CN1805758A - 核酸和细胞疫苗的组分 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸和细胞的疫苗组分和药物组分的一个新颖的组合以及其用于治疗和/或防治包括传染病、癌症、自身免疫性疾病、过敏、糖尿病和血液病等疾病的用途。疫苗组分包含编码抗原分子的核酸序列和基因修饰的抗原呈递细胞(APCs)，更好的方式为相互混合物。APCs被修饰为可表达免疫调控分子。用本发明的疫苗组分对对象免疫接种，导致宿主免疫系统应答和引发起高效率的免疫性对抗已存在的疾病或保护宿主对抗疾病。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗的组分，特别是疫苗的组分中含有核酸和基因修饰的抗原呈递细胞，以及它们的应用。
背景技术
用核酸序列，包括DNA或者RNA序列，作为接种的方法已经于最近十年期间发展起来了。DNA疫苗是比较容易制造的，而且稳定、造价低。另外，重复性的使用DNA疫苗不会产生明显的载体特异性免疫反应。当裸的质粒DNA打进小小鼠的皮肤和肌肉，DNA将会被旁边的细胞吸收掉。这些非淋巴组织表达质粒所编码的蛋白，然后这抗原肽在与主要组织相容性复合体(MHC)I类或者II类分子结合后向T淋巴细胞上呈递(Annu.Rev.Immunel.2000，18：927)。
DNA免疫接种对抗不同的病原体感染和恶性疾病的能力已经在动物模型上研究过(Annu Rev.Immunol.1997，15：617-648)。DNA免疫接种可以抑制自身免疫疾病以及抑制过敏反应(Nat.Med.19962：899-905，Nat.Med.1996，2：540-544)。最近的研究结果表明，人体上用DNA疫苗能产生对抗疟疾感染和HIV多肽的细胞性免疫反应(Science1998，282：476-480，Lancet 1998，351：1320-1325)。
典型地，质粒DNA载体有两个主要单元：(1)质粒骨架，用于传送辅助因子；(2)转录单元，包括启动子、抗原性核苷酸序列以及多聚腺苷酸附加序列，它们一起指导蛋白的合成。
当今DNA疫苗的主要问题是不像我们想象的那么有效。从临床前工作和临床试验中得不到满意的结果，让人们对DNA疫苗的应用产生严重怀疑。所以，疫苗效率的改善成为DNA疫苗发展的一个重要目标。
树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是造血来源的专职化的抗原呈递细胞(APCs)。虽然所有DCs具有共同的抗原(Ag)处理和T细胞激活化的功能，但是DCs细胞含有多种子型细胞类型和各种各样的功能。
肿瘤表达一些能被T细胞识别的蛋白质抗原，成为癌症免疫疗法的潜在目标。树突状细胞(DCs)具有向T细胞呈递抗原的独特能力。这种特性已用于开发治疗癌症疫苗。在临床试验上用DC接种去对抗非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)和黑色素瘤，已观察到对抗肿瘤免疫反应和肿瘤衰退的诱导(Annu Rev Med.1999，50：507-529)。
发明内容
本发明的总的目的是提供一个新的疫苗组分。
本发明的一个目的是提供一个生产所述的疫苗组分的方法。
本发明的另一个目的是提供一个药物组分。
本发明的进一步的目的是提供一个疫苗组分，其含有编码抗原性分子的核酸序列和修饰的抗原呈递细胞，不限于树突状细胞(DCs)。
本发明的一个特别目的是提供一个疫苗组分可用于防止和/或治疗癌症、传染病、老年性痴呆病、过敏、自身免疫疾病和血液病。
本发明的再一个特别的目的是提供一个疫苗组分含有树突状细胞子类，称为血浆细胞状树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)或者是干扰素生产细胞(IPCs)。这种树突状细胞子类经过遗传工程改造为可表达免疫调控分子。
这些和其它的发明目的在本发明的相应权利要求中有相关定义。
简单地讲，本发明提供了一个新颖的疫苗组分。该组分包括一个编码抗原分子的核苷酸序列和基因修饰的抗原呈递细胞(APCs)，更好的方式是把核苷酸序列和基因修饰的抗原呈递细胞预先培养成混合物。
编码抗原的核苷酸序列可以是一个裸露的DNA或RNA序列。另外，编码抗原的核苷酸序列更好的是插人和包含在一个载体中，这时核苷酸序列置于启动子、增强子和/或其他调节序列的转录控制下。本发明所述的载体优选为包含编码抗原基因的质粒DNA载体。该载体可能也包含其他核苷酸序列，这些序列可调节或控制对象宿主的免疫应答。接受该疫苗组分的对象优选为哺乳动物，更好的对象为人。这样的免疫应答调控序列可能是非甲基化的胞苷磷酸鸟苷(CpG)序列，或者是编码参于调节对象免疫反应的异种(xenogenic)分子(蛋白/多肽)的基因序列。
用于本发明的疫苗组分中的APCs细胞为适合于向其它细胞处理和呈递抗原的细胞类型，特别是向免疫系统的CD4+和CD8+T细胞。更好的APCs的例子包括专职性APCs，比如DCs、IPCs、巨噬细胞、单核细胞和B细胞。更佳的APCs细胞类型是具有pDC/IPCs特征和功能的细胞，特别是可表达Toll-like受体9(TLR9)和P2X7受体，在微生物刺激下分泌细胞因子和产生大量I型α-干扰素和β-干扰素并且刺激免疫系统的效应细胞。
此外，APCs应是被基因修饰的，或被其他方式修饰过，从而可表达免疫反应调控分子。这样的分子能通过提高抗原的输送，刺激Th1或Th2细胞因子的分泌，激活APCs，郎格罕氏(Langerhans)细胞和效应细胞和/或者提高免疫反应，来增强对象的免疫反应。另外，特别是在自身免疫疾病和过敏中，免疫反应调控分子能帮助抑制免疫反应或者诱导对象的免疫耐受性或无变应性。用于修改APCs的合适的基因包括：细胞因子基因、白介素基因、粘附分子、干扰素基因、趋化因子基因和趋化因子受体基因和编码热休克蛋白的基因、肿瘤坏死因子(TNF)、抗细胞凋亡剂、细胞凋亡诱导分子、生长因子和药物学可接受的载体。
本发明的疫苗组分中除了核酸序列和APCs以外也包括其他附加分子。这些附加分子可提高或抑制对象的免疫反应，增加APCs的抗原呈递，刺激Th1或Th2细胞因子的分泌，激活APCs、郎格罕氏(Langerhans)细胞、效应细胞和/或调控APCs的免疫功能。
本发明的疫苗组分中最有效的组分包括基因修饰的pDCs或者是I型干扰素(IFN)生产细胞(IPCs)和编码MHC结合的抗原并含有CpG基序(CpG motifs)的质粒DNA。
本发明也涉及一种治疗和防止疾病的方法，即将本发明的疫苗组分给予对象，优选是哺乳类，最好是人类，以及其应用。本发明的疫苗组分包括编码与疾病相关的抗原性分子的核酸序列。例如，对于传染病，核酸序列编码与疾病有关的且来自感染微生物的蛋白质或多肽，例如病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫的多肽或蛋白质。在人体和动物上用编码感染微生物的蛋白质或多肽的核酸序列和修饰APCs一起来接种，将会诱导引起对抗编码的蛋白质或多肽的特异性的免疫反应。
癌症通常有改变的或反常的基因表达。蛋白质在癌细胞里反常水平的表达可以作为T细胞攻击的目标。本发明的疫苗组分中也包括编码与肿瘤相关的抗原的核酸序列。
本发明也包括一个生产本疫苗组分的方法。这个方法包括在用本疫苗组分去治疗或防止疾病时，设计鉴定与MHC结合的和与疾病或紊乱相关的抗原分子。
更好的具体化，是将编码鉴定后的抗原分子的核酸序列引进入一个质粒DNA载体中，最好是一个含有非甲基化的CpG序列的质粒载体中。分离APCs，可从对象(或接受者)的本体的APCs中来。APCs更好是特殊的树突状细胞子型，类似pDCs类型和(自然)干扰素导致细胞类型(NIPCs)并且具有在例如象质粒DNA的刺激下能产生I型干扰素的能力。APCs由一个或几个编码免疫共刺激分子的基因修改过后，调节了APC的功能和刺激了免疫效应细胞。最后，将编码抗原的核苷酸序列和基因修饰APC混合在一起，孵育，完成制造方法以及结束本发明的疫苗组分的具体化。
因此，根据本发明而获得正结果的主要特点是将基因修饰的APCs和编码抗原的核苷酸序列一起使用。本发明的另外的特点是在使用前预先孵育疫苗中的两个主要成份。
这样的预先孵育允许APCs摄取核苷酸序列。在进入APCs后，抗原序列将会被处理和呈递，然后CpG序列结合到不同的受体上包括TLR9，结果激活了APCs和产生了免疫调控的分子，例如I型干扰素和细胞因子。
本发明具有以下优点：
——与以前的DNA疫苗组分比较，本发明的疫苗组分在长肿瘤的小鼠上应用具有更优的抗肿瘤效率；
——与单用核苷酸序列或者是编码抗原的核苷酸序列的质粒作疫苗相比，本发明的疫苗组分治疗癌症具有5倍以上的效应；
——与用含有编码抗原的核苷酸序列的质粒DNA或者是空的质粒载体作疫苗相比，本发明的疫苗组分对在体内活化肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)具有8倍以上的效应；
——与唯一用基因修饰的APCs和其MHC-I类分子装载了抗原多肽作疫苗相比，本发明的疫苗组分对在体内活化肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)具有2倍以上的效应；
——用本发明的疫苗组分接种能活化和诱导识别在疫苗组分含有的肿瘤肽的肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)；
——与削弱的或失活的病原体相比，能消除引进未完全失活的病原体的风险；
——为了打破对自身抗原耐受和在对象上引导对抗自身抗原的免疫反应，本疫苗也能包括异种属的核苷酸序列；
——通过简单地交换编码抗原的核苷酸序列，能用于治疗和/或防止大范围疾病和紊乱；以及
——通过对疫苗组分的抗原呈递细胞进行基因工程改造，允许引进免疫调控的分子。
本发明所具有的其它优点将在下面作具体化的描述。
简要附图说明
通过参考以下的描述与附图，将会对由本发明的对象和优点作进一步更好的理解。
图1为本发明生产或准备疫苗组分的方法流程图；
图2为图1中提供的疫苗中提供核苷酸的方法流程图；
图3为图1中提供的疫苗中提供APC的方法流程图；
图4为图1中疫苗生产方法的附加步骤的流程图。
图5为说明以莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒载体构造的含鼠CD40配体(CD40L)基因的反转录病毒载体(RVV-mCD40L)的概要图；
图6为说明用RVV-mCD40L来转导DCs。在重复性的转导和筛选以后，DCs容易地在它们的细胞表面表达CD40L，而且超过96％的DCs表达CD40L，这些细胞被用于本发明所述的疫苗组分的一个例子中；
