CN105106214A

CN105106214A - 抑制移植物抗宿主病的新型Lck的小分子抑制剂

Info

Publication number: CN105106214A
Application number: CN201510471992.0A
Authority: CN
Inventors: 范国煌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-05
Filing date: 2015-08-05
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明公开了一种新型蛋白激酶Lck的小分子抑制剂，用于抑制同种异体嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）所引起的移植物抗宿主病（GVHD）。所述的Lck激酶小分子抑制剂为FL-2501，其分子式为：

Description

抑制移植物抗宿主病的新型 Lck 的小分子抑制剂

技术领域

本发明涉及生物医药领域的一种抑制移植物抗宿主病（GVHD）的新型Lck的小分子抑制剂，尤其涉及一种对体细胞抗原受体（TCR）的信号传递具有强烈抑制作用的小分子化合物，用于预防同种异体CAR-T治疗过程中所产生的可能致命的GVHD。该化合物也适用于同种异体骨髓移植所产生的GVHD。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T疗法）代表当今肿瘤免疫细胞治疗技术的最前沿，在急性淋巴细胞白血病的临床试验中获得极大的成功。它的基本原理就是利用病人自身的T细胞，嵌合抗原受体修饰后，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。CAR-T治疗分以下五步：1）从癌症病人身上分离免疫T细胞。2）利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体（CAR），使T细胞变成CAR-T细胞。它不再是一个普通的T细胞，它是一个带着GPS导航，随时准备找到癌细胞，并发动自杀性袭击。 3）体外培养，大量扩增CAR-T细。4）把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内。5）严密监护病人，尤其是控制前几天身体的剧烈反应。

目前的CAR-T疗法是一种“个性化”的疗法，细胞制品来自于患者自身，无法“现货供应”，只能“现做现用”，不仅操作复杂，不可控因素多，关键问题在于90%的患者由于自身T细胞缺陷，尤其是在CAR-T治疗前往往接受过化疗和免疫抑制剂治疗，T细胞数量和质量达不到CAR-T制备的要求，因而无法接受CAR-T治疗。鉴于这一问题，多个中心尝试开发通用型CAR-T，即采用正常异体来源的T细胞制备CAR-T，用于肿瘤患者的治疗。这种策略显著拓宽了CAR-T的细胞来源，避免因患者自体T细胞因数量低、功能不足、扩增能力差等限制应用。第三方细胞来源的CAR-T还具备易于操作、重复性好等优势，更有利于大批量临床应用。同种异体CAR-T治疗的主要风险是移植物抗宿主病（GVHD）。鉴于T细胞受体（TCR）及其介导的信号通路是产生GVHD的关键因素，目前普遍采用的技术是通过敲除内源性TCR基因以排除同种异体TCR导致的GVHD。但是，通过敲除TCR制备同种异体CAR-T目前遇到敲除效率低等技术瓶颈，预计在若干年内都不能用于临床。

TCR的信号传递需要关键的蛋白激酶，包括蛋白激酶Lck和ZAP-70。

Lck是T淋巴细胞所特异表达的一种蛋白激酶。它与辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的CD4和CD8共受体的细胞内段结合，从而协助TCR的信号转导。当TCR被MHC所递呈的抗原激活后，Lck首先使CD3及TCR复合物的z链发生磷酸化，从而使细胞内的络氨酸激酶ZAP-70与之结合。然后，Lck使ZAP-70发生磷酸化，后者进一步使信号分子LAT（Linker of Activated T cells）发生磷酸化，参照图1所示。

另外，近年的研究发现，抑制Lck能增强CAR-T的抗肿瘤功能，尤其是对实体肿瘤的杀伤作用。在实体肿瘤中常常有大量的调节性T细胞（Treg）浸润，在这种情况下，CAR-T的肿瘤细胞杀伤效果显著降低。研究发现，抑制Lck能解除 Treg对CAR-T的抑制作用。

络氨酸激酶Lck介导的信号转导首先体现在细胞内Ca²⁺的移动以及一系列信号分子的激活。这些信号分子包括Ras-MEK-ERK通路，后者激活一系列转录因子，包括NFAT、NF-κB和AP-1，从而调节IL-2等基因的表达，促进T细胞的增殖和分化。因此，Lck抑制剂不仅能有效地阻断TCR介导的GVHD，同时能增强CAR-T的肿瘤杀伤效果，在同种异体CAR-T治疗以及骨髓移植方面具有良好的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种抑制移植物抗宿主病的新型Lck的小分子抑制剂，旨在开发Lck的小分子抑制剂，抑制TCR的信号传递而不影响T细胞的抗肿瘤功能，从而克服同源异体CAR-T治疗过程中所引起的致命的GVHD。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种新型Lck小分子抑制剂，所述的Lck小分子抑制剂为FL-2501，其分子式为：

。

进一步的，所述的新型Lck小分子抑制剂，用于抑制同种异体CAR-T治疗过程中所引起的移植物抗宿主病。

进一步的，所述的Lck特异性小分子抑制剂为FL-2501的衍生物。

进一步的，所述的Lck的特异性小分子抑制剂抑制TCR信号及T细胞活化，用于制备同种异体CAR-T，避免其产生移植物抗宿主病。

进一步的，所述的Lck的特异性小分子抑制剂抑制TCR信号及T细胞活化，用于预防同种异体骨髓抑制所产生的移植物抗宿主病。

本发明的有益效果是:

本发明的Lck的特异性小分子抑制剂通过抑制Lck使T细胞上的TCR受体信号转导抑制，进而抑制TCR介导的GBHD的产生。所发明的Lck的特异性小分子抑制剂可抑制同源异体CAR-T治疗所引起的GVHD，促进同源异体CAR-T的推广和产业化。同时，这类化合物也可用于预防同种异体骨髓抑制所引起的GVHD。

本发明用高通量筛选法从化合物库中筛选到对TCR信号具有高强度选择性抑制作用的小分子化合物，包括其药学上可接受的盐和前体药。该化合物是蛋白激酶Lck的选择性抑制剂，在体外试验中能抑制CAR-T细胞内TCR的信号传递，但不影响CAR-T的增殖和肿瘤杀伤功能。此类化合物可以有效地抑制同种异体CAR-T治疗过程中所产生的GVHD，促进同种异体CAR-T的临床应用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是Lck参与TCR信号转导的示意图。当TCR被MHC所递呈的抗原激活后，Lck首先使CD3及TCR复合物的ζ链发生磷酸化，从而使细胞内的络氨酸激酶ZAP-70与之结合。然后，Lck使ZAP-70发生磷酸化，后者进一步使信号分子LAT（Linker of Activated T cells）发生磷酸化。

图2是基于Lck荧光极化的高通量筛选流程图。

图3是本发明的FL-250对原代培养的T细胞络氨酸激酶的抑制作用。（A）FL-2501抑制OKT3介导的络氨酸激酶磷酸化；（B）FL-2501抑制OKT3介导的Lck的下游蛋白激酶ERK的磷酸化。

图4是本发明的FL-2501对TCR-介导的T细胞内Ca²⁺的移动的抑制作用。FL-2501对T细胞与孵育后向细胞培养液中加anti-CD3,然后用FLIPR®Calcium Assay Kits检测Ca²⁺的移动。FL-2501显著抑制TCR-介导的T细胞内Ca²⁺的移动。

图5是本发明的FL-2501对TCR-介导的IL-2产生的抑制作用。FL-2501对T细胞与孵育后向细胞培养液中加anti-CD3, 然后用ELISAs检测IL-2的水平。FL-2501显著抑制TCR-介导的IL-2的表达。

图6是本发明的FL-2501对自体或异体CAR-T的排斥反应（体外GVHD）的抑制作用。自体或异体的CAR-T细胞经FL-2501孵育后进行混合淋巴反应实验。我们发现，FL-2501对异体CAR-T引起的排斥反应有显著的抑制作用。

图7是本发明的FL-2501对CAR-T抗肿瘤功能的影响。FL-2501对CAR-T的抗肿瘤功能无显著影响，提示FL-2501抑制GVHD但不抑制CAR-T的肿瘤杀伤功能。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

参照图2所示，鉴于Lck在TCR的信号转导以及TCR介导的GVHD过程中的关键作用，我们建立了基于Lck荧光极化的高通量筛选平台, 通过筛选，获得了Lck选择性抑制剂。将所得的化合物经TCR信号转导实验进一步筛选，所获得的Lck选择性抑制剂能显著抑制TCR介导的GVHD。

通过这一系列筛选，我们发现了一系列PKCθ的选择性抑制剂。其中包括FL-2501。

进一步的，所述的PKC抑制剂为FL-2501的衍生物。

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2502，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2503，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2504，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2505，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2506，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2507，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2508，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2509，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2510，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2511，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2512，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2513，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2514，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2515，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2516，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2517，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2518，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2519，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2520，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2521，其分子结构如下：

优选的，所述FL-2501的衍生物为FL-2522，其分子结构如下：

进一步的，所述的Lck选择性抑制剂用于制备预防或治疗GVHD的药物。

进一步的，所述的Lck选择性抑制剂用于预防同种异体CAR-T所引起的GVHD，也可用于同种异体骨髓移植所引起的GVHD。

实施例1：参见图6，FL-2501对异体T细胞所引起的混合淋巴反应（体外排斥反应）具有显著的抑制作用。究其原理，我们发现FL-2501显著抑制络氨酸激酶Lck，进而抑制TCR介导的细胞信号转导，导致IL-2等基因的表达下调。显著抑制CD3/28激活TCR所引起的转录因子RelA以及细胞因子IL-2表达，参照图3至图5。

值得注意的是，FL-2501并不影响CAR-T的肿瘤杀伤功能，参照图7所示。因此，通过抑制TCR的信号转导，FL-1507对异体T细胞移植所致的GVHD有优良的抑制作用，对于同种异体CAR-T治疗以及骨髓抑制具有潜在的应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新型Lck小分子抑制剂，其特征在于：所述的Lck小分子抑制剂为FL-2501，其分子式为：

。

2.根据权利要求1所述的新型Lck小分子抑制剂，用于抑制同种异体CAR-T治疗过程中所引起的移植物抗宿主病。