白靶向序列，甘露糖基化金颗粒的内化已经被EM定位到披网格蛋白小窝(58，59)。网格蛋白依赖型内吞可通过短暂高渗休克或K+耗尽而特异性中断(61)。为了确定结合甘露糖受体的甘露糖基化抗原或B11是否经披网格蛋白小窝内化，在B11mAb或甘露糖基化BSA存在下，将未成熟DC在含有或不含400mM蔗糖的AIM5培养基中、在冰上培养30分钟。随后将细胞加热到37℃并使其内化20分钟。洗涤并固定后，细胞用共焦显微镜法进行分析(数据未显示)。当B11结合MR时，其摄取被高渗休克所抑制，表明其内化机制是通过披网格蛋白小窝。甘露糖基化BSA的摄取正好相反，不被高渗休克抑制，这表明其内化机制不依赖于披网格蛋白小窝的形成。甚至在比B11的浓度高20倍的情况下，甘露糖基化BSA FITC的表面染色相对较弱。其后的研究揭示出内化的甘露糖基化BSA FITC与非特异性、液相示踪物共定位，其中作为含有内化B11的小囊泡排除非特异性示踪物(数据未显示)。与B11-FITC相反，甘露糖基化的BSA-FITC和液相示踪物的摄取，通过用PI3K抑制剂渥曼青霉素预处理，而大半被阻断(数据未显示)。这些结果表明，绝大多数甘露糖基化BSA通过未成熟树突细胞经非特异性大胞饮机制吸收，提示针对甘露糖基化抗原的免疫应答质量可能与特异性靶向MR的抗原相差甚远。
实施例6：B11sfv-βhCG与DC的结合
在37℃，将单核细胞衍生的DC暴露于PBS-BSA缓冲液中的B11sfv-βhCG或βhCG-B11中达45分钟，并在CD40L存在下，使其成熟过夜。收获的DC随后经洗涤并先后用小鼠抗βhCG、山羊抗huIgG(Fc)-PE缀合物染色。染色的细胞在流式细胞仪(BD-LSR)上进行分析。每个样品大约收集10,000个事例。背景自动荧光和同种型匹配的抗体染色用作对照。根据平均荧光强度(MFI)(数据未显示)，B11sfv-βhCG与DC上表达的MR的结合类似于βhCG-B11的结合。
实施例7：对βhCG-B11构建体具有特异性的CTL识别由DC呈递的抗原(B11sfv-βhCG)的scFv形式
针对抗DC-呈递的βhCG-B11产生的CTL，要测试其暴露于βhCG-B11和B11sfv-βhCG的自体DC靶，同时用未经处理DC或暴露于B11的DC作为对照。抗原暴露后，靶用51铬标记并在一个4小时的试验中与CTL混合，该试验测量上清液中放射性的释放。在该实验中，βhCG-B11-特异性T细胞识别呈递I类MHC分子上抗原的4个靶中的2个。当DC缺少抗原时，不发生靶的杀伤(图11)。因此，DC对βhCG-B11的摄取，导致βhCG-来源的T细胞表位被CTL识别。
实施例8表达人甘露糖受体的转基因小鼠的产生
靶向人甘露糖受体(MR)的抗体与来自实验室常用的其它物种(包括猴)的MR没有交叉反应。因此，开发了能够表达人MR的转基因小鼠。采用标准微注射技术，用全部30个外显子基因以及来自5′端和3′端的额外序列，产生表达人MR的转基因小鼠。选择C57B1/6品系作为人MR转基因小鼠(huMR-tg)的背景，因为对于该品系已经建立了免疫和肿瘤攻击实验。采用不同方法，证明了人MR转基因的表达和调节类似于人体组织中人MR的表达和调节(数据未显示)。
实施例9MR表达细胞有效荷载B11-βhCG
给予B11-βhCG后24小时，通过分析来自表达人甘露糖受体(hMR)的转基因小鼠组织，研究了B11-βhCG的体内靶向能力。对淋巴结和邻近注射部位周围组织中的βhCG抗原进行免疫化学染色，证明淋巴结组织和周围巨噬细胞和间质树突细胞(图16)内明显有抗原蓄积。在不表达hMR的对照小鼠中没有观察到染色，表明靶向hMR在抗原呈递细胞和淋巴结中有效地荷载了抗原。
具体地讲，给表达人甘露糖受体的转基因小鼠(huMR-tg小鼠)或WT同窝出生的小鼠在其肢体注射B11-βhCG(10μg)。24小时后，切取邻近淋巴结和周围组织，对βhCG进行染色。组织切片用抗βhCG多克隆抗体染色，再用过氧化物酶标记的抗兔IgG聚合物试剂处理。如图16所示，WT小鼠未观察到染色，而在huMR-tg小鼠的淋巴结和周围组织的间质树突细胞和巨噬细胞内都观察到染色。
实施例10当靶向MR时，针对hβCG的体液和细胞应答增强
通过用B11-βhCG免疫huMR-tg小鼠及其Wt同窝出生小鼠，研究了对MR具有特异性的靶向抗体的疫苗的潜力。与非转基因的同窝出生小鼠相比，转基因小鼠针对B11-βhCG的抗原特异性体液免疫发展更快更高(参见图17)。具体地讲，如图17所示，用10μgB11-βhCG或等量的无βhCG给小鼠免疫3次(第1、15和29天，如箭头所指)。每次免疫后1周给小鼠放血。用标准ELISA测定抗βhCG效价。
同样，与非转基因的同窝出生小鼠相比，用B11-βhCG免疫的huMR-tg小鼠表现出针对B11-βhCG的细胞免疫应答较强(图18)。具体地讲，如图18所示，对照(Wt)和huMR-tg小鼠用B11-βhCG(1μg i.p.和佐剂)免疫。14天后收获脾细胞，并用标准ELISPOT测定分析响应βhCG肽的IFN-γ产生。这些研究进一步证明了在体内将抗原靶向APC的效力。此外，在缺乏佐剂时容易观察到体液应答，而当B11-βhCG与佐剂例如poly-IC和CPG联用时，细胞对βhCG的应答更显著。
等同实施方案
仅用常规实验，本领域技术人员就会认识或者能够确定本文所述发明的具体实施方案的许多等同实施方案。这些等同实施方案包括在所附权利要求书中。
文献引用
本文引用的所有专利、待审批的专利申请和其它出版物，全都通过引用结合到本文中。
参考文献
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80.Shen等，J.of Immunol.137(11)：3378-3382。
81.Snider和Segal(1989)J.of Immunol.143(1)：59-65。
82.美国专利第4,954,617号。
83.Snider和Segal(1987)J.Immunology 139：1609-1616。
84.Kawamura和Berzofsky(1986)J.of Immunol.136(1)：58-65。
                                          序列表
<110>塞尔德克斯医疗公司(CELLDEX THERAPEUTICS，INC.et al.)
<120>包含能结合人树突细胞的单克隆抗体和β人绒毛膜促性腺激素的疫苗缀合物
<130>CDJ-301CPPC
<140>PCT/US2005/027044
<141>2005-07-28
<150>10/903191
<151>2004-07-30
<160>32
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1407
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atgggatgga gctgtatcat cctgttcctc gtggccacag caaccggtgt ccactctgag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120
tgtaagggtt ctggagacag ttttaccacc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180
gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac catatacagc 240
ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 300
cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtacgag aggggaccgg 360
ggcgttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctccgg gtaaaggctc gagctga                                     1407
<210>2
<211>468
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225                 230                 235                 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
            420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
Lys Gly Ser Ser
465
<210>3
<211>348
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc 60
tcctgtaagg gttctggaga cagttttacc acctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccatatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtac gagaggggac 300
cggggcgttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca              348
<210>4
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95
Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
    115
<210>5
<211>702
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
atgggatgga gctgtatcat cctgttcctc gtggccacag caaccggtgt ccactccgac 60
atccagatga cccagtctcc atcctcactg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120
acttgtcggg cgagtcaggg tattagcagg tggttagcct ggtatcagca gaaaccagag 180
aaagccccta agtccctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg 240
ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcggcct gcagcctgaa 300
gattttgcaa cttattactg ccaacagtat aatagttacc ctcggacgtt cggccaaggg 360
accaaggtgg aaatcaaacg tacggtggcg gcgccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag                    702
<210>6
<211>233
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
            20                  25                  30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser
            100                 105                 110
Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
        115                 120                 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
    130                 135                 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
                165                 170                 175
Ash Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
            180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
        195                 200                 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
    210                 215                 220
Thr Lys Ser Phe Ash Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>7
<211>321
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a                                           321
<210>8
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>9
<211>1842
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
atgggatgga gctgtatcat cctgttcctc gtggccacag caaccggtgt ccactctgag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120
tgtaagggtt ctggagacag ttttaccacc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180
gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac catatacagc 240
ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 300
cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtacgag aggggaccgg 360
ggcgttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctccgg gtaaaggctc gagctccaag gagccgcttc ggccacggtg ccgccccatc 1440
aatgccaccc tggctgtgga gaaggagggc tgccccgtgt gcatcaccgt caacaccacc 1500
atctgtgccg gctactgccc caccatgacc cgcgtgctgc agggggtcct gccggccctg 1560
cctcaggtgg tgtgcaacta ccgcgatgtg cgcttcgagt ccatccggct ccctggctgc 1620
ccgcgcggcg tgaaccccgt ggtctcctac gccgtggctc tcagctgtca atgtgcactc 1680
tgccgccgca gcaccactga ctgcgggggt cccaaggacc accccttgac ctgtgatgac 1740
ccccgcttcc aggactcctc ttcctcaaag gcccctcccc ccagccttcc aagtccatcc 1800
cgactcccgg ggccctcgga caccccgatc ctcccacaat aa                    1842
<210>10
<211>613
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225                 230                 235                 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
            420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
Lys Gly Ser Ser Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile
465                 470                 475                 480
Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr
                485                 490                 495
Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val
            500                 505                 510
Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg
        515                 520                 525
Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val
    530                 535                 540
Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu
545                 550                 555                 560
Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu
                565                 570                 575
Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
            580                 585                 590
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
        595                 600                 605
Pro Ile Leu Pro Gln
    610
<210>11
<211>1325
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
aagcttcacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggccacag ctaccggtgt 60
ccactccgac atccagatga cccagtctcc atcctcactg tctgcatctg taggagacag 120
agtcaccatc acttgtcggg cgagtcaggg tattagcagg tggttagcct ggtatcagca 180
gaaaccagag aaagccccta agtccctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt 240
cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcggcct 300
gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg ccaacagtat aatagttacc ctcggacgtt 360
cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaagg agggggcggt tccggaggag gcggcagcgg 420
gggaggaggt agcgaggtgc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agcccgggga 480
gtctctgagg atctcctgta agggttctgg agacagtttt accacctact ggatcggctg 540
