CN1079166A - 用白细胞介素-10抑制移植物抗宿主病 - Google Patents

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Abstract

一种用于抑制移植物抗宿主病或组织排斥的方 法，该方法包括给个体施用有效量的白细胞介素 -10。

Description

从总体上说本发明涉及一种经给患病个体施用有效量的白细胞介素-10来治疗并抑制移植物抗宿主病或组织排斥的方法。
本发明涉及用白细胞介素-10（IL-10）抑制移植物抗宿主病或对移植组织的排斥。本发明也包括含白细胞介素-10或其活性变异体的药物组合物。较好的是，本发明的白细胞介素-10选自由下列氨基酸序列定义的开放阅读框架的成熟多肽组成的组中：
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly
Val Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys
Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln
Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr
Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile
Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln
Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile
Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
和
Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gln Cys Leu Val Leu Leu
Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe
Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
Leu Ser Glu Net Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln
Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Ler Arg Arg Cys His
Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Gln Gln Ile
Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala
Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met
Thr Ile Lys Ala Arg,
其中，用标准的三字母缩写表示L-氨基酸，并从N-末端开始。这两种形式的IL-10有时指人IL-10（或人细胞激活素合成抑制因子）和病毒IL-10（或BCRF1）（分别如：Moore  et  al.，Science，Vol.248，pgs.1230-1234（1990）;Vieira  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.88，pgs.1172-1176（1991）;Fiorentino  et  al.，J  Exp.Med.Vol.170，pgs.2081-2095（1989）;Hsuet  al.，Science，Vol.250，pgs.830-832（1990））。更好是，本发明方法中所用的成熟IL-10或其变异体选自由下列氨基酸序列组成的组中
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe
Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
Ser Arg Val Lys The Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu
Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Gly Glu
Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro AspIle Lys Ala His
Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala
Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly
Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile
Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
和
Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu
Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr
Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala
Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln
Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile
Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.
图1是用于在哺乳动物细胞中表达IL-10所用的载体pcD（SRα）示意图。
图2是用于在细菌中表达IL-10所用的载体TRP-C11的示意图。
图3表示携带小鼠IL-10，病毒IL-10，或人-IL-10的开放阅读框架（ORF）的质粒pGSRG，所述的开放阅读框架插入在该质粒的Xho  I限制性位点;该图也表示最后构建体（称为TAC-RBS）的RBS-ATG-多聚连接子区域的序列。
图4表示在MLC中，内源和外源IL-10对增殖反应的影响。在浓度不断增加的IL-10（空心带）和抗-IL-10mAb（实心带）存在的情况下，将PBMC（1×105/孔）和异基因的经辐射的PBMC（1×105/孔）[PBMC供体A×PBMC供体B（A）;PBMC供体B×PBMC供体A（B）]培养5天。在没有（实心带）或存在（影线带）100U/ml IL-10以及浓度不断增加的抗-IL-10mAb（C）情况下，完成MLC。
图5表示IL-10对用各种异基因的细胞刺激的纯化T细胞增殖反应的影响。在浓度不断增加的IL-10情况下，将纯化T细胞（1×105/孔）与同种异体的辐射洗脱单核白细胞（2×104/孔）（A），趋向性选择出的CD14+单核白细胞（2×104/孔）（B），纯化的B细胞（3.3×104/孔）（C），EBV-LCL（1×104/孔）（D）一起培养5天。
图6表示IL-10效应的动力学如何取决于IL-10加到培养基中的时间。将PBMC（1×105/孔）和异基因的经辐射的PBMC（1×105/孔）培养5天。在指定的时间加入指定浓度的IL-10。
图7表示在MLC中，IL-10对IL-2-生产的影响。用浓度不断增加的IL-10并在有或没有100μg/ml的抗-IL-2R抗体BB10存在的情况下，培养PBMC（1×105/孔） 和异基因的经辐射的PBMC（1×105/孔）。三天后，收集上清液，用细胞激活素特异的ELISA法检测其中的IL-2含量。
图8表示外源IL-2对由IL-10诱导的减弱T细胞的异抗原-诱导的增殖反应的影响。在没有（空心符号）或有（实心符号）100U/ml IL-10存在的条件的，将用异基因的经辐射的PBMC（105/孔）（A），或纯化的B细胞（3.3×104/孔）（B）刺激的纯化T细胞（105/孔）与浓度不断增加的IL-2一起培养。
本发明涉及一种用IL-10或其拮抗剂抑制个体如移植患者中的移植体抗宿主病或组织排斥的方法。本发明也包括用于实施该方法的含有IL-10的药物组合物。本发明所用的IL-10选自由pH5C，pH15C，和pBCRF（SRα）[均寄存于美国典型培养物收集中心（ATCC），Rockville，Maryland，寄存号分别为68191，68192和68193]的cDNA插入片段定义的开放阅读框架编码的成熟多肽以及其活性变异体如拮抗剂组成的组。拮抗剂包括突变蛋白和如加工、平截，糖基化作用的翻译后变异体。
Ⅰ  白细胞介素-10检测方法
