CN117860782B - 双阴性t细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及双阴性T细胞（double negative T cell,DNT细胞）在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。所述双阴性T细胞是由CD4+CD25‑T细胞转化而成的CD4‑CD8‑双阴性T细胞。所述脊髓损伤是创伤性脊髓损伤。实验结果表明，双阴性T细胞能够促进脊髓损伤后运动能力恢复，抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖和胶质瘢痕形成。本发明首次发现了双阴性T细胞在治疗脊髓损伤方面的用途，具有重要的理论意义和临床转化价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及双阴性T细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
背景技术
脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是一种严重致残性疾病，绝大部分由外伤引起。全世界每年因车祸、暴力以及跌落等原因导致的脊髓损伤患者约25-50万人。这一严重的致残性疾病会导致损伤平面以下感觉和运动功能障碍，并因此产生神经病理性疼痛、痉挛、褥疮以及膀胱和肠道功能障碍等并发症，患者的生活质量严重下降。
迄今，脊髓损伤的治疗依然是医学难题中的一个堡垒，成为难以逾越的“世界屋脊”。脊髓损伤过程复杂，早期以轴突、少突胶质细胞和神经元凋亡和缺失为主；继而破坏血脑屏障，诱发大量炎性细胞浸润；后期在损伤部位产生空洞、胶质瘢痕、髓鞘脱落而诱导远端神经元萎缩和凋亡，并且阻断轴突的再生，限制功能恢复。手术治疗、药物治疗、康复治疗等是目前临床上治疗脊髓损伤的主要方案，但皆不能有效逆转受损脊髓的病理程度，影响功能恢复。
目前对SCI有效的治疗方法很少。基因治疗和干细胞移植等新技术在治疗SCI方面显示出前景，但是在将这些疗法用于临床治疗之前，需要解决许多技术挑战。因此，探索安全、有效、方便的治疗脊髓损伤的新治疗方案仍是当务之急，其具有重要的理论意义和临床转化价值。
双阴性T细胞（double negative T cell, DNT细胞）是近年来发现的一类具有免疫调节功能的T细胞，广泛存在于外周血、淋巴结、脾脏、肝脏、肠道等组织中。在人和小鼠外周血和淋巴组织中，DNT细胞虽然只占总T淋巴细胞的1-3%，但是这些细胞具有重要的免疫调控作用。近年来，多项研究表明DNT细胞在红斑狼疮、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、原发性胆源性胆管炎等免疫相关疾病中发挥重要作用。一方面，DNT细胞能够通过颗粒酶/穿孔素（Prf1）途径直接杀伤促炎细胞发挥免疫抑制作用，另一方面，DNT细胞能够分泌多种免疫调节性细胞因子实现其免疫调控功能。进一步的研究表明应用DNT细胞治疗免疫相关疾病产生良好效果，在自身免疫性脑脊髓炎动物模型中DNT细胞可降低脑部组织淋巴细胞浸润。在卵清白蛋白诱导的过敏性哮喘模型中，DNT细胞显著减轻了小鼠肺部的炎性细胞浸润和呼吸道阻塞。Joshua Hsu等人研究表明，肺部缺血再灌注损伤时，DNT细胞通过调节炎症和细胞凋亡对肺组织发挥保护作用，表明了DNT细胞潜在的免疫调节功能。
此前，尚未有针对DNT在治疗脊髓损伤方面的报道。
发明内容
本发明的目的是为了填补现有技术的空白，解决目前临床上使用的治疗脊髓损伤的药物不足或疗效不佳的问题，提供了双阴性T细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
为了达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了双阴性T细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途，所述双阴性T细胞是由CD4+CD25- T细胞细胞转化而成的CD4- CD8- 双阴性T细胞。
作为可选的方式，在上述用途中，所述双阴性T细胞的制备方法包括以下步骤：