ggtgcgccag atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc 600
tgataccata tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat 660
cagcaccgcc tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg 720
tacgagaggg gaccggggcg ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc 780
aggctctacc ggtgggggag gctcgagctc caaggagccg cttcggccac ggtgccgccc 840
catcaatgcc accctggctg tggagaagga gggctgcccc gtgtgcatca ccgtcaacac 900
caccatctgt gccggctact gccccaccat gacccgcgtg ctgcaggggg tcctgccggc 960
cctgcctcag gtggtgtgca actaccgcga tgtgcgcttc gagtccatcc ggctccctgg 1020
ctgcccgcgc ggcgtgaacc ccgtggtctc ctacgccgtg gctctcagct gtcaatgtgc 1080
actctgccgc cgcagcacca ctgactgcgg gggtcccaag gaccacccct tgacctgtga 1140
tgacccccgc ttccaggact cctcttcctc aaaggcccct ccccccagcc ttccaagtcc 1200
atcccgactc ccggggccct cggacacccc gatcctccca caataagcgg ccgcagaaca 1260
gaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg cgccgcacat caccatcatc accattgatt 1320
ctaga                                                             1325
<210>12
<211>411
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
            20                  25                  30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser
            100                 105                 110
Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
    130                 135                 140
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile
            180                 185                 190
Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln
        195                 200                 205
Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp
    210                 215                 220
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly
225                 230                 235                 240
Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
                245                 250                 255
Ser Gly Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Lys Glu Pro Leu Arg
            260                 265                 270
Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly
        275                 280                 285
Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys
    290                 295                 300
Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln
305                 310                 315                 320
Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro
                325                 330                 335
Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu
            340                 345                 350
Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly
        355                 360                 365
Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser
    370                 375                 380
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
385                 390                 395                 400
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
                405                 410
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
Thr Tyr Trp Ile Gly
 1               5
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr
 1               5
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala
 1               5                  10
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
 1               5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
 1               5
<210>19
<211>143
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr
            20                  25                  30
Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe
    50                  55                  60
Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser
                85                  90                  95
Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp
            100                 105                 110
Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
        115                 120                 125
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
    130                 135                 140
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu
 1               5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile
 1               5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn
 1               5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
 1               5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala
 1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
 1               5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val