IL-10显示出数种可作为检测方法的依据和单位的生物活性。特别是，IL-10（各种）具有抑制由IFN-γ，淋巴细胞毒素，IL-2，IL-3组成的组中的至少一种细胞激活素以及T辅助细胞群体中的GM-CSF的合成的特性。这些T辅助细胞与提供同基因抗原的细胞（APCs）和抗原接触后被诱导合成一种或多种上述 细胞激活素。在该活性中，处理APCs以便它们不能复制，但它们的抗原加工机制仍保留其功能。在与T细胞混合前，如用约1500-3000R（γ或Ⅹ-射线）辐射APCs可很方便地完成上述处理。
另外，可以在不需使用同基因APCs的一级或较好的是二级混合淋巴细胞反应（MLR）中检测细胞激活素的抑制作用。MLRs是现有技术中已知的，如Bradley，pgs.162-166，in Mishell et al.，eds.Selected Methods in Cellular Immunology（Freeman，San Francisco，1980）;和Battisto et al.，Meth.in Enzymol.Val.150，pgs.83-91（1987）。总之，两群异基因淋巴样细胞混合，其中一群在混和前已经被处理过，如辐射，以阻止增殖。较好地是，在补充培养基，如用10%胎牛血清补充的RPMI1640中，以约2×106细胞/ml的浓度制备细胞种群。对于对照和检测培养基，混和0.1ml的各种群进行检测。对于二级MLR，用新鲜制备的，经辐射刺激物细胞再刺激在一级MLR中保持7天留下后的细胞。在混和时，将可能含IL-10的样品加到检测培养基中，并在混和后，1到3天，检测对照和被检测培养基中产生的细胞激活素。
用在Disabato.et  al.，eds.，Mech.in  Enzymol.Vol.108（1984）中详细描述的本领域已知的技术得到用于IL-10检测法的T细胞群和/或APC群。用于优选的IL-10检测的APCs是外周血液单核白细胞。用标准技术，如由Boyum，Meth.in  Enzymol.Vol.108，pgs.88-102（1984）;Mage，Meth.in  Enzymol.，Vol.108，pgs  118-132（1984）; Litvin  et  al.，Meth.in  Enzymol.，Vol.108，pgs.298-302（1984）;Stevenson，Meth.in  Enzymol.，Vol.108，pgs.242-249（1989）;和Romain  et  al.，Meth.in  Enzymol.，Vol.108  pgs.148-153（1984）（全部文献均引入本文作为参考）描述的方法得到上述细胞。较好的是，在IL-10检测方法中使用辅助T细胞，首先从外周血液中分离淋巴细胞，然后用商业上可得到的抗-CD4抗体，如在美国专利4，381，295中描述和从Ortho  Pharmaceutical  Corp.得到的OKT4通过如经扫描或流动细胞计数器筛选，得到上述辅助T细胞。所必需的技术由Boyum在Scand.J.Clin.Lab.Invest.，Val.21（Euppl.97），pg.77（1968），和在Meth.in  Enzymol.，Vol.108（上文注释的）和由Bram  et  al.在Meth.in  Enzymol.，Vol.121，pgs  737-748（1986）中全部公开。通常，从新鲜血液中经Ficoll  Hypaque密度梯度离心得到PBLs。
在检测中可以使用各种抗原，如
Figure 931044812_IMG3
孔匙血蓝蛋白（KLH），家禽γ-球蛋白，等。更好的是，在检测中代替抗原，用抗-CD4单克隆抗体，如在美国专利4，361，549中公开的OKT3刺激辅助T细胞。
用标准生物和/或免疫化学检测方法测量在对照和被检测样品中细胞激活素的浓度。如果可以得到纯化的细胞激活素，构建用于特定细胞激活素的免疫化学检测方法是现有技术中已知的：如Campbell，Monoclonal  Antibody  Technology（Elservier，Amsterdam，1984）;Tijssen，Practice  and  Theory  of  Enzyme Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）;和美国专利4，486，530是该领域中大量文献中的实例。可从Genzyme  Corp.（Boston，MA）购买到用于人IL-2，人IL3.和人GM-CSF的ELISA药盒;从Endogen，Inc.（Boston，MA）可购买到用于人IFN-γ的ELISA药盒。可从Genzyme  Corp.得到特异于人淋巴细胞毒素的多克隆抗体，它可用于人淋巴细胞毒素的放射免疫检测，例如Chard，An  Introduction  to  Radioimmunoassay  and  Ralated  Techniques（Elsevier，Amsterdam，1982）。
上文列举的细胞激活素的生物检测方法也可用于确定IL-10活性。由Aggarwal，Meth.in  Enzymol.，Vol.116pgs.441-447（1985），和Matthews  et  al.，pgs.221-225，in  Clemens.et  al.，eds.，Lymphokines  and  Interferons：A.Practical  Approach（IRL  Press，Washington，D.C.1987）公开了有关人淋巴细胞毒素的生物检测。可以用因子依赖性细胞系CTLL-2和KG-1（可从ATCC得到，寄存号分别为TIB214和CCL246）检测人IL-2和GM-CSF。根据其具有刺激在软琼脂培养基上形成各种类型造血细胞菌落，如由Metcalf，The  Hemopoietic  Colony  Stimulating  Factors（Elsevier，Amsterdam，1984）的能力而检测人IL-3。可以用抗-病毒检测方法[如Meager，pgs.129-147，in  Clemens  et  al.，eds.（上文引述的）]定量分析IFN-γ。参见，Roitt（1992）Encyclopedia  of  Immunolgy，Academic  Press，New  York;and  Coligan（1992）and  periodic  supplements）Current  Protocols  in  Immunology  Greene/Wiley，New  York。
也可以通过mRNA分析确定细胞激活素的生产。可以用如White  et  al.，J.Biol.Chem.Vol.257，pgs.8569-8572（1982），和Gillespie  et  al.，美国专利4，483，920描述的细胞质点杂交方法检测细胞激活素mRNAs。其它方法包括利用纯化RNA的点印迹法[如Chaper  6，in  Hames  et  al.，eds.Nucleic  Acid  Hybridization  A  Practical  Approach（IRL  Press，Washington.D.C.1985）]。
一些检测IL-10活性的样品需要预处理以除去可能影响检测的预测定的细胞激活素。例如，在一些细胞中，IL-2提高IFN-γ的生产。因此根据检测中所用的辅助T细胞，必需从被检测样品中除去IL-3。使样品通过标准抗-细胞激活素亲和柱可以很容易地完成上述清除。
为了方便，根据IL-10具有增加IL-4诱导的MC/9细胞（在美国专利4，559，310中描述并可以从ATCC得到，寄存号：CRL8306）增殖的能力定义IL-10活性单位。1单位/ml被定义为在下列检测中，IL-4水平上得到50%MC/9增殖最大刺激的IL-10浓度。在标准微滴定盘每孔50μl培养基中，制备IL-4和IL-10的两倍或三倍稀释物。上述培养基由RPMI1640，10%胎牛血清，50μM2-巯基乙醇，2mM谷氨酰胺，青霉素（100μ/L）和链霉素（100μg/L）组成。加入IL-4，即以25μl/孔的1600u/ml（最后浓度为400u/ml）稀释于培养基中，并过夜培养，如20-24小时。以0.5-1.0μCi/孔加入3H-胸苷（如50μCi/ml在培养基中）并再过夜培养细胞，然后收集细胞并检测掺入的放射活性。
可以按在如Sambrook  et  al.（1989）Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual  Cold  Spring  Harbor  Press，Cold  Spring  Horbor，New  York;或Ausubel（1987and定期补充）Current  Protocols  in  Molecular  Biology  Greene/Wiley，New  York描述的重组方法;或，如在Atherton  et  al.（1989）Solid  Phase  Peptide  Synthesis：A  Practical  Approach  IRL  Press，Oxford描述的合成方法制备本文所述的IL-10变异体和类似物。
Ⅱ  纯化和药物组合物
