CN107073039A - 用于癌症治疗的免疫疗法 - Google Patents

Abstract

描述了使用双阴性(DN)T细胞治疗癌症的方法。DNT可用于治疗化疗抗性癌症诸如再发的或复发的急性髓性白血病(AML)。还描述了对正常宿主组织不显示毒性和与移植物抗宿主病相关的并发症的同种异体DNT(诸如衍生自健康供体的那些)的用途。

Description

用于癌症治疗的免疫疗法

相关申请

本申请要求2014年8月15日提交的美国临时专利申请No.62/037,889的优先权，该临时申请的内容通过引用整体纳入本文。

技术领域

本公开内容涉及使用双阴性T细胞治疗癌症诸如白血病和淋巴瘤，包括急性髓性白血病(AML)。

背景技术

急性髓性白血病(AML)是成人急性白血病的主要原因，占所有成人白血病的～80％(Menzin等，2002)。尽管为了开发更有效的靶向该疾病的方法进行了广泛的研究，但AML仍然与低长期存活相关；只有～5％的AML老年患者和～30％的AML年轻患者能够存活5年或更长时间(Ungewickell and Medeiros,2012；Hoand等,2012)。常规化疗可在>70％的受治疗的AML患者中有效地实现疾病的初期缓解(Ungewickell and Medeiros,2012)。然而，由于该疾病的高度异质性，～30％的AML患者不响应化疗(Ungewickell and Medeiros,2012；Bucisano等,2012)。此外，化疗不能在大多数患者中实现疾病的完全清除，大于70％的缓解期患者在初期治疗后的2年内复发AML(Ungewickell and Medeiros,2012；Bucisano等,2012)。对于复发AML的患者没有标准的治疗方案，复发的AML与预后不良相关(Ferrara等,2004)。复发的AML是由一种叫做微小残留病(MRD)的现象引起的，这种现象由具有化疗抗性的AML细胞群介导(Garces-Eisele,2012；Lin and Levy,2012)。已知MRD很大程度上是由白血病干细胞(LSC)群引起的，因为其能够承受恶劣的环境和条件，诸如化疗(Ishikawa等,2010；Kadowaki和Kitawaki,2011；Vaz等,2013)。因此，开发靶向AML-LSC和MRD的治疗以实现疾病的无复发的清除是一个活跃的研究领域。

同种异体造血干细胞移植(同种异体HSCT)是AML患者的潜在治愈性治疗，并且与常规化疗相比具有更高的无疾病存活率(Alatrash和Molldrem,2009)。供体来源的T细胞介导的抗白血病效应有助于增加患者的存活，因为T细胞耗竭的移植物导致更高的复发率(Alatrash和Molldrem,2009)。然而，临床上同种异体HSCT的使用受到短缺合适供体、治疗的毒性和其他相关并发症的限制(Alatrash和Molldrem,2009；Shlomchik,2007)。强烈的免疫应答可以在正常组织上诱导，导致组织损伤，并且可能在严重病例中导致患者死亡(Alatrash和Molldrem,2009；Shlomchik,2007)，因此构成限制使用同种异体细胞治疗的主要障碍。

自从利用T细胞免疫疗法治疗黑色素瘤患者的早期工作以来，对其他癌症的过继性T细胞疗法已经取得了显著进展，这进一步支持了细胞疗法的潜在应用以实现无复发的AML清除(Rosenberg等,1988)。已鉴定了在白血病细胞中上调的抗原，白血病相关抗原(LAA)，并且已在体外和动物模型中证实了LAA-特异性T细胞的抗白血病作用(Vaz等,2013；Teague和Kline,2013)。然而，LAA-特异性T细胞的使用受碍于分离和扩增这些细胞的困难(Kochenderfer等,2010；Johnson等,2009；Parkhurst等,2011；Robbins等,2011)。此外，尽管许多LAA在AML中过表达，但这些抗原在其他组织诸如胸腺中的表达由于T细胞特异性的胸腺选择而阻止了具有对LAA高度亲和的受体的成熟T细胞的发育(Teague和Kline,2013)。或者，也已经尝试了使用表达针对LAA的转基因TCR或嵌合Ag受体的转基因CD8+T细胞，所述LAA分别诸如Wilms’肿瘤抗原或Lewis Y(Peinert等,2010；Xue等,2010)。这些T细胞具有显著增加的结合LAA的能力并且显示出优异的抗肿瘤活性(Kochenderfer等,2010；Johnson等,2009；Parkhurst等,2011；Robbins等,2011)。然而，与基因治疗相关的潜在副作用，连同复杂和漫长的程序，限制了使用这些策略来治疗AML。此外，注射超生理数量的基因工程T细胞可导致严重的不良事件，包括死亡。因此，开发对广泛的癌症具有有效作用而不需要鉴定LAAs的新的细胞免疫疗法将革新白血病免疫疗法。

双阴性T细胞(DNT细胞或DNT)是成熟的外周T淋巴细胞，它们表达CD3-TCR复合体但不表达CD4、CD8或NKT细胞标志物αGalCer-加载的CD1d和Jα24-Vα14；它们代表了人体中1～3％的外周血单核细胞(PBMC)(Zhang等,2000)。已经描述了在化疗诱导的完全缓解期间从AML患者中扩增DNT的方法，并且已经证明AML患者DNT在体外对获自同一患者的原代AML细胞具有显著的抗白血病活性(Young等,2003；Merims等,2011)。

先前已经证明DNT以剂量依赖性方式通过穿孔素-颗粒酶依赖途径诱导杀死同种异体AML细胞系(Merims等,2011)。在动物模型中，也已证明，与常规的CD4+或CD8+T细胞不同，灌注同种异体的小鼠DNT可赋予免疫抑制功能(Zhang等,2000；Young等,2003；He等，2007)。然而，还未在体内研究过DNT对于患者原代白血病细胞的活性。

发明内容

在本发明的一个方面，已经确定双阴性(DN)T细胞(DNT)对于治疗癌症诸如淋巴瘤或白血病是有效的。特别是，使用DNT的免疫疗法已被证明对于急性髓性白血病(AML)的治疗是有效的，包括杀死对化疗治疗有抗性的白血病细胞。任选地，DNT可以是自体的，诸如来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者的DNT，或同种异体的，诸如来自没有癌症的健康供体的DNT。值得注意的是，观察到DNT在体外以及在异种移植模型中体内对癌细胞具有细胞毒性，而在正常细胞和组织中没有可检测出的毒性。

如实施例2中所示，已证明注射的DNT在体内增殖和存留，并迁移到不同的组织包括血液、脾脏和肺，还在肺、肝脏和骨髓观察到DNT群体，表明DNT可靶向这些器官中的肿瘤。本发明人还证明了来自健康供体的同种异体DNT选择性靶向AML细胞并显示癌症杀伤活性。DNT还显示出在AML异种移植模型中抑制植入，表明DNT在体内可减少白血病细胞的水平。此外，如实施例6所示，注射的DNT从血液迁移到骨髓并靶向预先存在的AML癌细胞，表明DNT在用于治疗患有AML的受试者的临床环境中可以是有效的。

许多癌细胞系也被证明表现出体外对DNT细胞介导的细胞毒性的高度敏感性，包括Daudi(B细胞淋巴瘤(伯基特淋巴瘤))、Jurkat(急性T细胞淋巴瘤)、K562(慢性髓性白血病)、U937(慢性髓性白血病)以及原代和建立的肺癌细胞系(数据未显示)。

化疗是用于AML患者的标准治疗，可有效减少白血病负荷并实现疾病的初期缓解。然而，化疗通常不能实现完全清除，导致AML患者的高复发率。因此，消除对化疗不响应的AML细胞并降低复发率的能力预期将显著增加AML患者的存活。如实施例7所示，本发明人已经证明DNT在杀死化疗抗性癌细胞特别是化疗抗性AML中是有效的。因此，DNT可用于在不响应化疗的受试者中进行免疫治疗或用于预防或治疗复发或再发的癌症诸如AML和/或化疗抗性的微小残留病(MRD)的病例。