图7A说明在亲代BM185wt肿瘤细胞上免疫反应激活分子的表达。
图7B说明在DCs上表达B220分子；
图8说明在D2SC/wt，基因修饰的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF细胞上表达CD8、CD11c、MHC类II(I-A)、B7.1、B7.2和CD40L分子；
图9说明由Western blot检测DCs表达TLR9蛋白质。
图10概要地表明空的pVAX-1载体的一部分和含有小基因(minigene)序列跨过人的e1a2融合区域的pVAX-e1a2载体的一部分。另外，图上表明通过体外pVAX-1和pVAX-e1a2质粒载体的转录结合的翻译分析，检查出小基因序列编码的蛋白质产品；
图11A：显示D2SC/wt和D2SC/CD40L细胞诱导同种异体T细胞增生的能力。与未改造过的亲代DCs比较，被基因修饰的DCs诱导8倍以上同种异体T细胞增生；
图11B说明D2SC/wt和D2SC/CD40L引导自体T细胞增生。与未改造过的亲代DCs比较，被基因修饰的DCs诱导4倍以上的自体T细胞增生。
图12.A说明将基因修饰的DCs用于接种时的滴定的最佳剂量，该DCs在注射前装载了肿瘤溶解物；
图12B说明通过单独接种脉冲肿瘤溶解物抗原的基因修饰DCs对长肿瘤小鼠的治疗；
图13表明在只用肿瘤溶解物的单独治疗，或者脉冲肿瘤溶解物的基因修饰的DCs的单独治疗，在长肿瘤的小鼠上诱导产生了肿瘤特异性的CTLs。
(a)用装载肿瘤溶解物的D2SC/CD40L或D2SC/GM-CSF细胞来单独接种，产生了能特异杀死亲代BM185wt肿瘤细胞的肿瘤CTLs。(b)值得注意的是，肿瘤CTLs不杀死同源的A20淋巴瘤。
图14概要地说明本发明使用的小鼠接种模型的一个例子；
图15说明在长有bcr/abl阳性肿瘤的小鼠上用不同的疫苗组分来接种后肿瘤消失的小鼠的百分比。另外，为了检验所诱导的免疫保护性的效力和特异性，用活的亲代BM185wt肿瘤细胞再次挑战肿瘤消失的小鼠。
图16说明用pVAX-e1a2和DC/CD40L来接种诱导产生肿瘤特异性的和e1a2特异性的CD8+T细胞；
图17说明本发明的疫苗组分与其它的疫苗组分在长有bcr/abl阳性肿瘤的小鼠的治疗效果上的比较；
图18.A说明在用不同的疫苗策略进行免疫后，在体内产生肿瘤特异性的T细胞应答。从肿瘤消失的小鼠中形成的CTLs是特异性地直接对抗亲代肿瘤细胞，BM185wt细胞。
图18B说明在用不同的疫苗组分接种以后，在体内产生肿瘤特异性的T细胞的应答。从肿瘤消失的小鼠上提取的在体外培养产生的CTLs，识别在TAP缺陷的RMA-S细胞上装载的e1a2肽；
图19说明在体外T细胞扩展以后产生的CD8+CTLs的百分比；
图20说明特异性的CD8+T细胞识别在H-2Ld：Ig复合物上装载的e1a2肽；以及
图21说明一个可指导本发明所述的效果的机制的假说。
具体实施方式
除非其他定义，这里所有被使用的技术和科学术语可被本发明所属领域的人理解。
以下提供在本发明中使用的许多的一般定义的参考：Singleton P and Sainsbury D，Dictionary of microbiology and molecular biology，3rd ed.，2002，Walker，The Cambridgedictionary of science and technology，1988，Rieger R，et al.，eds.，Glossary of genetics，5thed.，1991，Hale WG and Marham JP，Harper Collins dictionary of biology，1991，Abbas A，et al.，Cellular and Molecular Immunology，2003，Blood 2001：1：587-600.为了发明的清晰理解，本发明涉及以下定义。
除非另外说明，“核酸序列”的定义包括：双链和单链的DNA，寡核苷酸，cDNA和RNA.在定义中也包括像DNA-RNA，DNA-DNA之类的杂交体。在核苷酸序列或核酸序列的含义中也包括本领域的人所知的碱基修改，比如自然发生的结构变异和人工合成的非自然发生的类似物。
“免疫应答”指的是由免疫系统的细胞和分子介导的在一个个体上发生的集体和协合的对外来物质入侵的反应。
“免疫系统”指的是提供对抗外来生物体的免疫或保护的集体性功能的分子、细胞、组织和器官。
“CpG基序(CpG-motifs)”指的是比如在细菌、酵母、昆虫和neomatode DNA中的未甲基化“CpG二核苷酸”或“CpG基序”。在许多细菌质粒上已鉴定了CpG基序并且它们可作为DNA疫苗的潜在佐剂(Immunol.Today 1998，19：89-97)。CpG-DNA现已知道是一个强力的Th1-like佐剂，它不仅促进MHC-I类的限制性CTL对蛋白质或多肽的交叉激活(cross-priming)，而且触发Th1介导的抗体反应(Immunity.2001 14：499-502)。在其它方面，不含有CpG基序的DNA序列具有抑制免疫系统的作用(Arthritis and rheumatism.2003，48：1701-1707)。
“P2受体(P2receptors)”指的是细胞外核苷酸的受体。P2受体被划分成两个亚型：G蛋白质耦联受体(P2Y)和配体门控离子通道受体(P2X)(Curr Opin Cell Biol.1996，8：474-483)。
“抗原呈递细胞(APC)”指的是具有抗原处理和抗原呈递功能的细胞。这些APCs在其细胞表面显示与MHC分子结合的蛋白质抗原的肽片段，并且激活抗原特异性的T细胞。除了显示肽片段-MHC结合体之外，APCs也表达最适宜T细胞激活的共刺激分子。特别是，APC特指专职性APC，包括DCs、IPCs、NIPCs、单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞，尤其是pDCs，IPCs，NIPCs，以及具有pDCs/IPCs/NIPCs特征和功能的专职化的APCs，例如在微生物刺激后能表达TLR9并产生或分泌I型干扰素和进一步分泌TNF-a的细胞。
“修饰APCs”指的是通过用病毒载体或由非病毒载体处理后，获取基因或蛋白信息的抗原呈递细胞。遗传修饰的结果使基因或蛋白物质进入或结合到抗原呈递细胞中并在那里表达。
根据本发明的一个方面是提供含有分离或极大纯化的异种核苷酸序列或编码抗原分子核酸序列和基因修饰抗原呈递细胞(APCs)的疫苗组分。
疫苗组分更好地是作为核苷酸序列和APCs的相互混合物来提供的。比如，核苷酸序列和APCs更好地是预先混合和孵育后才引入对象。与以前的DNA疫苗比较，本发明的疫苗组分获得增强的免疫应答和优越的治疗和保护效果，特别是在消灭已存在癌细胞和保护宿主抵抗肿瘤细胞的再挑战。
以本发明的核苷酸序列编码的抗原分子、RNA或更好是与MHC结合的抗原肽/蛋白质，当引入对象中产生对抗原的免疫应答。该抗原更好的是一个产生免疫性的分子，一个产生免疫性的分子片段，比如产生免疫性的蛋白质、肽或核糖核酸分子或其片段。
本发明的基于核酸的疫苗可以是单价的或多价的疫苗。在单价疫苗的构成中，核苷酸序列编码一个抗原分子，而在多价疫苗的构成中，核苷酸序列包含至少一个编码异源或同源抗原的多抗原的异源基因。因此用多价疫苗注入对象从而引进和呈递了多个抗原，造成激活和识别不同抗原的抗原特异性的T细胞。本发明也包括抗原序列的几个重复拷贝，比如，提供为两倍体或三倍体等。
本疫苗组分的核苷酸序列也包括其它免疫共刺激或调控的序列，比如编码具有免疫应答调节效应的蛋白质或肽分子的基因序列。共刺激的DNA序列，比如未甲基化的CpG基序也可包括在核苷酸序列中。
本发明所述的核苷酸序列更好但不限于的是，一起输入的裸露DNA或RNA，更好的方案是与基因修饰的APCs作为混合物输入。如果提供的为RNA序列，核酸序列也包括允许在对象(接受者)细胞中翻译的基序。同样，如果提供的为DNA，核酸序列包括基序，比如启动子、可能的增强子和/或其它调控核苷酸序列的转录和翻译的元素。
然而，编码抗原的核苷酸序列，更好是包括在一个具有启动子转录控制的载体中，比如，包括在含有表达控制序列的载体表达盒中。此外，载体或含有表达控制序列的载体更好是包括其它的核苷酸序列转录/翻译所需和要求的调控序列，包括但不限于多聚腺苷酸化(polyadenylation)序列，转录序列和增强子。载体中含有的启动子或增强子可以有细胞类型特异性或组织特异性。根据实验性设计或疫苗构建，启动子可是可诱导或有选择性地被激活。接种人体的适当的启动子例子包括病毒启动子，比如巨细胞病毒(CMV)启动子。本发明的载体可以是微生物载体或非微生物载体。
本发明所述的一个载体的例子是脂质体。多种阳离子脂质形式已被用于将DNA导入细胞。将聚乙二醇的衍生物插入脂类膜或脂质体，可能增加脂质体在静脉输注后的循环半衰期。
另一类被活跃研究的合成载体是阳离子聚合物。一般原则是在带正电荷的聚合物和带负电荷的DNA分子之间形成复合物。与阳离子脂类比较，阳离子聚合物对凝聚DNA是高效的。优选作为基因传递的聚合物例子是多聚L-赖氨酸、聚乙烯基亚氨(polyethylenimine(PEI)和多聚葡萄糖氨(polyglucosamines)和多聚脂质体(polylipid)。
并且，小颗粒，比如纳米颗粒(nanoparticles)也能作为本发明的载体使用。
本发明所述的更优选的载体是编码MHC结合抗原的DNA质粒载体。质粒DNA的骨架更好的是包含具有促有丝分裂活性的免疫调节序列或辅助因子。本发明所述的细菌DNA质粒载体的应用，无论是裸露DNA还是埋在脂质体或阳离子聚合物里，或小颗粒，提供了进一步的显著优势。这些质粒DNA载体也包括免疫刺激的CpG核苷酸序列。因此，除了在对象上传递和表达本发明的抗原，质粒载体还能刺激对象的免疫应答。
另外，病毒系统也能被用于传递和随后生产本发明的抗原或免疫调控分子。病毒是传递核苷酸序列有吸引力的载体，因为它们发展了进入寄主细胞和表达它们的基因的特殊和高效率的方法。在病毒载体发展中的主要挑战是安全问题。复制缺陷型病毒载体或复制型病毒载体目前都用于基因治疗。用病毒载体来进行基因传递称为转导。迄今在临床试验有至少四种类型病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒相关病毒。其它研究中的病毒包括痘病毒，呼吸道肠道病毒(reovirus)，lentive病毒，新城疫病毒，甲病毒属(alphaviruses)和多泡状口腔炎病毒，这些都可以作为载体供本发明所用。