当本发明的多肽以可溶形式表达时，如作为转化酵母或哺乳动物细胞的一种分泌产物，可以按现有技术中的标准方法，包括硫酸铵沉淀步骤，离子交换层析，凝胶过滤，电泳，亲和层析，和/或等：如“Enzyme  Purification  and  Related  Techniques”，Methods  in  Enzymology，22：233-577（1977）纯化它们;并且Scopes，R.，Protein：Purification：Principle  and  Practice（Cspringer-Verlag，New  York，1982）提供上述纯化方法的指导。另外，当本发明的多肽以可溶形式表达时，如作为集合物，内含体等等，可以用现有技术中的标准方法纯化它们，包括从破裂的宿主细胞中经离心分离内含体，用离液序列高的以及还原剂，溶解内含体，稀释溶解的混和物，并降低离液序列高的试剂和还原剂的浓度，以便使多肽具有生物活性结构。在下列文献中公开了上述方法中的后者，这些文献引入本文作为参考：Winkler  et  al.，Biochemistry，25：4041-4045（1986）;Winkler  et  al.，Biotechnology，3：992-998（1985）;Koths  et  al.， 美国专利4，569，790;和欧洲专利申请86306917.5和86306353.3。
本文所用的“有效量”是指足以减少或抑制移植物抗宿主病或组织排斥的量（参见，如Paul（1989），Fundamental  Immunology  Raven  Press，New  York）。可以根据如移植组织的状态，类型，数量，患者的总体健康，施用的方法，副作用的严重程度等等改变对于特定患者的有效量。通常，IL-10作为含有效量IL-10和药物学载体的药物组合物施用。药物学载体可以是适于将本发明的组合物释放给患者的任何相容的，无毒物质。通常，上述药物的非肠道施用的组合物是已知的，如，Remington's  Pharmaceutical  Science，15th.Ed.（Mack  Publishing  Company，Easton，PA1980）。另外，可以用可植入或可注射的药物传递系统，如Urquhart  et  al.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，pgs.199-236（1984）;Lewis，ed.Controlled  Release  of  Pesticides  and  Pharmaceuticals（Plenum  Press，New  York，1981）;美国专利3，270，960等等将本发明的组合物导入患者体内。
当非肠道施用时，以一单位剂量可注射形式（溶液，悬浮液，乳剂）与药物学载体结合配制IL-10。上述载体的实例是常规盐水，格林氏溶液，葡萄糖溶液，和Hank's溶液。也可以使用非水载体如固定油，油酸乙酯。优选的载体是5%葡萄糖/盐水。载体可含有少量附加物质如可增加等渗性和化学稳定性的物质，如缓冲液和防腐剂。最好以基本上没有集合体和其它蛋白的纯化形式，以约5到20μg/ml的浓度配制IL-10。最好以连续注入施用IL-10，以便每天释放约50-800μg范围的量（即：约1-16μg/Kg /天）。在监测副作用和血液细胞数的基础上，变化每天的注入速率。
实施例
下列实施例用于说明本发明。选用的载体和宿主，试剂的浓度，温度和其它变量值仅仅是为说明本发明的应用且不能认为是其限制值。
实施例1.在细菌宿主中表达人CSIF
从许多化学合成的双链DNA片段中装配合成的人CSIF以形成称作TAC-RBS-hCSIF的表达载体。在标准细菌系统，如大肠杆菌K-12菌株JM101，JM103等等[由Viera  and  Messing，in  Gene，Vol.19，pgs.259-268（1982）中描述]完成克隆和表达。用标准方法[如Maniatis  et  al.，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manul（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，New  York，1982）]完成限制酶消化和连接酶反应。
将碱性方法（Maniatis  et  al.，上文引述的）用于小规模质粒制备。为了大量制备，使用一种改进的碱性方法，其中使用等体积异丙醇以便从澄清的溶胞产物中沉淀核酸。在氯化铯等密度离心前用冷2.5M乙酸铵进行沉淀除去RNA，并用溴化乙锭检测。
为了过滤杂交物，使用Whatman 540过滤循环以便检出菌落，然后将其溶解并用0.5MNaOH，1.5M NaCl;1M Tris HCl PH8.0，1.5M NaCl（每次2分钟）连续处理固定，并在80℃加热2小时。在42℃用32P-标记（激酶处理）的合成DNAs将其在6×SSPE，50%甲酰胺，0.1%十二烷基磺酸钠（SDS），100μg/ml大肠杆菌tRNA中杂交6小时（在 800ml H2O中溶解174g NaCl，27.6g NaH2PO4·9H2O，和7.4g EDTA，用NaOH将PH调到7.4，将体积加到1升，并用高压蒸汽灭菌整个溶液而制备20×SSPE）。用1×SSPE;0.1%SDS将滤纸冲洗两次（15分钟，室温）。放射自显影（Fwji RX胶片）后，用在滤纸上的兰-斑菌落对照再生长菌落以便定位阳性菌落。用Sanger et al.Pro.Natl.Acad.Sci.，Vol.74pg.5463（1977）的双脱氧方法测定DNA序列。双脱氧反应的模板是再克隆到M13mp载体中的相关区域的单链DNAs[如，Messing et al.，Neccleic Acids Res.，Vol.9，pg.309（1981）];或者是用微碱性方法并用0.2M NaOH变性（5分钟，室温），加入2体积乙醇从0.2M NaOH，1.43M乙酸铵中沉淀而制备的双链DNA。用Applied Biosystems 380A合成器经phosphoramidite化学法合成DNA。按380A合成器的操作说明进行合成，去保护，裂解和纯化（7M脲PAGE，洗脱，DEAE-纤维素层析）。
将需克隆的合成DNAs的互补链（各400ng）混和，并在50μl反应体积中用多核苷酸激酶磷酸化。将该DNA与用适当限制酶消化的1μg载体DNA连接，连接反应在室温下在50μl体积中进行4到12小时。磷酸化，限制酶消化，多聚酶反应，以及连接反应的条件已有描述（Maniatis et al.，上文引述的）。通过将于培养于用氨苄青霉素，异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）（0.4mM）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）（40mg/ml）补充的L琼脂平板上而筛选lacZ+的菌落（如果需要）。
用DNA多聚酶填平带tacP的质粒pDR540（Pharmacia）的单个BamHI位点，来构建TAC-RBS载体。然后将该载体与未磷酸化的合成寡核苷酸（Pharmacia）连接，形成编码同感核糖体结合位点（RBS  GTAAGGAGGTTTAAC）的双链片段。连接后，将混和物磷酸化并再将其与SstI连接子ATGAGCTCAT连接。再用SetI和EcoRI裂解该复合体，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离173个碱基对（bp）片段，并将其克隆到EcoRI-SstI-限制的pUC19（Pharmacia）（如下文所述）中。在图2中表示了最后构建体（称作TAC-RBC）的RBC-ATG-多聚连接子区域的序列。
用8个步骤将合成的IL-10基因装配到UC19质粒中。在进行将pUC19的lacZ（α）基因保留在带有步骤1中插入的ATG起始密码子的框架中的克隆后，可以检测每个步骤中没有缺失和/或插入的插入片段。在含X-gal和IPTG的L-氨苄青霉素平板上获得兰菌落，从而可以过滤去除含缺失和/或插入改变的克隆。另外，在小规模的质粒DNA制备中，用通用的定序引物，如可从Boehringer  Mannheim得到，可以很容易地确定每个步骤中插入片段的序列。
在步骤1，用SstI消化TAC-RBS载体，用T4DNA多聚酶（其3′-核酸外切酶活性消化SstI切割物3′-突起链以形成平整末端片段）处理，在T4DNA多聚酶失活后，用EcoRI处理以形成含TAC-RBS区并在ATG起始密码子有平整末端，且在相对的末端有EcoRI切割的173bp片段，最后，分离173bpTAC-RBS片段。
在步骤2中，将步骤1分离的TAC-RBS片段与EcoRI/ KpnI-消化的质粒pUC19和合成片段1A/B混和，如下文所示，1A/B片段在其上游末端有一个平整末端，在其下游末端有相应于KpnI切割的交叉末端。将KpnI末端连接至BstEⅡ位点的下游。连接上述片段以形成步骤2的pUC19。