在本发明的另一方面，已显示DNT与细胞周期抑制剂组合有效杀死癌细胞。如实施例9所示，使用DNT和细胞周期抑制剂AraC的组合治疗相对于单独用AraC的治疗降低了AML植入的水平。

如实施例10中所示，同种异体的DNT具有针对原代AML患者胚细胞(blast)的强效抗白血病作用，包括体外化疗抗性癌细胞和在异种移植模型中，对正常细胞和组织没有可检测出的毒性。未观察到同种异体DNT攻击正常外周血单核细胞(PBMC)或造血祖细胞/干细胞，也未在小鼠中引起异种移植物抗宿主病。

因此，在一个实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的如本文所述的DNT。还提供了如本文所述的DNT用于在有需要的受试者中治疗癌症的用途。在一个实施方案中，所述癌症是白血病。在优选的实施方案中，所述癌症是急性髓性白血病(AML)。在一个实施方案中，所述癌症是慢性髓性白血病(CML)。在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一个实施方案中，所述癌症是B细胞淋巴瘤，诸如伯基特淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症是急性T细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症是肺癌。

在一个实施方案中，所述癌症对化疗治疗有抗性。例如，在一个实施方案中，所述癌症是化疗抗性AML。在一个实施方案中，本文所述的方法和用途用于治疗患有再发的或复发的癌症的受试者。在一个实施方案中，癌症是再发的、复发的或难治性白血病或淋巴瘤。在一个实施方案中，癌症是复发的癌症，诸如由微小残留病(MRD)或白血病干细胞引起的复发的AML。在一个实施方案中，所述受试者不处于完全缓解中。例如，在一个实施方案中，受试者具有一个或多个可检测出的癌细胞，任选地一个或多个可检测出的白血病或淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，受试者先前已经进行了癌症的化疗治疗，但是癌细胞对所述化疗治疗不响应(即，难治性癌症)。在一个实施方案中，受试者先前已经进行了癌症的化疗治疗，并且具有一个或多个可检测出的癌细胞。在一个实施方案中，受试者先前没有进行癌症的化疗治疗。在一个实施方案中，DNT用于在患有癌症或怀疑患有癌症但没有在进行化疗的受试者中使用或给药。

在一个实施方案中，提供了用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，包括使癌细胞与一个或多个DNT接触。还提供了如本文所述的DNT用于抑制癌细胞的生长或增殖的用途。任选地，所述癌症细胞是在体内或体外。在一个实施方案中，所述癌细胞是白血病细胞。在优选的实施方案中，癌细胞是AML细胞。在一个实施方案中，癌细胞是淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，癌细胞是对化疗治疗有抗性的细胞。例如，在一个实施方案中，癌细胞是对用细胞周期抑制剂如AraC的治疗有抗性的AML细胞。在一个实施方案中，癌细胞是癌干细胞，诸如白血病干细胞。

本文所述的DNT可以容易地由本领域技术人员获得，并且容易与其它类型的T细胞区分。在一个实施方案中，DNT不表达CD4和CD8。在一个实施方案中，DNT表达CD3-TCR复合物，并且不表达CD4和CD8。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、γδ-TCR+或αβ-TcR+、CD4-、CD8-、α-Gal-、PD-1-、CTLA4-。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、γδ-TCR+或αβ-TcR+、CD4-、CD8-、α-Gal-、PD-1-、CTLA4-、CD44+、CD28-。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、CD4-、CD8-、α-Gal-、PD-1-、CTLA4-、CD44+。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、CD4-、CD8-、α-Gal-、Jα24-、Vα14-、CD44+、PD-1-、CTLA4-、CD45Ro+。在一个实施方案中，DNT可从包含外周血单核细胞(PBMC)的样品获得。在一个实施方案中，所述样品是血液样品。任选地，所述样品来自健康供体或来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者，并且DNT用于治疗所述受试者。

任选地，DNT细胞可在给予或使用它们来治疗如本文所述的癌症以前在体外或离体扩增。在一个实施方案中，将DNT配制成通过静脉内注射使用于或给予受试者。

在一个实施方案中，DNT是从受试者诸如患有癌症或怀疑患有癌症的受试者获得的自体DNT。在一个实施方案中，DNT来自具有一个或多个可检测出的癌细胞、任选地一个或多个白血病或淋巴瘤细胞的受试者。在一个实施方案中，DNT来自先前已经被治疗癌症的受试者。在一个实施方案中，DNT来自完全缓解的受试者。在一个实施方案中，DNT来自不完全缓解的受试者。在一个实施方案中，在化疗之前、化疗期间或化疗之后从受试者获得DNT。例如，DNT可以在开始化疗疗程之前、在第一轮化疗后、在数轮化疗之间或在一轮或多轮化疗之后从受试者获得。在一个实施方案中，在给予受试者化疗剂的同一天、3天内、1周内、2周内、3周内或1个月内从受试者获得DNT。

在一个实施方案中，DNT是同种异体的，诸如从一个或多个没有癌症的受试者获得的DNT。在一个实施方案中，DNT从一个或多个健康供体获得。

在一个实施方案中，DNT用于或给予受试者以治疗癌症，诸如用于治疗白血病或淋巴瘤。在一个实施方案中，DNT用于或给予没有在经历化疗的受试者。在另一个实施方案中，DNT在化疗之前、化疗期间或化疗之后用于或给予受试者。例如，DNT可以在开始化疗疗程之前、在第一轮化疗后、在数轮化疗之间或在一轮或多轮化疗之后用于或给予受试者。在一个实施方案中，DNT在化疗的同一天、3天内、1周内、2周内、3周内或1个月内给予受试者。在一个实施方案中，化疗包括使用或给予一种或多种化疗剂，诸如本文所述的细胞周期抑制剂。

任选地，可以给予或使用两个或更多个单独剂量的DNT以在有需要的受试者中治疗癌症。例如，在一个实施方案中，本文所述的方法和用途包括第一剂量的DNT和至少一个另外剂量的DNT。在一个实施方案中，所述至少一个另外的剂量用于在DNT的最后剂量的至少3天后、在DNT的最后剂量的至少5天后、或任选地在DNT的最后剂量的3天至两周之间之后使用或给予。在一个实施方案中，所述两个或更多个单独剂量用于在化疗之前、化疗期间或化疗之后给予或使用。

在一个实施方案中，DNT是已经被修饰以表达一种或多种外源蛋白质的重组细胞。例如，在一个实施方案中，本文所述的DNT表达对癌生物标志物(诸如在癌细胞表面上表达的蛋白质)具有高亲合力的受体。在一个实施方案中，DNT表达优先结合癌细胞(诸如白血病细胞)的嵌合抗原受体(CAR)。例如，在一个实施方案中，本文所述的DNT表达结合CD33、CD19、CD20、CD123和/或LeY的一种或多种受体。

在一个实施方案中，相对于正常细胞，DNT优先杀死和/或抑制癌细胞的增殖。在一个实施方案中，相对于正常细胞，DNT优先杀死和/或抑制白血病细胞的增殖。例如，在一个实施方案中，相对于其他造血细胞或外周血单核细胞(PBMC)，DNT优先杀死和/或抑制AML胚细胞的增殖。在一个实施方案中，相对于正常造血干细胞，DNT优先杀死和/或抑制白血病干细胞的增殖。

在另一个实施方案中，当使用或给予受试者用于治疗癌症时，DNT不引起同种异体免疫应答。

本发明人已经确定，使用DNT和化疗剂诸如细胞周期抑制剂的联合治疗在杀死癌细胞、特别是AML方面出乎意料地有效。因此，在一个实施方案中，提供了治疗受试者中的癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的DNT和化疗剂。还提供了有效量的DNT和化疗剂用于治疗癌症的用途。在一个实施方案中，化疗剂是细胞周期抑制剂。在一个实施方案中，细胞周期抑制剂是DNA合成抑制剂。任选地，将DNT和化疗剂在不同时间或相同时间给予所述受试者。