本发明的APCs是专门对免疫系统处理和呈递抗原的细胞类型。本发明的APCs更好的是专职性APCs，包括但不限于DCs、IPCs、NIPCs、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、朗格罕氏(Langherhans)细胞、肥大细胞、T细胞、骨髓来源细胞、从干细胞分化的细胞、血管内皮细胞和/或各种各样的上皮细胞和骨髓间质细胞。混合至少两种类型的APCs也可用于本发明。目前更好的APCs类型是pDCs、IPCs、NIPCs或具有pDCs/IPCs/NIPCs特征，更好的特征是能表达TLR9和可诱导生产I型干扰素(IFN)。这些细胞在抵抗微生物时扮演重要的角色，并且它们能交叉激活宿主T细胞以及作为先天的和适应性免疫反应的联结。
本发明的树突状细胞子型更好的是pDCs/IPCs，有处理和呈递与MHC结合抗原的高能力，当装载病毒或细菌DNA时高水平产生I型干扰素，表达P2X7受体和toll-like受体，比如TLR9。
TLRs在宿主抵御感染时扮演重要角色。TLRs识别病原生物相关分子和负责激活宿主防御系统的信号，特别是促炎症细胞因子。因为针对CpG-DNA的细胞型应答是通过TLR9来调节的，所以TLR9对本发明是特别重要的。TLR9是在树突状细胞(DCs)和巨噬细胞的内质网(ER)上。TLR9不触发CpG-DNA的内吞作用而是激活DCs内吞作用的下游。
因此，本发明中的APCs优选自pDCs或其它具有上述特征和功能的APCs。
本发明所述的接种组分中的APCs是遗传修饰的APCs。因此，APCs被修饰而表达调控分子，比如，增强或抑制或诱导免疫反应的耐受或过敏的分子，诱导细胞凋亡和/或根据设计或接种策略的其它细胞生存调整反应。APCs也可以被修饰而增加抗原处理和呈递，激活APCs和/或提高效应细胞的免疫功能。因此，遗传物质被引进或转移入APCs，或者从附加体位置暂时性表达，或者整合到APCs的宿主基因组而稳定地表达，或提供作为一个稳定的染色体外的元素。用于修饰APCs适当的基因包括细胞因子基因、白介素基因、黏附分子、干扰素基因(比如，I型干扰素I IFN-a和IFN-b)，趋化因子基因、趋化因子受体基因、抗细胞凋亡基因和编码不同免疫共刺激分子、免疫调控的分子、配体(如CD40L)和受体并且药物中可接受载体的基因。
例如，CD40配体在参与适应性免疫反应中扮演重要角色。CD40已成为B细胞、单核细胞和DCs细胞功能的一个关键信号。在抗原刺激和与DCs共激活后，CD40L(CD154)表达在被激活的T细胞里。CD40-CD40L相互作用导致DCs的活化和分化。在CD40-CD40L活化时，DCs获取了诱导高水平生产细胞因子IL-12的能力，极化CD4+T细胞往Th1型发展，提高CD8+T细胞的增值和激活NK细胞。因此，CD40-CD40L互相作用作为触发用于适应性免疫反应中的共激动分子表达和有效的T细胞活化作用。因此，本发明的APCs能通过基因修饰而提供高效率的CD40表达或CD40L表达。
修饰APCs适当的基因传递方案包括但不限于病毒和非病毒方法。能用的病毒载体举例包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、胞疹和腺病毒相关病毒、牛痘病毒(vaccina virus)、单纯疱疹病毒和lentvirus。基因的非病毒传递入APCs包括但不限于质粒DNA转入，脂质体、电脉冲击(electroporation)微注射(microinjection)和微生物来源的载体和从微生物中获得的毒素。
此外，APCs更好地表达其它细胞表面分子包括但不限于对T细胞和其它类型的免疫细胞有效活化所要求的黏附分子和共激化分子。另外，本发明的APCs更好地表达趋化因子和趋化因子受体和FLIt3配体。
具体化，本发明的APCs可能从对象获得，更好的但不限于，给予组分接种的同样的对象，比如，使用自体同源APCs。选择地，也包括同源异体的APCs或同源的APCs(来自于对象的同一双胞胎)。
另一具体化，在体外或体内，APCs能通过本领域公知方法可选地被富集或被纯化和/或被扩增。例如，不限于，在细胞因子的存在下，从外周血液、脐带血或骨髓来源的干细胞和祖细胞激活和分化获得APCs。
在进一步具体化，疫苗组分被提供为包括编码外来抗原的核苷酸序列和基因修饰的APCs的预处理混合物。
在APCs摄进或内吞核苷酸序列后，核苷酸序列被处理。CpG基序更好的是包括在APCs中激活toll-like受体途径的核苷酸序列中，和刺激I型IFN-a和IFN-b的生产，以及呈递编码的抗原。这次事件可发生在核苷酸序列和修饰APCs的孵育期间，早于疫苗组分的注射。因此在孵育后，修饰的APCs、呈递MHC结合抗原和表达或分泌免疫共刺激分子，在给对象打入疫苗时可直接或间接地激活初始APCs。本发明所使用的修饰APCs可接着移居到淋巴腺器官，能直接地或间接地活化初始T细胞、B细胞和DCs，因此获得对抗外来抗原更加快速、增强的和更高效率的治疗和对外来抗原的保护性免疫反应。
因此，本发明所述的混合核苷酸序列和修饰APCs是对于获得疫苗的高效率的优先的和新颖的步骤。
此外，一旦注入对象中，核苷酸序列或含有核苷酸序列的载体将被对象的细胞吞进并在其中表达。随后，合成的抗原分子在细胞液内被蛋白酶体(proteasome)处理成多肽。
此外，在疫苗输入以后，专职性APCs可直接地获取抗原或从其他被转导的细胞中释放的抗原。本发明的转染载体或核苷酸序列的细胞溶解，导致释放编码抗原从而被APCs摄取。
本疫苗构成中编码抗原分子的核苷酸序列和(遗传)修饰APCs被提供和引入等渗溶液，优选为缓冲溶液，或引入药物上可接受的溶液、胶凝体，适用于注入对象，优选是人体。这样的溶液的一个例子是磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)。
本发明的接种溶液除核苷酸序列和APCs以外可包含附加的分子。这些附加分子包括调节分子(可以调节(提高或压制)对象的免疫反应，增加APCs的抗原呈递，刺激Th1或Th2细胞因子的分泌，激活APCs、朗格罕氏(Langherhans)细胞、效应细胞和/或提高APCs的免疫作用)，还包括细胞因子、黏附分子、热休克蛋白质和趋化因子，比如白介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TNFα、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、I型IFN-α，IFN-β，热休克蛋白质(hsp)70、hsp90、gp96、CD40L和B7，载体和佐剂。
溶液也可包括调控免疫反应的载体和佐剂，增加抗原呈递，再指导疫苗对应免疫系统和/或促进DNA进入细胞。佐剂包括，但不限于，矿物盐佐剂或矿物盐胶凝体佐剂、颗粒佐剂、毒素、微粒佐剂、黏膜佐剂和免疫刺激性佐剂。佐剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝胶凝、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、细菌超级抗原、角鲨烯或角鲨烯水包油(oil-in-water)佐剂形式、生物可降解和生物相容性聚酯、聚合脂质体、三萜系配糖或皂角苷、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏-D-异谷氨酰胺(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin)、LPS和单磷酸类脂A和非活性的微生物。
本发明的另一目标是在对象上使用疫苗产生免疫反应。在这种情况下，疫苗组分，包括编码抗原分子的的核苷酸序列和基因修饰的APCs，被用药于对象，更好的为哺乳类对象和更好的为人体。
在本发明的进一步体现是按照本发明所述注入对象所需的有效量的疫苗组分从而治疗和/或预防对象疾病的方法，更好的对象是哺乳动物，最好的对象是人体。
本发明同样指一种疫苗组分，含有编码抗原的核苷酸序列和基因修饰的APCs，用作药剂。在其它具体化，本发明教导了疫苗组分可用于生产治疗或预防传染病的药剂的用途，其中编码传染物质相关抗原的核苷酸序列是介入疾病的。而另一个具体化是疫苗组分可用于生产治疗或预防癌症的药剂的用途，该核苷酸序列编码由癌细胞表达的肿瘤相关抗原。
用于治疗或预防传染病的本发明的疫苗组分是由以下的传染物质导致的，包括但不限于，病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生生物。不管怎样，疫苗组分中含有编码与致病性微生物相关的抗原分子的核苷酸序列。此外，这个抗原分子更好地由被接种的对象的免疫系统识别为非己物。
病毒性疾病可通过本发明疫苗来治疗或预防，包括由以下病毒所引起的疾病：腺病毒、虫媒病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、刺病毒(echinovirus)、棘病毒(echovirus)、汉坦病毒(hantavirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹I型病毒、单纯疱疹II型病毒、阿氏病病毒(Aujeszky′s disease virus，ADV)、I型和II型HIV(HIVenv蛋白也能作为抗原分子)、流行性感冒病毒(NP抗原能作为抗原分子)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳头瘤病毒(papilloma)、乳多空病毒(papova)、骨髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(syncytial)、鼻病毒(rhinovirus)、牛疫(rinderpest)、引致腹泻的轮状病毒(rotavirus)、风疹病毒和水痘。
传染病也可用本发明的疫苗组分来防治和/或治疗，引起传染病的例子有：军团菌、分枝杆菌属(hsp65抗原可能被用作分枝杆菌结核病抗原分子)、菌质、奈瑟氏菌和立克次氏体。
本发明的疫苗组分可能也可治疗原生动物引起的疾病，包括由kokzidioa、利什曼和锥虫(trypanosoma)造成的疾病。但是相应的寄生虫病能由衣原体，疟疾寄虫、立克次氏体和利什曼主要鼠传染(抗原分子可能是LACK抗原)造成。
本发明的疫苗组分也很适用于预防和/或治疗癌症。疫苗中的核苷酸序列编码在特定癌症类型中与肿瘤相关的抗原分子。
许多癌症具有在癌细胞中基因或染色体易位的特征。这样的易位引起两个或更多编码序列或部分连接起来，然后形成杂交或融合蛋白或多肽。这样的杂交蛋白可能被病人的免疫系统识别为非自体，因此具有抗原性。一个最具特色的典型例子是易位造成癌症基因的杂交，是来自于费城(pH1)染色体易位，发生在慢性粒细胞白血病(CML)和急性淋巴母细胞白血病(ALL)的病人。在染色体22和染色体9之间的易位形成合成bcr-abl融合转录的费城染色体。在ALL中，断裂点发生在bcr基因第一内含子从而形成e1a2融合基因和产生具有致癌活力的一个185kDa酪氨酸激酶。