在步骤3中，将合成片段2A/B和3A/B（下文所示）与步骤2的BstEⅡ/SmaⅠ-消化的pUC19（扩增和纯化后）混和，并将其连接以形成步骤3的pUC19。应该说明，片段3A/B的下游末端含有形成SmaⅠ平整末端的额外的碱基。在步骤4中裂解这些额外的碱基。另外，片段2A/B和3A/B有互补的9-残基单链末端，这两个末端在混和时退火，将得到的2A/B的上游BstEⅡ切割点和3A/B的下游平整末端与pUC19连接。
在步骤4中，用AflⅡ/XbaⅠ消化步骤3的pUC19，将其扩增，纯化，再纯化，与合成片段4A/B（下文所示）混和，并连接形成步骤4的pUC19。
在步骤5中，用XbaⅠ/SalⅠ消化步骤4的pUC19，将其扩增并纯化，与合成片段5A/B（下文所示）混和，并连接形成步骤5的pUC19。应注意的是，在步骤6中，用HpaⅠ消化除去片段5A/B的SalⅠ-交叉末端。
在步骤6中，用HpaⅠ/PstⅠ消化步骤5的pUC19，将其扩增，纯化，与合成片段6A/B（下文所示）混和并连接形成步骤6的pUC19。
在步骤7中，用ClaⅠ/SphⅠ消化步骤6中的pUC19，将其扩增，纯化，与合成片段7A/B（下文所示）混和并连接形成步骤7的pUC19。
在步骤8中，用MluⅠ/HindⅢ消化步骤7的pUC19，将其扩增，纯化，与合成片段8A/B和9A/B混和并连接形成最后的构建体，然后用标准技术将该构建体插入到大肠杆菌K-12菌株JM101（如可从ATCC得到，寄存号为33876）。培养后，从JM101细胞中提取蛋白质，并稀释提取物，检测其生物活性。
AGCCCAGGCC  AGGGCACCCA  GTCTGAGAAC  AGCTGCACCC ACTTCCCAGG-
TCGGGTCCGG  TCCCGTGGGT  CAGACTCTTG  TCGACGTGGG TGAAGGGTCC-
tAACCggtac
aTTGGc
片段1A/B
GtAACCTGCC  TAACATGCTT  CGAGATCTCC  GAGATGCCTT CAGCAGAGTG-
GACGG  ATTGTACGAA  GCTCTAGAGG  CTCTACGGAA  GTCGTCTCAC-
AAGACTTTCT  TT
TTC
片段2A/B
CAAATGAAGG  ATCAGCTGGA  CAACTTGTTc  TtAAG
TGAAAGAAA  GTTTACTTCC  TAGTCGACCT  GTTGAACAAg  AaTTC
片段3A/B
GAGTCCTTGC  TGGAGGACTT  TAAGGGTTAC  CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC-
CTCAGGAACG  ACCTCCTGAA  ATTCCCAATG  GACCCAACGG TTCGGAACAG-
TGAGATGATC  CAGTTTTAt
ACTCTACTAG  GTCAAAATaG  AtC
片段4A/B
CTaGAGGAGG  TGATGCCCCA  AGCTGAGAAC  CAAGACCCAG ACATCAAGGC-
GAtCTCCTCC  ACTACGGGGT  TCGACTCTTG  GTTCTGGGTC TGTAGTTCCG-
GCATGTtAAC  g
CGTACAaTTG  cagct
Fr片段nt5A/B
AACTCCCTGG  GGGAGAACCT  GAAGACCCTC  AGGCTGAGGC TACGGCGCTG-
TTGAGGGACC  CCCTCTTGGA  CTTCTGGGAG  TCCGACTCCG ATGCCGCGAC-
TCATCGATct  gca
AGTAGCTAg
片段6A/B
CGATTTCTTC  CCTGTCAAAA  CAAGAGCAAG  GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA-
TAAAGAAG  GGACAGTTTT  GTTCTCGTTC  CGGCACCTCG  TCCACTTCTT-
cGCgTgcatg
gCGcAc
片段7A/B
CGCGTTTAAT  AATAAGCTCC  AAGACAAAGG  CATCTACAAA GCCATGAGTG-
AAATTA  TTATTCGAGG  TTCTGTTTCC  GTAGATGTTT  CGGTACTCA
AGTTTGAC
片段8A/B
ATCTTCATCA  ACTACATAGA  AGCCTACATG  ACAATGAAGA-
CTCAAACTG  TAGAAGTAGT  TGATGTATCT  TCGGATGTAC TGTTACTTCT-
TACGAAACTG  A
ATGCTTTGAC  Ttcga
片段9A/B
（小字母说明碱基不同于同样位点的天然序列）。
实施例2.在COS7猴细胞中表达vIL-10
用引物，经多聚酶链反应扩增编码vIL-10的开放阅读框架的基因，该引物可使扩增片段然后插入到EcoRⅠ-消化的pcD（SRα）载体（图1）中。下列表示插入片段的编码链（用大写字母表示开放阅读框架）。
aattcATGGA  GCGAAGGTTA  GTGGTCACTC  TGCAGTGCCT  GGTGCTGCTT
TACCTGGCAC  CTGAGTGTGG  AGGTACAGAC  CAATGTGACA  ATTTTCCCCA
AATGTTGAGG  GACCTAAGAG  ATGCCTTCAG  TCGTGTTAAA  ACCTTTTTCC
AGACAAAGGA  CGAGGTAGAT  AACCTTTTGC  TCAAGGAGTC  TCTGCTAGAG
GACTTTAAGG  GCTACCTTGG  ATGCCAGGCC  CTGTCAGAAA  TGATCCAATT
CTACCTGGAG  GAAGTCATGC  CACAGGCTGA  AAACCAGGAC  CCGGAGGCTA
AGGACCATGT  CAATTCTTTG  GGTGAAAATC  TAAAGACCCT  ACGGCTCCGC
CTGCGCAGGT  GCCACAGGTT  CCTGCCGTGT  GAGAACAAGA  GTAAAGCTGT
GGAACAGATA  AAAAATGCCT  TTAACAAGCT  GCAGGAAAAA  GGAATTTACA
AAGCCATGAG  TGAATTTGAC  ATTTTTATTA  ACTACATAGA  AGCATACATG
ACAATTAAAG  CCAGGTGAg
通过vIL-10表达和/或限制消化的电泳图谱来鉴别在正确方向携带插入片段的克隆。将一个带vIL-10基因的上述载体称作pBCRF1（SRα）且寄存于ATCC，寄存号为68193。在大肠杆菌MC1061中扩增pBCRF1（SRα），用标准技术分离，并按如下方法用于转染COS7猴细胞：转染前一天，将约1.5×106COS7猴细胞播种于单个的100mm盘中的Dulbecco's改良Eagle培养基（DME），该培养基含5%胎牛血清（FCS）和2mM谷氨酰胺。为了完成转染，与胰蛋白酶一起培养从盘中取出COS7细胞，用无血清DME洗涤两次，并在无血清DME中悬浮该细胞，达到107细胞/ml。将0.75ml样品与20μgDNA混和，并将其转移到无菌的0.4cm电穿孔小容器中。10分钟后，在Biokad Gene脉冲仪装置中，以200瓦，960μF脉冲细胞。再经10分钟后，从小容器中取出细胞，并将其加到20ml含5%FCS，2mM谷氨酰胺，青霉素，链霉素，和庆大霉素的DME中。将混和物等分到4个100mm组织培养盘中。在37℃，5%CO212到24小时后，用仅含1%FCS的相似培养基代替上述培养基，并在37℃，5%CO2继续培养72小时，收集培养基后，检测其抑制IFN-γ合成的能力。
在37℃，将10ml新分离的PBLs样品（约2×106细胞/ml）与PHA（100ng/ml）一起在由（ⅰ）补充了5%FCS和2mM谷氨酰胺的90%DME，和（ⅱ）预先用pBCRF1（SRα）转染的10%COS7上清液组成的培养基中培养。24小时后，收集细胞和上清液以便分别检测是否存在IFN-γ mRNA或IFN-γ蛋白质。对照实验的处理相同，但不同的是10%上清 液是从用携带不相关的cDNA插入片段的质粒预先转染的COS7培养物中收集的。与对照组比较，vIL-10-处理的样品表现出抑制约50%的IFN-γ合成。
实施例3  在大肠杆菌中表达vIL-10-10
在大肠杆菌中可以表达编码下列成熟vIL-10的基因：
Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu
Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr
Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala
Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln
Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile
Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.