在一个实施方案中，化疗剂是细胞周期抑制剂。在一个实施方案中，细胞周期抑制剂是细胞周期依赖性化疗药物。示例性细胞周期抑制剂包括但不限于，多柔比星(Doxorubicin)、美法仑(Melphlan)、罗斯考维汀(Roscovitine)、丝裂霉素C、羟基脲、50氟尿嘧啶、顺铂、Ara-C、依托泊苷(Etoposide)、吉西他滨(Gemcitabine)、硼替佐米(Bortezomib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、丙戊酸钠、HDAC抑制剂或达卡巴嗪(Dacarbazine)。HDAC抑制剂的实例包括但不限于FR01228，曲古抑菌素A(Trichostatin A)，SAHA和PDX101。

在一个实施方案中，提供了治疗受试者的急性髓性白血病(AML)的方法，包括给予所述受试者有效量的DNT和化疗剂。在一个实施方案中，所述化疗剂是细胞周期抑制剂。在一个实施方案中，所述细胞周期抑制剂是AraC。在一个实施方案中，所述受试者具有再发的或复发的AML，诸如由微小残留病(MRD)引起的再发的或复发的AML。在一个实施方案中，所述受试者患有化疗难治的白血病。

在另一个实施方案中，提供了包含DNT和化疗剂的组合物。在一个实施方案中，所述化疗剂是细胞周期抑制剂。在一个实施方案中，所述细胞周期抑制剂是AraC。任选地，组合物还包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，还提供了包含DNT和化疗剂的组合物用于治疗癌症的用途。在一个实施方案中，所述组合物用于治疗AML。在一个实施方案中，所述组合物用于治疗对单独使用化疗剂的化疗有抗性的AML。

根据以下详细说明，本公开内容的其他特征和优点将变得显而易见。然而应当理解，详细说明和具体实施例虽然指示了本公开内容的优选实施方式，但其仅用于解释，因为根据这些详细说明，本公开内容的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

现在将联系附图说明本公开内容的一个或多个实施方案，其中：

图1a示出了来自AML患者与健康志愿者的外周血中的DNT的扩增，并且DNT可离体和在体外扩增。分别测定了从24名来自缓解期的患者和7名HV的20ml PB的36个和7个DNT-扩增培养物扩增的DNT的数目。图1b示出了增殖，图1c)示出了NSG小鼠模型中离体扩增的HVDNT的迁移。2×10⁷个CFSE标记的DNT静脉注射到NSG小鼠，在第0、2、3、和7天，腹膜内注射10⁵IU IL-2补充液。图1b示出了在注射后第2、7、10和14天检测到的脾脏中人CD45+细胞的CFSE荧光变化的代表性图。图1c示出了从血液、脾、骨髓、肝、和肺收获的人细胞的频率和数目(n＝3)。数字示出了平均值和SEM，误差棒代表每组的SEM。(***p<0.001)。

图2a示出了新开发的基于流动的杀伤测定的代表性图，以确定原代AML样品对DNT细胞介导的细胞毒性的体外敏感性。用原代AML样品090596和来自健康供体的正常PBMC以不同的效应物与靶标比进行该测定。膜联蛋白V荧光用于确定共培养后的凋亡水平。图2b显示了使用同种异体DNT对健康和白血病细胞进行的基于流动的杀伤测定的结果。用从三个健康供体(HD)扩增的针对不同的靶标的同种异体DNT进行基于流动的杀伤测定来确定特异性杀伤百分比，所述靶标为：AML(实心)、AML3和两种原代AML患者胚细胞，以及获得自三个健康供体(空心)的PBMC和造血干细胞和祖细胞(HSPC)。每个图表示进行的三次杀伤测定的平均值，误差棒表示SEM。

图3a显示体外筛选患者AML胚细胞对DNT细胞介导的细胞毒性敏感性的结果，并且在一个实施方案中证明，HD DNT在体外诱导针对大部分原代AML胚细胞的强力溶细胞活性。通过同种异体DNT以4:1效应物与靶标比介导的21个原代AML样品的特异性杀伤百分比。图3b显示在注射之前用DNT处理AML显著降低AML体内植入的水平。原代AML胚细胞#0578在有或没有DNT的情况下培养18小时，股骨内注射到亚致死照射(225cGy)的NSG小鼠(分别为n＝5和n＝3)。胚细胞移植的31天后，处死小鼠并收获注入的骨髓细胞，所述细胞用人抗CD45和抗CD33染色，并通过FACS分析。AML植入的水平通过人CD45+和CD33+细胞的频率来确定。示出了每组的平均％植入，误差棒代表SEM。*表示相比单独胚细胞对照的显著差异(*p<0.05)

图4显示同种异体的DNT介导抗白血病活性，并且同种异体的DNT可在体内靶向原代AML胚细胞。亚致死照射的NSG小鼠通过股骨内注射5.0x10⁶#5786(图4a)或#090392(图4b)患者胚细胞而植入原代AML。#5786或#090392注射的分别10或14天后，小鼠静脉内注射2×10⁷HV DNT或PBS。DNT注射的14-21天后，处死小鼠，用抗人CD38、CD33、CD34、和CD45荧光标记的抗体染色来自注射了胚细胞的骨的细胞。通过人CD38、CD33、CD33和/或CD45阳性细胞的百分比来确定注射了胚细胞的骨中AML细胞的频率。

图5显示多剂量治疗增强了DN T细胞疗法的功效。植入了2.4×10⁶个胚细胞(#090240)的NSG小鼠在如上所述注射胚细胞的10天后用DNT处理、或保持不处理。胚细胞注射的37天后，处死小鼠，收获脾脏。在DN T细胞处理的(▲)或未处理的(■)小鼠的脾脏中发现的AML胚细胞以及原代患者AML胚细胞090240(●)用作基于流动的杀伤测定中的靶标，该测定用从两个健康供体扩增的DNT进行，如实施例3所述，确定各靶标的特异性杀伤％。为了确定DNT处理后残余的AML胚细胞是否对DN T细胞介导的细胞毒性有抗性，将残余的胚细胞从DN T细胞-和PBS-处理的小鼠的脾中分离。用基于流动的杀伤测定来确定收获的残余AML细胞和最初用于植入的原代AML胚细胞对体外DN T细胞介导的溶细胞作用的敏感性(图5a)。基于该观察，测试了多剂量DN T细胞处理的效力。图5b和 5c)显示，DNT能够以剂量依赖性方式介导体内的抗白血病活性。如上所述给NSG小鼠植入2.4×10⁶个胚细胞#090240，在胚细胞注射后第20天(1×DNT)或者第10和第20天(2×DNT)用2×10⁷的DNT处理，或者保持不处理。在胚细胞注射后第34天，处死小鼠，如上所述确定在注射胚细胞的骨髓(图5b)和脾(图5c)中植入的AML细胞的频率。显示了平均AML植入％，误差棒代表SEM(*p<0.05,**p<0.01)。

图6显示DNT可靶向化疗敏感性以及化疗抗性的AML。针对来自化疗抗性、难治性(空心)或复发的(实心)患者(图6a)或化疗敏感性患者(图6b)的原代AML样品进行基于流动的杀伤测定。以4:1的效应物:靶标比将细胞共孵育2小时。图6c)示出了从化疗抗性(n＝10)和化疗敏感性(n＝8)样品计算的4:1效应物:靶标比时的特异性杀伤百分比的比较。数字代表平均％特异性杀伤值，带有SEM。n.s.–无统计学显著性。

图7显示体内由DNT介导的对LSC的潜在靶向。植入了高攻击性胚细胞090240的NSG小鼠在胚细胞注射的10天后用2×10⁷DNT或PBS处理。胚细胞注射后第39天，处死小鼠，分别确定未注射的组织、未注射的骨(图7a)和脾(图7b和7c)中AML细胞的频率或频率和数目。每条线代表平均值，误差棒代表SEM。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)

图8显示DNT-和化学-组合疗法的抗白血病活性。植入了胚细胞090240的NSG小鼠用PBS(无处理●)、或AraC(AraC，■)、或AraC然后加DNT(AraC+DNT，◆)处理。胚细胞注射后第37天，处死小鼠，确定注射的骨(图8a)、未注射的骨(图8b)和脾(图8c)中AML细胞的频率。每条线代表平均值，误差棒代表SEM。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