另外，许多癌症的特征是特定基因及基因产物的反常的表达。肿瘤相关抗原不但在肿瘤中而且在宿主的正常组织中表达。为了诱导一个有效的抗肿瘤的免疫应答，接种必须克服对自身抗原的免疫耐性。本发明的一个可选择方法是选用异种来源的抗原，比如，在DNA质粒载体中提供含有编码肿瘤相关抗原的核苷酸序列从而冲破对自身抗原的免疫耐性而诱导抗肿瘤免疫。另外，免疫系统中包含未从免疫系统发展过程中除掉的自身反应性T细胞和B细胞。自身反应的淋巴细胞可由在种类之间的交叉反应来触发。对小鼠自身抗原的交叉反应免疫可由在异源的DNA免疫后识别相应的人蛋白质的免疫来诱导。因此，为在对象内获得一个免疫反应，编码自身抗原的核苷酸序列更好的是提供在异源的载体中。比如，异源DNA质粒载体(包含异源序列、异种的基因序列、外来的基因序列)，为了打破对自身抗原的耐性，更好的是编码异源蛋白质和多肽的基因序列。
肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的非限制例子中，编码序列可用于在本发明的疫苗组分中，包括KS 1/4全癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，前列腺酸磷酸盐，前列腺特异的抗原，黑色素瘤相关抗原p97，黑色素瘤抗原gp75，高分子重黑色素瘤抗原，MAGE抗原家族，T细胞受体γ链可选择阅读码框蛋白(TARP)抗原，前列腺特异的膜抗原和e1a2融合蛋白抗原和bcr/abl融合蛋白。
治疗黑色素瘤、胰脏癌、乳腺癌和前列腺癌的疫苗目前被使用在临床试验中。与以前的癌症疫苗相比，对这些癌症类型使用本发明的疫苗组分会得到优越结果。进一步用本发明的疫苗组分治疗和/或防止非限定的癌症例子是以下类型癌症：人体肉瘤和癌，比如，成纤维瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨发生肉瘤、脊索瘤、血管瘤、肉皮瘤、淋巴血管瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌症、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头癌、乳头状的腺癌、囊腺瘤、髓心癌、支气管癌、肾脏细胞癌、肝细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜癌、松果体癌、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜胶质瘤、黑色素瘤，神经母细胞瘤和视网膜胚细胞瘤；白血病，比如，急性淋巴母细胞的白血病(ALL)，和急性髓细胞性白血病(成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红细胞)，慢性白血病(慢性单核细胞白血病、慢性粒细胞内的白血病和慢性淋巴细胞内的白血病)，原发性红血球增多症，淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病病)，多重性骨髓瘤，瓦尔登(Waldenstrm’s)巨球蛋白血症，重链疾病；病毒引起的癌症。
本发明的疫苗组分可用于消除已存在肿瘤或病原生物，治疗癌症或传染病。但是，疫苗组分也可能或供选择地用于保护对象，更好的对象是哺乳动物，最好的对象是人类，免受疾病遭遇或保护免受挑战或肿瘤细胞的复发或致病性传染物质(微生物)的复发。在这种情况下，疫苗被使用为预防癌症或传染病，例如，有预防疾病的特性。
过敏和超敏反应的不同的形式可由本发明来治疗，通过在载体中使用适当的编码抗原的核苷酸序列。序列的使用取决于过敏的类型，并且能由本行专业人士选择出来。例如，针对花生过敏症，载体可包含编码Arah 2抗原的核苷酸序列。
本发明的疫苗组分可被修饰而能治疗I型糖尿病，但不限于，包含编码胰岛素的全部或部分核苷酸序列。疫苗组分也可用于治疗老年性痴呆病人、不同的血液病、遗传性的疾病、移植相伴或获得的疾病及其获得性的免疫缺陷。
本发明的疫苗组分可被引入一个对象，更好的对象是哺乳动物，最好的对象是人类，使用适当的和临床可接受的接种途径，包括但不限于，皮下给药、肌内给药、动脉内给药、静脉内给药，血管内给药、口服，皮内给药，腹腔内给药，直接注入淋巴结内和注入肿瘤内。编码抗原分子的核苷酸序列和基因修饰的APCs更好的是在引入前预先混合，比如，引入本发明的疫苗组分的两个组分的混合物。
疫苗可通过所有常规手段引入，但不限于，包括注射器，管套针，导尿管，电穿孔，无针引进等。
引入的剂量取决于受治疗或接种的对象的状况和大小以及引入疫苗组分的数量，引入频率，引入路线，疗法的类型，比如治疗和/或预防，被治疗或被接种的疾病类型。继续的治疗方案，包括部位、药量和频率可由对象的最初的反应和临床评断来决定。然而，在癌症的治疗上，更好的是给予至少三次重复性接种。所用的疫苗组分的使用量可由本领域熟知的方法运用在动物的药量反应试验的结果来确定。
另外本发明的另一方面是提供用本发明的接种方法来制备的试剂盒。第一具体化试剂盒包括一个含有编码抗原分子的核苷酸序列和基因修饰的APCs混合物的容器。抗原分子更好地同疾病，如传染病或癌症关联在一起，通过注入试剂盒的内容对对象进行治疗或预防，更好的对象是哺乳动物和最好的对象是人类。
其它具体化试剂盒包含第一容器，包括制备编码一个抗原分子的核苷酸序列，以及第二容器，包含遗传修饰APCs的制品。在引入对象前，更好是将第一和第二容器的内含物交互混合，即将第一容器的内含物加入到第二容器的内含物，或者将第二容器的内含物加入到第一容器的内含物里或将第一和第二容器的内含物单独地加入到所提供的第三个供混合的容器内。混合物在注入对象之前可在一起孵育，更好的对象是哺乳动物和最好的对象是人类。
本发明的试剂盒包含疫苗组分，配药构成(治疗或预防疾病或紊乱(disorder)，比如传染病、癌症、自身免疫疾病、过敏或糖尿病)。试剂盒中至少有一个容器，更好的是容器中含有基因修饰的APCs容器，也可包括另外的物质和佐剂，可增加APCs的抗原呈递，激活APCs和/或提高APCs的免疫功能。
本发明进一步的目的是提供生产疫苗组分的方法。如图1的流程图所示，在步骤S1，提供一个编码抗原分子的核苷酸序列(诱导对抗一个所希望的免疫反应)。在步骤S2提供了基因修饰的APCs，如DCs、pDCs、IPCs、巨噬细胞、单核细胞和/或B细胞。在步骤S3，核苷酸序列和APCs混合从而完成本方法和结束本发明的疫苗组分的生产。
图2更具体地说明在图1中步骤S1的核苷酸序列的提供。在可选步骤S11，编码与疾病或紊乱相关的抗原分子的核苷酸序列被鉴定和分离，这些疾病或紊乱是由疫苗组分来治疗或预防的。该鉴定以及至少部分的鉴定可用本领域所知的MHC-结合肽基序查询。本领域所知的方法，包括化学合成DNA序列和PCR(聚合酶链式反应)，可用于获得相关的核苷酸序列。然后在步骤S12，鉴定和分离所得的核苷酸序列被克隆进合适的载体。载体是经选择适应于引入对象而且一但进入对象，能表达核苷酸序列，随后得到希望的抗原分子。所获的载体然后被繁殖在步骤S13，即在寄主细胞内，体外(in vitro)等。
图1中提供APC的步骤S2在图3中有较详细的说明。在步骤S21中，分离APCs更好是从接受疫苗组分的对象上取得或前述的其它来源中取得。在该步骤S21，一个特别有利APC亚类，比如DCs或DC亚类，可被选择和分离。在步骤S22，APCs是被(遗传)修饰过。在这种情况下，引入一个或几个基因，比如CD40L基因，编码调节免疫反应分子的基因，基因可作为额外染色体元素或被插入APCs的染色体上而进入抗原呈递细胞。
在图4中进一步S31步骤中，另有物质加入了载体-APCs混合物中。这些物质至少包括细胞因子、黏附分子、趋化因子、热休克蛋白和前面所提的一般调节接受疫苗组分的对象的免疫反应和免疫细胞和/或提高效应细胞和APCs的免疫作用的佐剂。核苷酸序列和修饰APCs的混合物也可能加上另外的物质，更好是在步骤S32作为疫苗使用之前预先孵育，孵育的物理条件可以由本行业专业人士决定。为了提高核苷酸序列的被内吞，孵育更好持续至少5分钟，更好至少几个小时。孵育时间由其它生理因素典型地表明，比如孵出温度。通常，过夜，例如至24小时是适当的，但不限于，直到孵出时间为限。温度在孵育期间是更好的是至少4℃，最好为室温(约20-25℃)或约37℃。孵育溶液的酸碱度更好是中性或轻微酸性。为了提高内吞作用更好是通过共离心法将核苷酸序列(质粒)和APCs被迫的结合在一起。或者用其他的技术，或者增加其他的技术，比如脂质转染试剂。
以下是用本发明的疫苗组成接种来对抗急性白血病的例子。因此，核苷酸序列编码的抗原分子是同该类型癌症相关的。但是，本领域应知本发明并不局限于这个特殊的疾病和抗原而可被用于治疗和/或预防上面所提的任何疾病或紊乱。
实施例
本发明的疫苗组分与各种各样的其它接种方法比较，包括用抗原肽和编码的抗原肽质粒DNA来接种。
细胞系
A20(H-2d)是从BALB/c小鼠上获得的B细胞淋巴瘤细胞系，在本发明研究中用作CTL靶。A20细胞表达B220、MHC-I、MHC-II和CD19分子。
肿瘤细胞(BM185wt，H-2d)是小鼠急性白血病细胞系(pre-B ALL)。它是用编码人的一个185 kDa bcr/abl致癌蛋白的反转录病毒载体转导BALB/c小鼠骨髓细胞而建立的(Cell 1995，82：981-988)。BM185wt细胞在其细胞表面表达B220、CD19和MHC-I分子。
D2SC/wt细胞(或D2SC/1)是由Paola Paglia博士热心提供的。本发明中所使用D2SC/wt，(H-2d)是从BALB/c小鼠脾脏树突状细胞经过反转录病毒无限增殖而获得的。(J.Immunel.Methods 1994，174：269-279)D2SC/wt细胞大多显示发育未全的DC形态，免疫表型和功能属性，包括MHC组II分子的组成性表达(低)、共刺激分子B7/BB1，热稳定Ag，和ICAM-1，和具有有效的Ag呈递功能(J Immunol Methods.1994，174：269-279.，J.Immunol.1999，162(7)：3757-3760)。
RMA-S是TAP2缺陷的肿瘤细胞系。它是从来自B6小鼠用劳舍尔氏(Rauscher)白血病毒诱导的T细胞淋巴瘤RBL-5而建立(Nature(London)1986，319：675-678)。
细胞培养