在pBCRF1（SRα）的cDNA插入片段再克隆到经位点特异性诱变改变两次的M13质粒中：第一次在该成熟vIL-10多肽编码区的5′-末端形成ClaⅠ位点，第二次在该成熟vIL-10多肽编码区的3′-末端形成BamHⅠ位点。然后很容易将突变序列插到下文所述的TRPC11表达载体中。
通过将合成的同感RBS片段与ClaⅠ连接子（ATGCAT）并将所得片段克隆至ClaⅠ-限制的pMT11hc（已预先修饰以含有ClaⅠ位点）来构建TRPC11载体。pMT11hc是一个小（2.3Kb） 的高拷贝，pBR322的AMPR，TETS衍生物，它带πVX质粒的EcoRⅠ-HindⅢ多聚连接子区域（πVX由Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，1982描述）。通过用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性切割pMT11hc，填平所得的粘性末端并用CalⅠ连接子（CATCGATG）连接，由此恢复EcoRⅠ和BamHⅠ位点，并用ClaⅠ位点代替SmaⅠ位点，这样修饰pMT11hc使其包含ClaⅠ位点，来自TRPC11构建体的一个转化体在ClaⅠ位点侧面有串联RBS序列，通过用PstⅠ消化该质粒，用Bal31核酸酶处理，用EcoRⅠ限制并在全部四种三磷酸脱氧核苷酸存在的情况下用T4DNA多聚酶处理，从而除去该质粒中的一个ClaⅠ位点和部分RBS序列的第二拷贝。用PAGE回收所得的30-40bp片段，并将其克隆到SmaⅠ限制的pUC12。然后将从pKC101[由Nichols et al.，in Methods in Enzymology，Vol.101，pg.155（Academic Press，N.J.1983描述的）]得到的携带有大肠杆菌色氨酸启动子248bp的大肠杆菌片段克隆到EcoRⅠ位点以完成TRPC11构建体，说明见图2。通过首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化TRPC11，将其纯化，然后在标准连接溶液中将其与含成熟BCRF1核苷酸编码序列的M13的ClaⅠ-BamHⅠ片段混和，从而将TRPC11用作为vIL-10的载体。含TRPC11的插入片段称为TRPC11-BCRF1，在大肠杆菌K12菌株JM101（如可从ATCC，寄存号33876得到）中繁殖该片段。
实施例4
本实施例在本文件的优先权日以后由Bejarano等人（1992）International  Immunology  4：1389-1397公开。它提供了在适当的体外环境下IL-10治疗效果的证明。尤其是，它说明IL-10抑制异源基因的增殖以及在一级混和淋巴细胞培养物（MLC）中产生的细胞毒性T细胞反应。
该实施例显示IL-10如何以剂量依赖性方式抑制异抗原诱导的增殖反应。当在培养开始时加入IL-10，抑制效果最好，这说明它在T细胞活化早期起作用。存在抗-IL-10mAb情况下，增强增殖反应，这说明内源产生的IL-10在一级MLC中抑制增殖。当刺激物细胞是被照射的异基因外周血液单核细胞（PBMC），纯化单核白细胞或B细胞时，仍可观察到IL-10的抑制效果。高浓度的外源IL-2不能恢复减弱的增殖反应，这说明IL-10的影响不仅仅与IL-2合成的抑制有关。另外，IL-10可以减少在一级MLC中IL-2，IFN-γ，IL-6，GM-CSF和TNF的生产而存在抗-IL-10mAb时，增加其生产。在IFN-γ生产中观察到最大效果。虽然IL-10减弱增殖反应，但在IL-10处理的培养物和对照组中，CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的比率保持不变。然而，存在IL-10时，按CD25+和HLA-DR+表达判断激活的CD3+T细胞的百分比一直减少。
IL-10抑制异特异性的增殖反应和细胞激活素生产。另外，证明外源IL-12不能恢复减弱的增殖反应，暗示IL-10通过减弱刺激物细胞的刺激能力而明显地抑制异特异性的增殖T细胞反应。
这些资料说明，在体外，IL-10对异基因反应有重要的调节 作用。
培养基和试剂
在用10%采集的热激活人AB血清补充的Yssel's培养基中培养细胞（参见Yssel  et  al.，（1986）Eur.J.Immunol.16：1187-）。
制备抗vIL-10的中和性抗-IL-10mAb  19F1并有效地抑制hIL-10和vIL-10（参见Bejarano  et  al.（1985）Int.J.Cancer  35：327;和ATCC寄存物HB10487，寄存日1990年6月28）。认别IL-2Rp55链的BB10mAb是Dr.J.Wijdenes友好地赠送的礼物（CRTS，Besancon，France;参见Herve  et  al.（19-）Blood  75：1017-1023）。从Becton-Dickinson（Mountain  View，CA）购买鼠抗-CD3（抗-Leu-4，IgG1），抗-CD4（抗-Leu-3a，IgG1），抗-CD8（抗-Leu-2a，IgG2a），抗-CD14（抗-Leu-M3，IgG2b），抗-CD19（抗-Leu-12，IgG1），抗-CD25（抗-IL-2R  P55，IgG1），抗-CD56（抗-Leu-19，IgG1），抗-HLA-DR（克隆L243，IgG2a）mAb和适当的异型对照mAb。
细胞制剂
从Blood  Bank  of  Stanford  University  Hospital得到血沉棕黄色层制剂。通过在Ficollhypaque（Pharmacia，Uppsala，Sweden） 密度梯度离心分离PBMC。
为了纯化T细胞，通过塑料吸附和铁吞噬作用消耗尽PBMC单核细胞（参见Bejarano et al.（1985）Int.J.Cancer 35：327-）。非吸附细胞通过尼龙棉（Julius et al.（1973）Eur.J.Immunol.3：645-），借助磁粉小珠除去NK细胞。简单地说，用饱和浓度的抗-CD56mAb在4℃，染色30分钟后，用Hanks's平衡盐溶液（HBSS），洗涤两次并且随后用羊抗-小鼠IgG（Dynbeads M-450羊抗-小鼠IgG，Dynal AS，Oslo，Norway）包被的磁珠以珠∶细胞40∶1的比率完成玫瑰花实验。在按制造商建议用磁性颗粒浓缩器除去玫瑰细胞前，在缓慢振动下于4℃将混合物培养30分钟。所得的细胞制剂＞99%CD3+，＜1%CD14+，＜1%CD19+，＜1%CD56+。
为了分离CD14+单核细胞，用PE共轭的CD14mAb（Becton-Dickinson，Mountain View，CA）给PBMC染色，在HBSS中洗涤两次，然后用FACStar-Plus（Becton-Dickinson，Sunnyvale，CA）将其分CD14+和CD14-群体。再分析经分类的群体表明，大于99.5%的纯化细胞是CD14+。在部分实验中，通过在血液组分分离器中经密度离心从外周血液分离单核细胞，接着离心淘选（参见，Figdor et al.（1984）J.Immunol.Methods 68：68-）。根据非特异性酯酶染色判断，这些单核细胞制剂的纯度大于95%。
用磁性小珠耗竭得到纯化B淋巴细胞。简单地说，在4℃，将非吸附的PBMC与饱和浓度的抗-CD3，抗-CD4，抗-CD8，抗-CD14和抗-CD56mAbs一起培养30分钟。用HBSS 洗涤细胞两次，用羊抗-小鼠IgG（Dynal AS，Oslo，Norway）包被的磁性小珠以40∶1的小珠∶细胞比率做玫瑰花实验。随后，按上面所述耗竭玫瑰花细胞。所得的群体含大于98%的CD19+细胞。
增殖检测
用各种经辐射的（4000rad）异基因刺激物细胞刺激PBMC或高度纯化的T细胞（1×105细胞/孔）。将PBMC，CD14+单核细胞，经离心淘洗分离的单核细胞，以及纯化的B淋巴细胞，分别以R∶S1∶1，5∶1，5∶1和3∶1的比率用作刺激物细胞。在200μl培养基中，没有（实心图5-7）（或有（影线柱）IL-10的情况下，在96孔平底微滴定板设置三个重复完成培养。