图9a示出了化疗药物AraC在AML细胞对DNT细胞毒性的敏感性上的效果。KG1a用1ug/ml AraC或PBS处理14小时。然后，KG1a与从健康供体离体扩增的DNT以4:1效应物与靶标比共培养4小时。如上文所述确定对于各靶标所诱导的特异性杀伤水平。图9b显示，Ara-C不干扰DNT的细胞毒性功能。离体扩增的DNT用Ara-C或PBS预处理14小时，并用于针对AML细胞系OCI-AML3以4:1效应物与靶标比进行的体外杀伤测定4小时。如上文所述确定各DNT诱导的特异性杀伤水平。

图10显示PBMC和扩增后DNT的表型鉴定。PBMC(上图)和扩增的14天后收获的DNT(下图)用抗人CD3、CD4、CD8、和αGalCer-CD1d的抗体染色。实心直方图代表荧光扣除(fluorescence minus one，FMO)对照。图上的数字代表各象限或门中的群体的频率。(***p<0.001)

图11a和11b显示，来自健康供体(HD)的DNT在体内不攻击造血干细胞并影响其分化。CD133⁺CD34⁺人HSPC静脉注射到亚致死照射的NSG小鼠(5×10⁶细胞/小鼠，n＝13)。HSPC注射的八周后，7只小鼠静脉注射10⁷个离体扩增的同种异体DNT。DNT注射的八周后，从PB收获细胞，并用抗小鼠CD45，抗人CD45、CD3、CD19、CD11b、CD56、CD33和CD34抗体染色。通过流式细胞术分析来确定人白细胞(图11a)及其子集(图 11b)的百分比。水平棒代表平均值，误差棒代表各组的SEM。

图12显示DNT细胞可以援救注射致死剂量的AML细胞系的NSG小鼠。亚致死照射的NSG小鼠静脉注射10⁶MV4-11，并且从第7天开始，接受2×10⁷DNT(n＝9)或PBS(n＝10)的三次注射，每次注射之间相隔4天。箭头代表DNT或PBS注射的时间。**p<0.01；***p<0.001。

具体实施方式

一个方面，本发明人已经确定DNT可用于治疗癌症，特别是用于治疗白血病或淋巴瘤。在一个实施方案中，还已经确定DNT可用于抑制癌细胞的生长或增殖或杀死癌细胞，包括对化疗有抗性的癌细胞。在优选的实施方案中，本文所述的DNT可用于治疗AML，或治疗再发的或复发的AML，诸如由微小残留病引起的AML。在另一个实施方案中，本文所述的DNT可用于治疗淋巴瘤。

如本文所用，术语“癌症”是指由可以扩散到身体的邻近组织或其他部分的细胞的不受控制的异常生长引起的一组疾病之一。癌细胞可以形成实体瘤，其中癌细胞聚集在一起，或作为分散的细胞存在，如在白血病中。

术语“癌细胞”是指以不受控制的异常生长和侵入另一组织的能力为特征的细胞或衍生自这种细胞的细胞。癌细胞包括，例如从患有癌症的患者获得的原代癌细胞或衍生自这样的细胞的细胞系。一个实施方案中，癌细胞是血液癌细胞，诸如白血病细胞或淋巴瘤细胞。例如，在一个实施方案中，癌细胞可以是来自患有AML的受试者的白血病细胞或是淋巴瘤细胞诸如来自患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者的细胞。在一个实施方案中，癌细胞可以是患有AML的受试者中的白血病癌细胞。在一个实施方案中，本文所述的DNT可用于在体外、离体或体内抑制癌细胞的生长或增殖。在一个实施方案中，本文所述的DNT可用于在体外、离体或体内杀死癌细胞。

如本文所用，“化疗抗性癌症”是指不响应化疗治疗或在用化疗治疗后复发的癌症。例如，化疗抗性细胞可以是从不响应化疗的受试者获得的原代癌细胞，或者是从最初对化疗响应并缓解但经历疾病复发的受试者获得的癌细胞。在一些受试者中，在复发后，癌细胞不再响应化疗，所述受试者具有化疗抗性癌症。在一个实施方案中，化疗抗性细胞是直接从受试者获得的原代白血病细胞。

本文所用的术语“白血病”是指涉及在造血组织、其他器官中并且通常在血液中发现的数目增加的异常白细胞进行性增殖的任何疾病。“白血病细胞”是指以这种细胞的增加的异常增殖为特征的白细胞。

如本文所用，“急性髓性白血病”(“AML”)是指髓系血细胞的癌症，其特征是异常白细胞的快速生长，其累积在骨髓中并干扰正常血细胞的产生。

如本文所用，“慢性髓性白血病”(“CML”)是指以骨髓中主要是髓系细胞的增加的和不受调节的生长以及这些细胞在血液中的累积为特征的癌症。

如本文所用，“淋巴瘤”是指特征在于从淋巴细胞发育的血细胞肿瘤的疾病。任选地，淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤(HL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。NHL的实例包括伯基特淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。“淋巴瘤细胞”是指以这种细胞的增加的异常增殖为特征的淋巴细胞。

本文使用的术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，并且适当地指人。任选地，术语“受试者”包括已经诊断患有癌症或处于缓解的哺乳动物。在一个实施方案中，术语“受试者”是指患有或怀疑患有血液癌症的人。在一个实施方案中，术语“受试者”是指患有AML或怀疑患有AML、任选地再发的或复发的AML的人。

在一个实施方案中，本文所述的方法和用途提供癌症的治疗。本文使用的术语“治疗”是本领域公知的，是指用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方式。有益或期望的临床结果可以包括但不限于，减轻或改善一种或多种症状或状况，减少疾病程度，稳定的(即不恶化的)疾病状态(例如维持患者缓解)，预防疾病或防止疾病的传播，延迟或减缓疾病进展，改善或减轻疾病状态，减少疾病的复发，和缓解(无论部分或全部)，无论是可检测出的还是不可检测出的。“治疗”还可以指与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。如本文所用的“治疗”还包括预防性治疗。在一个实施方案中，治疗方法包括给予受试者治疗有效量的如本文所述的DNT，并任选地由单次给药组成，或者包括一系列给药。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法和用途包括使用DNT和细胞周期抑制剂的联合治疗。

如本文所用，“减少癌细胞的生长或增殖”是指作为细胞生长或细胞分裂的结果由癌细胞产生的细胞数目的减少，包括细胞死亡。本文所用的术语“细胞死亡”包括杀死细胞的所有形式，包括坏死和细胞凋亡。

在一个实施方案中，本文所述的方法和用途涉及给予或使用有效量的DNT和任选地细胞周期抑制剂。如本文所用，短语“有效量”或“治疗有效量”是指在实现期望的结果所需的剂量和时间段内有效的量。例如在本文的上下文中或对于治疗癌症诸如AML，有效量是例如与不给予化合物而获得的响应相比，诱导缓解、降低肿瘤负荷、和/或防止肿瘤扩散或白血病细胞生长的量。有效量可根据诸如动物的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。对应于这样量的给定化合物的量将根据各种因素而变化，所述因素诸如所给药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者或主体的特性等，但是仍然可以由本领域技术人员常规地确定。

在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物包括给予或使用双阴性(DN)T细胞。DNT显示出将它们与其它类型的T细胞区分开的许多特征。在一个实施方案中，DNT不表达CD4或CD8。在一个实施方案中，DNT表达CD3-TCR复合物并且不表达CD4和CD8。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、αβ-TcR+、CD4-、CD8-、CD44-、CD28-。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、αβ-TcR+、CD4-、CD8-、α-Gal-、PD-1-、CTLA4-、CD44+、CD28-。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、CD4-、CD8-、α-Gal-、PD-1-、CTLA4-、CD44+。在一个实施方案中，DNT具有表型CD3+、CD4-、CD8-、α-Gal-、Jα24-、Vα14-、CD44+、PD-1-、CTLA4-、CD45R0+。DNT可使用本领域已知的技术获得，诸如但不限于荧光激活细胞分选(FACS)。在一个实施方案中，可从外周血单核细胞分离DNT。任选地，DNT可以是自体细胞或同种异体细胞。

在一个实施方案中，DNT是从患有癌症或怀疑患有癌症的受试者获得的自体细胞。任选地，在化疗之前、期间或之后从受试者获得DNT。在一个实施方案中，在化疗疗程之前、期间或之后从受试者获得DNT。例如，在一个实施方案中，在第一轮化疗后、或在一轮或多轮化疗后获得DNT。