取6-8周龄C57/BL6小鼠脾脏和淋巴结，研磨和裂解红细胞后经200 μm筛网得到淋巴细胞悬液。应用小鼠T细胞富集柱富集淋巴细胞悬液中的T细胞，应用抗 TER119/CD25/CD19/CD8a/NK1.1/CD11b/TCRγδ PE抗体和PE亲和磁珠分选富集幼稚CD4+ T细胞。将幼稚CD4+ T细胞和成熟骨髓树突状细胞按4:1比例共培养，培养体系中加入IL-2，培养7天后应用流式分选方式得到CD4- CD8- 双阴T细胞。
作为可选的方式，在上述用途中，所述脊髓损伤是创伤性脊髓损伤。
作为可选的方式，在上述用途中，所述创伤性脊髓损伤是不完全性脊髓损伤。
作为可选的方式，在上述用途中，所述治疗脊髓损伤是抑制脊髓损伤后反应性星形胶质细胞的过度增殖和胶质瘢痕形成。
作为可选的方式，在上述用途中，所述治疗脊髓损伤是促进脊髓损伤后运动能力恢复。
优选地，所述运动能力恢复表现为运动能力提高，运动的潜伏期变短和振幅显著变大。
作为可选的方式，在上述用途中，所述药物是细胞制剂，所述细胞制剂包含所述双阴性T细胞群。
作为可选的方式，在上述用途中，所述细胞制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
作为可选的方式，在上述用途中，所述细胞制剂是液体制剂。
作为可选的方式，在上述用途中，所述细胞制剂用于尾静脉注射。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明首次提出了双阴性T细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。所述双阴性T细胞是由CD4+CD25- T细胞转化而成的CD4- CD8- 双阴性T细胞。所述脊髓损伤是创伤性脊髓损伤。实验结果表明，双阴性T细胞能够促进脊髓损伤后运动能力恢复，抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖和胶质瘢痕形成。本发明首次发现双阴性T细胞在治疗脊髓损伤方面的用途，具有重要的理论意义和临床转化价值。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：脊髓损伤小鼠运动功能修复情况。其中，图1A：不同组小鼠指定时间点BMS评分；图1B：不同组小鼠指定时间点体重变化；图1C：脊髓损伤后8周不同组小鼠前后肢抓力变化情况；图1D：脊髓损伤后8周不同组小鼠精细行为变化情况。
图2：脊髓损伤小鼠胶质瘢痕形成情况。图2A：不同组小鼠脊髓损伤8周后GFAP免疫组化染色结果；图2B：统计不同组GFAP所包围的胶质瘢痕的面积；图2C和图2D：不同组小鼠脊髓损伤8周通过流式细胞术对病灶区域星形胶质细胞进行检测，并进行统计分析。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例
1. 实验方法：
SPF级健康雌性C57BL/6（20±2 g）小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物随机分为假手术组，SCI组和SCI+DNT（在实施例中，DNT指由CD4+CD25- T细胞细胞转化而成的CD4- CD8- 双阴性T细胞，下文中的DNT具有相同含义）干预组，每组8只动物。2%异氟烷麻醉小鼠，取俯卧位，固定在手术台上，备皮，常规消毒，以T10为中心行后正中线纵行切口，显露T9-T11棘突及椎板。在T10级别进行椎板切除术，采用IH-400打击器70 KD力度进行脊髓打击。假手术组仅行椎板切除术；SCI组接受椎板切除术和脊髓损伤造模，并注射溶剂对照。SCI+DNT干预组接受椎板切除术和脊髓损伤造模，并注射免疫细胞DNT。DNT注射，在SCI模型后半小时内，经小鼠尾静脉注射0.1 mL（5×106个）DNT细胞。溶剂对照组即通过尾静脉注射相同体积的培养基。
DNT细胞的制备方法包括以下步骤：取6-8周龄C57/BL6小鼠脾脏和淋巴结，研磨和裂解红细胞后经200 μm筛网得到淋巴细胞悬液。应用小鼠T细胞富集柱富集淋巴细胞悬液中的T细胞，应用抗 TER119/CD25/CD19/CD8a/NK1.1/CD11b/TCRγδ PE抗体和PE亲和磁珠分选富集幼稚CD4+ T细胞。将幼稚CD4+ T细胞和成熟骨髓树突状细胞按4:1比例共培养，培养体系中加入IL-2，培养7天后应用流式分选方式得到CD4-CD8-双阴T细胞。