在5天培养期间的最后10小时用[3H]TdR脉冲培养物并将其收集到的纤维玻璃滤器上，用液体闪烁计数器测定放射性。在图4中将结果表示成[3H]TdR掺入的c.p.m，且代表三个重复培养物的方式。
大量培养
以上述的R∶S比率，在50ml烧瓶中，以1×106反应细胞/ml浓度在有或没有100U/ml IL-10的情况下，将PBMC或高度纯化的T细胞与经辐射的异基因细胞一起培养。5至6天后，收集上清液，在-20℃将其冷冻以确定它们的细胞激活素含量，回收细胞以进行表型分析。
荧光分析
在4℃，将从大量培养中回收的细胞（105）在V-底的微滴定盘（Flow Laboratories，Mclean，Va）中与10μl纯化的PE共轭的mAb一起培养30分钟，在双标记实验中，在FITC标记后，用1%正常小鼠血清将细胞洗涤两次，加入PE共轭的mAb。用含1%BSA和0.02M NaN3的HBSS将细胞洗涤两次，然后在FACScan上分析。
淋巴细胞激活素的测定：
用淋巴细胞激活素特异的ELISA（Bacchetta  et  al.（1989）J.Immunol.144：902-）检测从5到6天的大量培养物中收集的上清液中GM-CSF，IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-5和IL-6含量。为了测定IL-2产生的量，在存在10mg/ml抗-IL-2受体抗体BB10的情况下进行培养以减少IL-2消耗。72小时后，收集上清液，并用特异的ELISA确定IL-2水平。各种ELISA的敏感性是：对IL-4为40pg/ml;对IL-2，IL-5和IL-6为20pg/ml;对GM-CSF为50pg/ml;对TNF-α和IFN-γ为100pg/ml。
在MLC中IL-10抑制增殖反应
为了确定典型的一条途径一级MLC中IL-10对增殖反应的影响，在没有或有各种浓度IL-10的情况下用异基因PBMC刺激PBMC。图4表明，IL-10以剂量依赖性方式抑制增殖反应。 在1U/ml低的IL-10浓度，就已经观察到显著的抑制效果，而在100U/ml的IL-10浓度得到最大抑制效果（在不同实验中，从33-95%的抑制范围）。这些IL-10的抑制效果完全由抗-IL-10mAb中和，从而说明抑制的特异性（图4C）。事实上，在存在中和抗-IL-10mAb的情况下进行的MLC中的增殖反应被显著地增强，这说明内源产生的IL-10具有抑制一级MLC中的增殖反应的能力。
在MLC中单核白细胞对IL-10抑制效果的影响
已经知道通过向下调节Ⅱ型MHC抗原，IL-10大大减弱单核白细胞提供Ag（Ap）的能力。相反，Epstein-Barr病毒（EBV）-转化的B细胞（EBV-转化的淋巴样干细胞系：EBV-LCL）的Ap-能力和Ⅱ型MHC表达不受IL-10的影响。
在该实验中，将经负选择得到的高度富集的T细胞用作反应器细胞。将经离心淘洗或由从PBMC，纯化的B淋巴细胞，和EBV-LCL直接分离的CD14+细胞而富集的纯化单核白细胞群体用作刺激器细胞。IL-10大大地抑制由异基因单核白细胞独立诱导的增殖反应，所述的单核白细胞是经离心淘洗（图5a）或由FACS（图5b）正挑选得到的;而对异基因EBV-LCL的增殖反应不受影响（图5d）。按照对可溶性抗原的特异性增殖反应所观察的，这些结果表明，当异基因单核白细胞，但不是异基因EBV-LCL用作刺激器细胞时，异基因增殖被阻断。由刚分离的高度纯化的异基因B细胞诱导的增殖反应也由IL-10抑制（图5c），说明尽管IL-10对这些细胞的Ⅰ型或Ⅱ型MHC表达没有可测量的影响， 但当B细胞用作刺激器时，也存在IL-10的抑制效果。
动力学实验表明，IL-10对MLC-诱导的增殖的影响随时间逐步降低。当在一级培养开始时加入IL-10，有最大效果，如果在培养开始后2或3天加入，则有临界效果且观察到不清楚的剂量反应影响（图6）。这些结果说明IL-10在MLC中T细胞激活作用早期起作用。
IL-10在MLC中抑制细胞激活素生产
已经证明IL-10降低由抗-CD3或PHA激活的PBMC生产的IFN-γ和GM-CSF。另外，IL-10抑制由单核白细胞生产的细胞激活素。为了确定IL-10对单途径MLC中细胞激活素生产的影响，将异基因PBMC用作反应器和刺激器细胞。在没有或有IL-10或抗-IL-10mAb的情况下完成培养，在第5天收集上清液且检测其细胞激活素含量。表1表示在MLC中生产的IFN-γ，IL-6，GM-CSF和TNF-α，且IL-10在各种程度上抑制这些细胞激活素的生产。未检测到显著的IL-4生产，且IL-5的水平低于100pg/ml。在不同实验中，IL-10的生产量从1000到3000pg/ml。在IFN-γ的生产中观察到最弱的抑制效果。
在有抗-IL-10mAb完成的MLC（表1）的上清液中观察IFN-γ，GM-CSF和TNF-α的水平得到提高。抗-IL-10mAb对细胞激活素生产的这些增强作用是剂量依赖性的。综上所述，这些结果表明内源和外源IL-10降低所检测的细胞激活素的生产。为估算在MLC中IL-10对IL-2生产的影响且为了 降低由激活的T细胞消耗IL-2，在有或没有IL-10和抗IL-2受体mAb  BB10的情况下进行培养。在这些实验中，IL-10以剂量依赖性方式抑制IL-2生产（图7）。当以100U/ml加入IL-10时，没有检测到可检测水平的IL-2。
表1
外源和内源IL-10对由异抗原刺激的淋巴细胞生产细胞激活素的影响
条件  细胞激活素
IL-10  αIL-10  IL-6  IL-10  GM-CSF  TNF-α  IFN-γ
A  0  22.2  572  109  79  <1
1  20.5  41  61  <1
10  13.0  11  38  <1
100  12.1  16  47  <1
0.05  22.9  144  144  <1
0.5  25.8  165  111  <1
5  24.9  172  51  <1
A+B  0  35.4  1473  1744  141  29.5
1  35.3  928  151  20.8
10  23.9  784  82  18.1
100  24.7  612  66  11.4
0.05  36.9  2372  137  33.1
0.5  39.1  2355  137  45.3
5  39.1  3487  250  43.8
在没有和有IL-10或抗IL-10mAb  19F1的情况下，将人PBMC（A）单独或与异基因辐射的PBMC（B）一起培养5天。用细胞激活素特异的ELISA法，确定上清液中细胞激活素的生产。
表1表示四个实验之一的效果。
由外源IL-2不能恢复IL-10的抑制影响
为了研究是否在有外源IL-2的情况下观察到IL-10的抑制效果，用各种浓度的IL-2进行MLC。图8表示，向MLC中加入其量连续增加的IL-2时（其中，纯化的T细胞用作反应器和PBMC或纯化的B细胞用作刺激器），在没有和有IL-10的情况下，增殖都得到加强。然而，当以高至100U/ml的浓度加入IL-2时，仍然有IL-10的抑制影响;且应该说明10U/ml足以饱和高亲和度的IL-2R。相似地，当加入有T细胞生长因子活性的400U/ml  IL-4时，不能恢复由IL-10诱导的降低的增殖反应。综上所述，这些结果说明，在有IL-10的情况下完成MLC时，IL-2的缺乏不是导致所观察的降低的增殖反应的限制因子。
IL-10降低MLC激活T细胞的比例
为了确定存在IL-10的情况下在MLC中增殖反应的降低是否不同程度地影响CD4+或CD8+T细胞亚群，确定CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的比例。表2中表示当用异基因PBMC，纯化单核白细胞，或B细胞在IL-10存在的情况下刺激T细胞时，T细胞总数降低30到60%。然而CD4+和CD8+T细胞的比例相同，这说明IL-10对每一个T细胞亚群没有优先的影响。