在一些实施方案中，DNT可以在使用于或给予受试者之前在体外或离体扩增。用于分离和扩增DNT的示例性方法描述于美国专利号6,953,576“调节肿瘤免疫的方法(Methodof Modulating Tumor Immunity)”和PCT公开号WO2007/056854“扩增双阴性T细胞的方法(Method of Expanding Double Negative T Cells)”中，这二者均通过引用整体纳入本文。

在一个实施方案中，DNT可以从之后将给予其DNT(即自体细胞)以治疗癌症、减少癌细胞的生长或增殖或杀死癌细胞的受试者获得。在一个实施方案中，DNT可以是同种异体的。如本文所用，术语“同种异体”是指最初从与所述细胞的预期接受者是不同的个体但是与接受者是相同物种的受试者获得的细胞。任选地，同种异体细胞可以是来自细胞培养物的细胞。在优选的实施方案中，DNT从健康供体获得。如本文所用，术语“健康志愿者”(“HV”)或“健康供体”(“HD”)是指一个或多个没有癌症的受试者。在一个实施方案中，健康供体是没有可检测出的癌细胞的受试者，例如没有可检测出的白血病细胞的受试者。

在一个实施方案中，DNT可以用本领域已知的药学上可接受的制剂来配制以使用于受试者或者来制备以给予受试者。用于选择和制备合适制剂的常规方法和成分描述于例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(2003–第20版)和1999年出版的《美国药典：国家处方集(The United States Pharmacopeia:The NationalFormulary)》(USP 24NF19)。术语“药学上可接受的”是指与动物特别是人的治疗相容。

在一个实施方案中，本文所述的DNT在与化疗剂组合时出乎意料地有效减少癌细胞的增殖和/或治疗癌症。在一个实施方案中，化疗剂是细胞周期抑制剂。在一个实施方案中，细胞周期抑制剂是DNA合成抑制剂。因此，在一个实施方案中，提供了治疗受试者的癌症的方法，包括给予受试者DNT和化疗剂。还提供了DNT和化疗剂用于在有需要的受试者中治疗癌症的用途。在一个实施方案中，化疗剂是阿糖胞苷(AraC)。在一个实施方案中，癌症是白血病，例如急性髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，DNT与化疗剂诸如细胞周期抑制剂的组合可用于治疗化疗抗性的癌症，例如再发的或复发的AML。

如本文所用，术语“细胞周期抑制剂”是指抑制或防止细胞的分裂和/或复制的化疗剂。在一个实施方案中，术语“细胞周期抑制剂”包括选自以下的化疗剂：多柔比星(Doxorubicin)、美法仑(Melphlan)、罗斯考维汀(Roscovitine)、丝裂霉素C、羟基脲、50氟尿嘧啶、顺铂、Ara-C、依托泊苷(Etoposide)、吉西他滨(Gemcitabine)、硼替佐米(Bortezomib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、丙戊酸钠、HDAC抑制剂或达卡巴嗪(Dacarbazine)。HDAC抑制剂的实例包括但不限于FR01228、曲古抑菌素(Trichostatin)A、SAHA和PDX101。

如本文所用，术语“DNA合成抑制剂”是指抑制或防止癌细胞合成DNA的化疗剂。DNA合成抑制剂的实例包括但不限于AraC(阿糖胞苷)，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，5-氟尿嘧啶，卡培他滨(capecitabine)，氟尿苷，吉西他滨，地西他滨(decitabine)，维达扎(vidaza)，氟达拉滨(fludarabine)，奈拉滨(nelarabine)，克拉屈滨(cladribine)，氯法拉滨(clofarabine)，喷司他丁(pentostatin)，thiarabine，曲沙他滨(troxacitabine)，沙帕他滨(sapacitabine)或呋咯地辛(forodesine)。在一个实施方案中，DNA合成抑制剂是阿糖胞苷或如本文所述的另一种脱氧胞苷类似物。在一个实施方案中，DNA合成抑制剂是DNA延伸终止子，并且以类似于阿糖胞苷的方式起作用，例如氟达拉滨，奈拉滨，克拉屈滨或氯法拉滨。

如本文所用，“AraC”(阿拉伯呋喃糖基胞苷)是指包含胞嘧啶碱基和阿拉伯糖的化合物，其在体内转化为阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶三磷酸。AraC也称为阿糖胞苷或胞嘧啶阿拉伯糖苷。

在一个实施方案中，将DNT和化疗剂同时给予受试者，任选作为包含DNT和化疗剂的组合物，或作为两个分开的剂量。在一个实施方案中，将DNT和化疗剂在不同时间使用于或给予受试者。例如，在一个实施方案中，在化疗剂之前或之后给予DNT。在一个实施方案中，在化疗剂之前或之后给予DNT，间隔的时间为至少1分钟，2分钟，5分钟，10分钟，30分钟，45分钟，1小时，1.5小时，2小时，3小时，4小时，5小时，8小时，10小时，12小时，16小时或24小时。任选地，在一些实施方案中，将DNT和化疗剂隔开以下时间给予受试者：超过24小时，36小时，48小时，3天，4天，5天，6天，1周，10天，12天，两周，三周，一个月，6周，2个月或大于2个月。在一个实施方案中，在化疗剂之后的2天和7天之间给予或使用DNT。

在另一个实施方案中，提供了包含DNT和化疗剂的组合物。在一个实施方案中，化疗剂是DNA合成抑制剂。在一个实施方案中，DNA合成抑制剂是阿糖胞苷或如本文所述的另一种脱氧胞苷类似物。任选地，本文所述的组合物包括药学上可接受的载体，例如《雷明顿药物科学(2003–第20版)和1999年出版的《美国药典：国家处方集》(USP 24NF19)中描述的那些。还提供了包含DNT和化疗剂的组合物用于治疗癌症的用途。在一个实施方案中，所述癌症是白血病，任选地是AML。在一个实施方案中，组合物用于治疗对单独用化疗治疗有抗性的癌症。在一个实施方案中，受试者患有白血病，任选地AML。

以下非限制性实施例说明了本公开内容：

实施例1：从健康供体的外周血扩增DNT

从HD或化疗后完全缓解的AML患者获得20ml PB。DNT如先前所述扩增(Merims等人，2011)。简言之，通过使用RosetteSep^TM从外周血单核细胞(PBMC)中清除CD4+和CD8+细胞。用板结合的抗CD3抗体刺激剩余的CD4-CD8-PBMC 3天，洗涤，随后用可溶性CD3从第7天至第10天再刺激。第3、7和10天用含IL-2的新鲜培养基替换培养基。在2周扩增结束时，计数细胞并用抗CD3、CD4、CD8、iNKT TCR(TCR Vα24-Jα18)抗体和NKT受体抗原(α-半乳糖神经酰胺)染色。在用等体积的完全缓解AML患者的PB和HD的PB制备的扩增培养物中证明了HD DNT比患者DNT具有更高的扩增潜力，因为当从HD的PB扩增时(3.97±18.24×10⁸)，获得比从患者(3.25±0.9169×10⁷)显著更高数量的DNT(图1a)。此外，DML在约50％的AML病例中不能扩增，并且当使用HD的PB时获得更高纯度的DNT群体(90.74％±1.7％)，相比于当使用AML患者PB时的65.0％±19.8％(表1)。患者DNT的较低扩增潜力和纯度可能部分归因于在患者血液中遭遇AML细胞而耗尽和/或由强力的化疗引起的异常生理学。不能扩增或获得纯DNT用于治疗可对临床环境中DNT的使用造成严重限制。然而，这些数据表明可以使用HD DNT避免这些限制，为专注于同种异体HD DNT提供了依据。