BMS（Basso Mouse Scale）评分：损伤后的指定时间点进行旷场实验评价小鼠后肢运动功能，由经过培训的两名观察者独立进行，将单只小鼠置于长×宽（90 cm）的方形的旷场内，持续观察其行为活动5 min，同时记录。主要对小鼠的后肢踝关节活动度、负重行走、协调性进行评价。
抓力分析（Grip Strength Meter）：损伤后不同时间点，让小鼠后肢抓住与传感器相连的网格，并迅速拉走以记录抓力峰值，每只连续进行五次实验得到五个抓力值，通过去掉最高值和最低值，取三个值的平均值来评价小鼠后肢抓力。
精细行为检测（HomeCageScan）：使用侧面摄像机对处于自然笼内的实验动物进行拍摄，自动识别动物的鼻、耳、前肢、后肢、上背、下背、腹、尾根、颈部等部位，并可在软件中看到各个部位的标记；对动物在笼内自然状态下的直立、下卧、走/跑、悬挂、跳跃、饮、食、咀嚼、梳理、排尿等行为进行自动识别与跟踪记录。
结果以平均值和标准误（SEM）表示。数据通过SPSS 17.0版统计软件包进行分析。t检验用于确定两组之间的显着性。进行了one-way ANOVA检验以比较三个或三个以上的组。P<0.05认为差异有显著性。
2. 实验结果：
2.1 DNT注射促进脊髓损伤小鼠运动功能修复
小鼠脊髓损伤后立即进行DNT尾静脉移植，在损伤后每周进行BMS评分和体重检测，观察到DNT细胞移植组的BMS评分要高于SCI组，从损伤后14天到28天，BMS评分均显著性提高。同时观察到DNT注射后动物的体重明显上升；尤其在损伤后24天，28天，35天和56天，与SCI组相比，DNT注射后动物体重显著增加。损伤后56天，DNT注射组小鼠后肢抓力比损伤组显著增加。此外通过精细行为观察了不同组小鼠的24种行为，研究数据显示，与SCI组小鼠相比，DNT注射组小鼠运动功能的行为（Remain Low和Walk slowly）显著上调，而睡眠时间显著减少。上述结果显示DNT注射能够显著改善脊髓损伤后小鼠运动功能恢复。具体实验结果如图1所示。
2.2 DNT细胞对胶质瘢痕形成的抑制作用
免疫组化结果显示DNT细胞干预显著降低了损伤核心GFAP阳性区域的平均灰度值，提示DNT细胞可能对损伤后胶质瘢痕形成具有抑制作用。进一步通过流式细胞术对病灶区域星形胶质细胞进行检测发现，DNT治疗后显著抑制CD15/CD133双阳的星形胶质细胞比例，即DNT细胞治疗抑制病灶区星形胶质细胞向高增殖方向分化。提示DNT可能对病灶区星形胶质细胞分化具有调节作用，为阐明DNT细胞对损伤状态下星形胶质细胞的作用机制提供了依据。具体实验结果如图2所示。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1. 双阴性T细胞在制备治疗创伤性脊髓损伤的药物中的用途，其特征在于：所述双阴性T细胞是由CD4+CD25- T细胞转化而成的CD4-CD8-双阴性T细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述创伤性脊髓损伤是不完全性脊髓损伤。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗创伤性脊髓损伤是抑制脊髓损伤后反应性星形胶质细胞的过度增殖和胶质瘢痕形成。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗创伤性脊髓损伤是促进脊髓损伤后运动能力恢复。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是细胞制剂，所述细胞制剂包含所述双阴性T细胞。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述细胞制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述细胞制剂是液体制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述细胞制剂用于尾静脉注射。
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