相反，在含IL-10的培养物中，激活T细胞表达的CD25 和HLA-DR抗原的比例持续降低。用纯化B细胞或单核白细胞刺激纯化的CD3+T细胞时，在MLC中通常可观察到最大程度的减少。
表2
IL-10对异抗原刺激的T细胞的影响
Figure 931044812_IMG4
a）说明没有IL-10
b）ND＝未做
c）负挑选的单核白细胞
d）正挑选的单核白细胞（CD14+）
在没有或有IL-10（100U/ml）的情况下，将纯化的T细胞与经辐射的异基因PBMC，纯化B细胞或单核白细胞一起培养。 6天后，用间接的免疫荧光法计数并表型分析回收的T细胞。
呈现的结果表明在典型单途径一级MLC中，IL-10以剂量依赖的方式减少异反应性T细胞的增殖，其中，两种不同供体的异基因PBMC被分别用作反应器和辐射的刺激器细胞。用抗-IL-10mAb可完全中和这些抑制效果，从而表明抑制作用的特异性。另外，已表明在存在抗-IL-10mAb的情况下，显著地增强增殖反应，这说明内源IL-10的产生导致MLC中增殖反应的抑制。
将高度纯化的T细胞用作反应器和以纯化单核白细胞用作刺激器时，IL-10也降低MLC中的增殖反应。有意思的是，当由经辐射的异基因EBV-LCL刺激纯化的T细胞时，IL-10没有效力（参见图5b）。这些资料与前面的研究结果一致，即当以单核细胞，但不是EBV-LCL用作抗原递呈细胞（APC）时，IL-10明显地阻碍T细胞或T细胞克隆对可溶抗原或抗原肽的特异性增殖反应。发现这种降低的抗原递呈能力与IL-10对单核白细胞Ⅱ型MHC表达的下降调节有关。相反，IL-10不影响EBV-LCL的表达Ⅱ型MHC。从这些资料得出结论，降低的抗原特异性的增殖T细胞反应反映了反应器细胞激活作用的阻碍，而不是对T细胞增殖的直接抑制影响。存在IL-10的情况下激活的反应器T细胞克隆中减弱的Ca2+流动进一步支持该结论。
不仅在以单核白细胞用作刺激器而且使用纯化的B细胞时，IL-10也抑制MLC-诱导的增殖。数项研究已经表明，MHC异抗原的T细胞识别在机制上与病毒，细菌，或其它外源蛋白抗原的识别相似。最近，已经证明显著比例的MHCⅡ型异反应活性的T细胞克隆识别与异基因Ⅱ型分子相关的经加工的人血清蛋白的抗原决定簇。 在相反的情况中，需要形成新的MHC-肽复合体以激活抗原特异的T细胞克隆，没有迹象表明必须在单核白细胞和B细胞上形成新的异-MHC-肽复合体以刺激MLC中的T细胞。而且，IL-10不影响在人B细胞上表达Ⅱ型MHC膜。因此，这是不相似的，IL-10对MLC-诱导的T细胞增殖的抑制影响能够完全归因于对单核白细胞表达MHC  Ⅱ型的下降调节。可能是其它还未确定的机制在IL-10存在的情况下，引起B细胞的刺激能力降低。
已经表明，除经特异性异抗原交叉连接或TCR/CD3复合体外，LFA-1-ICAM-1的相互作用需要由异特异性的T细胞产生的细胞激活素。另外，已经证明CD28-B7/BB1的相互作用对诱导休止T细胞异抗原-特异性激活作用，从而导致细胞激活素的生产，增殖以及胞毒活性是必需的。B7在休止B细胞和单核白细胞上的表达很弱，但可随这些细胞的激活而提高。但是，可以排除由于IL-10对TCR/CD3或这些辅助分子的表达的下降调节引起增殖降低和胞毒异反应。IL-10不影响TCR/CD3，LFA-1在反应器T细胞上的表达，或ICAM-1和B7在用作为刺激器的B细胞或单核白细胞上的表达。
此外，本文所报道的资料说明对异抗原的降低的增殖反应也反映出对反应器T细胞激活作用的阻碍。需从培养的开始就加入IL-10以发挥其最大的抑制作用。另外，按CD25和HLA DR抗原的表达判断，在含IL-10的培养物中，激活T细胞的比例比对照MLC中明显地低。虽然存在IL-10的情况下完成的MLC中生产的全部CD3+T细胞总数是减少的，但这些T细胞亚群的比例与没有IL-10的情况下完成的对照MLC中的那些相比，IL-10 并不是优先地影响CD4+或CD8+T细胞的反应。CD25的表达降低说明在MLC中对T细胞增殖的抑制作用不仅仅是IL-10细胞激活素抑制活性的结果：当外源IL-2以足以饱和高亲和度IL-2受体的浓度加入（图8）时，IL-10也降低增殖反应的结论支持上述结果。总的来说，这些资料说明IL-10降低在MLC中PBMC，单核白细胞和正常B细胞的刺激能力。不能完全排除IL-10直接影响T细胞的可能性。但是，IL-10不能抑制用EBV-LCLs作为刺激器生产MLC的事实不支持该观点，除非EBV-LCL能超越IL-10的抑制效果。
存在外源IL-10的情况下，也显著地降低以全部异基因PBMC用作反应器和刺激器的MLC中生产的细胞激活素水平。IL-2，IFN-γ，TNF-α，和GM-CSF的量比没有IL-10的情况下完成的对照MLC中的相应量低约2到3倍。IL-6的生产受很少的影响;这可能由于在IL-10的抑制活性变得有效之前，这些培养基中的单核白细胞在激活后很早就已经生产了可观察的该细胞激活素。
目前的结果因此清楚地说明IL-10在体外下降调节异反应性中起重要的作用。从这些体外观察和研究看，对于移植组织的特异性免疫排斥来说，异抗原是主要对象，人们可预料在体内异基因移植后IL-10对耐受性的诱导和维持起重要作用。
实施例5
下列实施例在本申请的优先权日以后由Roncarolo和Bacehetta（1992）在Bone  Marrow  Transplantion：Proceedings  of Foetal  and  Neonatal  Cell  Transformation  and  Retroviral  Therapy  Vol  9，副刊1中公开的。它提供了体内胎儿干细胞移植后T细胞抗体库在耐受性方面的重要性的证据。
在用HLA错配的胎儿肝干细胞移植的患严重结合性免疫缺陷症的两个患者中研究T细胞抗体库和耐受机制。他们是18和6岁（在1993）且身体健康，对回忆抗原表现正常的免疫应答。他们的T细胞是供体源的，而单核白细胞和B细胞仍是宿主的。NK细胞有不同的来源，因为在一个患者中从供体得到，在另一个患者中从宿主得到。尽管在供体和宿主细胞间有HLA错配，但没有观察到急性或慢性移植物抗宿主病。用PBMC的体外实验表明对由宿主细胞表达的HLA抗原有特异的非应答性。然而，广泛的克隆分析表明，在两个患者的外周血液中存在CD4+和CD8+宿主反应性T细胞克隆，它们分别识别宿主Ⅱ型和Ⅰ型HLA分子。限制性稀释实验表明CD8+宿主反应性细胞的频率与对异反应活性T细胞所观察的范围一样。相反，可分离出非供体反应性CD8+细胞。宿主反应性CD4+和CD8+T细胞克隆在生产IL-2，IFN-γ，GM-CSF和IL-5能力方面是正常的，但它们完全不能合成IL-4。另外，来自患者RV的CD4+T细胞克隆分泌很高水平的IL-10。有趣的是，外源IL-10能够抑制CD4+宿主反应性T细胞克隆的增殖反应。这些资料说明，在进行异基因胎儿肝干细胞移植后，供体T细胞抗体库中没有缺失宿主反应性细胞。因此，体内宿主与供体间的耐受性由细胞激活素起作用的外周自动调节机制维持。
从HLA相同的供体进行骨髓移植是选择给患严重结合性免疫缺陷症（SCID）儿童的治疗法。然而，从错配的供体移植生成的红 细胞的胎儿肝细胞（FLT）可以提供持续的移植且在没有HLA-相同的骨髓供体的情况下提供一种可能的治疗（参见如，Touraine  et  al.（1987）Thymus  10：75-）。在上述患者中，可以在移植后的2-3个月内鉴定由HLA类型确定的供体源的免疫活性T淋巴细胞。虽然可用常规方法检测用胎儿肝干细胞移植的儿童中的外周T淋巴交移特质，但B淋巴细胞交移特质缺乏不是罕见的。对这些患者的免疫原性评估，给在HLA错配的体内条件下，在T前体细胞和分化环境之间研究人T细胞分化和自身/非自身辨别提供了唯一的可能。
关于用全部HLA完全不同的供体提供的胎儿肝干细胞移植的18和6岁前两个SCID儿童的报告为IL-10在调节免疫系统方面的体内活性提供了证据，特别是，由宿主反应性细胞生产的IL-10在体内下降调节它们的应答方面起重要的作用。