表1：患者和HV DNT细胞在扩增结束时的频率。在患者或HV外周血的扩增培养设置结束时DNT细胞的纯度的总结。

实施例2:在NSG小鼠模型中表征人类DNT

成功的过继性T细胞治疗依赖于注射的T细胞在接受者中的存活和存留，从而这些细胞可以发现和消除肿瘤细胞。理想地，输注的T细胞能够在接受者中进一步繁殖，从而需要相对少量的T细胞用于注射。由于DNT在相对短的时间内(在初始样品收集的2周内)产生，所以这些DNT可能是早期效应器，并且可以在注射后增殖和存留。为了测试该假设，使用免疫缺陷NSG小鼠模型。第10天离体扩增的DNT用5μM CFSE标记，2×10⁷个细胞静脉内注射到亚致死量辐射的NSG小鼠中。为了维持人类DNT，向接受者小鼠补充腹膜内注射hrIL-2(10,000国际单位(i.u.))。在第2天、第4天和第7天收集血液、脾脏、骨髓、肝脏和肺以测定DNT在体内的增殖、迁移和存留。如图1b所示，从第2天至第4天观察到CFSE稀释，但第4天至第7天没有观察到，表明在过继转移后，DNT在注射后的前几天增殖。将收获的细胞用抗人CD45抗体染色，并使用FACS分析以确定不同组织中DNT随时间的频率。在注射后的血液、脾和肺中检测到DNT的相对较高的频率，而在注射后最多7天在肝和骨髓中观察到较小但可观察到的DNT群体(图1c)。

实施例3:开发基于流动的杀伤测定

铬释放测定法是广泛用于测定靶细胞的细胞毒性水平的标准测定法。然而，由于低的铬同位素负载效率和原代AML患者胚细胞的高自发死亡率，广泛使用的铬释放测定法对于确定原代AML胚细胞对体外DNT介导的细胞毒性的敏感性而言不是最佳的。为了确定离体扩增的DNT在体外诱导针对AML的细胞毒活性的能力，开发了新的基于流式细胞术的杀伤测定法。在该测定中，DNT用荧光膜染料PKH-26标记，并与原代AML-胚细胞以不同的效应子与靶标比共培养2小时。单独培养靶细胞和效应子细胞作为对照以确定自发性细胞死亡的水平。在共孵育2小时后，用表面标志物CD33和CD45抗体将细胞染色，以鉴定CD45^低和/或CD33+的AML，以及用膜联蛋白V染色，以鉴定细胞死亡水平(图2)。百分比特异性杀伤确定为：

％特异性杀伤＝％膜联蛋白V⁺ _{AML-DNT共培养}－％膜联蛋白V⁺ _单独的AML

与常规铬释放测定相比，基于流动的杀伤测定更快，与较低的背景噪声相关，并且不需要额外制备靶细胞，例如同位素负载。这种新的测定允许直接监测DNT以剂量依赖性方式介导的AML细胞凋亡的水平，同时避免了与标准铬释放测定相关的限制。此外，其可以用于确定DNT对AML群体的不同亚群的影响。然而，基于流动的杀伤测定法不能确定累积细胞死亡的水平。

实施例4:从HD扩增的DNT在体外以剂量依赖性方式选择性靶向AML，但不杀伤正常的同种异体PBMC。

为了测定同种异体DNT相对于正常PBMC对白血病细胞的细胞毒性，使用从3个不同的健康供体扩增的同种异体DNT针对以下细胞进行基于流动的杀伤测定：从两个HD获得的正常PBMC，从两个HD获得的HSPC，两个原代AML患者样品和AML细胞系，OCI-AML3和KG1a。来自所有三个供体的DNT显示以剂量依赖性方式对两种原代AML胚细胞和AML细胞系的强力杀伤活性，但对同种异体PBMC和HSPC未显示杀伤活性(图2b)。由于如实施例2和图1c所示DNT可以在接受者中存留，所以将健康PBMC和同种异体DNT的共培养延长至14小时。再一次，DNT不诱导正常的同种异体PBMC的杀伤(数据未显示)。这一发现与小鼠中输注同种异体DNT不会在接受者中引起病理损伤并因此是安全的报道一致。DNT靶向同种异体白血病细胞但不靶向健康PBMC的能力表明同种异体DNT可安全用于治疗白血病患者。

实施例5:DNT能够在体外杀死原代AML胚细胞并在NSG小鼠中抑制白血病植入。

为了测定从HD扩增的DNT杀死白血病细胞的能力，对从一组23名患者获得的原代AML胚细胞样品进行细胞毒性测定。虽然敏感性水平存在差异，但在19/23例中，患者原代胚细胞在体外以剂量依赖性方式对DNT介导的细胞毒性敏感，而4名患者胚细胞显示高水平的抗性(图3a)。这些数据表明同种异体DNT可以有效靶向大多数原代AML胚细胞。

尽管体外筛选证明DNT介导的显著水平的细胞毒性，但这是否会转化为较低的AML植入或AML数目的短暂减少仍然不确定。接下来，为了研究DNT对体内AML植入的效果，使用已建立的AML-NSG异种移植模型(Barabe等人，2007)测定用或不用DNT细胞处理的AML植入水平。简言之，将AML胚细胞#0578与或不与DNT一起培养18小时，随后注射至经亚致死照射的NSG小鼠的右股骨。移植的31天后，处死小鼠，并测定注射的骨中AML的植入。与无处理对照相比，用与DNT预孵育的AML胚细胞注射的小鼠中AML植入水平显著降低，表明DNT介导的效应可降低体内白血病细胞的水平(图3b)。

实施例6:DNT在体内以剂量依赖性方式介导抗原代AML的抗白血病活性。

图3b中观察到的AML植入的减少可能是在输注之前体外杀死AML细胞的结果。为了进一步确定输注的DNT是否可以迁移到白血病植入部位并消除骨髓中预先存在的AML(这更接近地类似于临床环境中的条件)，将DNT处理给予植入有AML胚细胞的NSG小鼠，如先前所述(Barabe等，2007)。简言之，将小鼠用2.5×10⁶–5.0×10⁶个原代AML胚细胞#5786或#090392注射到右股骨中。10到14天后，此时人白血病细胞植入了接受者，将AML植入的小鼠静脉内注射PBS或2×10⁷个DNT。在DNT注射的14-21天后处死小鼠，并收获来自用AML细胞注射的骨的细胞，用荧光标记的抗人CD3、CD33、CD45，CD19、CD34和CD38抗体染色以通过FACS分析确定AML植入的水平。在DNT-和PBS-处理的组之间比较AML细胞的植入频率。与PBS处理组相比，AML胚细胞#5786和#090392的频率在DNT处理组的注射骨中显著降低(图4a和4b)。这些结果表明，DNT可以从血液迁移到骨髓(AML源自此处)，并且靶向骨髓中预先存在的AML。

虽然DNT处理显著降低了AML植入的频率，但在DNT处理组中观察到一些残留的胚细胞。两种可能性可解释残留的AML细胞：1)这些细胞对DNT介导的细胞毒性有抗性，2)单剂量DNT治疗可能不足以消除大量预先存在的AML细胞。为了确定剩余的AML细胞是否对DNT介导的细胞毒性敏感，从DNT处理的和未处理的组中分离残留的AML胚细胞，并将其与在我们的基于流动的杀伤测定中最初用于植入的原代AML胚细胞一起用作靶标。从DNT处理的小鼠获得的残留AML胚细胞对于DNT在体外介导的杀伤作用与原代AML细胞和从PBS处理组获得的AML细胞同样敏感(图5a)，表明AML细胞的持续不可能是由于它们对DNT杀伤的抗性。此外，我们观察到DNT减少AML植入的能力与接受者中预先存在的AML细胞的频率负相关(图5b)，支持了多于一剂的DNT治疗可能进一步降低AML植入水平的观点。为了测试这种假设，NSG小鼠用高移植胚细胞#090240股骨内注射。在AML细胞注射的10天后，如前所述用一剂DNT静脉内输注接受者小鼠。再过10天后，用第二剂量的来自相同供体的DNT处理一半的DNT处理的小鼠。对照小鼠注射PBS作为对照。用两个剂量的DNT处理的组显示在骨髓和脾脏中最低水平的AML植入(图5b和5c)。在脾脏中，与用单剂量的DNT处理的组相比，第二剂量的DNT显著降低了胚细胞的频率(图5c)。尽管统计学上不显著，但是对于骨髓观察到相同的趋势(图5b)，这可能是由于骨髓中预先存在的AML细胞的频率非常高。总之，这些数据表明DNT能够在异种移植模型中消除AML细胞和抑制白血病植入。因此，有可能的是多次注射可以增强DNT治疗的功效。此外，在通过常规化疗消除大部分AML细胞后，DNT可作为辅助疗法特别有效用于靶向MRD。初始给予或使用化疗如AraC可帮助消除大多数癌细胞，接着DNT剂量可以更有效地对抗相对较少的剩余的化疗抗性细胞。