DCs细胞培养于IMDM培养基而且加有10％热灭活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.，Scotland，UK)，2mM L-谷氨酸盐，100IU/ml青霉素/链霉素，10mM hepes和5×10-5M 2-巯基乙醇。细胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的湿润空气中。
肿瘤细胞培养于RPMI-1640培养液(ICN Biomedicals，Inc.Costa Mesa，CA)添加热灭活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.Scotland，UK)，2mM L-谷氨酸盐，100 IU/ml青霉素/链霉素，10mM hepes，0.1mM丙酮酸钠，5x10-5M 2-巯基乙醇和10mM非必需氨基酸。细胞被孵育在37℃和5％二氧化碳的湿润空气中。
MHC-结合肽基序的搜索合成
ALL特异性的e1a2融合蛋白的氨基酸序列用于筛选对小鼠MHC-I抗原(H-2Kd)的结合力(表I)(来自Kenneth Parker博士研制的HLA多肽结合预测程序，http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)。一个九氨基酸序列，AFHGDAEAL，位于e1a2融合蛋白的连接点区域(表I和图10)，对结合小鼠H-2Kd显示有高的计分。覆盖e1a2微型蛋白多肽由标准方法合成和由高压液相色谱(HPLC)纯化。在实验中所使用的是高计分结合肽(AFHGDAEAL，SEQ ID NO：5，看作为e1a2肽)和低计分结合肽(HGDAEALQR，SEQ ID NO：6，看作为肽8)。肽K(ATGFKQSSK，SEQ ID NO：7)与H-2Kd不结合而用作为控制肽。
以下的表I说明用肽结合预测程序来搜索HLA-肽基序的结果，以及所用的使用参数计分在500之上被认为非常高计分的结合。
表1
| 使用参数和计分信息 | ||||
| 限制数字结果的选择方法请求的结果数字选择的HLA分子类型亚序列计分的选择长度为输入序列选择的回声模式回声格式用户输入肽序列的长度亚序列计分计算的数字首位计分的亚序列在计分输出量表上回报的数字 | 明确数字20Kd9Y编号的行1799 | |||
| 计分的结果 | ||||
| 等级 | 开始位置 | 亚序列残基目录 | 计分 | |
| 123456789 | 379285146 | AFHGDAEALDAEALQRPVEALQRPVASGAFHGDAEAAEALQRPVAHGDAEALQREGAFHGDAEFHGDAEALQGDAEALQRP | 1152.00014.4002.0001.4400.1200.1200.1000.0120.012 | |
遗传修饰DCs
基于反转录病毒来进行基因转导的系统已被开发了。反转录病毒的前病毒经处理而除去所有的gag、pol和env基因，仅保留下3′-和5′-LTRs。有缺陷的反转录病毒载体可从包装细胞系的上清液中获得。
在本发明中，反转录病毒载体(参见图5)，(从MFG-mGMCSF包装细胞系中获得(Dr.Richard Mulligan馈赠，Children’s Hospital，Harvard Medical School，USA))和Moloney小鼠白血病病毒载体(MoMLV)，(PG1a.muCD40L(Dr.M.Brenner馈赠，Baylor College ofMedicine，USA))用于修饰DCs。
本发明所使用的DCs被修饰后释放GM-CSF或在其细胞表面表达CD40L分子。使用muCD40L或MFG-mGMCSF反转录病毒载体将CD40L基因或GM-CSF转入DCs。本发明所使用的DCs被修饰后释放GM-CSF或在其细胞表面表达CD40L分子。在凝聚胺(polybrene)(10μg/ml，Sigma)存在下，D2SC/wt细胞由重复性的自旋离心来转导。简言之，105个细胞悬浮在0.5ml病毒上层清液和凝聚胺中，细胞和病毒共离心，10000rpm，在室温下进行60分钟。离心后，上层清液被除去并将细胞悬浮在新的培养液中，细胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的湿润空气中，24小时后再进行第二次转导。DCs转导效率因重复的离心而明显提高。多轮的转导后，表达CD40L分子的细胞的相应百分比在图6中说明。
在重复转导后，约70-80％的DCs表达CD40L转基因。D2SC/CD40L细胞进一步由转基因的表达而被筛选。并且大约96％的DCs表达CD40L基因产物。CD40L基因表达多年保持稳定，且即使在重复性解冻-结冰操作后依然稳定。DCs在它们的细胞表面明确表达了CD40L。看下面的图6。
根据厂商的说明书(CytoscreenTM，immuneassay kit，Biosource Int.，California，USA，BD Bioscience，U.S.A)，由ELISA方法来评估在D2SC/wt以及CD40L和GM-CSF基因转导后的DCs细胞培养上清液中IL-12、GM-CSF、IFN-γ的产生。在D2SC/GM-CSF细胞细胞培养上清液中GM-CSF分泌是11，370pg/ml/106细胞/24小时。
D2SC/wt和基因修饰的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF DCs肿瘤细胞的免疫表型特性描述
细胞与小鼠抗表面分子的单克隆抗体一起培养(2×105细胞/0.5μg mAbs，BD，Pharmingen，San Diego，CA)。以下的mAbs被使用了：CD40-FITC(异硫氰酸荧光素共轭的mAB)，CD40L-PE(巯基化藻红蛋白)，I-A-FITC，H-2Kd-FITC，B7.1-FITC，B7.2-PE，CD 11c-FITC，CD8α-PE，B220-FTIC，B220-PE，Thy1.2-FITC，Thy1.1-PE，IgG1-FITC，IgG2-PE。细胞表型在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上分析。
肿瘤细胞的免疫表型(BM185/wt)在图7A中说明。BM185细胞在它们的细胞表面表达B220，CD19和MHC-I，I-A分子。但是，BM185wt细胞缺乏共刺激分子和CD40分子的表达(数据未显示)。
B220分子在D2SC/wt细胞的表达在图7B中可见。因此D2SC/wt细胞表达标记物(markers)，CD8a+，CD11c+(见图8)；B220+，被视为小鼠DCs子类型，血浆细胞状树突状细胞(pDCs)的典型标志。
亲代的D2SC/wt细胞和基因修饰的树突状细胞免疫表型(D2SC/CD40L)的比较及其说明可见图8。亲代的D2SC/wt细胞具有发育未全的DC表型和在它们的细胞表面表达MHC-1，I-A，CD8α、CD11.c、B7.1和B7.2，正如图所示，但是缺乏CD40配体的表达。与之相比，在D2SC/CD40L细胞里CD40L是明确表达了。但是，在D2SC/CD40L细胞培养液中IL-12的分泌未查出。D2SC/CD40L细胞体外(inv itro)成长动力学与它们的亲代细胞相似(数据未显示)。
蛋白质印迹法(Western Blot)
根据制造商的说明书(Sigma)，DCs被溶解在缓冲液里，含有1％NP40、0.1％SDS、TBS和蛋白酶抑制剂的混合剂(cocktail)中。在4℃下，细胞在缓冲液中用超声波处理。在经过5000rpm、5分钟、4℃离心后，收集可溶蛋白质并用蛋白质印迹法来分析。根据制造商的说明书(BioRad，USA，Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)，蛋白质在12％SDS聚丙烯酰胺凝体中分离并转移在PVDF滤纸上。初级的多克隆抗体，兔抗小鼠TLR9(Cat.No IMG-431，Imgenex，San Diago，USA)，在TBS缓冲中1∶1000稀释后用(10mM Tris-Cl and 150mM NaCl，pH 8.0)。次级抗体是与辣根过氧化物酶(HRP)共轭的羊抗兔抗体。在图9中说明本发明中的DCs表达小鼠TLR9受体。
D2SC/wt细胞是从脾脏中分离出的功能完全而发育未成熟的树突状细胞。D2SC/wt细胞表达一些熟知的标记物，比如在一种DCs亚类即pDCs上发现的CD11c+，B220+，CD8α+，MHC-IIlow，TLR9+标记。另外，当与病毒、细菌和CpG DNA相互作用时，D2SC/wt细胞释放很多I型干扰素-α和干扰素-β。由在原位杂交研究可检查出D2SC/wt细胞表达极高拷贝数目的I型干扰素mRNA(Scand.J.Immunol.1997，46：235-41；ElorantaML.，et al unpublished data)，从而得出D2SC/wt细胞是在小鼠中相当于假定的人体自然干扰素产生细胞而且是树突状细胞的一种pDC/IPCs子类的结论。
质粒DNA载体
最近的研究表明，空的质粒pcDNA3载体骨架包含一定数量的非甲基化的CpG基序。(Science 1996，273：352-354)通过猪的白细胞和质粒pcDNA3的孵育，在猪的白细胞中诱导高水平的干扰素-α和IL-6的产生。使pcDNA3的CpG二核苷酸上所有胞苷甲基化，则废除了诱导干扰素-α产生的能力(Vet Immunol Immunopathol.200，78：45-56)。
pVAX-1是根据FDA的推荐而从pcDNA3.1载体修改而构建的(Invitrogen，CA，USA)。pVAX-1是一个3.0kb的质粒载体，为开发人的癌症疫苗而设计。
克隆编码e1a2融合肽的微基因进入含有CpG基序的质粒载体