患者SP接受两种胎儿肝干细胞移植，同时注射同基因的胎儿胸腺。虽然标准HLA定型表明仅移植来自第二供体的细胞，但使用对多态HLC抗原决定簇特异的单克隆抗体进行的一种更精确的细胞荧光检测分析表明，10-20%的T淋巴细胞实际上来自第一个供体。第二个患者RV接受了七种胎儿肝干细胞移植，但在外周血液中仅能鉴别一种供体细胞群（参见Roncarolo  et  al（1986）J.Clin.Investig.77：673-）。
表3
HLA定型
A  C  B  DR  DQ
SP
受体  3-33  6  14-47  4-5  3
第一供体  2-11  4  27-62  1-8  1
第二供体  1-2  7  8-18  3-9  3
RV
受体  2-13  4-7  X-62  8-10  4-5
供体  2-30  4  8-35  11-13  6-7
在上述患者中，移植后观察到供体T细胞的稳定结合，而B细胞和单核白细胞是来源于宿主。
表4  交移特质
αβTCR+T细胞  供体源
γδTCR+T细胞
单核白细胞  宿主源
B细胞
NK细胞  宿主源->SP
供体源->RV
尽管在免疫系统的细胞内处于这种分离的交移特质状态，但仍可获得全部重建物并在体内和体外观察到对回忆抗原的正常抗体应答。这归因于供体T细胞能跨越异基因障碍与宿主的抗原递呈细胞（APC）协作。特别是，供体源的破伤风类毒素特异性的T细胞克隆（从患者SP的外周血液分离的）可以识别由宿主B细胞，EBV-转化的B细胞系，和NK细胞克隆加工并递呈的抗原（Ag）。相反，由供体细胞表达的Ⅱ型HLA抗原不能抑制至今所检测的任何Ag-特异性的T细胞克隆（参见Roncarolo  et  al.（1988）J.Expt'l  Med.167：1523-;Roncarolo  et  al.，（1991）J.Immunol.147：781-）。
在这两个患者中NK群体的交移特质不同。在一个患者中，新鲜的NK细胞和NK细胞克隆表现出宿主的HLA表型，在另一患者中 他们是源自于供体的。这些NK细胞表达CD16CD56抗原并表现出抗各种NK敏感的靶目标的正常胞毒活性。这些结果表明，宿主或供体功能NK细胞的存在不阻止胎儿干细胞移植后，供体T细胞的稳定结合。尽管淋巴样细胞与主要的和/或最小的组织亲和性抗原差异共存，但在这两个患者体内达到了完全的耐受性，且未观察到急性或慢性移植物抗宿主病。此外，体外研究表明，供体T细胞对宿主表达的HLA抗原的特异性非反应性存在于一级混和白细胞培养中，而抗异基因细胞的增殖反应是正常的。然而在克隆水平，研究结果有所不同。已经从两个患者的外周血液中得到供体源的宿主。反应活性胞毒T细胞克隆，它能识别Ⅰ型HLA或Ⅱ型HLA抗原。相反已经报告了在用HLA-单一相同亲本供体骨髓移植的SCID患者中，不能从这些患者中分离到供体反应活性的T细胞克隆。此外，在患者RV中，未能鉴别到与宿主共有的与HLA Ⅰ型位点A抗原特异的T细胞克隆。用改进的限制稀释检测方法（参见Vandekerckhove et al.（1992）J.Expl.Med.175：1033-1043）的频率分析确定供体反应活性的丧失并证明CD8+宿主-反应活性T细胞频率与T细胞抗第三个参与者的HLA抗原的反应频率范围相同。这些结果说明从供体T细胞抗体库中，不能通过克隆去除宿主反应活性细胞。显然，由于这些患者中，移植物抗宿主病的临床症状不明显，所以上述宿主反应活性的T细胞是受调节的。这可能是宿主反应活性细胞在体内是无反应性，且在存在IL-2的情况下体外刺激能中止这种无反应性。
在多克隆和抗原特异性的刺激后，宿主反应活性T细胞表现出一种独特的淋巴细胞激活素生产方式。没有CD4+或CD8+细胞克 隆能分泌IL-4，而它们能合成正常水平的IL-2，IL-5，和GM-CSF。这些克隆的IFN-γ生产量通常是非常高的。另外，在抗原特异性刺激后，患者RV的CD4+宿主反应活性克隆的IL-10生产量极高，这似乎与低IL-2合成负相关。此外，外源IL-10的加入可以显著地抑制体外CD4+宿主反应活性T细胞克隆的增殖反应。这提供了宿主反应活性细胞生产的IL-10在体内下降调节它们的应答方面起重要作用的证据。
实施例6
本实施例研究在用异基因干细胞移植的SCID患者中IL-10的生产。用错配的HLA胎儿干细胞给患严重结合免疫缺陷症的儿童移植，且在仅有供体T细胞结合时，获得免疫重建体。尽管对宿主具耐受性，在这些患者的外周血液中仍存在高频率的宿主反应活性T细胞，但说明自体调节抑制机制可导致体内的内环境稳定。最近，将IL-10描述成能抑制（异）抗原特异性T细胞激活和增殖的抑制性细胞激活素。对两个患有全部外周血液单核白细胞的半定量PCR分析。证明IL-10mRNA水平比正常供体的高很多，而IFN-γ和GM-CSF mRNA类似。对纯化单核细胞，B和T细胞的PCR分析表明宿主源的单核细胞引起IL-10的生产量增加。在一个患者中，在纯化的全部T细胞中也观察到高水平的IL-10mRNA。此外，由CD4+宿主反应活性T细胞生产的高水平IL-10以自体调节方式抑制应答宿主细胞的这些细胞的增殖。这些结果说明高水平内源IL-10生产可引起干细胞移植后异反应性的抑制。
1989年12月20日，申请人将携带pH5C，pH15C，和pBCRF1（SRα）的大肠杆菌MC1061的不同培养物寄存于美国典型培养物收集中心，Rockville，MD  USA（ATCC），寄存号分别为68191，68192，和68193。这些寄存物根据ATCC的关于用于专利目的的培养物寄存（Culture  Deposit  for  Patent  Purposes）的协议提供的条件进行寄存，根据35USC122和37CFR1.14，确保美国专利和商标委员会（US（Commissioner  of  Patents  and  Trademarks）得到寄存物，且在美国专利公开后，公众可得到，并要求使寄存物保持存活。当违背任何政府的权威机构根据其专利法授予的专利权时，得到寄存菌株不能构成实施本发明的许可。
已经对寄存物限制以便使其符合布达佩斯条约（Budapest  Convention）的要求。
本发明上文描述的实施例是为了达到说明和描述的目的。它们不是用来详尽或限制本发明以达到公开的精确形式，且显然，按上文的指导，许多改进和变化都是可行的。所选择和描述的实施方案是为了更好地解释本发明的原理以使本领域的其它技术人员能够在各种实施方案以及在特别设计的用途中所用的各种改进方案中更好地利用本发明。意图是本发明的范围由这里所附的权利要求限定。

Claims (15)

1、一种抑制个体中移植物抗宿主病或组织排斥的方法，该方法包括给个体施用有效量白细胞介素-10或其拮抗剂的步骤。
2、根据权利要求1的方法，其中所述白细胞介素-10选自病毒白细胞介素-10和人白细胞介素-10组。
3、根据一种抑制个体中移植物抗宿主病的方法，该方法包括给个体施用有效量的白细胞介素-10的步骤。
4、根据权利要求3的方法，其中所述白细胞介素-10选自病毒白细胞介素-10和人白细胞介素-10组。
5、一种抑制个体中组织排斥的方法，该方法包括给个体施用有效量白细胞介素-10的步骤。
6、根据权利要求5的方法，其中所述白细胞介素-10选自病毒白细胞介素-10和人白细胞介素-10。
7、根据权利要求1的方法中，其中所述白细胞介素-10是转译后的变异体或突变型蛋白。
8、一种抑制个体中移植物抗宿主病或组织排斥的方法，该方法包括给个体施用有效量的下列序列的白细胞介素-10：
Figure 931044812_IMG1
Figure 931044812_IMG2
9、根据权利要求8的方法，其中所述白细胞介素-10选自病毒白细胞介素-10和人白细胞介素-10组。
10、白细胞介素-10治疗移植物抗宿主病或组织排斥的用途。
11、制备用于治疗移植物抗宿主病或组织排斥的药物的白细胞介素-10的用途。
12、一种治疗患有移植物抗宿主病患者的方法，包括给所述患者施用有效量的白细胞介素-10。
13、用于治疗移植物抗宿主病或组织排斥的白细胞介素-10。
14、用于治疗移植物抗宿主病或组织排斥的含白细胞介素-10的药物组合物的用途。
15、制备用于治疗移植物抗宿主病或组织排斥的药物组合物的白细胞介素-10的用途。
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