实施例7:化疗抗性AML对DNT敏感。

化疗是用于AML患者的标准治疗。化疗有效减少白血病负荷并实现疾病的初期缓解。然而，其通常不能实现疾病的完全清除，导致AML患者的复发率高。

因此，AML患者治疗的主要限制之一是不能有效地靶向化疗抗性AML，这导致高的AML复发率。为了研究DNT是否可以靶向化疗抗性AML，将从化疗敏感和抗性患者获得的AML样品在我们的体外杀伤测定中用作DNT的靶标。值得注意的是，10个化疗抗性AML患者样品中的7个(图6a)和8个化疗敏感AML患者样品中的7个(图6b)显示对DNT的显著敏感性。此外，平均特异性杀伤水平在化疗敏感和化疗抗性组中相当，分别为19.8±3.7％和16.6±4.1(图6c)。通过对获自化疗抗性、无响应(#5786，图4a)和复发(#090240，图5b和5c)患者的样品进行的体内实验进一步验证了DNT对化疗抗性AML的杀伤，如实施例6所述。DNT处理显著降低了两种样品中的AML负荷。这些结果表明DNT可以用作潜在的免疫疗法以治疗化疗无响应患者，并突出了DNT对抗化疗抗性MRD以实现无复发的缓解的临床应用潜力。

实施例8:DNT介导的潜在LSC-靶向活性。

以前，证明了DNT对LSC的潜在细胞毒活性，因为DNT靶向具有CD34(由LSC表达的标志物)表达的AML(Merims等人，2011)。然而，由于不是所有的CD34+细胞都代表LSC群体，DNT对LSC的作用仍然不能确定。用高侵袭性AML样品#090240进行的体内实验显示，在非注射组织、脾和非注射骨中有高水平的AML植入。由于它们的癌症起始和成群特征，AML在非注射组织中的植入被认为是由LSC介导的。本文提供的结果提供了DNT介导LSC的潜在杀伤的证据，因为DNT处理降低了非注射骨(图7a)和脾(图7b和7c)中的AML植入水平。不清楚这种减少是由于在植入部位杀死非LSC AML还是杀死移植物诱导的LSC而引起的。

实施例9:DNT-和化学-联合疗法的功效

化疗对于大量减少白血病的规模和实现疾病的初期缓解是有效的。然而，它在实现疾病的完全清除方面不是非常有效，因此具有MRD介导的复发的AML的限制。相反，DNT治疗在特异性靶向AML(包括不能通过化疗杀死的癌症)方面是有效的，如实施例7所示。然而，AML负荷的水平似乎是DNT疗法的功效的重要决定因素，和用细胞疗法对抗其他癌症一样。为了确定是否可以组合使用DNT疗法和化疗来克服与单独治疗相关的限制，将#090240-AML植入的NSG小鼠腹膜内注射标准化疗药物阿拉伯呋喃糖基胞苷(AraC)，60mg/kg，5天，从胚细胞注射的13天后开始。在最后一次Ara-C注射的3天后，如前所述向小鼠注射具有IL-2补充物的DNT或PBS。DNT注射的14天后，处死小鼠，收获骨髓和脾。在注射骨(图8a)、非注射骨(图8b)和脾(图8c)中使用联合疗法的AML的频率显著降低。虽然统计学上不显著，但是在所有三种组织中，联合疗法也比单独的治疗中的任一种实现了更低的平均AML植入频率。在脾中，接受联合疗法的组具有比接受单独AraC疗法的组显著更低的AML植入水平(图8c)。这些数据综合起来证明了由DNT疗法和化疗介导的叠加的抗白血病效应，以及在临床中在化疗后使用DNT疗法以靶向化疗后的残留胚细胞的潜力。因此，与使用DNT的免疫疗法或者化疗单独相比，使用DNT和化疗剂诸如AraC的组合疗法可能更有效地治疗AML。以前，不知道化疗后使用DNT是否会在减少癌细胞方面产生任何益处。如上所述，AraC和DNT似乎靶向不同的AML细胞，因此与任一单独的治疗相比，组合疗法可以产生显著的益处。

为了确定AraC和DNT组合治疗的优良的抗白血病活性是由于两者的协同效应还是仅仅为两种不同治疗的加和效应，对白血病干细胞样AML细胞系KG1a进行体外杀伤测定。用AraC或PBS处理14小时的KG1a与DNT共温育。AraC使得KG1a对DNT显著更敏感，因为DNT诱导的杀伤％对未处理的KG1a为15.38±0.51％，对AraC处理的KG1a为45.59±2.34％(图9a)。然而，在针对OCI-AML3的体外杀伤测定之前用AraC处理DNT细胞14小时对DNT介导的细胞毒性没有影响，表明DNT可以与化疗药物同时使用(图9b)。

实施例10:同种异体双阴性T细胞对急性髓性白血病的选择性细胞毒活性

如下所述，本发明人已经确定，同种异体的人类DNT在体外以及异种移植模型中对原代AML患者胚细胞(包括化疗抗性的那些)具有强力的抗白血病效应，对正常细胞和组织没有可检测出的毒性。这些发现支持了使用从HD扩增的DNT作为AML患者的新的细胞疗法，以克服当前治疗的局限性并增加患者存活。

离体扩增的同种异体DNT在体外和体内诱导针对原代AML患者胚细胞的强力细胞溶解活性。

之前在体外证明了从处于完全缓解中的AML患者的外周血(PB)离体扩增的DNT对自体CD34⁺白血病胚细胞的细胞毒性(Merims等人，2011)，但是只有30％的患者DNT能够被扩增(36个培养物中的12个扩增至3×10⁷个DNT或更高)。

这里，本发明人令人惊讶地说明，DNT可以从测试的所有HD扩增，其DNT的总数为从AML患者扩增的平均10倍高(图1a)，纯度显著更高(HD DNT为90.74％±1.7％vs.患者DNT为65.0％±19.8％)(图10)。

DNT的输注不攻击正常的同种异体PBMC和CD34⁺HSPC

为了进一步确定同种异体DNT对正常HSPC植入和分化的潜在作用，将NSG小鼠通过移植CD34⁺CD133⁺HD HSPC而人源化并用来自不同HD的DNT处理。如其他人报道的(McDermott等，2010，Drake等，2011)，在移植的小鼠的脾脏和BM中观察到一致地高嵌合性(～70-80％)，而外周血中的嵌合性为～15％。重要的是，在DNT处理和未处理小鼠之间没有观察到频率(图11a)和谱系分化(图11b)的差异。这些发现表明，DNT不靶向HSPC也不干扰HSPC分化为造血谱系。总之，通过证明离体扩增的同种异体DNT具有强力的抗白血病活性，但对正常组织和造血细胞不具细胞毒性，这些结果支持了DNT作为新的癌症免疫疗法的安全性。

同种异体DNT延长具有致死性AML的NSG小鼠的存活

与大多数原代AML胚细胞相反，AML细胞系MV4-11对NSG小鼠是致死的。当给予MV4-11注射的NSG小鼠三次DNT注射时，在DNT处理组中观察到显著的存活益处(图12)。总的来说，这些结果证明离体扩增的同种异体DNT在体外对化疗抗性原代AML胚细胞具有细胞毒性，并且可有效减少异种移植模型中的白血病负荷。