为放大核苷酸序列而设计PCR引物，该核苷酸序列编码预定的与MHC-I类型结合的e1a2融合肽。微基因的生产以补平反应开始(Pharmacia)，使用了以下重叠的引物：5’-TGCTAGCATGATCTGGCCCAACGACGGCGAGGGCGCCTTCCACGGCGACGCCGAGGCCCTGCAGCGC-3’(见SEQ ID NO：1)和5’-AATCGATCACAGGCCCTGGGGCTCGAAGTCGCTGGCCACGGGGCGCTGCAGGGC-3’(参见SEQ ID NO：2)。根据制造商的推荐，除上述两引物外，反应混合物包括Klenow片段(大肠杆菌DNA聚合酶I)、dNTPs和酶缓冲液。反应在室温下进行1小时，接着使用同样引物进行PCR反应，加入PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs，操作为95℃、1分钟，随后35个周期，每个周期为95℃、30秒，65℃、30秒和72℃、30秒。获得的PCR片段被分离和最初地被克隆进入pUC19质粒载体的Nhe I/Cla I位置(NewEngland BioLabs)。Nhe I/Cla I片段然后被插入pBK-CMV质粒载体(Stratagene)。在pBK-CMV含e1a2融合微基因的Nhe I/Kpn I片段最后被克隆入pVAX-1质粒载体(Invitrogen，CA，USA)的Nhe1和Kpn1位置。一旦插入载体，e1a2融合微基因置于CMV启动子的控制下。pVAX-e1a2结构由DNA消化和DNA测序所证实。根据制造商的说明书，用Qiagen EndoFree Plasmid Maga Maga kit放大质粒(Qiagen，Santas Clarita，CA，USA)。质粒DNA纯度由UV分光光度测定法和agarose胶凝电泳法来确定。纯化的DNA以OD 260nm/OD 280nm吸收比率大于1.9是可用的。
空的pVAX-1载体和含编码微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列的载体pVAX-e1a2的图见图10。微型e1a2融合基因序列和对应的多氨基酸序列被分别显示在SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
由一个体外转录联结翻译的分析法(TNT，Promega)测试pVAX-e1a2质粒结构所生产的产物大小。约1μg质粒DNA以50μl体积孵育2小时，30℃，该混合物包含25μl兔网状细胞溶解物、2μl TNT反应缓冲液、1μl TNT T7RNA聚合酶，1μl的1mM氨基酸减去甲硫氨酸的混合物，4μl(35S)甲硫氨酸10mCi/ml和1μl的40U/μl的RNA RNAasin核醣核酸抑制剂。取3μl容量的反应物装载于16％SDS聚丙烯酰胺胶凝上。在烘干以后，胶凝体暴露于放射自显影的照片。结果在图10表明，e1a2融合蛋白只出现于pVAX-e1a2而不出现于空的pVAX-1。另外，用Lipofectin试剂转染后，pVAX-e1a2转录在COS-7细胞系被检测到(数据未显示)。总之，pVAX-e1a2质粒DNA，含96bp核苷酸序列跨过e1a2基因的融合区域，被转录和表达在转染的细胞中。
幼稚T细胞的激活
从脾脏制备单细胞的悬浮液。从BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠脾脏分离T细胞。从C57BL/6J小鼠脾脏用Percoll梯度所富集的T细胞作为同种异体T细胞的来源。根据制造厂家的说明书，从BALB/c小鼠使用MACS CD4或CD8 microBeads来分离纯化CD4+或CD8+T细胞(Miltenyi Biotec，Germany)。刺激者(DCs)在辐射(50Gy，从137Cs)后用分级的量添加进人反应细胞(脾脏细胞或T细胞，2×105细胞/孔)在96-孔园底的微板上执行(Becton，Dickinson)。实验一式三份执行在最终容量为200μl/well。增殖化的测量由在第三天加入[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(1μCi/孔)(Amersham International，Amersham，UK)，培养6小时，随后收获到glass-fibre滤纸和放入闪烁计数器(Beta counter，Pharmacia)来执行。
基因修饰引发了未成熟的DCs刺激T细胞的能力
作为一种未成熟的DCs，非修饰D2SC/wt细胞是差的T细胞刺激者。因此，比较了D2SC/wt和D2SC/CD40L刺激天然的同种异体T细胞增殖的能力。在图11A说明，与非修饰亲代DCs(D2SC/wt)比较，CD40L基因修饰的DCs(D2SC/CD40L)刺激同种异源T细胞增殖是高8倍。
D2SC/wt与D2SC/CD40L诱导天然的自体同源T细胞增殖的能力进行了比较。在图11B说明，与非修饰亲代DCs(D2SC/wt)比较，CD40L基因修饰的DCs(D2SC/CD40L)刺激自身的T细胞增殖是高4倍。DCs被修饰而释放GM-CSF(D2SC/GM-CSF)也可导致强的自体同源和自身T细胞增殖(数据未显示)。因此，在DCs上CD40配体表达是具有功能活跃的和参与了T细胞的刺激。明显地，D2SC/CD40L细胞可获取了在体内注射后直接敏化自身T细胞的能力。在皮肤下注射后，发现DCs迁移入脾脏和淋巴结(数据未显示)。
肿瘤抗原的制备
自体的肿瘤溶胞产物是从BM185/wt细胞制备来的。肿瘤细胞被几次重复性结冰(液氮)-解冻(37C热水浴)的周期处理。肿瘤细胞裂解物进一步被超声波处理4℃30分钟。细胞残骸用2500rpm，10分钟，4℃离心法去掉。收集可溶性蛋白并且由Bradford方法确定蛋白质含量(Protein Assay，Bio-Rad，CA，U.S.A)。
用肿瘤抗原或肿瘤抗原肽来脉冲DCs
DCs和肿瘤细胞裂解物(100μg/106 cells)在37℃，7％二氧化碳中预先孵育过夜。用PBS/5mM EDTA将DCs是从培养瓶分开并在注入小鼠之前仔细地洗涤。在肽脉冲实验中，106细胞与10μM肽在未含FCS培养液，37℃，5％二氧化碳中脉冲2小时。
用疫苗组分免疫
雌性BALB/c小鼠(H-2d)，年龄6-8星期，购自M&B(丹麦)，并且养在Uppsala大学标准条件的动物所内。所有动物实验按照动物护养委员会的要求执行(ref.nr.C63/97，C36/1)。
在致瘤性研究上，免疫活性的同源小鼠可实行皮下注射(s.c)增长剂量的BM185/wt细胞。在6-8星期老年小鼠上注射500个肿瘤细胞，在3-4星期内导致100％死亡(参见上面的图14)。注射用致死量(800个肿瘤细胞/小鼠)通常为目前的研究所采用。
寻找有效的消除肿瘤派生所需基因修饰的DCs最小剂量。在免疫前用肿瘤细胞裂解物隔夜装载DCs。用106D2SC/CD40L细胞单一接种发现有效治疗长有肿瘤的小鼠，见图12.A。
长有肿瘤的小鼠被治疗一次(在肿瘤点或在一个远位置)用肿瘤细胞裂解物脉冲D2SC/CD40L(p＜0.001)或D2SC/GM-CSF细胞(p＜0.001)。用CD40L或GM-CSF基因修饰的DCs免疫诱导有效的抗肿瘤免疫反应。在图12B显示，单一接种已能充分根除已存在肿瘤细胞并且所有被治疗的小鼠肿瘤消除(100％)。本结果代表四个重复的实验当中一个。
诱导的抗肿瘤免疫反应与在体内同产生肿瘤特异性细胞毒素的T细胞(CTLs)联系在一起的。在体外增生的CTLs专杀亲代BM185肿瘤细胞(图13A)，但不杀同源的A20肿瘤细胞系(图13B)。
这些研究表明，在长有肿瘤小鼠上，遗传修饰的DCs、D2SC/CD40L细胞具有刺激有效的治疗免疫反应的能力。
图14中说明本发明使用的用于治疗和预防接种的长有肿瘤小鼠模型例子。
质粒DNA和DCs的预孵育
为了提高质粒对DCs的结合和促进质粒DNA内吞入DCs，发展了共离心法。简言之，在细胞培养瓶里，基因修饰的DCs生长在适合的密度，用PBS/5mM EDTA解离37℃20分钟。收集DCs和用PBS(未含Ca+，Mg+)洗涤并且悬浮在PBS中。质粒DNA(1mg/ml)加到107DCs/ml。它们被共离心，10000rpm，室温30分钟。在离心后注射小鼠之前，质粒DNA/DCs混合物被孵育额外的3小时，在37℃、7％二氧化碳中。
CTL分析
在接种治疗后，为了调查细胞毒T细胞(CTLs)在体内的发展，从正常或接种的小鼠中分离脾脏和淋巴结(LN)。纯化T细胞由Percoll梯度方法或根据制造厂说明书的磁性活化细胞分选法(Miltenyi Biotec，Germany)用MACS CD4或CD8 MicroBeads来分离。在加有rhIL-2(10ng/ml)下用BM185/wt(200Gy，137Csγ--辐射)或BM185/CD40L(200Gy)再刺激T细胞5-7天。在常规4小时51Cr释发细胞毒分析，死细胞被去除而活细胞被用为效应器。简言之，靶细胞先被51Cr标明(25μCi/106细胞)在37℃为2小时。活效应细胞与预先标记的目标细胞在不同的效应细胞-目标细胞(effector-to-target)比率下孵育了4个小时。由51Cr释放入培养液来测量细胞溶解，该结果代表三份重复样品。
根据以下公式计算特异性溶解的百分比：
伴刀豆凝集素A(Con A)激活的T胚细胞
在对照实验中，从正常小鼠分离的脾脏细胞以2×106细胞/ml孵育48小时，在RPMI1640培养基中含有青霉素/链霉素，10％FCS，10mM Hepes，3×10-5M 2-巯基乙醇和3μg/ml ConA(Sigma)。Con A激活的T胚细胞用为抗肿瘤细胞的效应细胞(负对照)。
统计分析
所有动物实验以每组至少有五个或十个动物。所有的研究被重复了至少三次得以近似结果。分析生存区别是以卡方检验(Chi-square test)来解释实验小组之间区别的意义。
DNA和DCs接种效率的调查
在0天，各只小鼠右侧面(5小鼠/组)皮肤下注入有致死剂量的亲代BM185/wt肿瘤细胞。在7、14和21天，在小鼠肿瘤点免疫接种了(1)PBS；(2)空的pVAX-1载体(100μg/小鼠)；(3)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(4)D2SC/CD40L单独没有抗原；(5)经预先孵育的pVAX-e1a2质粒DNA和D2SC/CD40L细胞(106细胞/100μg质粒DNA/小鼠)。肿瘤大小每星期检测两次。当肿瘤检测到时，认为小鼠是在生存终点和被牺牲了。
尽管在质粒载体的骨架里含有可能免疫刺激的CpG基序，单独用空的pVAX-1载体或pVAX-e1a2载体治疗长有肿瘤的小鼠，结果没有消除已存在的肿瘤。在没有肿瘤抗原的情况下，用D2SC/CD40L细胞治疗长有肿瘤的小鼠，结果没有消除肿瘤。相反，共同送递pVAX-e1a2载体和D2SC/CD40L细胞表现出优越的抗肿瘤效果。以pVAX-e1a2和D2SC/CD40L细胞接种导致100％高效率消除在所有被治疗的小鼠原有的肿瘤细胞(p＜0.01)。
进一步调查所诱导的抗肿瘤免疫应答保护小鼠免受亲代肿瘤细胞再挑战的能力。最后接种以后的一个星期，在一个远点位置将致死剂量的亲代肿瘤细胞注入肿瘤已消除的小鼠。图15显示，用pVAX-e1a2载体和D2SC/CD40L细胞多次性的治疗长有肿瘤的小鼠，结果发展了高效率的抗肿瘤免疫应答足以保护小鼠免受肿瘤细胞再挑战，大约80％小鼠被保护了并且保持无肿瘤存在(结果代表三个重复实验当中的一个)。