 1               5
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val
 1               5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu
 1               5
<210>29
<211>294
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gaga       294
<210>30
<211>98
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>31
<211>285
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct                 285
<210>32
<211>95
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95

Claims (45)

1.一种分子缀合物，其包含与β人绒毛膜促性腺激素(βhCG)和免疫刺激剂连接的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能结合人抗原呈递细胞(APC)。
2.权利要求1的分子缀合物，其中所述βhCG和所述免疫刺激剂与抗体共价连接、非共价连接、重组连接或者采用它们的组合连接。
3.权利要求1的分子缀合物，其中所述βhCG和所述免疫刺激剂都连接在所述抗体的同一链上。
4.权利要求3的分子缀合物，其中所述βhCG和所述免疫刺激剂都连接在所述抗体的重链上。
5.权利要求3的分子缀合物，其中所述βhCG和所述免疫刺激剂都连接在所述抗体的轻链上。
6.权利要求1的分子缀合物，其中所述βhCG和所述免疫刺激剂分别连接在所述抗体的重链和轻链上。
7.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体、βhCG和免疫刺激剂一起表达为一个重组融合蛋白。
8.权利要求1的分子缀合物，其中所述免疫刺激剂选自CD40配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体、toll受体激动剂、LPS(内毒素)、R837、R848、聚肌胞苷酸(肌苷：胞苷多核苷酸)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑和静脉内免疫球蛋白。
9.权利要求8的分子缀合物，其中所述细胞因子选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2。
10.权利要求8的分子缀合物，其中所述toll受体激动剂为鞭毛蛋白或MALP-2。
11.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体能结合人树突细胞上表达的C型凝集素。
12.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体能结合人甘露糖受体。
13.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体选自人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
14.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体选自完整抗体、Fab片段和单链抗体。
15.权利要求1的分子缀合物，其中所述缀合物是重组融合蛋白。
16.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体包含人重链可变区和人轻链可变区，所述人重链可变区包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，所述人轻链可变区包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中：
(a)所述人重链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO：15及其保守修饰；和
(b)所述人轻链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO：18及其保守修饰。
17.权利要求16的分子缀合物，其中所述人重链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO：14及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO：17及其保守修饰。
18.权利要求16的分子缀合物，其中所述人重链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO：13及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO：16及其保守修饰。
19.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体包含：
(a)来源于人VH5-51种系序列的重链可变区(SEQ ID NO：30)；
(b)来源于人Vk-L15种系序列的轻链可变区(SEQ ID NO：32)。
20.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体包含人重链可变区和人轻链可变区，所述可变区包含分别示于SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：8的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8同源性足够高的氨基酸序列，致使所述抗体保持与人树突细胞结合的能力。
21.一种分子缀合物，其包含能结合人APC的人抗体重链以及能结合人APC的人抗体轻链，其中这两条链中的任一条或两条都能与βhCG和免疫刺激剂连接。
22.一种分子缀合物，其包含能结合人APC的人抗体重链以及能结合人APC的人抗体轻链，其中这两条链中的一条与βhCG连接，而另一条与免疫刺激剂连接。
23.权利要求21的分子缀合物，其中所述重链与βhCG连接并且包含示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
24.权利要求21的分子缀合物，其中所述轻链包含示于SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
25.一种分子缀合物，其包含：
单克隆抗体，它能结合人抗原呈递细胞(APC)；
β人绒毛膜促性腺激素(βhCG)；和
免疫刺激剂，其中所述抗体包含：
(a)来源于人VH5-51种系序列的重链可变区(SEQ ID NO：30)；
(b)来源于人Vk-L15种系序列的轻链可变区(SEQ ID NO：32)。
26.一种分子缀合物，其包含示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列并与免疫刺激剂连接。
27.权利要求1的分子缀合物，所述缀合物由APC内化并加工，致使产生针对所述抗原的T细胞介导的免疫应答。
28.权利要求27的分子缀合物，其中所述T细胞应答是由细胞毒性T细胞介导的。
29.权利要求27的分子缀合物，其中所述T细胞应答是由CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的。
30.权利要求27的分子缀合物，其中所述T细胞应答是通过I类MHC途径和II类MHC途径诱导的。
31.一种组合物，所述组合物包含免疫刺激剂和分子缀合物，其中所述分子缀合物包含与βhCG连接的抗体，所述抗体能结合APC。
32.权利要求31的组合物，其中所述免疫刺激剂与所述分子缀合物连接。
33.权利要求32的组合物，其中所述连接是共价连接、非共价连接或重组连接。
34.权利要求31的组合物，其中所述抗体是人抗体。
35.权利要求31的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
36.权利要求31的组合物，所述组合物还包含佐剂。
37.权利要求31的组合物，其中所述免疫刺激剂选自CD40配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体、toll受体激动剂、LPS(内毒素)、R837、R848、聚肌胞苷酸(肌苷：胞苷多核苷酸)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑和静脉内免疫球蛋白。
38.权利要求37的组合物，其中所述细胞因子选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2。
39.一种诱导或增强针对βhCG的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括使权利要求31的组合物与APC接触，致使所述抗原以诱导或增强针对所述抗原的T细胞介导应答的方式而被加工并呈递给T细胞。
40.权利要求39的方法，其中所述免疫刺激剂与所述分子缀合物连接。
41.一种对受试者进行免疫的方法，所述方法包括给予权利要求31的组合物，致使产生针对βhCG的T细胞介导的免疫应答。
42.权利要求41的方法，其中所述免疫刺激剂与所述分子缀合物连接。
43.权利要求41的方法，所述方法还包括给予佐剂的步骤。
44.权利要求41的方法，其中所述免疫刺激剂选自CD40配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体、toll受体激动剂、LPS(内毒素)、R837、R848、聚肌胞苷酸(肌苷：胞苷多核苷酸)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑和静脉内免疫球蛋白。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞因子选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2。
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