讨论

尽管在过去十年中广泛使用化疗来治疗AML患者，但是由于化疗抗性而导致的高复发率仍然是患者存活的主要挑战(Lin&Levy,2012,Hourigan&Karp,2013)。同种异体-HSCT是AML患者的潜在治愈性治疗，但其应用受相关毒性和供体可用性的限制(Brissot&Mohty,2015,Vyas等，2015,MacDonald等,2013)。如在HSCT、T细胞和NK细胞治疗中所明显的，在同种异体环境中的移植物抗白血病效应比自体环境中的那些更强，因为供体免疫细胞识别同种异体抗原，引起对转化细胞的强烈免疫反应(Arpinati&Curti,2014,Campbell&Hasegawa,2013,Ruggeri等，2002,6月,2007)。来自健康个体的同种异体DNT可在体外(图2b,3a,6a和6b)和体内(图4和6c)有效地靶向大量原代AML胚细胞。此外，DNT治疗后残留的胚细胞显示出对DNT杀伤的高度敏感性，这种敏感性与未处理组以及最初用于植入的原代胚细胞对应的敏感性相当(图5a)。这表明，与化疗不同，AML胚细胞在治疗之后不发展对DNT的抗性。与此一致，多次DNT治疗进一步降低白血病负荷(图5b和5c)。更重要的是，DNT有效地靶向化疗抗性的AML细胞(图5b、5c和6)。这些数据说明DNT通过与化疗不同的机制靶向AML细胞，并且DNT可单独用于化疗不响应的AML或者与化疗组合以靶向引起复发的化疗抗性AML，从而克服AML患者治疗中的当前的限制。

与没有同种异体反应(图2b和12)一致，来自单个供体的DNT可以杀伤一系列的原代AML细胞，并且来自单个患者的AML胚细胞被来自不同供体的DNT裂解至相似程度(数据未显示)。这些特征指向DNT作为细胞疗法的更广泛的适用性，并且避免了从每个患者产生治疗性细胞的需要。此外，随着最近在治疗淋巴瘤中的成功(Maude等，2014)，利用CAR技术靶向AML的研究变得更加活跃(Kenderian等，2015，Lichtenegger等，2015，Tettamanti等，2014，Wang等，2015)。鉴于它们易于扩增和具有抗癌免疫应答的效应分子的组成型高表达(Merims等人，2011)，DNT可作为CAR技术的良好细胞载体以进一步增强它们的抗肿瘤活性。此外，由于从化疗抗性和复发患者获得的原代胚细胞在体外和体内对DNT介导的细胞毒性敏感(图6和7)，DNT可以用作一线疗法治疗化疗难治性患者或作为常规化疗之后的巩固疗法以靶向化疗抗性的微小残留病。

虽然已经参照目前被认为是优选的实施例描述了本公开内容，但是应当理解，本公开内容不限于所公开的实施例。相反，本公开内容旨在覆盖包括在所附权利要求的精神和范围内的各种改动和等同安排。

所有公开、专利和专利申请通过引用整体纳入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用整体纳入。

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Claims (63)

1.一种治疗有需要的受试者的白血病或淋巴瘤的方法，包括给予所述受试者有效量的双阴性T细胞(DNT)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述白血病是急性髓性白血病(AML)。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述DNT是自体的。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述DNT来自具有一个或多个可检测出的癌细胞的受试者。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述DNT来自先前被治疗癌症的受试者。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述DNT来自不处于完全缓解中的受试者。

7.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述DNT获得自化疗之前、化疗期间或化疗之后的受试者。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述DNT获得自一轮或多轮化疗之后的受试者。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述DNT是同种异体的。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述DNT来自一个或多个没有癌症的受试者。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述DNT获得自包含外周血单核细胞(PBMC)的样品。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述样品是血液样品。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述DNT已在体外扩增或离体扩增。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述受试者患有再发的AML、复发的AML或难治性AML。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述再发的AML或复发的AML是由微小残留病(MRD)或白血病干细胞引起的。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述DNT通过静脉内注射给予所述受试者。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述DNT在化疗之前、化疗期间或化疗之后给予受试者。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述DNT在化疗的同一天、3天内、1周内、2周内、3周内或1个月内给予受试者。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，还包括给予所述受试者一个或多个另外剂量的有效量的DNT。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述另外剂量在最后一剂DNT的至少3天后、最后一剂DNT的至少5天后、或任选地最后一剂DNT的3天至两周之间之后给予。

21.一种抑制白血病或淋巴瘤细胞生长或增殖的方法，包括使所述细胞与双阴性(DN)T细胞接触。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述DNT是同种异体的。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述白血病细胞或淋巴瘤细胞是化疗抗性的。

24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述白血病细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。

25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述白血病细胞或淋巴瘤细胞在体外或体内。

26.一种治疗有需要的受试者的白血病或淋巴瘤的方法，包括给予所述受试者有效量的同种异体DNT和化疗剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述化疗剂是细胞周期抑制剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞周期抑制剂是AraC。

29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，用于治疗有需要的受试者的急性髓性白血病(AML)。

30.有效量的双阴性(DN)T细胞用于治疗有需要的受试者的白血病或淋巴瘤的用途。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述白血病是急性髓性白血病(AML)。

32.如权利要求30或31所述的用途，其中所述DNT是自体的。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述DNT来自具有一个或多个可检测出的癌细胞的受试者。

34.如权利要求30或31所述的用途，其中所述DNT来自先前被治疗癌症的受试者。

35.如权利要求30-34中任一项所述的用途，其中所述受试者不处于完全缓解中。

36.如权利要求34或35所述的用途，其中所述DNT获得自化疗之前、化疗期间或化疗之后的受试者。

37.如权利要求36所述的用途，其中所述DNT获得自一轮或多轮化疗之后的受试者。

38.如权利要求30或31所述的用途，其中所述DNT是同种异体的。

39.如权利要求38所述的用途，其中所述DNT来自一个或多个没有癌症的受试者。

40.如权利要求30-39中任一项所述的方法，其中所述DNT获得自包含外周血单核细胞(PBMC)的样品。

41.如权利要求40所述的用途，其中所述样品是血液样品。

42.如权利要求30-41中任一项所述的用途，其中所述DNT已在体外扩增或离体扩增。

43.如权利要求30-42中任一项所述的用途，其中所述受试者患有再发的AML、复发的AML或难治性AML。

44.如权利要求43所述的用途，其中所述再发的AML或复发的AML是由微小残留病(MRD)或白血病干细胞引起的。

45.如权利要求30-44中任一项所述的用途，其中所述DNT用于通过静脉内注射使用。

46.如权利要求30-45中任一项所述的用途，其中所述DNT用于在化疗之前、化疗期间或化疗之后使用。

47.如权利要求30-46中任一项所述的用途，其中所述DNT用于在化疗的同一天、3天内、1周内、2周内、3周内或1个月内使用。

48.如权利要求30-47中任一项所述的用途，还包括使用一个或多个另外剂量的有效量的DNT。

49.如权利要求48所述的用途，其中所述另外剂量用于在最后一剂DNT的至少3天后、最后一剂DNT的至少5天后、或任选地最后一剂DNT的3天至两周之间之后使用。

50.有效量的双阴性(DN)T细胞用于抑制白血病细胞或淋巴瘤细胞的生长或增殖的用途。

51.如权利要求50所述的用途，其中所述DNT是同种异体的。

52.如权利要求50或51所述的用途，其中所述白血病细胞或淋巴瘤细胞是化疗抗性的。

53.如权利要求50-52中任一项所述的用途，其中所述白血病细胞是急性髓性白血病(AML)细胞。

54.如权利要求50-53中任一项所述的用途，其中所述白血病细胞或淋巴瘤细胞在体外或在体内。

55.有效量的同种异体DNT和化疗剂用于治疗有需要的受试者的白血病或淋巴瘤的用途。

56.如权利要求55所述的用途，其中所述化疗剂是细胞周期抑制剂。

57.如权利要求56所述的用途，其中所述细胞周期抑制剂是AraC。

58.如权利要求55-57中任一项所述的用途，用于治疗有需要的受试者的急性髓性白血病(AML)。

59.包含DNT和化疗剂的组合物。

60.如权利要求59所述的组合物，其中所述化疗剂是细胞周期抑制剂。

61.如权利要求60所述的组合物，其中所述细胞周期抑制剂是AraC。

62.如权利要求59-61中任一项所述的组合物，还包含细胞因子诸如IL-2。

63.如权利要求59-62中任一项所述的组合物，用于治疗有需要的受试者的急性髓性白血病。