用本发明疫苗免疫接种、pVAX-e1a2和DC/CD40L引起在体内产生可杀死肿瘤细胞的肿瘤特异性的T细胞。分析从肿瘤已消除的小鼠上分离的T细胞。体外培养的CTLs特异地杀死亲代BM185肿瘤细胞。这些肿瘤特异性的CTLs只识别e1a2肽，但不识别装载RAM-s细胞的与MHC低亲合力结合的肽8，(图16)。
比较不同接种的组成
本发明的疫苗组分的效力将与其它接种方法比较，治疗长有bcr/abl阳性肿瘤的小鼠并且保护小鼠对抗亲代肿瘤细胞的再挑战。在0天，小鼠右侧面(5小鼠/组)皮肤下注入有致死剂量的亲代活BM185/wt肿瘤细胞。在7、14和21天，在肿瘤位置为小鼠免疫接种(a)PBS；(b)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(c)e1a2肽(AFHGDAEAL，10mM/小鼠，SEQ ID NO：5)；(d)D2SC/wt细胞与e1a2肽脉冲(106细胞/10μM/小鼠)；(e)D2SC/CD40L细胞与e1a2肽脉冲(106细胞/10μM/小鼠)；(f)D2SC/CD40L细胞与低结合的MHC肽脉冲(HGDAEALQR，106细胞/10μM/小鼠)；(g)D2SC/CD40L细胞与从BM185细胞获得的肿瘤溶解物脉冲；(h)预先孵育的D2SC/CD40L细胞和pVAX-e1a2质粒DNA(106细胞/100μg/小鼠)。在免疫保护研究上，在最后接种以后的一个星期，用有致死剂量的亲代的活BM185wt肿瘤细胞在肿瘤已消除的小鼠的左侧面再挑战。肿瘤大小每星期检测两次。当肿瘤可检测到时，认为小鼠是在生存终点和被牺牲了。实验被重复了三次并且结果代表这些实验当中的一个。
本发明的疫苗组分(预先孵育的D2SC/CD40L细胞和pVAX-e1a2质粒DNA，填装圆点)是最有效的消除原有的肿瘤治疗方法(p＜0.01)，所有被治疗的小鼠不存在肿瘤(100％)。调查了由接种引起的保护宿主免受肿瘤攻击的免疫应答的效力和容量。在一个远点位置将有致死剂量的亲代活肿瘤细胞注入肿瘤已消除的小鼠。用pVAX-e1a2载体和D2SC/CD40L细胞多次性的治疗长有肿瘤的小鼠，结果发展了高效率的抗肿瘤免疫应答足以保护小鼠免受肿瘤，约80％小鼠被保护了并且在肿瘤细胞再挑战之后保持几个月无肿瘤存在(p＜0.01)，参见图17。
与以前的研究一致，接种用pVAX-e1a2，或e1a2肽，或D2SC/CD40L细胞，与肽脉冲，对MHC-I有低亲合力，不能根除小鼠的肿瘤。
D2SC/CD40L细胞与MHC-I类结合肽脉冲明显地提高了肿瘤抗原呈递。用装载了e1a2肽的D2SC/CD40L治疗长有肿瘤的小鼠结果引导了抗肿瘤免疫，但是，这个方法与用本发明的疫苗治疗长肿瘤的小鼠的方法比较有低于2倍的效率。
本疫苗组分pVAX-e1a2和DC/CD40L的优越效力，也强调了本疫苗组分的关键元素。除抗原之外，pVAX-e1a2质粒DNA包含CpG基序。CpG基序已知可通过TLR9途径刺激和激活DCs，结果产生I型干扰素。D2SC/wt和D2SC/CD40L细胞被发现含有TLR9。而且早期的研究表示，在受病毒和细菌刺激以后，D2SC/wt细胞释放I型干扰素-α和干扰素-β。
因此，与用注入D2SC/CD40L细胞与肿瘤抗原肽脉冲方法比较，用本疫苗组分治疗长有肿瘤的小鼠，有体内有产生I型干扰素以及质粒骨架里的CpG-基序刺激免疫反应的可能性，贡献出优越效应(图17)。
在用不同接种方案之后引发肿瘤特异性的和肿瘤抗原肽特异性的CTLs
用本发明疫苗免疫接种在体内引起可杀死肿瘤细胞的肿瘤特异性的和e1a2肽特异性的T细胞。为T细胞的体外刺激，Cs或肿瘤细胞先与e1a2肽脉冲然后幅射而作为刺激者。T细胞从肿瘤挑战后无肿瘤小鼠上分离出来，T细胞与这些DCs或肿瘤细胞共刺激七到十天。收集细胞培养上清液并存放于-80℃，用于分析细胞因子的分泌。活细胞(80％CD8+T细胞)用作CTL检测中的效应细胞。
测试在体外形成的CTLs溶解肿瘤细胞的能力。治疗长肿瘤的小鼠(a)PBs；(b)e1a2肽；(c)pVAX-e1a2；(d)D2SC/CD40L细胞与e1a2肽脉冲；(e)D2SC/CD40L细胞与肿瘤溶解物脉冲；(f)预先孵育了的D2SC/CD40L细胞和pVAX-e1a2质粒DNA。然后从亲代肿瘤细胞攻击后的小鼠分离T细胞。用被肿瘤抗原(裂解物或e1a2肽)装载的DC/CD40L或预先孵育了的D2SC/CD40L细胞和pVAX-e1a2质粒治疗后，在肿瘤已消除的小鼠激发抗肿瘤免疫(图18.A)。另外，在CTLs培养上清液(在6天)查出了IFN-的分泌，见表II。
表II
| 疫苗组分 | IFN-γ(ng/ml) |
| 正常(控制)PBSe1a2肽pVAX-e1a2D2SC/CD40L/e1a2肽D2SC/CD40L/lysate(裂解物)D2SC/CD40L/pVAX-e1a2 | 1.52.96.14.515.22321.5 |
用肿瘤肽和含肿瘤肽的质粒治疗小鼠，未导致肿瘤特异的CTLs产生。相反，用pVAX-e1a2质粒DNA载体和DC/CD40L重复接种，导致一个强烈的肿瘤特异的CTL反应，同时导致一个治疗效应。
肿瘤特异性的CTLs识别由本发明的疫苗组分呈递的肿瘤肽
调查肿瘤特异性的CTLs杀死肽脉冲的靶细胞的能力。将e1a2肽装载上TAP缺陷的RMA-S细胞。因RMA-S细胞缺乏装载它们自己的MHC-I类的能力。因此RAM-S细胞与e1a2肽脉冲后，e1a2肽是存在于细胞表面唯一的肽。用肿瘤抗原(肿瘤溶解物或e1a2肽)装载DC/CD40L和孵育了的D2SC/CD40L细胞和pVAX-e1a2接种之后，在无肿瘤小鼠上产生的CTLs识别RAM-S细胞呈递的e1a2肽(图18B)。肿瘤肽特异性的CTLs不杀死亲代RMA-S细胞(没有装载肽，数据没显示)。结论是，由接种而在体内引起的抗肿瘤免疫是肿瘤抗原特异性的，并且直接对抗亲代BM185肿瘤细胞。
接种后引发的e1a2肽特异性的CTLs频率
在rhIL-2(25ng/ml，R&D，UK)存在的情况下扩展e1a2肽特异性的CTLs，通过将纯化的T细胞(含90％CD8+细胞和10％CD4+细胞)与e1a2肽脉冲过的D2SC/CD40L细胞(50Gy)共刺激。在七天刺激以后，约85％T细胞是CD8+T细胞(图19)。
运用DimerX肽呈递方法(BD Bioscience，U.S.A)去研究体外肿瘤肽，e1a2肽特异性的CTLs频率。简言之，H-2Ld:Ig与肽(e1a2肽或肽8)混合在160摩尔过量在37℃隔夜培养。CD8+T细胞悬浮在106细胞/50μl中。从肽装载H-2Ld:Ig蛋白复合物中取2μg加入到T细胞中，在4℃孵育60分钟。使用PE共轭的大鼠抗小鼠IgG1抗体和用流式细胞仪检测结合的蛋白复合物。
识别肿瘤细胞和e1a2肽脉冲的目标细胞的e1a2肽特异性的CD8+T细胞显示与e1a2肽装载的H-2Ld:Ig复合体的结合(图20)。与CTL测定分析相一致，与单独用pVAX-e1a2接种相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治疗小鼠引发8倍以上e1a2肽特异性的CTLs产生。与用e1a2肽装载的DC/CD40L接种相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治疗小鼠引发2倍以上e1a2肽特异性的CTLs产生。
总之，这里提出一个新颖的提高抵抗已存在的bcr/abl肿瘤的抗肿瘤免疫疫苗组成和接种方法。
在这个方案中使用DCs遗传性修饰DCs子类，pDCs/IPCs，和含有编码e1a2肿瘤特异肽基因和CpG的质粒载体。用DC/CD40L和含CpG基序的pVAX-e1a2质粒重复的接种去治疗长肿瘤的小鼠引发出肿瘤特异性的和e1a2肽特异性的T细胞应答。
它进一步展示，通过CTL检测和在这些T细胞表面间接性免疫荧光染色e1a2肽鉴别。e1a2肽特异性的CTLs在体内被诱导了。明显地接种诱导了能识别瘤细胞和在原位杀死它们的e1a2肽特异性的T细胞。新引发的e1a2肽特异性的T细胞，可在保护宿主对抗亲代肿瘤再挑战扮演重要角色。本发明的疫苗组分有效的消除原有的bcr/abl阳性肿瘤和保护动物抵抗亲代肿瘤的攻击。因此，本发明的疫苗组分很好应用于对费城染色体阳性肿瘤的治疗和药物组成。
为疫苗组分建议的机理
根据本发明的实验结果和由其他人在肿瘤免疫学领域的研究，下面和图21显示贡献于本发明成功的可能性机理和关键因素提出的假设。
在强迫以后，编码肿瘤肽(CpG-DNA-e1a2)的质粒DNA与DCs结合。大多数CpG-DNA-e1a2质粒DNA被内吞和随后肽呈递在MHC分子上。在质粒DNA上的CpG基序结合到TLR9和激活DCs内的toll-like受体途径。
TLR9途径的激活可导致I型干扰素-α和干扰素-β的分泌。这事件可发生在CpG-DNA-e1a2与DCs的孵育期间。因此，在预先孵育时，提前、同时和/或之后，更好由共离心的方法来提高质粒DNA对DCs的结合。DCs细胞经遗传修改后表达CD40L。因此DCs表达B7和CD40L，两个最重要的T细胞活化信号。在CD40L、B7和I型干扰素的存在下，基因修饰的DCs对免疫细胞，比如幼稚T细胞呈递肿瘤肽并且通过CD40-CD40L互作用，激活幼稚DCs。在体内，DCs可摄入未结合的抗原/或CpG-DNA-e1a2的产物。
两类型树突状细胞、pDCs/IPCs/CD40L/B7和被激活的DCs装载肿瘤抗原迁移到淋巴组织并且激活免疫细胞包括幼稚T细胞、B细胞和DCs.交叉敏化和直接引发宿主的免疫系统可在同样的组织同时发生。可产生细胞因子，比如IL12，IL15，IFN-γ，I型TNF-α和其它Th1细胞因子。CD40L修饰pDCs，表达B7分子，可能直接对幼稚CD8+T细胞呈递肿瘤肽和激活肿瘤特异性的CTLs，因此获得一个更快速、增强的和更高效率的治疗和保护性免疫应答。用本发明免疫接种最后的结果是引发e1a2特异性的CTLs和消除已存在的肿瘤。在体内诱发的抗肿瘤的免疫性保护宿主对抗免肿瘤攻击。
因此，我们新颖的疫苗战略强调激活先天免疫和适应性免疫的独特组合。这个新颖的疫苗组分适用于为了治疗或防治人和动物的疾病而设计药物疫苗组分用。它将由本领域人士了解，对本发明所作的各种各样的修改和变动没有超出所附加的权利要求的定义范围。
序列表
<110>黄冉阳
<120>核酸和细胞疫苗的组分
<130>P366PC00
<150>SE 0301109-5
<151>2003-04-14
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>1
tgctagcatg atctggccca acgacggcga gggcgccttc cacggcgacg ccgaggccct 60
gcagcgc 67
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>2
aatcgatcac aggccctggg gctcgaagtc gctggccacg gggcgctgca gggc 54
<210>3
<211>96
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(96)
<223>
<400>3
atg atc tgg ccc aac gac ggc gag ggc gcc ttc cac ggc gac gcc gag 48
Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu
1 5 10 15
gcc ctg cag cgc ccc gtg gcc agc gac ttc gag ccc cag ggc ctg tga 96
Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu
20 25 30
<210>4
<211>31
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu
1 5 10 15
Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu
20 25 30
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Ala Phe His Gly Asp Ala Glu Ala Leu
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>对鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)低结合的合成多肽
<400>6
His Gly Asp Ala Glu Ala Leu Gln Arg
1 5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>对鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)不结合的合成多肽
<400>7
Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys
1 5
Claims (43)
1、核酸疫苗组分，包含：
-编码抗原的核苷酸序列；和
-修饰的表达免疫应答调控分子的抗原呈递细胞。
2.核酸疫苗组分包含：
-编码抗原的核苷酸序列；和
-修饰的表达细胞生存调控分子的抗原呈递细胞。
3.根据权利要求2所述的疫苗组分，其特征在于：所述的细胞生存调控分子是凋亡诱导分子。
4.根据权利要求1至3之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的疫苗组分为所述的核苷酸序列与所述的修饰的抗原呈递细胞的混合物。
5.根据权利要求4所述的疫苗组分，其特征在于：所述的疫苗组分为所述的核苷酸序列与所述的修饰的抗原呈递细胞的一个预先孵育的混合物。
6.根据权利要求1或5所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞是专职性抗原呈递细胞。
7.根据权利要求所述的疫苗组分，其特征在于：所述的专职性抗原呈递细胞是树突状细胞。
8.根据权利要求7所述的疫苗组分，其特征在于：所述的树突状细胞是高效率的抗原处理和抗原呈递细胞。
9.根据权利要求7或8所述的疫苗组分，其特征在于：所述的树突状细胞是血浆细胞状树突状细胞。
10.根据权利要求1到9之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞是与表达CD8α、B220、CD11C和B7分子的小鼠树突状细胞子类相当的人树突状细胞子类。
11.根据权利要求1到10之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞表达Toll-like受体9。
12.根据权利要求1到11之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞表达P2X7。
13.根据权利要求1到12之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞可诱导产生I型α干扰素和/或β干扰素。
14.根据权利要求13所述的疫苗组分，其特征在于：当与微生物相互作用时，诱导所述的抗原呈递细胞产生I型α干扰素和/或β干扰素。
15.根据权利要求1到14之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞作为对象的先天性和适应性免疫应答的连接。
16.根据权利要求1到5之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原呈递细胞至少选自以下之一：
-树突状细胞；
-血浆细胞状树突状细胞；
-干扰素生产细胞；
-天然干扰素产生细胞；
-单核细胞；
-巨噬细胞；
-骨髓细胞；
-干细胞分化的细胞
-B细胞；
-T细胞；和
-肥大细胞。
17.根据权利要求1所述的疫苗组分，其特征在于：所述的免疫应答调控分子由转入所述的抗原呈递细胞的核苷酸序列编码，该基因序列至少选自下列之一：
-细胞因子基因；
-白介素基因；
-粘附分子基因；
-干扰素基因；
-趋化因子基因和趋化因子受体基因。
18.根据权利要求17所述的疫苗组分，其特征在于：所述的免疫反应调控分子选自CD40配体和GM-CSF。
19.根据权利要求2或3所述的疫苗组分，其特征在于：所述的细胞生存调控分子由转入所述的抗原呈递细胞的核苷酸序列编码，该基因序列至少选自下列之一：
-抗凋亡基因；和
-凋亡诱导基因。
20.根据权利要求1到19之一所述的疫苗组分，其特征在于：含所述的核苷酸序列的载体至少选自下列之一：
-病毒载体；
-非病毒载体；
-质粒；
-微生物载体；
-脂质体；
-小分子载体。
21.根据权利要求20所述的疫苗组分，其特征在于：所述的载体包含免疫应答调控核苷酸序列。
22.根据权利要求21所述的疫苗组分，其特征在于：所述的免疫应答调控核苷酸序列是未甲基化的胞苷磷酸鸟苷(CpG)序列。
23.根据权利要求1到22之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的抗原包含氨基酸序列为SEQ ID NO：5的e1a2融合多肽。
24.根据权利要求1到22之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的核苷酸序列包含微型e1a2融合基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
25.根据权利要求1到22之一所述的疫苗组分，其特征在于：所述的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：4的微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列。
26.生产核苷酸和细胞疫苗组分的方法，包含以下步骤：
-提供编码抗原的核苷酸序列；
-提供修饰的表达免疫应答调控分子的抗原呈递细胞；以及
-混合所述的编码抗原的核苷酸序列和所述的修饰的抗原呈递细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：还包含孵育所述的核苷酸序列和所述的修饰的抗原呈递细胞以增强其结合的步骤。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于：所述的提供核苷酸序列的步骤包括：
-提供MHC结合的抗原蛋白或多肽；
-克隆编码所述的抗原蛋白或抗原多肽的核苷酸序列进人所述的载体；以及
-在扩增系统中扩增所述的载体。
29.根据权利要求26至28之一所述的方法，其特征在于：所述的提供抗原呈递细胞的步骤包括：
-从对象分离所述的抗原呈递细胞；以及
-改造抗原呈递细胞至可表达所述的免疫应答调控分子。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于：所述的分离步骤包括分离表达Toll-like受体9和能生产α干扰素和/或β干扰素的树突状细胞子类。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：所述的树突状细胞子类在对象中充当先天性和获得性免疫应答的重要角色。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其特征在于：所述的树突状细胞子类是血浆细胞状树突状细胞。
33.根据权利要求1或2的疫苗组分作为药物的用途。
34.根据权利要求1或2的疫苗组分用于制备治疗或防治传染病的药物的用途，其特征在于：所述的核苷酸序列编码在所述疾病中的与传染物质相关的抗原。
35.根据权利要求1或2的疫苗组分用于制备治疗或防治癌症的药物的用途，其特征在于：所述的核苷酸序列编码在癌症中表达的肿瘤相关抗原。
36.诱导免疫应答的方法，包括对对象引入根据权利要求1或2所述的疫苗组分的步骤。
37.对对象治疗或防治疾病的方法，包括对对象引入根据权利要求1或2所述的疫苗组分的步骤，所述的抗原是与所述疾病的致病物质相关的抗原。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于：所述的抗原呈递细胞适合于呈递至少一个所述抗原的片段到对象的免疫系统的细胞。
39.根据权利要求36到38之一所述的方法，其特征在于：所述的对象是哺乳动物。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于：所述的哺乳动物是人类。
41.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述的疾病至少选自下列之一：
-传染病；
-癌症；
-白血病；
-淋巴瘤；
-自身免疫疾病/紊乱
-炎症；
-血液疾病；
-过敏；
-遗传性疾病；
-移植所需疾病；和
-糖尿病。
42.试剂盒，包括：
-编码抗原的核苷酸序列；与
-修饰的表达免疫应答调控分子的抗原呈递细胞。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其特征在于：所述的核苷酸序列和所述的修饰的抗原呈递细胞为混合物。
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